JP2006312117A - 生理活性物質の分離用材料及びその製造方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】生理活性物質の分離用材料であって、支持体の表面上に、該生理活性物質に対して親和性を有する物質と、下限臨界共溶温度を有するセグメントとおよび親水性セグメントとから構成されるポリマーとを、それぞれ独立に結合しているものを提供する。前記生理活性物質に対して親和性を有する物質が、前記生理活性物質とキレート環を形成する。前記下限臨界共溶温度を有するセグメントとおよび親水性セグメントとから構成されるポリマーがブロックポリマーである。前記下限臨界共溶温度を有するセグメントがポリ(N置換アクリルアミド誘導体)である。
【選択図】図1
Description
第33回医用高分子シンポジウム 要旨集p1
本発明における支持体1aとして、有機材料や無機材料あるいはそれらのハイブリッド材料等、種々の組成の材料を使用することができる。支持体1aは、下限臨界共溶温度を有するセグメント1bと親水性セグメント1cから構成されるブロックポリマー、さらにはアフィニティーリガンド1e、スペーサー1dと化学結合を形成し得る官能基を有していることが好ましく、官能基を有していない場合には、適宜処理して官能基を導入しておくことが好ましい。官能基としては、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、エステル基、クロロメチル基などを挙げることができる。ただし、同様の効果が期待できる範囲において、他の官能基であっても適用可能である。
本発明において、支持体1aに結合している高分子鎖は、下限臨界共溶温度1bと親水性セグメント1cから構成されるブロックポリマーである。
本発明における、アフィニティーリガンド1eは、特定の生理活性物質に対して親和性を有する物質である。ここでいう生理活性物質とは、ペプチドやタンパク質のように、生体内において活性を示し、生体内または生体外の他の物質との間に相互作用、親和性を有する物質を意味する。本発明におけるアフィニティーリガンド1eとして、ターゲットとする生理活性物質と金属イオンを介したキレート環を形成する物質が好ましい。生理活性物質とキレート環を形成する物質として、分子内にジカルボン酸構造を有する化合物などが挙げられる。ただし、生理活性物質とキレート環を形成しないアフィニティーリガンド1eであっても、同様の効果を期待できる範囲において適用可能である。
本発明における、スペーサー1dとは、支持体1aとアフィニティーリガンド1eの間に存在する化学物質である。スペーサー1dは、支持体1a及びアフィニティーリガンド1eと結合する前は、その両端に例えば、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、エポキシ基等の官能基を有していることが好ましい。本発明におけるスペーサー1dとは、支持体1aとアフィニティーリガンド1eとを適当な距離を置いて結合しうるものであれば特に制限されないが、具体的にはエチレングリコールジグリシジルエーテル誘導体を使用することが好ましい。
以下、本発明の生理活性物質の分離用材料を用いて目的の生理活性物質を分離・回収(まとめて回収という)する仕組みを説明する。
反応用シュレンク管にブロモ化末端を有するPEO(Mn:1000, Mw/Mn:1.1)、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)、CuCl、tris[2−(dimethylamino)ethyl]amine (Me6TREN)、ジメチルホルムアミド(DMF)を加え反応溶液とする。凍結真空脱気によりシュレンク管内の酸素を除去し、室温にて原子移動ラジカル重合(ATRP)を進行させる。所定時間経過後、反応系内に大量のメルカプト酢酸を加えることにより、生成するブロックポリマーの末端をカルボキシル化する。カルボキシル化はNMRにより確認する。さらに、カルボキシル化ブロックポリマー(poly(EO−b−NIPAM)−COOH)を透析により精製し、凍結乾燥法により乾燥状態で回収する。回収したpoly(EO−b−NIPAM)−COOHを水溶性カルボジイミド(WSC)を含む水溶液中に溶解させ、N−ヒドロキシルスクシンイミド(NHS)と反応させることにより、poly(EO−b−NIPAM)−COOHのカルボキシル基を活性エステル基に変換する。この反応の進行はNMRにより確認する。活性エステル化ブロックポリマー(poly(EO−b−NIPAM)−NHS)をGPCにて測定したところ、数平均分子量 6000、分子量分布指数 1.3であることが確認できる。
poly(EO−b−NIPAM)−NHSの活性エステル基とアミノプロピルシリカビーズ(5μm)のアミノ基を水中で反応させることで、アミノプロピルシリカビーズ表面にpoly(EO−b−NIPAM)−NHSを導入する。この導入はXPSによる表面元素分析にてS原子を指標に確認する。
ポリエチレングリコールグリシジルエーテルのエポキシ基とpoly(EO−b−NIPAM)−NHSを導入したアミノプロピルシリカビーズの残存アミノ基を水中にて反応させることで、ポリエチレングリコールグリシジルエーテルを結合させる。次に、イミノ2酢酸のアミノ基とエチレングリコールグリシジルエーテルを水中にて反応させる。その後、CuCl2水溶液中にて攪拌し、イミノ2酢酸基とCu2+イオンとの間にキレートを形成させる。キレート形成は、ethylene diamine tetra−acetic acid(EDTA)を用いてCu2+を溶出させ、原子吸光分析にて溶出Cu2+量を定量することによって確認する。以下、このような手法でアフィニティーリガンドとブロックポリマーを共固定したシリカビーズをcode1と表現する。
生理活性物質のモデルとしてウシ血清アルブミン(BSA)を用いる。
25℃に温度設定した蒸留水にcode1を分散させ、さらにBSAを加えて評価用の水溶液を調整する。この水溶液を25℃にて1時間振騰した後、遠心分離によってcode1を沈降させてその上澄み液を採取する。採取した上澄み液中のBSA濃度を吸光度測定により評価したところ、初期のBSA濃度と変化しないことが確認される。このことから25℃の水溶液中では、code1にBSAは吸着しない。
40℃に温度設定した蒸留水にcode1を分散させ、さらにBSAを加えて評価用の水溶液を調整する。この水溶液を40℃にて1時間振騰した後、遠心分離によってcode1を沈降させてその上澄み液を採取する。採取した上澄み液中のBSA濃度を吸光度測定により評価したところ、初期のBSA濃度の10%以下であることが確認される。このことから40℃の水溶液中では、code1にBSAは選択的に吸着する。
1−4−2でBSAを吸着したcode1が分散した水溶液を、25℃に温度降下した後、遠心分離によってcode1を沈降させてその上澄み液を採取する。採取した上澄み液中のBSA濃度を吸光度測定により評価したところ、初期のBSA濃度と変化しないことが確認される。このことから40℃でcode1にBSAを選択的に吸着させた後、25℃に温度降下させることでBSAを回収することができる。
code1の作製過程において、実施例[1−3]の過程を行わずブロックポリマーのみを固定化したシリカビーズ(code1’)を用いて比較実験を行う。40℃に温度設定した蒸留水にcode1’を分散させ、さらにBSAを加えて評価用の水溶液を調整する。この水溶液を40℃にて1時間振騰した後、遠心分離によってcode1’を沈降させてその上澄み液を採取する。採取した上澄み液中のBSA濃度を吸光度測定により評価したところ、初期のBSA濃度と変化しないことが確認される。つまり、実施例[1−4−2]におけるcode1へのBSAの吸着は、非特異的吸着ではなく、アフィニティーリガンドに起因して生じる。
シリカビーズを濃硝酸で洗浄した後、ろ過により回収する。回収したシリカビーズを乾燥N2雰囲気下、135℃にて5時間加熱処理した後、無水トルエンに分散させる。このシリカビーズ/トルエン分散液に、シランカップリング剤である2−(4−クロロメチルフェニル)エチルトリメトキシシランを添加し、シリカビーズ表面の水酸基と反応させる(クロロメチル化)。この反応の進行は、XPSによる表面分析にてCl原子を指標に確認する。次に、クロロメチル化したシリカビーズを水で分散し、その分散液にアミノエタンチオールを添加して、クロロメチル基の一部をアミノ化する。さらに、分散液中にジチオカルバミン酸ナトリウムを添加し、残存クロロメチル基と反応させる。これらの反応の進行は、XPSによる表面分析にてN原子とS原子を指標に確認する。以下このようにして処理したシリカビーズを前処理済みビーズと表現する。
ポリエチレングリコールグリシジルエーテルのエポキシ基と前処理済みビーズ表面のアミノ基とを水中にて反応させることで、前処理済みビーズ表面にポリエチレングリコールグリシジルエーテルを結合させる。次に、イミノ2酢酸のアミノ基とエチレングリコールグリシジルエーテルを水中にて反応させる。以下このようにして作製したアフィニティーリガンド導入済みシリカビーズを、アフィニティービーズと表現する。
反応用シュレンク管にアフィニティービーズとNIPAM、水、ベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメートを加えて反応溶液とする。シュレンク管内を窒素置換し、室温にてUVグラフト重合を進行させることでアフィニティービーズ表面にpoly(NIPAM)を形成させた。ここでUVランプとして照射波長312nm〜577nmのものを用いた。次に、反応系内にアクリルアミドを後添加し、さらにUVグラフト重合を進行させることで、アフィニティービーズ表面にpoly(NIPAM−block−AAm)を形成させる。フリーな開始種として加えておいたベンジルN,N−ジエチルジチオカルバメートから生成した高分子鎖の分子量と分子量分布を測定したところ、数平均分子量が約5200で、分子量分布指数が1.25であることが確認できる。以下、このような手法でアフィニティーリガンドとブロックポリマーを共固定したシリカビーズをcode2と表現する。
生理活性物質のモデルとしてリゾチームを用いる。
code2をスラリー状にしてステンレスカラム(30×4.6mmφ)に充填後、NiCl2溶液を通液して、イミノ二酢酸基とN2+イオンとのキレートを形成させる。次に、カラム温度を40℃に保持して所定量のリゾチーム水溶液をカラム内に通液し、その溶出液を採取する。採取した溶出液中のリゾチーム濃度をマイクロBCA法により評価したところ、溶出液中にはリゾチームが含まれないことが確認される。このことから40℃においてリゾチームは、code2に選択的に吸着する。
実施例2の[2−4−1]に引き続いて、カラム温度を20℃に降下させ、リゾチーム水溶液通液後の溶出液を採取する。溶出液中のリゾチーム濃度をマイクロBCA法により評価したところ、初期のリゾチーム濃度の90%以上が含有されることを確認する。このことから、40℃でcode2にリゾチームを選択吸着させた後、20℃に温度降下することでリゾチームを回収することができる。
code2の作製過程において、[2−2]の過程を経ずに、ブロックポリマーのみを固定化したシリカビーズ(code2’)を用いて比較実験を行う。code2’をスラリー状にしてステンレスカラム(30×4.6mmφ)に充填後、NiCl2溶液を通液する。次に、カラム温度を40℃に保持して所定量のリゾチーム水溶液をカラム内に通液し、その溶出液を採取する。採取した溶出液中のリゾチーム濃度をマイクロBCA法により評価したところ、初期のリゾチーム濃度の100%が含有されることを確認する。つまり、実施例[2−4−1]におけるcode2’へのリゾチームの吸着は、非特異的吸着ではなく、アフィニティーリガンドに起因して生じる。
1b 温度応答性セグメント
1c 親水性セグメント
1d スペーサー
1e アフィニティーリガンド
3a 生理活性物質
Claims (6)
- 生理活性物質の分離用材料であって、支持体の表面上に、前記生理活性物質に対して親和性を有する物質と下限臨界共溶温度を有するセグメントと親水性セグメントとから構成されるポリマーとを、それぞれ独立に結合してなることを特徴とする生理活性物質の分離用材料。
- 前記生理活性物質に対して親和性を有する物質が、前記生理活性物質とキレート環を形成することを特徴とする請求項1に記載の生理活性物質の分離用材料。
- 前記下限臨界共溶温度を有するセグメントとおよび親水性セグメントとから構成されるポリマーが、ブロックポリマーであることを特徴とする請求項1〜2のいずれかに記載の生理活性物質の分離用材料。
- 前記下限臨界共溶温度を有するセグメントがポリ(N置換アクリルアミド誘導体)であることを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の生理活性物質の分離用材料。
- 生理活性物質の分離用支持体表面上に、前記生理活性物質に対して親和性を有する物質を結合する工程と、下限臨界共溶温度を有するセグメントとおよび親水性セグメントとから構成されるポリマーを結合する工程とを含むことを特徴とする生理活性物質の分離用材料の製造方法。
- 請求項1に記載の分離用材料を、生理活性物質を含む溶液中に浸漬させ、温度を下限臨界共溶温度以下に変化させることにより、前記生理活性物質に対して親和性を有する物質と前記生理活性物質が解離し、かくして前記生理活性物質を前記溶液中から回収することを特徴とする生理活性物質の回収方法。
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