JPH09124697A - ペプチド及びモノクローナル抗体 - Google Patents
ペプチド及びモノクローナル抗体Info
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-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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-
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト血管透過性因子の一部のペプチド及び該
ペプチドを認識する血管透過性因子モノクロナール抗体
の提供。 【解決手段】 ヒト血管透過性因子の一部のペプチド及
び該ペプチドを認識する血管透過性因子モノクロナール
抗体を提供することを目的とする。 【効果】 本発明のペプチドは、血管透過性因子に対す
るモノクロナール抗体を作製するための抗原として、本
発明のモノクロナール抗体と同様に、生化学試薬や癌そ
の他の疾病の診断薬、治療薬として有用である。
ペプチドを認識する血管透過性因子モノクロナール抗体
の提供。 【解決手段】 ヒト血管透過性因子の一部のペプチド及
び該ペプチドを認識する血管透過性因子モノクロナール
抗体を提供することを目的とする。 【効果】 本発明のペプチドは、血管透過性因子に対す
るモノクロナール抗体を作製するための抗原として、本
発明のモノクロナール抗体と同様に、生化学試薬や癌そ
の他の疾病の診断薬、治療薬として有用である。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト血管内皮細胞
増殖因子（血管透過性因子とも呼ばれ以下ＶＰＦとい
う）の一部分の連続したアミノ酸配列に相当するペプチ
ド及びこのペプチドと反応するＶＰＦモノクローナル抗
体に関するものである。このペプチドはＶＰＦに対する
モノクローナル抗体と反応することから、ＶＰＦに対す
る抗体の作製或いはＶＰＦの生化学的な解析、例えばＶ
ＰＦ受容体に対するＶＰＦの結合様式の解析などに有用
であり、又、このペプチドと反応するＶＰＦモノクロー
ナル抗体はＶＰＦの生化学的な解析、癌やその他のＶＰ
Ｆの関与する疾病治療等に広く利用することができるも
のであり、生化学や薬学等において本発明は利用される
ものである。
増殖因子（血管透過性因子とも呼ばれ以下ＶＰＦとい
う）の一部分の連続したアミノ酸配列に相当するペプチ
ド及びこのペプチドと反応するＶＰＦモノクローナル抗
体に関するものである。このペプチドはＶＰＦに対する
モノクローナル抗体と反応することから、ＶＰＦに対す
る抗体の作製或いはＶＰＦの生化学的な解析、例えばＶ
ＰＦ受容体に対するＶＰＦの結合様式の解析などに有用
であり、又、このペプチドと反応するＶＰＦモノクロー
ナル抗体はＶＰＦの生化学的な解析、癌やその他のＶＰ
Ｆの関与する疾病治療等に広く利用することができるも
のであり、生化学や薬学等において本発明は利用される
ものである。
【０００２】
【従来の技術】血管新生、即ち、毛細血管内皮細胞の増
殖、移動及び組織への浸潤は胎児の生長、創傷治癒、癌
細胞の増殖等の生理的又は病理的現象において重要な役
割を果たしていることが知られている[(Folkman,J.,Can
cer Res.46:467(1986)]。血管新生を誘導する因子とし
ては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質として塩基
性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth facto
r, bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast
growth factor, aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／血管
透過性因子(vascular endothelial cell growth factor
/vascularpermeability factor, VEGF/VPF)、血小板由
来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothelial ce
ll growth factor, PD-ECGF)等が、又、間接的に血管内
皮細胞に作用する物質としてtransforming growth fact
or-α(TGF-α)、transforming growth factor-β(TGF-
β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)
等が見つけられている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.
Chem.,267:10931(1992)]。
殖、移動及び組織への浸潤は胎児の生長、創傷治癒、癌
細胞の増殖等の生理的又は病理的現象において重要な役
割を果たしていることが知られている[(Folkman,J.,Can
cer Res.46:467(1986)]。血管新生を誘導する因子とし
ては、直接的に血管内皮細胞に作用する物質として塩基
性線維芽細胞増殖因子(basic fibroblast growth facto
r, bFGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(acidic fibroblast
growth factor, aFGF)、血管内皮細胞増殖因子／血管
透過性因子(vascular endothelial cell growth factor
/vascularpermeability factor, VEGF/VPF)、血小板由
来内皮細胞増殖因子(platelet-derived endothelial ce
ll growth factor, PD-ECGF)等が、又、間接的に血管内
皮細胞に作用する物質としてtransforming growth fact
or-α(TGF-α)、transforming growth factor-β(TGF-
β)、angiogenin、tumor necrosis factor-α(TNF-α)
等が見つけられている[Folkman,J. & Shing,Y.,J.Biol.
Chem.,267:10931(1992)]。
【０００３】ＶＰＦは、マウス、ラット、モルモット、
ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で分泌されており、
又、組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在すること
が明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine
Rev iews 13:18(1992)]。又、ヒトＶＰＦは乳癌の血管
新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Med. 324:1(19
91)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ 168:231(199
4)]、或いは網膜疾患における血管新生[Adamis,A.P. e
t.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:631(1993)]に
関与していることが報告されている。さらにＶＰＦは標
的細胞表面に存在する受容体（Ｆlt-1，Ｆlk-1／ＫＤ
Ｒ) と結合することにより細胞内へシグナルを伝達する
ことが明らかになっているが[De Vies,C. et.al. Scien
ce,255:989(1992),Terman,B.I. et al. Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,187:1579(1992)]、ＶＰＦとその受容体
との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳細に
は解明されていない。
ウシ及びヒトの正常又は腫瘍細胞株で分泌されており、
又、組織別では脳、下垂体、腎臓、卵巣に存在すること
が明らかにされている[(Ferrara,N., et.al. Endocrine
Rev iews 13:18(1992)]。又、ヒトＶＰＦは乳癌の血管
新生と転移[Weider,N, et.al. N.Engl.J.Med. 324:1(19
91)]や腎細胞癌の血管新生[医学のあゆみ 168:231(199
4)]、或いは網膜疾患における血管新生[Adamis,A.P. e
t.al., Biochem.Biophys.Res.Comm.,193:631(1993)]に
関与していることが報告されている。さらにＶＰＦは標
的細胞表面に存在する受容体（Ｆlt-1，Ｆlk-1／ＫＤ
Ｒ) と結合することにより細胞内へシグナルを伝達する
ことが明らかになっているが[De Vies,C. et.al. Scien
ce,255:989(1992),Terman,B.I. et al. Biochem.Biophy
s.Res.Commun.,187:1579(1992)]、ＶＰＦとその受容体
との相互作用機構やシグナル伝達機構については詳細に
は解明されていない。
【０００４】ヒトＶＰＦ遺伝子についてはそのcＤＮＡ
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も決定されている。このＶＰＦ遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１２１個、
１６５個、１８９個、２０６個の４種類)が作られ、そ
れらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの(以下ＶＰ
Ｆ121という)と１６５個のアミノ酸残基数のもの(以下
ＶＰＦ165という)が血管内皮細胞に対する作用が強い[F
errara,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。
ＶＰＦ121はＶＰＦ165のカルボキシル末端付近の４４個
のアミノ酸が欠損したものであるが、ＶＰＦ121とＶＰ
Ｆ165の間に生体において血管内皮細胞に対する作用の
違いがあるかどうかについての詳細は明らかでない。
がすでに単離されて塩基配列が決定され、アミノ酸配列
も決定されている。このＶＰＦ遺伝子からアミノ酸残基
数の異なる４種類の蛋白(アミノ酸残基数が１２１個、
１６５個、１８９個、２０６個の４種類)が作られ、そ
れらの中で１２１個のアミノ酸残基数のもの(以下ＶＰ
Ｆ121という)と１６５個のアミノ酸残基数のもの(以下
ＶＰＦ165という)が血管内皮細胞に対する作用が強い[F
errara,N., et.al. Endocrine Reviews 13:18(1992)]。
ＶＰＦ121はＶＰＦ165のカルボキシル末端付近の４４個
のアミノ酸が欠損したものであるが、ＶＰＦ121とＶＰ
Ｆ165の間に生体において血管内皮細胞に対する作用の
違いがあるかどうかについての詳細は明らかでない。
【０００５】一方、モノクローナル抗体は抗血清(ポリ
クローナル抗体)に比べて特異性が高く、抗原決定基が
単一であるため必要な親和性の抗体を選択でき、恒常的
に均一な品質のものを得ることができる。したがって、
現在では生化学的な解析や臨床的には種々の疾患の診断
に広くモノクローナル抗体が使用されている。ヒトＶＰ
Ｆに対するモノクローナル抗体もＶＰＦ165については
すでに取得されているが、その抗体のＶＰＦ中の反応部
位は明らかではない[Kim,K.J. et.al. Growth Factors,
7:53(1992)] 。又、 マウスモノクローナル抗体の作製技
術は、Kohler & Milstein によりにすでに確立されてお
り[Kohler & Milstein, Nature 256:495(197 5)] 、蛋
白質、ペプチド、糖質、脂質或いは低分子化合物に対す
るモノクローナル抗体の作製が可能である。しかしなが
ら効率よくモノクローナル抗体を作製するためには免疫
する抗原として何を用いるかが重要である。すなわち、
ＶＰＦのような蛋白質(高分子物質)を抗原とする場合、
モノクローナル抗体と反応する部位は分子表面に存在す
るアミノ酸であるため、抗原分子中のどのアミノ酸が分
子表面に存在するかを明らかにすれば、その部分のアミ
ノ酸配列を抗原として用いることによって、容易にモノ
クローナル抗体を作製できると考えられる。本発明者等
は既にＶＰＦ121に対するモノクローナル抗体を得て報
告しているが、本発明者等はそれらのモノクローナル抗
体より強い抗腫瘍活性を有しているモノクローナル抗体
を見いだすべく研究を行ったのである。
クローナル抗体)に比べて特異性が高く、抗原決定基が
単一であるため必要な親和性の抗体を選択でき、恒常的
に均一な品質のものを得ることができる。したがって、
現在では生化学的な解析や臨床的には種々の疾患の診断
に広くモノクローナル抗体が使用されている。ヒトＶＰ
Ｆに対するモノクローナル抗体もＶＰＦ165については
すでに取得されているが、その抗体のＶＰＦ中の反応部
位は明らかではない[Kim,K.J. et.al. Growth Factors,
7:53(1992)] 。又、 マウスモノクローナル抗体の作製技
術は、Kohler & Milstein によりにすでに確立されてお
り[Kohler & Milstein, Nature 256:495(197 5)] 、蛋
白質、ペプチド、糖質、脂質或いは低分子化合物に対す
るモノクローナル抗体の作製が可能である。しかしなが
ら効率よくモノクローナル抗体を作製するためには免疫
する抗原として何を用いるかが重要である。すなわち、
ＶＰＦのような蛋白質(高分子物質)を抗原とする場合、
モノクローナル抗体と反応する部位は分子表面に存在す
るアミノ酸であるため、抗原分子中のどのアミノ酸が分
子表面に存在するかを明らかにすれば、その部分のアミ
ノ酸配列を抗原として用いることによって、容易にモノ
クローナル抗体を作製できると考えられる。本発明者等
は既にＶＰＦ121に対するモノクローナル抗体を得て報
告しているが、本発明者等はそれらのモノクローナル抗
体より強い抗腫瘍活性を有しているモノクローナル抗体
を見いだすべく研究を行ったのである。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は血管新生が関
与する疾患、特に腫瘍に対して格別に優れた活性、即
ち、優れた抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体の作
製に有効なＶＰＦ121の部分的なペプチド及びこれに反
応する優れた抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体の
提供を課題とするものである。
与する疾患、特に腫瘍に対して格別に優れた活性、即
ち、優れた抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体の作
製に有効なＶＰＦ121の部分的なペプチド及びこれに反
応する優れた抗腫瘍活性を有するモノクローナル抗体の
提供を課題とするものである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題に
にもとづいて鋭意研究を行った結果、既に報告のあるモ
ノクローナル抗体以上に強い抗腫瘍活性を有したモノク
ローナル抗体を得るとともにＶＰＦのアミノ酸配列中の
連続した１２アミノ酸からなる６７種類のペプチドのな
かに、遺伝子工学的に得られたＶＰＦに対する上記モノ
クローナル抗体と反応するペプチドを見い出し、言い換
えれば該ペプチドに反応するモノクローナル抗体の取得
に成功し本発明を完成させた。即ち、本発明は、アミノ
酸配列が配列番号１、配列番号２又は配列番号３のいず
れかであるペプチドに関するものである。更に本発明
は、前記ペプチドを認識するＶＰＦモノクローナル抗
体、特に等電点 pＩが５.２〜５.５であるモノクローナ
ル抗体に関するものである。更に本発明は、前記ＶＰＦ
モノクローナル抗体、該ＶＰＦモノクローナル抗体から
のキメラ抗体又はひと化抗体を有効成分とする医薬品に
関するものである。
にもとづいて鋭意研究を行った結果、既に報告のあるモ
ノクローナル抗体以上に強い抗腫瘍活性を有したモノク
ローナル抗体を得るとともにＶＰＦのアミノ酸配列中の
連続した１２アミノ酸からなる６７種類のペプチドのな
かに、遺伝子工学的に得られたＶＰＦに対する上記モノ
クローナル抗体と反応するペプチドを見い出し、言い換
えれば該ペプチドに反応するモノクローナル抗体の取得
に成功し本発明を完成させた。即ち、本発明は、アミノ
酸配列が配列番号１、配列番号２又は配列番号３のいず
れかであるペプチドに関するものである。更に本発明
は、前記ペプチドを認識するＶＰＦモノクローナル抗
体、特に等電点 pＩが５.２〜５.５であるモノクローナ
ル抗体に関するものである。更に本発明は、前記ＶＰＦ
モノクローナル抗体、該ＶＰＦモノクローナル抗体から
のキメラ抗体又はひと化抗体を有効成分とする医薬品に
関するものである。
【０００８】
【発明の実施の形態】以下本発明を詳細に説明する。本
発明のペプチドはＶＰＦモノクローナル抗体と特異的に
反応し得るものである。 （１）モノクローナル抗体の製造 ＶＰＦモノクローナル抗体は動物をＶＰＦで免疫し脾細
胞を取り出しこれをミエローマ細胞とを融合して得たハ
イブリドーマ細胞を培養することにより製造することが
できる。このハイブリドーマの製造は例えばKohlerとMi
lsteinの方法[Nature,256:495(1975)]等により行うこと
ができる。 抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
ＶＰＦ１０〜１００μｇの量を抗原として２〜３週間ご
とに最低２〜３回免疫を行う。動物の飼育及び脾細胞の
採取は常法に従って行われる。尚、免疫の際にはＶＰＦ
に例えばグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ等を融合
させて得られた蛋白質又はキーホールリンペットヘモシ
アニン等を結合させて得られた複合蛋白質を抗原として
用いることもできる。 ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマＳp2/Ｏ−Ａg
14(Ｓp2、Ｐ3/ＮＳ1/1-Ａg4-1(ＮＳ-1、Ｐ3×63Ａg8Ｕ.
1等が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に従
って行われる。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１：１０の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。 ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０-3〜１０-5Ｍ)、アミノプテリン(１０-6〜１０-7
Ｍ)、チミジン(１０-5〜１０-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。 ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発
明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。 モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる場合があ
る。モノクローナル抗体の選別には酵素免疫測定法、ウ
エスタンブロッティング法等が用いられる。又、モノク
ローナル抗体のアイソタイプの決定はモノクローナル抗
体の酵素免疫測定法又はオクタロニー法等によって行う
ことができる。
発明のペプチドはＶＰＦモノクローナル抗体と特異的に
反応し得るものである。 （１）モノクローナル抗体の製造 ＶＰＦモノクローナル抗体は動物をＶＰＦで免疫し脾細
胞を取り出しこれをミエローマ細胞とを融合して得たハ
イブリドーマ細胞を培養することにより製造することが
できる。このハイブリドーマの製造は例えばKohlerとMi
lsteinの方法[Nature,256:495(1975)]等により行うこと
ができる。 抗体産生細胞の調製 免疫用動物にはマウス、ラット、ウサギ等の齧歯類が用
いられる。ミエローマ細胞としてはマウスまたはラット
由来の細胞が用いられる。そして免疫動物１匹に対して
ＶＰＦ１０〜１００μｇの量を抗原として２〜３週間ご
とに最低２〜３回免疫を行う。動物の飼育及び脾細胞の
採取は常法に従って行われる。尚、免疫の際にはＶＰＦ
に例えばグルタチオン-Ｓ-トランスフェラーゼ等を融合
させて得られた蛋白質又はキーホールリンペットヘモシ
アニン等を結合させて得られた複合蛋白質を抗原として
用いることもできる。 ミエローマ細胞の調製 ミエローマ細胞としてはマウスミエローマＳp2/Ｏ−Ａg
14(Ｓp2、Ｐ3/ＮＳ1/1-Ａg4-1(ＮＳ-1、Ｐ3×63Ａg8Ｕ.
1等が挙げられる。これらの細胞の継代培養は常法に従
って行われる。 細胞融合 脾細胞とミエローマ細胞とを１：１〜１：１０の割合で
混合してポリエチレングリコールと混合するか電気パル
ス処理することにより細胞融合を行うことができる。 ハイブリドーマの選択 融合細胞（ハイブリドーマ）の選択はヒポキサンチン
(１０-3〜１０-5Ｍ)、アミノプテリン(１０-6〜１０-7
Ｍ)、チミジン(１０-5〜１０-6Ｍ)を含む培地を用いて
培養して生育してくる細胞をハイブリドーマとすること
により行われる。 ハイブリドーマの培養 ハイブリドーマのクローン化は限界希釈法により少なく
とも２回繰り返して行う。ハイブリドーマを通常の動物
細胞と同様にして培養すれば培地中に本発明のモノクロ
ーナル抗体が産生される。又、ハイブリドーマ細胞をマ
ウス腹腔内に移植して増殖することにより腹水中に本発
明のモノクローナル抗体を蓄積させることもできる。 モノクローナル抗体の採取及び精製 ハイブリドーマ細胞の培養液中又は腹水中に蓄積したモ
ノクローナル抗体は従来から用いられている硫安分画
法、ＰＥＧ分画法、イオン交換クロマトグラフィー及び
ゲル濾過クロマトグラフィーを用いる方法で精製され
る。又、プロテインＡやプロテインＧ等のアフィニティ
ークロマトグラフィーによる方法も利用できる場合があ
る。モノクローナル抗体の選別には酵素免疫測定法、ウ
エスタンブロッティング法等が用いられる。又、モノク
ローナル抗体のアイソタイプの決定はモノクローナル抗
体の酵素免疫測定法又はオクタロニー法等によって行う
ことができる。
【０００９】（２）モノクローナル抗体の反応部位の同
定 ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチドの作
製 ＶＰＦ121の連続した１２個のアミノ酸を１つのペプチ
ドとしてＶＰＦ121の全配列を網羅する６７種類のペプ
チドを設計する。設計された各ペプチドは例えばマルチ
ピンペプチド合成法［Maeji,N.J. et al.,J.Immunol.Me
thod,134:23(1990)]等により合成することができる。
尚、合成したペプチドの定量はオルトフタルアルデヒド
を用いてアミノ基を定量する事により行うことができ
る。 モノクローナル抗体と反応するペプチドの同定 以上のようにして合成した６７種類のペプチドはＶＰＦ
１２１の全領域に対応するものである。従って６７種の
ペプチドとモノクローナル抗体の反応性を調べることに
よりモノクローナル抗体がＶＰＦのどの部位に反応して
いるかを明らかにすることができる。反応性の測定には
酵素免疫測定法，オクタロニー法，ウエスタンブロッテ
ィング法等が用いられる。
定 ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチドの作
製 ＶＰＦ121の連続した１２個のアミノ酸を１つのペプチ
ドとしてＶＰＦ121の全配列を網羅する６７種類のペプ
チドを設計する。設計された各ペプチドは例えばマルチ
ピンペプチド合成法［Maeji,N.J. et al.,J.Immunol.Me
thod,134:23(1990)]等により合成することができる。
尚、合成したペプチドの定量はオルトフタルアルデヒド
を用いてアミノ基を定量する事により行うことができ
る。 モノクローナル抗体と反応するペプチドの同定 以上のようにして合成した６７種類のペプチドはＶＰＦ
１２１の全領域に対応するものである。従って６７種の
ペプチドとモノクローナル抗体の反応性を調べることに
よりモノクローナル抗体がＶＰＦのどの部位に反応して
いるかを明らかにすることができる。反応性の測定には
酵素免疫測定法，オクタロニー法，ウエスタンブロッテ
ィング法等が用いられる。
【００１０】（３）モノクローナル抗体の制癌剤として
の使用 本発明のＶＰＦモノクローナル抗体又はキメラ抗体又は
ヒト化抗体を制癌剤として投与する場合には投与する対
象を特に限定しない。例えば個々の癌種の予防或いは治
療することを特異目的として用いることができる。又投
与する方法は経口又は非経口でもよく経口投与には舌下
投与を包含する。非経口投与には注射例えば皮下、筋
肉、血管内注射，点滴、座剤等を含む。又、その投与量
は動物か人間かによって、又年齢、投与経路、投与回数
により異なり、広範囲に変えることができる。この場合
本発明のＶＰＦモノクローナル抗体の有効量と適切な希
釈剤および薬学的に使用し得る担体の組成物として投与
される有効量は０.１〜１００mg/kg体重/日であり１日
１回から数回に分けて投与される。本発明のＶＰＦモノ
クローナル抗体を経口投与する場合はそれに適用される
錠剤・顆粒剤・細粒剤・散剤・カプセル剤等は通常それ
らの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤・包含剤
・賦形剤・滑沢剤・崩壊剤・湿潤剤のような添加剤を含
有する。又、経口用液体製剤としては内用水剤・懸濁剤
・乳剤・シロップ剤等いずれでの状態であってもよく、
又、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であっても良
い。更にその組成物は添加剤・保存剤の何れを含有して
も良い。また非経口投与の場合には安定剤・緩衝剤・保
存剤・膨張化剤等の添加剤を含有し通常単位投与量アン
プル若しくは多投与量容器又はチューブの状態で提供さ
れる。上記の組成物は使用する際に適当な担体たとえば
発熱物質不含の滅菌された溶解剤で再溶解させる粉体で
あっても良い。
の使用 本発明のＶＰＦモノクローナル抗体又はキメラ抗体又は
ヒト化抗体を制癌剤として投与する場合には投与する対
象を特に限定しない。例えば個々の癌種の予防或いは治
療することを特異目的として用いることができる。又投
与する方法は経口又は非経口でもよく経口投与には舌下
投与を包含する。非経口投与には注射例えば皮下、筋
肉、血管内注射，点滴、座剤等を含む。又、その投与量
は動物か人間かによって、又年齢、投与経路、投与回数
により異なり、広範囲に変えることができる。この場合
本発明のＶＰＦモノクローナル抗体の有効量と適切な希
釈剤および薬学的に使用し得る担体の組成物として投与
される有効量は０.１〜１００mg/kg体重/日であり１日
１回から数回に分けて投与される。本発明のＶＰＦモノ
クローナル抗体を経口投与する場合はそれに適用される
錠剤・顆粒剤・細粒剤・散剤・カプセル剤等は通常それ
らの組成物中に製剤上一般に使用される結合剤・包含剤
・賦形剤・滑沢剤・崩壊剤・湿潤剤のような添加剤を含
有する。又、経口用液体製剤としては内用水剤・懸濁剤
・乳剤・シロップ剤等いずれでの状態であってもよく、
又、使用する際に再溶解させる乾燥生成物であっても良
い。更にその組成物は添加剤・保存剤の何れを含有して
も良い。また非経口投与の場合には安定剤・緩衝剤・保
存剤・膨張化剤等の添加剤を含有し通常単位投与量アン
プル若しくは多投与量容器又はチューブの状態で提供さ
れる。上記の組成物は使用する際に適当な担体たとえば
発熱物質不含の滅菌された溶解剤で再溶解させる粉体で
あっても良い。
【００１１】
【実施例】以下実施例により本発明をさらに具体的に説
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない （１）ＶＰＦモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 単離したヒトＶＰＦcＤＮＡにて形質転換した酵母の培
養液よりヒトＶＰＦを精製し(ＹＶＰＦ；特開平７−３
１４９６号参照)、キーホールリンペットヘモシアニン
(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複合体を作製
し、得られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノ
クローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-ＹＶＰＦで
免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞(Ｓp2)
をポリエチレングリコール存在下で細胞融合させた。得
られたハイブリドーマは限界希釈法によりクローニング
した。ＹＶＰＦとクローン化したハイブリドーマの培養
上清の反応性を酵素免疫測定法により調べ、ＹＶＰＦと
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を選択した。又、このハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体をＭＶ833と命名した。なお得られたモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマは通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５
１９２として寄託されている。
明する。但し本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない （１）ＶＰＦモノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマの作製 単離したヒトＶＰＦcＤＮＡにて形質転換した酵母の培
養液よりヒトＶＰＦを精製し(ＹＶＰＦ；特開平７−３
１４９６号参照)、キーホールリンペットヘモシアニン
(ＫＬＨ)とグルタルアルデヒドを用いて複合体を作製
し、得られた蛋白を抗原として常法に従ってマウスモノ
クローナル抗体を作製した。即ち、ＫＬＨ-ＹＶＰＦで
免疫したマウスの脾細胞とマウスミエローマ細胞(Ｓp2)
をポリエチレングリコール存在下で細胞融合させた。得
られたハイブリドーマは限界希釈法によりクローニング
した。ＹＶＰＦとクローン化したハイブリドーマの培養
上清の反応性を酵素免疫測定法により調べ、ＹＶＰＦと
反応するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ
を選択した。又、このハイブリドーマが産生するモノク
ローナル抗体をＭＶ833と命名した。なお得られたモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマは通商産業省
工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＰ−１５
１９２として寄託されている。
【００１２】（２）ＶＰＦモノクローナル抗体の調製 選択したハイブリドーマをヌードマウスの腹腔内に移植
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。又、下記の方法で測定したＶＰＦ121及びＶＰ
Ｆ165に対する解離定数は以下の通りであり本発明のモ
ノクローナル抗体はＶＰＦに対して強い親和性を有する
ことがわかる。 ○ １.１４×１０-11Ｍ±０.０７×１０-11Ｍ（ＶＰＦ
121) ○ １.１０×１０-10Ｍ±０.１１×１０-10Ｍ（ＶＰＦ
165) 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し取り外
し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で一
晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
を３０μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで調
製したＶＰＦと125Ｉ標識ＶＰＦ(125Ｉ標識ＶＰＦ121は
ＹＶＰＦをクロラミンＴ法により標識、125Ｉ標識ＶＰ
Ｆ165はアマシャム社より購入)反応混液を穴あたり２０
０μl添加して一晩放置する。この反応混液中のＶＰＦ
濃度はＶＰＦ121が０〜１ng/穴，ＶＰＦ165が０〜１０n
g/穴、125Ｉ標識ＶＰＦが１×１０４cpm/穴(125Ｉ標識
ＶＰＦ121 ; ６６.７pg/穴、125Ｉ標識ＶＰＦ165 ；１
１６pg/穴)とする。穴から反応混液を取り除き０.１％
ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した後、穴を１個ずつ切り離
して分析用チューブに入れガンマーカウンターにてカウ
ントしその結果から作成した散布図から解離定数を求め
る。又、下記の方法で測定した本発明のモノクローナル
抗体の等電点は pＩ＝５.２〜５.５であった。現時点で
報告のある他のＩgＧ1タイプの抗ＶＰＦモノクローナル
抗体の等電点は我々の報告しているＭＶ101が pＩ＝７.
０〜７.５でありジェネンテック社のＡ４.６.１が pＩ
＝４.２〜５.２[Kim,K.J. et.al. GrowthFactors,7:53
(1992)]であり本発明の物質はいずれの物質とも異なる
物質である。 等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。
し、モノクローナル抗体を大量に含む腹水を採取した。
この腹水中からプロテインＧアフィニティーカラム(Ｍ
ＡbＴrapＧII、ファルマシア社製）を用いてモノクロー
ナル抗体を精製した。又、抗体のクラスを抗マウス免疫
グロブリンサブクラス特異的抗体を用いた酵素免疫測定
法により調べた結果、ＭＶ833抗体のクラスはＩgＧ1で
あった。又、下記の方法で測定したＶＰＦ121及びＶＰ
Ｆ165に対する解離定数は以下の通りであり本発明のモ
ノクローナル抗体はＶＰＦに対して強い親和性を有する
ことがわかる。 ○ １.１４×１０-11Ｍ±０.０７×１０-11Ｍ（ＶＰＦ
121) ○ １.１０×１０-10Ｍ±０.１１×１０-10Ｍ（ＶＰＦ
165) 解離定数の測定方法 モノクローナル抗体を０.１Ｍ塩化ナトリウムを含む２
５mＭ炭酸緩衝液(pＨ=９.０)で２μg/mlに調製し取り外
し可能な有穴プレートに１００μlずつ添加し４℃で一
晩放置する。次に穴から溶液を除き１％ＢＳＡ-ＰＢＳ
を３０μlずつ添加し３７℃で４時間放置する。１％Ｂ
ＳＡ-ＰＢＳを取り除いた後０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳで調
製したＶＰＦと125Ｉ標識ＶＰＦ(125Ｉ標識ＶＰＦ121は
ＹＶＰＦをクロラミンＴ法により標識、125Ｉ標識ＶＰ
Ｆ165はアマシャム社より購入)反応混液を穴あたり２０
０μl添加して一晩放置する。この反応混液中のＶＰＦ
濃度はＶＰＦ121が０〜１ng/穴，ＶＰＦ165が０〜１０n
g/穴、125Ｉ標識ＶＰＦが１×１０４cpm/穴(125Ｉ標識
ＶＰＦ121 ; ６６.７pg/穴、125Ｉ標識ＶＰＦ165 ；１
１６pg/穴)とする。穴から反応混液を取り除き０.１％
ＢＳＡ-ＰＢＳで６回洗浄した後、穴を１個ずつ切り離
して分析用チューブに入れガンマーカウンターにてカウ
ントしその結果から作成した散布図から解離定数を求め
る。又、下記の方法で測定した本発明のモノクローナル
抗体の等電点は pＩ＝５.２〜５.５であった。現時点で
報告のある他のＩgＧ1タイプの抗ＶＰＦモノクローナル
抗体の等電点は我々の報告しているＭＶ101が pＩ＝７.
０〜７.５でありジェネンテック社のＡ４.６.１が pＩ
＝４.２〜５.２[Kim,K.J. et.al. GrowthFactors,7:53
(1992)]であり本発明の物質はいずれの物質とも異なる
物質である。 等電点の測定方法 モノクローナル抗体の等電点電気泳動は市販の等電点電
気泳動用アガロースゲル(和科盛社)を使用し同社の等電
点電気泳動層にて泳動した。泳動は等電力出力可能なパ
ワーサプライ(バイオラド社)により３Ｗで３０分間泳動
した。泳動後ゲルは銀染色キット(バイオラド社)にて蛋
白染色した。モノクローナル抗体の等電点は同時に泳動
した等電点マーカー蛋白の泳動度より抗体の等電点を求
めた。
【００１３】（５）ＶＰＦ中のモノクローナル抗体の反
応部位の同定 （ａ）ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチ
ドの作製 ヒトＶＰＦ121のアミノ配列の連続した１２個のアミノ
酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種のペ
プチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合成
法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用ピ
ンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニルメ
トキシカルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりＦmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジ
イミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-
アミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗
浄後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合さ
せ、この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合
成した。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行
い、さらにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。
ピン上で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すこ
とにより切り出した。合成したペプチドの定量はオルト
フタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量することによ
り行った。合成した６７種のペプチドのアミノ酸配列を
表１に示した。数字はペプチド識別番号を示す。
応部位の同定 （ａ）ＶＰＦのアミノ酸配列の一部分に相当するペプチ
ドの作製 ヒトＶＰＦ121のアミノ配列の連続した１２個のアミノ
酸を１つのペプチドとして全配列を網羅する６７種のペ
プチドを考案し、各ペプチドをマルチピンペプチド合成
法[Maeji,N,J, et.al. J.Immunol.method,134:23(199
0)]により合成した。まず９６穴アッセイプレート用ピ
ンブロックのピンの先端に導入された9-フルオレニルメ
トキシカルボニル(Ｆmoc)-β-アラニンからピペリジン
によりＦmoc基を除去した後、ジシクロヘキシカルボジ
イミドとヒドロキシベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-
アミノ酸を縮合させた。N,N-ジメチルホルムアミドで洗
浄後、再びジシクロヘキシカルボジイミドとヒドロキシ
ベンゾトリアゾール存在下でＦmoc-アミノ酸を縮合さ
せ、この操作を繰り返すことにより目的のペプチドを合
成した。縮合反応終了後、無水酢酸でアセチル化を行
い、さらにトリフルオロ酢酸で側鎖保護基を除去した。
ピン上で合成したペプチドはピンを中性溶液中に浸すこ
とにより切り出した。合成したペプチドの定量はオルト
フタルアルデヒドを用いてアミノ基を定量することによ
り行った。合成した６７種のペプチドのアミノ酸配列を
表１に示した。数字はペプチド識別番号を示す。
【００１４】
【表１】
【００１５】（ｂ）ＭＶ833抗体と反応するペプチドの
同定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＰ
Ｆ121の全領域に対応するものである。したがって６７
種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べることに
よりＭＶ833抗体がＶＰＦのどの部位に反応しているか
を明らかにすることができる。そこで酵素免疫測定法に
より６７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べ
た。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社製)に６７種の
２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３回洗浄した
後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間放置した。
２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１％ＢＳＡ-Ｐ
ＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ
-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヒツジ
抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶
液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニレンジアミン２
塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含む０.２Ｍトリス
−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて発色させた。反
応は２規定硫酸を加えて停止させた後、吸光度(ＯＤ４
９０／６５０)を測定した。以上の方法で測定した結果
をグラフにプロットし図１に示した。
同定 以上のようにして合成した６７種のペプチドはヒトＶＰ
Ｆ121の全領域に対応するものである。したがって６７
種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べることに
よりＭＶ833抗体がＶＰＦのどの部位に反応しているか
を明らかにすることができる。そこで酵素免疫測定法に
より６７種のペプチドとＭＶ833抗体との反応性を調べ
た。９６穴ＮＯＳプレート(コースター社製)に６７種の
２０μＭペプチド溶液を入れ室温で２時間放置した。
０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳでプレートの穴を３回洗浄した
後、２％ＢＳＡ-ＰＢＳを入れ室温で１時間放置した。
２％ＢＳＡ-ＰＢＳを除いた後、ＭＶ833(１％ＢＳＡ-Ｐ
ＢＳ溶液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ
-ＰＢＳで６回洗浄後ペルオキシダーゼ標識したヒツジ
抗マウスＩgＧ(アマシャム社)(０.１％ＢＳＡ-ＰＢＳ溶
液)を入れ室温で１時間放置した。０.１％ＢＳＡ-ＰＢ
Ｓで６回洗浄後８.３mg/mlオルトフェニレンジアミン２
塩酸塩および０.０１％過酸化水素を含む０.２Ｍトリス
−クエン酸緩衝液(pＨ=５.２)を入れて発色させた。反
応は２規定硫酸を加えて停止させた後、吸光度(ＯＤ４
９０／６５０)を測定した。以上の方法で測定した結果
をグラフにプロットし図１に示した。
【００１６】ＭＶ833抗体は６７種類のペプチドの中で
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＰＦ
のＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ
配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反応している
ことが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出して
いる部分を認識すると考えられるため、この２種類のア
ミノ酸配列部分はＶＰＦの表面に露出している部分であ
ると言える。又、モノクローナル抗体は抗原決定基が単
一であると言われているが、高次構造をとっている蛋白
質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が立体的に抗原
を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体の反応性を調
べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配列に反応する
ことがある。ＭＶ833抗体がＶＰＦ中の二箇所のアミノ
酸配列部分に反応したことより、本抗体は二箇所のアミ
ノ酸配列部分を立体的に同時に認識していると考えられ
る。
ペプチド識別番号３１、３２、３３、６０、６３の５つ
のペプチドに強く反応した。ペプチド識別番号３１〜３
３のペプチドにはＫＰＳＣＶＰＬＭＲという配列が共通
に含まれていることより、この領域ではＭＶ833抗体は
ＫＰＳＣＶＰＬＭＲというアミノ酸配列部分と反応して
いると考えられる。したがって、ＭＶ833抗体はＶＰＦ
のＫＰＳＣＶＰＬＭＲ配列とＳＦＬＱＨＮＫＣＥＣＲＰ
配列とＫＣＥＣＲＰＫＫＤＲＡＲ配列とに反応している
ことが予想される。抗体はタンパク質の表面に露出して
いる部分を認識すると考えられるため、この２種類のア
ミノ酸配列部分はＶＰＦの表面に露出している部分であ
ると言える。又、モノクローナル抗体は抗原決定基が単
一であると言われているが、高次構造をとっている蛋白
質などの高分子物質が抗原の場合は抗体が立体的に抗原
を認識し、蛋白質の一次構造レベルで抗体の反応性を調
べた時に二箇所以上の不連続なアミノ酸配列に反応する
ことがある。ＭＶ833抗体がＶＰＦ中の二箇所のアミノ
酸配列部分に反応したことより、本抗体は二箇所のアミ
ノ酸配列部分を立体的に同時に認識していると考えられ
る。
【００１７】微量タンパク質やウイルスの研究を行う場
合現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩基
配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。この
アミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索し、
その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用いてい
る。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824(1981)]などを用
いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあてはまる
とは限らない。したがって本発明によりＶＰＦの表面に
露出している部位の中で腫瘍増殖に重要である部分が明
らかにされたことにより強い抗腫瘍活性を有したＶＰＦ
抗体を容易に作製できるようになり、また、本発明に採
用された方法は蛋白質の表面に露出している部位を明ら
かにする方法としても適用されるものである。
合現在ではその遺伝子のクローニングを行い、その塩基
配列よりタンパク質のアミノ酸配列が予想できる。この
アミノ酸配列をもとにして親水性の高い部位を探索し、
その部位の合成ペプチドに対するポリクローナル抗体や
モノクローナル抗体を作製して免疫学的解析に用いてい
る。親水性の高い部位の探索にはHoop＆Woodsらの方法
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824(1981)]などを用
いて解析しているが、あらゆるタンパク質にあてはまる
とは限らない。したがって本発明によりＶＰＦの表面に
露出している部位の中で腫瘍増殖に重要である部分が明
らかにされたことにより強い抗腫瘍活性を有したＶＰＦ
抗体を容易に作製できるようになり、また、本発明に採
用された方法は蛋白質の表面に露出している部位を明ら
かにする方法としても適用されるものである。
【００１８】（６）ＶＰＦモノクローナル抗体の抗腫瘍
試験 ＨＴ-１０８０のヌードマウス腫瘍系を用いて本発明の
モノクローナル抗体の抗腫瘍試験を以下の通り行った。
予め腫瘍細胞ＨＴ-１０８０をヌードマウス皮下に移植
し腫瘍塊ができるまで飼育した。ついで腫瘍塊を２mm角
程度に切り取りこれを別のヌードマウスの腹部皮下に移
植した。移植翌日より本発明のモノクローナル抗体を２
５μg/マウス/日の投与量で合計９回腹腔内投与した(投
与日は１〜４、７〜１１日目とした)。またモノクロー
ナル抗体と投与しないもの本発明ではないモノクローナ
ル抗体(ＭＶ101抗体およびＭＶ303抗体)を投与したもの
を対照とした。なお実験に使用したヌードマウスは各群
４匹で行った。各群の腫瘍の形成および腫瘍の大きさ
(体積)を比較した結果、図２に示すとおりモノクローナ
ル抗体非投与のものと比較した場合はもちろん本発明の
もの以外のモノクローナル抗体を投与したものに比較し
ても本発明のモノクローナル抗体は優れた腫瘍増殖抑制
活性が確認された。図２中、白丸はモノクローナル抗体
非投与群，黒丸は本発明のＶＰＦモノクローナル抗体Ｍ
Ｖ833投与群，黒三角および黒四角はいずれも本発明の
ものでないＶＰＦモノクローナル抗体投与でありそれぞ
れＭＶ101およびＭＶ303を示す。
試験 ＨＴ-１０８０のヌードマウス腫瘍系を用いて本発明の
モノクローナル抗体の抗腫瘍試験を以下の通り行った。
予め腫瘍細胞ＨＴ-１０８０をヌードマウス皮下に移植
し腫瘍塊ができるまで飼育した。ついで腫瘍塊を２mm角
程度に切り取りこれを別のヌードマウスの腹部皮下に移
植した。移植翌日より本発明のモノクローナル抗体を２
５μg/マウス/日の投与量で合計９回腹腔内投与した(投
与日は１〜４、７〜１１日目とした)。またモノクロー
ナル抗体と投与しないもの本発明ではないモノクローナ
ル抗体(ＭＶ101抗体およびＭＶ303抗体)を投与したもの
を対照とした。なお実験に使用したヌードマウスは各群
４匹で行った。各群の腫瘍の形成および腫瘍の大きさ
(体積)を比較した結果、図２に示すとおりモノクローナ
ル抗体非投与のものと比較した場合はもちろん本発明の
もの以外のモノクローナル抗体を投与したものに比較し
ても本発明のモノクローナル抗体は優れた腫瘍増殖抑制
活性が確認された。図２中、白丸はモノクローナル抗体
非投与群，黒丸は本発明のＶＰＦモノクローナル抗体Ｍ
Ｖ833投与群，黒三角および黒四角はいずれも本発明の
ものでないＶＰＦモノクローナル抗体投与でありそれぞ
れＭＶ101およびＭＶ303を示す。
【００１９】
【発明の効果】本発明によりＶＰＦの腫瘍増殖に重要な
一部分のペプチドおよびこれと反応するモノクローナル
抗体が提供され、本発明のペプチドはＶＰＦに対する強
い抗腫瘍活性を有した抗体の作製、ＶＰＦの活性発現を
生化学的な解析をするのに有用であり、また、該ペプチ
ドと反応する本発明のＶＰＦモノクローナル抗体はＶＰ
Ｆの生化学的な解析をするための試薬としてさらには血
管新生が関与する疾患の治療や癌の増殖の抑制剤として
も利用可能なものである。
一部分のペプチドおよびこれと反応するモノクローナル
抗体が提供され、本発明のペプチドはＶＰＦに対する強
い抗腫瘍活性を有した抗体の作製、ＶＰＦの活性発現を
生化学的な解析をするのに有用であり、また、該ペプチ
ドと反応する本発明のＶＰＦモノクローナル抗体はＶＰ
Ｆの生化学的な解析をするための試薬としてさらには血
管新生が関与する疾患の治療や癌の増殖の抑制剤として
も利用可能なものである。
【００２０】
配列番号：１ 配列の長さ：９ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：２ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン： 配列番号：３ 配列の長さ：１２ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直線状 配列の種類：タンパク質 起源： セルライン：
【図面の簡単な説明】
【図１】ヒトＶＰＦ121中の一部分に相当する６７種の
ペプチドに対するＭＶ833抗体の反応性を調べた図であ
る。
ペプチドに対するＭＶ833抗体の反応性を調べた図であ
る。
【図２】ＭＶ833抗体の抗腫瘍活性を示す図である(ＭＶ
833抗体 ●：ＭＶ101抗体 ▲：ＭＶ303抗体 ■：非
投与 ○)
833抗体 ●：ＭＶ101抗体 ▲：ＭＶ303抗体 ■：非
投与 ○)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/08 9162−4Ｂ Ｃ // Ｃ１２Ｎ 5/10 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 松本 友恵 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 岡本 雅次 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内 (72)発明者 鈴木 日出夫 茨城県つくば市大久保２番 東亞合成株式 会社つくば研究所内
Claims (5)
- 【請求項１】 アミノ酸配列が配列番号１、配列番号２
又は配列番号３のいずれかであるペプチド。 - 【請求項２】 請求項１記載のペプチドと反応する血管
内皮細胞増殖因子モノクローナル抗体。 - 【請求項３】 請求項１記載のペプチドと反応し等電点
pＩが５.２〜５.５である血管内皮細胞増殖因子モノク
ローナル抗体。 - 【請求項４】 請求項２又は請求項３記載の抗体を有効
成分とする医薬 - 【請求項５】 請求項２又は請求項３記載の抗体から得
られるキメラ抗体又はヒト化抗体を有効成分とする医薬
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7308184A JPH09124697A (ja) | 1995-11-01 | 1995-11-01 | ペプチド及びモノクローナル抗体 |
| US08/742,243 US6024955A (en) | 1995-11-01 | 1996-10-31 | Peptides and monoclonal antibodies |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7308184A JPH09124697A (ja) | 1995-11-01 | 1995-11-01 | ペプチド及びモノクローナル抗体 |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09124697A true JPH09124697A (ja) | 1997-05-13 |
Family
ID=17977928
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7308184A Pending JPH09124697A (ja) | 1995-11-01 | 1995-11-01 | ペプチド及びモノクローナル抗体 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JPH09124697A (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US20020137890A1 (en) * | 1997-03-31 | 2002-09-26 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| US20030190669A1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-10-09 | Genentech, Inc. | Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same |
| BR0010017A (pt) | 1999-04-28 | 2002-06-11 | Univ Texas | Composições e processos para o tratamento de câncer por inibição seletiva de vegf |
| US6703020B1 (en) | 1999-04-28 | 2004-03-09 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF |
| US6562571B1 (en) * | 1999-05-25 | 2003-05-13 | University Of Rochester | Human heme-regulated initiation factor 2-α kinase |
| EP1183047B1 (de) * | 1999-06-12 | 2003-08-27 | bitop Aktiengesellschaft für biotechnische Optimierung | Proteinenthaltende pharmazeutische zubereitung |
| SK5482003A3 (en) * | 2000-11-10 | 2004-03-02 | Wyeth Corp | Adjuvant combination formulations |
| US7202335B2 (en) * | 2001-12-06 | 2007-04-10 | Genentech, Inc. | PRO300 polypeptides |
| FR2902799B1 (fr) * | 2006-06-27 | 2012-10-26 | Millipore Corp | Procede et unite de preparation d'un echantillon pour l'analyse microbiologique d'un liquide |
| MX2009003229A (es) | 2006-09-29 | 2009-06-18 | Oncomed Pharm Inc | Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer. |
| US8569464B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-10-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| WO2008079302A2 (en) | 2006-12-21 | 2008-07-03 | Millipore Corporation | Purification of proteins |
| US8362217B2 (en) | 2006-12-21 | 2013-01-29 | Emd Millipore Corporation | Purification of proteins |
| WO2009151514A1 (en) * | 2008-06-11 | 2009-12-17 | Millipore Corporation | Stirred tank bioreactor |
| SG171446A1 (en) | 2008-12-16 | 2011-07-28 | Millipore Corp | Stirred tank reactor and method |
| ES2895226T3 (es) | 2009-10-16 | 2022-02-18 | Mereo Biopharma 5 Inc | Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos |
| CN102892791B (zh) | 2010-05-17 | 2017-05-17 | Emd密理博公司 | 用于纯化生物分子的刺激响应性聚合物 |
| US8551479B2 (en) | 2010-09-10 | 2013-10-08 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Methods for treating melanoma |
| BR112014007035B1 (pt) | 2011-09-23 | 2021-05-04 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc | anticorpos biespecíficos que se ligam a vegf/dll4, composição farmacêutica e célula procariótica, fúngica ou de levedura que compreende os mesmos, moléculas de polinucleotídeo, vetor, usos terapêuticos e método para a produção de um anticorpo |
| EP2914961A4 (en) | 2012-10-31 | 2016-04-20 | Oncomed Pharm Inc | METHODS AND MONITORING A TREATMENT BY AN ANTAGONIST OF DLL4 |
| US20150231077A1 (en) | 2014-02-17 | 2015-08-20 | The Cleveland Clinic Foundation | Amine passivated nanoparticles for cancer treatment and imaging |
| DK3212233T3 (da) | 2014-10-31 | 2020-07-27 | Oncomed Pharm Inc | Kombinationsterapi til behandling af sygdom |
| AU2016326609B2 (en) | 2015-09-23 | 2023-03-09 | Mereo Biopharma 5, Inc. | Methods and compositions for treatment of cancer |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5491284A (en) * | 1988-10-05 | 1996-02-13 | Anticancer Incorporated | Nude mouse model for neoplastic disease |
-
1995
- 1995-11-01 JP JP7308184A patent/JPH09124697A/ja active Pending
-
1996
- 1996-10-31 US US08/742,243 patent/US6024955A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US6024955A (en) | 2000-02-15 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
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