JP2014240391A - 生体分子の精製のための刺激応答性ポリマー - Google Patents
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Description
(a)標的分子及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;(b)高分子電解質骨格に結合させた1つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーが、1つ以上の不純物に結合してポリマーと1つ以上の不純物の複合体を形成するのに適した第1組の条件下で、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させるステップ;及び(c)複合体を沈殿させるのに適した第2組の条件下でサンプルに刺激を加えるステップ;を含み、複合体を沈殿させると1つ以上の不純物から標的分子が分離し、これにより標的分子の純度を向上させる。
を含む。モノマー単位の総数(すなわち、x及びyモノマー単位の合計)に対するyモノマー単位(すなわち、骨格に結合している疎水基を有する)の比がポリマーの「疎水性修飾の%」に相当する。
を含む。ポリマー中のモノマー単位の総数(すなわち、x、y及びzモノマー単位の合計)に対するyモノマー単位(すなわち、骨格に結合している疎水基を有する)の比がポリマーの「疎水性修飾の%」に相当する。更に、モノマー単位の総数(すなわち、x、y及びzモノマー単位の合計)に対するzモノマー単位(すなわち、骨格上の荷電基に結合している官能基を有する)の比はポリマーの「官能基修飾の%」に相当する。
を含む。幾つかの実施形態では、x(すなわち、高分子電解質骨格中の非修飾荷電基)に対するy(すなわち、高分子電解質骨格中の荷電基に結合している疎水基を有するモノマー単位)の比は0.01〜0.75または0.05〜0.75である。従って、疎水基修飾%は全高分子電解質モノマー単位(すなわち、x+y)の1%〜75%または5%〜75%である。
を含む。高分子電解質モノマー単位の総数に対するyモノマー単位の比は0.01〜0.75である。高分子電解質モノマー単位の総数に対するzモノマー単位の比は0.05〜0.5または0.01〜0.5である。従って、疎水基修飾%は1%〜75%または5%〜75%であり、官能基修飾%は1%〜50%または5%〜50%である。
本明細書中で互換可能に使用されている用語「刺激」は、本発明に従う刺激応答性ポリマーによる応答をもたらす環境における物理的または化学的変化を指すことを意味する。従って、本発明は、刺激に対して応答性であり、刺激によりポリマーの溶解度の変化をもたらす新規ポリマーを提供する。本明細書中に記載されている1つ以上のポリマーが応答性である刺激の例には、例えば温度の変化、導電性の変化及び/またはpHの変化が含まれるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、刺激は、サンプルへの複合体化剤または複合体形成塩の添加を含む。各種実施形態では、刺激は、通常、サンプルにポリマーを添加した後に加える。しかしながら、サンプルへのポリマーの添加中またはその前に刺激を加えてもよい。
清澄化されていない非発現細胞培養液(CCF)の作成
代表的実験において、非発現チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株由来の細胞を10Lのバイオリアクター(New Brunswick Scientific)において10×106細胞/mLの密度まで増殖させ、64% 生存度で収集した。IgGを1.3g/Lの濃度までスパイクした。宿主細胞タンパク質(HCP)のレベルは、ELISA(Cygnus #CM015)を用いて8300ng/mlであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のpHは7.2であった。
疎水基で修飾させた高分子電解質骨格を含む刺激応答性ポリマーの合成
代表的実験において、疎水基で修飾させたポリアリルアミン(BzMPAA)骨格を含む刺激応答性ポリマーを合成した。疎水基で修飾させたカチオン性高分子電解質骨格を含むポリマーを40%wt 線状ポリアリルアミン(NITTOBO,150kD)(10.3g)、水酸化リチウム(2g)及び50% 水/メタノール(20ml)の混合物を用いて合成し、十分に混合されるまで攪拌した。ベンジルクロリド(2.1ml)をメタノール(15ml)中に含む溶液をポリマー溶液に添加した。生じた混合物を60℃で14時間加熱した。溶媒との熱力学的非相容性の結果として、ベンジル修飾ポリアリルアミンは反応期間の終わりに沈殿した。沈殿をアセトン(30mL)で洗浄し、1M 酢酸(400mL)中に再溶解した。ポリマーをpH7の50mM リン酸ナトリウムで沈殿させることにより更に精製した。図1は、ポリアリルアミン高分子電解質ポリマーの疎水基、すなわちベンジルクロリドとの反応の概略を示す。
ベンジル修飾ポリアリルアミン(BzMPAA)の溶液の製造
室温で16時間連続攪拌しながら実施例2からのポリマー(10g)を1M 酢酸(90g)中に溶解させることにより10% BzMPAA溶液を製造した。生じた粘性溶液はわずかに曇っていた。
非発現細胞培養液(CCF)の清澄化における異なる濃度のベンジル修飾ポリアリルアミン(BzMPAA)の使用
実施例1からの清澄化されていない細胞培養液(CCF)の5mL サンプルに0.2g,0.3g,0.4g及び0.5gの量の実施例3からのBzMPAAを添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5〜5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2M トリス塩基を用いてpH7に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム(0.043g)を添加した。分散状の固体懸濁液形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心(4000rpmで1分間)により収集した。各サンプルからの上清を0.2um Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表1に詳記する。
BzMPAAを用いる非発現CCFの清澄化における異なるpH値の使用
実施例1からの清澄化されていない細胞培養液(5mL)を含有している4つのサンプルに実施例3からのBzMPAA(各0.4g)を添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5〜5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2M トリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム(0.043g)を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心(4000rpmで1分間)により収集した。次いで、各サンプルからの上清を0.2um Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過した。生じた精製を下表1に詳記する。この表にはスパイクした非発現CHOCCFのBzMPAA精製が記載されている。
CCFの清澄化におけるBzMPAAの使用により生ずる純度レベルについてのアッセイ
実施例4及び実施例5からのサンプルをアフィニティープロティンA分析用HPLCアッセイを用いてIgG回収についてアッセイした。或いは、溶液中のIgGのレベルを分析用プロティンAカラムを用いて測定した。具体的には、Poros A/20プロティンAカラム(Applied Biosystems)をPBSで平衡化し、0.1M リシン(pH2)で溶離し、6M グアニジンHClで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルIgG(Seracare)を用いてIgG標準曲線を作成した。サンプルを注入し、IgG濃度を標準曲線から求めた。
清澄化されていない細胞培養液(CCF)の作成
発現チャイニーズハムスター卵巣(CHO−DG44)細胞株由来の細胞を10Lのバイオリアクター(New Brunswick Scientific)において10×106細胞/mlの密度まで増殖させ、30% 生存度で収集した。モノクローナル抗体(MAb)価は0.8g/Lであると測定された。宿主細胞タンパク質(HCP)のレベルはELISAアッセイ(Cygnus #3G ELISA)を用いて200,000ng/mlであると判明した。清澄化されていない細胞培養物のpHはpH6.9であった。
20% ベンジル修飾ポリアリルアミン(BzMPAA)の合成
ポリアリルアミン(PAA)(Nittobo,150kD;40%wt./wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド(1.38g,1.25mL)を一度に添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(40mL)中で攪拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(3.48g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHを約6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
40% ベンジル修飾ポリアリルアミン(BzMPAA)の合成
ポリアリルアミン(PAA)(Nittobo,150kD;40%wt/wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド(2.30g,2.09mL)を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去すると、ポリマーが沈殿した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(40mL)中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(3.48g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
60% ベンジル修飾ポリアリルアミン(BzMPAA)の合成
ポリアリルアミン(PAA)(NITTOBO,150kD;40%wt/wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、ベンジルクロリド(3.23g,2.94mL)を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(40mL)中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで400mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(3.48g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
ジフェニル修飾ポリアリルアミン(DPhMPAA)の合成
例示的実験において、高分子電解質ポリマー骨格のポリアリルアミンをジフェニル基で修飾させた。簡単に説明すると、ポリアリルアミン(PAA)(Nittobo,150kD;40%wt/wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、クロロジフェニルメタン(3.68g,3.23mL)を添加し、室温で数分間攪拌した後、一晩17時間60℃に加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄し、1M 水性AcOH溶液(40mL)中で撹拌した。ジフェニルクロロメタンの加水分解により生じた残りの白色固体を濾別した。次いで、溶液をH2Oで400mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(3.48g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
6% ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン(DClBzMPAAの合成)
別の実験において、ポリアリルアミン(PAA)(NITTOBO,150kD;40%wt/wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、3,4−ジクロロベンジルクロリド(1.71g,1.21mL)を添加し、混合物を室温で一晩17時間撹拌した。次いで、反応混合物をH2O(100ml)で希釈した後、pHをリン酸で中性(pH7.0)に調節した。沈殿したポリマーを濾別し、H2Oで洗浄し、真空オーブン中60℃で一晩乾燥した。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
10% ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミン(DClBzMPAA)の合成
別の代表的実験において、10% ジクロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン(PAA)(NITTOBO,150kD;40%wt/wt.)(5g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(1.68g)(1.2当量/モノマー)を50/50 H2O/1,2−ジメトキシエタン(DME)(40mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、3,4−ジクロロベンジルクロリド(0.57g,0.40mL)を添加し、室温で数分間攪拌した後、60℃に一晩21時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60〜70℃で除去した後、残りの溶媒を除去した。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(20mL)中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(1.74g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥した。
33% クロロベンジル修飾ポリアリルアミン(DClBzMPAA)の合成
別の代表的実験において、33% クロロベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン(PAA)(NITTOBO,150kD;40%wt/wt.)(5g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)を50/50 H2O/1,2−ジメトキシエタン(DME)(40mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4−クロロベンジルクロリド(1.48g)を添加し、室温で数分間攪拌した後、60℃に一晩21時間加熱した。翌日、DMEを真空下60〜70℃で蒸発させ、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(20mL)中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(1.74g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50〜60℃で一晩乾燥した。
13% フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン(DClBzMPAA)の合成
別の実験において、13% フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン(PAA)(Nittobo,150kD;40%wt/wt.)(4.7g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)を50/50 H2O/1,2−ジメトキシエタン(DME)(40mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4−フェニルベンジルクロリド(1g)を添加し、混合物を55℃で一晩20時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60〜70℃で除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(40mL)中で撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(1.74g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7.0に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50〜60℃で一晩乾燥した。
27% フェニルベンジル修飾ポリアリルアミン(DClBzMPAA)の合成
別の実験において、27% フェニルベンジル修飾ポリアリルアミンを次のように合成した。ポリアリルアミン(PAA)(Nittobo,150kD;40%wt/wt.)(2.8g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(3.34g)(1.2当量/モノマー)を50/50 H2O/1,2−ジメトキシエタン(DME)(40mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加した。次いで、4−フェニルベンジルクロリド(1g)を添加し、混合物を55℃で一晩20時間加熱した。次いで、反応物を室温まで冷却し、DMEを真空下60〜70℃で除去し、残りの溶媒を沈殿したポリマーから分離した。後者を水で洗浄した後、1M 水性AcOH溶液(32mL)中で撹拌し、完全に溶解するまで一晩撹拌した。次いで、溶液をH2Oで200mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(1.74g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH7.0に調節して、精製ポリマーを沈殿させた。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空中50〜60℃で一晩乾燥した。
異なるポリマー濃度でのCCFの清澄化
例示的実験において、実施例8〜16に上記されている刺激応答性ポリマーをCCFの清澄化について評価した。CCFの作成は実施例7に上記されている。清澄化されていない細胞培養液の5mL サンプルに0.2g,0.3g,0.4g及び0.5gの量の実施例8〜16からのポリマー溶液を添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5〜5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2M トリス塩基を用いてpH7に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩(0.043g)を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心(4000rpmで1分間)により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μm Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に詳記する。
異なるpHでのポリマーを用いるCCFの清澄化
別の実験において、実施例7に記載されている清澄化されていない細胞培養液(5mL)を含有している4つのサンプルに実施例8〜16からのポリマー溶液(各0.4g)を添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5〜5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2M トリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液にリン酸水素二カリウム塩(0.043g)を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心(4000rpmで1分間)により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μm Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に記載する。
異なるレベルの多価イオン刺激に対して応答性のポリマーを用いるCCFの清澄化
別の実験において、実施例8〜15に記載されているポリマーを異なる量の多価イオン刺激を用いてCCFの清澄化について評価した。具体的には、実施例7に記載されている清澄化されていない細胞培養液(5mL)を含有している4つのサンプルに実施例8〜15からのポリマー溶液(各0.4g)を添加した。サンプルを室温で2分間混合した。ポリマー添加によりpHがpH4.5〜5.5の範囲に低下したので、混合物のpHを2M トリス塩基を用いてそれぞれpH5.5、6.5、7.5及び8.5に調節した。ポリマー−標的分子、細胞及び細胞破片複合体を沈殿させるために、生じた溶液に0.031〜0.043g(50〜70mMの最終リン酸塩濃度)の範囲のリン酸水素二カリウム塩を添加した。分散状の固体懸濁液の形態の沈殿を5分間連続的に混合した。次いで、沈殿を遠心(4000rpmで1分間)により収集した。その後、各サンプルからの上清を0.2μm Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過した。生じた精製を表2に記載する。
慣用されている凝集剤を用いるCCFの清澄化
別の実験において、比較データを得る試みにおいて慣用されている凝集剤のキトサンをCCFの清澄化のために使用した。ポリマー溶液(2wt%)はRiske,F.ら;Journal of Biotechnology,128(2007),813−823に記載されている手順に従って作成した。ポリマー溶液を量及びpH条件を変えて実施例7からのCCFに添加した。このポリマーの場合刺激は使用しなかった。生じた精製を表2に記載する。
CCFを刺激応答性ポリマーを用いて沈殿させた後の純度レベルの評価
代表的実験において、実施例8〜16に記載されているポリマーをアフィニティープロティンA分析用HPLCアッセイを用いてIgG回収についてアッセイした。或いは、溶液中のIgGレベルを分析用プロティンAカラムを用いて調べた。Poros A/20プロティンAカラム(Applied Biosystems)をPBSで平衡化し、0.1M リシン(pH2)で溶離し、6M グアニジンHClで洗浄した。注入容量の異なる一連のポリクローナルIgG(Seracare)を用いてIgG標準曲線を作成した。サンプルを注入し、IgG濃度を標準曲線から求めた。実施例8〜16からのサンプルを市販の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)キット(Cygnus Technologies Inc.,ノースカロライナ州サウスポート,Cygnus #CM015)を用いて宿主細胞タンパク質(HCP)についてアッセイした。実施例8〜16からのサンプルを標準ピコグリーンアッセイ及び標準としてのニシン***DNAを用いてDNAについてもアッセイした。細胞及び細胞破片の減少を評価するために、4000rpmで1分間遠心した後濁度を調べた。
ベンジル修飾ポリエチレンイミン(BzMPEI)の合成
別の実験において、ベンジル修飾ポリエチレンイミン刺激応答性ポリマーを次のように合成した。PEI(Aldrich,750kD;50%wt./wt.)(10g)を100mlの丸底フラスコに入れ、水酸化ナトリウム(1.2当量/モノマー)(〜3.34g)をH2O(25mL)中に含む溶液を室温で磁気撹拌しながら少しずつ添加する。次いで、ベンジルクロリド(2.30g,2.09mL)を添加し、室温で数分間攪拌した後、60℃で一晩17時間加熱する。次いで、反応物を室温まで冷却し、溶媒を除去する。沈殿したポリマーを水で洗浄した後、完全に溶解するまで1M 水性AcOH溶液(20mL)中で撹拌する。次いで、溶液をH2Oで400mL(1% ポリマー溶液)の最終容量まで希釈し、リン酸水素二カリウム(K2HPO4)(3.48g)を撹拌しながら添加し、溶液のpHをpH6.8に調節して、修飾ポリマーを沈殿させる。ポリマーをガラス濾過器を用いて濾過することにより収集し、最後に真空オーブン中50〜60℃で一晩乾燥する。
ベンジル修飾ポリビニルアミン(BzMPVA)の合成
代表実施例において、ベンジル修飾ポリビニルアミンを次のように合成した。ポリ(ビニルアミン)(PVA)塩酸塩(MW=83,500,Air Products and Chemicals Inc.)(32g)をガラス容器に秤量して入れた。H2O(200mL)を添加し、50% NaOH(26g)を添加し、十分混合されるまで撹拌する。ベンジルクロリド(23.5g)を添加し、70℃で16時間混合する。反応が進行するにつれて、固体白色塊が上清から分離する。固体を沈降させ、デカントにより上清を捨てる。固体を3% 酢酸(350mL)中に一晩溶解する。H2O(360mL)を添加し、溶液が均質になるまで16時間混合する。全容量を脱イオン(DI)H2Oで3.2Lにすることにより1%w/v溶液まで希釈する。ポリマーの沈殿を開始するためにリン酸ナトリウムを50mMの濃度まで添加する。pH6.8に達するまで1M NaOHを添加して、追加的にポリマーを沈殿させる。乾燥ケーキを濾過し、上清を捨てる。固体を70℃で一晩乾燥する。5%w/v溶液を製造するために均質溶液が生ずるまで3% 酢酸中に溶解する。
刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較
それぞれ0.2%wt及び0.4%の最終ポリマー濃度とするように水性溶液にポリアリルアミン(PAA,Nittobo,150kD;40%wt./wt.)及び実施例10からのポリマー(Bz−MPAA)を添加した。リン酸水素カリウム塩を刺激として使用し、PAA及び実施例10のポリマー溶液に異なる量で添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表3に示す。
刺激の存在下での清澄化における修飾及び非修飾ポリマーの比較
それぞれ0.2重量%及び0.4重量%の最終ポリマー濃度とするように水性溶液に非修飾ポリマーポリアリルアミン(PAA,Nittobo,150kD;40%wt/wt.)、ポリエチレンイミン(PEI,Aldrich,750kD;50%wt/wt.)、ポリビニルアミン(ポリ(ビニルアミン)(PVA)塩酸塩,MW=83,500,Air Products and Chemicals Inc.)、並びに実施例10からの修飾ポリマー(Bz−MPAA)、実施例22からの修飾ポリマー(BzMPEI)及び実施例23からの修飾ポリマー(BzMPVA)を添加した。リン酸水素カリウム(150mM)を刺激として使用し、0.4% ポリマー溶液の各々に添加し、濁度及び形成された凝集物の種類を記録した。結果を下表4に示す。
ヘキサン酸及びtert−ブチル修飾ポリアリルアミン(HC−t−BuMPAA)の合成
40wt% 線状ポリマーポリ(アリルアミン)(150kDa,NITTOBO)(10ml)及び水酸化ナトリウム(1M)(30ml)を含む溶液中に6−ブロモヘキサン酸(3.49g)を溶解した。混合物をT=50℃で18時間反応させ、生成物を水和ゲルとして沈殿させた。沈殿を100mg/ml 水酸化リチウム溶液中に溶解し、tert−ブチルグリシジルエーテル(2.5ml)を含有するメタノール(10ml)と混合した。次いで、混合物をT=50℃で18時間反応させた。ポリマー溶液を3.5kda分子量カットオフ透析チューブを用いて脱イオン(DI)水に対する示量透析(3日間)により精製した。ポリマー溶液の最終濃度は7.2wt%であった。合成反応の概略を図2に示す。
トリス緩衝液中に溶解したときのヘキサン酸及びtert−ブチル修飾ポリアリルアミン(HC−t−BuMPAA)の多価刺激に対する塩化ナトリウムの影響
0、0.15または0.5M 塩化ナトリウムを含有する25mM リン酸ナトリウム(10ml)に実施例26からのHC−t−BuMPAA(600μl)を添加した。溶液の最終pHは11.6であった。溶液を3M 酢酸を用いて滴定し、各添加後に溶液の濁度を記録した。図3に示すように、リン酸ナトリウムに加えて塩化ナトリウムを添加することにより、相転移が生ずるpH応答性の変化が観察された。
異なるポリマー濃度でのポリマーHC−t−BuMPAAを用いるCCFの清澄化
代表的実験において、清澄化されていないCCFを本発明に従うポリマーを用いて次のように清澄化した。25mM リン酸ナトリウムを含有している実施例1からの清澄化されていない細胞培養液(5ml)に実施例26からのHC−t−BuMPAA(178、356または534μl)を添加し、3M 酢酸(25μl)を用いてpH8.7に調節した。ポリマーを添加した後、溶液の最終pHを3M 酢酸を用いて7.2に調節すると、ポリマー−細胞複合体が沈殿した。
モノマーからのポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーの合成
第1級アミンを含有する反復単位を含む刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。脱イオン水(165g)及びN−ビニルホルムアミド(NVF)(SIGMA−ALDRICH,98%)(22.5g)を250mlの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びN2ディップスティックを備えた。N2をパージしながら溶液を0.5時間攪拌した後、連続的にパージしながら更に0.5時間かけて45℃に加熱した。2,2’−アゾビス(2−アミドプロパン)二塩酸塩(ABAP)(Aldrich)(0.288g)を脱イオン水(10ml)に添加することにより開始剤溶液を製造し、溶解した。250mlの丸底フラスコに開始剤溶液をN2雰囲気下で添加した。窒素下激しく攪拌しながら、溶液を55℃に1時間加熱した後、65℃で2時間加熱し、更に75℃で1時間加熱した。粘性の均質溶液が得られ、室温まで冷却した。粘度をブルックフィールド粘度DV−II+ Pro粘度計(設定100RPM,45% トルク,スピンドル#34)により測定した。生じた溶液の粘度は278〜350センチポイズ(cP)であった。溶液を500mlのフラスコに移し、H2O(330ml)で希釈し、50% NaOH(40g)を攪拌しながら添加した。溶液を85℃で8時間加熱した。
一連の疎水性修飾させたポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーの合成
実施例29から合成したPVAを用いて、3つの別々の疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。実施例29からの5% PVA溶液(100ml)を3つの500mlのガラスジャーの各々に入れ、ジャー1、2及び3のラベルを付けた。3つのジャーの各々に、4モル NaOH(100g)を攪拌しながら添加した。次いで、各ジャーに1−プロパノール(50g)を補助溶媒として添加し、溶液を攪拌した後、ジャー1、2及び3にそれぞれ0.74g、1.47g及び2.94gのベンジルクロリドを添加した。3つのジャーを60℃で16時間加熱した。反応溶液の容量を脱イオン水で500mlとし、25% HClを用いてpHを8に調節し、2モル リン酸ナトリウム(100g)を添加することにより、生じたポリマーの各々を個々の反応溶液から単離した。リン酸塩イオンを添加したら、固体沈殿を真空濾過により収集した。各反応からの固体を個別に脱イオン水で洗浄し、1モル 酢酸(300ml)中に溶解した。個々の溶液をpH7.4に調節し、2モル リン酸ナトリウムを1滴ずつ添加してポリマーを沈殿し、生じた固体を濾過し、固体を水及びイソプロピルアルコールで順次洗浄した後、真空オーブン中65℃で2日間乾燥することにより、ポリマーを更に精製した。乾燥ポリマーの各サンプルを液体窒素を用いて凍結し、微粉末に粉砕した。回収した乾燥ポリマーの塊はジャー1、2及び3のそれぞれにつき1.44、2.12及び2.47gであった。個々のポリマーの各々を1モル 酢酸中に溶解して2%溶液とした。
ポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーを製造するための超高分子量ポリ(N−ビニルアセトアミド)の加水分解によるアミンの脱保護
別の例示的実験例では、超高分子量刺激応答性ポリマーを次のように製造した。超高分子量ポリマーは通常、1000KDa以上の分子量を有するポリマーを指す。
脱保護したポリ(N−ビニルアセトアミド)を主成分とする疎水性修飾ポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーの合成
実施例31からの脱保護した4,060kDa ポリ(N−ビニルアセトアミド)線状ホモポリマーから得たPVAを用いて、超高分子量の疎水性修飾した刺激応答性ポリマーを次のように製造した。
刺激応答性ビニルアミン/ビニルブチルエーテルコポリマー(VA−コ−VBE)の合成
別の実験では、モノマー単位の1つが疎水基を含んでいる刺激応答性コポリマーを製造した。
逆乳化重合によるNVFモノマーからの超高分子量ポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーの合成
第1級アミンを含有する反復単位から構成される刺激応答性ポリマーをモノマーから次のように合成した。オクタン(90g)、Span−85(SIGMA)(2.5g)、N−ビニルホルムアミド(NVF)(ALDRICH,98%)(16g)及び脱イオン水(30g)を250mlの丸底フラスコに入れた。フラスコに磁気攪拌機及びN2ディップスティックを備えた。溶液を攪拌し、温度が55℃に上昇したのでN2を1時間パージした。脱イオン水(20ml)中に2,2’−アゾビス(2−アミジノプロパン)二塩酸塩(ABAP)(ALDRICH)(0.20g)を添加し、溶解することにより開始剤溶液を製造した。開始剤溶液を窒素をパージした雰囲気下で反応溶液を収容している250mlの丸底フラスコに充填した。激しく撹拌し且つ窒素を連続パージしながら、溶液を60℃に2時間加熱した後、75℃に1時間加熱した。底に粘性ゲル層を有する2相溶液が生じた。上層をデカントし、捨てた。下層に脱イオン水(500ml)を添加し、激しく攪拌しながら50% NaOH(48g)を添加した。溶液を80℃に16時間加熱した。16時間後、溶液を熱から外し、室温まで冷却した。容量を脱イオン水を用いて1Lまで増加させた。2モル リン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することにより生成物を単離すると、大きな白い沈殿が生じた。上清をデカントすることにより沈殿を収集し、沈殿を脱イオン水で洗浄し、イソプロピルアルコール中に2時間浸漬し、最後に脱イオン水で再び洗浄した。生じた固体の塊を真空オーブン中65℃で3日間乾燥した。乾燥させたポリマーを液体窒素を用いて凍結し、微粉末まで粉砕し、更に1日乾燥した。生じた乾燥粉末の塊は21.5gであった。乾燥粉末を1モル 酢酸及び0.08% HCl中に溶解することにより2%溶液を製造した。1% ポリマー溶液の50mL サンプルに2モル リン酸ナトリウムまたは0.2モル クエン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することにより、生じた溶液の多価イオン刺激に対する感受性について試験した。リン酸塩またはクエン酸塩イオンを添加すると、白色沈殿が観察された。
高分子量の疎水性修飾ポリビニルアミン(PVA)刺激応答性ポリマーの合成
BASFから入手したLupamin 9095(線状ポリビニルアミン,平均MW=340kDa,20% 固体,pH7〜9)の溶液を用いて、疎水性修飾させた刺激応答性ポリマーを次のように製造した。Lupamin 9095(約60gのポリビニルアミン)(300g)を2Lのガラスジャーに添加した。次いで、NaOHペレット(40g)及び脱イオン水(500ml)を溶解し、ジャーに添加した。この後、1,2−ジメトキシエタン(SIGMA)(500ml)を補助溶媒として添加し、均質になるまで溶液を激しく攪拌した。次いで、反応ジャーにベンジルクロリド(ACROS ORGANICS,99%)(17.66g)を攪拌しながら添加した。溶液を磁気撹拌しながら60℃に16時間加熱した。次いで、溶液を室温まで冷却し、5Lのビーカーに移した。次いで、脱イオン水(1500ml)を攪拌しながら添加した。氷酢酸を用いてpHを5に調節した。2モル リン酸ナトリウム(250ml)をゆっくり添加することにより生成物が沈殿し、固体を収集し、脱イオン水で洗浄した。
疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性ポリマーの200g規模の合成
本明細書中に記載されている例示的実験で、本明細書中に記載されているポリマーが大規模で製造され得ることが立証された。
CHO細胞培養物における刺激応答性ポリマー対カチオン性高分子電解質の添加量増加に対する凝集性能及び上清品質の測定
本明細書中に記載されている例示的実験では、本発明に従う刺激応答性ポリマーを幾つかの所望の特性について公知のポリマー、すなわちキトサンと比較した。
CHO細胞培養物における多価アニオン刺激の存在下対刺激なしでの刺激応答性ポリマーの添加量の増加を伴う凝集性能及び上清品質の測定
CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性(33%−BnPAA)ポリマーの2%w/w溶液を実施例36に従って製造した。33%−BnPAAポリマーの場合、CHO細胞培養物を収容している各コニカルチューブに0.0、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.14、0.18、0.22及び0.4%w/vの添加量の個々のポリマーを3通りに(1つはリン酸塩、1つはクエン酸塩、1つは刺激なし)添加した。pHを7.2に調節し、150mM リン酸ナトリウムまたは150mM クエン酸ナトリウム塩の刺激を加え、または刺激を加えなかった。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表6及び図11に示す。
CHO細胞培養物における非修飾刺激応答性ポリマーの添加量の増加に伴う凝集性能及び上清品質の測定
別の実験において、CHO細胞培養物中の非修飾刺激応答性ポリマーでの凝集能力及び上清品質を本明細書中に記載されているように測定した。
CHO細胞培養物における刺激応答性ポリマーの凝集性能、沈降時間及び上清品質の測定
CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性(33%−BnPAA)ポリマーの10%w/w溶液を実施例36と同様に製造した。CHO細胞培養物(50ml)を100mlのガラスメスシリンダーに2通りで入れた。シリンダーの1つには、刺激応答性ポリマーを0.5%の添加量で添加し、2モル トリス塩基を1滴ずつ添加してpHを7に調節し、2モル リン酸ナトリウム溶液を添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMに調節し、溶液を2分間撹拌した。刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集し、粒子サイズを大きくするために、リン酸ナトリウム及びpH調節を実施した。リン酸ナトリウムを添加し、pHを調節した後、大きな凝集粒子が刺激応答性ポリマーで処理した供給材料で観察された。他のメスシリンダーを2分間攪拌し、何も添加しなかった。いずれのシリンダーも1時間放置した。1時間後、上清を吸引し、濁度を記録した。
異なる分子量を有するポリアミンを用いる清澄化性能の比較
異なる分子量を有する一連のポリマーを入手し、修飾し、細胞培養物を凝集、沈殿及び精製するために使用した。分子量が15kD、85kD、150kD、350kD、600〜950kD及び2000〜4000kDの第1級アミン反復単位を有するポリマーを以下の方法により入手し及び/または修飾した。
異なる疎水性修飾のポリアミンを用いる清澄化性能の比較
CHO細胞培養物を実施例1に記載されている方法を用いて作成した。実施例31、32、33及び35に記載されているポリマーのサンプルを実施例38に記載されている細胞培養物に添加した。ただし、ポリマー添加量は表10に記載されているように0.1wt%〜0.6wt%であった。初期細胞培養濁度は〜900NTUであり、ポリマー処理なしの遠心分離液の濁度は212NTUであった。pHを7.2に調節し、50mM リン酸ナトリウムの刺激を加えた。すべてのコニカルチューブを3000RPMで2分間遠心し、上清をデカントし、遠心分離液濁度を測定した。本実施例に記載されている実験の結果を表10に示す。この表には、異なるポリマー添加量での各種疎水性修飾の性能が明示されている。
刺激応答性ポリマーを用いて得た低い濁度の下流濾過に対する影響
刺激応答性ポリマーのその後の遠心及びデプス濾過ステップに対する影響を評価するために、次の手順を実施した。PTG1抗体を発現するDG44チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を10Lのバイオリアクター(NEW BRUNSWICK SCIENTIFIC)において約15×106細胞/mLの密度まで増殖させ、<50% 生存度で収集した。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性(33%−BnPAA)ポリマーの10%w/w溶液を実施例36と同様に製造する。
モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のアフィニティー樹脂を用いる捕捉
刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、モデル供給材料を作成し、次の手順を実施する。CHO細胞培養物を実施例1に同様の方法を用いて作成する。初期供給材料HCPレベルは〜210,000ppmであった。疎水性修飾ポリアリルアミンを主成分とする刺激応答性(33%−BnPAA)ポリマーの10%w/w溶液を実施例36と同様に製造する。CHO細胞培養物の1つの画分を0.1%の刺激応答性ポリマー33%−BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の別の画分を0.4%の刺激応答性ポリマー33%−BnPAAで処理し、CHO細胞培養物の第3の画分は処理しない。刺激応答性ポリマーで処理した細胞培養物に対して2モル リン酸ナトリウムを1滴ずつ添加することによりリン酸ナトリウム濃度を50mMとし、2モル トリス塩基を1滴ずつ添加することによりpHを7.2に調節する。リン酸ナトリウム及びpH調節は、刺激応答性ポリマー及び細胞、細胞破片、不純物、残留ポリマーの複合体を沈殿させ、固体を凝集させ、粒度を大きくするために実施する。リン酸ナトリウム添加及びpH調節の後に、刺激応答性ポリマーで処理した供給材料中に大きなフロック状粒子が観察される。細胞培養物の各画分を実験室規模のバケット遠心分離機を用いて3000RPMで5分間遠心する。各遠心分離液の濁度を記録し、表11に報告する。遠心分離液を0.2μm Durapore(登録商標)フィルターを介して濾過する。
モデルタンパク質流の刺激応答性ポリマーを用いる精製及びその後のカチオン交換樹脂を用いる捕捉
刺激応答性ポリマーのその後の精製ステップに対する影響をよりうまく評価するために、次の手順を実施した。PTG1抗体を発現するDG44チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞株を10Lのバイオリアクター(New Brunswick Scientific)において約15×106細胞/mLの密度まで増殖させ、〜142000ppmのHCPレベルで<50% 生存度で収集した。
リン酸2−ヒドロキシエチルメタクリレート(PAHEMA)で修飾させたポリエチレン膜表面
別の実験において、膜を多価イオン刺激を取り込むように修飾した。この膜は残留刺激応答性ポリマーを除去するために使用され得る
PAHEMAの16% 水性混合物を、PAHEMA(Aldrich #695890,75% PAHEMA及び25% BisHEMPA)(16g)、イルガキュア2959(0.2g)及び水(93.8g)を用いて製造した。ポリエチレン膜(0.65um,UPDP MILLIPORE)を予めメタノールで湿らし、水と交換し、PAHEMA調製物で処理した。サンプルをUV光に曝し、メタノール及び水で洗浄し、乾燥した。この表面修飾により膜に付加された重量は4.4%であった。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー(正に荷電した染料)で染色すると、1.43のシアン光学密度の深青色が生じた。
リン酸2−ヒドロキシエチルメタクリレート(PAHEMA)で修飾させた親水性ポリエチレン膜表面
PAHEMAの16% 水性混合物を、PAHEMA(Aldrich #695890,75% PAHEMA及び25% BisHEMPA)(16g)、イルガキュア2959(0.2g)及び水(93.8g)を用いて製造した。親水性膜(0.65um,MPLC MILLIPORE)を直接PAHEMA溶液と接触させた。上記のようにUV光に曝し、洗浄すると、膜に7.6%が付加された。膜の赤外スペクトルは強いメタクリレートカルボニル吸収を示した。膜をメチレンブルー(正に荷電した染料)で染色すると、1.45のシアン光学密度の深青色が生じた。
リン酸ヒドロキシエチルメタクリレート(PAHEMA)で修飾させた親水性ポリメタクリレート樹脂
別の実験では、樹脂を刺激を含むように修飾した。この修飾された樹脂はその後残留ポリマーを除去するために使用され得る。
リン酸2−ヒドロキシエチルメタクリレート(PAHEMA)で修飾させた親水性ポリエチレン膜表面との刺激応答性ポリマーの結合
PAHEMA修飾MPLC膜(実施例47)を使用して、以下の実験手順を用いてそれぞれ100、10及び1ppm PAAを含有している3つの溶液からポリアリルアミン(PAA)ポリマーを捕捉した。膜ディスク20mm直径を15ccセルホルダーにおいて加工した。PAA溶液を1.5cc/秒で加工した。膜をPBS緩衝液(100mL)を用いてセルホルダーの内外を洗浄した。加工した膜をPonceau Sで染色した。
Claims (39)
- 高分子電解質骨格に結合した1つ以上の疎水基を含む高分子電解質骨格を含み、刺激を加えるとサンプル中の対象生体分子に結合し、沈殿させることができる、刺激応答性ポリマー。
- 高分子電解質骨格が少なくとも2つのモノマー単位を含む、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。
- 高分子電解質骨格が少なくとも3つのモノマー単位を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。
- 高分子電解質骨格中の各モノマー単位が電荷を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。
- モノマー単位の少なくとも50%が電荷を含む、請求項2に記載の刺激応答性ポリマー。
- 対象生体分子が治療用ポリペプチドである、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。
- 対象生体分子が治療用ポリペプチドと一緒にサンプル中に存在している不純物である、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。
- 不純物が宿主細胞タンパク質、エンドトキシン、DNA、RNA、ウイルス、脂質、全細胞及び細胞破片からなる群から選択される、請求項7に記載の刺激応答性ポリマー。
- 刺激が多価イオンである、請求項1に記載の刺激応答性ポリマー。
- 多価イオンがリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項9に記載の刺激応答性ポリマー。
- 治療用ポリペプチドが抗体である、請求項7に記載の刺激応答性ポリマー。
- 抗体がモノクローナル抗体である、請求項11に記載の刺激応答性ポリマー。
- ポリアリルアミン、ベンジル基で修飾させたポリアリルアミン、ポリビニルアミン及びベンジル基で修飾させたポリビニルアミンからなる群から選択される刺激応答性ポリマーであって、刺激がリン酸塩またはクエン酸塩である、前記ポリマー。
- サンプル中の1つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、
(a)標的分子及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;
(b)サンプルを請求項1に記載の刺激応答性ポリマーと接触させてポリマーと1つ以上の不純物の複合体を形成するステップ;及び
(c)サンプルに刺激を加えて溶液から複合体を沈殿させるステップ;
を含み、これにより1つ以上の不純物から標的分子を分離する、前記方法。 - 1つ以上の濾過ステップを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 1つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む、請求項14に記載の方法。
- 刺激が多価イオンである、請求項14に記載の方法。
- 多価イオンがリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項17に記載の方法。
- 高分子電解質骨格が少なくとも2つのモノマー単位を含み、前記単位の少なくとも50%が電荷を含む、請求項14に記載の方法。
- 高分子電解質骨格が少なくとも3つのモノマー単位を含み、前記単位の少なくとも50%が電荷を含む、請求項14に記載の方法。
- 請求項1に記載の刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、刺激応答性ポリマーを用いてサンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、
(a)抗体及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;
(b)ポリマーが1つ以上の不純物と結合するのに適した第1組の条件下において、サンプルを請求項1に記載のポリマーと接触させ、それによりポリマーと1つ以上の不純物の第1複合体を形成し、前記第1組の条件が、ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのpHまたは塩濃度を調節することを含むステップ;
(c)第2組の条件下でサンプルから第1複合体を沈殿させるステップ;
(d)サンプルを多価イオンを含む刺激と接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第2複合体を形成するステップ;
(e)第2複合体を沈殿させるステップ;
を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する、前記方法。 - 抗体がモノクローナル抗体である、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上の不純物が宿主細胞タンパク質、DNA、RNA、ウイルス、抗体凝集物及び細胞培養添加物からなる群から選択される、請求項23に記載の方法。
- サンプルが供給材料を含む、請求項23に記載の方法。
- サンプルが抗体が分泌される細胞培養培地を含む、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上のクロマトグラフィーステップを更に含む、請求項23に記載の方法。
- 1つ以上の濾過ステップを更に含む、請求項23に記載の方法。
- 高分子電解質骨格がポリアミン骨格を含む、請求項1に記載のポリマー。
- 疎水基がフェニル基である、請求項1に記載のポリマー。
- 刺激応答性ポリマーの残留量を最小限にしながら、刺激応答性ポリマーを用いてサンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離する方法であって、
(a)抗体及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;
(b)ポリマーが1つ以上の不純物と結合するのに適した第1組の条件下において、サンプルを刺激応答性ポリマーと接触させ、それによりポリマーと1つ以上の不純物の第1複合体を形成し、前記第1組の条件が、ポリマーの添加前、添加中または添加後に、サンプルのpHまたは塩濃度を調節することを含むステップ;
(c)第1組の条件下でサンプルから第1複合体を凝集させるステップ;
(d)凝集させた固体を除去するステップ;
(e)サンプルを多価イオンと接触させて、残留ポリマーと多価イオンの第2複合体を形成するステップ;及び
(f)第2複合体を沈殿させるステップ;
を含み、それによりサンプル中の残留ポリマーの量を減少させながら、サンプル中の1つ以上の不純物から抗体を分離させる、前記方法。 - サンプル中の1つ以上の不純物から標的分子を分離する方法であって、
(a)標的分子及び1つ以上の不純物を含んでいるサンプルを用意するステップ;
(b)多価イオン応答性ポリマーの添加前、添加中または添加後に多価イオンを添加してサンプルを多価イオン応答性ポリマーと接触させて、ポリマーと1つ以上の不純物の複合体を形成するステップ;
(c)溶液から複合体を沈殿させるステップ;
を含み、それにより1つ以上の不純物から標的分子を分離させる、前記方法。 - 多価イオン刺激がリン酸塩またはクエン酸塩である、請求項35に記載の方法。
- 刺激応答性ポリマーがコポリマーである、請求項35に記載の方法。
- ステップ(c)の後に、多価イオンで修飾させた膜または樹脂を使用することを含む、残留量のポリマーを除去するステップを更に含む、請求項35に記載の方法。
- 多価イオンがリン酸塩である、請求項38に記載の方法。
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