DE69002657T2

DE69002657T2 - Limulustest-positives Pflanzenglykolipid und Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems eines Tieres.

Info

Publication number: DE69002657T2
Application number: DE90400328T
Authority: DE
Inventors: Den Ichi Mizuno; Haruyuki Oshima; Gen-Ichiro Soma; Daisuke Tsukioka; Jun Yoshimura
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-02-06
Filing date: 1990-02-06
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2010-02-07
Also published as: EP0384798A1; US5236709A; ATE92765T1; ES2060078T3; DE69002657D1; US5382430A; EP0384798B1; DK0384798T3

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein im Limulustest positives Pflanzenglykolipid. Sie betrifft insbesondere ein im Limulustest positives Glykolipid und ein Verfahren zur Stimulierung des Immunsystems eines Tieres.

Beschreibung des Standes der Technik

Organismen haben ihre eigene Immunität, um ihre Bedingungen im Innern gegen Störung durch ein exogenes oder endogenes Fremdmaterial und ihre Homöostase aufrechtzuerhalten. Die Abnahme der Immunität führt somit zu einer Beeinträchtigung der Gesundheit, zum Auftreten von verschiedenen Erkrankungen, zur Stimulierung der Alterung und dgl. Andererseits führt ihre Aktivierung zu einer Verbesserung der Gesundheit, zur Verhinderung des Auftretens verschiedener Erkrankungen, zur Heilung verschiedener Erkrankungen und zur Verhinderung das Alterns oder dgl.
Aus den obengenannten Gründen ist es erwünscht, über eine Substanz zu verfügen, die in der Lage ist, die Immunität zu aktivieren. Bisher sind als Substanzen, die diese Fähigkeit haben, bekannt PSK (anderer Name: Krestin (Warenzeichen der Firma Kureha Kagaku Co., Japan, eingetragen in Japan), Lentinan (Warenzeichen der Firma Ajinomoto Co., Japan, eingetragen in Japan), Bestatin (Warenzeichen der Firma Nihon Kayaku Co., Japan, eingetragen in Japan), Sonifilan (Warenzeichen der Firma Kaken Seiyaku Co., Japan, eingetragen in Japan), OK-432 ("Cancer Chemotherapy Reports", Teil 1, Band 58, Nr. 1, Seiten 10, 1972; anderer Name: Picibanil (Warenzeichen der Firma Chugae Seiyaku Co., Japan, eingetragen in Japan).
Außerdem gehören zu allgemein bekannten, Limulustestpositiven Glykolipiden E. coli LPS (Lipopolysaccharid), B. pertussis LPS und Salmonella LPS, und diese werden in einigen Versuchen verwendet. Der hier verwendete Ausdruck "Limulus-Test" wird nachstehend näher erläutert.
Sie sind jedoch so toxisch, daß sie bisher in der Praxis nicht verwendet wurden. Bezüglich des im Limulus-Test positiven (nachstehend als "Limulustest-positiv" bezeichnet) Pflanzenglykolipids ist bisher selbst über dessen Existenz nichts berichtet worden.
Unter den bekannten Immun-Stimulatoren haben PSK, Lentinan , Bestatin und Sonifilan keine TNF-Produktivität und ihre Immun-Stimulierung ist somit gering.
OK-432 ist zwar bekannt dafür, daß es eine TNF-Produktivität aufweist, es muß jedoch eine ziemlich große Menge dieses Produkts verabreicht werden, um eine zufriedenstellende Menge an TNF zu erzeugen, wodurch unvermeidlich ein Fieberanfall oder ein Schüttelfrost-Anfall verursacht wird, der Blutdruck gesenkt und die Anzahl der Thrombozyten herabgesetzt wird. Daher hat OK-432 einen niedrigen chemotherapeutischen Koeffizienten. OK-432 hat den zusätzlichen Nachteil, daß seine Herstellungsstufen die Kultivierung von Mikroorganismen umfassen und daß die Verfahren zu seiner Abtrennung und Reinigung extrem kompliziert sind, wodurch die Produktionskosten erhöht werden. Außerdem liefert OK-432 keine TNF bei oraler oder subkutaner Verabreichung, die sehr leicht durchzuführen ist; deshalb muß OK-432 auf unbequemem Wege verabreicht werden.
Der hier verwendete Ausdruck "TNF" ist die allgemeine Bezeichnung (Freiname) für die von einem Makrophagen gebildeten Tumor-Nekrose-Faktoren" ("The Journal of Biol. Chem." 260, Seiten 2345-2354, 1985) und die Bildungsmenge der TNF steigt mit steigender Aktivität des Makrophagen. Ein Makrophage ist die generelle Bezeichnung (Freiname) für große amöbenartige Zellen, die zu den immunkompetenten Zellen gehören, die in den meisten inneren Geweben von Tieren vorhanden sind und ein teilchenförmiges Fremdmaterial und Abfallzellen in dem Körper auffressen und digestieren. Der hier verwendete Ausdruck "chemotherapeutischer Koeffizient" ist das Verhältnis zwischen der vom Wirt maximal tolerierten Dosis des Arzneimittels und der minimalen wirksamen Dosis des Arzneimittels; je größer das Verhältnis ist, um so besser ist das Arzneimittel.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung dient der Bereitstellung eines im Limulustest positiven Pflanzenglykolipids (nachstehend als "Limulustest-positives Pflanzenglykolipid" bezeichnet), das frei von den Nachteilen des Standes der Technik ist und somit einen hohen Grad der Immunstimulierung und einen großen chemotherapeutischen Koeffizienten aufweist und das mit geringen Kosten hergestellt werden kann und intravenös und oral verabreicht werden kann und auf die Haut aufgebracht (aufgetragen) werden kann. Bei dem hier erwähnten "Limulus-Test" handelt es sich um ein Verfahren, das Lewin 1968 gefunden hat zur quantitativen Bestimmung von Endothoxin, bei dem ein Königskrabben-Hämozyten-Extrakt und ein chromogenes Substrat verwendet werden.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Limulustest-positives Pflanzenglykolipid zur Verfügung zu stellen, das einen hohen Grad der Immun-Stimulierung und einen großen chemotherapeutischen Koeffizienten aufweist und das mit geringen Kosten hergestellt werden kann und intravenös und oral verabreicht und auf die Haut aufgebracht (aufgetragen) werden kann.
Die Erfindung betrifft ferner Immun-Stimulatoren, Veterinär-Immun-Stimulatoren, Immunitäts-diagnostische Reagentien, Veterinär-Immunitäts-diagnostische Reagentien, Quasi-Arzneimittel, wie sie in "The Japanese Pharmacopoeia" definiert sind, Kosmetika, Lebensmittel und Futtermittel, die mindestens einen Vertreter des genannten Glykolipids enthalten. Der hier verwendete Ausdruck "die mindestens einen Vertreter des genannten Glykolipids enthalten" bedeutet, daß die jeweiligen Vertreter des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Glykolipids einzeln verwendet werden können oder miteinander kombiniert werden können oder gegebenenfalls mit einem beliebigen anderen Material kombiniert werden können.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem eine Immunstimulator-Zusammensetzung, die eine wirksame Menge des erfindungsgemäßen Glykolipids im Gemisch mit einem pharmazeutisch oder veterinär-akzeptablen Träger enthält, so daß dann, wenn sie an ein Tier verabreicht wird, das Immunsystem dieses Tiers stimuliert wird, wodurch mindestens eine Verbesserung in bezug auf die Osteogenese, das Eierlegen und die Schalenfestigkeit erzielt wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 ist ein gaschromatographisches Diagramm des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, das Peaks aufweist, welche die Anwesenheit von Fettsäuren in dem Molekül anzeigen;
Fig. 2 ist ein gaschromatographisches Diagramm von E. coli LPS, das Peaks aufweist, welche die Anwesenheit von Fettsäuren im Molekül anzeigen;
Fig. 3 ist ein gaschromatographisches Diagramm von B. pertussis LPS, das Peaks aufweist, welche die Anwesenheit von Fettsäuren im Molekül anzeigen;
Fig. 4 ist ein Diagramm, das die endogene TNF-Produktions-Stimulierung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, wenn es intravenös verabreicht wird, im Vergleich zu derjenigen einer Kontrolle oder eines der bekannten Immun-Stimulatoren anzeigt;
Fig. 5 ist ein Diagramm, das die endogene TNF-Produktions-Stimulierung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, wenn es oral verabreicht wird, im Vergleich zu derjenigen einer Kontrolle oder eines der bekannten Immun-Stimulatoren anzeigt;
Fig. 6 ist ein Diagramm, das die Dosis-Abhängigkeit der endogenen TNF-Produktions-Stimulierung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids zeigt;
Fig. 7 ist ein Diagramm, das die Verabreichungsintervall-Abhängigkeit der endogenen TNF-Produktions-Stimulierung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids zeigt;
Fi.g 8 ist ein Diagramm, das die endogene TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids zeigt;
Fig. 9 ist ein Diagramm, das zeigt, daß die endogene TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids drastisch ansteigt für den Fall, daß eine Vielzahl von TNFs als endogene TNF-Produktions- Stimulatoren verwendet werden;
Fig. 10 ist ein Diagramm, das die endogene TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids im Vergleich zu derjenigen von E. coli LPS zeigt;
Fig. 11 ist eine logarithmische normale Wahrscheinlichkeitskurve, welche die endogene TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids im Vergleich zu dem unter Anwendung des Limulustests bestimmten Gehalt an dem genannten Glykolipid zeigt; und
Fig. 12 zeigt die Stimulierung der lokalisierten Produktion von TNF durch das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbaren Ausgangspflanzen umfassen alle Pflanzen, die einen Limulustest-positiven Bestandteil enthalten. Es kann beispielsweise jede beliebige Pflanze, die zu den Gymnospermae, den Monocotyledoneae, den Dicotyledoneae, den Pteridophyta, den Algen oder den Fungi gehört, einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden.
Die Pflanzen, die zu den Gymnospermae gehören, die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar sind, umfassen beispielsweise solche, die zu den Pinaceae gehören.
Erläuternde Beispiele für die Pflanzen, die zu den Monocotyledoneae gehören, die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar sind, sind solche, die zu den Gramineae, den Iridaceae, den Zingiberaceae, den Araceae oder Liliaceae gehören. Die Pflanzen, die zu den Gramineae gehören, die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar sind, umfassen beispielsweise die Reispflanze, Weizen, Gerste, Roggen und Hafer. Erfindungsgemäß können auch Gemische derselben verwendet werden.
Die Pflanzen, die zu den Dicotyledoneae gehören, die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar sind, sind beispielsweise diejenigen, die zu den Rubiaceae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Lauraceae, Juglandaceae, Piperaceae, Umbelliferae, Menispermaceae, Saururaceae, Solanaceae, Rosaceae, Actinidiaceae, Leguminosae, Rutaceae, Magnoliaceae oder Myristicaceae gehören. Diese Pflanzen können einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden.
Die Pflanzen, die zu den Pteridophyta gehören, die für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar sind, sind beispielsweise diejenigen, die zu den Equisetaceae oder Osmundaceae gehören. Auch diese Pflanzen können einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden.
Als Pflanzen, die zu den Algen gehören, können beliebige Pflanzen einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden, die beispielsweise gehören zu den Phacophyceae, Rhodophyceae, Chlorophyceae oder Cyanophyceae. Ein erläuterndes Beispiel für die Pflanzen, die zu den Chlorophyceae gehören, ist Chlorella.
Als Fungus, der für die erfindungsgemäße Verwendung verfügbar ist, kann beispielsweise irgendeiner, der zu den Basidiomyceten oder Ascomyceten gehört, einzeln oder im Gemisch miteinander verwendet werden.

Nachweis und Bestimmung des Gehaltes an Limulustest-positivem Pflanzenglykolipid

Der Nachweis und die Bestimmung des Gehaltes an dem erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipid, das in irgendeiner der obengenannten Pflanzen enthalten ist, kann durchgeführt werden unter Verwendung beispielsweise eines Reagens-Sets, wie es von der Firma Sei-Kagaku Kogyo Co., Japan, unter dem Handelsnamen "Toxi Color-System" erhältlich ist. Das heißt, die Ausgangspflanze wird mit dem LS-1-Set des genannten Systems in Kontakt gebracht und die chromogene Stärke der Pflanze wird bestimmt im Vergleich zu den Daten der unter Verwendung des Et-2- Sets des genannten Systems erstellten Eichkurve.
Das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid kann auf die nachstehend beschriebene Weise abgetrennt und gereinigt werden.

Abtrennung und Reinigung des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids

1) Die Ausgangspflanze wird, erforderlichenfalls nach dem Zerschneiden in Scheiben (Stücke), in geeigneter Weise getrocknet und pulverisiert, in destilliertem Wasser suspendiert und dann wird die überstehende Flüssigkeit gesammelt.
Wenn beispielsweise die Ausgangspflanze in Form von Getreide-Samenkörnern geliefert wird, dann werden die Samenkörner erforderlichenfalls oder gewünschtenfalls nach der Entfernung der Samenkornüberzüge etwas zerkleinert oder pulverisiert bis zu einer eßbaren Teilchengröße der Pulver. Die resultierenden Pulver werden durch Zugabe von Wasser und Rühren zu einer Dispersion verarbeitet. Die Dispersion wird stehen gelassen oder zentrifugiert, um das Sediment zu entfernen oder die Dispersion wird durch Verkneten zu einem Teig verarbeitet und vorsichtig in einem Mischer mit Wasser gewaschen, um das Sediment zu entfernen.
Wenn die obengenannte Extraktion durchgeführt wird, ist es nicht erforderlich, die Teilchengröße der Samenkörner, die Temperatur, die Eigenschaften und die Wassermenge, die Geschwindigkeit und die Dauer des Rührens und die Zentrifugierbedingungen Beschränkungen zu unterwerfen. Die Temperatur des Wassers für die Extraktion soll jedoch, der Bequemlichkeit halber, nicht mehr als 50ºC betragen, so daß die Stärke in den Getreide-Samenkörnern nicht gelatiniert. Obgleich die Wassermenge, die zugegeben werden soll, sich ändert je nach Typ und Teilchengröße der verwendeten Getreidearten, soll sie zur Erleichterung der Operation zweckmäßig 20 bis 50 Gew./Vol.-% betragen. Am Ende dieser Stufe der Operation steigt die Reinheit des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids auf etwa den 30-fachen Wert an im Falle der Weizensamenkörner, von den Limulustest-Aktivitätsdaten aus betrachtet.
2) Um eine höhere Reinheit zu erhalten, kann die überstehende Flüssigkeit auf konventionelle Weise einer Ultrafiltration unterworfen werden, um Fraktionen mit Molekulargewichten von 5000 oder weniger zu entfernen.
3) Die resultierende getrocknete Probe wird dann in destilliertem Wasser suspendiert bis zu einem Mengenanteil von 50 mg/ml, danach wird sie zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit zu sammeln.
4) Die in der obigen Stufe (3) erhaltene überstehende Flüssigkeit wird in Eiswasser gekühlt und dann wird eine Säure zugegeben, wobei ein Sediment entsteht. Dafür ist keine spezifische Säure erforderlich und es können beispielsweise verwendet werden Trichloressigsäure (nachstehend als "TCA" bezeichnet), Perchlorsäure, Trifluoressigsäure, Essigsäure oder Dichloressigsäure.
5) Dann wird die Mischung zentrifugiert, um das Sediment zu sammeln, das dann mit destilliertem Wasser gewaschen wird, und danach wird zentrifugiert, um erneut das Sediment zu sammeln.
6) Das Sediment aus der obigen Stufe (5) wird in destilliertem Wasser suspendiert und der Suspension wird ein Alkali zugesetzt, bis sich das Sediment darin löst. Auch hier ist kein spezifisches Alkali erforderlich und es können Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak, Natriumcarbonat oder Natriumacetat verwendet werden. Es sollte jedcch sorgfältig darauf geachtet werden, daß die Basizität der Suspension nicht über pH 11 hinausgeht, wenn sich das Sediment löst, um zu verhindern, daß das erfindungsgemäße Glykolipid desaktiviert wird.
7) Dann wird der Suspension eine Säure zugesetzt, um ihren pH-Wert auf 8 zu bringen, danach wird auf 37ºC erwärmt. Die weitere Zugabe einer Säure macht die Suspension basisch unter Bildung eines Sediments, das dann in einer auf 37ºC erwärmten Zentrifuge gesammelt wird.
8) Die auf diese Weise gesammelte überstehende Flüssigkeit wird auf Eis gekühlt und dann erneut bei 4ºC zentrifugiert.
9) Die überstehende Flüssigkeit wird gesammelt und dann durch Zugabe eines Alkali neutralisiert und durch Ultrafiltration auf konventionelle Weise eingeengt. Auch hier ist kein spezifisches Alkali erforderlich.
10) Dann wird das Konzentrat einer Gelfiltration auf konventionelle Weise unterworfen und die Limulustest-positiven Fraktionen werden gesammelt und miteinander vereinigt. Hier kann der Träger für die Gelfiltration beispielsweise sein Sephadex G-75, G-100, Sephacryl S-200, Sepharose 6B (die obengenannten Produkte werden alle hergestellt von der Firma Pharmacia Inc., USA), Biogel P-100 (hergestellt von der Firma Biorad Inc.), Toyo Pearl HW-50, HW-55 (hergestellt von der Firma Toyo Soda Kogyo Co., Japan). Die Pufferlösung kann irgendeine beliebige Pufferlösung sein, so lange sie innerhalb des pH-Wertbereiches von 3 bis 10 gehalten werden kann. So können beispielsweise Tris-HCl- oder Phosphat-Puffer-Lösungen verwendet werden. 11) Dann wird ein proteolytisches Enzym den vereinigten Fraktionen zugesetzt, die dann 2 h lang oder länger bei 37ºC inkubiert werden, um die verbliebenen Proteine zu zersetzen. Die so behandelte Lösung wird dann durch Ultrafiltration auf konventionelle Weise eingeengt. Auch hier ist kein spezifisches proteolytisches Enzym erforderlich und es können beispielsweise einzeln oder in beliebigen Kombinationen davon verwendet werden V8-Protease, Chymotrypsin, Trypsin oder Thermolysin. Die im Handel erhältlichen proteolytischen Enzyme, die erfindungsgemäß verwendet werden können, umfassen beispielsweise Pronase (der Firma Kaken Kagaku Co., Japan) und Proteinase (der Firma Merck Co., USA).
12) Dann werden die gesammelten Fraktionen auf konventionelle Weise behandelt, indem man sie beispielsweise einer Ionenaustauschchromatographie unterwirft unter Verwendung von Mono-Q-Sepharose oder Q-Sepharose, hergestellt von der Firma Pharmacia Inc., um die Limulustest-positiven Fraktionen zu sammeln.
13) Danach werden die Fraktionen auf konventionelle Weise einer Gelfitration unterworfen, um die entsalzten Limulustest-positiven Fraktionen zu sammeln.
Bei Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren wurden im Falle von Weizen-Samenkörnern etwa 20 % des ursprünglich vorhandenen Limulustest-positiven Materials gewonnen (abgetrennt) und es wurde eine gereinigte Probe mit einer Reinheit von etwa 95 % erhalten. Dieser Wert, der im Falle von Weizen-Samenkörnern erzielt wird, ist etwa 1000 mal so hoch wie derjenige, der am Ende der obigen Stufe (1) erhalten wurde.

Physikalische Eigenschaften des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids

Wie in den weiter unten folgenden Beispielen näher erläutert, weist eine Probe des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids mit einer Reinheit von 96 % ein Molekulargewicht von etwa 8000 ± 1000 (bei der SDS-Elektrophorese) auf, die Phosphor-Zahl beträgt 1 oder mehr pro Molekül, die Hexosamin-Zahl beträgt 6 ± 2 pro Molekül und die Fettsäure-Zahl beträgt 6 ± 2 pro Molekül.

Gelieferte Formen

Das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid kann als solches oder in bis zu dem jeweils gewünschten Grad verdünnter Form geliefert (zugeführt) werden. Außerdem kann es zur Verbesserung seiner Stabilität in Form von getrockneten Pulvern auf konventionelle Weise geliefert (zugeführt) werden, z.B. durch Lyophilisierung und Sprühtrocknung. Jede dieser Formen kann auf konventionelle Weise hergestellt werden.

Bestimmung der Immun-Stimulierung

Die Immun-Stimulierung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids wurde durch die endogene TNF-Produktions-Stimulierung, die endogene TNF-Produktivität, die Kohlenstoffentfernungs-Aktivität und die Stimulierung der Osteogenese, des Eierlegens und der Verbesserung der Schalenfestigkeit durch Stimulierung der Makrophagen-Aktivität bestätigt.

Endogene TNF-Produktions-Stimulierung und endogene TNF- Produktivität

Carswell et al. berichten, daß Primer(Starter)- und Trigger(Auslöser)-Stufen erforderlich sind, um in dem Körper eines Tieres endogene TNF zu erzeugen; vgl. "Proc. Natl. Acad. Sci. USA", 72, Seiten 3666-3670, 1975. Danach wurden viele Kandidaten-Chemikalien ausprobiert zur Stimulierung der jeweiligen Stufen. Die zum Starten der Primer- Stufe verwendete Chemikalie ist ein Primer (endogener TNF- Produktions-Stimulator), während diejenige, die zum Starten der Trigger-Stufe verwendet wird, ein Trigger (endogenes TNF-produzierendes Agens) ist. Das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid arbeitet sowohl als Primer als auch als Trigger ebenso ausgezeichnet wie Picibanil , eines der Arzneimittel, dessen Brauchbarkeit bereits anerkannt ist.
Die TNF-Aktivität wird wie nachstehend angegeben bestimmt auf der Basis der Zytotoxizität gegenüber L929-Zellen ("Procl. Natl. Acad. Sci. USA", 72, Seiten 3666-3670, 1983). L-929-Zellen werden in einem Eagles-Minimal-Essential-Medium (nachstehend lediglich als MEM bezeichnet) kultiviert, wobei 5 % fetales Kalbs-Serum (nachstehend lediglich als FCS bezeichnet) zugegeben wird, bis 100 ul des Mediums 8 x 10&sup4; Zellen enthalten, und dann werden die Zellen in einer Platte mit ebenem Boden mit 96 Vertiefungen gezüchtet.
Die Wachstumsbedingungen sind 37ºC in Gegenwart von 5 % CO&sub2; und eine Feuchtigkeit von 100 % für 2 h und die Verfahren können die gleichen sein wie bei einer konventionellen Zellkultur. Dann wird Actinomycin D dem Medium bis zu einer Endkonzentration von 1 ug/ml zugegeben und das Volumen der Kulturlösung wird auf 150 ul eingestellt. Unmittelbar danach werden 50 ul der in geeigneter Weise mit dem MEM-Medium verdünnten Probe zu der Kulturlösung zugegeben. Die ED50 kann bestimmt werden durch geeignete Einstellung der Verdünnung. Die L-929-Zellen mit einem Endvolumen von 200 ul werden für weitere 18 h unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend angegeben kultiviert (gezüchtet).
Zur Bestimmung der Zell-Nekrose-Aktivität wird zuerst das gesamte Medium entfernt, danach wird eine 1 %ige methylalkoholische Lösung zugegeben, die 0,1 % Kristallviolett enthält, um die Färbung zu fixieren. Kristallviolett färbt alle Eucariotenzellen, die toten Zellen werden jedoch vom Boden des Kolbens entfernt durch einfaches Waschen nach dem Färben; so kann die Zell-Nekrose-Aktivität direkt bestimmt werden. Der Grad der Färbung wird gemessen auf der Basis der Adsorption bei OD590 nm und mit demjenigen einer Kontrolle verglichen zur Bestimmung der Zell-Nekrose-Aktivität. Diese Aktivität ist wie folgt definiert.
Es wird die Verdünnung der Probe bestimmt, die es ermöglicht, daß 50 % der L-929-Zellen überleben (N). Als Kontrolle wird Kaninchen-TNS verwendet und seine Aktivität n (Einheiten/ml) wird bestimmt unter Verwendung von 2,4 x 10&sup6; Einheiten/mg/ml TNF-α. Es wird die Verdünnung der Kaninchen-TNS bestimmt, die eine ED50 ergibt.
Die Aktivität der Probe (Einheiten/ml) wird mittels der Gleichung N/C x n errechnet.

Kohlenstoffentfernungs-Aktivität

Es ist seit langem bekannt, daß die Entfernung von kolloidalem Kohlenstoff aus dem Blut ein Anzeichen für die Makrophagen-Aktivität ist (Nr. 5 von "Library of Bacteriological Technology", "Functions of macrophage and methods of determining them", herausgegeben vom Board of Education of Japanese Society for Bacteriology, Seite 98, publiziert von Saikon Shuppan Co., Japan, 1985). Auf diese Weise wird die Immun-Stimulierung des subkutan verabreichten Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids bestimmt auf der Basis der Entfernungsrate des intravenös verabreichten Kohlen-Stoffs als Indikation nach dem Verfahren, wie es auf den Seiten 1531 bis 1532 der August-Ausgabe von "Cancer Research" (1968), beschrieben ist.

Stimulierung der Osteogenese (Knochenbildung)

Diese Stimulierung wurde durch einen Osteolast-Aktivierungstest bestätigt.
Osteolast-Zellen sind solche, welche die Aufgabe haben, Knochengewebe zu absorbieren, die alte Knochen in dem genannten Gewebe zerstören. Die Aktivierung von Osteolast- Zellen führt zu einer kompensierenden Aktivierung von Osteoblast-Zellen, so daß die Osteogenese (Knochenbildung) die Knochenadsorption überwiegt. Als Folge davon wird, wie angenommen wird, die Osteogenese stimuliert.
In dem Osteolast-Aktivierungstest werden Parietal-Knochen eines Hühner-Embryos als experimentelle Proben verwendet. Das heißt, die Parietal-Knochen des Hühner-Embryos werden mit &sup4;&sup5;Ca markiert und in einem Medium, das einen Arzneimittel-Kandidaten enthält (behandelte Gruppe) oder in einem von dem Kandidaten freien Medium (Kontrollgruppe) kultiviert und danach wird die Menge des in den Knochen zurückbleibenden &sup4;&sup5;Ca und diejenige des während der Kultivierung in das Medium ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca bestimmt. Die &sup4;&sup5;Ca-Austrittsraten sowohl bei der behandelten Gruppe als auch bei der Kontrollgruppe werden unter Anwendung der folgenden Gleichung errechnet:
&sup4;&sup5;Ca-Austrittsrate = (Menge des ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca)/(Menge des zurückbleibenden &sup4;&sup5;Ca + Menge des ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca).
Der Effekt des Kandidaten wird durch die folgende T/C-Rate ausgedrückt:
T/C-Rate = (Menge des in der behandelten Gruppe ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca)/(Menge des in der Kontrollgruppe ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca).
Theoretisch bedeuten die Werte der T/C-Rate von mehr als 1, daß der Kandidat die erwartete Wirkung hat. Es wurde nur einer der beiden Parietal-Knochen des Embryos aus dem gleichen Hühnchen in der Kontrollgruppe verwendet, während der andere in der behandelten Gruppe verwendet wurde, wodurch eine Beeinflussung durch unterschiedliche getestete Hühner vermieden wurde.

Stimulierung des Eierlegens (Eiablage) und Verbesserung der Festigkeit der Schale

Die genannten Aktivitäten wurden bestätigt durch Bestimmung der Anzahl der Eier, die von den Hühnern gelegt wurden, denen das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid verabreicht worden war, und der Festigkeit der Schale der Eier.
Der Handel mit Eiern unterliegt der Kontrolle der Vorschriften des permanenten Vizeministers des japanischen Ministeriums für Landwirtschaft und Forsten. Nach der existierenden Vorschrift Nr. Ref. 54-Tiku-A-5136 vom 25. Dezember 1979 werden Eier klassifiziert im Hinblick auf ihr Gewicht und die Ergebnisse des Tests in bezug auf ihr Aussehen und ihre Durchlässigkeit. Darin findet sich jedoch kein Hinweis auf die Festigkeit der Schale, die als Indiz für die Verhinderung des Zerbrechens von Eiern während des Transports, der Handhabung, der Verwendung und dgl. dienen könnte. Die Vorschrift besagt lediglich, daß das äußere Verhalten einen Wert von 8,8 oder mehr aufweisen muß bei dem Test gemäß JIS (Japanese Industrial Standard)-First class-Bruchfestigkeits-Standard. Aber selbst wenn das äußere Verhalten sehr stabil ist, kann zweifellos das Zerbrechen von Eiern wegen der Vibrationen während des Transports oder der Lagerung nicht verhindert werden. Deshalb gibt es nicht wenige Fälle, in denen nur Eier mit einer Festigkeit der Schale oberhalb eines bestimmten Wertes von Großverbrauchern, wie Restaurants oder Supermärkten, gekauft werden. In diesen Fällen wird eine Festigkeit von 4 kg/cm² als ausreichend angesehen.
Bis heute sind Substanzen, Futtermittel oder dgl., die wirksam sind in bezug auf die Erhöhung der Festigkeit der Eierschale, weder entwickelt noch verkauft worden.

Verwendung des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids

Das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid kann für verschiedene Zwecke verwendet werden. Der erste Grund für die verschiedenen Verwendungszwecke beruht darauf, daß das Ausgangsmaterial ein solches ist, wie es üblicherweise von Tieren einschließlich Menschen verzehrt wird, und daß daher keine Probleme gelöst werden müssen, wenn das Glykolipid an Tiere einschließlich Menschen verabreicht wird.
Der zweite Grund besteht darin, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid in verschiedenen Formen geliefert (zugeführt) werden kann, weil es als solches oder in Form von Verdünnungen, die auf den gewünschten Grad verdünnt worden sind, oder als getrocknete Pulver zugeführt werden kann.
Der dritte Grund beruht darauf, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid billig ist.
Eine der Verwendungen des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, das die obengenannten Vorteile aufweist, ist diejenige als Immun-Stimulator oder als Veterinär-Immun-Stimulator, wobei die Immun-Stimulierung direkt ausgenutzt wird.
Als zweite Verwendung kann das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid in Immunitätsdiagnostischen Reagentien oder Veterinär-Immunitäts-diagnostischen Reagentien verwendet werden zur Prüfung der Immun-Bedingungen von Tieren einschließlich Menschen auf der Basis der Immun-Stimulierung.
Der dritte Verwendungszweck des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids umfaßt die Verwendung als Quasi-Arzneimittel, wie in "Japanese Pharmacopoeia" definiert, in Kosmetika, Nahrungsmitteln, Futtermitteln und dgl., denen das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid einverleibt worden ist, um eine Immun-Stimulierung zu induzieren. So sind beispielsweise Kosmetika mit dem erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipid verwendbar zur Verhinderung der Alterung der Haut und zur Stimulierung des Metabolismus (Stoffwechsels) und somit zum Frischhalten der Haut für einen langen Zeitraum.

Verfahren zur Herstellung der gelieferten Präparate

Jedes der obengenannten Präparate einschließlich der Immun-Stimulatoren kann auf konventionelle Weise hergestellt werden. So können beispielsweise auf konventionelle Weise Arzneimittel oder Veterinär-Arzneimittel, Immun-Stimulatoren und Veterinär-Immun-Stimulatoren in Form von oralen, intravenösen oder intramuskulären Präparaten geliefert werden, die das Limulustest-positive Pflanzenglykolipid allein oder im Gemisch mit anderen Substanzen enthalten. Außerdem sind auf der Haut viele Makrophagen vorhanden, so daß das erfindungsgemäße Limulustestpositive Pflanzenglykolipid in Form von Haut-Salben verabreicht werden kann, um bessere Effekte zu erzielen.
Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf Beispiele und Experimente näher erläutert.

Beispiel 1

1) In eine kleine Knetvorrichtung wurden eingeführt 3120 g Hartweizenmehl, enthaltend 1,09 % Asche (Hard Red Spring Wheat aus den USA oder Kanada), danach wurden 2,03 l destilliertes Wasser zugegeben und es wurde 10 min lang geknetet zur Herstellung eines Teigs. Die Mischung wurde 15 min lang stehen gelassen und dann wurden 10 l Wasser zu der Mischung zugegeben, danach wurde langsam gerührt, um eine Stärkeemulsion zu extrahieren und die löslichen Bestandteile in dem Wasser zu lösen. Die resultierende Lösung wurde 12 h lang in einem Kühlschrank bei 5ºC stehen gelassen und dann wurde das Stärke enthaltende Sediment entfernt. Die überstehende Flüssigkeit wurde lyophilisiert, wobei man 201,1 g Pulver (Pulver A) erhielt.
Dann wurden 5 l destilliertes Wasser zu dem verbliebenen Teig zugegeben, danach wurde langsam gerührt und die Mischung wurde auf die gleiche Weise wie oben behandelt, wobei man 40,1 g Pulver (Pulver B) erhielt.
2) Die Pulver A und B wurden in ein Ultrafilter HF-Labl (Amico n Co.) eingeführt und die Ultrafiltration wurde unter Verwendung einer hohlen Patrone HF-LablPM5 durchgeführt für Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 und unter Verwendung einer anderen hohlen Patrone HF-Labl PM10 für Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10 000; der Temperaturbereich betrug 5 bis 10ºC, der Druck am Einlaß betrug 25 psi (1,76 kg/cm²) und der Druck am Auslaß betrug 15 psi (1,06 kg/cm²). Als Ergebnis wurden die jeweiligen Fraktionen wie folgt benannt:
Pulver A: Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder weniger wurden als a&sub1; bezeichnet;
Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder mehr wurden als a&sub2; bezeichnet.
Pulver B: Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder weniger wurden als b&sub1; bezeichnet;
Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder mehr wurden als b&sub2; bezeichnet.
Pulver A: Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder weniger wurden als a&sub3; bezeichnet;
Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder mehr wurden als a&sub4; bezeichnet.
Pulver B: Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder weniger wurden als b&sub3; bezeichnet;
Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 10 000 oder mehr wurden als b&sub4; bezeichnet.
Jede dieser Fraktionen wurde dem Limulustest unterzogen nach dem Verfahren, wie es in dem weiter unten beschriebenen Versuch 1 näher beschrieben ist, und es wurde bestätigt, daß viele Limulustest-positiven Bestandteile in Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder mehr vorhanden sind, während wenige Limulustest-positive Bestandteile in Fraktionen mit einem Molekulargewicht von 5000 oder weniger vorhanden sind.
3) 30 g des obengenannten Pulvers a&sub2; wurden in einen 1 l Erlenmeyer-Kolben eingeführt, danach wurden 600 ml destilliertes Wasser darauf gegossen. Die resultierende Mischung wurde 60 min lang mit einem Rührer gerührt und dann 10 min lang bei 10 000 g zentrifugiert unter Verwendung einer Hitachi-Hochgeschwindigkeits-Zentrifuge SCR-20B vom Kühlungs-Typ (der Rotor RPR16 wurde vorher auf 4ºC abgekühlt), um die überstehende Flüssigkeit zu gewinnen.
4) Die überstehende Flüssigkeit aus dem obigen Abschnitt (3) wurde in einen weiteren 1 l-Erlenmeyer-Kolben eingeführt, danach wurden 20,5 ml einer 100 %igen wäßrigen TCA- Lösung, die vorher auf 2ºC abgekühlt worden war, zugetropft, während mit Eis gekühlt (die Temperatur der Lösung betrug etwa 2ºC) und mit einem Rührer gerührt wurde. Nach Beendigung des Zutropfens wurde der Kolben 10 min lang in Eiswasser stehen gelassen.
5) Danach wurde die Mischung auf die gleiche Weise wie oben bei 4ºC zentrifugiert (mit 10 000 g für 10 min), um das Sediment zu sammeln, das seinerseits zusammen mit 300 ml destilliertem Wasser unter Kühlen in Eiswasser in einen 500 ml-Becher eingeführt wurde zur Herstellung einer Suspension. Die resultierende Suspension wurde in Eiswasser gekühlt und bei 4ºC auf die gleiche Weise wie oben zentrifugiert (mit 10 000 g für 10 min), um das Sediment zu gewinnen (abzutrennen).
6) Das Sediment wurde in einen 1 l-Becher eingeführt, danach wurden 500 ml destilliertes Wasser zugegeben zur Herstellung einer Suspension. Die resultierende Suspension wurde unter Verwendung von etwa 3,5 ml 1 N Natriumhydroxid auf pH 7 neutralisiert und dann unter Kühlen in Eiswasser wurden etwa 2 ml 1 N Natriumhydroxid zu der neutralisierten Suspension zugegeben, bis eine 0,02 N Natriumhydroxid- Lösung hergestellt worden war, zum Auflösen des Sediments.
7) Etwa 1,5 ml 1 N Chlorwasserstoffsäure wurden zu der Lösung zugegeben, um den pH-Wert auf 8 zu bringen, dann wurden 100 ml destilliertes Wasser zugegeben. Die Lösung wurde in einen 1 l-Erlenmeyer-Kolben überführt, der in einem Inkubator bei 37ºC 30 min lang langsam geschüttelt wurde.
8) Die Lösung des obigen Abschnitts (7) wurde mit 30 ml einer 100 %igen wäßrigen TCA-Lösung gemischt und dann in einem Inkubator 10 min lang bei 37ºC langsam geschüttelt. Danach wurde die Lösung 10 min lang bei 3000 g zentrifugiert unter Verwendung einer Zentrifuge Tomy CD100R (der Firma Tomy Seiki Co., Japan).
9) Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt und auf Eis gekühlt und dann bei 4ºC zentrifugiert (10 min lang bei 10 000 g).
10) Die überstehende Flüssigkeit wurde gesammelt und mit etwa 3,6 ml 10 N Natriumhydroxid auf pH 7 neutralisiert und die neutralisierte Lösung wurde eingeengt unter Verwendung eines Ultrafilters (Toyo Roshi UHP-150, Filter:UK- 10, N&sub2;-Druck: 4,0 kg/cm²).
11) Das resultierende Konzentrat (60 ml) wurde einer Gelfiltation unterworfen (Puffer 10 mM Tris-HCl/10 mM NaCl (pH 7,5), Fließgeschwindigkeit: 60 ml/h), um 20 ml-Fraktionen zu sammeln unter Verwendung einer Sepharose 6B- Säule (hergestellt von der Firma Pharmacia Inc., Säulengröße: 5 cm (Innendurchmesser) x 100 cm (2 l)).
12) Die 43. bis 56. Fraktion wurden miteinander vereinigt zur Herstellung von 280 ml einer Lösung, danach wurden 450 ug Pronase E (der Firma Kaken Kagaku Co., Japan) zugegeben und 2 h lang unter Schütteln auf 37ºC erwärmt. Danach wurde die Mischung eingeengt unter Verwendung eines Ultrafilters (Toyo Roshi UHP-62, Filter: UK-10, N&sub2;-Druck: 4,0 kg/cm²). Dann wurde dar Konzentrat einer Anionenaustauschchromatographie unterworfen unter Verwendung des FPLC-Systems (hergestellt von der Firma Pharmacia Inc., Säule: Mono Q HR 10/10). Das heißt, die Probe wurde auf die Säule aufgegeben unter Verwendung einer Pufferlösung, die 10 mM Tris-HCL (pH 7,5) und 10 mM NaCl enthielt, und dann wurde die Säule mit 20 ml einer Flüssigkeit gewaschen, die 165 mM NaCl zusätzlich zu den Komponenten der obengenannten Pufferlösung enthielt. Danach wurden insgesamt 400 ml des Eluats verwendet, um das gewünschte Glykolipid zu eluieren, während die NaCl-Konzentration so erhöht wurde, daß der NaCl-Konzentrations-Gradient in dem Bereich von 165 mM bis 1 M lag. Es wurden 2 ml-Fraktionen gesammelt. Die 5. bis 8. Fraktion nach dem Start des Konzentrations-Gradienten, die sich als Limulustest-positiv erwiesen, wurden miteinander vereinigt unter Bildung von 8 ml Glykolipid mit einer Reinheit von etwa 92 % (Glykolipid: 3,03 mg (ausgedrückt als E. coli LPS nach dem Limulustest; das gleiche gilt für die nachstehenden Angaben), Zucker: 0,23, Protein: 0,04).
13) Dann wurden die 8 ml einer Gelfiltration unterworfen (Puffer: Wasser) unter Verwendung von Sephadex G-25 (Säule: 2,0 cm (Innendurchmesser) x 20,2 cm (66 ml)), wobei 3 ml-Fraktionen gesammelt wurden. Die 9. bis 12. Fraktion, die sich als Limulustest-positiv erwiesen, wurden miteinander vereinigt, unter Bildung von 12 ml Glykolipid mit einer Reinheit von etwa 95 % (Glykolipid: 2,7 mg, Zucker: 0,18, Protein: 0,03). Der Zuckergehalt wurde nach dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren bestimmt, während der Proteingehalt nach dem Lowry-Verfahren bestimmt wurde. Die vereinigten Fraktionen waren sauer, was durch Anionenaustauschchromatographie bestätigt wurde. Das Molekulargewicht gemäß der SDS-Elektrophorese betrug 6000 bis 10 000.
14) Die obigen Fraktionen wurden bei -80ºC eingefroren und dann bis zu einem konstanten Gewicht lyophilisiert, das 0,75 mg betrug. Nachstehend wird diese lyophilisierte Probe lediglich als CHF bezeichnet.
Die Limulus-Aktivität dieses CHF wurde zu 2,7 mg bestimmt nach dem Verfahren, wie es im weiter unten beschriebenen Versuch 1 beschrieben ist, so daß seine spezifische Aktivität zu 3,6 (2,7 : 0,75) errechnet wurde. Es wird angenommen, daß mit den obengenannten Reinigungsverfahren praktisch alle freien Zucker, die als Verunreinigungen vorhanden waren, entfernt worden waren, so daß die nachgewiesenen Zucker als solche angesehen werden, die das Glykolipid CHF aufbauen. Die Reinheit des CHF auf der Basis des Gewichts in dieser Stufe kann somit wie folgt errechnet werden:
Proteingehalt: 0,03 mg
Glykolipidgehalt: 0,72 mg (0,75 - 0,03)
Reinheit = 0,72/0,75 x 100 = 96 (%).

Physikalische Eigenschaften von CHF

15) Molekulargewicht

CHF wurde in destilliertem Wasser gelöst zur Herstellung einer 1 mg/ml Lösung von CHF und 4 ul der Lösung wurden in ein 1,5 ml-Treff-Röhrchen eingeführt. Getrennt davon wurden 2,5 % SDS, 5 % Mercaptoethanol und 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) zu 1 mM EDTA zugegeben zur Herstellung von 1 ul einer SDS-Behandlungslösung, und diese Lösung wurde zu der obigen Lösung in dem Treff-Röhrchen zugegeben, das dann 3 min lang in siedendes Wasser eingetaucht wurde. In den Elektrophorese-Versuchen wurde das Phast-System der Pharmacia Inc. verwendet. Das heißt, 1 ul der Mischung wurde auf ein Gel aufgegeben (Phast-Gel-Gradient 8-25 der Firma Pharmacia Inc.), das über einen SDS-Puffer-Streifen der Firma Pharmacia Inc. mit den Elektroden verbunden war, die maximale Potentialdifferenz und der maximale elektrische Strom wurden auf 250 V bzw. 10 mA eingestellt und dann wurde die Elektrophorese gestartet. Am Ende der Elektrophorese wurden das Verhalten bei der Coomassie-Färbung und bei der Silber-Färbung beobachtet.
Für die Coomassie-Färbung wurde Phast Gel Blue R als Färbelösung verwendet und als Entfärbelösung wurde eine Mischung von Methanol, Essigsäure und destilliertem Wasser (Volumenverhältnis 3:1:6) verwendet. Das Färben und Entfärben wurden in der folgenden Reihenfolge durchgeführt:
1) 8 min lang gefärbt bei 50ºC,
2) 5 min lang gefärbt bei 50ºC,
3) 8 min lang gefärbt bei 50ºC,
4) 10 min lang entfärbt bei 50ºC,
5) 5 min lang geschützt bei 50ºC (eine Mischung von Glycerin, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 5:10:85),
6) getrocknet.
Die Silbverfärbung wurde in der folgenden Reihenfolge durchgeführt:
1) 2 min lange Behandlung bei 50ºC mit einer Waschflüssigkeit (Mischung von Ethanol, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 5:1:4),
2) 2 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (eine Mischung von Ethanol, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 10:5:85),
3) 4 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (Mischung von Ethanol, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 10:5:85),
4) 6 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Sensibilisierungslösung (8,3 % Glutardialdehyd),
5) 3 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (eine Mischung von Ethanol, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 10:5:85),
6) 5 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (Mischung von Ethanol, Essigsäure und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 10:5:85).
7) 2 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (entionisiertes Wasser),
8) 2 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (entionisiertes Wasser),
9) 13 min lang bei 40ºC behandelt mit einer 0,25 gew./vol.-%igen Silbernitratlösung,
10) 30 s lang bei 30ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (entionisiertes Wasser),
11) 30 s lang bei 30ºC behandelt mit einer Waschflüssigkeit (entionisiertes Wasser),
12) 30 s lang bei 30ºC behandelt mit einem Entwickler (0,04 Vol./Vol.-% Formaldehyd + 2,5 Gew./Vol.-% Natriumcarbonat als Waschflüssigkeit),
13) 4 min lang bei 30ºC behandelt mit einem Entwickler (0,04 Vol./Vol.-% Formaldehyd + 2,5 Gew./Vol.-% Natriumcarbonat als Waschflüssigkeit),
14) 2 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Reaktionsabstoppungslösung (5 Vol./Vol.-% Essigsäure),
15) 3 min lang bei 50ºC behandelt mit einer Schutzlösung (eine Mischung von Essigsäure, Glycerin und destilliertem Wasser in einem Volumenverhältnis von 10:8:85), und
16) getrocknet.
Das Glykolipid wurde einer Silberfärbung unterzogen, jedoch keiner Coomassie-Färbung. Diese Differenz wurde berücksichtigt bei der Beobachtung der gefärbten Banden und die gefärbte Hauptbande von CHF wurde in einer Position gefunden, die ein Molekulargewicht von 8000 ± 1000 anzeigt. In entsprechender Weise wurden die gefärbten Banden von E. coli LPS in aufeinanderfolgenden Linien (Frequenzen) beobachtet und das Molekulargewicht der gefärbten Banden mit der höchsten Farbdichte wurde auf 30 000 ± 5000 geschätzt. Im Falle von B. pertussis wurden die gefärbten Banden mit den höchsten Farbdichten an Stellen beobachtet, die Molekulargewichte von 6000 ± 1000 und 9000 ± 1000 anzeigen.

16) Phosphorgehalt

Der obengenannte Gehalt wurde nach dem Chen-Toribara- Verfahren bestimmt (Chen et al, "Analytical Chemistry", Band 28, Seiten 1756-1758, 1956).
CHF wurde in destilliertem Wasser gelöst zur Herstellung von 20 ul einer Lösung, die 25 ug CHF enthielt, die dann in ein kleines Teströhrchen eingeführt wurde. Zu der Mischung wurden 20 ul 50 vol./vol.%-ige Perchlorsäure zugegeben und dann wurde die Mischung 1 min lang auf einem Gasbrenner erhitzt, um sie zu veraschen. Danach wurden 0,5 ml destilliertes Wasser und dann 0,5 ml eines Reaktions-Reagens (ein Teil des Präparats, hergestellt durch Mischen von 1 ml 6 N Schwefelsäure, 2 ml destilliertem Wasser, 2 ml 2,5 gew./vol.-%igem Ammoniummolybdat und 1 ml 10 vol./gew.%-iger Ascorbinsäure) zu der erhitzten Mischung zugegeben, die dann 30 min lang bei Raumtemperatur stehen gelassen wurde. Anschließend wurde die Absorption bei 820 nm (OD&sub8;&sub2;&sub0; nm) bestimmt. Als Standardprobe zur Erstellung der Eichkurve wurde Kaliumdihydrogenphosphat (hergestellt von der Firma Wako Jun-yaku Co., Japan) mit Wasser verdünnt zur Herstellung von 0,5 ml-Lösungen, die 2,5 ug, 1 ug, 0,25 ug oder 0 ug des Standards, ausgedrückt als Phosphor, enthielten. In diesem Zusammenhang entsprechen 1 g Phosphor 4,39 g Kaliumdihydrogenphosphat. Die beobachteten Effekte sind in der nachstehenden Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1 Proben Kaliumdihydrogenphosphat (ausgedrückt als Phosphor: ug) CHF (Daten von 4 Proben) (Phosphor-Gehalt, errechnet unter Berücksichtigung der Eichkurve:ug) Fußnote: Die CHF-Daten sind modifiziert durch subtrahieren der Werte der Kontrolle, die keiner Erhitzung unterworfen wurde, von den beobachteten Werten, um das Auftreten von Fehlern als Folge des Einmischens von anorganischem Phosphor aus beispielsweise der Phosphatpufferlösung zu vermeiden.
Unter der Annahme, daß das Molekulargewicht von CHF 8000 beträgt, wird die Phosphor-Zahl in CHF errechnet zu 1 bis 4 pro Molekül unter Anwendung der folgenden Gleichung auf der Basis der in der obigen Tabelle angegebenen Daten:
Phosphorgehalt x 10&supmin;&sup6; x Molekulargewicht/[25 x 10-6] x 1/32
Zur Erläuterung dessen, warum die Phosphor-Zahl in dem Bereich von 1 bis 4 liegt, kann man annehmen, daß die Phosphorsäure(n) als Folge des Einmischens der Monophosphoesterase in der Reinigungsstufe eliminiert sein kann (können).
In entsprechender Weise wurde die Phosphor-Zahl von E. coli LPS (das Molekulargewicht wurde angenommen zu 30 000) und von B. pertussis LPS (das Molekulargewicht wurde angenommen zu 8000) zu etwa 12 bzw. 5 pro Molekül bestimmt.

17) Hexosamingehalt

Der obengenannte Gehalt wurde nach dem Elson-Morgan- Verfahren wie folgt bestimmt ("Library of Biochemical Experiments" Nr. 4, S. 377-379, Tokyo Kagaku Dojin Shuppan Co., Japan).
CHF wurde in destilliertem Wasser gelöst zur Herstellung einer Lösung, die 1 mg/ml CHF enthielt, und eine 100 ul-Portion davon wurde in ein Teströhrchen mit einer Schraubkappe (hergestellt von der Firma Iwaki Glass Co., Japan) eingeführt, danach wurden 100 ul 8 N HCl zugegeben und die Mischung wurde 16 h lang auf 110ºC erhitzt und dann wurden etwa 200 ul 4 N NaOH zu der Mischung zugegeben, um den pH-Wert auf 7 zu bringen. Eine 100 ul-Portion der Mischung wurde abgetrennt und in ein anderes Test- Röhrchen mit einer Schraubkappe eingeführt, danach wurden 200 ul des nachstehend erläuterten Reagens A zugegeben. Die Mischung wurde dann 1,5 h lang auf 105ºC erhitzt und dann mit laufendem Wasser gekühlt. Danach wurde eine 100 ul-Portion der Mischung abgetrennt, woran sich die Zugabe von 670 ul 96 %igem Ethanol und danach von 67 ul des nachstehend erläuterten Reagens B anschlossen, und dann wurde eine Stunde lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, danach wurde die Adsorption bei 535 nm bestimmt. Als Standardprobe zur Herstellung der Eichkurve wurden 0,20 bis 200 ug/ml N-Acetyl-glukosamin (Wako Jun-yaku Co., Japan) verwendet.
Reagens A: hergestellt durch Mischen von 75 ul Acetylaceton und 2,5 ml von 1,25 N Natriumcarbonat
Reagens B: hergestellt durch Mischen von 1,6 g p-Dimethylbenzaldehyd, 30 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure und 30 ml 96 %igem Ethanol
Als Ergebnis betrug die Hexosamin-Zahl in CHF 6 ± 2 pro Molekül, wobei angenommen wurde, daß sein Molekulargewicht 8000 beträgt. In entsprechender Weise wurde die Hexosamin-Zahl in E. coli LPS (es wurde angenommen, daß das Molekulargewicht 30 000 beträgt) und in B. pertussis LPS (es wurde angenommen, das das Molekulargewicht 8000 beträgt) zu 45 ± 6 bzw. 16 ± 2 bestimmt.

17) Fettsäuregehalt

Zu 90 ul einer Lösung von CHF in destilliertem Wasser, die 1 mg/ml CHF enthielt, wurden 10 ul eines internen Standards (0,55 mM Margarinsäure) zugegeben, woran sich die Zugabe von 1,0 ml 0,5 M Natriummethylat für die Hydrolyse und Veresterung von Fettsäureestern anschloß. Die Mischung wurde 1 h lang bei Raumtemperatur stehen gelassen, dann wurden zur Neutralisation 960 ul 0,5 N HCl zugegeben. Zu der Mischung wurden 2 ml Hexan zugegeben, dann wurde 15 min lang stark gerührt. Anschließend wurde die resultierende Mischung 5 min lang bei 1000 g zentrifugiert, um die Hexan-Schicht abzutrennen. Das Hexan wurde mittels Stickstoffgas verdampft und die Schicht wurde auf etwa 20 ul eingeengt. Das resultierende Konzentrat wurde einer Gaschromatographie unterworfen (GC8APF, hergestellt von der Firma Shimaz & Co., Japan; Kapillarvolumen: FSCAP Sp2330, hergestellt von der Firma Spelco Co., Kanada; Trägergas: Stickstoff), um den Fettsäuregehalt zu bestimmen. Als Standard für die Bestimmung des Fettsäuregehaltes wurde verwendet LA-15-PP vom E. coli-Typ, ein synthetisches Lipid A, hergestellt von der Firma Dai-ichi Kagaku Yakuhin Co., Japan, das bekanntlich ein Molekulargewicht von 2000 und eine Fettsäure-Zahl von 6 pro Molekül aufweist.
Als Ergebnis betrug die Fettsäure-Zahl in CHF 6 ± 2 pro Molekül, wobei man annahm, daß sein Molekulargewicht 8000 beträgt.
In entsprechender Weise wurde die Fettsäure-Zahl von E. coli LPS (wobei angenommen wurde, daß das Molekulargewicht 30 000 beträgt) und von B. pertussis LPS (wobei angenommen wurde, daß das Molekulargewicht 8000 beträgt) zu 18 bzw. 5 pro Molekül bestimmt.
Die bei der obengenannten Gaschromatographie beobachteten Diagramme sind in den beiliegenden Figuren 1 bis 3 dargestellt. Die Fig. 1 zeigt das Diagramm von CHF, die Fig. 2 zeigt das Diagramm von E. coli LPS und die Fig. 3 zeigt das Diagramm von B. pertussis LPS. Die den Haupt- Peaks, wie sie in den Fig. 1 bis 3 dargestellt sind, entsprechenden Retentionszeiten (Minuten) sind folgende: Peak-Nr. Retentionszeit (min) Fig.
Aus einem Vergleich der Figuren 1 bis 3 geht hervor, daß CHF und E. coli LPS ähnliche Diagramme ergeben, während das Diagramm von CHF deutlich verschieden ist ovn demjenigen von B. pertussis LPS.

Versuch 1: Quantitative Bestimmung des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids

Die quantitative Bestimmung des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, das in verschiedenen Pflanzen enthalten war, wurde durchgeführt unter Verwendung des Toxicolor-Systems, erhältlich von der Firma Sei-Kagaku Kogyo Co., Japan.
1) Destilliertes Wasser für die Injektion wurde in eine Platte mit einem ebenen oder runden Boden, die 96 Vertiefungen aufwies, in einem Mengenanteil von 180 ul pro Vertiefung gegossen. 20 ul der Testprobe (wenn die Probe ein Feststoff ist, wird er in destilliertem Wasser für die Injektion gelöst) wurden in eine der Vertiefungen der Platte eingeführt. Das Pipettieren wurde durchgeführt, während mit einem Plattenmischer gerührt wurde, zur Herstellung einer 10-fachen Verdünnung; danach können 20 ul-Portionen der jeweiligen verdünnten Proben nacheinander gesammelt werden zur Herstellung von 10-Fach-Reihen-Verdünnungen, die umfassen eine 100-fache, eine 1000-fache Verdünnung und dgl.
Außerdem kann der Grad der Verdünnung je nach Wunsch geändert werden durch Einstellung der quantitativen Rate des destillierten Wassers für die Injektion, bezogen auf die Probe.
2) Als interner Standard wurde eine 100 000-fache Verdünnung einer 1,5 ug/ml E. coli enthaltenden Lösung hergestellt und verwendet zur Bestätigung, daß das Verdünnungsverfahren und das chromogene Verhalten des Limulustests normal waren.
3) 35 ul der in dem obigen Abschnitt (1) erwähnten 10- fachen Verdünnung wurden in eine Vertiefung einer anderen Platte eingeführt, danach wurden 35 ul des LS-1-Sets des Toxicolor-Systems, im Handel erhältlich von der Firma Sei-Kagaku Kogyo Co., Japan, zugegeben. Die Mischung wurde 30 min lang bei 37ºC stehen gelassen, dann wurden 105 ul wäßrige 1 M Essigsäure zu der Mischung zugegeben, um die Reaktion zu beenden. Die Extinktion dieser Probelösung wurde bei einer Wellenlänge von 415 nm bestimmt unter Verwendung von Plate Reader MTP-100, eines Extinktions-Meßgerätes für 96 Vertiefungen, hergestellt von der Firma Corona Denki Co., Japan. Als Hintergrund wurde destilliertes Wasser verwendet und es wurden 32 pg/ml des ET-1-Sets des Toxicolor-Systems der Firma Sei-Kagaku Kogyo Co., Japan, verwendet zur Erstellung einer Eichkurve. Diese Eichkurve wurde als Basis zur Bestimmung der Menge des Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids der jeweiligen Testproben verwendet; es wurde angenommen, daß die Extinktion von destilliertem Wasser 0 beträgt.
Die Versuche wurden wiederholt mit anderen Verdünnungen, wenn der Wert nicht mehr innerhalb eines Bereiches von 10 bis 45 pg/ml lag, weil die Farbdichte, wie bestätigt wurde, von dem Gehalt an dem Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids innerhalb des genannten Bereiches abhängt für den Fall, daß das obengenannte LS-1-Set verwendet wurde.
Die quantitative Bestimmung der verdünnten Probe wurde aus der folgenden Gleichung errechnet:
(auf der Eichkurve ermittelter Wert) x (Grad der Verdünnung).
Die Ergebnisse der Versuche sind in der Tabelle 2 angegeben, in der Feststoffproben in den Einheiten ng/g und Flüssigkeitsproben in den Einheiten ng/ml angegeben sind.
In der Tabelle sind die in der Proben-Spalte angegebenen Firmen und Orte die Lieferanten und die Wachstumsgebiete der jeweiligen Proben. Die Proben ohne diese Hinweise wurden von dem Nakano-cho-Zweig des Supermarkts Chujitsuya in Tsukui-gun in Kanagawa, Japan, gekauft und ihre Hersteller konnten nicht identifiziert werden. Tabelle 2 Probe (Feststoff) Gehalt an Limulustestpositivem Glykolipid (ng) Gymnospermae Pinus spp. (Konan Boeki Co., Japan) Monocotyledonoeae Hartweizen-Samenkörner (Chiba Flour Milling Co., Ltd., Japan) Hartweizen-Samenkörner (MG 5000 or mehr) (Chiba Flour Milling Co., Ltd.) Hartweizen-Mehl (Chiba Flour Milling Co., Ltd.) Weizenkleie (MG 5000 oder mehr) (Chiba Flour Milling Co., Ltd.) Weizenkeim (Chiba Flour Milling Co., Ltd.) Weizenkeim (MG 5000 oder mehr) (Chiba Flour Milling Co., Ltd.) unpolierter Reis Reismehl (MG 5000 oder mehr) (Hinomoto Koku-fun Co., Japan) Reiskleie Reiskleie (MG 5000 oder mehr) Maismehl (MG 5000 oder mehr) (Taiyo Shiro Co, Japan) Maiskleienmehl (MG 5000 oder mehr) (Taiyo Shiro Co, Japan) Mais (Wako Shokuryo Co, Japan) Gramineae Sasa (Sekimoto Bussan Co., Japan) Iridaceae Iris (Samenkörner) Knoblauch (Wurzelknolle) Spargel (Trieb, Sproß) Zingiber mioga (Blüte) ul Coix Lacryma-jobi L. var. Ma-yuen Slapf (Uchida Wakan-yaku Co., Japan) Pinella ternata (Thunb) Breitenbach (Maatsu-ura Yakugyo Co, Japan) Ophiopogon Japonicus Ker-Gawl. var.genuinus Maxim. O. japonicus Ker-Gawl. (Tochigi Tenkaido Co., Japan) Turmeric (SB Shokuhin Co., Japan) Dicotyledoneae Sojabohne (Sanjo Shokuhin Co., Japan) Sojabohne (MG 5000 oder mehr) (Hokuren Co, Japan) "Adzuki"-Bohne (Wako Shokuryo Co, Japan) "Adzuki"-Bohne (MG 5000 oder mehr) (Wako Shokuryo Co.,) Sau-Bohne (roh) Kartoffel (MG 5000 oder mehr) (Hokuren Co.) Japanische Mispel (Samenkorn) Avocado (Samenkorn) Pfirsisch (Samenkorn) Walnuß (Samenkorn) Sau-Bohne (Samenkorn) Kürbis (Samenkorn) Tomate (rohe Frucht) "Kaiware daikon", (Japanischer Rettich) (mit Ausnahme der Wurzel) Actinidia polygama Maxim. (Marukyu bussan Co., Japan) Gynosiemma pentaphyllum (Thunb.)Makino (K.K. Sakurai, Japan) Houttuynia cardata Thunb (bezogen auf das Gewicht) (Medizinischer Pflanzengarten, der zur Telkyo Universität in Japan gehört) Weißer Pfeffer (SB Shokuhin Co.,) Capsicum annuum L. (Konan Boeki Co., Japan) Illicium verum Hook. fil. (Konan Boeki Co.) Muskatnuß (Lion Co., Japan) Saure Orange (Uchida Wakanyaku Co.,) Kudzu-Wein (Tochigi Tenkaido Co.,) Glycyrrhiza glabra L. var. glandulifera Regal et Herder (Uchida Wakanyaku Co.,) Karotte (Uchida Wakanyaku co.,) Seseli libanotis Koch var. daucifolia DC. (Tochigi Tenkaido Co.) Sinomenium acutum Rehd. et Wils (Tochigi Tenkaido Co.) Uncaria rhynchophylla Miq. Ourouparia rhynchophylla Matsum (Uchida Wakanyaku Co.) Pteridophyta Schachtelhahn (bezogen auf das Naßgewicht) (medizinischer Pflanzengarten, der zur Teikyo Universität in Japan gehört) Königsfarn (Sekimoto Bussan Co., Japan) Algae Undaria pinnatifida suringar (Sanriku-Distrikt in Japan) Sproß von Undaria pinnatifida Suringar Hijikia fusiformis (roh) Sproß von Hijikia fusiformis (Sho-zen Hon-ten, Japan) Kelb(Tang) (Yamato Takahasi Co., Japan) Asakusa-Laver (Purpurtang) (getrockneter roher Laver) Chlorella (Healstar Japan YS Co., Japan) (Mannan foods YS co., Japan) Fungi Lentinus edodes Sing. Cortinellus shiitake P. Henn. (Shimonita in Shizuoka, Japan) Winter-Pilz (Nakano City in Nagano, Japan) Lyophyllum shimeji (Seta-gun, Miyagi-machi in Gumna, Japan) Polyporales grifuola (Ohtone in Japan) Pilz (Champignon) Judasohr Pholiota nameko Brauereihefe Cordyceps sinensis Sacc., Cordyceps sobolifera Probe (Flüssigkeit) Limulustest-positives Glykolipid (ng) Bier Kirin's FINE PISLNER LAGERBIER HEARTLAND FEIN-DRAFT Asahi's SUPER YEAST Wein Suntory's Ste. Neige (weiß) (rot) Cidre (Apfel) Sake (japanischer Schnaps) Ozeki, erste Qualität (Ozeki Shuzo Co.,) Kizakura, zweite Qualität (Kizakura Shozu Co.) Taikan Ginjo, zweite Qualität (Gyokusendo Shuzo Co.,) Sake aus unpoliertem Reis Hibi Ikkon (Ozeki Shuzo Co.) Kräuter-Schnaps Totoshu DELCUP (Totoshu Honpo Co., Japan) Shochu(japanischer destillierter Schnaps minderer Qualität) TAKARA SHOCHU (Takara Shuzo Co., Japan) Andere KYOLEOPIN (Wakunaga Seiyaku Co., Japan) Knoblauch-Extrakte (Wakunaga Seiyaku Co., )

Versuch 2

A. Bestimmung der endogenen TNF-Produktions-Stimulierung

1) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, welche die jeweiligen Testproben als Primer enthielt, wurden in 7 Wochen alte weibliche C3H/He-Mäuse über die Caudalvene injiziert; jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g. 3 h später wurde 1 KE von OK-432 als Trigger über die Caudalvene an die Tiere verabreicht. Unter "KE" ist eine klinische Einheit zu verstehen und 1 KE entspricht der Menge eines Präparats, das 0,1 mg getrocknete Zellen enthält. 2 h später wurde das Serum gesammelt, um seine TNF-Aktivität zu bestimmen auf der Basis der Toxizität für L929-Zellen. Die Ergebnisse, die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechnet wurden, sind in der Fig. 4 angegeben.
Aus der Fig. 4 geht hervor, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid den gleichen Grad der endogenen TNF-Produktions-Stimulierung wie OK-432 aufweist. Es wird ferner angenommen, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid die maximale Stimulierung der endogenen TNF-Produktion bei einer bestimmten Menge bewirkt.
2) Getrennt davon wurden die jeweiligen Testproben als Primer oral den jeweiligen Gruppen verabreicht, die aus drei Mäusen (7 Wochen alte weibliche C3H/He-Mäuse, Durchschnittsgewicht 25 g) bestanden. Jede der Testproben wurde in 200 ul destilliertem Wasser gelöst und dann mittels einer Oralsonde direkt in den Magen verabreicht und dann auf die gleiche Weise wie oben im Falle der intravenösen Verabreichung behandelt. Die als Durchschnittswert aus drei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der Fig. 5 angegeben.
Die Fig. 5 zeigt, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid die Produktion von endogenem TNF auch dann stimuliert, wenn es oral verabreicht wird.
3) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die verschiedene Mengenanteile des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers A-a&sub2; als Primer enthielt, wurde über die Caudalvene 12 Wochen alten männlichen C3H/He-Mäusen injiziert; jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 29 g. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, in der 1,0 oder 3,0 KE OK-432 gelöst waren, als Trigger über die Caudalvene den Tieren verabreicht. 2 h später wurde das Serum gesammelt, um seine TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität für L929-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse, die als Durchschnittswert von 3 Werten pro Gruppe errechnet wurden, sind in der Fig. 6 dargestellt.
Aus der Fig. 6 geht hervor, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid die maximale Stimulierung der endogenen TNF-Produktion in einer bestimmten Menge bewirkt.
4) Getrennt davon wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die das in Beispiel 1 erhaltene Pulver A-a&sub2; als Primer enthielt (ausgedrückt als E. coli LPS, es war 1 ug des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids darin enthalten) wurde über die Caudalvene 9 Wochen alten männlichen C3H/He-Mäusen injiziert. Jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 27 g und dem Pulver A-a&sub2;. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, in der 1,0 oder 3,0 KE OK-432 gelöst waren, als Trigger über die Caudalvene den Tieren verabreicht. 2 h später wurde das Serum gesammelt, um seine TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse, die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechnet wurden, sind in der Fig. 7 dargestellt, in der die Abszisse das Verabreichungsintervall des Primers und des Triggers angibt.
Aus der Fig. 7 geht hervor, daß das Verabreichungsintervall des Primers und des Triggers so eingestellt werden sollte, daß eine maximale Stimulierung der endogenen TNF- Produktion erzielt wird.

B. Bestimmung der endogenen TNF-Produktivität

1) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die das in Beispiel 1 erhaltene Pulver A-a&sub2; als Primer (ausgedrückt als E. coli LPS; es waren 1 ug des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids darin enthalten) enthielt, oder nur einer physiologischen Salzlösung (Kontrollgruppe) wurden über die Caudalvene in 9 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 27 g. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, in der 0 bis 10 mg des Pulvers A-a&sub2; gelöst waren, als Trigger über die Caudalvene den Tieren verabreicht. 1 h nach der Verabreichung des Triggers wurden das Serum, die Leber- die Milz und die Lunge isoliert, um die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse, die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechnet wurden, sind in der Fig. 8 dargestellt, in der die Daten des Serums links oben, die Daten der Leber, der Milz und der Lunge rechts oben, links unten bzw. rechts unten dargestellt sind.
Aus der Fig. 8 geht hervor, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid auch als Trigger verwendbar ist.
2) Getrennt davon wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die 1000 Einheiten irgendeiner der in der nachstehenden Tabelle 3 angegebenen verschiedenen TNF als Primer enthielt, oder nur einer physiologischen Salzlösung (Kontrollgruppe) über die Caudalvene in 9 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 29 g. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, in der 1 mg des erfindungsgemäßen Pulvers gelöst war, wie es in Beispiel 1 erhalten worden war, über die Caudalvene als Trigger den Tieren verabreicht. Nach der Verabreichung des Triggers wurde das Serum gesammelt, um die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die Ergebnisse, die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechnet wurden, sind in der Fig. 9 dargestellt. Tabelle 3 Verwendete Primer (beschrieben in Beispiel 1 der japanischen Patentanmeldung Nr. HEI 1-95784) Maus-TNF-α ("Procl. Natl. Acad. Sci. USA", 82, Seiten 6060-6064, 1985) Thymosin β4/TNF-Sam1 ("Biochemistry International", Band 18, Nr. 3, Seiten 501-508, 1989).
Aus der Fig. 9 geht eindeutig hervor, daß die endogene TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustestpositiven Pflanzenglykolipids auf etwa das 30-fache des ursprünglichen Wertes ansteigt, wenn TNF als Primer (Starter) verwendet wird.
3) Getrennt davon wurden 200 ul (2 x 10&sup5; Zellen) pro Vertiefung Makrophagen-Peritoneal-Zellen von Mäusen in eine Platte mit ebenem Boden mit 96 Vertiefungen eingeführt und es wurden 10 ul rekombinantes IFN-γ (100 Einheiten/ml) als Primer in die jeweiligen Vertiefungen eingeführt. 3 h später wurden als Trigger 10 ul/Vertiefung des erfindungsgemäßen Pulvers A-a&sub2;, wie es in Beispiel 1 beschrieben worden ist (2 mg/ml), oder E. coli LPS (1 ug/ml) zugegeben und anschließend 2 h lang kultiviert. Es wurde eine Pipette verwendet zum Sammeln von 130 ul der überstehenden Flüssigkeit aus den jeweiligen Vertiefungen und es wurde die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L-929-Zellen bestimmt. Die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der Fig. 10 dargestellt. In der Fig. 10 steht o für die Daten des Pulvers A-a&sub2; des Beispiels 1, bei dem es sich um einen Vertreter des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids handelt, steht für die Daten von E. coli LPS. Außerdem steht für die direkte Toxizität des Pulvers A-a&sub2; und von E. coli LPS gegenüber L929-Zellen; die Werte betrugen in den beiden Fällen 0.
Aus der Fig. 10 geht hervor, daß die endogene TNF- Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids auf dem gleichen Niveau liegt wie diejenige von E. coli LPS.
Die Fig. 11 zeigt eine Wahrscheinlichkeitsanalyse der endogenen TNF-Produktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids, wie es in Fig. 10 dargestellt ist, wobei der Gehalt des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids unter Anwendung des Limulustests bestimmt wurde.
Die Fig. 11 beweist, daß der Gehalt an dem erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipid in enger Korrelation steht zu der endogenen TNF-Produktivität und daß daher kein Zweifel besteht, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid eine endogene TNF-Produktivität besitzt.

C. Einfluß der Differenz auf die endogene TNF-Produktions-Stimulierung und die TNF-Produktivität

1) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die 1 oder 3 ug CHF (ausgedrückt durch die Limulusaktivität) enthielt, wurde über die Caudalvene in 7 Wochen alte männliche C3H/He-Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus 2 Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g. 1 h später wurde das Serum gesammelt, um die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die als Durchschnittswert von zwei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 4 angegeben. Tabelle 4 Trigger TNF-Aktivität (Einheiten/ml) Physiologische Salzlösung (Kontrolle) Pulver A-a&sub2;
2) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die als Primer 1 ng (ausgedrückt durch die Limulusaktivität) CHF enthielt, von dem angenommen wurde, daß es drei Phosphoratome pro Molekül enthielt, oder nur einer physiologischen Salzlösung wurden über die Caudalvene in 7 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus 2 Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die 1 KE OK-432 gelöst enthielt, ebenfalls über die Caudalvene injiziert. 2 h später wurde das Serum gesammelt, um die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929- Zellen zu bestimmen. Die als Durchschnittswert von zwei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 5 angegeben. Tabelle 5 CHF-Dosis (P-Zahl: 3/mol) als Primer (ng) TNF-Aktivität (Einheiten/ml)
3) 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die als Primer 1 ng (ausgedrückt durch die Limulusaktivität) CHF enthielt, von dem angenommen wurde, daß es drei Phosphoratome pro Molekül enthielt, oder 1 ng E. coli LPS wurden über die Caudalvene in 7 Wochen alte männliche BALB/c- Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus 2 Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 25 g. 3 h später wurden 0,2 ml einer physiologischen Salzlösung, die 1 ug (ausgedrückt durch die Limulusaktivität) CHF oder 1 ug E. coli LPS als Trigger darin gelöst enthielt, ebenfalls über die Caudalvene injiziert. 1 h nach der Injektion des Triggers wurde das Serum gesammelt, um die TNF-Aktivität auf der Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die als Durchschnittswert von zwei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 6 angegeben. Tabelle 6 Probe TNF-Aaktivität (Einheiten/ml) E.Coli LPS-E.Coli LPS
Aufgrund der in den Tabellen 4 und 6 angegebenen Ergebnisse scheint es, daß die Anwesenheit mindestens eines Phosphoratoms ausreicht, um eine Abnahme der TNF-Produktions-Stimulierung und Produktivität zu verhindern.

Versuch 3: Bestimmung der lokalisierten Produktion von TNF

Das Pulver A-a&sub2; wurde in einer physiologischen Salzlösung suspendiert zur Herstellung von 0,2 ml einer Suspension, die 20 ug des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids enthielt, die über die Caudalvene in 7 Wochen alte männliche BALB/c-Mäuse, die das Fibra Meth A trugen, injiziert; jede Gruppe bestand aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 24 g. Dann wurde die Änderung der Menge der TNF in dem Serum, in dem Tumorgewebe, in der Leber, in der Lunge und in der Milz mit dem Ablauf der Zeit über einen Zeitraum von 6 h beobachtet. Die Bestimmung erfolgte unter Anwendung der Toxizität gegenüber L929-Zellen als Indikation. Die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der Fig. 12 dargestellt.
In der Fig. 12 zeigen o, , , und die Daten für das Serum, das Tumorgewebe, die Leber, die Lunge bzw. die Milz.
Die Fig. 12 zeigt, daß die Produktion von TNF in dem Tumorgewebe pber einen langen Zeitraum anhält.

Versuch 4: Bestimmung der Immun-Stimulierung durch subkutane Verabreichung

A. Stimulierung der endogenen TNF-Produktion

1) 200 ml einer physiologischen Salzlösung (Gruppe A) oder 200 ml einer physiologischen Salzlösung, die 1 ug des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers A-a&sub2; als Primer darin suspendiert enthielt (Gruppe B), wurde über die Caudalvene in 6 Wochen alte männliche BALB/c nu/nu-Mäuse injiziert; jede Gruppe bestand aus zwei Mäusen mit einem Gewichtsbereich von 19 bis 23 g, oder es wurde 50 %iges wäßriges Glycerin, das 1 mg/ml des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers A-a&sub2; enthielt, auf das gesamte Abdomen (Bauch) 3 bis 6 mal aufgebracht in Zeitabständen von 20 min (100 ul bei einem Auftrag) (Gruppe C).
2) 3 h nach der intravenösen Injektion oder nach Beendigung des Auftrags wurde 1 KE OK-432 über die Caudalvene als Trigger den Tieren verabreicht. 2 h später wurde das Serum gesammelt, um die TNF-Aktivität ihrer 20 ul-Fraktionen auf Basis der Toxizität gegenüber L929-Zellen zu bestimmen. Die als Durchschnittswert von zwei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der Tabelle 7 angegeben. Tabelle 7 Gruppe Einheiten/ml

B. Kohlenstoff-Entfernungs-Aktivität

1) Eine 50 %ige wäßrige Glycerinlösung (Gruppe A), eine 50 %ige wäßrige Glycerinlösung, die 1 mg/ml des in Beispiel 1 erhaltenen Pulvers A-a&sub2; enthielt (Gruppe B), oder eine 50 %ige wäßrige Glycerinlösung, die 2 ug/ml E. coli LPS enthielt, wurde 5 Tage lang einmal pro Tag auf das Abdomen (Bauch) von 10 Wochen alten männlichen BALB/c-Mäusen aufgebracht; die jeweiligen Gruppen bestanden aus drei Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 24 bis 29 g und jedesmal wurden 50 ul aufgebracht. 5 Tage später wurden 200 ul einer physiologischen Salzlösung, die 15 ug/ml E. coli LPS enthielt, über die Caudalvene den Mäusen der Gruppe D injiziert.
2) 2 Tage nach dem letzten Auftrag in den Gruppen A bis C oder nach der intravenösen Injektion in der Gruppe D wurde eine Kohlenstoff-Rotring-Ink Art 591017 (hergestellt von der Firma Rotring Ink Co., Deutschland) als 6-fache Verdünnung mit einer physiologischen Salzlösung hergestellt und den jeweiligen Mäusen in einem Mengenanteil von 1/100 des jeweiligen Körpergewichts über die Caudalvene injiziert.
3) 5 min nach Beendigung der intravenösen Injektion des Kohlenstoffs wurde das Blut gesammelt und das jeweilige Gesamtblut (20 ul) wurde mit 2 ml 1 % Na&sub2;CO&sub3; verdünnt und der Kohlenstoffgehalt wurde optisch gemessen als OD&sub6;&sub6;&sub0;. Die als Durchschnittswert von drei Werten pro Gruppe errechneten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 8 angegeben.
In der Tabelle 8 ist die Gruppe E die Gruppe von Mäusen, aus denen unmittelbar nach der intravenösen Injektion des Kohlenstoffs Blut gesammelt wurde, und die Kohlenstoff-Entfernungsaktivität wurde in diesem Falle als "0" angenommen. Die Gruppe F ist die Gruppe von Mäusen, die nicht behandelt wurde, und die optischen Daten der 20 ul-Portionen ihres Blutes wurden als Hintergrund verwendet.
Die Kohlenstoff-Entfernungsraten wurden aus der folgenden Gleichung errechnet.
(1-)[(Wert jeder Gruppen - (Wert der Gruppe F)]/[(Wert der Gruppe E) - (Wert der Gruppe F)] x 100 Tabelle 8 Gruppe Kohlenstoff-Entfernung (%)

Versuch 5: Bestimmung der Osteogenese-Stimulierung

1) Die linken und rechten Parietal-Knochen (insgesamt gibt es zwei Parietal-Knochen) eines 18 Tage alten Hühner- Embryos wurden nach dem Ausschlüpfen entnommen und in getrennte Teströhrchen eingeführt, die 1 ml des vollständigen synthetischen Mediirns BGJb-HW2 enthielten (die Zusammensetzung ist nachstehend angegeben), das &sup4;&sup5;Ca aufwies (1,85 x 10&sup4; s&supmin;¹/ml (0,5 uCi/ml) als &sup4;&sup5;CaCl&sub2;) und dann 2 h lang in einem Wasserbad inkubiert, um die Knochen mit &sup4;&sup5;Ca zu markieren. Komponenten Gehalt (mg/l) L-Lysin.HCl L-Histidin.HCl.H&sub2;O L-Arginin.HCl L-Threonin L-Valin L-Leucin L-Isoleucin L-Methionin L-Phenylalanin L-Tryptophan L-Tyrosin L-Cystein.HCl.H&sub2;O L-Glutamin Glycin L-Serin L-Prolin Nicotinamid Thiamin.HCl Kaliumpantothenat Riboflavin Pyridoxalphosphat Folsäure Biotin p-Aminobenzoesäure α-Tocopherolphosphat-Na Cholinchlorid m-Inosit Cyanocobalamin NaCl, getrocknet KCl, getrocknet CaCl&sub2;, wasserfrei MgSO&sub4;, wasserfrei getrocknete Probe wie oben Glucose, getrocknet (die obengenannten Komponenten wurden in destilliertem Wasser gelöst zur Herstellung von 1 l Lösung, welcher die folgenden Komponenten zugegeben wurden) Kalbsserum-Albumin L-Ascorbinsäure-Na Penicillin G-K-Salz Streptomycin Phenolrot geeignete Menge
2) Nach dieser Markierung wurden die jeweiligen Parietal-Knochen mit PBS (-) (Nissui Co.) gewaschen und dann in getrennte Inkubationsröhrchen eingeführt, die jeweils 1 ml des nicht-markierten vollständigen synthetischen Mediums BGJb-HW2 enthielten, und die Röhrchen wurden verschlossen. Über Nacht wurde eine Inkubation bei 30ºC durchgeführt unter Verwendung eines Rotations-Inkubators. Das Austreten von &sup4;&sup5;Ca in das Medium wähend dieser Inkubationszeit wurde zurückgeführt auf physikalisch-chemische Austauschreaktionen, nicht jedoch auf die Knochengewebe-Absorptionsaktivität, und das Medium wurde verworfen.
3) Einer der beiden Parietal-Knochen wurde in ein Inkubationsröhröchen, das nur 1 ml des nicht-markierten vollständigen synthetischen Mediums BGJb-HW2 enthielt, eingeführt und der andere wurde in ein getrenntes Inkubationsröhrchen eingeführt, das nicht nur 1 ml des nicht-markierten vollständigen synthetischen Mediums BGJb-HW2, sondern auch das Pulver A-a&sub2;, wie es in Beispiel 1 erhalten worden war, erhielt, bei dem es sich um das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid handelte, und die beiden Röhrchen wurden verschlossen und über Nacht in einein Rotationsinkubator inkubiert.
4) Das Medium (jeweils 250 ul) wurde zu 4,5 ml eines AC- SII-Szintillators (der Firma Amersham Co., Großbritannien) zugegeben und das Zählen wurde auf der Basis der Flüssigkeitsszintillation durchgeführt zur Bestimmung der Menge des in das Medium ausgetretenen &sup4;&sup5;Ca.
5) Nach der Inkubation wurden die jeweiligen Parietal- Knochen mit PBS (-) gewaschen und dann in andere Inkubations-Röhrchen überführt, die jeweils 1 ml 1 N HCl enthielten, und die Röhrchen wurden verschlossen und dann über Nacht bei Raumtemperatur stehen gelassen. Das Medium (jeweils 250 ul) wurde zu 4,5 ml ACSII-Szintillator zugegeben und das Auszählen wurde durchgeführt auf der Basis der Flüssigkeitsszintillation zur Bestimmung der Menge des in den Knochen verbleibenden &sup4;&sup5;Ca. Die als Durchschnittswert von fünf Proben errechneten Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 9 angegeben. Tabelle 9 &sup4;&sup5;Ca-Austritt Probe Kontrolle C behandelt T T/C-Rate Einheit Pulver A (/ml) PTH = das bereits bekannten Parathyroid-Hormon, das ein Knochengewebe absorbierendes Hormon ist. Bei ihm entspricht eine Einheit etwa 1 ug.
Wie aus den in der obigen Tabelle angegebenen Daten hervorgeht, nimmt der Effekt des Pulvers A mit steigender Dosis zu und die Verwendung von 10 ug ist wirksamer als die Verwendung von etwa 1 ug PTH. Der Vorrat an PTH ist sehr gering und es ist sehr teuer. So kann das Pulver A, ein Vertreter des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids als ein sehr billiger und häufig gelieferter Ersatz für das PTH verwendet werden.

Versuch 6: Bestimmung der Stimulierung der Eiablage und der Verbesserung der Festigkeit der Schale

Das in Beispiel 1 erhaltene Pulver A wurde in Wasser gelöst und die resultierende Lösung wurde in einer Rate von etwa 350 ml pro Tag 16 Tage lang an Haushühner verabreicht. Die Anzahl der Eier und die Festigkeit der Schale der jeweiligen Hühner wurden 30 Tage lang täglich untersucht einschließlich des Tages, an dem die Lösung verabreicht wurde.
Die Hühner wurden in drei Gruppen eingeteilt, je nach Menge des ihnen verabreichten Pulvers A. Jede Gruppe bestand aus sechs Hühnern.
Gruppe X: 600 mg/ml
Gruppe Y: 60 mg/ml
Gruppe Z: Wasser (Kontrolle)
Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle 10 angegeben. Tabelle 10 Gruppe Gesamtemenge der Eier (Gesamtmenge von 6 Hühnern in jeder Gruppe) Anzahl der Eier mit einer Festigkeit der Schale von 4 kg/cm oder mehr (Gesamtmenge von 6 Hühnern in jeder Gruppe) während der Dosierung nach der Dosierung Gesamt-S Gesamt-T
Die folgenden drei Punkte gehen aus den in der vorstehenden Tabelle 10 angegebenen Daten hervor:
1) Die Anzahl der Eier in den Gruppen X und Y, denen das Pulver A, ein Vertreter des erfindungsgemäßen Limulustestpositiven Pflanzenglykolipids verabreicht wurde, war größer als diejenige der Gruppe Z. Insbesondere betrug die Anzahl in der Gruppe X das 1,3-fache (165 dividiert durch 129) derjenigen der Gruppe Z. Daraus ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid eine Eilege-Stimulierung aufweist.
2) Das Verhältnis der Anzahl der Eier mit einer Schalenfestigkeit von 4 kg/cm² oder mehr zur Gesamtanzahl der Eier in den Gruppen X und Y, denen das Pulver A, ein Vertreter des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids verabreicht wurde, beträgt das Doppelte oder mehr desjenigen in der Gruppe Z. Daraus ergibt sich, daß das erfindungsgemäße Limulustest-positive Pflanzenglykolipid eine ausgezeichnete Eilege-Stimulierung aufweist.
3) Die Stimulierung des Eierlegens und die Verbesserung der Schalenfestigkeit wurde auch beobachtet, nachdem die Dosierung gestoppt wurde. Daraus ergibt sich, daß die Aktivität des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids über einen langen Zeitraum hinweg anhält.

Dosis, Intervall und Toxizität

Die Art der Immun -Stimulatoren, die Dosis und das Intervall der Verabreichung des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids bei der Verwendung als Immun-Stimulator und als Veterinär-Immun-Stimulator werden natürlich durch einen Arzt oder einen Tierarzt individuell festgelegt im Hinblick auf das Alter und den Zustand des Patienten und im Hinblick auf die Menge, die erwartungsgemäß produziert wird. Es kann jedoch gesagt werden, daß 0,1 bis 200 ug (im Falle einer 100 %igen Reinheit) eine Standarddosis für Erwachsene ist (Körpergewicht 50 kg).
Eine Probe des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids mit einer Reinheit von 95 % wurde intravenös an drei sechs Wochen alte männliche BALB/c- Mäuse (Körpergewicht 19-23 g) verabreicht und die Mäuse wurden 48 h lang beobachtet. Als Ergebnis wurde ihr Tod bestätigt. Bei Erwachsenen (50 kg), denen 15 g (ausgedrückt als aktiver Bestandteil) des erfindungsgemäßen Glykolipids verabreicht wurden, wurde keine aktue Toxizität festgestellt. Die LD50 von E. coli LPS bei der Verabreichung an die gleichen Mäuse wie oben angegeben betrug 8,4 mg/kg, so daß der Sicherheitsabstand des erfindungsgemäßen Limulustest-positiven Pflanzenglykolipids sehr zuverlässig ist.

Claims

1. Limulustest-positives Glykolipid mit den folgenden Eigenschaften:

Molekulargewicht: 8000 ± 1000 (SDS Elektrophorese)

Phosphorzahl : nicht unter 1/Mol

Hexosaminzahl : 6 ± 2/Mol

Fettsäurezahl : 6 ± 2/Mol.

2. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 1, worin das Lipid erhalten ist aus einer Pflanze, ausgewählt aus Gymnospermae, Monocotyledoneae, Dicotyledoneae, Pteridophyta, Algae und Fungi und Gemischen davon.

3. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 2, worin die zu Monocotyledoneae gehörenden Pflanzen solche sind, die den Gramineae angehören.

4. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 3, worin die den Gramineae angehörende Pflanze Reis ist.

5. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 3, worin die den Gramineae angehörenden Pflanzen ausgewählt sind aus Weizen, Gerste, Roggen, Hafer und Gemischen davon.

6. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 2, worin die den Algae zugehörenden Pflanzen ausgewählt sind aus Phaeophyceae, Rhodophyceae, Chlorophyceae und Cyanophyceae und Gemischen davon.

7. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 6, worin die den Chlorophyceae angehörige Pflanze Chlorella ist.

8. Limulustest-positives Pflanzenglykolipid nach Anspruch 2, worin die den Fungi angehörenden Pflanzen ausgewählt sind aus Basidiomycetes und Ascomycetes und Gemischen davon.

9. Immunstimulator, enthaltend mindestens eines der Limulustestpositiven Pflanzenglykolipide nach einem der Ansprüche 1 bis 8.