JP2003524680A - 刺激応答性高分子を用いた親和力制御型材料および該材料を用いた分離精製方法 - Google Patents
刺激応答性高分子を用いた親和力制御型材料および該材料を用いた分離精製方法Info
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Abstract
Description
epolymer)および(b)親和力制御型材料(affinity con
trolling material)と接触して溶液中に存在する標的物質に
対する親和力を有する親和性物質(リガンド)(affinitive sub
stance(ligand))を含む親和力制御型材料に関する。当該材料に
刺激、例えば、物理的刺激、を受けさせることによってリガンドの周囲に与えら
れた化学的および/または物理的環境を変化させ、それによりリガンドと標的物
質の間の親和力を変化させることができる。環境変化は、典型的には刺激応答性
高分子の構造変化に関係する。
は溶解された緩衝成分および塩(イオン)を含有する。典型的な溶液は、液体成
分として水、有機溶媒およびそれらの混合溶液のような溶媒を有する。有機溶媒
としては特に水と混和性のある溶媒、例えば、水混和性アルコール、アセトニト
リル、テトラヒドロフラン等、およびこれらの混合溶媒が挙げられる。本発明に
おいて、「親和力の変化」、「親和力を変化させること」等という用語は見かけ
の親和力(apparent affinity)、すなわち、適用される条件
下で測定することができる親和力を指す。
あるいは分離材料(separation material)とも称する。 さらに、本発明は、他の物質を含む混合物から望ましい標的物質(金属イオン
、医薬品、生体成分(biological components)など)を
除去あるいは分離および/または精製する親和力制御型材料に関する。
薬品、生体成分など)を分離精製する方法に関する。当該方法は、温度以外の条
件(例えば、溶液中のpHまたは有機溶媒もしくは塩などの濃度)のうち少なく
とも1つの条件を一定にすることを含むことが好ましい。
て親和性結合(affinity binding)に基づくイオン交換クロマ
トグラフィー、逆相クロマトグラフィー、および他のアフィニティークロマトグ
ラフィー並びに種々のバッチ式プロトコル(batch−wise proto
cols)などがこれまでに用いられている。さらに、近年バイオテクノロジー
技術の発展に伴い、組み換えタンパク質などの新規な生理活性物質が多数開発さ
れている。同時に、生理活性を失わないでこれらの物質を分離精製する改良方法
が求められている。
分離および/または精製並びに他の吸着に基づく分離技術は分離工程(吸着工程
)および放出工程(脱着工程または溶出工程)を典型的に包含する。結合工程と
比較して、放出工程は分離媒体と接触している液体の組成物の変化を必要とする
。適切な変化を実施する具体例は、有機溶媒を移動相に添加すること、移動相の
塩濃度を高めること、または移動相のpH値を変化させることである。これはバ
ッチ式処理において用いられる乱流液相(turbulent liquid
phase)または非乱流液相(non−turbulent liquid
phase)にも適用される。これらの操作は生理活性物質の失活の原因となる
。また、従来のクロマトグラフィーにより活性を保持したまま生理活性物質を分
離精製することができたとしても、多くの場合、移動/液体相に添加した有機溶
媒、塩などを少なくとも精製した若しくは単離した標的物質から一部除去する必
要がある。これにより標的物質の活性および/または回収/収量が低下するとい
う別の問題点があった。
て用いられる種類の不溶性分離媒体(insoluble separatio
n medium)への目的物質の結合または分配に基づく他の技術と刺激応答
性高分子を組み合わせることに関心が集まっている。
いての記載が見られる。例えば、WO99/61904に対応する日本出願14
0722/98を参照されたい。
7−43およびWO94/154951は、複数のリガンド基がベースマトリッ
クス(base matrix)に共有結合しているクロマトグラフィーシステ
ムにおける標的物質の温度溶出を記載している。温度応答性高分子は多点結合(
multi−point attachment)によりリガンド基に間接的に
結合している。すなわち、熱応答性高分子(thermo−responsiv
e polymer)の結合は、ベースマトリックスへのリガンドの事前結合(
prior attachment)に依存している。温度を変化させることに
より、リガンドは多かれ少なかれその標的物質に親和性結合(affinity
bond)しやすくなる。
答性高分子に結合させる分離方法を記載している。結合と標的物質の溶出が臨界
溶液温度(critical solution temperature)の
同じ側で生じる。臨界溶液温度という用語については熱応答性高分子に関する記
載においてさらに言及する。
いない分離材料に基づくクロマトグラフィーについて記載した文献も数多く存在
する。Gewehr et al(Macromolecular Chemi
stry and Physics 193(1992)249−256)は、
温度応答性高分子で被覆した多孔質シリカビーズ上のゲルクロマトグラフィーを
記載している。Hosoya et al(細谷ら)(Anal.Chem.6
7(1995)1907−1911);Yamamoto et al.(山本
ら)(Proc.114th National Meeting of the
Pharmaceutical Society of Japan,Tok
yo(1994)160;Kanazawa et al(金澤ら)(薬学雑誌
117(10−11)(1997)817−824頁);Kanazawa e
t al(金澤ら)(Anal.Chem.68(1)(1996)100−1
05);Kanazawa et al(金澤ら)(Anal.Chem.69
(5)(1997)823−830);Kanazawa et al(金澤ら
)(J.Pharm.Biomed.Anal.15(1997)1545−1
550);Yakushiji et al(薬師寺ら)(Langmuir1
4(16)1998)4657−466268);Kanazawa et a
l(金澤ら)(Trends Anal. Biochem.17(7)(19
98)435−440);Yakushiji et al(薬師寺ら)(An
al.Chem.71(6)1999)1125−1130);Grace &
Co(EP534016);Okano(岡野)(特開平6−108643)
は、生体分子の分離に用いる熱応答性高分子によって被覆されたマトリックス上
の逆相クロマトグラフィーを記載している。このマトリックスは多孔質であって
もよい。利用される疎水性基は高分子中にそのようなものとして本来備わってい
る。重合化後に高分子に共有結合しているリガンドはない。
nd)の間で抱合体(conjugate)を用いて共有結合により機能化され
た(covalently functionalized)分離媒体および(
b)刺激応答性高分子および親和性リガンドの個々の/独立した結合によって機
能化された分離媒体に基づきクロマトグラフィー上で分離を実施するという一般
的着想(general ideas)のある側面がそれぞれ1999年3月2
8日および1999年5月27日に日本化学会の全国大会で発表された(SPS
J(日本高分子学会)、年会、要旨集583頁)。
ある。典型的には、この粒子はリガンドが直接的に若しくは間接的に、例えば、
スペーサーを介して結合しているベースマトリックスを含む。粒子の材料は、ス
チレン架橋重合体物(polimerisate)、アクリレート/メタクリレ
ート架橋重合体物および同様な物質の架橋重合体物のような合成高分子であって
もよい。しかし、ポリスチレン粒子およびポリメタクリレート粒子自体は相対的
に疎水性であり、したがって、しばしば目的とする標的物質とともに存在する可
能性のある種々の物質の顕著でかつ非特異的な吸着を示す。このような粒子が親
和性に基づく分離において支持体として使用しようとする場合、したがって疎水
性/非特異性吸着を最小化するためにその粒子を十分に親水性にすることが必要
である。粒子の分離精製能力を改善するために、粒子径のそろった粒子(モノサ
イズ化された(monosized)粒子または均散化された(monodis
persed)粒子)を使用することがしばしば好都合である。
が求められているものが、その製造法はあまり多くないのが実状である。
離方法および分離材料を可能にすることである。ような現状に鑑み、タンパク質
との非特異的吸着を抑え分離性能の高い支持体を利用して、温度以外の条件(例
えば、溶液中のpHまたは有機溶媒もしくは塩などの濃度)のうち少なくとも1
つの条件を一定にしたまま、物理的刺激で生理活性物質などの標的物質を分離精
製する親和力制御型材料およびかかる親和力制御型材料を用いた標的物質の分離
精製法を提供することである。
(リガンド)をそれぞれ独立して支持体に、すなわち、分離結合構造(sepa
rate linking structures)を介して結合することで親
和力制御型材料を合成できることを見出した。また、本発明者は、かかる親和力
制御型材料によって吸着された標的物質を、物理的刺激以外の条件のうち少なく
とも1つの条件を一定にしたまま、温度変化のような物理的刺激のもとで脱着で
きることを見出した。例えば、もしこの刺激が温度変化であるならば、一定にし
ておくべき条件は、例えば、pH、有機溶媒の濃度、塩濃度などの中から選択す
ることが可能である。また、本発明者は、リガンドと標的物質の間の結合能力は
、リガンドが支持体/ベースマトリックスに結合するスペーサーの長さ、あるい
は支持体に結合する刺激応答性高分子の大きさが標的物質に依存することを見出
した。
化された=均散化された)ものであってもよい親水性多孔質ポリマー粒子を使用
することも見い出した。かくて、本発明のこの部分において、本発明者は、膜乳
化法によって得られたモノマーの乳濁液/懸濁液の重合化により得られた粒子を
使用することを見い出した。またこの実施態様は、酸性物質あるいは塩基性物質
で粒子を化学処理し、親水性基または/またはリガンドおよび/または刺激応答
性高分子の共有結合、例えば、ヒドロキシ基および/またはアミノ基の共有結合
を可能にする基を含む。この化学処理は、膜乳化法において用いられる出発材料
(モノマー)が利用された酸性物質あるいは塩基性物質と反応することができる
ということを必要とする。典型的な反応性基はこれまでエポキシ基であった。本
発明はこれらの知見に基づいて完成したものである。
に関する。主要な特徴点のうちの1つはベースマトリックスに対して刺激応答性
高分子とリガンドが個々の/独立した結合により結合しているということである
。臨界レベル/強度(critical level/intensity)の
一方の側から他方の側に当該高分子に関する適切な刺激のレベルおよび/または
強さを変化させると、リガンドとその標的物質の間における親和力の可逆的な変
化がもたらされる。この刺激は物理的刺激であってもよく、実験の部においては
温度変化を典型的な例として挙げている。
定にしたまま物理的刺激のもとで刺激応答性高分子の化学的または物理的環境を
変更すること、すなわち、他の刺激のうち少なくとも1つの刺激を一定にしたま
ま熱応答性高分子を1つの物理的刺激の変化にさらすことにより、標的物質の親
和性物質における親和力を可逆的に変化させる親和力制御型材料に関する。もし
変化させる刺激が温度である場合、温度以外の少なくとも1つの条件/刺激(例
えば、pH、有機溶媒の濃度または塩の濃度)を本質的に一定に維持する。
大きさ に依存する上で定義した通りの親和力制御型材料/分離媒体に関する。
径を有するおよび/または膜乳化法から得られたモノマー乳濁液/懸濁液の重合
化により製造される親水性多孔質ポリマー粒子を含む、上で定義した通りの親和
力制御型材料に関する。酸性物質あるいは塩基性物質と反応性のある官能基を示
す疎水性粒子は、この種の物質と反応させることにより疎水性の度合いを低下さ
せることが可能である。反応性基の典型的な例はエポキシ基である。すなわち、
もし膜乳化法が重合化を必要とする場合は、出発モノマーはエポキシ基を含有す
る。
して利用することに関する。 本発明の別の実施態様は、液体試料(溶液)(液体I)から1種若しくは2種
以上の標的物質を分離する方法である。この実施態様は次の工程を含む: (a)標的物質を含有する液体試料(液体(I))を(クロマトグラフィー用充
填剤を含む)分離媒体と接触させ(この分離媒体はリガンドで機能化されており
、このリガンドは標的物質に親和性結合(affinity binding)
することが可能である)、この接触は前記標的物質を前記リガンドに結合するこ
とを許容する条件下で実施されること; (b)前記標的物質を前記リガンドからこの標的物質を含有していない液体(I
I)に放出するように、前記担体(carrier)を液体(II)に接触させ
ること。
。工程(b)の後で、液体(II)は分離媒体から分離してもよい。標的物質は
、もしそのように望むのであれば、液体(II)から取り出してもよい。分離媒
体は工程(a)と(B)の間に洗浄してもよい。
構造(核酸を含む)、ポリペプチド構造(タンパク質を含む)、炭水化物構造、
ステロイド構造等の中から選択される構造を有する生物学的有機分子(bioo
rganic molecules)である標的物質に関しては、上記液体は典
型的にはこれまで水性であった。
高分子とリガンドが別個に結合されている支持体/ベースマトリックスを含むこ
と、および (ii) 工程(a)において、かつ少なくともリガンドに標的物質を結合する
間に、刺激応答性高分子が標的物質のリガンドへの結合を高めるコンフォメーシ
ョン(conformation)となるレベル/強度の刺激を分離媒体に受け
させること、および (iii)工程(b)において、かつ少なくともリガンドから標的物質を放出す
る間に、刺激応答性高分子が標的物質のリガンドへの結合を妨げるコンフォメー
ションとなるレベル/強度の刺激を分離材料に受けさせること。
。工程(a)と比較して、工程(b)における刺激のレベル/強さは用いられた
刺激感応性高分子(stimulus−sensitive polymer)
についての臨界レベル/強度の反対側にある。工程bの後、典型的には個々の洗
浄/再生工程(washing/regeneration steps)およ
び平衡工程(equilibration steps)の後で工程aを繰り返
す場合は、この処理を循環させることができる。
マトグラフィーによる方法でも実施することが可能である。クロマトグラフィー
による方法は、例えば、個々の工程およびベースマトリックスに結合された刺激
応答性高分子に関して分離媒体の床(bed)に適切な刺激を受けさせながら、
プラグ流れ(plug flow)(移動相)における種々の液体を前記床に通
過させることにより実施することが可能である。この床は多孔質モノリス(po
rous monolith)であってもよいし充填された若しくは流動化粒子
の床であってもよい。
、pH等が適用されてもよい。刺激応答性高分子はしばしば「インテリジェント
な高分子(intelligent polymers)」と呼ばれる。
さらされると、それらの物理化学的性質の構造的かつ可逆的変化を受けることに
より特徴付けられる。この変化は、顕著な疎水性から顕著な親水性への転換また
は顕著な親水性から顕著な疎水性への転換であると言ってよい。この転換が生じ
るのに必要な刺激の厳密なレベル/強度は刺激の臨界レベル(critical
level)または臨界強度(critical intensity)と呼
ばれ、当該高分子の構造、またしばしば他の条件(溶媒、塩などの溶質、等)に
よって決まる。この種の最も周知でありかつ最も利用される高分子は熱に応答す
る(熱応答性高分子または温度応答性高分子)。温度応答性高分子は、それらが
顕著な親水性状態から顕著な疎水性状態へ、および顕著な疎水性状態から顕著な
親水性状態へ転換する鋭敏な温度限界(sharp temperature
limit)によって認識される。溶液中における温度応答性高分子については
、コンフォメーション/物理化学的性質の変化はいわゆる臨界溶液温度(cri
tical solution temperature:CST)において起
こる。
または高臨界溶液温度(UCST)がある。LCSTを有する高分子について、
当該高分子は、温度がLCSTより低い温度からLCSTを通過しているときに
親水性コンフォメーションから疎水性コンフォメーションへ変化する。UCST
を有する高分子について、当該高分子は、温度がUCSTより低い温度からUC
STを通過しているときに疎水性コンフォメーションから親水性コンフォメーシ
ョンへ変化する。LCSTおよびUCSTの厳密な値は高分子および他の適用条
件(溶媒、他の溶質、等)によって決まる。
リガンドへの結合およびリガンドからの放出は適用されるCSTの反対側で行わ
れる。
たリガンドとの間の親和力と比較して、標的物質に対する有する親和性が取るに
足らない(insignificant)ことが好ましい。リガンドと刺激応答
性高分子との間には有意な(significant)親和力がないことが好ま
しい。
プロピルアクリルアミド)をはじめとするポリ(N−置換アクリルアミド)、ポ
リ(N−イソプロピルメタクリルアミド)をはじめとするポリ(N−置換メタク
リルアミド)、ポリ(N,N−二置換アクリルアミド)、ポリ(N,N−二置換
メタクリルアミド)、ポリメチルビニルエーテル、ポリ(エチレンオキシド−プ
ロピレンオキシド)共重合体、部分けん化ポリビニルアルコールをはじめとする
ポリビニルアルコール誘導体、およびメチルセルロースをはじめとするセルロー
ス誘導体などが挙げられる。また、刺激応答性高分子を支持体/ベースマトリッ
クスに共有結合するために、刺激応答性高分子にアミノ基、カルボキシル基、水
酸基などの反応性官能基を導入することもできる。
好ましくは後者によってベースマトリックスに結合することが可能である。本発
明の概念によれば、それは刺激応答性高分子によってもたらされるものではない
。
互作用により標的物質に親和性結合する。あるいは、この結合は、従来の親和性
結合(親和性吸着)のようなより複雑な相互作用を含む。イオン性相互作用に関
して、リガンドは正に荷電した若しくは負に荷電した物(entities)を
含む(イオン交換;固定化された物は第一級アミン、第二級アミン、第三級アミ
ンおよび第四級アンモニウム、スルホン酸塩、硫酸塩、ホスホン酸塩、リン酸塩
、カルボキシ等の基)。より複雑な相互作用は次に示す2つで1組となる個々の
親和性メンバー(individual affinity member)で
あるリガンドによって例証される。
ば、酵素、酵素基質、補助因子(cofactors)、補助基質(cosub
strates)等をも含む。細胞−細胞および細胞−表面の相互作用のメンバ
ー並びに生物学的に製造される親和性メンバーの合成物(synthetic
mimetics of bioproduced affinity mem
bers)も含まれる。リガンドという用語はまた、親和力によって複雑な生体
分子(biomolecules)、例えば、オリゴもしくはポリペプチド構造
(タンパク質を含む)、オリゴおよびポリヌクレオチド構造(核酸を含む)、オ
リゴ−若しくはポリサッカライド構造等を有する複雑な生体分子に結合する多少
複雑な有機分子分子をも含む。
(CIBACRONE BLUE)F3G−A(商品名;Fluka(社)製)
をはじめとする色素および他の複合色素(complex dyes)、イミノ
ジ酢酸(iminodiacetic acid)、グルコースをはじめとする
糖鎖、ヘパリンおよびレクチンをはじめとするタンパク質、ビオチン、ベンズア
ミジン、リシン、アルギニン、ペプチド類およびDNAが挙げられる。また、本
発明によれば、2価アルキル基またはエチレンオキシド基のようなスペーサーを
介して標的物質の親和性物質を支持体に共有結合で結合することによって標的物
質の結合能を制御することも可能である。ベースマトリックス(すなわち、クロマトグラフィー用充填剤) 本発明の方法において使用する分離媒体は有機材料および/または無機材料に
基づくものであってよいベースマトリックス(担体)を含む。使用される液体が
水性である場合、ベースマトリックスは親水性であることが好ましい。このこと
は上で述べた種類の生体分子である標的物質に特に適用される。
あり水中で多少膨張するものが好ましく、ゲルが好ましい。誘導体化されて(d
erivatized)親水性になった疎水性高分子もこの定義中に含まれる。
好適な高分子は、ポリヒドロキシ高分子、例えば、アガロース、デキストラン、
セルロース、澱粉、プルラン等のようなポリサッカライドに基づくポリヒドロキ
シ高分子、並びにポリアクリル酸アミド、ポリメタクリル酸アミド、ポリ(ヒド
ロキシアルキルビニルエーテル)、ポリ(ヒドロキシアルキルアクリレート)お
よびポリメタクリレート(例えば、ポリグリシジルメタクリレート)。ポリビニ
ルアルコール並びにスチレンおよびジビニルベンゼンに基づく高分子、並びに前
記の高分子に対応するモノマーの2種若しくは3種以上が含まれる共重合体のよ
うな完全に合成された高分子である。水溶性の高分子は、例えば、吸着若しくは
共有結合を介して不溶性物体に結合させることにより誘導体化されて不溶性とな
る。OHに転換できる基を示すモノマーの重合により、あるいは最終的な高分子
の親水性化(hydrophilization)、例えば、親水性高分子のよ
うな適当な化合物の吸着により、親水性基は疎水性高分子上(例えば、モノビニ
ルベンゼンおよびジビニルベンゼンの共重合体上)に導入することができる。
ニウム、グラファイト、酸化タンタル等である。 好ましいベースマトリックスは、加水分解に対して不安定な基、例えば、シラ
ン基、エステル基、アミド基およびシリカ中にそのようなものとして存在する基
を欠いている。好ましいベースマトリックスは、刺激応答性高分子および/また
はリガンドを共有結合により結び付けるために使用することが可能である官能基
を含有する。この種の官能基の例としてヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基
等が挙げられる。
されるべき化合物に対してマトリックスが十分に若しくは部分的に透過性(多孔
質)であっても、完全に非透過性(非多孔質)であってもよいことを意味する。
のであってよく、このことは直径が≧0.1μmそれぞれ≧0.5μmの球体(
a sphere≧0.1μm respective≧0.5μm in d
iameter)が通過することができることを意味する。適用される液体はこ
の種の細孔システム(伝達性細孔システム(convective pore
system)を通じて流れることが可能であるといってよい。支持体マトリッ
クスが床に充填されたビーズの形態である場合は、伝達性細孔システムの細孔径
と粒子の直径との割合は典型的には0.01−0.3の区間、好ましくは0.0
5−0.2の区間である。大きさ≧0.1μm、例えば、≧0.5μmである細
孔はしばしばマクロ細孔(macropores)と呼ばれる。
る細孔有していてもよく、このことは直径が≦0.5μm、例えば、≦0.1μ
mの球体のみがが通過することができることを意味する。孔径≦0.5μm、例
えば、≦0.1μmである細孔はしばしばミクロ細孔(micropores)
と呼ばれる。本発明の1実施態様として、ベースマトリックスは1−1000μ
m、好ましくは高性能適用(high performance applic
ations)に対しては5−50μmの範囲、予備的な目的に対しては50−
300μmの範囲の大きさを有する不規則な若しくは球状の形態を有する。使用
される粒子は、単分散系(monosized)であっても多分散系(poly
sized)であってもよい。単分散化された粒子という用語は、それらの平均
直径の±5%以内の大きさを有する粒子が95%より多い粒子集団(parti
cle populations)を意味し、この粒子集団は本発明について言
えば、均一サイズの表現粒子(expression particles)を
企図するものである。多分散化された粒子は他の粒子集団を包含する。
モノリスの形態であってもよい。代替の幾何学形態(alternative
geometric forms)は管等の内壁である。
外部表面および/または内部表面(マクロ細孔および/またはミクロ細孔の表面
)に結合することが可能である。上で述べたように、刺激応答性高分子およびリ
ガンドは物理的吸着および/または共有結合、好ましくは後者によってベースマ
トリックスに結合される。
ー粒子を使用することが特に好ましく、上で述べた通りこの粒子は膜乳化法およ
びその後の酸性物質若しくは塩基性物質による化学的処理により製造される。
ス製)に透過して第1の液体と混和しない第2の液体に送り、かくして第2の液
体中で実質的に同じ大きさの小液滴(droplets)を形成することを含む
。なお、この方法は、たとえば、S.Omi,K.Katami,A.Yama
moto,and M.Iso,J.Appl.Polym.Sci.,51(
1994)1−11に記載されている。第1の液体が重合性モノマーを含有し前
記小液滴が重合化を受ける場合は、粒子は第2の液体中で形成することになる。
ックス)は次のようにして製造される:高分子粒子のための出発材料として有用
なモノマーおよび希釈剤等から液体混合物(第1の液体)を調製する。次に、多
孔質ガラス膜の片側をこの液体混合物で充填し、反対側を第1の液体と混和しな
い第2の液体で充填する。液体混合物に圧力を加えて膜を通過させ第2の液体中
で小液滴を形成させる。例えば、第1の液体は水と不混和性であってもよく、第
2の液体は水性であってエマルジョン安定化剤等を含有していてもよく、その結
果、実質的に均一な大きさを有する小液滴からなるエマルジョンが得られる。続
いて、例えば、加熱することにより均一な粒子径を有するラテックス粒子が得ら
れることにより重合が実施される。もしモノマーが酸性物質若しくは塩基性物質
と反応性を有する基を含有するならば、ラテックス粒子をこの種の物質を含有す
る溶液中で撹拌して親水性多孔質ポリマー粒子が得られる。この後処理の間に、
アミノ基のような反応性官能基を支持体に導入することができる。これらの反応
性官能基を使用することによって、刺激応答性高分子またはリガンドを支持体に
共有結合させることができる。
ノマーの例として、アクリル酸グリシジル、メタクリル酸グリシジル、ジアクリ
ル酸エステル(例えば、ジアクリル酸エチレン)、ジメタクリル酸エステル(例
えば、ジメタクリル酸エチレン)、グリシジルビニルベンジルエーテル、ジビニ
ルベンゼン等を挙げることができる。また、これらのモノマーを任意に組み合わ
せることもできる。 エマルジョン 本発明の均一な粒子径を有する親水性多孔質ポリマー粒子の製造
に用いられる希釈剤としては、使用されるモノマーとともに重合しない化合物で
あれば良い。そのような希釈剤の例として、トルエンなどの芳香族溶媒/化合物
、ドデカンなどの脂肪族化合物などを挙げることができる。
酸性物質あるいは塩基性物質の例として、硫酸、塩酸、硝酸、酢酸、水酸化ナト
リウム、アンモニア、1,6−ジアミノヘキサンをはじめとする脂肪族ジアミン
などを挙げることができる。
ることができる。 (a)刺激応答性高分子またはその共重合体を支持体に共有結合によって固定化
し、次いで標的物質の親和性物質を当該支持体に共有結合によって固定化するこ
とを含む方法;または (b)標的物質の親和性物質を支持体に共有結合によって固定化し、次いで刺激
応答性高分子またはその共重合体を当該支持体に共有結合によって固定化するこ
とを含む方法;または (c)標的物質の親和性物質および刺激応答性高分子またはその共重合体をそれ
ぞれ支持体に共有結合によって同時に固定化することを含む方法。
て何ら限定されるものではない。
0.18g)、および2,2’−アゾビス(4−シアノ吉草酸)(0.27g)
をテトラヒドロフラン(200ml)に溶解し、重合管に入れた。溶液中の酸素
は凍結融解脱気法により除いた。重合は60℃で2時間行い、再沈殿溶媒として
ジエチルエーテルを用いることで片末端にカルボキシル基を有するポリ(N−イ
ソプロピルアクリルアミド)を合成した。
た。GPCでは、移動相として10mM臭化リチウムを含むジメチルホルムアミ
ド、カラムとしてα−3000(東ソー株式会社製)、標準物質としてポリスチ
レンを用いたところ、数平均分子量約4500、重量平均分子量約10000の
ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)であった。末端基定量法では、0.0
1規定の水酸化ナトリウム水溶液を用いて合成したポリ(N−イソプロピルアク
リルアミド)のカルボキシル基を求めたところ、その数平均分子量が約5000
であった。合成したポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の数平均分子量が
、GPCおよび末端基定量法のそれぞれの方法でほぼ一致したことを確認した。
シこはく酸イミド(0.25g)、N,N’−ジシクロヘキシルカルボジイミド
(0.45g)をテトラヒドロフラン(60ml)に溶解し、室温で12時間攪
拌した。析出物をろ取した後、再沈殿溶媒としてジエチルエーテルを用いて、片
末端のカルボキシル基をN−ヒドロキシこはく酸イミドでエステル化したポリ(
N−イソプロピルアクリルアミド)を合成した。 2.均一な粒子径を有する親水性多孔質ポリマー粒子の合成 メタクリル酸グリシジル(3.1ml)、ジメタクリル酸エチレン(1.9m
l)、トルエン(7.1ml)そしてドデカン(0.4ml)および2,2‘−
アゾビス(2,4−ジメチル−バレロニトリル)50mgを原料として、平均細
孔径1.95μmのMPG(ミクロ多孔質ガラス)パイプを通して加圧により2
wt%のポリビニルアルコール水溶液中に原料を押し出すことでO/Wエマルジ
ョンを調製した。重合は70℃で6時間行い、粒子径のそろったラテックス粒子
を高収率で合成した。このラテックス粒子の平均粒子径は12.5μm、CV(
変動係数(coefficient of variation))値は12.
4%であり、粒子径がそろっていることを確認した。さらに、合成したラテック
ス粒子(3.5g)を1,6−ヘキシルジアミン(1.8g)を含む水溶液(1
60ml)に分散させて30℃で2時間撹拌した。
37(7)(1981)485−491)によれば、1,6−ヘキシルジアミン
で処理する前のラテックス粒子表面には、エポキシ基が3.1mmol/g存在
していたことを記載している。さらに、滴定を用いるアッセイ法により1,6−
ヘキシルジアミンで処理した粒子径均一親水性多孔質ポリマー粒子の表面には0
.36mmol/gのアミノ基が導入されたことを明らかにした。
ー粒子(3.5g)を無水酢酸10ml中で撹拌して、表面のアミノ基をアセチ
ル化し、アミド化粒子を合成した。このアミド化粒子は、20mMリン酸緩衝液
(pH7.0)の移動相では牛血清アルブミン(BSA)を吸着しなかった。こ
のことから、この粒子径均一親水性多孔質ポリマー粒子は、アフィニティークロ
マトグラフィーなどのタンパク質を分離するクロマトグラフィー担体(ベースマ
トリックス)として有用な親水性を有していることを明らかにした。 3.ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)の支持体への固定化 1,6−ヘキシルジアミンで処理した粒子径均一親水性多孔質ポリマー粒子(
4.5g)、片末端のカルボキシル基をN−ヒドロキシこはく酸イミドでエステ
ル化したポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)(4.5g)、そしてアセト
ニトリル(75ml)を室温で12時間攪拌した。アセトニトリル、テトラヒド
ロフラン、メタノール、アセトンで洗浄した後、室温で乾燥した。元素分析によ
り、支持体である粒子径均一親水性多孔質ポリマー粒子に3.4wt%のポリ(
N−イソプロピルアクリルアミド)が固定化されたことを確認した。さらに、温
度による親和力制御能を比較するために、支持体に残存しているアミノ基を無水
酢酸でアセチル化した充填剤(noCB)も合成した。 4.チバクロンブルーF3G−Aの支持体への固定化 ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)を固定化した支持体(0.70g)
(上記3から得られたもの)、1,3−ブタジエンジエポキシド(0.09ml
)あるいはエチレングリコールジグリシジルエーテル(0.21g)、そしてア
セトニトリル(10ml)を30℃で1時間撹拌することで、支持体に残存して
いるアミノ基とスペーサーとなるジエポキシド化合物の一方のエポキシ基を反応
させた。その懸濁液に無水酢酸(0.11ml)を加えて30℃で1時間撹拌す
ることで、支持体の未反応アミノ基をアセチル化した。ポリ(N−イソプロピル
アクリルアミド)およびスペーサーをそれぞれ固定化した支持体をアセトニトリ
ル、アセトンで洗浄した後、室温で乾燥した。
した支持体の混合物(0.61g)、アミノヘキシル化チバクロンブルーF3G
−A(0.89g)、水(10ml)を加え、水酸化ナトリウムでpH11に調
整した後、25℃で3時間撹拌して、ポリ(N−イソプロピルアクリルアミド)
とチバクロンブルーF3G−Aをそれぞれ支持体に固定化した充填剤を合成した
。チバクロンブルーF3G−Aの固定化量は滴定により求め、スペーサーとして
1,3−ブタジエンジエポキシドを用いた充填剤(CB−4)は21μmol/
g、スペーサーとしてエチレングリコールジグリシジルエーテル(CB−10)
を用いた充填剤は12μmol/gであった。
6mm、長さ30mmのステンレススチール製カラムにそれぞれ充填した。 2.充填剤により吸着されたBSAに対する吸着量の測定 移動相としてpH5のクエン酸緩衝液(I=0.01)を用い、20℃を基準
として40℃におけるそれぞれの充填剤の吸着量を破か曲線で求めた。その結果
を表1に示す。
、支持体とチバクロンブルーF3G−Aとの間のスペーサー長さがBSAの吸着
量に影響していることを示している。また、支持体に結合したポリ(N−イソプ
ロピルアクリルアミド)は、BSAの吸着に大きく影響しないことも示している
。 3.アフィニティークロマトグラフィーにおける充填財の温度変化による親和力
制御 CB−10を用いて、40℃でBSAを充填剤CB−10のリガンドであるチ
バクロンブルーF3G−Aに吸着させた後に、20℃に温度を変化させることで
刺激応答性高分子の構造を変化させた。高分子の構造変化によりリガンドからB
SAが脱着して移動相に溶出されることを確認した。その結果を図1に示す。移
動相としてpH5のクエン酸緩衝液(I=0.01)を用い、40℃でBSA(
111μg)をCB−10のカラムに負荷した。マイクロBCATM PROTE
IN ASSAY REAGENT KIT(Pierce社製)を用いて溶出
液中のBSAの量を測定した。過剰量のBSAが1〜4mlの溶出液量で溶出し
た。溶出液量が6mlまで40℃で移動相(カラム)を流してBSAの溶出が確
認されなくなった後、移動相の流れを止めて20℃で20分間冷却した。20℃
のまま移動相を再び流したところ、支持体に結合しているポリ(N−イソプロピ
ルアクリルアミド)の構造変化により、40℃でリガンドに吸着したBSAが脱
着してカラムから溶出した(溶出液量7〜9ml)。また、この温度変化で溶出
したBSAの量は、CB−10のBSAに対する吸着量の90%であった。これ
らの結果は、刺激応答性高分子および標的物質に対する親和性を有するリガンド
が別個の結合を介して共有結合によって固定化された支持体/ベースマトリック
スを含む材料を用いて標的物質が除去または分離精製することができることを明
らかにした。また、この結果は標的物質とリガンドとの間の親和力が温度のよう
な物理的刺激により制御できることを示したものである。
ムである。
i(特開平8−103653号公報)、Ohnishi(特開平7−13650
5号公報)およびOhnishi(特開平7−135957号公報)は刺激応答
性高分子および支持体マトリックスの表面に特異的な親和性を有する物質を含む
分離材料を開示している。しかしながら、これらの文献は、リガンドを温度応答
性高分子に結合することによって得られた共重合体(複合体)をベースマトリッ
クスの固定化する分離システムに基づく温度変化による標的物質の溶出を報告し
ているのみである。このような複合体を使用すると、標的物質の溶出温度がリガ
ンドの種類および性質に左右されて変動するので、リガンドの種類により複合体
の種類を変えることによって温度制御を実施しなければならない。 Hofman et al.,(WO8706152)は、リガンドを温度応
答性高分子に結合させる分離方法を記載している。結合と標的物質の溶出が臨界
溶液温度(critical solution temperature)の
同じ側で生じる。臨界溶液温度という用語については熱応答性高分子に関する記
載においてさらに言及する。
Claims (9)
- 【請求項1】 刺激応答性高分子および標的物質に対する親和力を有する親和性
物質(リガンド)が独立して支持体に結合、好ましくは共有結合、している親和
力制御型材料。 - 【請求項2】 溶液中における親和力制御型材料および親和性物質の混合物に物
理的刺激を受けさせることにより前記高分子によって与えられた親和性物質の周
囲の化学的あるいは物理的な環境を変化することにより、親和性物質および標的
物質の間の親和力を変化させることが可能である請求項1記載の親和力制御型材
料。 - 【請求項3】 温度以外の条件のうち少なくとも1つの条件を一定にしたまま標
的物質の親和性物質における親和力を物理的刺激で可逆的に変化させる請求項1
または2記載の親和力制御型材料。 - 【請求項4】 物理的刺激が温度変化であることを特徴とする請求項1、2また
は3記載の親和力制御型材料。 - 【請求項5】 標的物質の親和性物質が刺激応答性高分子と相互に作用しない請
求項1、2、3または4のいずれか1項記載の親和力制御型材料。 - 【請求項6】 標的物質の親和性物質を支持体と結合するスペーサーの長さある
いは刺激応答性高分子の大きさにより標的物質の結合能力を制御することを特徴
とする請求項1〜5のいずれか1項記載の親和力制御型材料。 - 【請求項7】 支持体が、側鎖にエポキシ基を有するモノマーを原料として膜乳
化法と酸性物質あるいは塩基性物質で化学処理する方法で製造した粒子径均一親
水性多孔質ポリマー粒子を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれか1項記
載の親和力制御型材料。 - 【請求項8】 クロマトグラフィー用充填剤として利用することを特徴とする請
求項1〜7のいずれか1項記載の親和力制御型材料。 - 【請求項9】 請求項1〜7のいずれか1項に記載された親和力制御型材料を使
用する標的物質の分離精製法。
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