CN111246885A - 从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本文中报道了一种通过在两个2/3‑IgG之间的半抗体交换反应产生多特异性抗体的方法，通过在一个半中不对称扰动性突变去稳定化所述2/3‑IgG，以促进正确组装的全长双特异性抗体生成的。该方法可以在还原剂不存在的情况下进行并且不需要起始2/3‑IgG中的铰链区二硫键。

Description

从单特异性抗体生成多特异性抗体的方法
本文中报道了使用新的半抗体(half-antibody)交换方法，生成双特异性抗体和多特异性抗体的易用和可放大方法。
背景技术
使单特异性抗体衍生物生物化学转化以组装双特异性抗体的现有技术方法应用了(i)半抗体互补作用反应和(ii)IgG-IgG交换反应。
这些技术例如公开于以下文献中：WO 2015/046467、Rispens等人,J.Biol.Chem.289(2014)6098–6109、US 9,409,989、WO 2013/060867、WO 2011/131746、WO2011/133886、WO 2011/143545、WO 2010/151792,Gunasekaran等人,J.Biol.Chem.285(2010)19637–19646、WO 2009/041613、WO 2009/089004、WO 2008/119353、WO 2007/114325、US 8,765,412、US 8,642,745、WO 2006/047340、WO 2006/106905、WO 2005/042582、WO 2005/062916、WO 2005/000898、US 7,183,076、US 7,951,917、Segal,D.M.等人,Curr.Opin.Immunol.11(1999)558–562、WO 98/50431、WO 98/04592、Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681、WO 96/27011,Carter,P.等人,Immunotechnol.2(1996)73、WO 93/11162和Kostelny,S.A.等人,J.Immunol.148(1992)1547-1553。
使单特异性抗体或抗体衍生物转化成bsAbs的现有技术方法具有缺点，如，例如，涉及装配后bsAb制备物的过程及其组成的局限性。
例如，除了双价IgG外，半抗体技术装配单特异性和单价抗体。输入分子的表达以及交换反应本身不仅生成半抗体，还生成IgG样双价(单特异性)抗体衍生物。聚合物也存在于输入材料中以及装配反应的输出中。两者(双价单特异性抗体和聚集物)均需要借助复杂纯化方案从组装的bsAb定量移除或(当定量移除难以按高通量方式实现)，它们某种程度“损害”bsAb制备物。
例如，Fab臂交换技术从单特异性双价IgG-衍生物装配双特异性双价IgG。因此，进入交换反应的输入物是双价，即通过默认实现的亲合力。为了确保将进行亲合力筛选或激动性抗体筛选的交换反应中完全缺少剩余的双价单特异性输入材料，将必须确保完全移除任何剩余的双价输入物以及完全移除交换反应期间可能形成的任何聚集物。归因于输入物和bsAb的高度相似性，用于定量移除的精细程序是必要的(很难按高通量实现)，或剩余的双价输入物和聚集物将某种程度损害最终的bsAb制备物。
Labrijn,A.F.等人公开了通过受控Fab臂交换高效生成稳定的双特异性IgG1(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(2013)5145-5150)。
WO 2014/081955公开了异二聚体抗体及使用方法。
WO 2009/089004公开了使用静电转向效应产生抗体Fc-异二聚体分子的方法。其中公开：涉及结构域-结构域相互作用的四个独特电荷残基对(Asp356---Lys439'、Glu357--Lys370'、Lys392---Asp399'、Asp399---Lys409')当中，仅Lys409---Asp399'适于工程化，因为两个残基在结构上均保守以及被埋入。在其他三个对子，至少一个配偶体是溶剂暴露的(％ASA>10)。
WO 2018/155611公开了未通过共价键合作用结合的第一抗原结合分子和第二抗原结合分子的组合，其中相比同型二聚体，所述组合在混入液体时更易形成异二聚体。前述文献在一个实施方案中更优选地公开：在按照EU编号体系的位置226和位置229的一个位置或二个位置中半胱氨酸残基处置换为其他氨基酸与按照EU编号体系的位置357或位置397的至少一个位置中将第一CH3和第二CH3之一者或二者置换为其他氨基酸残基组合。
发明简述
本文中报道了一种通过半抗体交换反应产生多特异性抗体的方法。已经发现，作为起始材料，包含抗体轻链、抗体重链和抗体重链Fc区片段的非完整抗体(如2/3-IgG)是有利的，其中重链-重链相互作用通过不对称扰动性突变、优选地在Fc区片段中的不对称扰动性突变去稳定化。已经发现这种扰动性突变促进起始性非完整抗体解离及正确组装的(例如，全长)双特异性抗体生成。
本发明的方法可以在还原剂存在以及不存在的情况下进行。在后一种情况下，在起始抗体(如，例如2/3-IgG或完整抗体)中，不需要重链-重链二硫键，如，例如铰链区二硫键，并且因此其不存在。因此，本发明的链-交换反应和方法还允许双特异性抗体在无初始还原的情况下体外组装。因此，可以(例如通过诱变PCR)移除起始分子(2/3-IgG)的重链之间的分子内二硫键。可以依据蛋白质L/SEC方法操作2/3-IgG的纯化，所述方法可以规定为这些分子的标准纯化策略。尽管重链之间缺少全部分子间二硫键，但稳定(即可分离)的2/3-IgG正确形成。因此，采用起始分子，可以用无还原过程的链-交换反应实现双特异性抗体的体外生成。在链-交换反应后，可以实现纯化形成的双特异性抗体，例如若使用组氨酸标签，则通过镍吸附色谱实现。与依赖还原性链-交换反应的现有技术方法相比，使用这种无还原过程的链-交换反应，可以形成蛋白质产率更高的纯化双特异性抗体。总之，本发明的无还原过程的链交换方法使得更高效产生纯的和有功能的双特异性抗体成为可能。
总体上，本文中报道了一种用于产生(多特异性)结合物/多聚体多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-孵育
第一结合物(其是单特异性或双特异性和异聚体)/多聚体多肽，其包含均包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域的第一(单聚体)多肽和第二(单聚体)多肽，
其中第一多肽的CH3结构域相对于其野生型序列包含一个或多个突变，并且第二多肽的CH3结构域相对于其野生型序列包含一个或多个突变，据此第一和第二CH3结构域中的两个或更多个突变导致异二聚体形成，
其中第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第二多肽在CH3结构域中包含与异二聚化所要求的突变(选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组)不同的至少一个/第一扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽共价或非共价地彼此缔合/形成共价或非共价的二聚体/共价或非共价地彼此缔合/是共价或非共价的二聚体，(据此当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
第二结合物(其是单特异性或双特异性和异聚体)/多聚体多肽，其包含均包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域的第三(单聚体)多肽和第四(单聚体)多肽，
其中第三多肽的CH3结构域相对于其野生型序列包含一个或多个突变并且第四多肽的CH3结构域相对于其野生型序列包含一个或多个突变，据此第一和第二CH3结构域中的两个或更多个突变导致异二聚体形成，
其中第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第三多肽在CH3结构域中包含与异二聚化所要求的突变(和选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组)不同的至少一个/第二扰动性突变，据此第四多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，据此第三多肽中的突变处在异于第二多肽中突变的位置，
其中第三多肽和第四多肽共价地或非共价地彼此缔合/形成共价或非共价的二聚体/是非共价或共价地彼此缔合/是非共价或共价的二聚体，(据此当第三多肽和第四多肽形成异二聚体时，第三多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
其中当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的(第一)扰动性突变和第三多肽中的(第二)扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的结合物并且因而产生(多特异性)结合物，
本文中报道了一种用于产生(多特异性)结合物/多聚体多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-孵育
第一结合物(其是单特异性或双特异性和异聚体)/多聚体多肽，其包含均包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域的第一(单聚体)多肽和第二(单聚体)多肽，
其中i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
其中第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个/第一扰动性突变(其选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组)，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽共价或非共价地彼此缔合/形成共价或非共价的二聚体/共价或非共价地彼此缔合/是共价或非共价的二聚体，(据此当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
第二结合物(其是单特异性或双特异性和异聚体)/多聚体多肽，其包含均包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域第三(单聚体)多肽和第四(单聚体)多肽，
其中i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
其中第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第三多肽在CH3结构域中包含至少一个/第二扰动性突变(其选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组)，据此第四多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，据此第三多肽中的突变处在异于第二多肽中突变的位置，
其中第三多肽和第四多肽共价地或非共价地彼此缔合/形成共价或非共价的二聚体/是非共价或共价地彼此缔合/是非共价或共价的二聚体，(据此当第三多肽和第四多肽形成异二聚体时，第三多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
其中当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的(第一)扰动性突变和第三多肽中的(第二)扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的结合物并且因而产生(多特异性)结合物，
本发明的一种方法是一种用于产生多聚体多肽的方法，所述方法包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体起始多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-1)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-1)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的第一扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第一扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-1)第一多肽和第二多肽是二聚体，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体起始多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-2)i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
b-2)第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-2)第三多肽在CH3结构域中包含与a-2)下的突变不同的第二扰动性突变，据此第四多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第二扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-2)第二扰动性突变处在异于第一扰动性突变的位置，
e-2)第三多肽和第四多肽是二聚体，
f-2)当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的多聚体多肽并且因而产生多聚体多肽。
在一个实施方案中，第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含衍生自人IgG1CH2结构域(变体人IgG1 CH2结构域)的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域(变体人IgG1CH3结构域)的CH3结构域。
在一个实施方案中，第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含i)彼此独立地氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:65)或氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，ii)衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和iii)衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域。
在一个实施方案中，i)第一和第四多肽各自还包含衍生自人IgG1CH1结构域((变体)人IgG1 CH1结构域)的CH1结构域和(彼此独立地)包含(重链或轻链)可变结构域，或ii)第一或第四多肽包含衍生自人IgG1CH1结构域((变体)人IgG1 CH1结构域)的CH1结构域并且相应的其他多肽包含衍生自轻链恒定结构域((变体)人κ或λCL结构域)的结构域并且每种多肽还包含可变结构域。在一个实施方案中，第一多肽的可变结构域和第四多肽的可变结构域是(不同的)重链可变结构域。在一个实施方案中，第一多肽的可变结构域是重链可变结构域并且第四多肽的可变结构域是轻链可变结构域或反之亦然。
在一个实施方案中，第一和第四多肽可以具有相同或不同的N端至C端序列并且如若第一和第四多肽不同，则它们彼此独立地选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
iv)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab。
viii)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域(衍生其中的CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人IgG1κ或λ轻链恒定结构域(衍生其中的轻链恒定结构域)，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域(衍生其中的CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1κ或λ轻链恒定结构域(衍生其中的轻链恒定结构域)和第二重链可变结构域，
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然。
在一个实施方案中，第一和第四多肽中一者以N末端至C末端方向包含第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、第二重链可变结构域、第一轻链恒定结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，并且第一和第四多肽中另一者以N末端至C末端方向包含第一重链可变结构域，(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域。在一个实施方案中，包含了含有两个重链可变结构域的多肽的结合物还包含第一轻链和(结构域交换的)第二轻链，其中所述第一轻链包含第一轻链可变结构域和第二轻链恒定结构域(与第一重链可变结构域配对)，所述第二轻链包含第二轻链可变结构域和(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域(与第二重链可变结构域配对)，并且另一结合物还包含第一轻链。
在一个实施方案中，第一和第四多肽中一者包含以N末端至C末端方向第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、第一轻链可变结构域、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、铰链区SEQ ID NO:65或66、衍生自人IgG1CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，并且第一和第四多肽中另一者以N末端至C末端方向包含第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域。在一个实施方案中，包含了含有两个可变结构域的多肽的结合物还包含第一轻链和(结构域交换的)第二轻链，其中所述第一轻链包含第二可变轻链结构域和第一轻链恒定结构域(与第一重链可变结构域配对)，所述第二轻链包含第二重链可变结构域和第二轻链恒定结构域(与第一轻链可变结构域配对)，并且另一结合物还包含第一轻链。
在一个实施方案中，第一和第二结合物/多聚体起始多肽各自还包含抗体轻链。
在一个实施方案中
第一结合物/多聚体起始多肽包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自人)IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域，和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第一扰动性突变，所述第一扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽非共价或共价地彼此缔合/形成非共价或共价的二聚体，(据此当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二结合物/多聚体起始多肽包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变，所述第二扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第五多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，据此第四多肽中的扰动性突变处于异于第二多肽中扰动性突变的不同位置，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域，和衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、衍生人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域，和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽非共价或共价地彼此缔合/形成非共价或共价的二聚体，(据此当第四多肽和第五多肽形成异二聚体时，第四多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
在一个实施方案中，孵育步骤在还原剂存在下进行。
在一个实施方案中，孵育步骤在还原剂不存在下进行。
在一个实施方案中，i)第二多肽和第三多肽，或ii)第二多肽和第五多肽还包含(C末端)标签。在一个实施方案中，该标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，并且通过金属(镍)螯合物亲和色谱柱上的色谱回收。在一个实施方案中，该标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)，并且通过C标签亲和色谱柱上的色谱回收。
在一个实施方案中
第一结合物/多聚体起始多肽包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二IgG1 CH1结构域(衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域)、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域，和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第一扰动性突变，所述第一扰动性突变选自D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E和K439E组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽非共价或共价地彼此缔合/形成非共价或共价的二聚体，(据此当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二结合物/多聚体起始多肽包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变，所述第二扰动性突变选自D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K370E和K439E组成的突变群组，据此第五多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，据此第四多肽中的扰动性突变处于异于第二多肽中扰动性突变的不同位置，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、衍生人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽非共价或共价地彼此缔合/形成非共价或共价的二聚体，(据此当第四多肽和第五多肽形成异二聚体时，第四多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
如本文中报道的一个方面是一种用于鉴定(双特异性)结合物组合的方法，所述方法包括步骤
-通过使选自第一多种(单特异性)结合物的第一(单特异性)结合物和选自第二(但是异于第一多种单特异性结合物)多种(单特异性)结合物的第二(单特异性)结合物的每种组合经历本发明的方法，产生多种(双特异性)结合物，
-在结合测定法(如例如ELISA或SPR测定法)中分别测量所产生的多种结合物的每种结合物与至少两种抗原的同时结合作用(其量)，并且
-基于结合测定法(如例如ELISA或SPR测定法)的结果从多种结合物选择结合物并且因而鉴定(双特异性)结合物组合。
如本文中报道的一个方面是包含第一多肽和第二多肽的多聚体多肽其中两种多肽均包含人免疫球蛋白(IgG1)CH3结构域，
其中i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
其中第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个扰动性突变(其选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组)，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽非共价或共价地彼此缔合/形成非共价或共价的二聚体，(据此当第二多肽和第一多肽形成异二聚体时，第二多肽中的扰动性突变导致去稳定化相互作用)。
在一个实施方案中
第一多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，并且
vii)重链可变结构域、衍生人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域，和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
并且包含突变杵或突变臼，
和
第二多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自包含突变杵或突变臼的人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
包含扰动性突变，所述扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基。
在一个实施方案中，多聚体多肽还包含第三多肽，所述第三多肽包含通过至少一个二硫键与第一多肽共价结合的轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
如本文中报道的一个方面是一种组合物，其包含
第一异三聚体多肽，其包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，并且
vii)重链可变结构域、衍生人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变，所述扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，
和
作为第三多肽，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二异三聚体多肽，其包含
作为第一(第四)多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一异三聚体的第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一异三聚体的第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变，所述第二扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第二(第五)多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白(IgG1)中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白(IgG1)野生型氨基酸残基，据此第一(第四)多肽中的扰动性突变处于异于第一异三聚体的第二多肽中扰动性突变的不同位置，
和
作为第二(第五)多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的第一CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、衍生自人IgG1 CH1结构域的第二CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、衍生自人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、衍生人IgG1 CH1结构域的CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二(CH1结构域衍生自其中的)人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、(CH1结构域衍生自其的)人IgG1 CH1结构域)、SEQ IDNO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、(衍生自其的轻链恒定结构域)人IgG1κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和(相同多肽的)结合结构域的第二部分(缔合并且)形成与靶特异性结合的有功能结合位点；在一个实施方案中，结合结构域的第一部分是抗体重链Fab片段(VH-CH1或CH1-VH)并且结合结构域的第二部分是轻链Fab片段(VL-CL或CL-VL)或反之亦然，
如果第一(第四)多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一(第四)多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
和
作为第三(第六)多肽，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的多肽通过二硫键与第一(第四)多肽共价结合，
其中i)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一异三聚体的第一多肽的CH3结构域包含突变臼和第一异三聚体的第二多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一异三聚体的第一多肽包含突变臼，则第二异三聚体(第四)多肽的第一多肽包含突变杵，或ii)如若第一异三聚体的第一多肽包含突变杵，则第二异三聚体(第四)多肽的第一多肽包含突变臼，
其中第一异三聚体的第二多肽和第二异三聚体(第四)多肽的第一多肽在相同位置不包含扰动性突变/在不同位置包含扰动性突变。
本发明实施方案的详细描述
本发明至少部分地基于以下结果：可以使用非完整(即无双特异性结合作用的)抗体作为起始材料，通过半抗体交换反应获得多特异性抗体。示例的非完整抗体是所谓的2/3-IgG。示例性2/3-IgG包含抗体轻链、抗体重链(重链和轻链彼此共价缔合并且通过其VH结构域和VL结构域对形成结合位点)和抗体重链Fc区片段。所述重链Fc区片段本身可以是例如完整或延长或变异的抗体重链的部分。如2/3-IgG中存在的重链::重链Fc区片段对和(有功能的)结合位点限定了本发明交换反应所要求的最小结构性元件。在非完整抗体(如例如在所述2/3-IgG中)中，Fc区之间的相互作用由不对称扰动性突变去稳定化，所述不对称扰动性突变优选地存在于Fc区片段中。如若存在更好的匹配互补的非完整抗体，则所述扰动性突变促进起始性非完整抗体解离及正确组装的完整双特异性抗体生成。
本发明至少部分地基于以下进一步结果：通过使用如上文概述的起始化合物，可以甚至在还原剂不存在的情况下进行本发明的方法。即，不需要Fc区片段和重链之间的二硫键。因此，可以从起始非完整抗体移除铰链区二硫键以及其他重链-重链二硫键。已经发现无所述重链-重链二硫键情况下起始非完整抗体的生成以及交换反应和多特异性抗体的生成仍高效地发生。
I.定义
如本文所用，重链和轻链的全部恒定区和结构域的氨基酸位置根据Kabat等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中描述的Kabat编号***编号并且在本文中称作“根据(Kabat)编号”。具体而言，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(1991)的Kabat编号体系(参见第647-660页)用于κ和λ同种型的轻链恒定结构域CL，并且Kabat EU索引编号体系(参见第661-723页)用于(CH1、铰链区、CH2和CH3，这种情况下，其在本文中通过提到“根据Kabat EU索引编号”进一步澄清)的恒定重链结构域。
可以通过“杵入臼(knob-into-hole)”技术改变双价双特异性抗体的重链Fc-区中的CH3结构域，所述技术以例如WO 96/027011、Ridgway J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中的几个实例详述。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两个CH3结构域的一者可以是“杵”，而另一者是“臼”。二硫键的引入进一步稳定异二聚体(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并增加产率。
在抗体重链的CH3结构域中的突变T366W称作“杵突变”并且在抗体重链的CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V称作“突变臼”(根据Kabat EU索引编号)。也可以例如通过以下方式利用CH3结构域之间的额外链间二硫键(Merchant,A.M等人,Nature Biotech.16(1998)677-681)：向具有“杵突变”的重链的CH3结构域引入S354C突变(称作“杵-cys突变”或“突变杵-cys”)并且向具有“臼突变的重链的CH3结构域引入Y349C突变”(称作“臼-cys突变”或“突变臼-cys”)(根据Kabat EU索引编号)，或反之亦然。
关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。
例如在以下文献中描述了实施本发明的可用方法和技术：Ausubel,F.M.(编著),Current Protocols in Molecular Biology,第I至第III卷(1997)；Glover,N.D.和Hames,B.D.编著,DNA Cloning:A Practical Approach,第I至第II卷(1985),Oxford UniversityPress；Freshney,R.I.(编著),Animal Cell Culture–a practical approach,IRL PressLimited(1986)；Watson,J.D.等人,Recombinant DNA,Second Edition,CHSL Press(1992)；Winnacker,E.L.,From Genes to Clones；N.Y.,VCH Publishers(1987)；Celis,J.编著,Cell Biology,第2版,Academic Press(1998)；Freshney,R.I.,Culture of AnimalCells:A Manual of Basic Technique,第2版,Alan R.Liss,Inc.,N.Y.(1987)。
重组DNA技术的使用能够实现核酸衍生物的产生。这类衍生物可以例如在独立或几个核苷酸位置借助置换、改变、交换、缺失或***受到修饰。可以例如借助位点定向诱变实施修饰或衍生化。这类修饰可以容易地由本领域技术人员实施(参见，例如Sambrook,J.等人,Molecular Cloning:A laboratory manual(1999)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,New York,USA；Hames,B.D.和Higgins,S.G.,Nucleic acid hybridization–apractical approach(1985)IRL Press,Oxford,Englandd)。
必须指出，除非上下文另外明确指出，否则如本文中和所附权利要求中所用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“该(an)”包括多数称谓。因此，例如，对“某细胞”的提及包括多个此类细胞及本领域技术人员已知的其等同物等。同样，术语“a”(或“an”)、“一个或多个”和“至少一个”可以在本文互换使用。还应指出，术语“包含”、“包括”和“具有”可以互换使用。
术语“约”指下文数值的+/-20％范围。在一个实施方案中，术语“约”指下文数值的+/-10％范围。在一个实施方案中，术语“约”指下文数值的+/-5％范围。
术语“氨基酸置换”或“氨基酸突变”指将预先确定的亲本氨基酸序列中的至少一个氨基酸残基替换为不同的“替换”氨基酸残基。该替换残基或多个残基可以是“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码)并且选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)：亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。在一个实施方案中，替换残基不是半胱氨酸。本文的氨基酸置换定义中还涵盖用一种或多种非天然存在的氨基酸残基置换。“非天然存在的氨基酸残基”指除上文所列的那些天然存在的氨基酸残基之外，能够共价结合多肽链中相邻氨基酸残基的残基。非天然存在的氨基酸残基的例子包括正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸、aib和其他氨基酸残基类似物，如在Ellman等人,Meth.Enzym.202(1991)301-336中描述的那些。为了产生这类非天然存在的氨基酸残基，可以使用Noren等人(Science 244(1989)182)和/或Ellman等人(上文)的方法。简而言之，这些方法涉及用非天然存在的氨基酸残基化学活化激活阻抑tRNA，随后体外转录并翻译RNA。也可以通过化学地合成肽并随后使这些肽与重组产生的多肽如抗体或抗体片段融合，将非天然存在的氨基酸并入肽中。
术语“抗体依赖的细胞毒性(ADCC)”是由Fc受体结合作用介导的功能并且指在效应细胞存在下，抗体Fc区介导的靶细胞溶胞。在一个实施方案中，通过在效应细胞(如新鲜分离的PBMC(外周血单核细胞)或从血沉棕黄层纯化的效应细胞如单核细胞或NK(天然杀伤)细胞)存在下，用如本文中报道的包含Fc区的2/3-IgG处理表达靶的红细胞样细胞的制备物(例如，表达重组靶的K562细胞)，测量ADCC。将靶细胞用Cr51标记并随后与2/3-IgG孵育。标记的细胞与效应细胞孵育并对上清液分析释放的Cr51。对照包括靶内皮细胞与效应细胞但无2/3-IgG情况下孵育。通过测量2/3-IgG与表达Fcγ受体的细胞(如重组表达FcγRI和/或FcγRIIA的细胞)或NK细胞(基本上表达FcγRIIIA)的结合，研究其诱导介导ADCC的起始步骤的能力。在一个优选的实施方案中，测量与NK细胞上的FcγR结合。
术语“CH1结构域”指抗体重链多肽的从EU位置118延伸至EU位置215的部分(EU编号体系)。在一个实施方案中，CH1结构域包含ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVKDYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEPKSC(SEQ ID NO:27)的氨基酸序列。
术语“CH2结构域”指抗体重链多肽的从EU位置231延伸至EU位置340的部分(根据Kabat的EU编号体系)。在一个实施方案中，CH2结构域包含APELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVT CVWDVSHEDP EVKFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQESTYRW SVLTVLHQDW LNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAK(SEQ ID NO:28)的氨基酸序列。CH2结构域的独特性在于它不与另一个结构域紧密配对。相反，两个N联分枝的糖链间插在完整天然Fc区的两个CH2结构域之间。已经推测所述糖可以提供结构域-结构域配对作用的替代并且有助于稳定CH2结构域。Burton,Mol.Immunol.22(1985)161-206。
术语“CH3结构域”指抗体重链多肽的从EU位置341延伸至EU位置446的部分。在一个实施方案中，CH3结构域包含GQPREPQVYT LPPSRDELTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVEWESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NVFSCSVMHE ALHNHYTQKS LSLSP(SEQID NO:29)的氨基酸序列。
术语“包含”也包括术语“由……组成”。
术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指在补体存在下，如本文报道的Fc区诱导的细胞溶胞。在一个实施方案中，通过在补体存在下，用如本文中报道的2/3-IgG处理表达靶的人内皮细胞，测量CDC。在一个实施方案中，用钙黄绿素标记细胞。如果2/3-IgG在30μg/ml浓度诱导20％或更多的靶细胞发生溶胞，则存在CDC。可以在ELISA中测量与补体因子C1q的结合。在这种测定法中，原则上用一系列浓度的2/3-IgG包被ELISA板，其中向所述平板添加纯化的人C1q或人血清。通过针对C1q的抗体，随后借助过氧化物酶-标记的缀合物，检测C1q结合作用。对于过氧化物酶底
Figure BDA0002457664720000381
(2,2'-联氮-二-[3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸酯])，将结合作用的检测(最大结合Bmax)作为405nm处光密度(OD405)测量。
“效应子功能”指可归因于抗体的Fc区的那些生物学活性，所述活性随从中衍生Fc区的抗体类别变动。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖的细胞毒性(CDC)；Fc受体结合作用；抗体依赖的细胞介导细胞毒性(ADCC)；吞噬；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；和B细胞活化。
Fc受体结合作用依赖性效应子功能可以由抗体Fc区与作为造血细胞上特化细胞表面受体的Fc受体(FcRs)的相互作用介导。Fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且已经证实其借助抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，介导借助免疫复合物的吞噬移除抗体包覆的病原体和裂解呈递Fc区的红细胞和多种其他细胞靶(例如，肿瘤细胞)(参见，例如Van deWinkel,J.G.和Anderson,C.L.,J.Leukoc.Biol.49(1991)511-524)。FcR依据其对免疫球蛋白同种型的特异性定义：IgG型Fc区的Fc受体称作FcγR。例如在Ravetch,J.V和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492；Capel,P.J.等人,Immunomethods 4(1994)25-34；de Haas,M.等人,J.Lab.Clin.Med.126(1995)330-341；Gessner,J.E.等人,Ann.Hematol.76(1998)231-248中描述了Fc受体结合作用。
IgG型抗体Fc区的受体(FcγR)交联触发多种类型的效应子功能，包括吞噬、抗体依赖的细胞毒性和炎症介质释放，以及免疫复合物清除和调节抗体产生。在人类中，已经表征三个类别的FcγR，它们是：
-FcγRI(CD64)以高亲和力结合单聚体IgG并且表达在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上。在Fc区IgG中氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327和P329中至少一者处的修饰(根据Kabat的EU索引编号)减少与FcγRI的结合。向IgG1和IgG4中置换的位置233-236处的IgG2残基减少与FcγRI的结合103倍并且消除人单核细胞对抗体致敏的红细胞的应答(Armour,K.L.等人,Eur.J.Immunol.29(1999)2613–2624)。
-FcγRII(CD32)以中等至低亲和力结合复合型IgG并且广泛表达。这种受体可以分成二个亚型：FcγRIIA和FcγRIIB。FcγRIIA存在于参与杀伤过程的许多细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上并且似乎能够激活杀伤过程。FcγRIIB似乎在抑制性过程中发挥作用并存在于B细胞、巨噬细胞上以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。在B细胞上，它似乎发挥作用以抑制免疫球蛋白进一步产生及例如向IgE类别的同种型转换。在巨噬细胞上，FcγRIIB发挥作用以抑制FcγRIIA介导的吞噬。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，B形式可以通过IgE与其独立受体结合，帮助抑制这些细胞的活化。例如发现包含IgG Fc区的抗体对FcγRIIA的结合减少，所述IgG Fc区至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、R292和K414中一者(根据Kabat的EU索引编号)处具有突变。
-FcγRIII(CD16)以中等至低亲和力结合IgG并且作为二个类型存在。FcγRIIIA存在于NK细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞和某些单核细胞及T细胞上并且介导ADCC。FcγRIIIB在中性粒细胞上高度表达。例如发现包含IgG Fc区的抗体对FcγRIIIA的结合减少，所述IgG Fc区至少在氨基酸残基E233-G236、P238、D265、N297、A327、P329、D270、Q295、A327、S239、E269、E293、Y296、V303、A327、K338和D376中一者(根据Kabat的EU索引编号)处具有突变。
Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604中描述了将结合位点定位到针对Fc受体的人IgG1上、上文提到的突变位点和用于测量与FcγRI和FcγRIIA结合的方法。
术语“铰链区”指抗体重链多肽的部分，所述部分在野生型抗体重链中连接CH1结构域和CH2结构域，例如根据Kabat的EU编号体系从约位置221至约位置230，或根据Kabat的EU编号体系从约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基对齐，确定其他IgG亚类的铰链区。
铰链区通常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:30)，其中X是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO:31)，其中X是S或P。在一个实施方案中，铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO:32)，其中X是S或P。在一个实施方案中，铰链区没有内部二硫键。通过将SEQ ID NO:32的序列中(和同样地SEQ ID NO:30和31中)的半胱氨酸残基置换为丝氨酸残基或通过从SEQ ID NO:30、31或32的铰链区删除CPXC段(SEQID NO:89)，实现这点。
术语“肽接头”指天然和/或合成来源的接头。肽接头由氨基酸的线型链组成，所述线型链中20种天然存在的氨基酸作为肽键连接的单聚体结构单元。该链具有1至50个氨基酸残基，优选地1和28个氨基酸残基之间，特别优选地3和25个氨基酸残基之间的长度。该肽接头可以含有天然存在性多肽的重复氨基酸序列或序列。通过允许结构域正确折叠并恰当呈递，该肽接头具有确保2/3-IgG的结构域可以执行其生物学活性的功能。优选地，肽接头是称作富含甘氨酸、谷氨酰胺和/或丝氨酸残基的“合成性肽接头”。这些残基设置例如在多达五个氨基酸的重复小单位中，如GGGS(SEQ ID NO:69)、GGGGS(SEQ ID NO:70)、QQQG(SEQID NO:71)、QQQQG(SEQ ID NO:72)、SSSG(SEQ ID NO:73)或SSSSG(SEQ ID NO:74)。这种小的重复性单元可以重复二次至五次，以形成多聚体单元，例如(GGGS)2(SEQ ID NO:75)、(GGGS)3(SEQ ID NO:76)、(GGGS)4(SEQ ID NO:77)、(GGGS)5(SEQ ID NO:78)、(GGGGS)2(SEQ ID NO:79)、(GGGGS)3(SEQ ID NO:80)或(GGGGS)4(SEQ ID NO:81)。在一个实施方案中，肽接头选自SEQ ID NO:69至82的接头。在一个实施方案中，肽接头的每一者彼此独立地选自SEQ ID NO:69至82组成的接头群组。在一个优选的实施方案中，肽接头/每个肽接头(彼此独立地)选自SEQ ID NO:75至81组成的接头群组。在多聚体单元的氨基末端和/或羧基末端，可以添加多达六个附加的任意的天然存在性氨基酸。其他合成性肽接头由单一氨基酸组成，所述单一氨基酸重复10至20次之间并且可以在氨基末端和/或羧基末端包含至多到六个附加的任意的、天然存在氨基酸，如例如接头GSSSSSSSSSSSSSSSG(SEQ ID NO:82)中的丝氨酸。全部肽接头均可以由核酸分子编码并且因此可以重组表达。由于接头本身是肽，抗融合肽(antifusogenic)借助两个氨基酸之间形成的肽键与接头连接。
“抗体片段”指不同于完整抗体的分子，所述分子包括完整抗体的一部分，该部分结合完整抗体所结合的抗原。抗体片段的实例包括但不限于2/3-IgGs、Fv、scFv、Fab、scFab、Fab'、Fab’-SH、F(ab')2；双体抗体；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和从抗体片段形成的多特异性抗体。关于某些抗体片段的综述，参见Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134。关于scFv片段的综述，参见例如Plueckthun,A.,引自The Pharmacologyof Monoclonal Antibodies,第113卷,Rosenburg和Moore(编著),Springer-Verlag,NewYork(1994),第269-315页；还参见WO 93/16185；US 5,571,894和US 5,587,458。
双体抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段，所述两个抗原结合位点可以是双价或双特异性的。参见，例如，EP 0 404 097；WO 1993/01161；Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(2003)129-134；和Holliger,P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90(1993)6444-6448。Hudson,P.J.等人,Nat.Med.9(20039 129-134)中也描述了三体抗体和四体抗体。
单结构域抗体是包含抗体的全部或一部分重链可变结构域或全部或一部分轻链可变结构域的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见，例如，US 6,248,516)。
可以通过多种技术产生抗体片段，所述多种技术包括但不限于蛋白酶解消化完整抗体以及由重组宿主细胞产生(例如，大肠杆菌或噬菌体)。
术语“抗体片段”还包括“双重功能Fab”或“DAF”，其包含与两种不同抗原结合的抗原结合位点(参见，例如US 2008/0069820)。
“单特异性抗体”指对一种抗原具有单一结合特异性的抗体。可以将单特异性抗体作为全长抗体或抗体片段(例如2/3-IgG、F(ab')2)或其组合(例如全长抗体加额外的scFv或Fab片段)制备。
“多特异性抗体”指对相同抗原或两种不同抗原上的至少两个不同表位具有结合特异性的抗体。可以将多特异性抗体作为全长抗体或抗体片段(例如F(ab')2双特异性抗体)或其组合(例如全长抗体加额外的scFv或Fab片段)制备。还已经报道了具有二个、三个或更多个(例如四个)功能性抗原结合位点的工程化抗体(参见，例如US 2002/0004587A1)。一种多特异性抗体是双特异性抗体。也可以通过用以产生抗体Fc-异二聚体分子的工程化静电转向效应产生多特异性抗体(WO 2009/089004)。
术语“与结合”指结合位点与其靶的结合，例如，包含抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域的抗体结合位点与相应抗原的结合。可以例如使用
Figure BDA0002457664720000431
测定法(GEHealthcare，乌普萨拉，瑞典)测定这种结合作用。即，术语“与抗原结合”指抗体在体外测定法中与其抗原的结合。在一个实施方案中，在抗体与表面结合并通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体结合的结合测定法中测定结合作用。结合意指例如10-8M或更小、在一些实施方案中10-13至10-8M、在一些实施方案中10-13至10-9M的结合亲和力(KD)。术语“结合”也包括术语“特异性结合”。
例如，在
Figure BDA0002457664720000432
测定法的一个可能实施方案中，抗原与表面结合并且通过表面等离子体共振(SPR)测量抗体结合位点的结合。结合作用的亲和力由术语ka(缔合常数：缔合以形成复合体的速率常数)、kd(解离常数；复合体解离的速率常数)和KD(kd/ka)定义。备选地，可以就共振信号高度和解离行为方面，可将SPR传感图的结合信号与参比物的响应信号直接比较。
可以通过BIAcore测定法(GE Healthcare Biosensor AB，乌普萨拉，瑞典)研究结合作用。结合作用的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合速率常数)、kd(解离常数)和KD(kd/ka)定义。
术语“结合位点”指对靶显示结合特异性的任何蛋白质实体。这例如可以是受体、受体配体、抗运载蛋白(anticalin)、亲和体、抗体等。因此，如本文所用的术语“结合位点”指可以与第二多肽特异性结合或可以由第二多肽特异性结合的多肽。在一个实施方案中，结合位点选自抗体重链可变结构域、抗体轻链可变结构域、一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域、受体或其功能性片段、受体配体或其功能性片段、酶或其底物组成的多肽群组。
在抗体的情况下，结合位点包含至少三个HVR(例如在VHH的情况下)或六个HVR(例如在天然存在(即常规)的抗体的情况下)。通常，抗体中负责抗原结合的氨基酸残基形成结合位点。这些残基通常情况下含于成对的抗体重链可变结构域和同族抗体轻链可变结构域中。抗体的抗原结合位点包含来自“高变区”或“HVR”的氨基酸残基。“构架”区或“FR”区是除如本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链可变结构域和重链可变结构域从N端至C端包含区域FR1、HVR1/CDR1、FR2、HVR2/CDR2、FR3、HVR3/CDR3和FR4(免疫球蛋白构架)。特别地，重链可变结构域的HVR3/CDR3区域是对抗原结合作用贡献最大并限定抗体的结合特异性的区域。“有功能结合位点”能够与其靶特异性结合。术语“与特异性结合”指结合位点与其靶在体外测定法中(在一个实施方案中，在结合测定法中)结合。这种结合测定法可以是任何测定法，只要可以检测到结合事件即可。例如，其中抗体与表面结合并通过表面等离子体共振(SPR)测量抗原与抗体结合的测定法。备选地，可以使用桥式ELISA。结合意指10-8M或更小、在一些实施方案中10-13至10-8M、在一些实施方案中10-13至10-9M的来自抗体(结合物)与其靶的结合亲和力(KD)。
抗体的“类别”指由其重链拥有的恒定结构域或恒定区的类型。存在五个大类的抗体：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些类别中的几种可以进一步划分成亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类别免疫球蛋白的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。
术语“Fc区”指免疫球蛋白的重链C端区域，其至少含有一部分的铰链区、CH2结构域和CH3结构域。在一个实施方案中，人IgG重链Fc区从Asp221或从Cys226或从Pro230延伸至重链的羧基端。然而，Fc区的C端赖氨酸(Lys447)可以存在或可以不存在。Fc区由两条重链Fc区多肽组成，所述重链Fc区多肽可以借助形成链间二硫键的铰链区半胱氨酸残基彼此共价连接。
如本文所报道方法中产生的抗体包含Fc区，在一个实施方案中，Fc区衍生自人源的Fc区。在一个实施方案中，该Fc区包含人类恒定区的全部部分。抗体Fc区直接参与补体激活、C1q结合、C3活化和Fc受体结合。尽管抗体对补体***的影响依赖于某些条件，Fc区中限定的结合位点引起与C1q结合。这类结合位点是现有技术已知的并且例如由Lukas,T.J.等人,J.Immunol.127(1981)2555-2560；Brunhouse,R.和Cebra,J.J.,Mol.Immunol.16(1979)907-917；Burton,D.R.等人,Nature 288(1980)338-344；Thommesen,J.E.等人,Mol.Immunol.37(2000)995-1004；Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184；Hezareh,M.等人,J.Virol.75(2001)12161-12168；Morgan,A.等人,Immunology 86(1995)319-324；和EP 0 307 434描述。这类结合位点例如是L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331和P329(根据Kabat的EU索引编号)。IgG1、IgG2和IgG3亚类抗体通常显示激活补体、结合C1q且激活C3，而IgG4不激活补体***、不结合C1q且不激活C3。“抗体的Fc区”是技术人员熟知的术语并且基于木瓜蛋白酶对抗体的剪切而限定。在一个实施方案中，Fc区是人Fc区。在一个实施方案中，Fc区属于人IgG4亚类，包含突变S228P和/或L235E(根据Kabat的EU索引编号)。在一个实施方案中，Fc区属于人IgG1亚类，包含突变L234A和L235A和任选地P329G(根据Kabat的EU索引编号)。
术语“全长抗体”指这样的抗体，所述抗体具有基本上与天然抗体结构相似的结构。全长抗体包含两条全长抗体轻链和两条全长抗体重链，所述全长抗体轻链各自包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，所述全长抗体重链各自包含重链可变结构域、第一恒定结构域、铰链区、第二恒定结构域和第三恒定结构域。全长抗体可以包含其他结构域，例如与全长抗体的一个条或多条链缀合的额外scFv或scFab。这些缀合物也由术语全长抗体涵盖。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”互换使用并且指已经向其中引入外源核酸的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“转化的细胞”，这包括原代转化的细胞和从中衍生的子代，而无论传代次数是多少。后代可以在核酸含量含量方面不与亲本细胞完全相同，反而可以含有突变。本文中包括这样的突变子代，所述突变子代具有针对最初转化的细胞中所筛选或选择的相同的功能或生物活性。
术语“衍生自”指通过在至少一个位置引入改变/突变，从亲本氨基酸序列获得变异氨基酸序列。因此，因此，衍生的氨基酸序列在至少一个相应的位置异于相应的亲本氨基酸序列。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至15个氨基酸残基。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至10个氨基酸残基。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列在相应位置相异1至6个氨基酸残基。同样地，衍生的氨基酸序列与其亲本氨基酸序列具有高氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有80％或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有90％或更大的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，衍生自亲本氨基酸序列的氨基酸序列具有95％或更大的氨基酸序列同一性。
在一个实施方案中，一种或两种重链Fc区多肽衍生自SEQ ID NO:01的Fc区多肽并且与SEQ ID NO:01的Fc区多肽相比具有至少一个氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc区多肽包含/具有从约1个至约10个氨基酸突变，并在一个实施方案中具有约1个至约5个氨基酸突变。在一个实施方案中，Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:01具有至少约80％同源性。在一个实施方案中，Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:01具有至少约90％同源性。在一个实施方案中，Fc区多肽与人Fc区多肽SEQ ID NO:01具有至少约95％同源性。
从SEQ ID NO:01、或02、或03、或04的人Fc区多肽衍生的Fc区多肽由含有的氨基酸改变进一步限定。因此，例如，术语P329G指从相对于SEQ ID NO:01、或02、或03、或04的人Fc区多肽在氨基酸位置329具有脯氨酸至甘氨酸突变的从人Fc区多肽衍生的Fc区多肽。
人IgG1 Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:01)。
以下Fc区是衍生自野生型人IgG1 Fc区的变体。
人IgG1 Fc区衍生的具有突变L234A、L235A的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
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人IgG1 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A和Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
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人IgG1 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
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人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:08)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:09)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
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人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A突变和P329G突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:11)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:12)。
人IgG1 Fc区衍生的具有P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:13)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSRDELTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:14)。
人IgG1 Fc区衍生的具有L234A、L235A、P329G突变和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALGAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCRDELTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP(SEQ ID NO:15)。
人IgG4 Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:04)。
以下Fc区是衍生自野生型人IgG4 Fc区的变体。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P和L235E突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:16)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E突变和P329G突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:17)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:18)。
人IgG4 Fc区衍生的具有Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:19)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:20)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:21)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:22)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:23)。
人IgG4 Fc区衍生的具有P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
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人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和Y349C、T366S、L368A、Y407V突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVCTLPPSQEEMTKNQVSLSCAVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLVSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:25)。
人IgG4 Fc区衍生的具有S228P、L235E、P329G和S354C、T366W突变的Fc区多肽包含以下氨基酸序列：
ESKYGPPCPPCPAPEFEGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLGSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPCQEEMTKNQVSLWCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL(SEQ ID NO:26)。
“人源化”抗体指包含来自非人类HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的抗体。在某些实施方案中，人源化抗体将包含至少1个、并且一般2个可变结构域的基本上全部，其中全部或基本上全部的HVR(例如，CDR)与非人抗体的那些HVR对应并且全部或基本上全部的FR区与人抗体的那些FR对应。人源化抗体任选地可以包含从人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体(例如，非人抗体)的“人源化形式”，指已经历过人源化的抗体。
如本文所用，术语“高变区”或“HVR”指抗体可变结构域的下述每个区域，所述区域包含在序列上高变(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上确定的环(“高变环”)，和/或含有抗原接触残基(“抗原触点”)的氨基酸残基段。通常，抗体包含六个HVR；重链可变结构域VH中三个(H1、H2、H3)和轻链可变结构域VL中三个(L1、L2、L3)。
HVR包括
(a)出现在第26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)氨基酸残基处的高变环(Chothia,C.和Lesk,A.M.,J.Mol.Biol.196(1987)901-917)；
(b)出现在第24-34(L1)、50-56(L2)、89-97(L3)、31-35b(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)氨基酸残基处的CDR(Kabat,E.A.等人,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991),NIH Publication 91-3242)；
(c)出现在第27c-36(L1)、46-55(L2)、89-96(L3)、30-35b(H1)、47-58(H2)和93-101(H3)氨基酸残基处的抗原接触点(MacCallum等人,J.Mol.Biol.262：732-745(1996))；和
(d)(a)、(b)和/或(c)的组合，包括氨基酸残基46-56(L2)、47-56(L2)、48-56(L2)、49-56(L2)、26-35(H1)、26-35b(H1)、49-65(H2)、93-102(H3)和94-102(H3)。
除非另外说明，否则本文中HVR残基和可变结构域中的其他残基(例如，FR残基)根据上文Kabat等人编号。
术语“轻链”指天然IgG抗体的较短多肽链。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。参见人κ轻链恒定结构域的SEQ ID NO:33和人λ轻链恒定结构域的SEQ ID NO:34。
术语“互补位”指给定抗体分子的为靶和结合位点之间特异性结合所需要的部分。互补位可以是连续的，即由结合位点中存在的毗邻氨基酸残基形成，或是不连续的，即由这样的氨基酸残基形成，所述氨基酸残基处于一级序列中(如HVR/CDR的氨基酸序列中)依次不同的位置，但在结合位点采取的三维结构中紧邻。
“分离的”抗体是已经与其自然环境的组分分离的一种抗体。在一些实施方案中，将抗体纯化至大于95％或99％纯度，如通过例如电泳(例如，SDS-PAGE、等电聚焦(IEF)、毛细管电泳法、CE-SDS)或色谱(例如，大小排阻色谱或离子交换或反相HPLC)所确定。关于评估抗体纯度的方法的综述，参见，例如，Flatman,S.等人,J.Chrom.B 848(2007)79-87。
“分离的”核酸指已经与其自然环境的组分分离的核酸分子。分离的核酸包括在细胞内所含的核酸分子，所述细胞通常含有该核酸分子，但是该核酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置处。
如本文中所用的术语“单克隆抗体”指从基本上均一的抗体群体获得的抗体，即，构成该群体的各个抗体是相同的和/或结合相同的表位，除了可能的变体抗体之外(例如，含有天然存在突变或在产生单克隆抗体制备物期间出现)，这类变体通常以微小的量存在。与一般包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物相反，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。因此，修饰语“单克隆的”指示该抗体的特征为从基本上均一的抗体群体获得，并且不得解释为要求通过任何特定方法产生该抗体。例如，可以通过多种技术产生待根据本发明使用的单克隆抗体，所述技术包括但不限于杂交瘤方法、重组DNA方法、噬菌体展示方法和利用含有全部或部分的人免疫球蛋白基因座的转基因动物的方法，本文中描述了用于产生单克隆抗体的这类方法和其他示例性方法。
“天然抗体”指具有不同结构的天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链组成的约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白。从N端至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，也称作可变重结构域或重链可变结构域，随后是三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N端至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，也称作可变轻链域或轻链可变结构域，随后一个恒定轻链(CL)结构域。抗体的轻链可以基于其恒定域的氨基酸序列而划分成两种类型之一，称作κ和λ。
术语“药物制剂”指一种制备物，所述制备物处于这类形式从而允许其中所含的有效成分的生物学活性有效，并且不含有对于将会施用该制剂的受试者不可接受地有毒的额外组分。
“可药用载体”指药物制剂中除有效成分之外的对受试者无毒的成分。可药用载体包括但不限于缓冲剂、辅料、稳定剂或防腐剂。
如本文所用，术语“重组抗体”指通过重组手段制备、表达、产生或分离的全部抗体(嵌合、人源化和人抗体)。这包括从宿主细胞如NS0、HEK、BHK或CHO细胞或从相对于人免疫球蛋白基因为转基因的动物(例如小鼠)中分离的抗体或使用转染至宿主细胞中的重组表达质粒所表达的抗体。此类重组抗体具有重排形式的可变区和恒定区。如本文中报道的重组抗体可以经历体内体细胞超变。因此，重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是尽管源自人种系VH和VL序列并且与之相关，但可以不天然存在于体内人抗体种系库内部的序列。
如本申请中所用，术语“价态”指(抗体)分子中存在指定数目的结合位点。就这一点而论，术语“双价”、“四价”和“六价”指(抗体)分子中分别存在2个结合位点、4个结合位点和6个结合位点。在一个优选的实施方案中，如本文中报道的双特异性抗体是“双价的”或“三价的”。
术语“可变区”或“可变结构域”指抗体重链或轻链的参与使抗体结合其抗原的结构域。抗体重链和轻链的可变结构域(分别是VH和VL)通常具有相似的结构，每种结构域包含四个构架区(FR)和三个高变区(HVR)(参见，例如Kindt,T.J.等人,Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,N.Y.(2007),第91页)。单个VH结构域或VL结构域可能足以赋予抗原结合特异性。另外，结合特定抗原的抗体可以利用来自结合该抗原的抗体的VH或VL结构域分别筛选互补性VL结构域或VH结构域的文库进行分离。参见，例如，Portolano,S.等人,J.Immunol.150(1993)880-887；Clackson,T.等人,Nature 352(1991)624-628)。
术语“变体”指具有与亲本分子的氨基酸序列不同的氨基酸序列的分子。一般，这类分子具有一个或多个改变、***或缺失。在一个实施方案中，修饰的抗体或修饰的融合多肽包含这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列包含Fc区的非天然存在的至少一部分。这类分子与亲本结构域或Fc区具有小于100％的序列同一性。在一个实施方案中，变体具有这样的氨基酸序列，所述氨基酸序列与亲本结构域或Fc区的氨基酸序列具有从约75％至小于100％、尤其从约80％至小于100％、尤其从约85％至小于100％、尤其从约90％至小于100％和尤其从约95％至小于100％的氨基酸序列同一性。在一个实施方案中，亲本结构域或Fc区和变异结构域或Fc区相差一个(单个)、两个或三个氨基酸残基。
如本文所用的术语“结构域交叉”指，在抗体重链VH-CH1片段及其相应的同族抗体轻链的一对中，即在抗体结合臂中(即在Fab片段)中，结构域序列悖离天然序列，在于至少一个重链结构域由其相应的轻链结构域置换并且反之亦然。存在三个常用类型的结构域交叉，(i)CH1结构域和CL结构域交叉，这导致结构域交叉的轻链具有VL-CH1结构域序列和结构域交叉的重链片段具有VH-CL结构域序列(或全长抗体重链具有VH-CL-铰链-CH2-CH3结构域序列)，(ii)VH结构域和VL结构域的结构域交叉，这导致结构域交叉的轻链具有VH-CL结构域序列和结构域交叉的重链片段具有VL-CH1结构域序列的，和(iii)完整轻链(VL-CL)和完整VH-CH1重链片段的结构域交叉(“Fab交叉”)，这导致结构域交叉的轻链具有VH-CH1结构域序列和结构域交叉的重链片段具有VL-CL结构域序列(全部前述的结构域序列是指示按N末端至C端方向)。
如本文所用，术语“相互替换”相对于相应的重链结构域和轻链结构域而言指前述的结构域交叉。从而，当CH1结构域和CL结构域“相互替换”时，将它称作项(i)下提到的结构域交叉及所得的重链和轻链结构域序列。因此，当VH和VL“相互替换”时，将它称作项(ii)下提到的结构域交叉；并且当CH1结构域和CL结构域“相互替换”并且VH1结构域和VL结构域“相互替换”时，将它称作项(iii)下提到的结构域交叉。报道了包含结构域交叉的双特异性抗体，例如以下文献中报道：WO 2009/080251、WO 2009/080252、WO 2009/080253、WO 2009/080254和Schaefer,W.等人,Proc.Natl.Acad.Sci USA 108(2011)11187-11192。
采用如本文中报道的方法产生的多特异性抗体还可以包含Fab片段，所述Fab片段包含如上文项(i)下提到的CH1结构域和CL结构域的结构域交叉，或如上文项(ii)下提到的VH结构域和VL结构域的结构域交叉。构建与相同抗原特异性结合的Fab片段以具有相同的结构域序列。因此，如若多特异性抗体中包含多于一个具有结构域交叉的Fab片段，则所述Fab片段与相同的抗原特异性结合。
II.本发明的具体方法和化合物
为了鉴定用于多特异性抗体(例如双特异性或三特异性抗体)中的结合物的最佳组合，需要检验尽可能多的组合。因此，需要这样的方法，所述方法允许各自具有不同结合特异性的多个不同结合位点(即结合物)彼此组合并且在结合测定法或功能测定法中筛选最佳组合。
例如，具有第一结合特异性的第一多个结合位点(例如不同的轻链可变结构域和重链可变结构域对、Fv片段)的每种结合物与具有第二结合特异性(例如与相同抗原上的不同表位或与不同抗原结合)的第二多个结合位点的每种结合物组合。这导致制备组合矩阵，所述组合矩阵涵盖所述第一多个结合位点与所述第二多个结合位点中每个结合位点的每种组合。另外并且优选地，这个组合矩阵中还包含就价态和功能而言的不同样式。生成的多特异性抗体随后进行测定，以鉴定拥有所需功能的那些组合和样式(例如，根据对药物开发所需和重要的功能性能和/或参数进行排序)。具有两种特异性的组合矩阵的大小随输入分子的数目线性增加而指数式增长，例如100个‘A-结合物’和100个‘B-结合物’生成10,000个不同的‘A+B-bsAbs’(bsAb＝双特异性抗体)。通过独立设计和生成表达盒，随后表达并且纯化，生成这类大量不同的A+B bsAbs，这是繁琐的并且对可以受到评估的矩阵的大小带来限制。
至少两项任务得益于生成和筛选许多不同输入实体(不同特异性、表位、几何形状、亲和力和/或价态)的组合：亲合力介导的结合作用改善和生成激动性bsAbs。
亲合力介导的结合作用改善基于这样的抗体衍生物，其在单价形式下具有不良结合功能至无结合功能，结合功能仅通过两个(不同)单价结合位点与双价(或甚至多价)bsAb的物理连接实现。双价态或多价态产生亲合力，同时特异性依赖于两个不同结合位点的结合作用。
双特异性或多特异性激动性抗体的原理是相似的：通过同时结合(这可能包括交联)不同的抗原激发功能，而仅一个单价结合实体的结合没有活性。
以上原理的共同点是(独立单价结合实体无功能或至多功能不良和)双价或多价组合的所需功能。对所需结合位点组合的鉴定基于评估亲合力介导的结合性或激动性bsAbs的结合作用和/或功能(由双价态或多价态介导)。因此，对于这种筛选，需要供试抗体(即，例如，通过本发明交换反应生成的bsAb)不含任何剩余的(双价)单特异性分子，因为这些分子可能产生假阳性结果。出于相同原因，多价反应副产物(如，例如，聚集物)具有同等或甚至更多的扰动性。
A)使单特异性单价IgG衍生物转化成双特异性双价IgG的方法
本发明的方法实现单特异性(单价)抗体或抗体片段转化成双价bsAbs。这些方法允许轻易移除未转化的起始材料以及反应期间形成的双价但单特异性副产物以及聚集物。即，连同其他问题，本发明的方法解决了至少两个问题：避免双价单特异性抗体以及不想要的聚集物存在于最终制备物中。
为了实现这点，使用两种无功能的半抗体(仅单特异性)作为起始材料。示例地，可以使用所谓2/3-IgG作为起始材料。2/3-IgG由具有第一套杵入臼(KiH)突变的重链、与之互补的轻链以及Fc区组成，其中通过相应的互补性第二套杵入臼突变使所述Fc区与重链的Fc区互补。互补性Fc区可以例如是Fc区重链片段或第二重链。为了进一步促进所需双(多)特异性抗体正确组装，除互补性第二套KiH突变之外，互补性Fc区还包含附加的扰动性(去稳定化)排斥性电荷引入性突变。另外，互补性Fc区可以包含反应后用于高效移除非所需离析物和产物的亲和标签(例如His6或C标签)。第二2/3-IgG包含互补的扰动性突变，其中一旦半抗体彼此交换，例如当混合时，所述互补的扰动性突变变成吸引性突变。
本发明的交换反应/方法包括以下步骤
-将包含第一多肽和第二多肽的第一(起始)异二聚体多肽与包含第三多肽和第四多肽的第二(起始)异二聚体多肽孵育，以交换第二和第三多肽，以形成第三和第四异二聚体多肽，并且
-回收包含第一多肽和第四多肽的第四(交换的)异二聚体多肽，
其中
i)第二多肽包含(第一扰动性)突变，其中相比除第二多肽中的所述突变外，与所述第一异二聚体多肽相同的(异二聚体)多肽，所述突变导致第一异二聚体多肽去稳定化，
ii)第三多肽包含(第二扰动性)突变，其中相比除第三多肽中的所述突变外，与所述第二(异二聚体)多肽相同的异二聚体多肽，所述突变导致第二异二聚体多肽去稳定化，
iii)与第一(起始)异二聚体多肽和/或与第二(起始)异二聚体多肽相比，第二多肽中的(第一扰动性)突变和第三多肽中的(第二扰动性)突变导致包含所述第二多肽和所述第三多肽的第三(交换的)异二聚体多肽的稳定化，和
iv)与第一(起始)异二聚体多肽和/或第二(起始)异二聚体多肽相比，第四(交换的)异二聚体多肽更稳定。
因此，本发明至少部分地基于以下结果：在异二聚体多肽中添加单一(单侧，未配对的)去稳定化(扰动性)突变足以促进与也包含一个单一(单侧，未配对的)去稳定化(扰动性)突变的第二异二聚体多肽的多肽链交换，因为与起始异二聚体多肽相比，两种所得的新形成的交换的异二聚体多肽具有改善的稳定性(即，较低的CH3-CH3结合自由能)。必须遵循的唯一条件是，一旦相应的多肽彼此缔合，则在彼此相互作用的位置引入去稳定化(扰动性)突变。
这种方法可以适用于符合如上文概述的标准的任何异二聚体多肽。
然而，本发明的方法特别地可用于制药领域。
采用本发明的方法，如果交换反应期间彼此缔合的异二聚体起始多肽中每者的相应多肽包含一个或多个结合位点，则可以轻易地产生双特异性结合物的大型文库。因此，本发明方法中获得的交换的异二聚体多肽之一将包含这些结合位点。
从现有技术，已知产生异二聚体多肽的不同方法。可以使用这些方法的任一种，只要为形成起始异二聚体多肽所要求的突变不干扰为本发明交换反应所需要的(扰动性)去稳定化突变或与之重叠。
返回制药领域，抗体是使用最广泛的结合物类别。抗体通过其恒定区中、尤其重链的CH3结构域之间的相互作用二聚化。
因此，本发明是至少部分地基于以下结果：为了执行本发明的方法，在一对CH3结构域的一个CH3结构域中引入单个去稳定化突变足够用。更详细地，已经发现，在第一起始异二聚体多肽的仅一个CH3结构域中位置357处引入第一去稳定化突变且在第二起始异二聚体多肽的仅一个CH3结构域中位置370处引入第二去稳定化突变，在孵育两种起始异二聚体多肽时促进多肽链在这些起始多肽之间自发交换。所得的交换多肽之一包含在位置357和370处分别具有突变的CH3结构域对子，所述突变导致交换的异二聚体稳定化。可以用位置356和439处的突变实现类似情况。全部位置的编号均依据Kabat的EU索引。一个优选的突变对是E357K和K370E。另一个优选的突变对是D356K和K439E。本发明的方法可以适用于任何IgG亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，因为所讨论的残基高度保守。在一个优选的实施方案中，CH3结构域属于IgG1亚类。
本发明至少部分地基于以下结果：起始异二聚体多肽的多肽链不需要(例如借助二硫键)彼此共价连接，以允许起始异二聚体多肽形成和分离。更详细地，由于起始多肽已经是异二聚体，这些多肽将包含用于异二聚化的其他突变。已经发现这些突变足以使起始异二聚体稳定化，即便在去稳定化(扰动性)单一单侧突变存在下亦如此。因而，不再考虑起始异二聚体多肽中共价键链的必要。因此，在一个实施方案中，在含有铰链区的起始异二聚体多肽的情况下，这些铰链区包含突变C226S和C229S或缺失完整CPXC(SEQ ID NO:89)序列(根据Kabat EU索引编号)。
通过漏去异二聚体起始多肽的包含Fc区的链之间的二硫键，无需添加还原剂以启动交换反应。这种允许更温和的反应条件。另外，二硫键可以存在于起始异二聚体多肽中，如例如Fab片段中。
本发明至少部分地基于以下结果：还可以通过仅在交换反应后形成二硫键，稳定化交换的异二聚体多肽，例如，包含结合位点的那些。例如，为形成异二聚体抗体充分建立的突变是杵入臼突变。这些突变存在在两种变体中：无或有附加二硫键。因此，一个备选的起始异二聚体多肽包含用于形成起始异二聚体多肽的杵入臼突变，并且仅在携带结合位点的多肽链中提供杵入臼半胱氨酸残基。因而，仅在包含结合位点的交换的异二聚体多肽中，存在为相应的匹配性位置处形成二硫键所需要的两个半胱氨酸残基。因此，二硫键仅在所述交换产物中形成。这导致交换的靶异二聚体多肽进一步稳定化。
本发明至少部分地基于以下结果：标签在还包含(扰动性)去稳定化突变的每条多肽链中的存在引起包含结合位点的已交换异二聚体多肽的纯化改进。如与未反应的起始材料以及交换的非靶异二聚体多肽的分离是可能，因为仅包含结合位点的已交换异二聚体多肽不包含所述标签。
如本文所用的术语“异二聚体”指包含至少两条多肽链的多肽，所述多肽链在氨基酸序列方面部分地或完全地不相同并且满足本发明的要求。该术语还涵盖包含三条或更多条多肽链的多肽，只要它们当中至少两者是本发明的异二聚体。因此，术语“多聚体”指包含至少三条多肽链的多肽，其中至少两者是异二聚体并满足本发明的要求。
术语“扰动性突变”指导致(异)二聚体多肽去稳定化的突变。一般通过改变氨基酸残基的电荷实现这种去稳定化，如，例如通过将带正电荷的氨基酸残基与带负电荷的氨基酸残基交换或反之亦然。这种交换在相互作用性位置处导致相似电荷，并因此导致电荷排斥作用。一个优选的突变对子是E357K和K370E。另一个优选的突变对子是D356K和K439E。另外，本发明的方法可以适用于任何IgG亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，因为所讨论的残基高度保守。在一个优选的实施方案中，CH3结构域属于IgG1亚类。
WO 2009/089004中公开了一种评估CH3结构域突变对二聚体稳定性影响的方法(所述文献通过引用方式并入本文)。其中概述了EGAD软件怎样可以用来评估CH3-CH3结构域结合自由能(还参见Pokala,N.和Handel,T.M.,J.Mol.Biol.347(2005)203-227，所述文献通过引用方式完整并入本文)：
EGAD可以用来粗略比较在CH3结构域界面产生的多种突变的结合自由能。突变体的结合自由能定义为ΔΔGmut＝μ(ΔGmut-ΔGwt)(mut＝突变体，wt＝野生型)。其中，μ(通常＝0.1)是换算系数，所述换算系数用来归一化预测的结合亲和力变化，以与实验性能量比较时具有斜率1。解离过程的自由能(ΔG)定义为复合状态(ΔG结合型)和游离状态(ΔG游离)之间的能量差异。
下文中以具体的示例性起始材料即2/3-IgG例举本发明。这种起始材料作为基础性总体构思的范例呈现并且不得解释为限制本发明。权利要求中阐述本发明的实际范围。
图1显示作为示例性起始化合物用于本发明方法中的2/3-IgG的设计和模块组成。2/3-IgG由以下三条独立链组成：一条轻链(通常情况下，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的全长轻链)、一条重链(通常情况下，包含重链可变结构域和全部重链恒定结构域(包含铰链区)的全长重链)，和一个互补性重链Fc区多肽(通常情况下，包含铰链的至少某片段和CH2-CH3的重链Fc区片段)。轻链和重链的可变结构域形式有功能的结合位点，即VH-VL对。(通常情况下，人IgG1亚类的)重链含有i)杵突变或臼突变(在抗体重链的CH3结构域中的突变T366W称作“杵突变”并且在抗体重链的CH3结构域中的突变T366S/L368A/Y407V的结合称作“臼突变”(根据Kabat EU索引编号))，或ii)杵-cys突变或臼-cys突变(在抗体重链的CH3结构域中突变T366W/S354C的组合称作“杵-cys突变”并且在抗体重链的CH3结构域中突变T366S/L368A/Y407V/Y349C的组合称作“臼-cys突变”；反向设置同样是可能的：在CH3结构域中能够实现杵入臼Fc区异二聚体形成的T366W/Y349C和T366S/L368A/Y407V/S354C(根据Kabat EU索引编号))。互补性重链Fc区多肽也可以称作‘虚拟-Fc’，即缺少VH和CH1、N末端始于铰链区序列(或其片段)并且在其C末端携带纯化标签(例如His6或His8或C-标签)的IgG1衍生物。此外，取决于重链中的突变，2/3-IgG的互补性重链Fc区多肽在其CH3结构域中含有杵突变或臼突变。除杵-突变或臼-突变之外，重链Fc区多肽还相对于野生型序列分别包含至少一个引入一个(即单一附加)排斥性电荷的扰动性(即去稳定化)突变：例如，分别与K370E或K439E组合的D356K或E357K(SEQ ID NO:35、36、37和38，其也是本发明的方面)(参见图2)。下文中这种突变的重链Fc区多肽称作MHCFcRP。
取决于其中杵入臼突变的分布，重链和MHCFcRP可以形成两种类型的异二聚体：
i)重链-杵(-cys)::MHCFcRP-臼，和
ii)重链-臼(-cys)::MHCFcRP-结。
因此，2/3-IgG是缔合有轻链的异二聚体，即异三聚体。然而，这些异三聚体或多或少‘有瑕疵’，因为MHCFcRP中的电荷突变无重链中的匹配性对应物，并且，如果存在于重链中，则MHCFcRP缺少为与重链形成链间二硫键所需的附加CH3半胱氨酸。
2/3-IgG是单价、非二聚化/聚集性单臂抗体衍生物，其可以表达并纯化到与通常IgG相似的产率(参见图3)。这确保起始材料的单价性。如果将使用双价2/3-IgG，这种材料可以是单特异性的以及双特异性的。
然而，构成那些有瑕疵2/3-IgG的多肽能够重排成如图4中所示的双特异性抗体。
两个起始分子之间的交换反应受KiH(杵入臼)重链(H-链)彼此更好的互补性(无电荷排斥作用并且如果存在游离半胱氨酸残基，任选地形成二硫键)驱动以及受两个MHCFcRP彼此更好的互补性驱动。在该反应中，两个起始分子的Fc区复合物解离并且交换多肽以形成两个更有利的复合物。这种驱动反应如下：
2/3-IgG(A)-标签+2/3-IgG(B)-标签
(起始异二聚体多肽)
→
bsAb(AB)+MHCFcRP(A)-MHCFcRP(B)-标签
(交换的异二聚体多肽)
在如图4中所示的实例中，起始2/3-IgG(A)的重链(杵-cys)和起始2/3-IgG(B)的重链(臼-cys)形成匹配性双特异性抗体异四聚体(2xHC+2xLC)。
交换反应由破坏二硫键的还原步骤引发(如若存在铰链区/重链间二硫键)。如果使用无铰链区二硫键的2/3-IgG，则还原步骤可以省略(参见下文)。此后，链重排自发地发生。
全部2/3-IgG起始分子、交换反应期间可能形成的全部二聚体MHCFcRP副产物以及全部聚集物均包含至少一个亲和标签(例如His6或His8或C-标签)。因此，单一和简单的以及兼容高通量的吸附(亲和色谱)步骤可以用来移除全部不需要的分子，包括聚集物。例如，在His 6标签的情况下，这个步骤是金属螯合物亲和色谱(参见图6和图7)。所得的纯化的bsAbs可以直接适用于筛选程序，以鉴定具有所需功能的bsAbs(参见图8)。
参见下文实施例，尤其实施例1至5。
B)将单特异性和/或双价单特异性或双特异性IgG衍生物转化为双价、三价或四价双特异性、三特异性或四特异性抗体的方法
采用本发明的方法，不仅可以组合不同的结合特异性，与此同时还可以产生处于不同样式范围内及具有不同价态的这些组合。通过扩充如先前章节中所概述的方法中所用的起始材料，实现这点。
例如，从如先前章节中所概述的2/3-IgG开始，维持MHCFcRP不变，但在不同样式下使用重链。这类样式可以例如是在C末端或在N末端具有一个结合位点或具有两个结合位点(每个末端各一个)(一个在N末端和一个在C末端)的链(参见图9和图10)。
在这个实例中，三个不同的起始样式(N末端结合位点、C末端结合位点、N末端和C末端结合位点)在本发明的方法中彼此组合，以产生9个不同的bsAb样式，所述样式具有不同的结合位点、不同的价态、不同的几何形状和各个结合位点的不同三维布局/位置(参见图11)。
作为一个实例，50种‘结合物-A’起始分子和50种‘结合物-B’起始分子可以各自按三种样式表达(N末端结合位点、C末端结合位点、N末端和C末端结合位点)，为每种结合物产生150(3*50)种2/3-IgG制备物作为起始分子。可以随后将这些制备物改组并且与本发明的方法组合。这产生22,500种(50*3x50*3)不同的bsAbs。
为了生成bsAbs，不改变交换驱动原理(将有瑕疵的输入分子转化成匹配性输出分子)。MHCFcRPs也留下。因此，仅重链改变/多样化。
图1和图9-图10显示了可以在本发明的交换反应中彼此组合以产生九个不同双特异性样式的三种不同的起始分子(具有N末端、C末端、N末端和C末端结合位点的2/3-IgG)。这些分子在价态、几何形状和独立结合位点的不同位置方面相异。
在不受这种理论约束的情况下，假定以临时分离两种不同2/3-IgG的有瑕疵异源多聚体为基础的交换反应当产生偏好性匹配的Fc区异二聚体的产物。交换因此将单特异性2/3-IgG转化成双特异性IgG(处于不同样式)，以及相应的Fc区异二聚体。
为了示例性描述交换反应，输入分子如下命名：
-对于重链(H-链)的通常N末端处具有Fab臂的分子，‘nA或nB’，
-对于H-链的C末端处具有Fab臂的分子，‘cA或cB’，
-对于H-链的N末端以及其C末端具有Fab臂的分子，‘ncA或ncB’。
不同的样式-交换反应如下：
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(nAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(nAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(nAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(cAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(cAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(cAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(ncAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(ncAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(ncAncB)+(MHCFcRP)2-标签
如果存在铰链区二硫键，交换反应由破坏链间铰链区二硫键的还原步骤引发。链交换和重排自发地发生。全部输入分子、交换反应期间潜在可能形成的全部副产物以及全部聚集物均携带亲和标签(例如His6)。然而，交换反应中产生的所需bsAb不携带亲和力标签并且因此借助NiNTA亲和色谱(吸附)取出。剩余的bsAbs(处于不同样式)可以直接适用于筛选程序和分析，以鉴定各样式下具有最佳功能的bsAbs并且对其排序。
参见实施例6和7。
为了显示本发明方法的一般适用性，已经制备其它基于2/3-IgG的样式变体并使其经受本发明的交换反应。
i)非抗体结合物：
在又一样式中，一个2/3-IgG的Fab区已经由亲和体替换(参见图19)。交换反应也发生了(参见图23，ELISA结果)。
参见实施例13。
ii)在Fab区添加第三结合位点(VH/VL对)：
在又一样式中，2/3-IgG之一包含第二Fab区(Fab-延长型-2/3-IgG；参见图26)。交换反应也发生(参见图27)。
为了描述交换反应，输入分子如下命名为：
-对于重链的通常n末端处具有两个Fab臂的分子(Fab-延长型-2/3-IgG)，‘dA’，
-对于重链(H-链)的通常N末端处具有Fab臂的分子，‘nB’，
-对于H-链的C末端处具有Fab臂的分子，‘cB’，
-对于H-链的N末端以及其C末端具有Fab臂的分子，‘ncB’。
不同的样式-交换反应如下：
2/3-IgG(dA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(dAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(dA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(dAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(dA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(dAncB)+(MHCFcRP)2-标签
参见实施例9、15和16。
iii)约束型结合物：
在又一样式中，替代Fab区，2/3-IgG之一包含如WO 2017/191101中所述的约束型结合物(所述文献通过引用方式并入本文)(约束型-2/3-IgG，conA，conB；参见图31)。交换反应也发生(参见图32、图33和图34)。
为了描述交换反应，输入分子如下命名为：
-具有约束型结合位点的分子为‘conA或conB’，所述约束型结合位点包含相对于Fc区为N末端的结合位点的第一部分和相对于Fc区为C末端的结合位点的第二部分，其中第一部分和第二部分彼此缔合并且形成结合位点，这些分子呈环状，
-对于重链(H-链)的通常N末端处具有Fab臂的分子，‘nA或nB’，
-对于H-链的C末端处具有Fab臂的分子，‘cA或cB’，
-对于H-链的N末端以及其C末端具有Fab臂的分子，‘ncA或ncB’。
不同的样式-交换反应如下：
2/3-IgG(conA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(nAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(conA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(nAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(conA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(nAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(conA)-标签+2/3-IgG(conB)-标签→bsAb(conAconB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(nAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(nAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(nAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(nA)-标签+2/3-IgG(conB)-标签→bsAb(nAconB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(cAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(cAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(cAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(cA)-标签+2/3-IgG(conB)-标签→bsAb(cAconB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(nB)-标签→bsAb(ncAnB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(cB)-标签→bsAb(ncAcB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(ncB)-标签→bsAb(ncAncB)+(MHCFcRP)2-标签
2/3-IgG(ncA)-标签+2/3-IgG(conB)-标签→bsAb(ncAconB)+(MHCFcRP)2-标签
参见实施例21。
C)消除Fc区链间二硫键和消除还原步骤
重链链间二硫键使抗体稳定并限定与铰链连接的Fab臂的灵活性。包含铰链区的起始抗体的交换方案需要在交换反应之前或期间还原这些二硫键以及在交换反应完成时移除还原剂(参见实施例3和实施例7)。对于某些方案，可能需要避免这个还原步骤并且这促进交换产物的下游加工。
因此，作为本发明的另一个方面，本文中报道了有铰链区但没有链间铰链区二硫键的起始分子的交换反应。
为了例示这点，已经生成其中Fc区中的全部二硫键均已经消除的2/3-IgG。已经发现，可以产生并且甚至在无这些链间二硫键情况下以高效方式纯化这类消除二硫键的2/3-IgG(参见图15)。在本发明的方法中使用这类消除二硫键的2/3-IgG作为起始分子时，可以省略还原起始分子和交换反应后还原剂的移除。因而，提供改进的方法用于生成bsAbs(加工步骤更少且副产物更少)。从这些消除二硫键的2/3-IgG产生的bsAbs有功能并且稳定，在无链间二硫键情况下，由非共价Fc-Fc相互作用结合在一起(参见图16和图17)。
因此，移除Fc-Fc/铰链区链间二硫键消除了启动交换反应的还原步骤的必要性。所得的bsAbs是有功能的双特异性分子，在无Fc区链间二硫键情况下，由非共价Fc-Fc相互作用结合在一起。因此，Fc-Fc链间二硫键的消除在无需还原和再氧化的情况下，即在生理条件下允许相应的Fc区错配驱动的交换反应发生。这促进制备和(高通量)筛选方法。
在一个实施方案中，铰链区无二硫键。无二硫键的铰链区在SEQ ID NO:32的序列中包含丝氨酸残基替代半胱氨酸残基。该反应有或无铰链区二硫键情况下高效(参见图24，根据实例3或12的ELISA)。
除了移除二硫键，还可以缩短铰链区。通过使用这类修饰的铰链区，可以获得在各个结合位点之间提供不同距离的双特异性抗体(参见图25)。因此，在一个实施方案中，铰链区具有SEQ ID NO:31(HTCPXCP，X＝S或P)或SEQ ID NO:85(HTSPXSP，X＝S或P)或SEQ IDNO:86(HTPAPE；已经缺失SEQ ID NO.31的CPXC)的氨基酸序列。
参见实施例10、11、18和19。
已经发现2/3-IgG的组装浓缩作用影响链交换反应效率并且因而影响形成的双特异性抗体的量。在一个实施方案中，为确保高效链-交换反应，2/3-IgG的浓度至少0.1μM、即0.1μM或更高(直至1M)，在一个优选的实施方案中是1μM或更高。
参见实施例20和图30。
在一个优选的实施方案中，起始多聚体按等摩尔浓度混合。
D)Fc区变体
在某些实施方案中，可以向本文提供的2/3-IgG的Fc区引入一个或多个其他氨基酸修饰引入，因而生成Fc区变体。该Fc区变体可以包含人Fc区序列(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)，所述的人Fc区序列在一个或多个氨基酸位置包含氨基酸修饰(例如，置换)。
在某些实施方案中，本发明构思了拥有一些但非全部效应子功能的2/3-IgG变体，这使所述变体成为下述应用的有利候选物，在所述应用中体内半衰期重要，而某些效应子功能(如补体和ADCC)是不必要或有害的。可以实施体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性降低/耗尽。例如，可以实施Fc受体(FcR)结合测定法以确保2/3-IgG缺少FcγR结合作用(因此可能缺少ADCC活性)，但是保留FcRn结合能力。介导ADCC的原代细胞-NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch,J.V.和Kinet,J.P.,Annu.Rev.Immunol.9(1991)457-492的第464页上的表3中总结了造血细胞上的FcR表达。US 5,500,362(参见，例如，Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(1986)7059-7063；和Hellstrom,I.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502)；US 5,821,337(参见Bruggemann,M.等人,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中描述了评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例。备选地，可以使用非放射性分析方法(参见，例如，用于流式细胞术的ACTITM非放射性细胞毒性测定法(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA；和CytoTox
Figure BDA0002457664720000721
非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI)。用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选或额外地，可以在体内，例如，在动物模型中，如在Clynes,R.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(1998)652-656公开中的那种动物模型中评估目的分子的ADCC活性。也可以实施C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q并因此缺少CDC活性(参见，例如，WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA)。为了评估补体激活，可以进行CDC测定法(参见，例如，Gazzano-Santoro,H.等人,J.Immunol.Methods 202(1996)163-171；Cragg,M.S.等人,Blood101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood 103(2004)2738-2743)。也可以使用本领域已知的方法确定FcRn结合作用和体内清除率/半衰期(参见，例如，Petkova,S.B.等人，Int.Immunol.18(2006:1759-1769)。
包含效应子功能减少的Fc区的2/3-IgG包括置换一个或多个Fc区残基238、265、269、270、297、327和329(US 6,737,056)的那些。这类Fc区突变体包含在氨基酸位置265、269、270、297和327的两个或更多个位置处具有置换的Fc区突变体，包括残基265和297置换成丙氨酸的所谓“DANA”Fc区突变体(US 7,332,581)。
某些2/3-IgG包含具有改善或削弱的FcR结合作用的Fc区变体(参见，例如，US 6,737,056；WO 2004/056312，和Shields,R.L.等人,J.Biol.Chem.276(2001)6591-6604)。
在某些实施方案中，2/3-IgG包含具有一个或多个改善ADCC的氨基酸置换(例如，在Fc区的第298、333和/或334位置处的置换)(残基的EU编号)的Fc区变体。
在一些实施方案中，在Fc区内做出改变，所述改变导致变更(即改善或削弱)的C1q结合作用和/或补体依赖细胞毒性(CDC)，例如，如US 6,194,551、WO 99/51642和Idusogie,E.E.等人,J.Immunol.164(2000)4178-4184中所述。
在US 2005/0014934中描述了半寿期增加和新生Fc受体(FcRn)结合作用改善的抗体，所述新生Fc受体负责转移母源IgG至胎儿转移(Guyer,R.L.等人,J.Immunol.117(1976)587-593和Kim,J.K.等人,J.Immunol.24(1994)2429-2434)。这些抗体包含其中具有一个或多个置换的Fc区，其中所述置换改善Fc区与FcRn的结合。这类Fc区变体包括在一个或多个Fc区残基238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434处具有置换(例如，Fc区残基434的置换)的那些(US 7,371,826)。
关于Fc区变体的其他例子，还参见Duncan,A.R.和Winter,G.,Nature322(1988)738-740；US 5,648,260；US 5,624,821和WO 94/29351。
在全部方面的一个实施方案中，2/3-IgG包含(全部位置均依据Kabat的EU索引)
i)在两条Fc区多肽中具有突变P329G、L234A和L235A的人IgG1亚类Fc区，或
ii)在两条Fc区多肽中具有突变P329G、S228P和L235E的人IgG4亚类Fc区，或
iii)在两条Fc区多肽中具有突变P329G、L234A、L235A、I253A、H310A和H435A或在两条Fc区多肽中具有突变P329G、L234A、L235A、H310A、H433A和Y436A的人IgG1亚类Fc区，或
iv)人IgG1亚类的异二聚Fc区，其中两条Fc区多肽包含突变P329G、L234A和L235A并且
a)一条Fc区多肽包含突变T366W，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
v)人IgG4亚类的异二聚Fc区，其中两条Fc区多肽包含突变P329G、S228P和L235E并且
a)一条Fc区多肽包含突变T366W，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A和Y407V，或
b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和S354C，或
c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C，并且另一条Fc区多肽包含突变T366S、L368A、Y407V和Y349C，
或
vi)i)、ii)和iii)中一者与iv)和v)中一者的组合。
在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，包含CH3结构域的2/3-IgG包含额外的C末端甘氨酸-赖氨酸二肽(G446和K447，根据Kabat EU索引编号)。在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，包含CH3结构域的2/3-IgG包含额外的C末端甘氨酸残基(G446，根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，如本文报道的2/3-IgG包含特征为属于人亚类IgG1或属于亚类IgG4的Fc区，所述Fc区具有突变PVA236、L234A/L235A和/或GLPSS331(根据Kabat的EU索引编号)。在又一个实施方案中，2/3-IgG特征在于包含Fc区，所述Fc区属于任何IgG类，在一个实施方案中属于IgG1或IgG4亚类，在E233、L234、L235、G236、D270、N297、E318、K320、K322、A327、A330、P331和/或P329中(根据Kabat的EU索引编号)含有至少一个突变。另外在一个实施方案中，2/3-IgG包含人IgG4亚类的Fc区，所述Fc区含有突变S228P或突变S228P和L235E(Angal,S.等人,Mol.Immunol.30(1993)105-108)(根据Kabat的EU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG中所包含的Fc区多肽的C末端可以是以氨基酸残基PGK结尾的完整C末端。该C末端可以是其中已经移除一个或两个C端氨基酸残基的缩短的C末端。在一个优选的实施方案中，C末端是以氨基酸残基PG结尾的缩短的C末端。
E)异二聚化
已经描述了几种修饰CH3以支持异二聚化的方案，例如在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO 2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO 2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954、WO 2013/096291中描述，所述文献通过引用的方式纳入本文。
一般，在本领域已知的方案中，第一重链的CH3结构域和第二重链的CH3结构域均以互补方式工程化，从而包含一个工程化CH3结构域的重链可以不再与相同结构的另一个重链同型二聚化(例如CH3工程化的第一重链可以不再与CH3工程化的另一条第一重链同型二聚化；并且CH3工程化的第二重链可以不再与CH3工程化的另一条第二重链同型二聚化)。因而，包含一个工程化CH3结构域的重链与另一条以互补方式工程化的包含CH3结构域的重链异二聚化。对于这个实施方案，通过氨基酸置换，以互补方式工程化第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二重链Fc区多肽的CH3结构域，从而第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽异二聚化，而第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽不再同型二聚化(例如因空间原因)。
构思了上文提到并纳入的本领域已知用于支持重链异二聚化的不同方案，作为提供如本文报道的异二聚体/多聚体多肽(例如2/3-IgG)时所用的不同备选物。
可以通过“杵入臼”技术改变如本文报道的2/3-IgG的CH3结构域，所述技术以例如WO 96/027011、Ridgway J.B.等人,Protein Eng.9(1996)617-621和Merchant,A.M.等人,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中的几个实例详述。在这种方法中，改变两个CH3结构域的相互作用面以增加含有这两个CH3结构域的两条重链Fc区多肽的异二聚化。(两条重链Fc区多肽的)两个CH3结构域的一者可以是“杵”，而另一者是“臼”。可以额外地引入二硫键，以使异二聚体进一步稳定(Merchant,A.M.等人,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.等人,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并在本发明的交换反应中增加产率。
在一个优选的实施方案中，如本文报道的2/3-IgG包含在“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和在“臼链”的CH3结构域中的T366S、L368A、Y407V突变(根据Kabat EU索引编号)。也可以例如通过向杵链的CH3结构域之一引入Y349C突变并向臼链的CH3结构域之一引入E356C突变或S354C突变(在使用两种多聚体作为起始材料的本发明交换反应中，仅所述多聚体的CH3结构域之一包含额外半胱氨酸残基，从而仅在交换的产物中形成额外的二硫键)，使用CH3结构域之间额外的链间二硫键(Merchant,A.M.等人,Nature Biotech.16(1998)677-681)。因此在另一个优选的实施方案中，如本文报道的2/3-IgG在第一多聚体的CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变并且在第二多聚体的相应的互补性CH3结构域中包含E356C、T366S、L368A和Y407V突变；或如本文报道的2/3-IgG在第一多聚体的CH3结构域之一中包含Y349C和T366W突变并且在第二多聚体的相应的互补性CH3结构域中包含S354C、T366S、L368A和Y407V突变(一个CH3结构域中额外的Y349C突变和相应CH3结构域中额外的E356C或S354C突变形成链间二硫键桥)(根据Kabat EU索引编号)。
还可以备选或额外地使用EP 1 870 459A1中所述的其他的杵入臼技术。在一个实施方案中，如本文报道的2/3-IgG包含在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，如本文报道的2/3-IgG包含在“杵链”的CH3结构域中的T366W突变和在“臼链”的CH3结构域”中的T366S、L368A和Y407V突变和额外地在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
在一个实施方案中，如本文报道的2/3-IgG包含在CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和在互补性CH3结构域中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变，或如本文报道的2/3-IgG包含在CH3结构域之一中的Y349C和T366W突变和在互补性CH3结构域中的S354C、T366S、L368A和Y407V突变和额外地在“杵链”的CH3结构域中的R409D和K370E突变和在“臼链”的CH3结构域中的D399K和E357K突变(根据Kabat EU索引编号)。
除“杵入臼技术”之外，本领域已知修饰2/3-IgG的重链的CH3结构域以执行异二聚化的其他技术。本文中将这些技术，尤其在WO 96/27011、WO 98/050431、EP 1870459、WO2007/110205、WO 2007/147901、WO 2009/089004、WO 2010/129304、WO 2011/90754、WO2011/143545、WO 2012/058768、WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的那些，构思为与如本文报道的2/3-IgG组合的“杵入臼技术”的备选物。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用EP 1 870 459 A1中描述的方案支持2/3-IgG的第一重链和第二重链的异二聚化。这种方案基于第一和第二重链二者之间CH3/CH3结构域界面内的特定氨基酸位置处引入具有相反电荷的带电荷氨基酸。
因此，这个实施方案涉及一种如本文报道的2/3-IgG，其中在多聚体的三级结构中，第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二重链Fc区多肽的CH3结构域形成位于相应CH3结构域之间的界面，其中第一重链Fc区多肽的CH3结构域和第二重链Fc区多肽的CH3结构域的相应氨基酸序列各自包含位于2/3-IgG的三级结构中所述界面内部的一组氨基酸，其中从位于一条重链Fc区多肽的CH3结构域中该界面内的这组氨基酸中，第一氨基酸由带正电荷的氨基酸置换，并且从位于另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中界面内的这组氨基酸中，第二氨基酸由带负电荷的氨基酸置换。根据这个实施方案的2/3-IgG在本文中也称作“CH3(+/-)-工程化的2/3-IgG”(其中缩写“+/-”代表相应CH3结构域中引入的带相反电荷的氨基酸)。
在所述CH3(+/-)-工程化的如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K、R和H，并且带负电荷的氨基酸选自E或D。
在所述CH3(+/-)-工程化的如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸选自K和R，并且带负电荷的氨基酸选自E或D。
在所述CH3(+/-)-工程化的如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，带正电荷的氨基酸是K，并且带负电荷的氨基酸是E。
在所述CH3(+/-)-工程化的如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，在一条重链的CH3结构域中，位置409处的氨基酸R由D置换并且位置370处的氨基酸K由E置换，并且在另一条重链的CH3结构域中，位置399处的氨基酸D由K置换并且位置357处的氨基酸E由K置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2013/157953中描述的方案支持2/3-IgG的第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的异二聚化。在如本文报道的所述2/3-IgG的一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由K置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报道的所述2/3-IgG的另一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由K置换并且位置351处的氨基酸L由K置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的所述2/3-IgG的另一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由K置换并且位置351处的氨基酸L由K置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置351处的氨基酸L由D置换(根据Kabat EU索引编号)。另外，另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中包含以下置换至少之一：位置349处的氨基酸Y由E置换、位置349处的氨基酸Y由D置换并且位置368处的氨基酸L由E置换(根据Kabat EU索引编号)。在一个实施方案中，位置368处的氨基酸L由E置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2012/058768中描述的方案支持2/3-IgG的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚化。在如本文报道的所述2/3-IgG的一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置351处的氨基酸L由Y置换并且位置407处的氨基酸Y由A置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由A置换并且位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在另一个实施方案中，除前述置换之外，在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，置换了位置411(原为T)、399(原为D)、400(原为S)、405(原为F)、390(原为N)和392(原为K)处的氨基酸中至少一者(根据Kabat EU索引编号)。优选的置换是：
-将位置411处的氨基酸T用选自N、R、Q、K、D、E和W的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-将位置399处的氨基酸D用选自R、W、Y、和K的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-将位置400处的氨基酸S用选自E、D、R和K的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)，
-将位置405处的氨基酸F用选自I，M、T、S、V和W的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)；
-将位置390处的氨基酸N用选自R、K和D的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)；和
-将位置392处的氨基酸K用选自V、M、R、L、F和E的氨基酸置换(根据Kabat EU索引编号)。
在(根据WO 2012/058768工程化的)如本文报道的所述2/3-IgG的另一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置351处的氨基酸L由Y置换并且位置407处的氨基酸Y由A置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由V置换并且位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报道的所述2/3-IgG的另一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置407处的氨基酸Y由A置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由A置换并且位置409处的氨基酸K由F置换(根据Kabat EU索引编号)。在前面最后所述的实施方案，在所述另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置392处的氨基酸K由E置换，位置411处的氨基酸T由E置换，位置399处的氨基酸D由R置换并且位置400处的氨基酸S由R置换(根据KabatEU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2011/143545中描述的方案支持2/3-IgG的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚化。在如本文报道的所述2/3-IgG的一个实施方案中，在两条重链Fc区多肽的CH3结构域中位置368和/或409处引入氨基酸修饰(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2011/090762中描述的方案支持2/3-IgG的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚化。WO 2011/090762涉及根据“杵入臼”技术的氨基酸修饰。在如本文报道的所述CH3(KiH)-工程化2/3-IgG的一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由W置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置407处的氨基酸Y由A置换(根据Kabat EU索引编号)。在如本文报道的所述CH3(KiH)-工程化2/3-IgG的另一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置366处的氨基酸T由Y置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置407处的氨基酸Y由T置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的属于IgG2同种型的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2011/090762中描述的方案支持2/3-IgG的第一重链Fc区多肽和第二重链Fc区多肽的异二聚化。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2007/147901中描述的方案支持2/3-IgG的第一Fc区多肽和第二Fc区多肽的异二聚化。在如本文报道的所述2/3-IgG的一个实施方案中，在一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置253处的氨基酸K由E置换，位置282处的氨基酸D由K置换并且位置322处的氨基酸K由D置换，并且在另一条重链Fc区多肽的CH3结构域中，位置239处的氨基酸D由K置换，位置240处的氨基酸E由K置换并且位置292处的氨基酸K由D置换(根据Kabat EU索引编号)。
在如本文报道的2/3-IgG的一个实施方案中，使用WO 2007/110205中描述的方案支持2/3-IgG的第一多肽和第二多肽的异二聚化。
在如本文中报道的全部方面的一个实施方案中，2/3-IgG具有IgG型抗体的恒定结构域结构。在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，2/3-IgG特征在于：所述2/3-IgG包含人亚类IgG1或人亚类IgG1的具有突变L234A和L235A和任选地P329G的Fc区。在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，2/3-IgG特征在于：所述2/3-IgG包含人亚类IgG2的Fc区。在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，2/3-IgG特征在于：所述2/3-IgG包含人亚类IgG3的Fc区。在如本文报道的全部方面的又一个实施方案中，2/3-IgG特征在于：所述2/3-IgG包含人亚类IgG4或人亚类IgG4的具有附加突变S228P和L235E和任选地P329G的Fc区。
在全部方面的一个实施方案中，2/3-IgG包含第一Fc区多肽和第二Fc区多肽，其中
i)第一和第二Fc区多肽包含突变Y436A，或
ii)第一和第二Fc区多肽包含突变I253A、H310A和H435A，或
iii)第一和第二Fc区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A，或
iv)第一和第二Fc区多肽包含突变L251D、L314D和L432D，或
v)第一Fc区多肽包含突变Y436A并且第二Fc区多肽包含
a)突变I253A、H310A和H435A，或
b)突变H310A、H433A和Y436A，或
c)突变L251D、L314D和L432D，
或
vi)第一Fc区多肽包含突变I253A、H310A和H435A并且第二Fc区多肽包含
a)突变H310A、H433A和Y436A，或
b)突变L251D、L314D和L432D，
或
vii)第一Fc区多肽包含突变H310A、H433A和Y436A并且第二Fc区多肽包含
a)突变L251D、L314D和L432D。
III.示例的本发明实施方案集合
本发明实施方案的第1集合：
1.一种用于产生多聚体多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，
其中i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
其中第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第二多肽在CH3结构域中包含第一扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第一扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽是二聚体，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，
其中i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
其中第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第三多肽在CH3结构域中包含第二扰动性突变，据此第四多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第二扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
其中第二扰动性突变处在异于第一扰动性突变的位置，
其中第三多肽和第四多肽是二聚体，
其中当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的结合物并且因而产生(多特异性)结合物，
2.根据实施方案1的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含衍生自IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自IgG1CH3结构域的CH3结构域。
3.根据实施方案1至2中任一个实施方案的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含i)彼此独立地氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:65)或氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)，ii)衍生自IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和iii)衍生自IgG1CH3结构域的CH3结构域。
4.根据实施方案1至3中任一个实施方案的方法，其中i)第一和第四多肽各自还包含衍生自IgG1 CH1结构域的CH1结构域和可变结构域，或ii)其中第一或第四多肽包含衍生自IgG1 CH1结构域的CH1结构域并且另一多肽包含衍生自轻链恒定结构域的结构域并且每种多肽还包含可变结构域。
5.根据实施方案4的方法，其中第一多肽的可变结构域是重链可变结构域并且第四多肽的可变结构域是轻链可变结构域或反之亦然，并且当第一和第四多肽形成二聚体时，这些结构域形成结合位点。
6.根据实施方案1至4中任一个实施方案的方法，其中第一和第四多肽彼此独立地选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
iv)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
7.根据实施方案1至6中任一个实施方案的方法，其中第一和第二结合物还包含抗体轻链。
8.根据实施方案1至7中任一个实施方案的方法，其中
第一结合物包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二CH1人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变，所述扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽是二聚体，
和
第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二结合物包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变，所述第二扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第五多肽在其氨基酸序列中在野生型IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人IgG1野生型氨基酸残基，据此第四多肽中的扰动性突变处于异于第二多肽中扰动性突变的不同位置，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽是二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
9.根据实施方案1至8中任一个实施方案的方法，其中孵育步骤在还原剂存在下进行。
10.根据实施方案1至9中任一个实施方案的方法，其中i)第二多肽和第三多肽，或ii)第二多肽和第五多肽还包含(C末端)标签。
11.根据实施方案10的方法，其中标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，并且通过金属(镍)螯合物亲和色谱柱上的色谱回收。
12.一种用于鉴定结合物组合的方法，包括步骤
-通过使选自第一多种结合物的第一结合物和选自第二多种结合物的第二结合物的每种组合经历根据实施方案1至11中任一个实施方案的方法，产生多种结合物，
-在ELISA测定法中分别测量所产生的多种结合物的每种结合物与至少两种抗原的同时结合作用，并且
-基于ELISA的结果从多种结合物选择结合物并且因而鉴定结合物组合。
13.多聚体多肽，包含第一多肽和第二多肽
其中两种多肽均包含人免疫球蛋白CH3结构域，
其中i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
其中第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
其中第二多肽在CH3结构域中包含至少一个扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽是二聚体。
14.根据实施方案13的多聚体多肽，其中
第一多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
并且包含突变杵或突变臼，
和
第二多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自包含突变杵或突变臼的人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
包含扰动性突变，所述扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
通过二硫键与第一多肽共价结合的第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
15.一种组合物，其包含
第一异三聚体多肽，其包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变，所述扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
作为第三多肽，包含通过二硫键与第一多肽共价结合的轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
和
第二异三聚体多肽，其包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
如果第一异三聚体的第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一异三聚体的第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变，所述第二扰动性突变选自E345R、Q347K、Y349W、Y349E、L351F、L351Y、S354E、S354V、D356S、D356A、D356K、E357S、E357A、E357L、E357F、E357K、K360S、K360E、Q362E、S364V、S364L、T366I、L368F、L368V、K370E、N390E、K392E、K392D、T394I、V397Y、D399A、D399K、S400K、D401R、F405W、Y407W、Y407L、Y407I、K409D、K409E、K409I、K439E、L441Y、C349Y、S366T、A368L、V407Y、C354S和W366T组成的突变群组，据此第五多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，据此第四多肽中的扰动性突变处于异于第二多肽中扰动性突变的不同位置，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第一(第四)多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一(第四)多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
和
作为第六多肽，包含通过二硫键与第四多肽共价结合的轻链可变结构域和轻链恒定结构域的多肽，
其中i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，其中第二和第四多肽在相同位置不包含扰动性突变。
本发明实施方案的第2集合：
1.一种用于产生多聚体多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体起始多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-1)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-1)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的第一扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第一扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-1)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体起始多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-2)i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼-cys、或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵-cys，据此i)如若第一多肽包含突变臼-cys，则第四多肽包含突变杵-cys，或ii)如若第一多肽包含突变杵-cys，则第四多肽包含突变臼-cys，
b-2)第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-2)第三多肽在CH3结构域中包含与a-2)下的突变不同的第二扰动性突变，据此第四多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第二扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-2)第二扰动性突变处在异于第一扰动性突变的位置，
e-2)第三多肽和第四多肽形成二聚体，
f-2)当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变(设计成)产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的多聚体多肽并且因而产生多聚体多肽，
编号根据Kabat EU索引进行。
2.根据实施方案1的方法，其中第一扰动性突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，第二扰动性突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E。
3.根据实施方案1的方法，其中第一扰动性突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，第二扰动性突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D。
4.一种用于产生多聚体多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体起始多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-1)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-1)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的第一扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第一扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-1)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
e-1)第一多肽在铰链区中包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体起始多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-2)i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
b-2)第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-2)第三多肽在CH3结构域中包含与a-2)下的突变不同的第二扰动性突变，据此第四多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与第二扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
d-2)第二扰动性突变处在异于第一扰动性突变的位置，
e-2)第三多肽和第四多肽形成二聚体，
f-2)当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变产生吸引性相互作用，
g-2)第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)或包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的多聚体多肽并且因而产生多聚体多肽，
编号根据Kabat EU索引进行。
5.根据实施方案4的方法，其中第一扰动性突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，第二扰动性突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E。
6.根据实施方案4的方法，其中第一扰动性突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，第二扰动性突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D。
7.一种用于产生多聚体多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体起始多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-1)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-1)第二多肽在CH3结构域中包含突变E357K作为第一扰动性突变，并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，
d-1)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体起始多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-2)i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
b-2)第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-2)第三多肽在CH3结构域中包含突变K370E作为第二扰动性突变，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，
d-2)第三多肽和第四多肽形成二聚体，
f-2)当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的多聚体多肽并且因而产生多聚体多肽，
编号根据Kabat EU索引进行。
8.一种用于产生多聚体多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
包含第一多肽和第二多肽的第一多聚体起始多肽，所述第一多肽和第二多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-1)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-1)第二多肽在CH3结构域中包含突变D356K作为第一扰动性突变，并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，
d-1)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
包含第三多肽和第四多肽的第二多聚体起始多肽，所述第三多肽和第四多肽均包含免疫球蛋白G CH3结构域，其中
a-2)i)第三多肽的CH3结构域包含突变杵并且第四多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第三多肽的CH3结构域包含突变臼并且第四多肽的CH3结构域包含突变杵，据此i)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵，或ii)如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼，
b-2)第四多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
c-2)第三多肽在CH3结构域中包含突变K439E作为第二扰动性突变，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，
d-2)第三多肽和第四多肽形成二聚体，
e-2)当第二多肽和第三多肽形成异二聚体时，第二多肽中的第一扰动性突变和第三多肽中的第二扰动性突变产生吸引性相互作用，
和
-回收包含第一多肽和第四多肽的多聚体多肽并且因而产生多聚体多肽，
编号根据Kabat EU索引进行。
9.根据实施方案4至8中任一个实施方案的方法，其中第一多肽包含突变杵，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼。
10.根据实施方案4至8中任一个实施方案的方法，其中第一多肽包含突变杵-cys，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼-cys。
11.根据实施方案1至10中任一个实施方案的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域。
12.根据实施方案1至3和7至11中任一个实施方案的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含i)彼此独立地氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:65)或氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO:91)，ii)IgG1 CH2结构域，和iii)IgG1 CH3结构域。
13.根据实施方案1至12中任一个实施方案的方法，其中i)第一和第四多肽各自还包含IgG1 CH1结构域和可变结构域，或ii)其中第一或第四多肽包含IgG1 CH1结构域并且另一多肽包含轻链恒定结构域并且每种多肽还包含可变结构域。
14.根据实施方案13的方法，其中第一多肽的可变结构域是重链可变结构域并且第四多肽的可变结构域是轻链可变结构域或反之亦然，并且当第一和第四多肽形成二聚体时，这些结构域形成结合位点。
15.根据实施方案1至14中任一个实施方案的方法，其中第一和第四多肽彼此独立地选自
A)以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
vi)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
或
B)
以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
vi)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
16.根据实施方案1至15中任一个实施方案的方法，其中第一和第二多聚体起始多肽还包含抗体轻链。
17.根据实施方案1至16中任一个实施方案的方法，其中
A)
第一多聚体起始多肽包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二多聚体起始多肽包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，因而第五多肽在其氨基酸序列中在野生型IgG1中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人IgG1野生型氨基酸残基，因而第四多肽中的扰动性突变在异于第二多肽中扰动性突变的不同位置处，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合，
或
B)
第一多聚体起始多肽包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、和人IgG1 CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二多聚体起始多肽包含
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、和人IgG1 CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，因而第五多肽在其氨基酸序列中在野生型IgG1中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人IgG1野生型氨基酸残基，因而第四多肽中的扰动性突变在异于第二多肽中扰动性突变的不同位置处，
和
作为第五多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
18.根据实施方案1至17中任一个实施方案的方法，其中孵育步骤在还原剂存在下进行。
19.根据实施方案1至18中任一个实施方案的方法，其中i)第二多肽和第三多肽，或ii)第二多肽和第五多肽还包含(C末端)标签。
20.根据实施方案19的方法，其中
i)标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，并且通过金属(镍)螯合物亲和色谱柱上的色谱回收，
或
ii)标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)，并且通过C标签亲和色谱柱上的色谱回收。
21.一种用于鉴定多聚体多肽组合的方法，包括步骤
a)通过使选自第一多种多聚体多肽的第一多聚体起始多肽和选自第二多种多聚体多肽的第二多聚体起始多肽的每种组合经历根据实施方案1至20中任一个实施方案的方法，产生多种多聚体多肽，
b)在结合测定法中分别测量在步骤a)中产生的多种多聚体多肽的每种多聚体多肽与至少两种抗原的同时结合作用，并且
c)基于结合结果，从多种多聚体多肽选择多聚体多肽并且因而鉴定多聚体多肽组合。
22.根据实施方案21的方法，其中结合测定法是ELISA或SPR方法。
23.多聚体多肽，包含突变杵
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含与b-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
b-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
编号根据Kabat EU索引进行。
24.根据实施方案23的多聚体多肽，其中扰动性突变是E357K并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
25.根据实施方案23的多聚体多肽，其中第一扰动性突变是D356K并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
26.多聚体多肽，包含
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
a-5)第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)或包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含与a-2)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
b-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
b-5)第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)或包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)。
27.根据实施方案26的多聚体多肽，其中扰动性突变是E357K并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
28.根据实施方案26的多聚体多肽，其中第一扰动性突变是D356K并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
29.多聚体多肽，包含
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含突变E357K并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含突变K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E，
b-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
编号根据Kabat EU索引进行。
30.多聚体多肽，包含
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含突变D356K并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含突变K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D，
b-4)第三多肽和第四多肽形成二聚体，
编号根据Kabat EU索引进行。
31.根据实施方案26至30中任一个实施方案的多聚体多肽，其中第一多肽包含突变杵并且第二多肽包含突变臼；或第二多肽包含突变杵并且第一多肽包含突变臼。
32.根据实施方案26至30中任一个实施方案的多聚体多肽，其中第一多肽包含突变杵-cys并且第二多肽包含突变臼；或第二多肽包含突变杵并且第一多肽包含突变臼-cys。
33.根据实施方案29至32中任一个实施方案的多聚体多肽，其中第一多肽和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)或包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:85)替代IgG1野生型铰链区序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)。
34.根据实施方案22至33中任一个实施方案的多聚体多肽，其中
A)
第一多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
和
第二多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含选自突变D356K、E357K、K370E或K439E的突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
通过二硫键与第一多肽共价结合的第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域；
或
B)
第一多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域、和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域、和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
和
第二多肽是选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含选自突变D356K、E357K、K370E或K439E的突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
通过二硫键与第一多肽共价结合的第三多肽，其包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域。
本发明实施方案的第3集合：
1.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的第一突变，并且第一突变的引入增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
和
第二多聚体，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-1)如若第一多肽包含突变臼-cys，则第四多肽包含突变杵-cys并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵-cys，则第四多肽包含突变臼-cys并且第三多肽包含突变杵，
b-2)第三多肽在CH3结构域中包含与a-1)、a-2)和b-1)下的突变不同的第二突变，并且第二突变的引入增加第二多聚体的CH3-CH3结合自由能，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生所述多肽。
2.根据实施方案1的方法，其中a-2)下的突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，b-2)下的突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
3.根据实施方案1的方法，其中a-2)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，b-2)下的突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
4.根据实施方案1至3中任一个实施方案的方法，其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，并且其中第四和/或第三多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
5.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的第一突变，并且第一突变的引入增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
a-3)第一和第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，
和
第二多聚体，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-1)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-2)第三多肽在CH3结构域中包含与a-1)、a-2)和b-1)下的突变不同的突变，并且第二突变的引入增加第二多聚体的CH3-CH3结合自由能，
b-3)第四和/或第三多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生所述多肽。
6.根据实施方案5的方法，其中a-2)下的突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，b-2)下的突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
7.根据实施方案5的方法，其中a-2)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，b-2)下的突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
8.根据实施方案1或5中任一个实施方案的方法，其中第一多肽在CH3结构域中在与第二多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，并且其中第四多肽在CH3结构域中在与第三多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基。
9.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽在位置370包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变E357K，
和
第二多聚体，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-1)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-2)第三多肽包含突变K370E并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生该多肽，
诸位置根据Kabat EU索引编号。
10.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽在位置439包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变D356K，
和
第二多聚体，其包含
第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-1)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-2)第三多肽包含突变K439E并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生该多肽，
诸位置根据Kabat EU索引编号。
11.根据实施方案1至10中任一个实施方案的方法，其中包含第二多肽和第三多肽的第三多聚体的CH3-CH3结合自由能低于第一多聚体和/或第二多聚体的CH3-CH3结合自由能。
12.根据实施方案1至11中任一个实施方案的方法，其中第一多肽和第二多肽形成(可分离的)二聚体，并且第三多肽和第四多肽形成(可分离的)二聚体。
13.根据实施方案4至12中任一个实施方案的方法，其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ IDNO:31)，和/或其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)，和/或第三和/或第四多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)，和/或其中第三和/或第四多肽包含氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCPAPE(SEQ ID NO:90)。
14.根据实施方案5至13中任一个实施方案的方法，其中第一多肽包含突变杵，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼。
15.根据实施方案5至13中任一个实施方案的方法，其中第一多肽包含突变杵-cys，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼-cys。
16.根据实施方案1至15中任一个实施方案的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域。
17.根据实施方案1至16任一个实施方案的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含i)彼此独立地氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:65)或氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO:91)，ii)IgG1 CH2结构域，和iii)IgG1 CH3结构域。
18.根据实施方案1至17中任一个实施方案的方法，其中i)第一和第四多肽各自还包含IgG1 CH1结构域和可变结构域，或ii)其中第一或第四多肽包含IgG1 CH1结构域并且另一多肽包含轻链恒定结构域并且每种多肽还包含可变结构域。
19.根据实施方案18的方法，其中第一多肽的可变结构域是重链可变结构域并且第四多肽的可变结构域是轻链可变结构域或反之亦然，并且这些结构域在多肽中形成结合位点。
20.根据实施方案1至19中任一个实施方案的方法，其中第一和第四多肽彼此独立地选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
vi)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
21.根据实施方案1至20中任一个实施方案的方法，其中第一和第二多聚体还分别包含与第一多肽和第四多肽缔合的抗体轻链。
22.根据实施方案1至21中任一个实施方案的方法，其中
第一多聚体包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第五多肽，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二多聚体包含
作为第三多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，因而第五多肽在其氨基酸序列中在野生型IgG1中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人IgG1野生型氨基酸残基，因而第四多肽中的扰动性突变在异于第二多肽中扰动性突变的不同位置处，
和
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
23.根据实施方案1至3和9至12中任一个实施方案的方法，其中孵育步骤在还原剂存在或不存在下进行。
24.根据实施方案4至8和13至22中任一个实施方案的方法，其中孵育步骤在还原剂不存在下进行。
25.根据实施方案1至24中任一个实施方案的方法，其中i)第二多肽和第三多肽还包含(C末端)标签。
26.根据实施方案25的方法，其中
i)标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，并且通过金属(镍)螯合物亲和色谱柱上的色谱回收，
或
ii)标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)，并且通过C标签亲和色谱柱上的色谱回收。
27.一种用于鉴定多特异性多肽的方法，包括步骤
a)通过使选自与第一靶特异性结合的第一多种多聚体中的第一多聚体和选自与第二靶(其异于第一靶)特异性结合的第二多种多聚体中的第二多聚体的每种组合经历根据实施方案1至26中任一个实施方案的方法，产生多种多特异性多肽，
b)在结合测定法中，对步骤a)中产生的多种多特异性多肽的每个成员单独测量与两种靶的同时结合，并且
c)基于结合测定法的结果，从多种多聚体多肽选择多聚体多肽并且因而鉴定多特异性多肽。
28.根据实施方案27的方法，其中结合测定法是ELISA或SPR方法。
29.分离的多聚体多肽，包含
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含与b-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
b-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
编号根据Kabat EU索引进行。
30.根据实施方案29的多聚体多肽，其中扰动性突变是E357K并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
31.根据实施方案29的多聚体多肽，其中第一扰动性突变是D356K并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
32.分离的多聚体多肽，其包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的又一突变，并且又一突变的引入增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能。
33.根据实施方案32的分离的多聚体多肽，其中a-2)下的突变是E357K，并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或其中a-2)下的突变是K370E，并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
34.根据实施方案32的分离的多聚体多肽，其中a-2)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或其中a-2)下的突变是K439E，并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
35.根据实施方案32至34中任一个实施方案的分离的多聚体多肽，其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
36.分离的多聚体多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的又一突变，并且又一突变的引入增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
a-3)第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
37.根据实施方案36的分离的多聚体多肽，其中a-2)下的突变是E357K，并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或其中a-2)下的突变是K370E，并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
38.根据实施方案36的分离的多聚体多肽，其中a-2)下的突变是D356K，并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或其中a-2)下的突变是K439E，并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
39.根据实施方案32至36中任一个实施方案的分离的多聚体多肽，其中第一多肽在CH3结构域中在与第二多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基。
40.分离的多聚体多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽在位置370包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变E357K，
或
第二多肽包含突变K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
41.分离的多聚体多肽，包含
第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-1)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽在位置439包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变D356K，
或
第二多肽包含突变K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
42.根据实施方案29至41中任一个实施方案的分离的多聚体多肽，其中第一多肽选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
vi)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
43.根据实施方案29至42中任一个实施方案的分离的多聚体多肽，还包含与第一多肽缔合的抗体轻链。
44.根据实施方案43的分离的多聚体多肽，包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
作为第三多肽，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的多肽，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。
45.根据实施方案29至44中任一个实施方案的分离的多聚体多肽，其中第二多肽还包含(C末端)标签。
46.根据实施方案45的分离的多聚体多肽，其中
i)标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，
或
ii)标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)。
提供以下实施例、序列和附图以辅助理解本发明，所附权利要求书中阐述本发明的真实范围。可以理解，可以对所述方法作修改而不脱离本发明的精神。
附图简述
图1：在本发明方法中使用的2/3-IgG的设计和模块组成。
图2：在杵-cys重链和臼-cys重链(上半部分)之间和杵-cys重链和MHCFcRP(中间部分和下半部分)之间的各种相互作用。共价二硫键以短划线指示，用实心球之间的线示出吸引性相互作用对，排斥性相互作用或所得的空间位阻以双箭头线指示。
图3：具有不同MHCFcRP的纯化2/3-IgG的SEC色谱图：显示了从细胞培养上清液中进行蛋白A提取后2/3-IgG制备物的SEC曲线(profile)；每条曲线的主峰代表2/3-IgG；具有fluos特异性或bio特异性(参见实施例2)。
图4：通过2/3-IgG例举的本发明交换反应生成bsAbs(双特异性抗体)。
图5：应用TCEP(与2/3输入IgG有关的x摩尔当量)以(部分地)还原铰链二硫键。SEC区分2/3-IgG起始分子、生成的bsAb和二聚体MHCFcRP。在不同TCEP浓度的全部反应均在相同的孵育时间后终止(三角形：bsAb；十字形：2/3-IgG；菱形：二聚体MHCFcRP)。
图6：从所需的bsAb产物移除不需要的未反应的输入分子和副产物。
图7：NiNTA-纯化的SDS-PAGE；n.r.＝未还原；r＝还原；NiNTA结合(上半小图)表示从NiNTA洗脱的蛋白质，NiNTA通流(下半小图)是不含His-6或His-8标签的蛋白质；n.r.＝未还原，r.＝还原；M＝标记。
图8：通过本发明的交换反应产生的bsAbs的双特异性功能。通过能够实现检测双特异性抗体的结合位点同时结合作用的桥式ELISA，评估功能。包覆于ELISA板的抗原A是荧光素(fluos-BSA)并且抗原B是因其荧光被检出的bio-Cy5。
图9：在重链C末端具有结合位点的2/3-IgG-交换反应的示例性2/3-IgG。
图10：在重链N末端和C末端具有结合位点的2/3-IgG-交换反应的示例性2/3-IgG。
图11：使用2/3-IgG例举的具有不同结合特异性和样式的起始材料的IgG-交换反应。
图12：使用示例性2/3-IgG，借助本发明的交换反应生成的不同bsAb样式矩阵。用荧光素结合实体和生物胞素酰胺结合实体生成该矩阵。图10中显示输入分子和交换衍生的输出分子。使用fluos-BSA作为捕获抗原并使用bio-Cy5检测双特异性结合功能，通过桥式ELISA评估生成的bsAbs的功能。从桥式ELISA衍生的信号显示全部样式具有双特异性结合功效。
图13：使用小型化高通量方案和自动化相容性方案，借助本发明的交换反应的用于生成和表征bsAb多样性的矩阵。
图14：采用HTS技术根据本发明的方法，借助交换所得的双特异性抗体样式。显示了示例性桥式ELISA的信号，所述示例性桥式ELISA显示指示双特异性抗体样式的浓度依赖性荧光信号。Fluos-bio桥式ELISA，十字形：fluos[臼/K370E]+bio[结/E357K]；菱形：bio[臼/K370E]+fluos[杵/E357K]。全部其他曲线：无同族交换配偶物的2/3IgG输入分子不显示桥式信号。
图15：无铰链区二硫键和CH3结构域链间二硫键的2/3-IgG例举的本发明交换反应的示意图。这使得按本发明的方法无需添加还原剂情况下的链-交换反应成为可能。
图16：无链间二硫键桥的2/3-IgG像标准IgG那样分泌入培养上清液，由标准蛋白A亲和力和大小排阻色谱纯化，并通过SDS-PAGE分析，确认所需的100kDa 2/3-IgG为表达产物。这证明纯化的2/3-IgG衍生物在无链间二硫键桥情况下正确组装以及不存在不需要的二聚体和聚集物。纯化i)抗bio抗体轻链(SEQ ID NO:39)+无铰链区半胱氨酸残基的抗bio抗体重链-杵(SEQ ID NO:57)+无铰链区半胱氨酸残基的MHCFcRP-臼-E357K(SEQ ID NO:62)(左)和ii)抗fluos抗体轻链(SEQ ID NO:42)+无铰链区二硫键的抗fluos抗体全长重链-臼(SEQ ID NO:60)+无铰链区半胱氨酸残基的MHCFcRP–杵-K370E(SEQ ID NO:63)(右)。
图17：无铰链区二硫键的起始材料的本发明交换反应的结果：以纯化的bsAb作为阳性对照时2.5μM浓度的输入分子展示通过与没有Fc区链间二硫键的单特异性2/3-IgG输入分子的链交换，成功生成bsAb。
图18：通过2/3IgG(左)和IgG(右)例举的本发明交换反应生成bsAbs(双特异性抗体)。
图19：通过2/3IgG例举的本发明交换反应生成bsAbs(双特异性抗体)，其中Fab已经由亲和体(左)和IgG(右)替换。
图20：从细胞培养上清液中cOmpleteTM His标签纯化后，本发明交换反应中所用的纯化的亲和体构建体的SEC色谱图；水平线表示汇集供进一步研究的级分。
图21：本发明交换反应中待使用的SEC纯化的亲和体构建体的SDS-PAGE；M＝标记，S＝样品。
图22：ELISA分析方案。反应物携带His标签并且能够与Ni-包被平板结合，但是没有具备功能的生物素(Bio)结合实体并且因此不结合Bio-Cy5。仅当本发明的交换反应中链交换时，才生成有功能的抗生物素结合位点，这使得Bio-Cy5捕获和荧光信号检测成为可能。
图23：ELISA分析结果。ELISA确认携带Fab臂的实体和非抗体结合支架之间的链交换。
图24：用有和无铰链区二硫键的2/3-IgG(即在还原条件(红色)和非还原条件(绿色)下)进行的本发明交换反应。使用实施例中描述的桥式测定法监测交换反应。阴性对照(灰色)是两种单特异性2/3-IgG起始分子。
图25：通过修饰IgG1铰链区，即通过移除二硫键或通过起缩短铰链区，各个结合位点之间的不同距离可以工程化。
图26：具有包含第二Fab区的2/3-IgG的本发明交换反应。
图27：纯化的Fab-延长型2/3-IgG的SEC色谱图。
图28：通过连续注射生物素标记的或FITC标记的蛋白质获得的双特异性抗体<FITC><CD3>-杵-HC(dA)+<Biotin>-臼-nc-His(ncB)的SPR传感图(一旦首先已经注射生物素标记的蛋白质，则其次注射FITC标记的蛋白质，并且一旦首先已经注射FITC标记的蛋白质，则其次注射生物素标记的蛋白质)。
图29：包含C标签的起始2/3-IgG和本发明交换反应后反应混合物的非还原型CE-SDS色谱图。起始2/3-IgG A是Fluo-杵-n-HC+臼-MHCFcRP(E357K)-C-标签并且起始2/3-IgGB是生物素-臼-n-HC+杵-MHCFcRP(K370E)-C-标签。可以见到，双特异性抗体形成并且可以收集于通流中。加C标签的MHCFcRP在交换反应后结合于C标签树脂并且可以从其中洗脱。因而实现分离和纯化。
图30：浓度依赖***换反应。
图31：具有包含约束型结合位点的2/3-IgG的本发明交换反应。
图32：获得的conAconB交换反应产物的分析性SEC色谱图。
图33：获得的conAconB交换反应产物非还原型CE-SDS色谱图。
图34：通过连续注射cMET标记的或Fluo标记的蛋白质获得的双特异性抗体<cMET>-臼-HC(conA)+<Fluo>-杵-c-His(ncB)的SPR传感图。
实施例
实施例1
2/3-IgG的设计和模块组成
总体评价
图1显示用于本发明方法中的2/3-IgG的设计和模块组成。这些2/3-IgG由以下三条独立链组成：一条轻链(通常情况下，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的全长轻链)、一条重链(通常情况下，包含重链可变结构域和全部重链恒定结构域(包含铰链区)的全长重链)，和一个重链Fc区多肽(通常情况下，包含铰链-CH2-CH3的重链Fc区片段)。轻链和重链可变结构域形成有功能的结合位点。重链(通常情况下，其衍生自人IgG1亚类)含有在CH3中能够实现杵入臼Fc区二聚体形成的杵-cys突变或臼-cys突变(在抗体重链的CH3结构域中的突变T366W和S354C称作“杵-cys突变”并且在抗体重链的CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V、Y349C称作“臼-cys突变”(根据Kabat EU索引编号))。重链Fc区多肽是所谓的‘虚拟-Fc’/HCFcRP(参见下文)，即缺少VH和CH1、N末端始于铰链区序列并且在其C末端携带His6标签的IgG1衍生物。此外，2/3-IgG的重链Fc区多肽在其CH3结构域中含有杵突变或臼突变(在抗体重链的CH3结构域中的突变T366W称作“杵突变”并且在抗体重链的CH3结构域中的突变T366S、L368A、Y407V称作“臼突变”(根据Kabat EU索引编号))。除杵-突变或臼-突变之外，重链Fc区多肽还相对于野生型序列分别包含引入一个(即单一附加)排斥性电荷的去稳定化突变：D356K或E357K或K370E或K439E；SEQ ID NO:35至38；这种突变的重链Fc区多肽在下文称作MHCFcRP。
取决于其中杵入臼突变的分布，重链和MHCFcRP可以形成两种类型的异二聚体：
i)重链-杵::MHCFcRP-臼，和
ii)重链-臼::MHCFcRP-杵。
然而，那些异二聚体或多或少‘有瑕疵’，因为互补性Fc区缺少与重链形成链间二硫键所必需的附加CH3半胱氨酸，并且这些异二聚体还含有无匹配性重链对应物的电荷突变。
实施例2
本发明2/3-IgG的表达和纯化
通过将编码轻链、重链(具有杵突变或臼突变)和匹配性MHCFcRP(臼或杵)的质粒借助现有技术共转染入哺乳动物细胞(例如HEK293)，实现2/3-IgG的表达。
更详细地，例如，为了通过瞬时转染(例如在HEK293细胞中)产生2/3-IgG，应用了基于有或无CMV-内含子A启动子的cDNA编制或基于有CMV启动子的基因组编制的表达质粒。
除了抗体表达盒之外，该质粒还含有：
-复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素耐药性，和
-作为真核细胞中选择标记的来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因。
每个抗体基因的转录单位由以下元件组成：
-在5'末端的单一限制性位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA编制的情况下后接内含子A序列，
-人抗体基因的5'非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-作为cDNA或处于基因组编制(免疫球蛋白外显子-内含子编制维持)的抗体链
-具有多聚腺苷化信号序列的3’非翻译区，和
-在3'末端的单一限制性位点。
包含抗体链的融合基因通过PCR和/或基因合成法生成并且通过已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸区段(例如利用相应质粒中的单一限制性位点)来组装。通过DNA测序验证亚克隆核酸序列。为了瞬时转染，从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)制备质粒，制得较大量的质粒。
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养物技术。
使用HEK293-F***(Invitrogen)，根据制造商的说明书，通过用相应质粒瞬时转染，产生2/3-IgG。简而言之，将摇瓶中或搅拌式发酵器中无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)内悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以密度1*106个细胞/mL接种在600mL中并且以120转/分钟，8％CO2孵育。该日之后，将细胞按大约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用大约42mL以下混合物转染：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)及600μg总质粒DNA(1μg/mL)以及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)。在发酵过程期间根据葡萄糖消耗量，添加葡萄糖溶液。正确组装的2/3-IgG像标准IgG那样分泌入培养上清液。5-10天后收获含有分泌的2/3-IgG的上清液并且将2/3-IgG直接从上清液纯化或将上清液冷冻并存储。
因为2/3-IgG含有Fc区，故通过应用标准蛋白A亲和色谱纯化它们。
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，瑞典)的亲和色谱和Superde x 200大小排阻(GE Healthcare，瑞典)色谱，从细胞培养上清液纯化抗体。
简而言之，在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 3.0柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分汇集并用2M Tris，pH 9.0中和。使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superde x 200 26/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱，通过大小排阻色谱进一步纯化抗体汇集物。将含有2/3-IgG的级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.，法国)浓缩至要求的浓度并储存在-80℃。
每种纯化步骤后使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science，美国)通过CE-SDS分析纯度和完整性。根据制造商的说明，使用HT蛋白质表达试剂盒，制备用于CE-SDS分析的蛋白质溶液(5μl)，并使用HT蛋白质表达芯片，在LabChip GXII***上分析该溶液。使用LabChip GX软件分析数据。
已经通过共表达编码L-链、H-链和MHCFcRP的相应质粒，产生以下2/3-IgG：
Figure BDA0002457664720001601
图3中显示相应的SEC色谱图。
除如上文概述的蛋白A方法之外，同样地可以使用蛋白质L。
简而言之，在用PBS缓冲液(10mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的KappaSelect树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤并且用50mM pH 2.5柠檬酸钠洗脱。将洗脱的抗体级分汇集并用1M Tris，pH 9.0中和。使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superde x 200 26/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱，通过大小排阻色谱进一步纯化抗体汇集物。将含有2/3-IgG的级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.，法国)浓缩至要求的浓度并储存在-80℃。
实施例3
通过2/3-IgG-交换反应生成双特异性抗体(bsAbs)
含有一条轻链、一条重链和MHCFcRP的2/3-IgG已经按两种类型的KiH异二聚体生成：全长重链-结::MHCFcRP-臼和全长重链-臼::MHCFcRP-结。两个类型的2/3-IgG均或多或少‘有瑕疵’，因为MHCFcRP缺少与重链形成链间二硫键所必需的附加CH3半胱氨酸，并且MHCFcRP含有未匹配全长重链对应物的电荷突变。然而，构成那些有瑕疵异二聚体的模块能够重排成如图4中所示的带匹配性电荷的双特异性异二聚体。2/3-IgG A的全长重链(杵-cys)和来自2/3-IgG B的全长重链(臼-cys)形成匹配性异二聚体。当MHCFcRP(臼电荷)与MHCFcRP(结电荷)相互作用时还形成匹配性异二聚体。因此，以临时分离的两种不同2/3-IgG的起始异二聚体为基础的交换反应产生了含有优先(电荷)匹配性异二聚体的产物。交换反应因此将两个单特异性2/3-IgG转化成一个双特异性IgG和一个MHCFcRP异二聚体：
2/3-IgG(A)-His6(8)+2/3-IgG(B)-His6(8)→bsAb(AB)+
Fc-His6(8)
该交换反应由特别破坏铰链区链间二硫键的还原步骤(例如，通过施加多种浓度的2-MEA或TCEP)引发。此后，链重排自发地发生。
应用不同的TCEP浓度以启动交换。
因此，在384孔
Figure BDA0002457664720001611
平板(Brooks,#1800030)上，将抗荧光素-2/3-IgG和抗生物胞素酰胺-2/3-IgG输入分子以等摩尔量按100μg/ml的蛋白质浓度在总体积40μl的含所示TCEP浓度的1xPBS+0.05％Tween20中混合。在离心后，将平板密封并在27℃孵育一小时。
生物素–荧光素桥式ELISA随后用来定量双特异性抗体。
因此，将白色
Figure BDA0002457664720001612
MaxiSorpTM384孔平板用1μg/ml白蛋白–荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma，#A9771)包被并在4℃孵育过夜。用90μl PBST-缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，添加封闭缓冲液(1xPBS，2％明胶，0.1％Tween-20)90μl/孔并在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤3次后，向每个孔添加25μl的1:10稀释的每种交换反应。在室温孵育一小时后，将平板用90μl PBST缓冲液再次洗涤3次。将0.5％BSA、0.025％Tween-20、1xPBS中的25μl/孔生物素-Cy5缀合物添加至终浓度0.1μg/ml并将平板在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤6次后，向每个孔添加25μl 1xPBS。在TecanSafire 2读数仪上于发射波长670nm(649nm处激发)测量Cy5荧光。
图5显示通过2/3-IgG-交换生成bsAbs的氧化还原条件的分析结果。应用TCEP以(部分地)还原重链Fc区多肽之间(即，全长的半IgG和MHCFcRP之间)的铰链二硫键。可以通过区分2/3-IgG输入物、bsAb输出物和MHCFcRP副产物的SEC鉴定链交换。图5中显示取决于2/3-IgG和TCEP之间比率的交换反应的产率(为了比较，在相同的反应时间后分析全部反应)。
全部2/3-IgG起始分子、交换反应期间潜在形成的全部不想要的副产物以及全部聚集物均携带亲和标签(His6或His8)。交换反应中产生的所需bsAb是不携带His标签的唯一分子。因此，单纯的NiNTA吸附步骤适用于移除全部不想要的分子(参见图6和图7)。剩余的bsAbs(未借助NiNTA吸附耗尽)可以直接适用于筛选程序并被分析以鉴定具有所需功能的bsAbs。
实施例4
对通过2/3-IgG交换反应生成的双特异性抗体(bsAbs)的功能评估
通过桥式ELISA测定法，评价作为2/3-IgG交换反应产物生成的bsAbs的双特异性功能。作为一个实例，图8显示通过本发明交换反应生成的抗荧光素/生物胞素酰胺双特异性抗体的结合结果。在反应中使用结合生物胞素酰胺(bio)的2/3-IgG和结合荧光素(fluos)的2/3-IgG作为起始分子。抗fluos/bio双特异性抗体的fluos结合臂与fluos-BSA包被的ELISA平板结合。仅当bsAb介导的通过bsAb的bio-结合臂捕获bio-Cy5时，后续暴露于bio-Cy5才生成信号。因为桥接介导的信号仅随bsAbs才出现，而不随单特异性Fluos结合物或Bio结合物出现，故测定法中使用仅2/3-IgG时，未观察到信号。因为这点并且因为交换反应未迫使分子聚集，这种桥式ELISA可以对交换反应混合物上直接进行，无需事先NiNTA介导的非bsAb分子耗尽。施加反应混合物时观察到的信号指示有功能的bsAbs成功生成和存在。借助桥式ELISA生成的信号取决于交换反应中所用的输入实体的量。
实施例5
如本文报道的交换反应发挥作用独立于起始2/3-IgG的结合特异性或V区组成
生成多种2/3-IgG，以评价2/3-IgG生成以及交换反应是否独立于其结合特异性和V区组成而对不同抗体有效，以及是否对不同抗体组合有效。
因此，使用对生物胞素酰胺(bio)、地高辛(dig)、荧光素(fluos)、LeY-糖(LeY)、VEGF和PDGF有结合特异性的2/3-IgG。通过共转染编码如上文所述的全长轻链、杵-全长重链或臼-全长重链和突变的重链Fc区多肽的表达质粒，生成这些。
Figure BDA0002457664720001631
Figure BDA0002457664720001641
SEQ ID NO:49-52描述了对dig、VEGF、PDGF和LeY有特异性的2/3-IgG的VH-CH1区。那些与SEQ ID NO:40和41的铰链-CH2-CH3区(即代替bio VH-CH1区)融合以产生具有所需特异性的完整H-链。用于生成这些分子的MHCFcRPs作为SEQ ID NO:35-38列出。
全部这些2/3-IgG均可以生成并在可比较条件下纯化至与标准IgG相似的产率(参见实施例2)。下表中显示表达这些具有不同结合特异性的2/3-IgG的实例。
Figure BDA0002457664720001642
在适用于生成不同特异性的bsAbs的交换矩阵中，使用如下表所示的全部组合中对荧光素、生物胞素酰胺、VEGF、PDGF和地高辛有结合特异性的2/3-IgG的组合。
Figure BDA0002457664720001651
通过桥式ELISA监测起始2/3-IgG的链交换和具有所需特异性组合的bsAbs的生成(参见实施例4)，其中施加匹配不同bsAb特异性组合的包被平板的抗原和生成信号的抗原-缀合物/复合物。
下表中显示应用于评估不同bsAb组合的功能的桥式ELISA结果。仅识别其作为捕获抗原或检测抗原存在的同族抗原对的bsAbs在桥式ELISA中生成信号。矩阵中生成的其他bsAbs因缺少至少一种特异性而为阴性。
表：桥式ELISA确认生成的bsAbs的功能。显示一种测定法内输入分子浓度1.3μM时的相对信号强度。最高值设置为100％作为参比。
N.a.＝不可得
Figure BDA0002457664720001652
Figure BDA0002457664720001661
Figure BDA0002457664720001662
Figure BDA0002457664720001671
Figure BDA0002457664720001672
Figure BDA0002457664720001673
Figure BDA0002457664720001681
Figure BDA0002457664720001682
Figure BDA0002457664720001691
对含有VEGF的双特异性抗体，已经进行相同的测定法。这些测定法也仅显示比相应组合的背景水平高的信号。
可以见到，本发明的交换反应是总体适用的方法：交换反应产生与起始分子的结合特异性或V区组成无关的有功能bsAb。
实施例6
样式变体的设计、组成和生成
实施例4的2/3-IgG-交换反应扩展至这样的起始分子，其在重链的C末端具有一个结合位点，或具有在N末端以及C末端含结合位点的重链。为了生成交换的bsAbs，交换驱动原理(将有瑕疵的输入异二聚体转化成匹配性输出的异二聚体)保持不变。MHCFcRPs的组成也如上文所述那样保留。
图1和图9至图10显示适用于生成不同bsAb样式的三个2/3-IgG样式的模块组成。2/3-IgG之一在N末端位置具有一个Fab臂。另一个2/3-IgG具有借助柔性接头与重链的C末端连接的Fab臂(即其N末端始于铰链区)。第三个2/3-IgG具有C末端Fab臂以及N末端Fab臂。
通过将编码轻链、重链(杵或臼)和相应MHCFcRP(臼或杵)的质粒共转染入哺乳动物细胞(例如HEK293)，实现这些2/3-IgG变体的表达(参见实施例2)。
修饰的用于生成不同bsAb样式的全长重链的序列如下：
Figure BDA0002457664720001701
2/3-IgG像标准IgG那样分泌入培养上清液并且由标准蛋白A亲和色谱纯化(参见实施例2)。大小排阻和质谱数据分析揭示纯化的2/3-IgG变体正确组装以及不存在不需要的二聚体和聚集物。2/3-IgG的表达产率类似于相同表达***中标准IgG所观察到的那些产率。下表中呈现相应的数据。
Figure BDA0002457664720001702
Figure BDA0002457664720001711
实施例7
表征处于不同价态、化学计量和几何形状的具有联合结合功能的bsAbs
可以在本发明方法中彼此组合三种不同的起始分子(具有N末端、C末端、N末端和C末端结合位点的2/3-IgG)以产生九个不同bsAb样式。这些分子在价态、几何形状和独立结合位点的位置方面相异。生成这些不同bsAbs的交换反应在与实施例3中概述的相同条件下进行。
所有类型的输入样式均‘有瑕疵’，因为MHCFcRP缺少与重链形成链间二硫键所必需的附加CH3半胱氨酸并且因其含有排斥性电荷突变(即无匹配性全长重链对应物的电荷)。在本发明的方法中，构成那些“有瑕疵”异二聚体的重链重排以形成(电荷和二硫键)匹配性异二聚体。不同类型的全长重链(杵-cys及臼-cys)形成匹配性异二聚体。匹配性异二聚体还从MHCFcRP(臼电荷及杵电荷)形成。
在不受这种理论约束的情况下，假定以临时分离两种不同2/3-IgG的有瑕疵异二聚体为基础的交换反产生了含有优先完美匹配性异二聚体的产物，所述异二聚体具有匹配性电荷和(如果存在)形成二硫键的半胱氨酸残基。交换因此将单特异性2/3-IgG转化成双特异性IgG(处于不同样式)，以及相应(无可变区，即无目标结合能力的)Fc区异二聚体。
为了描述交换反应，输入分子命名为：
-对于全长重链(H-链)的正常N末端处具有Fab臂的分子，‘nA或nB’，
-对于H-链的C末端处具有Fab臂的分子，‘cA或cB’，
-对于H-链的N末端以及其C末端具有Fab的分子，‘ncA或ncB’。
不同的样式-交换反应如下：
2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(nAnB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(nAcB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(nA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(nAncB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(cAcB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(cAnB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(cA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(cAncB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(nB)-His-标签→bsAb(ncAnB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(cB)-His-标签→bsAb(ncAcB)+Fc-His-标签
2/3-IgG(ncA)-His-标签+2/3-IgG(ncB)-His-标签→bsAb(ncAncB)+Fc-His-标签
交换反应由破坏链间(铰链区)二硫键的还原步骤引发，链重排此后自发地发生。全部输入分子、交换反应期间潜在可能形成的全部副产物以及全部聚集物均携带亲和标签(例如，His6标签或His8标签)。然而，交换反应的bsAb产物不携带亲和标签并且可以因此借助亲和力(例如NiNTA)吸附色谱分离。bsAbs(处于不同样式)可以直接适用于筛选程序和分析，以鉴定具有最佳功能的不同bsAbs样式并排序。
通过按照384孔MTP格式交换上述的输入2/3-IgG，生成双特异性样式，随后进行桥式ELISA以评估有功能的组装。因此，将交换配偶物(由含有臼-cys突变的全长重链和MHCFcRP-杵-K370E组成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突变的全长重链和MHCFcRP-臼-E357K组成的2/3-IgG分子2)按等摩尔量(4μM)在总体积100μl 1xPBS+0.05％Tween20中混合。将蛋白质溶液按1:2在384深孔平板(Greiner 384
Figure BDA0002457664720001731
)中稀释11次。在384孔
Figure BDA0002457664720001732
平板(Brooks，#1800030)上，将20μl来自稀释系列的每份样品与20μl 0.5mMTCEP溶液混合至蛋白质终浓度200–0.2μg/ml和0.25mM TCEP。在离心后，将平板密封并在37℃孵育一小时。
作为对照实施例，使用在一侧含有bio结合功能并且在另一侧含有荧光素结合功能的bsAbs。通过生物素–荧光素桥式ELISA评估所得的bsAbs的功能。因此，将白色
Figure BDA0002457664720001733
MaxiSorpTM384孔平板用1μg/ml白蛋白–荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma，#A9771)包被并在4℃孵育过夜。用90μl PBST-缓冲液(PBST，双蒸水，10xPBS Roche#11666789001+0.05％Tween 20)洗涤3次后，添加90μl/孔封闭缓冲液(1xPBS，2％BSA，0.1％Tween 20)并在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤3次后，向每个孔添加25μl的1:4稀释的每种交换反应。在室温孵育一小时后，将平板用90μl PBST缓冲液再次洗涤3次。将0.5％BSA、0.025％Tween 20、1xPBS中的25μl/孔生物素-Cy5缀合物添加至终浓度0.1μg/ml并将平板在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤6次后，向每个孔添加25μl 1xPBS。在Tecan Safire 2读数仪上于发射波长670nm(649nm处激发)测量Cy5荧光。
通过交换不同样式的2/3-IgG生成具有一个荧光素结合实体和一个生物胞素酰胺结合实体不同的bsAb样式。图11中显示输入分子和交换衍生的输出分子。
使用fluos-BSA作为捕获抗原并使用bio-Cy5检测双特异性桥接结合功能，通过如图12中所示的桥式ELISA评估生成的bsAbs的功能。全部不同样式均产生桥式ELISA信号。
这些结果显示了使用本发明方法，通过链交换反应以稳健和高通量兼容方式生成不同样式的可行性。
实施例8
通过2/3-IgG-交换生成有功能bsAbs和筛选/鉴定具有所需功能的bsAbs兼容于小型化和高通量以及自动化技术
应用高通量和自动化技术对操作大量不同的bsAbs(结合位点序列和/或样式相异)有利并且在许多情况下为必需。因此已经分析了是否可以小型化借助本发明的2/3-IgG交换方法生成bsAb以及分析/筛选因而生成的双特异性抗体的功能(即双特异性结合作用)，旨在兼容于高通量和自动化技术。
因此，在348孔平板中以小型化规模进行2/3-IgG交换反应并分析反应产物。
矩阵筛选按384孔MTP样式如下设置：将交换配偶物(由含有臼-cys突变的全长重链和MHCFcRP-杵-K370E组成的2/3-IgG分子1；由含有杵-cys突变的全长重链和MHCFcRP-臼-E357K组成的2/3-IgG分子2)按等摩尔量(4μM)在总体积30μl 1xPBS+0.05％Tween 20中混合。将蛋白质溶液按1:3在384深孔平板(Greiner 384
Figure BDA0002457664720001741
)中稀释四次。在384孔
Figure BDA0002457664720001742
平板(Brooks，#1800030)上，将20μl来自稀释系列的每份样品与20μl0.5mM TCEP溶液混合至蛋白质终浓度2μM–0.025μM和0.25mM TCEP。在离心后，将平板密封并在37℃孵育一小时。
随后通过桥式ELISA(参见上文)按小型化高通量样式评估因而生成的bsAbs的功能：将白色
Figure BDA0002457664720001743
MaxiSorpTM384孔平板用1μg/ml白蛋白–荧光素异硫氰酸酯缀合物(Sigma，#A9771)、1μg/ml PDGF(CST，#8912)或1μg/ml VEGF121包被并在4℃孵育过夜。用90μl PBST-缓冲液(PBST、双蒸水，10xPBS+0.05％Tween 20)洗涤3次后，添加封闭缓冲液(1xPBS，2％BSA，0.1％Tween 20)90μl/孔并在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤3次后，向每个孔添加25μl的1:4稀释的每种交换反应。在室温孵育1小时后，将平板用90μlPBST缓冲液再洗涤3次。将0.5％BSA、0.025％Tween 20、1xPBS中的25μl/孔生物素-Cy5缀合物或dig-Cy5缀合物添加至终浓度0.1μg/ml并将平板在室温孵育一小时。用90μl PBST缓冲液洗涤6次后，向每个孔添加25μl 1xPBS。在Tecan Safire 2读数仪上于发射波长670nm(649nm处激发)测量Cy5荧光。图13中显示采用结合VEGF或PDGF或dig或bio或fluos的2/3-IgG模块的交换反应和这些分析物的桥式ELISA详情。这些分析中一个示例性分析的结果示于图14中并且表明，可以进行2/3-IgG-交换反应和后续功能分析并且它们兼容于高通量和自动化技术。
实施例9
具有以一个结合位点靶向第一抗原并以两个其他结合位点靶向另一抗原的三个结合位点的bsAbs的生成
本发明的方法可以用于生成T细胞双特异性抗体(TCBs)。这些抗体可以具有如之前描述的样式(参见，例如WO 2013/026831)。对于TCB交换方案，一条H-链(具有如上文所述的杵-cys或臼-cys)含有相对于其铰链为N末端的结合CD3的CrossFab衍生实体，在N末端由抗体衍生的另一种导引实体进一步延长。该交换反应在上文描述的相同条件下实施并且产生携带CD3结合实体和两个附加结合实体的TCB。这些实体可以与靶细胞抗原结合。这些分子可以与T细胞上的CD3并与靶(例如肿瘤)细胞上的抗原同时结合并因而诱导对靶细胞的杀伤。
实施例10
设计和生成(在铰链区以及CH3结构域中)无Fc区链间二硫键的2/3-IgG
与含有Fc区(铰链区)二硫键的2/3-IgG的链交换需要还原作为初始步骤，以使链分离和后续组装所需的bsAbs成为可能。为避免还原步骤和移除还原剂的相关需求，生成了无铰链区二硫键的2/3-IgG。图15中显示原理。通过突变成丝氨酸，移除铰链区中负责铰链-二硫键形成的半胱氨酸残基。另外，已经省略位置354或349处形成KiH相关二硫键的CH3-半胱氨酸。相应的氨基酸序列是：
Figure BDA0002457664720001761
通过将编码轻链、全长重链(杵或臼)和和相应MHCFcRP(臼或杵)的质粒共转染入哺乳动物细胞(例如HEK293)，实现以上2/3-IgG的表达(参见实施例2)。2/3-IgG像标准IgG那样分泌入培养上清液并且此后由标准蛋白A亲和力和大小排阻色谱纯化(参见实施例2)。后续通过大小排阻色谱和SDS-PAGE分析所需的100kDa 2/3-IgG表达产物(图16)。这证明2/3-IgG正确组装以及不存在不需要的二聚体和聚集物。这令人惊讶，因为这类分子未用Fc区之间的二硫键(既无铰链区，也无CH3结构域)稳定化。下表中展示无Fc区链间二硫键的抗fluos-2/3-IgG和抗bio-2/3-IgG的纯化产率
Figure BDA0002457664720001762
Figure BDA0002457664720001771
实施例11
通过无还原的2/3-IgG-交换反应生成有功能的bsAbs
使不含有Fc区链间二硫键的2/3-IgG经历如上文所述的链交换反应(参见实施例3)，例外是省略初始还原步骤。这些2/3-IgG含有fluos-结合位点或bio-结合位点和没有全长重链和MHCFcRP之间链间二硫键的Fc区。实施例10中描述这些2/3-IgG的组成和产生。在无初始性还原的交换反应后，进行桥式ELISA以展示bsAbs的双特异性功能。该桥式ELISA包括向固定的fluos-BSA添加交换反应产物，随后是洗涤步骤和后续添加bio-Cy5，以探测bsAb的第2结合臂的存在(桥式ELISA详情参见先前实例)。仅正确组装的有功能bsAbs可以借助其fluos-结合位点结合于分析平板，通过捕获和保留bio-Cy5被保留并且生成信号。无双特异性的分子不生成信号，因为它们不结合于平板(仅含bio的结合物)或不能捕获生成信号的bio-Cy5(仅含fluos的结合物)。图17中显示这些分析的结果(在这个实施例中以2.5μM输入分子浓度进行交换反应，以纯化的bsAb作为阳性对照)。这些结果展示通过与没有Fc区链间二硫键的单特异性2/3-IgG输入分子的链交换，成功生成bsAb。生产性链交换在不要求初始还原的情况下发生。因此，移除Fc区多肽间二硫键消除了初始还原步骤的必要性。所得的bsAbs由非共价Fc-Fc相互作用结合在一起。消除Fc-Fc链间二硫键因此在无需还原的情况下允许相应的Fc区错配驱动的交换反应。
实施例12
链交换反应受部分去稳定化的全长重链–MHCFcRP界面驱动
使2/3-IgG转化成bsAbs的驱动物是全长重链和MHCFcRP之间的设计的‘有瑕疵’界面。这种人工排斥性界面是向MHCFcRP的杵-CH3结构域或臼-CH3结构域引入突变的结果。在表达2/3IgG期间MHCFcRP仍与相应(“正常”)的杵-配偶物或臼-配偶物缔合(参见以上实施例)。那些分子具有足够的稳定性，以将2/3-IgG展示为行为得体的分子，无不利的聚合倾向。
在不受这种理论约束的情况下，当两个互补性2/3-IgG近距离聚拢并且全长抗体重链::MHCFcRP对部分地彼此释放时，产生bsAbs的本发明交换反应发生。因为全长抗体重链(CH3)界面完美，故匹配性(即不带电荷排斥的)杵-臼全长重链的再组装应当在这类条件下是优先的。因此，形成的bsAb的全长重链优先地保持缔合，胜过部分不完美(电荷错配)的2/3-IgG分子的再形成。因此，设计的部分去稳定化(电荷排斥)的CH3界面是成功的定向链交换反应的关键参数。
可以通过突变MHCFcRP的CH3残基，同时维持全长抗体重链上的相互作用性残基，实现Fc界面、尤其CH3-CH3界面的部分去稳定化。
下表中提供可以向MHCFcRP的CH3结构域引入的影响全长抗体重链::MHCFcRP界面的示例性突变。
Figure BDA0002457664720001781
Figure BDA0002457664720001791
这些突变中的某些包括向界面安置改变的电荷的交换。电荷突变削弱或破坏先前存在的稳定化电荷对或产生排斥效应或产生前两者。
类似地，可以引入侧链大小不同的氨基酸以生成空间排斥效应。这类突变削弱或干扰现有疏水界面相互作用或生成空间位阻或兼具前两者。
通过电荷效应和/或空间效应而部分去稳定化的突变也可以组合彼此。
另外，含有向其MHCFcRP引入的电荷改变和/或空间改变的第一2/3-IgG可以与含有向其MHCFcRP引入的不同电荷改变和/或空间改变(其匹配来自第一2/3-IgG的MHCFcRP的那些改变)的第二2/3-IgG组合。
2/3-IgG以及所得的bsAbs按其中配对的CH3结构域在一侧携带杵-突变并在另一侧携带臼-突变的方式装配。因此，‘回复突变’成MHCFcRP的相应杵残基或臼残基的野生型组成也产生界面扰动。下表中列出杵CH3结构域或臼CH3结构域与野生型结构域的这类组合。
Figure BDA0002457664720001792
Figure BDA0002457664720001801
这些回复突变可以适用于部分去稳定化的CH3-CH3界面。
这些回复突变也可以与其他扰动性突变(包括前表中所述的那些)组合使用。
也可以按照以下方式选择如上文所述的所有部分扰动性的独立突变或突变组合：它们使2/3-IgG部分地去稳定化，然而使杵-MHCFcRP::臼-MHCFcRP异二聚体作为交换反应的第2产物稳定化，因而使反应平衡进一步移向产物侧(交换反应)。
实施例13
设计含有非抗体部分的2/3-IgG和链-交换反应，使得靶向成为可能
本发明的交换反应利用CH3杵-实体和-臼实体之间的界面突变驱动链交换反应。图18展示了原理：各自具有由‘不完美’Fc-界面组成的H-链异二聚体的两个分子的相互作用交换其H-链以形成各自具有‘完美’H-H链界面的两种新实体。该原理可以适用于生成双特异性抗体和样式的大量变体，例如用于筛选目的。
茎-单元可以与任何结合物(例如，非抗体部分)一起使用。设计一种分子，所述分子含有替换2/3-IgG中常规Fab结合单元的非抗体结合单元，一种靶向HER2的亲和体(ZHER2:342；Orlova等人,Cancer Res.66(2006)4339-4348)。两条多肽链的氨基酸序列是SEQ ID NO:83和84。根据本发明的原理在这种情况下也适用并且尤其对图19中显示的这种交换反应是这样。
已经如实施例2中所概述那样产生分子并且已经如实施例3中所概述那样进行交换反应。
更详细地，通过基因合成或诱变生成用于表达的序列并将其克隆入基于CMV启动子的表达质粒。这些构建体在其结合实体中携带应经历本发明链交换反应的Her2亲和体结合物。
根据生产商的说明，在FreeStyleTM293-F细胞(Invitrogen)中进行瞬时表达。简而言之，将摇瓶中无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)内悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293-fectinTM(Invitrogen)转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以密度1*106个细胞/mL接种在600mL中并且以120转/分钟，8％CO2孵育。次日，将细胞按大约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用20mL Opti-MEM(Invitrogen)及600μg总质粒DNA(1μg/mL)以及20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin(2μL/mL)的大约42mL混合物转染。在表达期间根据生产商的方案添加浓剂葡萄糖溶液和补料溶液。正确组装的蛋白质分泌入培养上清液。转染后6天，收获上清液。
通过使用cOmpleteTM His标签纯化树脂的亲和色谱(Roche、瑞士)，随后是Superdex 200大小排除(GE Healthcare，瑞典)色谱，纯化含有亲和体的蛋白质。简而言之，在用50mM Na2HPO4和300mM NaCl，pH 7.4平衡的cOmpleteTM His标签纯化树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤并且用50mM Na2HPO4、300mM NaCl和250mM咪唑，pH 7.4洗脱。将洗脱的蛋白质级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius StedimBiotech S.A.,法国)浓缩至总体积2ml并且使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superdex 200 16/60GL(GE Healthcare，瑞典)柱，通过大小排阻色谱进一步纯化。将含有蛋白质的级分汇集，浓缩至要求的浓度并储存在-80℃。
图20(亲和纯化后的SEC图谱)和图21(纯化材料的SDS-PAGE)中显示纯度和正确组成。产量与其他含有Fab的2/3-IgG相当(5.8mg/L培养物)。
用携带非抗体亲和体部分的蛋白质进行本发明的交换反应。因此，将蛋白质与靶向LeY的前药分子(交换反应方案参见图19)按各自2μM在总体积300μl中于pH 6.0的20mM组氨酸，140mM NaCl内混合，随后在37℃孵育1小时。
通过ELISA展示前药实体与有功能结合分子成功发生本发明的交换反应。图22中显示ELISA分析原理。反应物携带His标签，但尚无有功能的抗原结合实体，即生物素-结合实体。仅当链交换时，才形成生物素结合位点(VH/VL对，抗生物素Fv)，所述位点是有功能的结合位点并且允许Bio-Cy5捕获和荧光信号检测。为了进行ELISA，将样品在含1％(w/v)牛血清白蛋白的1xPBS中稀释至1μM反应物蛋白质浓度，按100μl施加至Black
Figure BDA0002457664720001821
镍包被96孔板(Thermo Fisher Scientific，USA)并且在室温孵育一小时。用250μl PBST缓冲液(1xPBS+0.05％Tween 20)洗涤三次用后，添加PBST中的100μl 100ng/ml生物素-Cy5缀合物。此后实施在室温孵育一小时。用250μl PBST-缓冲液洗涤四次之后，添加100μl PBST至每个孔。在Tecan Infinite M200 Pro读数仪上于发射波长675nm(647nm处激发)测量Cy5荧光。图23显示ELISA结果并且揭示成功的链交换和从无活性前药实体活化结合性Fv。这表明非抗体部分可以用于本发明的交换反应中并且因而用于前药活化。
实施例14
镍亲和色谱
可以使用镍亲和色谱移除未反应的起始材料以及携带组氨酸标签的交换产物。
根据生产商的说明，使用0.2ml HisPurTM Ni-NTA离心柱(ThermoScientific)进行镍亲和色谱。将交换反应的粗制反应混合物施加至平衡的柱。为了增加样品和基于琼脂糖的亲和材料之间接触，将柱在室温孵育一小时。任选地，可以在孵育期间将柱离心。通过通流模式下离心用洗涤缓冲液洗脱未结合的材料。在洗涤三次后，根据生产商的说明使用洗脱缓冲液，洗脱结合的材料。
实施例15
表达和纯化本发明的Fab-延长型-2/3-IgG
通过将编码Fab-延长型-轻链、Fab-延长型-重链(具有杵突变或臼突变)和匹配性MHCFcRP(臼或杵)的质粒借助现有技术共转染入哺乳动物细胞(例如HEK293)，实现Fab-延长型-2/3-IgG的表达。
更详细地，例如，为了通过瞬时转染(例如在HEK293细胞中)产生Fab-延长型-2/3-IgG，应用了基于有或无CMV-内含子A启动子的cDNA编制或基于有CMV启动子的基因组编制的表达质粒。该质粒含有一个用于Fab-延长型-重链的表达盒和各自用于两条轻链的表达盒。
除了抗体表达盒之外，该质粒还含有：
-复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌中复制，
-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素耐药性，和
-作为真核细胞中选择标记的来自小家鼠(Mus musculus)的二氢叶酸还原酶基因。
每个抗体基因的转录单位由以下元件组成：
-在5'末端的单一限制性位点
-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，
-在cDNA编制的情况下后接内含子A序列，
-人抗体基因的5'非翻译区，
-免疫球蛋白重链信号序列，
-作为cDNA或处于基因组编制(免疫球蛋白外显子-内含子编制维持)的相应抗体链，
-具有多聚腺苷化信号序列的3’非翻译区，和
-在3'末端的单一限制性位点。
融合基因通过PCR和/或基因合成法生成并且通过已知的重组方法和技术，通过连接相应的核酸区段(例如利用相应质粒中的单一限制性位点)来组装。通过DNA测序验证亚克隆核酸序列。为了瞬时转染，从转化的大肠杆菌培养物(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)制备质粒，制得较大量的质粒。
使用如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.和Yamada,K.M.(编著),John Wiley&Sons,Inc.中所述的标准细胞培养物技术。
使用HEK293-F***(Invitrogen)，根据制造商的说明书，通过用相应质粒瞬时转染，产生Fab-延长型-2/3-IgG。简而言之，将摇瓶中或搅拌式发酵器中无血清FreeStyleTM293表达培养基(Invitrogen)内悬浮生长的HEK293-F细胞(Invitrogen)用相应表达质粒和293fectinTM或fectin(Invitrogen)转染。对于2L摇瓶(Corning)，将HEK293-F细胞以密度1*106个细胞/mL接种在600mL中并且以120转/分钟，8％CO2孵育。该日之后，将细胞按大约1.5*106个细胞/mL的细胞密度用大约42mL以下混合物转染：A)20mL Opti-MEM(Invitrogen)及600μg总质粒DNA(1μg/mL)以及B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μL/mL)。在发酵过程期间根据葡萄糖消耗量，添加葡萄糖溶液。正确组装的Fab-延长型-2/3-IgG像标准IgG那样分泌入培养上清液。5-10天后收获含有分泌的Fab-延长型-2/3-IgG的上清液并且将Fab-延长型-2/3-IgG直接从上清液纯化或将上清液冷冻并存储。
因为Fab-延长型-2/3-IgG含有Fc区，故通过应用标准蛋白A亲和色谱纯化它们。
通过使用MabSelectSure-SepharoseTM(GE Healthcare，瑞典)的亲和色谱和Superde x 200大小排阻(GE Healthcare，瑞典)色谱，从细胞培养上清液纯化抗体。
简而言之，在用PBS缓冲液(10Mm Na2HPO4，1mM KH2PO4，137mM NaCl和2.7mM KCl，pH 7.4)平衡的MabSelectSuRe树脂上捕获无菌过滤的细胞培养上清液，用平衡缓冲液洗涤并且用25mM pH 3.0柠檬酸钠洗脱。将洗脱的Fab-延长型-2/3-IgG级分汇集并用2M Tris，pH 9.0中和。使用以20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0平衡的Superde x 20026/60GL(GEHealthcare，瑞典)柱，通过大小排阻色谱进一步纯化汇集物。将含有Fab-延长型-2/3-IgG的级分汇集，使用Vivaspin超滤装置(Sartorius Stedim Biotech S.A.，法国)浓缩至要求的浓度并储存在-80℃。
每种纯化步骤后使用微流体Labchip技术(Caliper Life Science，美国)通过CE-SDS分析纯度和完整性。根据制造商的说明，使用HT蛋白质表达试剂盒，制备用于CE-SDS分析的蛋白质溶液(5μl)，并使用HT蛋白质表达芯片，在LabChip GXII***上分析该溶液。使用LabChip GX软件分析数据。
已经通过共表达编码L-链、H-链和MHCFcRP的相应质粒，产生以下示例性Fab-延长型-2/3-IgG：抗荧光素-抗CD3-2/3-IgG-杵-cys+抗生物素-E357K-臼-MHCFcRP。图27中显示相应的SEC色谱图。根据SEC的单体含量是93.4％。根据CE-SDS的单体含量是100％。通过MS确认质量。
实施例16
以Fab-延长型-2/3-IgG为起始材料，通过2/3-IgG-交换反应生成双特异性抗体(bsAbs)
含有两条轻链、一条重链和MHCFcRP的Fab-延长型-2/3-IgG已经作为KiH异二聚体生成：全长重链-杵::MHCFcRP-臼。Fab-延长型-2/3-IgG多少‘有瑕疵’，因为MHCFcRP含有在全长重链对应物中无匹配性电荷的电荷突变。然而，构成那些有瑕疵异二聚体的模块能够重排成带匹配性电荷的双特异性异二聚体。Fab-延长型-2/3-IgG A的全长重链(杵)和来自2/3-IgG B的全长重链(臼)形成匹配性异二聚体。当MHCFcRP(臼电荷)与MHCFcRP(杵电荷)相互作用时还形成匹配性异二聚体。因此，以临时分离两种不同2/3-IgG的起始异二聚体为基础的交换反应产生了含有优先(电荷)匹配性异二聚体的产物。交换反应因此将两个单特异性2/3-IgG转化成一个双特异性IgG和一个MHCFcRP异二聚体：
Fab延长的-2/3-IgG-His6(8)+2/3-IgG-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)
该交换反应由特别破坏铰链区链间二硫键的还原步骤(例如，通过施加多种浓度的2-MEA或TCEP)引发。此后，链重排自发地发生。
采用如图26中所示Fab-延长型2/3-IgG的三个交换反应的程序如下：
将1mg Fab-延长型-2/3-IgG(dA)与1mg相应的2/3-IgG样式(nB或cB或ncB)在1xPBS-缓冲液中以总体积2ml混合。向混合物添加1xPBS-缓冲液中的16x摩尔当量的TCEP。将样品在37℃和350转/分钟搅拌下孵育一小时。在孵育时间后，通过NiNTA色谱柱(HisCompleteTM,Roche,巴赛尔，瑞士)纯化样品并且收集通流中的已组装双特异性抗体。在室温进一步孵育通流过夜。随后通过分析性SEC、CE-SDS和质谱法方法分析样品。
下表中展示交换反应的结果：
Figure BDA0002457664720001861
使用BIAcore T200仪(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究与生物素和FITC的结合。使用HBS-P(10mM HEPES、140mM NaCl、0.05％Tween 20pH 7.4)作为运行缓冲液和稀释缓冲液，在25℃进行全部实验。使用标准胺偶联化学，将抗人Fc抗体(GEHealthcare#BR100839)固定在Series S CM5传感芯片(GE Healthcare#29104988)上。将双特异性抗体捕获到该表面上，随后连续注射生物素标记的或FITC标记的蛋白质(一旦首先是生物素标记的，则其次是FITC标记的，并且一旦首先已经注射FITC标记的，则其次注射生物素标记的)。监测缔合过程60秒，在浓度10μg/ml各自解离120秒。通过注射3M MgCl2持续60秒，使表面再生。通过扣减从模拟表面获得的响应值，修正本体折射率差异。扣减空白注射(双参考)。图28中显示双特异性抗体<FITC><CD3>-杵-HC(dA)+<Biotin>-臼-nc-His(ncB)的两幅示例性SPR传感图(两幅传感图代表生物素第一添加、FITC第二添加和FITC第一添加、生物素第二添加)。
下表中显示全部组合的结果：
Figure BDA0002457664720001871
全部起始分子、交换反应期间潜在形成的全部不想要的副产物以及全部聚集物均携带亲和标签(His6或His8)。交换反应中产生的所需双特异性抗体是不携带His标签的唯一分子。因此，单纯的NiNTA吸附步骤可以适用于移除全部不想要的分子。剩余的来自通流的双特异性抗体可以直接适用于筛选程序和分析，以鉴定具有所需功能的双特异性抗体。
实施例17
交换反应后纯化用替代性标签
在这些实验中已经使用EPEA C标签(SEQ ID NO:87)替代多组氨酸标签，以显示交换反应不受所用的标签影响。
已经表达并使用C标签纯化如同实施例6中那些的2/3-IgG，所述C标签具有与相应末端融合的短接头(SEQ ID NO:88)。下表中显示产生和纯化这些2/3-IgG的结果。
Figure BDA0002457664720001872
Figure BDA0002457664720001881
交换反应如下进行：
混合各自300μl相应的起始2/3-IgG(浓度＝1mg/ml；总计600μl)。按15x摩尔过量添加TCEP。将样品在37℃和400转/分钟孵育。将360μl样品与200μl C标签树脂(ThermoScientific；用1xPBS pH 7.4洗涤过的50％浆液)混合并且孵育在离心杯柱中于室温和800转/分钟搅拌60分钟。在孵育后，将离心柱在室温，800转/分钟离心5分钟并收集通流。将树脂用1xPBS pH 7.4(100μl和后续离心步骤)洗涤几次。在洗涤后，将树脂样品与100μl HCl-缓冲液pH 2.6混合并于室温和800转/分钟搅拌时孵育30分钟。通过在室温和800转/分钟离心5分钟，产生洗脱物。
图29中显示2/3-IgG A(Fluo-杵-n-HC+臼-MHCFcRP(E357K)-C-标签)与2/3-IgG B(生物素-臼-n-HC+杵-MHCFcRP(K370E)-C-标签)的示例***换反应的非还原型CE-SDS色谱图。可以见到，双特异性抗体形成并且可以收集于通流中。加C标签的MHCFcRP在交换反应后结合于C标签树脂并且可以从其中洗脱。因而实现分离和纯化。
实施例18
通过无还原的2/3-IgG-交换反应生成双特异性抗体
与含有Fc区二硫键的2/3-IgG的链交换需要还原作为初始步骤，以使链分离和后续再组装以形成所需的双特异性抗体成为可能。为了避免还原步骤和与之相关的副反应(因为2/3-IgG还含有非铰链二硫键(二硫键改组))，故生成H-链Fc和MHCFcRP Fc之间无二硫键的2/3-IgG。通过突变杵半部分抗体和臼半部分抗体中负责铰链-二硫键形成的半胱氨酸，以及杵MHCFcRP链或臼MHCFcRP链的半胱氨酸，实现这点。还移除了半部分抗体之间形成KiH相关的链间二硫键的CH3-半胱氨酸。
为了消除形成H-H链间二硫键的两个半胱氨酸，通过将其H-链铰链区中的两个半胱氨酸交换成丝氨酸，生成无铰链-链间二硫键的IgG1-衍生物。因而，改变野生型IgG1…HTCPXCP..(SEQ ID NO:31)的铰链区序列以编码…HTSPXSP..(SEQ ID NO:85)。
通过删除铰链区的促成链间二硫键形成的整个序列段，生成另一个无铰链-链间二硫键的实体。因此，删除通常IgG1的铰链区的CPPC序列以产生具有序列…HTPAPE...(SEQID NO:86)的更短铰链。
图25显示，用丝氨酸替换半胱氨酸生成了因释放否则限制的铰链二硫键而具有延长的跨越距离的抗体。
通过将CMV-启动子驱动的表达质粒按照如上文对含有二硫键的实体所述的相同方式共转染入哺乳动物细胞，实现无HC-HC-链间二硫键的2/3IgG的表达。表达质粒向HEK293细胞的瞬时转染导致CMV-启动子驱动的独立2/3-IgG共表达、在分泌区室中组装及后续分泌入培养上清液。
无HC-HC链间二硫键的2/3IgG分泌入细胞培养上清液并且携带Fc区以及κL-链。因此通过第一步骤中用蛋白A或用KappaSelect树脂捕获，纯化它们。后续步骤是通过大小排阻色谱(SEC)根据大小分离。这种2步骤方案使得以稳健和有效方式从细胞培养上清液高效回收2/3IgG衍生物成为可能，产率类似于随标准抗体观察到的那些产率。
实施例19
通过无还原的2/3-IgG-交换反应产生双特异性抗体
含有一条轻链、一条重链和互补性Fc区的2/3-IgG已经按两种类型的KiH异二聚体生成：重链-杵::相应的Fc区-臼和重链-臼::相应的Fc区-杵。两个类型的2/3IgG‘有瑕疵’，因为互补性Fc区含有无匹配性H-链对应物的电荷突变。然而，构成那些有瑕疵异二聚体的模块能够重排成完美异二聚体：2/3-IgG A的重链(杵)和来自2/3-IgG B的重链(臼)形成完美异二聚体。当互补性Fc区(臼电荷)与互补性Fc区(杵电荷)相互作用时，完美异二聚体也形成。因此，以临时分离两个不同2/3-IgG类型的起始异二聚体为基础的交换反应产生了含有优先完美异二聚体的产物。交换反应因此将两个单特异性2/3-IgG转化成一个双特异性IgG和一个互补性Fc区异二聚体。
如先前实例中所示，必须通过还原步骤引发含有CH3杵-臼和/或铰链-链间二硫键的最初2/3-IgG的交换反应。添加还原剂如TCEP以破坏二硫键，此后链重排出现发生。相反，无链间HC-HC二硫键的2/3-IgG衍生物不需要启动链交换的还原步骤，因为它们的H-链未经二硫键相互连接。
为了分析2/3-IgG转化成bsAbs是否和多大程度取决于初始还原，在还原情况下或无还原情况下进行2/3-IgG(无和有链间二硫键)交换反应。使用结合Bio或Fluos的单价单特异性2/3-IgG(上文所述)作为输入分子。作为结果，交换反应生成结合Bio及Fluos的双价双特异性bsAbs。通过如上文所述的桥式ELISA评估生成的bsAbs的形成和双特异性功能。该桥式ELISA由以下组成：向固定的Fluos-BSA添加交换反应混合物，随后是洗涤步骤和后续添加Bio-Cy5，以探测双特异性抗体的第2结合臂的存在。仅正确组装的有功能双特异性抗体借助其Fluos-结合臂保留于分析平板上，并且通过捕获和保留Bio-Cy5生成信号并因而生成分析信号。无双特异性的单特异性输入分子或‘虚假’分子不生成信号，因为它们不结合于平板(仅Bio-结合物)或不能捕获生成信号的Bio-Cy5(仅Fluos-结合物)。
图24显示这些桥式ELISA分析具有及没有初始性还原步骤的亲本(含有链间二硫键)和缺少H-H链间二硫键的2/3-IgG交换反应的结果。分析平板上的Fluos-结合臂通过捕获和保留Bio-Cy5生成信号并因而生成分析信号。单特异性输入分子或无双特异性的‘虚假’分子不生成信号，因为它们不结合于平板(仅Bio-结合物)或不能捕获生成信号的Bio-Cy5(仅Fluos-结合物)。图24显示这些桥式ELISA分析具有及没有初始性还原步骤的亲本(含有链间二硫键)和缺少H-H链间二硫键的2/3-IgG交换反应的结果。我们观察到初始还原对能够实现含有铰链二硫键的2/3-IgG的链交换是必需的。仅通过还原引发交换时，那些具有铰链二硫键的2/3-IgG才转化成双特异性抗体。相反，施加无铰链(和CH3)链间二硫键的2/3-IgG，实现有效的双特异性抗体生成。那些分子的链交换在还原性条件下按照如上文对铰链连接的输入分子所述的相同方式生成双特异性抗体。但是，初始性还原对这些分子的生产性链交换并非必需，因为生产性链交换还在无初始性还原(即在还原剂不存在的情况下)的情况下发生。因此，移除Fc-Fc链间二硫键消除了初始还原步骤的必要性。所得的双特异性抗体在无铰链区链间二硫键的情况下维系在一起。因此，一旦组合那些无铰链二硫键的2/3-IgG时，双特异性抗体的有效形成以自发方式发生，并且当使用无HC-HC-链二硫键的2/3-IgG时，可以省去启动交换反应的还原步骤。
实施例20
链交换反应呈浓度依赖性
使2/3-IgG转化成双特异性抗体的驱动物是Fc区之间的设计的‘部分有瑕疵’界面。这种特殊界面是向MHCFcRP Fc分子的杵-CH3结构域或臼-CH3结构域引入突变的结果。在表达2/3IgG期间，突变的CH3结构域仍与相应的正常杵-配偶物或臼-配偶物缔合。那些分子也足够稳定，以将2/3-IgG展示为行为得体的分子，无不利的聚合倾向。当两个互补性2/3-IgG近距离聚拢并且H-链::MHCFcRP对部分地彼此释放时，产生双特异性抗体的生产性链交换反应发生。杵-臼H-链再组装以形成无去稳定化突变的双特异性抗体在这类条件下有利，因为那些H-链(CH3)界面匹配得更好。因此，双特异性抗体产物的链优先地保持缔合，胜过部分不完美的2/3-IgG输入分子的再形成。因为这点，设计的部分去稳定化的CH3界面是成功的定向链交换反应的关键参数。可以通过如前文所述那样突变MHCFcRP的CH3残基，实现Fc界面的部分去稳定化。
发生交换反应的另一个必备要求(除部分去稳定化的界面之外)是，两个互补性2/3-IgG必须靠近以能够实现链交换。实体靠近的概率转而应当取决于它们在交换反应中的浓度。
按不同浓度施加无HC-HC链间二硫键的结合Bio和结合Fluos的2/3-IgG，在非还原条件下建立交换反应。在交换反应完成后，通过用交换缓冲液稀释具有较高离析物浓度的样品至最低实验样品浓度，将全部反应混合物补足至‘相等的离析物浓度’。随后使用桥式ELISA测定每份实验样品中有功能bsAb的相对量。因为相同量的离析物存在于稀释度齐整的样品中，浓度非依赖性将在全部样品产生相等/相似的ELISA值。反之，反应中伴随较高离析物浓度的连续增加的信号将指示链交换的浓度依赖性。这些分析的结果揭示ELISA信号在含有>2μM离析物浓度的反应中达到平顶(plateau)。因此，在这些浓度和高于这些浓度时，离析物浓度对交换反应的效能仅具备有限影响。较低的离析物浓度生成以剂量依赖性方式减弱的ELISA信号。因此，在某个阈值以下，借助交换生成bsAb显著地受离析物浓度影响，原因在于离析物相互作用发生的概率降低。图30中显示结果。
Figure BDA0002457664720001921
实施例21
以约束型2/3-IgG作为起始材料，通过2/3-IgG-交换反应生成双特异性抗体(bsAbs)
约束型2/3-IgG呈环状并且通过相对于Fc区为N末端的第一部分和相对于Fc区为C末端的第二部分形成结合位点，其中第一部分和第二部分彼此缔合并形成结合位点，并且MHCFcRP已经作为KiH异二聚体生成：全长环状重链-杵::MHCFcRP-臼。约束型2/3-IgG或多或少‘有瑕疵’，因为MHCFcRP缺少与重链形成链间二硫键所必需的附加CH3半胱氨酸，并且MHCFcRP含有无全长重链对应物中匹配性电荷的电荷突变。然而，构成那些有瑕疵异二聚体的模块能够重排成带匹配性电荷的双特异性异二聚体。2/3-IgG A的全长或全长约束型重链(杵-cys)和来自2/3-IgG B的全长或约束重链(臼-cys)形成匹配性异二聚体。当MHCFcRP(臼电荷)与MHCFcRP(杵电荷)相互作用时还形成匹配性异二聚体。因此，以临时分离两种不同2/3-IgG的起始异二聚体为基础的交换反应产生了含有优先(电荷)匹配性异二聚体的产物。交换反应因此将两个单特异性2/3-IgG转化成一个双特异性IgG和一个MHCFcRP异二聚体：
约束型2/3-IgG-His6(8)+2/3-IgG-His6(8)→bsAb(AB)+Fc-His6(8)
该交换反应由特别破坏铰链区链间二硫键的还原步骤引发。此后，链重排自发地发生。
如图31中所示的交换反应的程序如下：
将1mg的“输入样式A”与1mg的“输入样式B”在1x PBS-缓冲液中以总体积2ml混合。向混合物添加1xPBS-缓冲液中的16x摩尔当量的TCEP。将样品在37℃和350转/分钟搅拌下孵育一小时。在孵育时间后，通过NiNTA色谱柱(HisCompleteTM,Roche,瑞士)纯化样品并且收集通流中的已组装双特异性抗体。在室温进一步孵育通流过夜。随后通过分析性SEC、CE-SDS和质谱法方法分析样品。
下表中展示交换反应的结果：
Figure BDA0002457664720001941
使用BIAcore T200仪(GE Healthcare)，通过表面等离子体共振研究与c-MET、生物素和FITC的结合。使用HBS-P(10mM HEPES、140mM NaCl、0.05％Tween 20pH 7.4)作为运行缓冲液和稀释缓冲液，在25℃进行全部实验。使用标准胺偶联化学，将抗人His标签抗体(GE Healthcare#28995056)固定在Series S CM5传感芯片(GE Healthcare#29104988)上。将C-MET-Fc(R&D Systems#358-MT)注射到该表面上，随后注射浓度各自为10μg/ml的生物素标记的蛋白质或FITC标记的蛋白质。测量每个结合事件的解离相和解离相2分钟。通过注射10mM甘氨酸pH 1.5持续60秒，使表面再生。通过扣减从模拟表面获得的响应值，修正本体折射率差异。扣减空白注射(双参考)。
在第二设置下，将c-MET及抗人Fc抗体(GE Healthcare#BR100839)固定在SeriesS CM5传感芯片上。将对照抗体(contorsbody)以10μg/ml的浓度注射到两个流动小室上持续30秒。通过注射3M MgCl2持续60秒，使表面再生。通过扣减从模拟表面获得的响应值，修正本体折射率差异。扣减空白注射(双参考)。为了评价，将所得的c-MET结合响应对衍生自抗人Fc抗体结合的响应归一化。图33中显示双特异性抗体<cMET>-臼-con-HC(conA)+<Fluo>-杵-c-His(cB)的示例性SPR传感图。
下表中显示全部组合的结果：
Figure BDA0002457664720001951
n/a表示相应的结合位点不存在于双特异性抗体中并且因而可以预计无结合作用。
全部起始分子、交换反应期间潜在形成的全部不想要的副产物以及全部聚集物均携带亲和标签(His6或His8)。交换反应中产生的所需双特异性抗体是不携带His标签的唯一分子。因此，单纯的NiNTA吸附步骤可以适用于移除全部不想要的分子。剩余的来自通流的双特异性抗体可以直接适用于筛选程序和分析，以鉴定具有所需功能的双特异性抗体。
Figure IDA0002457664790000011
Figure IDA0002457664790000021
Figure IDA0002457664790000031
Figure IDA0002457664790000041
Figure IDA0002457664790000051
Figure IDA0002457664790000061
Figure IDA0002457664790000071
Figure IDA0002457664790000081
Figure IDA0002457664790000091
Figure IDA0002457664790000101
Figure IDA0002457664790000111
Figure IDA0002457664790000121
Figure IDA0002457664790000131
Figure IDA0002457664790000141
Figure IDA0002457664790000151
Figure IDA0002457664790000161
Figure IDA0002457664790000171
Figure IDA0002457664790000181
Figure IDA0002457664790000191
Figure IDA0002457664790000201
Figure IDA0002457664790000211
Figure IDA0002457664790000221
Figure IDA0002457664790000231
Figure IDA0002457664790000241
Figure IDA0002457664790000251
Figure IDA0002457664790000261
Figure IDA0002457664790000271
Figure IDA0002457664790000281
Figure IDA0002457664790000291
Figure IDA0002457664790000301
Figure IDA0002457664790000311
Figure IDA0002457664790000321
Figure IDA0002457664790000331
Figure IDA0002457664790000341
Figure IDA0002457664790000351
Figure IDA0002457664790000361
Figure IDA0002457664790000371
Figure IDA0002457664790000381
Figure IDA0002457664790000391
Figure IDA0002457664790000401
Figure IDA0002457664790000411
Figure IDA0002457664790000421
Figure IDA0002457664790000431
Figure IDA0002457664790000441
Figure IDA0002457664790000451
Figure IDA0002457664790000461
Figure IDA0002457664790000471
Figure IDA0002457664790000481
Figure IDA0002457664790000491
Figure IDA0002457664790000501
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Figure IDA0002457664790000521
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Figure IDA0002457664790000551
Figure IDA0002457664790000561
Figure IDA0002457664790000571
Figure IDA0002457664790000581

Claims (46)

1.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第二多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)下的突变不同并且增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
和
第二多聚体，其包含
b-1)第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
b-2)第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-3)如若第一多肽包含突变臼-cys，则第四多肽包含突变杵-cys并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵-cys，则第四多肽包含突变臼-cys并且第三多肽包含突变杵，
b-4)第三多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)、a-4)和b-3)下的突变不同并且增加第二多聚体的CH3-CH3结合自由能，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生所述多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中a-4)下的突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，b-4)下的突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
3.根据权利要求1所述的方法，其中a-4)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，b-4)下的突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，并且其中第四和/或第三多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
5.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第二多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)下的突变不同并且增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
a-5)第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，
和
第二多聚体，其包含
b-1)第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
b-2)第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-3)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-4)第三多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)、a-4)和b-3)下的突变不同并且增加第二多聚体的CH3-CH3结合自由能，
b-5)第四和/或第三多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生所述多肽。
6.根据权利要求5所述的方法，其中a-4)下的突变是E357K，第一多肽在位置370包含氨基酸残基K，b-4)下的突变是K370E，并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
7.根据权利要求5所述的方法，其中a-4)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K，b-4)下的突变是K439E，并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
8.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中第一多肽在CH3结构域中在与第二多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，并且其中第四多肽在CH3结构域中在与第三多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基。
9.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第一多肽在位置370包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变E357K，
和
第二多聚体，其包含
b-1)第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
b-2)第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-3)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-4)第三多肽包含突变K370E并且第四多肽在位置357包含氨基酸残基E，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生该多肽，
诸位置根据Kabat EU索引编号。
10.一种用于产生多肽的方法，包括以下步骤：
-孵育
第一多聚体，其包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第一多肽在位置439包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变D356K，
和
第二多聚体，其包含
b-1)第三多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
b-2)第四多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份
其中
b-3)如若第一多肽包含突变臼，则第四多肽包含突变杵并且第三多肽包含突变臼，
或
如若第一多肽包含突变杵，则第四多肽包含突变臼并且第三多肽包含突变杵，
b-4)第三多肽包含突变K439E并且第四多肽在位置356包含氨基酸残基D，
以形成包含第二和第三多肽的第三多聚体和包含第一和第四多肽的第四多聚体，
和
-回收第四多聚体并因而产生该多肽，
诸位置根据Kabat EU索引编号。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中包含第二多肽和第三多肽的第三多聚体的CH3-CH3结合自由能低于第一多聚体和/或第二多聚体的CH3-CH3结合自由能。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中第一多肽和第二多肽形成(可分离的)二聚体，并且第三多肽和第四多肽形成(可分离的)二聚体。
13.根据权利要求4至12中任一项所述的方法，其中第一和/或第二多肽包含了替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)，和/或其中第一和/或第二多肽包含了替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCPAPE(SEQID NO:90)的氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)，和/或第三和/或第四多肽包含了替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCP(SEQ ID NO:31)的氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)，和/或其中第三和/或第四多肽包含了替代IgG野生型铰链区氨基酸序列HTCPPCPAPE(SEQID NO:90)的氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
14.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中第一多肽包含突变杵，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼。
15.根据权利要求5至13中任一项所述的方法，其中第一多肽包含突变杵-cys，第二多肽包含突变臼，第三多肽包含突变杵，并且第四多肽包含突变臼-cys。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含IgG1 CH2结构域和IgG1 CH3结构域。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法，其中第一至第四多肽各自以N末端至C末端方向包含i)彼此独立地氨基酸序列DKTHTCPPC(SEQ ID NO:65)或氨基酸序列DKTHTSPPS(SEQ ID NO:66)或氨基酸序列DKTHT(SEQ ID NO:91)，ii)IgG1 CH2结构域，和iii)IgG1CH3结构域。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中i)第一和第四多肽各自还包含IgG1CH1结构域和可变结构域，或ii)其中第一或第四多肽包含IgG1 CH1结构域并且另一多肽包含轻链恒定结构域并且每种多肽还包含可变结构域。
19.根据权利要求18所述的方法，其中第一多肽的可变结构域是重链可变结构域并且第四多肽的可变结构域是轻链可变结构域或反之亦然，并且这些结构域在多肽中形成结合位点。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中第一和第四多肽彼此独立地选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域，和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
iv)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
iv)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中第一和第二多聚体还分别包含与第一多肽和第四多肽缔合的抗体轻链。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的方法，其中
第一多聚体包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
包含突变杵或突变臼，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
其中第一多肽和第二多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第五多肽，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合，
和
第二多聚体包含
作为第三多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第二多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第二多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含第二扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，因而第五多肽在其氨基酸序列中在野生型IgG1中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人IgG1野生型氨基酸残基，因而第四多肽中的扰动性突变在异于第二多肽中扰动性突变的不同位置处，
和
作为第四多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
如果第四多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第四多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
其中第四多肽和第五多肽形成二聚体，
和
包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的第六多肽，
其中第六多肽通过二硫键与第四多肽共价结合。
23.根据权利要求1至3和9至12中任一项所述的方法，其中孵育步骤在还原剂存在或不存在下进行。
24.根据权利要求4至8和13至22中任一项所述的方法，其中孵育步骤在还原剂不存在下进行。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中i)第二多肽和第三多肽还包含(C末端)标签。
26.根据权利要求25所述的方法，其中
i)标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，并且通过金属(镍)螯合物亲和色谱柱上的色谱回收，
或
ii)标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)，并且通过C标签亲和色谱柱上的色谱回收。
27.一种用于鉴定多特异性多肽的方法，包括步骤
a)通过使选自与第一靶特异性结合的第一多种多聚体中的第一多聚体和选自与第二靶(其异于第一靶)特异性结合的第二多种多聚体中的第二多聚体的每种组合经历根据权利要求1至26中任一项所述的方法，产生多种多特异性多肽，
b)在结合测定法中，对步骤a)中产生的多种多特异性多肽的每个成员单独测量与两种靶的同时结合，并且
c)基于结合测定法的结果，从多种多聚体多肽选择多聚体多肽并且因而鉴定多特异性多肽。
28.根据权利要求27所述的方法，其中结合测定法是ELISA或SPR方法。
29.多聚体多肽，包含突变杵
a)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
a-1)i)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，或ii)第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
a-3)第二多肽在CH3结构域中包含与a-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
a-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
或
b)均包含免疫球蛋白G CH3结构域的第一多肽和第二多肽，其中
b-1)i)第二多肽的CH3结构域包含突变杵并且第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys，或ii)第二多肽的CH3结构域包含突变臼并且第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys，
b-2)第一多肽包含至少一个有功能结合位点或结合位点的至少一部分，
b-3)第二多肽在CH3结构域中包含与b-1)下的突变不同的扰动性突变，据此第一多肽在其氨基酸序列中在相应的野生型免疫球蛋白G中与扰动性突变处氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基，
b-4)第一多肽和第二多肽形成二聚体，
编号根据Kabat EU索引进行。
30.根据权利要求29所述的多聚体多肽，其中扰动性突变是E357K并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
31.根据权利要求29所述的多聚体多肽，其中第一扰动性突变是D356K并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或扰动性突变是K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
32.分离的多聚体多肽，其包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼-cys并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第二多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)下的突变不同并且增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能。
33.根据权利要求32所述的分离的多聚体多肽，其中a-4)下的突变是E357K，并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或其中a-4)下的突变是K370E，并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
34.根据权利要求32所述的分离的多聚体多肽，其中a-4)下的突变是D356K，第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或其中a-4)下的突变是K439E，并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
35.根据权利要求32至34中任一项所述的分离的多聚体多肽，其中第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
36.分离的多聚体多肽，包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第二多肽在CH3结构域中包含突变，所述突变与a-3)下的突变不同并且增加第一多聚体的CH3-CH3结合自由能，
a-5)第一和/或第二多肽包含氨基酸序列HTSPPSP(SEQ ID NO:85)或氨基酸序列HTPAPE(SEQ ID NO:86)。
37.根据权利要求36所述的分离的多聚体多肽，其中a-4)下的突变是E357K，并且第一多肽在位置370包含氨基酸残基K；或其中a-4)下的突变是K370E，并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E，诸位置根据Kabat EU索引编号。
38.根据权利要求36所述的分离的多聚体多肽，其中a-4)下的突变是D356K，并且第一多肽在位置439包含氨基酸残基K；或其中a-4)下的突变是K439E，并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D，诸位置根据Kabat EU索引编号。
39.根据权利要求32至36中任一项所述的分离的多聚体多肽，其中第一多肽在CH3结构域中在与第二多肽中突变的氨基酸残基相互作用的位置处包含相应的免疫球蛋白G野生型氨基酸残基。
40.分离的多聚体多肽，包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第一多肽在位置370包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变E357K，
或
第二多肽包含突变K370E并且第一多肽在位置357包含氨基酸残基E。
41.分离的多聚体多肽，包含
a-1)第一多肽，其包含
i)免疫球蛋白G CH3结构域，
和
ii)至少一个有功能结合位点或其部份，
和
a-2)第二多肽，其包含
免疫球蛋白G CH3结构域，
其中
a-3)第一多肽的CH3结构域包含突变杵并且第二多肽的CH3结构域包含突变臼，
或
第一多肽的CH3结构域包含突变臼并且第二多肽的CH3结构域包含突变杵，
a-4)第一多肽在位置439包含氨基酸残基K并且第二多肽包含突变D356K，
或
第二多肽包含突变K439E并且第一多肽在位置356包含氨基酸残基D。
42.根据权利要求29至42中任一项所述的分离的多聚体多肽，其中第一多肽选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)scFv、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
v)scFab、任选地肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域和衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域，
vi)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
viii)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和第二人IgG1 CH1结构域，
ix)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和第二重链可变结构域，
x)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
xi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、和scFab，
xii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域、和轻链可变结构域，
xiii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
xiv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域、和人κ或λ轻链恒定结构域，
xv)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，和
xvi)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、衍生自人IgG1 CH2结构域的CH2结构域、衍生自人IgG1 CH3结构域的CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点。
43.根据权利要求29至42中任一项所述的分离的多聚体多肽，还包含与第一多肽缔合的抗体轻链。
44.根据权利要求43所述的分离的多聚体多肽，包含
作为第一多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
i)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1 CH3结构域，
ii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、重链可变结构域和人IgG1 CH1结构域，
iii)SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人IgG1 CH1结构域和重链可变结构域，
iv)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和第二人IgG1CH1结构域，
v)第一重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和第二重链可变结构域，
vi)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFv，
vii)重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、和scFb，
viii)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二人IgG1 CH1结构域和轻链可变结构域，
ix)重链可变结构域、第一人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、轻链可变结构域和第二人IgG1 CH1结构域，
x)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、第二重链可变结构域和人κ或λ轻链恒定结构域，
xi)第一重链可变结构域、人IgG1 CH1结构域、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地肽接头、人κ或λ轻链恒定结构域和第二重链可变结构域，
xii)结合结构域的第一部分、任选地第一肽接头、SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域、人IgG1 CH3结构域、任选地第二肽接头、和结合结构域的第二部分，其中结合结构域的第一部分和结合结构域的第二部分形成与靶特异性结合的有功能结合位点，
和
作为第二多肽，选自以N末端至C末端方向包含以下者的多肽群组的多肽
SEQ ID NO:65或66或91的铰链区、人IgG1 CH2结构域和人IgG1CH3结构域，
如果第一多肽包含突变臼，则所述多肽包含突变杵，或如果第一多肽包含突变杵，则所述多肽包含突变臼，
包含扰动性突变D356K、E357K、K370E或K439E，据此第一多肽在其氨基酸序列中在野生型免疫球蛋白IgG1中与扰动性突变处的氨基酸残基相互作用的氨基酸位置处包含人免疫球蛋白IgG1野生型氨基酸残基，
和
作为第三多肽，包含轻链可变结构域和轻链恒定结构域的多肽，
其中第三多肽通过二硫键与第一多肽共价结合。
45.根据权利要求29至44中任一项所述的分离的多聚体多肽，其中第二多肽还包含(C末端)标签。
46.根据权利要求45所述的分离的多聚体多肽，其中
i)标签具有氨基酸序列HHHHHH(SEQ ID NO:67)或HHHHHHHH(SEQ ID NO:68)，
或
ii)标签具有氨基酸序列EPEA(SEQ ID NO:87)。
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