KR970002165B1 - γ-인터페론의 제조방법과 그 용도 - Google Patents

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Abstract

내용없음.

Description

γ-인터페론의 제조방법과 그 용도
제1도는 HBL-38 세포의 위상차 현미경 사진.
제2도는 HBL-38 세포의 핵형(核型)분석 결과를 나타낸 사진.
본 발명은 γ-인터페론의 제조방법과 그 용도에 관한 것이며, 더욱 상세히 발하면 인체로 부터 연유하는 배양주화(培養株化)된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계(骨髓單球系) 세포(myelomonocyte-cell)를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 채취함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법, 이 γ-인터페론을 항원으로 한 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법, 이 모노클로날 항체에 의한 γ-인터페론의 정제방법, 및 이 γ-인터페론을 유효 성분으로 함유한 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제에 관한 것이다.
인터페론은 일본국의 고바야시 시게야스(小林茂保)저 「인터페론」(1975년, 일본국 株式會社 講談社 발행), D. A. J. Tyrrel 저「Interferon and Its Clinical Potential」(1976년, William Heinemann Medical Books Ltd.(London)발행), 및 「단백질, 핵산, 및 효소, Vol.21, No. 4」(1976년)등에 기재되어 있는 바와 같이, 예컨대 비루스, 세균, 원충, 리켓치아, 핵산, 엔도톡신, 다당류 등의 인터페론 유발물질(inducer)을 생세포에 작용시킴에 따라서, 그 세포내외에서 유발생성되는 당단백질로서, 그 세포내에서의 각종 비루스의 증식을 일반적으로 억제하는 기능을 가진 물질에 부여된 명칭이다.
인터페론이 가진 이와 같은 기능으로 부터 인터페론은 그 발견 당초부터 부루스성 질환의 예방제와 치료제로서 기대되어 왔다. 또, 근년에 와서 인터페론은 비루성 종양 뿐만 아니라 비루스성 종야에 대하여도 항종양성이 있음이 밝혀져 의약품으로서의 인터페론은 큰 기대를 하기에 이르렀다.
인터페론에는 α-인터페론(별명, 백혈구 인터페론), β-인터페론(별명, 섬유 아세포 인터페론) 및 γ-인터페론(별명, 면역 인터페론, 타입II 인터페론)이 있으며, 이중에서 α-인터페론에 대하여는 백혈구 등으로 부터, 그리고 β-인터페론에 대하여는 섬유 아세포 등으로 부터 제조방법이 각각 확립되어, 최근 이것들을 이용한 의약품이 시판되기에 이르렀다.
위에 나온 각각의 인터페론에 대하여는 이후부터 α-IFN, β-IFN 및 γ-IFN의 약자로 표기하기로 하고, Hu가 붙은 것은 인간 유래의 것을 뜻한다.
한편, γ-인터페론에 대하여는 다수의 제조방법이 제안되어 있으나, 어느 것이나 아직 공업적으로 실시하기에는 이르지 못하였다. 예컨대, 일본국 특허 공개 소 57-58891호 공보, 특허 공개 소 59-82092호 공보, 특허 공개 소 60-70099호 공보, 특허 공개 소 60-87300호 공보, 특허 공개 소 60-139700호 공보, 특허 공개 소 60-149600호 공보, 국제 특허 공고 소 57-500961호 및 소 58-502032호 공보 등에서 제안하고 있는 인체 말초 혈로부터 얻은 백혈구 또는 T-임파수를 사용하는 방법은 원료인 세포를 안정적으로 대량으로 공급하는 것이 곤란하고, 또 이들 세포의 HuIFN 생성량도 불충분하다.
또한, 일본국 특허 공개 소 55-98119호 공보에서 제안되어 있는 방법은 배양주화된 인체 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나 인간 이외의 온혈동물의 체내 또는 체외에 부착한 확산 챔버내에서 세포를 이식하여 그 온혈동물의 영양체액을 공급하면서 세포를 증식시켜 수득한 인체 세포를 사용하여 γ-인터페론을 제조하는 방법인데, 원료인 인체 세포를 대량으로 안정하게 공급할 수 있다는 점에 특징이 있다.
그러나, 이 방법에 있어서는 배양주화된 인체 세포의 종류에 따라 γ-HuIFN 생성능(生成能)에 변동이 있음을 판명하였고, 따라서 안정하게 고활성 γ-HuIFN을 제조하려면 더욱 개량할 필요가 있으므로 아직 공업적으로 실시에 이르지 못하였다.
γ-HuIFN은 세포 증식 억제 작용과 항종양 작용이 α-HuIFN 및 β-HuIFN보다도 현저히 강하고, 또 α-HuIFN 및/ 또는 β-HuIFN등과 병용함에 따라 α-HuIFN의 항비루스 작용, 세포 증식 억제 작용, 항종양 작용등을 강화하는 것이 알려져 있다. 이러한 이유로 해서 그 공업적 제조 방법의 확립이 강하게 기대되고 있다.
본 발명자등은 공업적 규모로 용이하게 실시할 수 있는 γ-인터페론의 제조방법을 확립하는 것을 목적으로 배양주화된 각종 인체 연유의 세포, 특히 배양주화된 각종의 인체 연유의 임파구성(Iymphoblastoid)세포의 γ-인터페론 생성능에 대하여 비교 연구를 계속하고, 나아가서 이 γ-인터페론이 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제로서 유용한지 아닌지를 예의 연구하였다.
그 결과, 이외에도 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포가 기타 임파구성 세포와는 달리 높은 γ-인터페론 생성능을 가지며, γ-인터페론 제조용 세포로서 가장 적합하다는 것을 발견하였으며, 나아가서 그 골수 단구계 세포로 부터 수득한 γ-인터페론이 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제로서 우수함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서 말하는 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포라 함은, 일본국의 이와나미서점 발생, 기시모도 다다미쓰, 와다나베 다께시편, 「이와나미 고오쟈 면역 과학 3, 면역 반응 세포」제181-204 페이지(일본국 소와 61년) 및 Mikio Shikita 및 Isao Yamane 저「Mammalian Cell Culture Technology」제 141-162 페이지, 1985년, Soft Science Publications, Tokyo, Japan등에 기재되어 있는 바와 같이 T-세포와 B-세포에 속하지 않는 세포로서 항원 항체 반응에 따라 골수 단구계 항원(Myelomonocyteantigen)의 존재를 체크함으로써 확인되는(identifiable) 세포를 뜻한다.
이러한 골수 단구계 세포의 예로서 본 발명자들이 확립한 HBL-38 세포, 전술한 인용문헌에 기재되어 있는 HL-60, KG-1, ML-1, ML-2, MML-3, THP-1, U-937등의 세포 및 Japanese Journal of Cancer Research(Gann) Vol. 75, 제 660-664 페이지(1984년)에서 보고되어 있는 CTV-1 등을 적당히 이용할 수 있다. 특히, HBL-38[본 출원인인 주식회사 林原生物化學硏究所의 藤崎細胞[일본국 岡山市藤崎 675-1 소재)에서 1985년 6월 18일 이래 현재까지 상기 세포의 보관, 관리 및 분양을 하고 있음]의 γ-인터페론 생성능은 높아서, 본 발명의 실시예 가장 유리하게 이용할 수 있었다.
또한, 이들 세포의 γ-인터페론 생성능을 가진 유전자를 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 또는 센다이 비루스등을 이용하는 세포 융합의 수단이나 DNA 리가아제(ligase), 제한효소(누클레아제), DNA 폴리머라아제 등의 효소를 이용하는 공지의 유전자 재조합 수단등에 의하여, 더욱 용이하게 대를 이어 배양할 수 있는 배양 주화된 세포에 도입하여 그 증식속도와 γ-인터페론 생성능을 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다.
본 발명에서 사용하는 인체로 부터 연유하는 배양주화된 공수 단구계 세포를 증식시키는 방법은 적당히 선택할 수 있다. 예컨대, γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 영양배지에 접종하여 생체밖에서 증식시키는 조직 배양법이나, γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나 인간 이외의 온혈동물의 체내 또는 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 인간 이외의 온혈동물의 영양체액의 공급을 받으면서 생체내에서 증식시키는 방법등이 있다.
먼저, 생체 밖에서 증식시키는 경우에 대하여 설명한다.
이때 사용하는 영양배지는 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 접종하여 증식할 수 있는 것이면 좋으며, 예컨대 RPMI 1640 배지, 이이글 최소 기본 배지(Eagle's minimal essential medium)등이 있는데, 필요에 따라서 다시 비타민, 미네랄, 탄소화물, 아미노산 및/또는 포유류의 혈청등을 보충하여 개량할 수도 있다.
배양 방법은 단층 배양법 또는 부유 배양법을 적당히 선택할 수 있다.
배양 온도는 약 20~40℃, 바람직하게는 약 35~38℃이고, 접종량은 접종후 약 1주간에서 최대 세포 발육을 나타낼 수 있는 배지 1ml당의 세포수이어야 하는데, 바람직하게는 배지 1ml당 약 104~107개이다.
인체의 골수 단구계 세포를 접종한 배지를 상기한 조건에서 약 4~10일간 배양하고, 배양동안에는 배지를 정기적으로 신선한 것과 교환하여 영양물을 충분히 보급함과 동시에, 배지속에 방출된 대사산물을 세척 및/또는 희석하여 증식시키는 것이 바람직하다.
다음에, 생체내에서 세포를 증식시키는 방법에 대하여 설명한다.
이 방법에서는 γ-인터페론 생성능을 가진 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 그 온혈동물의 영양체액의 공급을 받을 수 있는 챔버내에 수용하여 동물을 통상의 방법으로 사육을 한다면, 온혈동물의 체내로 부터 공급되는 영양물을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포가 용이하게 증식할 수 있기 때문에, 시험관내에 있어서의 조직 배양과 같이 값비싼 혈청등을 함유한 영양배지를 사용하지 않더라도, 또는 대폭 절약하여도 대량의 γ-인터페론을 생성시킬 수 있다.
즉, 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법은 세포 증식중의 유지관리가 용이하다는 것은 물론이고, 시험관내에서 배양하는 경우와 비교하여 세포의 증식이 안정하다는 사실, 또 세포당 γ-인터페론 생성량이 증대한다는 사실, 특히 2~10배 또는 그 이상까지도 증식하므로 극히 유리하다.
생체내 증식방법에서 사용하는 인간 이외의 온혈동물은 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포가 증식할 수 있는 것이면 좋은데, 예컨대 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 모르토르, 쥐, 햄스터(hamster), 보통 마우스, 누드 마우스 등의 포유류 등을 사용할 수 있다.
이들 동물에 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 이식하면 바람직하지 못한 면역 반응을 일으킬염려가 있으므로, 그 반응을 가급적 최소한으로 억제하기 위하여 사용하는 동물은 가급적 어린상태, 즉, 알, 배(胚), 태아 또는 신생기, 유소기의 동물일수록 바람직하다.
또, 이들 동물에 예컨대 약 200~600rem 정도의 X 선 혹은 γ선을 조사하던가 또는 항혈청 혹은 면역 억제제 등을 주사하는 등의 사전 처치를 하여 면역 반응을 약하게 하여 이식하여도 좋다.
사용하는 동물이 누드 마우스인 경우에는 성장한 것이라도 불필요한 면역 반응을 일으킬 우려가 거의 없으므로 이러한 사전 처치를 할 필요도 없이 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 이식하여 급속히 쉽사리 증식할 수 있으므로 특히 매우 편리하다.
또, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 예컨대 먼저, 햄스터에 이식하여 증식시킨 다음, 이 세포를 다시 누드 마우스에 이식하는 등과 같이 하여 인간 이외의 동종 또는 상이한 온혈동물들 사이에서 연속적으로 이식함으로써 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포의 증식을 보다 안정화하기도 하고, 나아가서 그로 부터 유발되는 γ-인터페론 양을 증가시킬 수도 있다. 이 경우, 동종(同種)간, 동속(同屬)간은 물론이고, 동강(同綱)간, 동목(同目)간의 이식이라도 좋다.
인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 좋고, 예컨대 뇨액강, 정맥, 복강, 피하 등을 자유로히 선택할 수 있다.
또한, 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포를 직접 동물체내에 이식하는 일이 없이 동물 세포의 통과를 저지할 수 있으나, 인간 이외의 온혈동물로 부터 영양체액을 HBL-38에 공급할 수 있는 적절한 수단, 즉 다공성의 여과막, 예컨대 구멍의 지름이 약 10-7~10-5m인 박막 필터, 한외 여과막 또는 유공섬유(hollow fiber)등을 설치한 공지의 각종 형상과 크기의 확산 챔버를 동물체내, 예를 들면 복강내에 매설하여 동물로 부터 영양물을 함유한 체액의 공급을 받으면서, 그 챔버내에서 전술한 인체로 부터 연유하는 배양 주화된 골수 단구계 세포를 어느것이나 증식시킬 수 있다.
또한, 필요에 따라서 이 챔버내의 영양물을 함유하는 용액을 동물체내의 체액과 접촉하여 흘러들어가도록 한 챔버를, 예컨대 동물 몸체에 부착하고, 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포의 챔버내의 증식상태를 투시할 수 있도록 하는 것도, 또, 이 챔버 부분만을 간헐적으로 착탈 교환할 수 있도록 하여 동물을 도살하지 않고 수명이 다할 때까지 세포를 증식시켜 동물개체당의 세포 생산량을 더욱 높일 수도 있다.
이러한 확산 챔버를 이용하는 방법은 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포가 동물 세포와 직접 접촉하지 않고 또한 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 우려도 극히 적으므로 면역 반응을 억제하는 사전 조치를 할 필요도 없이 각종 온혈동물을 자유로이 이용할 수 있고, 증식 세포를 쉽사리 회수할 수 있는 특징을 가지고 있다.
이식한 동물의 유지관리는 그 동물을 통상의 방법으로 사육을 계속하면 되는 것이므로, 이식후라 하더라도 특별한 취급을 전혀 필요로 하지 않으므로 매우 편리하다.
인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 최대한으로 증식시키기 위한 기간은 통상 1~10주의 기간이면 목적을 달성할 수 있다. 이와 같이 수득할 수 있는 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포수는 동물개체당 약 107~1012또는 그 이상에 이른다. 바꾸어 말하면, 본 발명에서는 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법에 따라 인체로 부터 연유하는 이식, 증식된 골수 단구계 세포는 동물개체당 이식한 세포수의 약 102~107배 또는 그 이상까지도 이르며, 생체밖의 영양배지에 접종하여 증식시켰을 경우의 약101~106배 또는 그 이상까지도 도달하므로 γ-인터페론의 제조를 위하여 매우 편리하다.
이와 같이 하여 증식시킨 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 생세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성시키는 한에 있어서 어떠한 생성 방법도 본 발명에서 마음대로 이용할 수 있다. 그것을 증식에 사용된 동물체내의 그대로의 상태에서 γ-인터페론 유도체를 작용시킬 수도 있다. 예를 들면, 복강내의 복수의 부유상태로 증식한 인체로부터 연유하는 골수 단구계 세포에 또는 피하에 발생한 종양 세포에 γ-인터페론 유발물질(inducer)을 직접 작용시켜 γ-인터페론의 생성을 유발시키고, 이어서 그 복수 또는 종양으로부터 γ-인터페론을 회수한 다음 정제하면 된다.
또, 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 동물 체내로 부터 들어내고, 생체밖에서 γ-인터페론 유발물질을 작용시켜서 γ-인터페론을 유발 생성시킬 수도 있다. 예컨대, 복수속에서 증식한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 수득하고, 또는 피하에 발생한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 함유하는 종양을 적출(extraction), 분산하여 수득한 세포를 약 20~40℃로 유지한 영양배지에 세포 농도가 약 105~108개 세포/ml가 되도록 부유시키고, 여기에 γ-인터페론 유발물질을 작용시킴에 따라서 γ-인터페론을 유발 생성시켜 이것을 회수하고 정제하면 된다.
더욱이, 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 확산챔버내에서 증식시켰을 경우에는 증식시킨 세포를 챔버내의 있는 그대로, 또는 챔버로 부터 들어내어 γ-인터페론 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시킬 수도 있다.
γ-인터페론의 유발생성에 있어서, 필요하다면 예컨대, 인체에 종의 특이성이 높은 인터페론을 이용하여 프라이밍(priming) 처리를 한다던가 대사 저해제(antimetabolite)를 사용하는 과도 유발법(super-induction)등의 공지의 방법을 채용함에 따라서, 생성하는 γ-인터페론 양을 더욱 증가시켜도 좋다.
아래에 나오는 방법들중 한가지 이상을 사용하여 동물개체당 γ-인터페론의 생성량을 증가시킬 수 있다.
(1) 인체로 부터 연유하는 증식시킨 골수 단구계 세포를 먼저 동물체내에 있는 그대로의 상태에서 γ-인터페론 유발물질에 작용시킨 다음, 이어서 동일 동물개체의 특정한 부위 또는 전체로 부터 채취한 인체로 부터 연유하는 골수 단구계 세포를 동물체 밖에서 γ-인터페론 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시키는 방법.
(2) 한번 γ-인터페론의 유발 생성에 작용시킨 세포를 다시 2번 이상 반복하여 γ-인터페론의 유발물질에 작용시켜 γ-인터페론을 유발 생성시키는 방법.
(3) 동물체내에 매설 혹은 접속되는 챔버를 간헐적으로 새 챔버와 교환하여 수득하는 세포수를 증가시키는 방법등의 방법.
본 발명에 사용되는 γ-인터페론 유발물질로서 통상 예컨대, 피토헤마 글루티닌, 콘카나발린 A, 아메리카 자리공 유사분열 물질(pokeweed mitogen), 리포폴리삭카라이드, 리피드 A, 엔도톡신, 다당류, 세포 등의 유사분열 물질이 가장 적합하다.
또한, 감작화(感作化)된 세포에 대해서는 항원도 γ-인터페론 유발물질로 작용한다. 이것을 γ-인터페론 유발물질로 사용할 경우에는 통상 약 0.001㎍/ml~10mg/ml의 농도에서 사용된다. 필요하다면, 예컨대 비루스, 핵산, 폴리뉴클레오티드 등의 α-인터페론 유발물질 병용하여 γ-인터페론 양을 더욱 증가시키는 것도 α-인터페론과 γ-인터페론양을 동시에 생성시키는 것도 모두 가능하다.
이와 같이 하여 유발 생성시킨 γ-인터페론은 공지의 정제, 분리법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 동결건조 등을 함에 따라서 용이하게 정제 분리하여 채취할 수 있다. 나아가서 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는 예컨대 이온 교환체에 의한 흡착 및 탈착, 용출, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 등전점 분획(isoelectric point fractionation), 고속 액체 크로마토그래피, 전기영동 등의 공지의 방법을 다시 조합하는 것이 좋으며, 특히 모노클로날 항체를 이용한 크로마토그래피 등에 따라 최고 순도의 γ-인터페론을 채취하는 것도 가능하다. 이와 같이 하여 수득한 γ-인터페론은 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
γ-인터페론 감수성 질환이라 함은 γ-인터페론에 의하여 예방되거나 치료되는 질환인데, 그것이 비루스성 질환, 예컨대 유행성 결막염, 헤르페스성 각막염, 인플루엔자, 풍진, 혈청 간염, 에이즈(AIDS)등과, 비비루스성 질환, 예컨대 대장암, 폐암, 간암, 골육종 등의 악성 종양을 비롯하여 과민성 알레르기, 중증 근무력증, 교원병(膠原病), 악성 빈혈, 관절 류머티스, 전신성 홍반(erythematisus)등의 면역질환 등이라도 좋다.
γ-인터페론 감수성 질환 예방제 또는 치료제는 그 목적에 따라서 그 형상을 자유로이 선택할 수 있다. 그 한가지 예를 들면, 분무제, 점안제, 양치질제, 주사제 등의 액제, 연고와 같은 페이스트제, 분제, 과립제, 정제 등의 고형제 등이 있다.
이러한 예방제 및 치료제에는 γ-인터페론을 통상 그램당 1~10,000,000 단위 정도 함유시키는 것이 좋고, 필요에 따라서 γ-인터페론과 함께 그 밖의 림포카인, 예컨대 α-인터페론, β-인터페론, 종양괴사 인자(TNF), 림포 톡신, 인터로이킨 2(interleukin 2), B 세포 분화인자(differentiating factor)등이나, 또는 기타 천연 또는 합성 화학 치료제 등의 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유시켜, 그 예방과 치료효과를 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다. 또한, 필요하다면 보조제, 증량제, 안정제 등의 1종 또는 2종 이상을 병용하는 것도 뜻대로 할 수 있다.
이와 같이 하여 제조되는 본 발명의 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제는, 예컨대 항비루스제, 항종양제로서, 또한 항종양성 화학치료제의 항종양 효과 증강제, 악성 종양의 전이 억제, 재발 방지제, 면역 조절제, 면역질환 치료제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.
인체에 종의 특이성이 높은 인터페론의 활성은 문헌(Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol. 20, No. 6, 제 616-643 페이지, 1975년)에 보고 되어 있는 인체 양막(amnion)으로 부터 연유하는 FL 세포를 사용하여 공지의 플래그(plaque) 반감법으로 측정하였다.
더욱이, γ-인터페론의 활성은 항 α-인터페론 항체 및 항 β-인터페론 항체를 공존시켜서 α-인터페론 및 β-인터페론을 중화한 다음 측정하였다.
적혈구 응집가는 문헌(J.E. Salk 저, The Journal of Immunology, Vol. 49, 제 87페이지, 1944년)에 공지된 방법에 준하여 측정하였다.
다음에, 본 발명에서 새로이 수립한 골수 단구계 세포 HBL-38에 대하여 설명한다.
급성 골수성 백혈병 환자(남성 55세)로 부터의 백혈수 세포를 시험관내에서 영양배지로 배양한 결과, 21일 후에 세포의 증식이 확인되었다.
그것을 대를 이어 배양하고, 이중의 1종류를 안정하게 증식시킴에 성공하여 이것을 HBL-38이라고 명명하였다.
(1) 증식능
소의 태아 혈청 10v/v%를 가한 RPMI 1640 배지에서의 증식 기능을 측정하였던 바, 배가시간(doubling time)은 약 30시간이었다.
(2) 형태
증식시에 플라스크의 저면에 부착하는 성질을 가지고 있었으나, 부착성이 약하여 곧 떨어졌다. 또, 증식시에 세포 덩어리의 형성도 발견하였으나 강고한 것은 아니어서 가볍게 접촉하였을 때 용이하게 단일 세포로 분산되었다. 이 세포를 위상차 현미경으로 관찰한 결과를 제1도에 나타내었다. 세포의 형태는 약 15㎍의 두께를 가진 거의 원형 형상을 하고 있었다. 김자 염색(Giemsa's stain)을 한 결과, 핵은 원형의 것외에도 불규칙한 분열 형성(lobation)이라거나 분엽핵(karyolbism)의 경향을 나타내고 있음도 확인되었다.
(3) 염색체수
염색체의 분석에서는 대수 증식기(exponential growth)의 세포를 사용하였다. 염색체수의 빈도 분포를 제1표로 나타내었다.
150개의 세포에 대하여 관찰한 결과, 염색체수는 낮은 2배체 영역에서 있었고, 그 최빈도 분포는 염색체수 45본이 가장 많아서 세포는 53개나 되었다. 또 염색체수 44본의 세포도 42개나 확인되었다.
Figure kpo00001
(4) 핵형(核形)분석
핵형 분성의 결과를 제2도에 나타내었다. 세포의 성염색체는 XY이었고 세포 유래원(source)과 일치하였다. 염색체 No. 17의 대응부(counterpart) 및 염색체 No. 18의 전부가 결핍되어 있었다.
염색체 No. 5의 짧은 팔(short arm)(p)과 염색체 No. 12의 팔(q)에 염색체 하나가 각각 삽입되어 있음을 관찰하였다. 또, 동일시할 수 없는 마아커어(marker) 염색체와 염색분체(chromatid)가 각기 1본이 확인되었다.
(5) 세포 표면 형징
각종 세포 표면 항체를 사용하여 HBL-38 세포의 동정(identification)을 한 결과를 제2표에 나타내었다. 염소 적혈구(E), 항체 감작 소적혈구(EA:erythrocyte amboceptor), 인간보체(amboceptor) 감작 소적혈구(EAC)를 사용한 분석에서는, EA에서 10%의 로제테(rosette)형성을 발견하였으나 그 밖의 것은 확인되지 않았다.
6개의 염소 항인체 항체(anti-human goat antibody)를 사용하여 세포 표면 면역 글로불린을 검출한 결과, HBL-38 세포는 모든 항체에 대하여 음성이었다. 모노클로날 항체를 사용하여 표면 마아커어를 스크리닝 한 결과, 3Al, MCS-2, B3/25, MY-9는 높은 양성율을 나타내었으며, NU-T2, Leu-5, Leu-4, AA-50, BA-2, OKT-1, NU-N1, B2, MO-1, MO-2는 모두 음성이었다.
Figure kpo00002
Figure kpo00003
비루스 마이커어
Figure kpo00004
(주) 수치는 양성 %를 뜻한다.
(6) EB 비루스 특이 행항원(EBNA)의 검색
EBNA에 대하여는 세포주를 수립한 다음 조기(早期)부처 여러번에 걸쳐 HBL-38 세포를 검색하였으나, 그 결과 HBL-38 세포는 EBNA-음성 이었다.
(7) 연한 한천 배지속에서의 콜로니 형성
콜로니 자극 인자(CSF:colony stimulating factor)를 함유한 0.3% 한천 배지속에서의 콜로니 형성에 대하여 HBL-38 세포를 시험하여 배양한지 14일째에 도립 현미경으로 관찰하였던 결과, 골수구 모양(myeloid)의 콜로니 형성 세포가 확인되었다. 그것들의 빈도는 1~2%였다. 콜로니 형성 인자를 가하지 않았을 경우에는 콜로니는 전혀 형성되지 않았다.
이상의 결과로 부터 HBL-38세포는 골수 단구계 세포에 속한다는 것을 판명하였다.
다음에 γ-인터페론의 제조에 관한 실험 1에 대하여 설명한다.
[실험 1]
인체로 부터 연유하는 배양주화된 각종 임파구성 세포의 γ-인터페론
생성능의 비교
[실험 1-1]
생체밖에서 증식시킨 세포에 의한 인간 인터페론의 제조
소 태아 혈청 20v/v%를 보충한 RPMI1640배지(pH7.2)에 인체로 부터 연유하는 배양주화된 각종 세포를 각기 접종하여 37℃에서 통상적인 방법을 따라서 배양하고, 이어서 혈청 첨가하지 않은 RPMI 1640배지(pH7.2)에서 세척한 다음 이 배지로 농도 1×106개 세포/ml가 되도록 현탁하였다.
이와 같이 하여 수득한 인체로 부터 연유하는 각종 세포 현탁액 각각에 리포폴리삭카라이드를 1ml당 약 10㎍을 첨가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켜 원심분리한 다음, 혈청액 상부를 사용하여 1ml당의 전체 인터페론의 활성 γ-인터페론의 활성을 측정하였다.
그 결과는 표 3과 같다.
Figure kpo00005
Figure kpo00006
(주) 수치는 인터페론 활성을 뜻하며, ()안의 수치는 γ-인터페론 활성을 뜻한다.
표 3의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 인체 연유의 배양주화된 각종 임파구성 세포의 γ-인터페론 생성능을 비교하였던 바, 종래 생산성이 전혀 알려져 있지 않은 골수 단구계 세포로 부터의 생성을 발견하였으며, 또한 그 생성량이 많다는 것을 판명하였다. 특히 HBL-38 세포는 γ-인터페론 생성능이 현저히 높아서 유리하게 이용할 수 있다.
[실험 1-2]
생체내에서 증식시킨 세포에 의한 인터페론의 제조
갖태어난 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법에 따라 제조한 항혈청을 미리 주사하여 햄스터의 면역을 약하게 한 다음, 그 피하에 배양주화된 인체 연유의 골수 단구계 세포를 각기 이식한 후, 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 발생한 종양을 적출하여 세절한 다음 트립신 함유의 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켰다.
수득한 각각의 세포를 실험1-1과 마찬가지로 현탁액으로 하여 마찬가지로 전체 인터페론의 활성과 γ-인터페론의 활성을 측정하였다.
그 결과는 표 4에 나와 있다.
Figure kpo00007
(주) 수치는 인터페론 활성을 뜻하며, ()안의 수치는 γ-인터페론 활성을 뜻한다.
제3표 및 제4표의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 배양주화된 인체 연유의 골수 단구계 세포, 특히 HBL-38 세포는 생체밖에서 증식시킨 세포 보다도 생체내에서 증식시킨 세포의 쪽이 현저하게 높은 γ-인터페론 생성량을 나타낸다는 것을 판명하였다.
다음에는 γ-인터페론의 제조예를 실시예A에 따라 설명한다.
[실시예 A-1]
HBL-38 세포를 태아 소 혈청 10v/v%를 보충한 RPMI 1640 배지(pH7.2)에 세포 농도 5×10 /ml가 되도록 접종하였다.
그런 다음, 통상의 방법에 따라서 정기적으로 신선한 배지와 교환하면서 37℃에서 배양하고, 이어서 신선한 동일 배지로 세포를 세척하여 이 배지에 농도 2×10 /ml가 되도록 현탁하였다. 여기에 리포폴리삭카라이드를 1ml당 약 10㎍를 첨가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 1ml당 약 5,100단위의 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 수득하였다.
[실시예 A-2]
갖태어난 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법에 따라 제조한 항혈청을 미리 주사하고, 햄스터의 면역 반응을 약하게 한 다음, 그 피하에 HBL-38 세포를 이식한 후, 통상의 방법으로 4주간 사육하였다. 피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음 콜라가나아제를 함유하는 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분리하였다.
이 세포를 이이글의 최소 기본 배지에서 세척한 다음, 같은 조성의 새로운 배지로 세포 농도가 약 2×10 /ml가 되도록 희석하고, 여기에 1ml당 피토헤마글루티닌 200㎍ 및 리피드A 5㎍을 가하고, 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다.
이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 93,000 단위의 γ-인터페론을 수득하였다.
따라서, 햄스터 1마리당 약 183,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.
[실시예 A-3]
갖태어난 쥐의 정맥에 KG-1 세포를 이식한 다음 통상의 방법으로 4주간 사육하였다.
피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음 실시예A-2와 마찬가지로 하여 분산시켜 세포 현탄액을 수득하였다. 이 세포 현탁액에 1ml 당 센다이 비루스 약 100적혈구 응집가 및 리포폴리삭카라이드 약 5㎍을 가하고 37℃에서 2일간 유지하여 인터페론 생성을 유발시켰다.
이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 49,000 단위 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서, 쥐 1마리당 약 97,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.
[실시예 A-4]
구멍의 지름이 약 0.5미크론인 박막 필터를 설치한 내용량 약 10ml의 플라스틱제 원통형 확산 챔버내에 CTV-1 세포를 생리 식염수로 부유시키고, 이 확산 챔버를 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.
이 쥐를 통상의 방법으로 4주간 사육한 다음 이 챔버를 들어내었다.
이 증식된 세포를 실시예A-1과 마찬가지로 처리하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 41,000 단위의 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서 쥐 1마리당 약 78,000,000단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.
[실시예 A-5]
37℃에서 5일간 보존한 닭의 수정란에 HBL-38 세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 관리하였다. 이 수정란을 깨어 증식된 세포를 채취하고, 이 세포를 실시예A-2와 마찬가지로 처리하여 인터페론 생성을 유발시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1ml당 약 36,000 단위 γ-인터페론을 수득하였다. 따라서, 수정란 10개당 약 60,000,000 단위의 γ-인터페론을 수득할 수 있었다.
다음에는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법과 그것을 이용한 고순도의 γ-인터페론의 정제예를 실시예B에 따라 설명한다.
[실시예 B-1]
(1) 부분 정제한 γ-인터페론의 제조
실시예A-2의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 함유하는 용액을 pH 8.5의 0.01M 트리스(Tris) 인산염완충액으로 20시간 투석한 다음, 다시 막여과하여 수득한 여과액을 항 α-인터페론 항체 및 항 β-인터페론 항체를 고정화하고 잇는 항체 칼럼에 가하여 그 비흡착 확분을 채취하였다. 획분을 크로마토포커싱법(chromatofocusing)에 따라 항비루스 활성 획분을 채취하여 농축, 동결 건조함으로써 γ-인터페론을 함유하는 분말을 활성 수율 약 30%로 수득하였다.
이 제품의 비활성(specific activity)은 약 10 단위/mg 단백질이었다.
(2) 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조
위의 실시예B-1(1)의 방법에서 수득한 부분정제 γ-인터페론을 생리 식염수 0.05w/w%의 농도가 되도록 용해하고, 이 용액에 프로인드 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)을 같은 양 혼합하여, 이 혼합액 0.2ml를 마우스의 피하에 주사한 다음, 7일후 다시 마찬가지로 주사하여 마우스를 면역하였다. 항체 생성능을 가진 세포를 γ-인터페론 항체를 유발 생성시켜 이 마우스로 부터 비장을 적출하고 세절 분산하여 수득한 비장 세포와 마우스 골수종 세포 P-X63-Ag8(미합중국 Flow Laboratories사 제조)를 혈청을 함유하지 않은 이이글 최소 기본 배지에서 제조한 50w/v%폴리에틸렌 글리콜-1000 함유 용액(pH7.2, 온도 37℃)에 각기 10 /ml의 세포 밀도가 되도록 부유시켰다. 이것을 5분간 유지한 다음 갖 제조한 동일의 기본 배지에서 20배로 희석하고, 이어서 공지의 방법[R. L. Davidson and P. S. Gerald, Somatic Cell Genetics, Vol. 2, No. 2, pp. 175-176(1976년)]에 준하여 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 함유 배양액에서 증식할 수 있는 잡종 세포를 채취하여 클로닝함으로써 이 잡종 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 세포를 선택하였다. 수득한 잡종 세포를 마우스 복강내에 1마리당 약 10 개를 이식하여 2주간 사육한 다음 이것을 도살하여 복수, 혈액등의 체액을 모아서 원심분리하고, 그 상청액에 황산 암모늄을 가하여 포화도 30~50%의 침전 획분을 얻었다.
이것을 투석하고 다시 이 액을 위의 (1) 방법으로 수득한 γ-인터페론과 시안화 브롬(BrCN)활성화 세파로오스(Sepharose)와 실온하에서 반응시켜서 수득한 고정화 γ-인터페론 겔로 친화성 크로마토그래피를 실행하고, 항 γ-인터페론 항체 획분을 수드하여 투석한 다음 농축하고 동결 건조하여 γ-인터페론의 모노클로날 항체의 분말을 채취하였다.
이 제품은 골수 단구계 세포로 부터 연유하는 인체 인터페론 활성에 대하여 면역학적으로 특이적인 중화 활성을 나타내었다.
이 모노클로날 항체의 수용액에서의 안정성을 pH7.2에서 30분간 유지하는 조건에서의 잔존 중화 활성의 측정으로 조사한 결과, 60℃에서 80% 이상의 활성이 잔존하였으나, 70℃에서 90% 이상의 활성을 상실하였다. 또한, 4℃에서 16시간 유지하는조건에서는 pH4.0~11.0의 범위에서 안정하였고, ph 2.0에서는 90% 이상의 활성을 상실하였다.
더욱이, 이 모노클로날 항체의 성질을 조사한 결과, 2-메르캅토에탄올 존재하에서는 불안정하였으며, 항마우스 면역글로블린 M항체와 특이적인 항원 항체 반응을 나타냄을 판명하였다.
따라서, 이 모노크롤날 항체는 면역글로블린 M급으로 분류되는 항체이다.
(3) 고순도로 정제한 γ-인터페론의 제조
위의 실시예B-1 (1)의 방법으로 제조한 부분정제 γ-인터페론을 위의 실시예B-1 (2)의 방법으로 제조한 모노클로날 항체를 고정화한 겔을 사용한 칼럼에서 크로마토그래피를 실시하여 γ-인터페론의 활성 획분을 채취하여 투석하고 농축하여 동결 건조함으로써 약 80%의 수율로 γ-인터페론 함유 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.
[실시예 B-2]
(1) 부분 정제한 γ-인터페론의 제조
실시예A-3의 방법으로 제조한 γ-인터페론 함유 용액을 실시예B-1 (1)의 방법에 준하여 부분정제 하여 비활성이 약 10 단위/mg 단백질인 γ-인터페론을 수율 약 20%로 수득하였다.
(2) 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조
실시예B-2 (1)의 방법으로 수득한 부분정제 γ-인터페론을 항원으로 사용한 이외는 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 마우스를 면역하여 비장 세포를 수득하였다.
이 비장 세포와 마우스 골수종 세포 P3-NS-1/1-Ag4-1(일본국의 다이닛뽕 세이야꾸 가부시기가이샤 제조)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaHPO, 2mM CaCl를 함유하는 염용액에 각기 세포 밀도 10 /ml가 되도록 부유시켜, 여기에 미리 자외선 조사(照射)로 비활성화한 센다이 비루스를 함유하는 전술한 것과 동일한 염용액을 가하여 빙냉하에서 혼합하고, 이 혼합액을 5분후에 37℃의 RPMI 1640배지에서 약 20배로 희석한 다음, 이어서 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 처리하여 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 클로닝하였다.
수득한 잡종 세포를 공지의 방법으로 면역 반응을 약하게 한 생후 7일되는 햄스터의 복강내에 1마리당 약 10 개를 이식하고, 실시예B-1 (2)와 마찬가지로 햄스터를 처리하여 모노클로날 항체를 제조하였다.
이 제품은 실시예B-1 (2)에서 제조한 모노클로날 항체와 마찬가지로 γ-인터페론 활성에 대하여 면역학적으로 특이적인 중화 활성을 나타낸다.
이 모노클로날 항체의 수용액에서의 안정성을 그 중화 활성의 측정으로 조사한 결과, pH7.2에서 30분간 유지하는 조건에서 60℃에서 80%이상의 활성이 잔존하였으나, 70℃에서는 90% 이상의 활성을 상실하였다. 또, 4℃에서 16시간 유지하는 조건에서 pH2.0~11.0의 범위에서 안정하였다.
더욱이, 이 모노클로날 항체의 성질을 조사한 결과, 2-메르캅토에탄올 존재하에서는 안정하였으며, 항마우스 면역글로블린 G항체와 특이적 항원 항체 반응을 나타내었음을 판명하였다.
따라서, 이 모노클로날 항체는 면역글로블린 G 급으로 분류되는 항체이다.
(3) 고순도로 정제한 γ-인터페론의 제조
실시예B-2 (1)의 방법으로 제조한 부분 정제 γ-인터페론을 실시예B-2 (2)의 방법으로 제조한 모노클로날 항체를 고정화한 겔을 사용한 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 γ-인터페론의 활성 획분을 채취하고, 투석, 농축하여 활성 수율 약 85%의 γ-인터페론 용액을 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg단백질이었다.
[실시예 B-3]
실시예A-1의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 pH7.2의 0.01M 인산염 완충액을 함유하는 생리식염수도 15시간 투석하고, 다시 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-1 (3)의 방법에 준하여 항체 컬럼에서 정제하고, 농축, 동결, 건조하여 활성 수율 약 75%의 γ-인터페론 함유 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.
[실시예 B-4]
실시예A-4의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 실시예B-3의 방법에 준하여 투석, 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-2 (3)의 방법에 준하여 항체 컬럼을 사용하여 정제하고 농축함으로써 활성 수율 약 70%의 γ-인터페론 용액를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.
[실시예 B-5]
실시예A-5의 방법으로 수득한 γ-인터페론을 함유하는 상청액을 실시예B-3의 방법에 따라서 투석, 막여과하여 수득한 여과액을 실시예B-1 (3)의 방법에 따라서 항체 칼럼을 사용하여 정제하고, 농축, 동결건조하여 활성 수율 약 70%의 γ-인터페론 고체를 수득하였다. 이 제품은 고순도로 정제된 γ-인터페론으로서 그 비활성은 약 1.5×10 단위/mg 단백질이었다.
다음에는 γ-인터페론을 사용하여 γ-인터페론 감수성 질환의 예방, 치료에 관한 실험2를 설명한다.
[실험 2]
γ-인터페론에 의한 γ-인터페론 감수성 질환의 예방, 치료 시험
[실험 2-1]
시험관내에서의 비루스 증식 억제 작용
직격 6cm의 접시에서 단층 배양한 인간 태아의 폐의 초대(初代) 배양 세포에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 0.1, 1.0 또는 10.0 단위를 첨가하여 37℃에서 5% CO가스 세균보육기속에서 20시간 관리한 다음, 여기에 γ-인터페론을 첨가하지 않았을 경우 약 100개의 플래크 형성능을 가진 투여량의 바리셀라 조스터 비루스(수두대상포진(水痘帶狀疱疹)비루스), 또는 인간 사이토메갈로 비루스(사산(死産), 조산원인 비루스)를 첨가함에 따라 새성하는 플래크수를 산출하였다.
비루스 증식 억제 작용은 γ-인터페론에 의한 플래크수 감소율의 크기로 판정하였다.
Figure kpo00008
A:γ-인터페론을 첨가하지 않은 것에서의 플래크수
B:γ-인터페론을 첨가한 것에서의 플래크수
Figure kpo00009
표 5의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 γ-인터페론은 비루스성 질환을 야기하는 비루스의 증식을 잘 억제하고 있음을 알 수 있다.
[실험 2-2]
γ-인터페론에 의한 악성 종양의 치료
(1) 시험관내에서의 γ-인터페론에 의한 악성 종양 세포 증식 억제 작용
소 태아 혈청 15v/v%를 함유하는 RPMI 1640 배지에서 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 최종 농도가 5, 50, 500 단위/ml 되도록 첨가하고, 다시 여기에 인체 연유의 악성 종양 세포를 5×10 /ml의 농도가 되도록 접종한 다음 37℃로 보존한 5% CO가스 세균 보육기 속에서 3일간 배양하였다. 대조하기 위하여 100℃에서 30분간 보존하여 미리 비활성화한 같은 양의 γ-인터페론을 동일한 배지에 각기 같은 양이 되도록 첨가하여 마찬가지로 배양하였다. 배양 종료후 공지의 방법[Applied Microbiobogy, Vol. 22, No. 4, pp. 671-677(1971년)]에 따라서 염색제인 중성 적(neutral red)으로 생세포를 염색한 후, 이 염색제를 산성화 에탄올로 용출하였다. 용출액의 540ml에서의 흡광도로 부터 생세포 양을 측정하였다.
세포 증식 억제율(%)은 다음 식으로 부터 산출하였다.
Figure kpo00010
A:시험구역의 생세포 양
B:대조구역의 생세포 양
측정 결과를 표6에 나타내었다.
Figure kpo00011
표 6의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명에서 사용하는 γ-인터페론은 KB 세포, HEP-2 세포, KATO-II 세포, P-4788 세포 등의 악성 종양 세포의 증식을 현저히 억제하고 있으며, 그 활성 농도도 5~500단위/ml에서 유효하다는 것을 알 수 있다.
(2) 시험관내에서 γ-인터페론에 의한 다른 림포카인 악성 종양
증식억제 작용의 증강 효과
사용한 림포카인(lymphokine)으로서 γ-인터페론을 5단위/ml,γ-인터페론을 50단위/ml 및 종양 괴사인자(TNF)를 10단위/ml를 사용하였다. 이러한 림포카인은 어느 것이나 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형의 것을 사용하였다.
실험 방법은 실험2-2 (1)의 방법에 준하여 실시하여 세포 증식 억제율(%)을 구하였다. 그 결과는 표 7에 나와 있다.
Figure kpo00012
(주) γ-IFN은 천연형 γ-인터페론을, α-IFN은 천연형 α-인터페론을, 그리고, TNF은 천연형 종양 괴사 인자를 뜻한다.
표7의 결과로 부터 명백한 바와같이, γ-인터페론을 병용하면 다른 림포카인이 가진 악성 종양 증식 억제 작용을 현저히 증강하였으며, 그 작용은 γ-인터페론이 가진 그 억제 작용과 상승 효과를 나타내었다.
(3) 시험관내에서 γ-인터페론에 의한 화학 요법제의 악성 종양 증식
억제 작용의 증강 효과
실험2-2 (1)의 방법에 준하여 제조한 영양 배지 1ml에 인체로부터 연유하여 악성 종양 세포를 10 개씩 접종하여 1일 배양한 다음, 여기에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 최종 농도 50 단위 및/또는 화학 요법제를 함유하는 생리 식염수 0.1ml을 첨가하여 37℃에서 2일간 배양하였다. 대조로서 γ-인터페론 및 화학 요법제를 함유하지 않는 생리 식염수를 사용하였다. 배양이 종료한 다음 실험2-2 (1)의 방법에 따라서 세포 증식 억제율(%)을 구하였다.
더욱이, 화학 요법제의 농도는 배양액 1ml당 염산 니무스틴(ACNU) 1.0×10 g, 플루오로우라실 (5-FU) 1.5×10 g, 독소루비신(ADM) 1.0×10 g, 미토마이신 C(MMC) 2.5×10 g 및 황산 빈크리스틴(VCR) 1.5×10 g으로 하였다. 그 결과 표 8에 나와 있다.
Figure kpo00013
(주) -는 첨가하지 않은 것을, +는 첨가한 것을 뜻한다.
제8표의 결과로 부터 명백한 바와 같이, γ-인터페론은 각종 화학요법제가 가진 악성 종양 증식 억제 작용을 현저히 증강하고, 그 작용은 γ-인터페론이 가진 억제 작용과 상가 효과 또는 상승 효과를 뜻한다.
(4) 생체내에서의 악성 종양 증식 억제 작용
BALB/c 연유의 누드 마우스에 인체 유암 조직편을 등부분 피하에 이식하고, 그 종양 체적이 약 200m 가 된 시기로 부터 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 단독으로 또는 이 인터페론과 인체 임파구성 세포로 부터 연유하는 다른 림포카인 및/또는 화학 요법제를 병용하여 생리 식염수에 용해한 상태에서 매일 1회씩 20일간 정맥 주사를 하였다.
그런 다음, 누드 마우스를 도살하여 종양의 중량을 측정하였다.
더욱이, 대조로서 위와 마찬가지로 생리 식염수를 사용하였다. 그 결과는 표 9에 나타내었다.
Figure kpo00014
Figure kpo00015
※ 위험율 5% 이하에서 대조한 값에 비교하여 추계학적(推計學的)으로 실험치와 이론치와의 차가 있었다.
표 9의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 생체내(in vivo)의 시험에 있어서도 γ-인터페론은 악성 종양의 증식을 현저히 억제한다. 또, 그 증식 억제 작용은 다른 림포카인이나 화학 요법제와의 병용에 따라 현저히 증강되어 높은 항종양 효과를 발휘하였다.
(5) 급성 독성 시험
생후 20일 되는 마우스를 사용하여 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론의 급성 독성 시험을 하였다.
그 결과, γ-인터페론의 독성은 극히 낮아서 복강내에 주사하였을 때의 LD50는 109단위 이상임을 판명하였다.
다음에는 본 발명의 γ-인터페론을 유효 성분으로 하여 함유시킨 약제의 제조예를 실시예 C에 따라 설명한다.
[실시예 C-1]
액제
생리 식염수에 실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 500단위의 비율로 함유시켜서 액제를 제조하였다.
이 제품은 유행성 결막염이나 인플루엔자 등의 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 분무용, 점안용, 점비용, 양치질용으로 가장 적합하다.
[실시예 C-2]
주사제
생리 식염수에 실시예B-2 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 100,000 단위의 비율로 함유시키고, 이것을 무균적으로 여과한 다음, 수득한 여과액을 멸균한 유리 용기에 2ml 씩 취하여 동결 건조하여 뚜껑을 닫은 후 건조 주사제를 수득하였다.
이 제품은 실시예C-1의 경우와 마찬가지로 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다. 그리고, 위암, 폐암, 간암, 백혈병 등의 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 또한 과민성 알레르기, 악성 빈혈, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 예방제, 치료제로서도 가장 적합하다.
더욱이, 멜팔란(melphalan), 메토트렉세이트(methotrexate), 독소루비신 등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 매우 적합하다.
[실시예 C-3]
주사제
생리 식염수 실시예B-3의 방법으로 제조한 γ-인터페론을 1ml당 10,000단위와 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 α-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 종양 괴사 인자를 1ml당 각각 100,000 단위씩의 비율로 함유시켜, 이것을 무균적으로 여과하고 실시예C-2와 마찬가지로 동결 건조하여 건조 주사제를 수득하였다.
이 제품은 각종 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 가장 적합하다.
또한, 유방암, 폐암, 간암, 위암, 백혈병 등의 각종 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 교원병 등의 각종 악성 종양의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 교원병, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 예방제, 치료제로서도 가장 적합하다.
더욱이, 테가푸르(tegafur), 미토마이신 C, 황산 빈크리스틴 등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 매우 적합하다.
[실시예 C-4]
[연고제]
실시예B-1 (3)의 방법으로 제조한 γ-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 α-인터페론을 통상의 방법에 따라 소량의 유동 파라핀과 함께 혼화한 다음 제품 그램당 γ-인터페론 및 α-인터페론이 각기 50,000단위 및 500,000 단위가 되도록 와셀린을 가하고 혼합하여 연고제를 수득하였다.
이 제품은 헤르페스, 피부암, 과민성 피부암 등의 각종 피부질환의 예방제, 치료제로서 가장 적합하다.
[실시예 C-5]
[장용성 정제]
통상의 방법에 따라서 전분과 말토오스를 기재로 하여 정제를 제조함에 있어, 실시예B-5의 방법으로 제조한 γ-인터페론 및 임파구성 세포로 부터 연유하는 천연형 종양 괴사 인자를 1정(200mg)당 10,000 단위씩 함유시켜서 정제를 제조하고, 여기에 미틸셀룰로오스 프탈레이트를 피복하여 장용성 정제를 수득하였다.
이 제품은 소장, 대장등에 있어서 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 유리하게 이용할 수 있다.
또한, 대장암, 결장암, 간암 등의 예방제, 치료제로서, 그리고 과민성 알레르기, 중증 근무력증, 관절 류머티즘, 전신성 홍반 등의 면역 질환의 치료제, 예방제로서도 유리하게 이용할 수 있다.
더욱이, 독소루비신(ADM), 플루오로우라실, 미토마이신 C등의 화학 요법제의 항종양 효과 증강제로서 이용하는 것도 가장 적합하다.
본문에서 상세히 설명한 바와 같이, 종래의 γ-인터페론은 그 생산량이 불충분하여 공업적으로 제조하는 것은 매우 곤란하였다. 이에 대하여, 본 발명은 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포가 γ-인터페론 생성능이 현저히 크다는 것을 발견하고, 이 세포를 사용하는 γ-인터페론의 대량 제조방법을 확립하였다.
또, 이 γ-인터페론을 항원으로 한 모노클로날 항체의 제조방법과 그 항체에 의한 정제방법을 확립하여 수득한 γ-인터페론을 유효 성분으로 함유시켜 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제를 완성하였다.
이 예방제 및 치료제는 종래 치료가 곤라하였던 비루스성 질환, 악성 종양, 면역 질환 등의 예방제, 치료제로서 현저한 효과를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 산업적 의의는 매우 큰 것이다.

Claims (18)

  1. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜, 이것을 회수함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론을 생성 시키는 단계에 있어서 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포에 유발물질을 작용시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서, 골수 단구계 세포가 HL-60세포, KG-1 세포, ML-1 세포, ML-2 세포, LM-3 세포, THP-1 세포, U-937 세포 및 CTV-1 세포로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 γ-인터페론의 제조방법.
  5. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 회수하고, 수득한 γ-인터페론을 항원으로 하여 인간 이외의 온혈동물을 면역시켜, 이 동물로 부터 항체 생성 세포를 채취한 다음, 이 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시키고, 수득한 융합 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 선택한 후, 이 잡종 세포를 증식시켜서 γ-인터페론에 특이성을 나타내는 모노클로날 항체를 생성시킴을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.
  6. 제5항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구게 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 모노클로날 항체가 면역글로불린 G급 또는 면역글로불린 M급임을 특징으로 하는 항 γ-인터페론 모노클로날 항체의 제조방법.
  8. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜, 이것을 γ-인터페론 모노클로날 항체를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 정제함을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.
  9. 제8항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서, 항 γ-인터페론 모노클로날 항체가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성, 축적시켜 이것을 회수하고, 수득한 γ-인터페론을 항원으로 하여 인간 이외의 온혈동물을 면역시켜, 이 동물로 부터 항체 생성 세포를 채취한 다음, 이 항체 생성 세포와 골수종 세포를 융합시키고, 수득한 융합 세포로 부터 항 γ-인터페론 항체 생성능을 가진 잡종 세포를 선택한 후, 이 잡종 세포를 증식시켜서 γ-인터페론에 특이성을 나타내는 모노크롤날 항체를 생성시켜 수득되는 것임을 특징으로 하는 γ-인터페론의 정제방법.
  11. 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포를 사용하여 γ-인터페론을 생성시키고, 생성된 γ-인터페론을 회수하고 정제하여 수득한 γ-인터페론 1~10,000,000단위/g과 약제학적으로 허용되는 담체를 함유함을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  12. 제11항에 있어서, 골수 단구계 세포가 인체로 부터 연유하는 배양주화된 골수 단구계 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내에 혹은 체외에 부착한 확산 챔버내에 이식하여 그 온혈동물의 체액을 받으면서 증식시켜 수득되는 세포임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론을 생성시키는 단계에 있어서 인체로 부터 연유하는 배양주화된 γ-인터페론 생성능을 가진 골수 단구계 세포에 유발물질을 작용시키는 단계를 포함함을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 골수 단구계 세포가 HL-60세포, KG-1 세포, ML-1 세포, ML-2 세포, LM-3 세포, THP-1 세포, U-937 세포 및 CTV-1 세포로 된 군으로 부터 선택되는 1종인 것을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 유효 성분으로 함유되는 γ-인터페론이 항 γ-인터페론 모노클로날항체를 사용한 칼럼 크로마토그래피로 정제하여 채취되는 것임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  16. 제11항 또는 제12항에 있어서, γ-인터페론과 함께 다른 림포카인을 유효 성분으로 함유시킴을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  17. 제11항 또는 제12항에 있어서, 림포카인이 γ-인터페론, β-인터페론, 종양 괴사 인자, 림포톡신, 인터로이킨 2, B세포 분화 인자 및 이들의 혼합물로 부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 림포카인임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
  18. 제11항 또는 제12항에 있어서, γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제가 항비루스제, 항종양제, 항종양 효과 증강제 또는 면역 질환 치료제임을 특징으로 하는 γ-인터페론 감수성 질환의 예방제 및 치료제.
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