JP2023508596A - 脳内の治療用抗体の量を決定するための方法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、治療用抗体が投与された実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定するための方法であって、前記組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、実験動物の組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、実験動物の組織中の治療用抗体の濃度が、以下の式：TIFF2023508596000021.tif18170（式中、ＣｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．＝実験動物の組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定することにより得られ、ＣｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．＝実験動物の血液サンプル中の治療用抗体の濃度を、組織サンプルを採取する直前に決定することにより得られ、ＣｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．＝実験動物の組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定することにより得られ、ＣｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．＝実験動物の血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を、組織サンプルを採取する直前に決定することにより得られ、Ｃ組織、サンプル＝組織サンプル中の組織濃度を決定することによって得られる）によって計算され、それによって不活性参照抗体は前記組織中に浸透せず、不活性参照抗体は、組織および血液サンプルを得る２～１０分前に投与される、方法が報告される。

Description

本発明は、イムノアッセイの分野に属する。より具体的には、本明細書では、脳組織中の治療用抗体の量、より具体的には血液脳関門を通過して血液から脳に輸送される治療用抗体の量を決定する方法が報告される。

背景
インビトロまたはインビボ起源のサンプル中の治療用モノクローナル抗体（ｔｍＡｂ）の分析には、それぞれのアッセイが必要である。

治療用抗体の量の決定は、一般に、サンプル中の前記治療用抗体の量を決定することによって行われる。したがって、例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、タンパク質ブロット（ウエスタンブロット）アッセイなどのイムノアッセイを使用し得る。

神経変性における秩序だったタンパク質集合に対する保護における抗体およびその受容体の役割は、Ｋａｔｓｉｎｅｌｏｓら（Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２０１９）Ａ１１３９）によって概説された。Ｋａｔｓｉｎｅｌｏｓらは、ＩｇＧレベルがヒト血清中で約１０ｍｇ／ｍｌに維持されることを概説している。脳は、血液脳関門（ＢＢＢ）によって血清から分離され、血液脳関門は、ＩｇＧを含む大きな巨大分子を透過せず、脳脊髄液（ＣＳＦ）に浸され、脳脊髄液は、血液の濾過および脈絡叢を横切るイオンの輸送後に生成される。したがって、結果として生じるＣＳＦ中のＩｇＧの濃度は、血清中よりも約５００～１，０００倍低い。

Ｈａｎｚａｔｉａｎら（ｍＡｂｓ １０（２０１８）７６５－７７７）は、治療用モノクローナル抗体および内因性ＩｇＧ抗体が、脳への外因性物質および内因性物質の両方の選択的かつ特異的な輸送を調節および制御する血液脳関門（ＢＢＢ）のために、中枢神経系（ＣＮＳ）への取り込みが制限されていることを報告した。抗体治療薬を脳に送達するための受容体媒介性トランスサイトーシス（ＲＭＴ）などの天然の輸送機構に使用することは、げっ歯類およびサルで研究されている。各ＤＶＤ－Ｉｇの全身投与後、Ｈａｎｚａｔｉａｎらは、脳への特異的取り込みを観察するために２つの独立した方法を並行して使用した：電気化学発光に基づく高感度定量アッセイおよび半定量的免疫組織化学技術を、それぞれ脳濃度決定および脳における生体分布／局在化のために使用した。ＣＮＳ標的または選択された全身投与経路にかかわらず、全てのＴｆＲ１ ＤＶＤ－Ｉｇタンパク質について脳の取り込みおよび保持が有意に増強されたことが観察された。分析用の脳サンプルを調製するために、使用したＣ５７ＢＬ／６Ｎマウスに、プログラム可能な蠕動ポンプを介して１０分間、２ｍｌ／分の速度でヘパリンを含有する冷ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を経心的に灌流した。

同等のアプローチは、Ｚｕｃｈｅｒｏら（Ｎｅｕｒｏｎ ８９（２０１６）７０－８２；ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｍｉｃｅ，ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ＩＶ ｉｎｊｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＰＢＳ ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）およびＪａｎｏｗｉｃｚら（Ｎａｔｕｒｅ Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．９（２０１９）９２５５；Ｐ３０１Ｌ ｔａｕ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐＲ５ ｍｉｃｅ，ｔｏ ｗｈｉｃｈ Ａｌｅｘａ－６４７－ｌａｂｅｌｅｄ ＩｇＧ，Ｆａｂ ｏｒ ｓｃＦｖ ｈａｄ ｂｅｅｎ ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ ｂｙ ｒｅｔｒｏ－ｏｒｂｉｔａｌ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ，ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｕｓｅｄ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｏ ｒｅｍｏｖｅ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｒｏｍ ｔｈｅｉｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）によって使用されていた。

国際公開第２０１８／１５２３５９号では、ＰＳ１９系統由来のヒトＴａｕを過剰発現するマウスを使用して、キメラＩｇＧ抗Ｔａｕ抗体クローン１Ｃ７および１Ａ１の標的会合を評価した。したがって、マウスにｉ．ｖ．（３５ｍｇ／ｋｇで）またはｉ．ｐ．（５０ｍｇ／ｋｇで）により、コントロールＩｇＧ、キメラＩｇＧクローン１Ｃ７またはキメラＩｇＧクローン１Ａ１を注射した。注射の２日後または７日後に、脳脊髄液（ＣＳＦ）を大槽を介して収集し、潜在的な血液汚染について視覚的に検査し、氷冷ＰＢＳによる経心灌流後に、脳組織を取り出して急速凍結した。

Ａｙａｂｅ，Ｍ．らは、抗ヒトインターロイキン－６受容体（ｈＩＬ－６Ｒ）抗体または対照の抗体を担癌ｈＩＬ－６Ｒトランスジェニックマウスに静脈内投与し、組織内残留血液量のマーカーとしてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を静脈内投与したことを報告した。溶解物サンプルを、抗ＢＳＡ抗体およびプロテインＡ磁気ビーズを使用する免疫沈殿とそれに続くトリプシン消化で処理した。各代用ペプチドをＬＣ／ＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによって同時に分析した。補正された組織濃度を計算した。

Ｖｅｄｅｌｅｒらは、急性ギラン・バレー症候群患者由来の血清および脳脊髄液中の免疫グロブリンに関して報告した（Ａｃｔａ Ｎｅｕｒｏｌ．Ｓｃａｎｄ．７３（１９８６）３８８－３９３）。

Ｓｈａｈらは、抗体生物分布係数（ａｎｔｉｂｏｄｙ ｂｉｏ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ）、特に、いくつかの前臨床種およびヒトにおける血漿濃度に基づくモノクローナル抗体の組織中の推測濃度を報告した（ＭＡＢＳ，５（２０１３）２９７－３０５）。

Ｌａｖｅｚｚｉらは、ｍＡｂのＭＰＢＰＫ－ＴＭＤＤモデル、特に代替モデル、比較、および同定可能性の問題を報告した（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎ．Ｐｈａｒｍｃｏｄｙｎ．４５（２０１８）７８７－８０２）。

発明の概要
本明細書では、実験動物の血液脳関門を通過して血液から脳に輸送された治療用抗体の量を決定する方法が報告される。この量は、好ましくは脳溶解物サンプル中で決定される。本発明の要旨は、血液脳関門を通過して輸送される治療用抗体の量が決定されなければならない脳サンプルを得る直前に、血液脳関門を通過して輸送されない不活性抗体をさらに適用することにある。不活性抗体を適用することにより、脳サンプル中の残留血液中に存在する治療用抗体の補正値が得られる。この残留血液に由来する量は、脳に位置しない抗体について決定された量を補正するために使用される。補正なしの決定により、サンプル中の治療用抗体の総量、すなわち血液脳関門を通過して脳に輸送される量およびサンプル中の残留血液中の量が決定される。血液中の抗体の約０．１％のみが血液脳関門を通過するので、残留血液中の治療用抗体の量は無視できない。したがって、血液中の治療用抗体の濃度は、脳内の治療用抗体の濃度を少なくとも２桁、最大３桁上回る。それにより、得られた結果は、本発明による方法で補正しない場合には高すぎる。

本発明は、少なくとも部分的には、血液脳関門を通過して脳内に輸送される治療用抗体の脳溶解物中の量をロバストかつ正確に決定するために、脳溶解物サンプル中の残留血液中の治療用抗体の量による補正、すなわち減少を行わなければならないという知見に基づいている。

本発明は、少なくとも部分的には、脳溶解物中の残留血液の量が、脳サンプルが採取される直前に補正抗体を適用することによって決定され得るという知見に基づいている。脳サンプルが得られる実験動物のいかなる標的にも特異的に結合しない抗体、最も好ましくはヒト生殖細胞系抗体を参照抗体として使用することが特に有利であることが分かった。

本発明の一態様は、実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定するための方法／アッセイであって、組織が前記動物の血液循環に対するバリアを有し、治療用抗体が前記実験動物に投与されており、前記組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、実験動物の組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、方法が、以下：
ｉ）実験動物の血液サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉ）実験動物の組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉｉ）実験動物の血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｉｖ）実験動物の組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｖ）組織サンプル中の組織濃度を決定する工程、および
以下の式：

（式中、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉｖ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{組織、サンプル}＝ｖ）の組織濃度）
を用いて実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定する工程
を含み、
－不活性参照抗体は、組織と血液循環との間の前記バリアを通過せず、
－ｉ）治療用抗体の投与後５分以内にサンプルを採取する場合は治療用抗体と一緒に、またはｉｉ）組織サンプルを採取する２～１０分前のいずれかで、不活性参照抗体が投与されている、方法／アッセイである。

別の表現における同じ態様は、治療用抗体が投与された実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定するための方法であって、前記組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される実験動物の組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、
以下の式：

（式中、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝実験動物の組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝実験動物の血液サンプル中の治療用抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝実験動物の組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝実験動物の血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{組織、サンプル}＝組織サンプル中の組織濃度を決定することによって得られる）
を用いて実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定する工程
を含み、
－不活性参照抗体は前記組織中に浸透せず、
－不活性参照抗体は、組織サンプルを得る２～１０分前に投与される、方法である。

以下は、本発明の各および任意の態様の全ての個々の実施形態である。したがって、本発明による任意の個々の態様に関して、実施形態のありとあらゆる可能な置換が開示されている。

一実施形態では、血液サンプルは、組織サンプルの最大５分前に採取される。一実施形態では、血液サンプルは、組織サンプルの前に採取される。一実施形態では、血液サンプルは、組織サンプルと一緒にまたは同時に採取される。

一実施形態では、組織が脳組織であり、治療用抗体が血液脳関門を通過し得るか、または組織が眼組織であり、治療抗体が血液眼関門を通過し得るののいずれかである。

本発明の一態様は、実験動物の脳組織または脳組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定するための方法／アッセイであって、脳組織が前記動物の血液循環に対するバリアを有し、治療用抗体が前記実験動物に投与されており、前記脳組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、実験動物の脳組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、方法が、以下：
ｉ）実験動物の血液サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉ）実験動物の脳組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉｉ）実験動物の血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｉｖ）実験動物の脳組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｖ）組織サンプル中の脳組織濃度を決定する工程、および
以下の式：

（式中、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉｖ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{組織、サンプル}＝ｖ）の組織濃度）
を用いて実験動物の脳組織または脳組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程
を含み、
－不活性参照抗体が、脳組織と血液循環との間の血液脳関門を通過せず、
－ｉ）治療用抗体の投与後５分以内に脳組織サンプルを採取する場合は治療用抗体と一緒に、またはｉｉ）脳組織サンプルを採取する２～１０分前のいずれかで、不活性参照抗体が投与されている、方法／アッセイである。

別の表現における同じ態様は、治療用抗体が投与された実験動物の脳組織または脳組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定するための方法であって、前記脳組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、実験動物の脳組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、
実験動物の脳組織中の治療用抗体の濃度が、下記式：

（式中、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝実験動物の脳組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝実験動物の血液サンプル中の治療用抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝実験動物の脳組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝実験動物の血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定することによって得られ、
Ｃ_{組織、サンプル}＝脳組織サンプル中の脳組織濃度を決定することにより得られる）
により算出され、
－不活性参照抗体が前記脳組織に浸透せず、
－不活性参照抗体が、脳組織サンプルを採取する２～１０分前に投与されている、方法である。

一実施形態では、治療用抗体は二重特異性抗体である。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体および脳標的に特異的に結合する。

一実施形態では、脳標的は、ヒトＣＤ２０またはヒトＡベータまたはヒトアルファ－シヌクレインまたはヒトタウまたはヒトグルコセレブロシダーゼまたはヒトリンゴ－１またはヒトハンチンチンである。

一実施形態では、実験動物は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、類人猿およびサルから選択される。

一実施形態では、実験動物は、体重が１００ｇ超１５ｋｇ未満の非ヒト実験動物である。

一実施形態では、実験動物はカニクイザルである。

一実施形態では、不活性参照抗体はヒト生殖細胞系抗体である。

一実施形態では、不活性参照抗体はＤＰ４７ＧＳである。一実施形態では、不活性参照抗体は、配列番号６７の重鎖可変ドメイン、および配列番号６８の軽鎖可変ドメインを含む。一実施形態では、不活性参照抗体は、配列番号６９の重鎖、および配列番号７０の軽鎖を含む。

一実施形態では、不活性参照抗体は、その適用後１５分以内に検出可能な量で前記バリアを通過しない。

一実施形態では、不活性参照抗体は、その適用後１０分以内に検出可能な量で前記バリアを通過しない。

一実施形態では、不活性抗体は、組織サンプルを採取する５～１０分前に投与される。

一実施形態では、組織は、血液サンプル料を採取した直後および組織サンプルを採取する前に水溶液で灌流される。

一実施形態では、濃度の決定は、架橋ＥＬＩＳＡによるものである。

発明の実施形態の詳細な説明
本明細書では、実験動物の血液脳関門を通過して血液から脳に輸送された治療用抗体の量を決定する方法が報告される。この量は、好ましくは脳溶解物サンプル中で決定される。本発明の要旨は、血液脳関門を通過して輸送される治療用抗体の量が決定されなければならない脳サンプルを得る直前に、血液脳関門を通過して輸送されない不活性抗体をさらに適用することにある。不活性抗体を適用することにより、脳サンプル中の残留血液中に存在する治療用抗体の補正値が得られる。この残留血液に由来する量は、脳に位置しない抗体について決定された量を補正するために使用される。補正なしの決定により、サンプル中の治療用抗体の総量、すなわち血液脳関門を通過して脳に輸送される量およびサンプル中の残留血液中の量が決定される。血液中の抗体の約０．１％のみが血液脳関門を通過するので、残留血液中の治療用抗体の量は無視できない。したがって、血液中の治療用抗体の濃度は、脳内の治療用抗体の濃度を少なくとも２桁、最大３桁上回る。それにより、得られた結果は、本発明による方法で補正しない場合には高すぎる。

本発明は、少なくとも部分的には、血液脳関門を通過して脳内に輸送される治療用抗体の脳溶解物中の量をロバストかつ正確に決定するために、脳溶解物サンプル中の残留血液中の治療用抗体の量による補正、すなわち減少を行わなければならないという知見に基づいている。

本発明は、少なくとも部分的には、脳溶解物中の残留血液の量が、脳サンプルが採取される直前に補正抗体を適用することによって決定され得るという知見に基づいている。脳サンプルが得られる実験動物のいかなる標的にも特異的に結合しない抗体、最も好ましくはヒト生殖細胞系抗体を参照抗体として使用することが特に有利であることが分かった。

本発明の一態様は、実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定するための方法／アッセイであって、組織が前記動物の血液循環に対するバリアを有し、治療用抗体が前記実験動物に投与されており、前記組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、実験動物の組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、方法が、以下：
ｉ）実験動物の血液血清サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉ）実験動物の組織サンプル中の治療用抗体の濃度を決定する工程、
ｉｉｉ）実験動物の血液血清サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｉｖ）実験動物の組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
ｖ）組織サンプル中の組織濃度を決定する工程、および
以下の式：

（式中、
Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉｉ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉｖ）の治療用抗体の濃度
Ｃ_{組織、サンプル}＝ｖ）の組織濃度）
を用いて実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定する工程
を含み、
－不活性参照抗体は、組織と血液循環との間のバリアを通過せず、
－ｉ）治療用抗体の投与後５分以内にサンプルを採取する場合は治療用抗体と一緒に、またはｉｉ）組織サンプルを採取する２～１０分前のいずれかで、不活性参照抗体が投与されており、
－血液サンプルは、組織サンプルと一緒に／直前に／同時に採取される、方法／アッセイである。

定義
「ノブ・イントゥ・ホール」二量体化モジュールおよび抗体操作におけるその使用は、Ｃａｒｔｅｒ Ｐ．；Ｒｉｄｇｗａｙ Ｊ．Ｂ．Ｂ．；Ｐｒｅｓｔａ Ｌ．Ｇ．：Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２，Ｎｕｍｂｅｒ １，Ｆｅｂｒｕａｒｙ １９９６，ｐｐ．７３－７３（１）に記載されている。

ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に与えられる。

本明細書において使用される場合、重鎖および軽鎖の全ての定常領域およびドメインのアミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ，ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）において説明されるＫａｂａｔナンバリングシステムによりナンバリングされ、本明細書では「Ｋａｂａｔによるナンバリング」と称される。具体的には、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）のＫａｂａｔ番号付けシステム（６４７～６６０頁を参照）を、カッパアイソタイプおよびラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１～７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３、本明細書では、この場合には、「ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け」と称することによってさらに明確にしている）に使用する。

「約」という用語は、その後に続く数値の±２０％の範囲を意味する。一実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±１０％の範囲を意味する。一実施形態では、「約」という用語は、その後に続く数値の±５％の範囲を意味する。

「抗体依存性細胞障害作用（ＡＤＣＣ）」という用語は、Ｆｃ受容体結合によって媒介される機能であり、本明細書に報告する抗体による標的細胞のエフェクター細胞の存在下での溶解を指す。ＡＤＣＣは、一実施形態において、ＣＤ１９発現赤血球（例えば、組換えヒトＣＤ１９を発現するＫ５６２細胞）の調製物を、単球またはＮＫ（ナチュラルキラー）細胞のように、新鮮に単離されたＰＢＭＣ（末梢血単核細胞）またはバフィーコートから精製されたエフェクター細胞のようなエフェクター細胞の存在下で、本明細書に報告する融合ポリペプチドを含む抗体で処理することによって測定される。標的細胞は、５１Ｃｒで標識され、その後、抗体とともにインキュベートされる。標識した細胞は、エフェクター細胞とともにインキュベートされ、その上清は、放出された５１Ｃｒについて分析される。対照としては、標的内皮細胞とエフェクター細胞とのインキュベーションが挙げられるが、抗体は含まれない。ＡＤＣＣを媒介する初期工程を誘発する抗体の能力は、ＦｃγＲＩおよび／もしくはＦｃγＲＩＩＡまたは（本質的にＦｃγＲＩＩＩＡを発現する）ＮＫ細胞を組み換えにより発現する細胞といった、Ｆｃγ受容体を発現する細胞への、抗体の結合を測定することにより調査される。好ましい一実施形態では、ＮＫ細胞上のＦｃγＲへの結合が測定される。

「アンプリファイア（ａｍｐｌｉｆｉｅｒ）」という用語は、ＥＬＩＳＡ（例えば、ＥＬＩＳＡで使用される酵素アンプリファイア）などの検出方法においてシグナルを増強するエンティティまたはプロセスを表す。

「抗ヒトＡ－ベータ抗体」および「ヒトＡ－ベータに特異的に結合する抗体」という用語は、抗体がＡ－ベータペプチドを標的とする際の診断および／または治療剤として有用であるように十分な親和性でヒトＡ－ベータペプチドに結合し得る抗体を指す。

ヒトＡ－ベータは、いくつかの天然に存在する形態を有し、ヒト形態は、Ａβ３９、Ａβ４０、Ａβ４１、Ａβ４２およびＡβ４３と呼ばれることに留意されたい。最も重要な形態であるＡβ４２は、配列番号０１のアミノ酸配列を有する。Ａβ４１、Ａβ４０、Ａβ３９では、Ｃ末端のアミノ酸Ａ、ＩＡおよびＶＩＡがそれぞれ欠損している。Ａβ４３形態では、追加のスレオニン残基が配列番号０１（３３１０６）のＣ末端に含まれる。

したがって、この用語は、ヒトＡ－βポリペプチドの短縮された断片に結合する抗体も包含する。

本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、様々な抗体構造を包含し、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、または多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）が挙げられるがこれらに限定されない。

抗体は、一般に、２つのいわゆる軽鎖ポリペプチド（軽鎖）および２つのいわゆる重鎖ポリペプチド（重鎖）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、抗原と相互作用し得る結合領域を含む可変ドメイン（可変領域）（一般にポリペプチド鎖のアミノ末端部分）を含む。重鎖および軽鎖ポリペプチドの各々は、定常領域（一般にカルボキシル末端部分）を含む。重鎖の定常領域は、ｉ）食細胞などのＦｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）を有する細胞への、またはｉｉ）ブランベル受容体としても知られる新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）を有する細胞への抗体の結合を媒介する。重鎖の定常領域は、成分（Ｃ１ｑ）などの古典的補体系の因子を含むいくつかの因子への結合も媒介する。抗体重鎖の定常ドメインは、ＣＨ１ドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含むのに対して、軽鎖は、カッパアイソタイプまたはラムダアイソタイプであり得るただ１つの定常ドメインＣＬを含む。

免疫グロブリンの軽鎖または重鎖の可変ドメインは、異なるセグメント、すなわち４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。

「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原を結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例としては、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖおよびｓｃＦａｂ）；単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）；ならびに、抗体断片から形成した多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。

「血液脳関門」または「ＢＢＢ」は、脳毛細血管内皮細胞膜内の密着結合によって形成される、末梢循環と脳および脊髄との間の生理学的バリアを指し、これは、脳内への分子、さらには尿素（６０ダルトン）などの非常に小さな分子の輸送を制限するタイトバリアを形成する。脳内のＢＢＢ、脊髄内の血液脊髄関門、および網膜内の血液網膜関門は、ＣＮＳ内の連続した毛細管バリアであり、本明細書ではまとめて血液脳関門またはＢＢＢと呼ばれる。ＢＢＢはまた、血液－ＣＳＦ関門（脈絡叢）を包含し、この関門は、毛細血管内皮細胞ではなく上衣細胞で構成される。

「血液脳関門受容体」（本明細書では「ＢＢＢＲ」と省略される）は、ＢＢＢを横切って分子を輸送し得る、または外因性投与分子を輸送するために使用される、脳内皮細胞上に発現される細胞外膜結合受容体タンパク質である。本明細書におけるＢＢＢＲの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ－Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）および低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）を含むがこれらに限定されない低密度リポタンパク質受容体、ならびにヘパリン結合性上皮成長因子様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）が挙げられる。１つの好ましいＢＢＢＲはトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。

「脳エフェクターエンティティ」という用語は、ＢＢＢを超えて脳に輸送される分子を示す。エフェクターエンティティは、典型的には、脳に送達されることが望まれる特徴的な治療活性を有する。エフェクターエンティティとしては、神経障害性薬剤および細胞傷害性薬剤、例えばポリペプチドおよび抗体、特に脳標的に対するモノクローナル抗体またはその断片が挙げられる。

「捕捉抗体」という用語は、検出のためにサンプル中に存在する標的物質に結合する（すなわち、捕捉される）ためにサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットで使用される抗体を表す。次いで、二次抗体（すなわち、検出抗体）が、捕捉された標的に結合し、抗体－標的－抗体複合体の検出を可能にする（抗体－標的－抗体からなる「サンドイッチ」を形成する）

「中枢神経系」または「ＣＮＳ」は、身体機能を制御する神経組織の複合体を指し、脳および脊髄を含む。

「ＣＮＳ抗原」および「脳標的」という用語は、抗体または小分子で標的化し得る、脳を含むＣＮＳで発現される抗原および／または分子を示す。そのような抗原および／または分子の例としては、限定されないが、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドベータ（Ａベータ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、グルコセレブロシダーゼおよびカスパーゼ６が挙げられる。

「コンジュゲート」は、標識、神経障害性薬剤または細胞傷害性薬剤を含むがこれらに限定されない１つ以上の異種分子にコンジュゲートされた本発明の融合タンパク質である。

「検出抗体」という用語は、可視化または定量化のための手段を有する抗体を表す。そのような手段は、典型的には酵素（適切な基質の添加後に着色または蛍光反応生成物を触媒する）、例えば西洋ワサビペルオキシダーゼ、ウレアーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコアミラーゼおよびβ－ガラクトシダーゼである。いくつかの実施形態では、検出抗体は目的の抗原に対するものである。いくつかの実施形態では、検出抗体は抗種抗体である。いくつかの実施形態では、検出抗体は、ビオチン、蛍光マーカー、または放射性同位体などの検出可能な標識にコンジュゲートされ、この標識を使用して検出および／または定量される。

「検出試薬」という用語は、抗原に結合した抗体の検出および／または定量を可能にする試薬を表す。いくつかの実施形態では、検出試薬は、抗体にコンジュゲートされた酵素の比色基質である。抗体－酵素コンジュゲートへの適切な基質の添加は、比色または蛍光測定シグナルの生成をもたらす（例えば、目的の抗原へのコンジュゲート化抗体の結合後に）。この定義には、検出系の一部としてのビオチンおよびアビジン系化合物（例えば、ニュートラアビジンおよびストレプトアビジンを含むがこれらに限定されない）の使用も包含される。

本明細書で使用される「直後」という用語は、第１のサンプルの採取と第２のサンプルの採取との間の時間幅を示し、これはサンプリング装置の変更およびサンプルを採取するための実際の時間のみを包含する。一実施形態では、直後という用語は、５分以下、さらなる実施形態では３分以下、１つの好ましい実施形態では２分以下の期間を示す。

「エフェクター機能」は、抗体のクラスにより異なっている抗体のＦｃ領域に起因する生物活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方制御、ならびにＢ細胞活性化が挙げられる。

Ｆｃ受容体結合依存性エフェクター機能は、抗体のＦｃ領域と、造血細胞における専用の細胞表面受容体である、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）との相互作用により媒介されることができる。Ｆｃ受容体は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、免疫複合体のファゴサイトーシスによる、抗体で覆われた病原体の除去、ならびに、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）による、赤血球、および対応する抗体で覆われた他の細胞標的（例えば腫瘍細胞）の溶解の両方を媒介することが示されている（例えば、Ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｊ．Ｇ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｌ．，Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．４９（１９９１）５１１－５２４を参照されたい）。ＦｃＲは、免疫グロブリンアイソタイプに対するその特異性により定義される：ＩｇＧ抗体に対するＦｃ受容体は、ＦｃγＲと呼ばれる。Ｆｃ受容体結合は、例えばＲａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｋｉｎｅｔ，Ｊ．Ｐ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９（１９９１）４５７－４９２；Ｃａｐｅｌ，Ｐ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４（１９９４）２５－３４；ｄｅ Ｈａａｓ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６（１９９５）３３０－３４１；およびＧｅｓｓｎｅｒ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．７６（１９９８）２３１－２４８に記載されている。

ＩｇＧ抗体（ＦｃγＲ）のＦｃ領域に対する受容体の架橋は、ファゴサイトーシス、抗体依存性細胞傷害、および炎症性メディエータの放出、ならびに、免疫複合体のクリアランスおよび抗体産生の制御を含む、多種多様のエフェクター機能を誘発する。ヒトにおいて、３クラスのＦｃγＲが特性決定されており、これらは以下のとおりである。
－ ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）は、高い親和性で単量体ＩｇＧを結合し、マクロファージ、単球、好中球および好酸球上に発現する。アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、およびＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の少なくとも１つにおける、Ｆｃ領域内での修飾によって、ＦｃγＲＩへの結合が低下する。ＩｇＧ１およびＩｇＧ４に置換された、位置２３３～２３６におけるＩｇＧ２残基は、ＦｃγＲＩへの結合を１０３倍低下させ、抗体により感作される赤血球に対するヒト単核細胞応答を取り除いた（Ａｒｍｏｕｒ，Ｋ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２９（１９９９）２６１３－２６２４）。
－ ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）は、複合体化したＩｇＧを中等度から低い親和性で結合し、広範に発現する。この受容体は、ＦｃγＲＩＩＡとＦｃγＲＩＩＢの２つのサブタイプへと分けることができる。ＦｃγＲＩＩＡは、殺滅に関与する多くの細胞（例えば、マクロファージ、単球、好中球）上で認められ、殺滅プロセスを活性化することができるようである。ＦｃγＲＩＩＢは、阻害プロセスにおいて役割を果たすと思われ、Ｂ－細胞、マクロファージならびに肥満細胞および好酸球に認められる。Ｂ細胞上では、ＦｃγＲＩＩＢは、免疫グロブリン産生、および、例えばＩｇＥクラスへのアイソタイプ切り替えを更に抑制する機能を有するようである。マクロファージ上では、ＦｃγＲＩＩＢは、ＦｃγＲＩＩＡによって媒介されるように、ファゴサイトーシスを阻害する役割を果たす。好酸球および肥満細胞上において、Ｂ形態は、ＩｇＥの、その個別の受容体への結合による、これらの細胞の活性化の抑制を補助し得る。ＦｃγＲＩＩＡに対する結合の低下は、例えば、少なくとも、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｒ２９２、およびＫ４１４（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）の１つにおいて突然変異を有するＩｇＧ Ｆｃ領域を含む抗体に対して発見されている。
－ ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）は、中等度から低い親和性でＩｇＧと結合し、２つのタイプとして存在する。ＦｃγＲＩＩＩＡは、ＮＫ細胞、マクロファージ、好酸球、ならびにいくつかの単球およびＴ細胞上に認められ、ＡＤＣＣを媒介する。ＦｃγＲＩＩＩＢは好中球上に高度に発現する。ＦｃγＲＩＩＩＡへの結合の低減は、例えば、アミノ酸残基Ｅ２３３～Ｇ２３６、Ｐ２３８、Ｄ２６５、Ｎ２９７、Ａ３２７、Ｐ３２９、Ｄ２７０、Ｑ２９５、Ａ３２７、Ｓ２３９、Ｅ２６９、Ｅ２９３、Ｙ２９６、Ｖ３０３、Ａ３２７、Ｋ３３８およびＤ３７６（ＫａｂａｔのＥＵインデックスによる番号付け）の少なくとも１つにおける突然変異があるＩｇＧＦｃ領域を含む抗体について認められる。

Ｆｃ受容体に対する、ヒトＩｇＧ１上での結合部位のマッピング、上述した突然変異部位、ならびにＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＡへの結合を測定する方法は、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４に記載されている。

薬剤、例えば、医薬製剤の「有効量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するために必要な薬用量および所要期間で有効な量を指す。

「ＥＬＩＳＡ」という用語は、酵素結合免疫吸着アッセイを表す。様々なＥＬＩＳＡフォーマットおよび用途が当技術分野で公知である（例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，’’Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（ＥＬＩＳＡ），’’ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｒａｐｌｅｙら．［編］，ｐｐ．５９５－６１７，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９８）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（編），Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８８）；Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１１，Ｊｏｈｎ ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９４）を参照されたい）。

１つの具体的なＥＬＩＳＡフォーマットは、いわゆる「直接ＥＬＩＳＡ」である。このＥＬＩＳＡフォーマットでは、サンプル中に存在する標的、例えばポリペプチドが検出される。直接ＥＬＩＳＡでは、標的を含有するサンプルを、固相、例えば固定または固定化支持体（例えば、マイクロタイタープレートウェル）と接触させる。標的がサンプル中に存在する場合、固相に固定化され、その後、酵素結合検出分子を使用して直接検出される。標的が抗原である場合、検出分子は抗原に特異的な抗体であるか、または標的が抗原に特異的な抗体である場合、検出分子は抗原に特異的な酵素コンジュゲート抗体である。

別の具体的なＥＬＩＳＡフォーマットは、いわゆる「間接ＥＬＩＳＡ」である。このＥＬＩＳＡフォーマットでは、抗原（または抗体）が固相（例えば、マイクロタイタープレートウェル）に固定化される。その後、抗原特異的抗体（または抗原）を添加し、続いて抗原に特異的に結合する抗体に特異的な検出抗体を添加する。この検出抗体は、「種－特異的」抗体（例えば、ヤギ抗ウサギ抗体）であり得る。

別の具体的なＥＬＩＳＡフォーマットは、いわゆる「サンドイッチＥＬＩＳＡ」である。このフォーマットでは、抗原は、抗原に特異的に結合する抗体（すなわち、捕捉抗体）による捕捉を介して固相（例えば、マイクロタイタープレートウェル）に固定化され、これは（共有結合または特異的結合対を介して）固相に固定化される。一般に、抗原を含むサンプルを固相に添加した後、洗浄する。目的の抗原がサンプル中に存在する場合、目的の抗原は捕捉抗体によって固相に結合する。

上記のＥＬＩＳＡフォーマットを組み合わせ得る。サンドイッチＥＬＩＳＡは「直接サンドイッチＥＬＩＳＡ」であり得、捕捉された抗原は、抗原に対する酵素コンジュゲート抗体を使用することによって直接検出される。サンドイッチＥＬＩＳＡは、「間接的サンドイッチＥＬＩＳＡ」であり得、捕捉された抗原は、抗原に対する抗体を使用することによって間接的に検出され、次いで、抗原特異的抗体に直接または結合した標識を介してのいずれかで結合する別の酵素結合抗体によって検出される。レポーター試薬を用いて、第３の抗体が検出される。

本明細書で使用される「Ｆｃ受容体」 という用語は、受容体に関連する細胞質ＩＴＡＭ配列の存在を特徴とする活性化受容体を指す（例えば、Ｒａｖｅｔｃｈ，Ｊ．Ｖ．およびＢｏｌｌａｎｄ，Ｓ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（２００１）２７５－２９０を参照されたい）。このような受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＩＡである。「ＦｃγＲの結合がない」という用語は、１０μｇ／ｍｌの抗体濃度で、本明細書で報告する抗体のＮＫ細胞への結合が、国際公開第２００６／０２９８７９号において報告された抗ＯＸ４０Ｌ抗体ＬＣ．００１について認められる結合の１０％以下であることを表す。

ＩｇＧ４はＦｃＲ結合の低下を示すが、他のＩｇＧサブクラスの抗体は強い結合を示す。しかしながら、Ｐｒｏ２３８、Ａｓｐ２６５、Ａｓｐ２７０、Ａｓｎ２９７（Ｆｃ炭水化物の喪失）、Ｐｒｏ３２９および２３４、２３５、２３６および２３７Ｉｌｅ２５３、Ｓｅｒ２５４、Ｌｙｓ２８８、Ｔｈｒ３０７、Ｇｌｎ３１１、Ａｓｎ４３４およびＨｉｓ４３５は、改変されるとＦｃＲ結合も低下させる残基である（Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．，ら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）６５９１－６６０４；Ｌｕｎｄ，Ｊ．，ら，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９（１９９５）１１５－１１９；Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．，ら，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４；およびＥＰ０３０７４３４を参照されたい）。一実施形態では、本明細書に報告する抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ２サブクラスのものであり、変異ＰＶＡ２３６、ＧＬＰＳＳ３３１および／またはＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａを含む。一実施形態では、本明細書に記載される抗体はＩｇＧ４サブクラスのものであり、変異Ｌ２３５Ｅを含む。一実施形態では、抗体は変異Ｓ２２８Ｐをさらに含む。

本明細書での「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部分を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。該用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異体Ｆｃ領域とを含む。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端までに及ぶ。しかしながら、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム（ＫａｂａｔのＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。

本明細書に記載の抗体は、Ｆｃ領域として、一実施形態では、ヒト起源に由来するＦｃ領域を含む。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ヒト定常領域の全ての部分を含む。抗体のＦｃ領域は、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、Ｃ３活性化、およびＦｃ受容体結合に直接関与している。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃ１ｑへの結合は、Ｆｃ領域における画定された結合部位によって引き起こされる。このような結合部位は、先行技術で公知であり、例えば、Ｌｕｋａｓ，Ｔ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２７（１９８１）２５５５－２５６０、Ｂｒｕｎｈｏｕｓｅ，Ｒ．およびＣｅｂｒａ，Ｊ．Ｊ．、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６（１９７９）９０７－９１７、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ２８８（１９８０）３３８－３４４、Ｔｈｏｍｍｅｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３７（２０００）９９５－１００４、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ，Ｅ．Ｅ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４（２０００）４１７８－４１８４、Ｈｅｚａｒｅｈ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２００１）１２１６１－１２１６８、Ｍｏｒｇａｎ，Ａ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８６（１９９５）３１９－３２４、および欧州特許第０３０７４３４号において記載されている。そのような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１およびＰ３２９（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵインデックスとも呼ばれる、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ら，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版，ＰｕｂｌｉｃＨｅａｌｔｈＳｅｒｖｉｃｅ，ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１），ＮＩＨＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ９１－３２４２に記載されるような、ＥＵナンバリングシステム）である。サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ３の抗体は通常、補体活性化、Ｃ１ｑ結合、およびＣ３活性化を示すのに対し、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑと結合せず、Ｃ３を活性化しない。「抗体のＦｃ領域」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン切断に基づいて画定される。一実施形態では、Ｆｃ領域はヒトＦｃ領域である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、変異Ｓ２２８Ｐおよび／またはＬ２３５Ｅ（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング）を含むヒトＩｇＧ４サブクラスのものである。一態実施形態では、Ｆｃ領域は変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）を含むヒトＩｇＧ１サブクラスのものである。

「完全長抗体」、「インタクト抗体」、および「全抗体」という用語は、本明細書では互換的に使用され、天然の抗体構造と実質的に同様の構造を有する、すなわち２本の軽鎖と２本の重鎖とを含む抗体を指す。

「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞により産生された抗体、またはヒト抗体レパートリまたは他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト由来の抗体に対応するアミノ酸配列を有する抗体である。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。

「インビトロ」という用語は、そのような人工環境、またはそのような人工環境内でプロセスもしくは反応が行われることのいずれかを示す。

「インビボ」という用語は、化合物の自然環境（例えば、動物または細胞）、またはプロセスもしくは反応がその自然環境内で行われることを表す。

「イムノアッセイ」という用語は、抗体などの特異的に結合する分子を利用して、定性分析または定量分析のための特異的標的を捕捉および/または検出する任意の技術を表す。一般に、イムノアッセイは、以下の工程を特徴とする。１）分析物の固定化または捕捉と、２）分析物の検出および測定とを含む、方法。分析物は、例えば膜、プラスチックプレート、または他の何らかの固体表面などの任意の固体表面上に捕捉され得る、すなわち結合され得る。

「リンカー」という用語は、本明細書に記載の血液脳関門シャトルモジュールおよび／または融合ポリペプチドおよび／またはコンジュゲートの種々のエンティティを共有結合的に連結する化学リンカーまたは一本鎖ペプチドリンカーを表す。リンカーは、例えば脳エフェクターエンティティを一価の結合エンティティに連結する。例えば、一価の結合エンティティがＣＨ２－ＣＨ３ Ｉｇエンティティおよび血液脳関門受容体に指向するｓｃＦａｂを含む場合、リンカーはＣＨ３－ＣＨ２ ＩｇエンティティのＣ末端にｓｃＦａｂをコンジュゲートさせる。脳エフェクターエンティティを一価の結合エンティティにコンジュゲート化するリンカー（第１のリンカー）およびｓｃＦａｂをＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ末端に連結するリンカー（第２のリンカー）は、同じであっても異なっていてもよい。

ペプチド結合によって連結された１～２０個のアミノ酸残基を含む一本鎖ペプチドリンカーを使用し得る。特定の実施形態では、アミノ酸は、２０個の天然アミノ酸から選択される。特定の他の実施形態では、アミノ酸の１つ以上は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。いくつかの実施形態では、リンカーは化学的リンカーである。特定の実施形態では、リンカーは、少なくとも２５アミノ酸残基の長さ、好ましい一実施形態では３２～５０アミノ酸残基の長さを有するアミノ酸配列を有する一本鎖ペプチドリンカーである。一実施形態では、ペプチドリンカーは、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、（ｘ＝３、ｎ＝８、９または１０）または（ｘ＝４およびｎ＝６、７または８）であり、一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝６または７であり、好ましい一実施形態では、ｘ＝４、ｎ＝７である（ＧｘＳ）ｎリンカーである。一実施形態では、リンカーは（Ｇ４Ｓ）４（配列番号０２）である。一実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）６Ｇ２（配列番号０３）である。

コンジュゲーションは、様々な化学リンカーを使用して実施され得る。例えば、一価の結合エンティティまたは融合ポリペプチドおよび脳エフェクターエンティティは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、ジメチルアジピミデートＨＣｌ）、活性エステル（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアネート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアネート）、およびビス－活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲートされ得る。リンカーは、脳への送達時にエフェクターエンティティの放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２（１９９２）１２７－１３１；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。

共有結合的コンジュゲーションは、直接的、またはリンカーを介してのいずれかてあり得る。特定の実施形態では、直接的コンジュゲーションは、ポリペプチド融合物（すなわち、ＢＢＢＲおよびエフェクターエンティティに対する一価の結合エンティティをコードし、単一のポリペプチド（鎖）として発現される２つの遺伝子の遺伝子融合によって）の構築によるものである。特定の実施形態では、直接的コンジュゲーションは、ＢＢＢＲに対する一価の結合エンティティの２つの部分のうちの１つにおける反応性基と、脳エフェクターエンティティ上の対応する基またはアクセプターとの間の共有結合の形成によるものである。特定の実施形態では、直接コンジュゲーションは、コンジュゲートされるべき２つの分子のうちの一方を、適切な条件下でコンジュゲートされるべき他方の分子への共有結合を形成する反応性基（非限定的な例として、スルフヒドリル基またはカルボキシル基）を含むように改変（すなわち、遺伝子改変）することによるものである。１つの非限定的な例として、所望の反応性基（すなわち、システイン残基）を有する分子（すなわち、アミノ酸）を、例えば、ＢＢＢＲ抗体に対する一価の結合エンティティおよび神経治療用抗体で形成されたジスルフィド結合に導入し得る。核酸およびタンパク質の共有結合的コンジュゲーションのための方法も、当技術分野で公知である（すなわち、光架橋、例えばＺａｔｓｅｐｉｎら．Ｒｕｓｓ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．７４（２００５）７７－９５を参照されたい）。コンジュゲーションはまた、様々なリンカーを使用して実施され得る。例えば、一価結合エンティティおよびエフェクターエンティティは、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシラート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣｌ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス－アジド化合物（例えば、ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス－ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６－ジイソシアナート）および二活性フッ素化合物（例えば、１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼン）などの多様な二官能性タンパク質カップリング剤を使用してコンジュゲートされ得る。ペプチド結合によって連結された１～２０個のアミノ酸残基からなるペプチドリンカーも使用され得る。特定のこのような実施形態では、アミノ酸残基は、２０個の天然に存在するアミノ酸から選択される。特定の他のそのような実施形態では、アミノ酸残基の１つ以上数は、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミンおよびリジンから選択される。リンカーは、脳への送達時にエフェクターエンティティの放出を促進する「切断可能なリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２（１９９２）１２７－１３１；米国特許第５，２０８，０２０号）が使用され得る。

本明細書で使用される 「モノクローナル抗体」 という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指す、すなわち、例えば天然に存在する変異を含有するか、またはモノクローナル抗体調製物の産生中に生じる可能性のある変異体抗体を除いて、集団を含む個々の抗体は同一であり、そのような変異体は一般に少量存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に同種の抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従うモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含むがこれらに限定されない様々な技術によって作製することができ、そのような方法および本明細書に記載されているモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を含むがこれらに限定されない。

「一価の結合エンティティ」という用語は、ＢＢＢＲに特異的に一価結合モードで結合し得る分子を示す。本明細書に記載の血液脳シャトルモジュールおよび／またはコンジュゲートは、一価の結合エンティティの単一単位の存在を特徴とする、すなわち、本発明の血液脳シャトルモジュールおよび／またはコンジュゲートは、一価の結合エンティティを正確に１単位含む。一価の結合エンティティとしては、ポリペプチド、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’を含む抗体断片、Ｆｖ断片、一本鎖抗体分子、例えば一本鎖Ｆａｂ、ｓｃＦｖが挙げられるが、これらに限定されない。一価の結合エンティティは、例えば、ファージディスプレイまたは免疫化などの最先端技術を使用して操作された足場タンパク質であり得る。一価の結合エンティティはまた、ポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、一価の結合エンティティは、ＣＨ２－ＣＨ３Ｉｇドメインと、血液脳関門受容体に指向された一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）とを含む。ｓｃＦａｂは、リンカーによってＣＨ２－ＣＨ３ ＩｇドメインのＣ－末端にカップリングされている。特定の実施形態では、ｓｃＦａｂは、トランスフェリン受容体を対象とする。

「１価の結合モード」という用語は、一価の結合エンティティとＢＢＢＲとの間の相互作用が単一のエピトープを介して起こるＢＢＢＲへの特異的結合を示す。一価の結合モードは、単一のエピトープ相互作用点に起因するＢＢＢＲの二量体化／多量体化を防止する。一価の結合様式は、ＢＢＢＲの細胞内選別が変化するのを防止する。

「ネイキッド抗体」とは、異種部位（例えば、細胞毒性部位）または放射性標識に結合していない抗体を指す。ネイキッド抗体は、医薬組成物中に存在していてもよい。

「ネイティブ抗体」とは、様々な構造を持つネイティブに存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合されている２つの同一の軽鎖および２つの同一の重鎖で構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）を有し、それに続いて３つの定常重ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）を有し、それに続いて定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。

「医薬組成物」または「医薬製剤」という用語は、調製物に含まれる有効成分の生物活性が有効になるような形態をしており、かつ、医薬組成物が投与されるであろう対象に対して容認できないほど毒性のある追加の成分を含まない、調製物を指す。

「薬学的に許容され得る担体」は、有効成分以外の医薬組成物または製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容され得る担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。

「サンプル」という用語は、生物または以前の生物からの任意の量の物質を含むが、これらに限定されない。そのような生物としては、マウス、サル、ラット、ウサギ、および他の動物が挙げられる。一実施形態では、サンプルは、サル、特にカニクイザル、またはウサギ、またはマウス、またはラットから得られる。

本明細書で使用される「シグナル」という用語は、反応が起こったこと、例えば抗体のその抗原への結合を示すために使用できる任意の検出可能な物理的変化を包含する。蛍光または比色生成物／試薬の形態のシグナルは、シグナルの特定の形態であり、本発明による方法で使用し得ることが意図される。本発明のいくつかの実施形態では、シグナルを定量的に評価する。

「固相」は非流体物質を表し、ポリマー、金属（常磁性、強磁性粒子）、ガラス、およびセラミックなどの材料から作られた粒子（マイクロ粒子およびビーズを含む）；シリカ、アルミナ、およびポリマーゲルなどのゲル物質；ポリマー、金属、ガラス、および／またはセラミックから作られていてもよい、キャピラリー；ゼオライトおよび他の多孔性物質；電極；マイクロタイタープレート；固体ストリップ；ならびにキュベット、チューブまたは他の分光計サンプル容器が挙げられる。「固体支持体」は、分子と化学的に相互作用することが意図される少なくとも１つの部分をその表面上に含有するという点で、アッセイの固相成分は不活性固体表面から区別される。固相は、チップ、チューブ、ストリップ、キュベット、もしくはマイクロタイタープレートなどの静止した成分であってもよく、またはビーズおよびマイクロ粒子などの静止していない成分であってもよい。タンパク質および他の物質の非共有結合または共有結合のいずれかを可能とする様々なマイクロ粒子が使用されてもよい。このような粒子には、ポリスチレンおよびポリ（メチルメタクリレート）などのポリマー粒子が含まれ；金ナノ粒子、金コロイド等の金粒子；シリカ、ガラス、金属酸化物粒子などのセラミック粒子などが挙げられる。例えば、Ｍａｒｔｉｎ，Ｃ．Ｒ．，ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ－Ｎｅｗｓ＆Ｆｅａｔｕｒｅｓ，７０（１９９８）３２２Ａ－３２７Ａ、またはＢｕｔｌｅｒ，Ｊ．Ｅ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ２２（２０００）４－２３を参照されたい。

「治療用（モノクローナル）抗体」および「薬物」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本明細書の「抗体」という用語は、最も広範な意味で使用されており、所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および抗体断片を含むがこれらに限定されない、種々の抗体構造を包含する。

「トランスフェリン受容体」（「ＴｆＲ」）は、脊椎動物における鉄取り込みに関与する２つのジスルフィド結合サブユニット（それぞれ約９０，０００Ｄａの見かけの分子量）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００Ｄａ）である。一実施形態では、本明細書で言及されるＴｆＲは、例えば、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒら（Ｎａｔｕｒｅ ３１１（１９８４）６７５－６７８）のようなアミノ酸配列を含むヒトＴｆＲである。

多重特異性抗体
一実施形態では、治療用抗体は二重特異性抗体である。一実施形態では、治療用抗体は二重特異性三価抗体である。好ましい一実施形態では、治療用抗体は、モノクローナル二重特異性三価抗体である。

特定の実施形態では、治療用抗体は多重特異性抗体、例えば二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、結合特異性の１つは第一の抗原に対するものであり、他は、異なる第二の抗原に対するものである。二重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。一実施形態では、抗体は、第１および第２の抗原に特異的に結合する二重特異性抗体である。一実施形態では、二重特異性抗体は、ｉ）第１の抗原に特異的に結合する第１の結合特異性、およびｉｉ）第２の抗原に特異的に結合する第２の結合特異性を有する。一実施形態では、抗体は二重特異性三価抗体である。好ましい一実施形態では、抗体はモノクローナル二重特異性三価抗体である。

一実施形態では、結合部位の１つがＢＢＢＲに特異的に結合する。

多重特異性抗体を作製するための技術としては、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．およびＣｕｅｌｌｏ，Ａ．Ｃ．、Ｎａｔｕｒｅ３０５（１９８３）５３７－５４０、国際公開第９３／０８８２９号、およびＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ，Ａ．ら、ＥＭＢＯ Ｊ．１０（１９９１）３６５５－３６５９を参照されたい）、および「ノブ・イン・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号を参照されたい）が挙げられるが、これらに限定されない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を作製するための静電的ステアリング効果の操作（国際公開第２００９／０８９００４号）、２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号、およびＢｒｅｎｎａｎ，Ｍ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２９（１９８５）８１－８３を参照）、ロイシンジッパを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ，Ｓ．Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８（１９９２）１５４７－１５５３を参照；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０（１９９３）６４４８－６４４４を参照）、および一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ，Ｍ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（１９９４）５３６８－５３７４を参照、および、例えば、Ｔｕｔｔ，Ａ．ら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：（１９９１）６０－６９）に記載されるような三重特異性抗体を調製することによっても作製され得る。

抗体または断片はまた、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２００９／０８０２５２号、国際公開第２００９／０８０２５３号、国際公開第２００９／０８０２５４号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号または国際公開第２０１０／１４５７９３号に記載されている多重特異性抗体であり得る。

異なる二重特異性抗体フォーマットが知られている。

本明細書に報告されるような方法に使用され得る例示的な二重特異性抗体の形態は以下の通りである。
－ ＣｒｏｓｓＭａｂフォーマット（＝ＣｒｏｓｓＭａｂ）：第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片を含む多重特異性ＩｇＧ抗体であって、第１のＦａｂ断片において、
ａ）Ｃおり（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含む）；
ｂ）ＶＨおよびＶＬドメインのみが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＬドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＨ１ドメインを含む）；または
ｃ）ＣＨ１とＣＬドメインが互いに置き換えられ、ＶＨおよびＶＬドメインが互いに置き換えられており（すなわち、第１のＦａｂ断片の軽鎖はＶＨおよびＣＨ１ドメインを含み、第１のＦａｂ断片の重鎖はＶＬおよびＣＬドメインを含む）；および
第二のＦａｂ断片が、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む重鎖とを含み、
ＣｒｏｓｓＭａｂは、ＣＨ３ドメインを含む第１の重鎖およびＣＨ３ドメインを含む第２の重鎖を含み得、ここで、両方のＣＨ３ドメインは、例えば国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、または国際公開第２０１３／０９６２９１号（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているように、第１の重鎖および修飾された第２の重鎖のヘテロ二量体化を支援するために、それぞれのアミノ酸置換によって相補的になるように操作されている。
－ アーム一本鎖形式（＝一アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである。
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖カッパ定常ドメイン）
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 重鎖（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 二アーム一本鎖フォーマット（＝二アーム一本鎖抗体）：第１のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第１の結合部位と、第２のエピトープまたは抗原に特異的に結合する第２の結合部位とを含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ１（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）；
－ 軽鎖／重鎖の組み合わせ２（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン＋ペプチドリンカー＋可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 一般的な軽鎖二重特異性フォーマット（＝一般的な軽鎖二重特異性抗体）：第１の抗原に特異的に結合する第１の結合部位および第２の抗原に特異的に結合する第２の結合部位を含む抗体であって、個々の鎖は以下の通りである：
－ 軽鎖（可変軽鎖ドメイン＋軽鎖定常ドメイン）
－ 重鎖１（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ホール変異を有するＣＨ３）
－ 重鎖２（可変重鎖ドメイン＋ＣＨ１＋ヒンジ＋ＣＨ２＋ノブ変異を有するＣＨ３）；
－ 二重特異性Ｆａｂフォーマット：ＶＨおよびＶＬドメインの相補的対に２つの（重複しない）パラトープを含むＦａｂであって、第１のパラトープが、ＶＬドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ３ならびにＶＨドメインのＣＤＲ２由来のアミノ酸残基を含み（からなり）、第２のパラトープが、ＶＨドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ３ならびにＶＬドメインのＣＤＲ２由来の残基を含む（からなる）Ｆａｂ（この文脈における「非重複」という用語は、二重特異性Ｆａｂの第１パラトープ内に含まれるアミノ酸残基が第２パラトープ内に含まれず、二重特異性Ｆａｂの第２パラトープ内に含まれるアミノ酸が第１パラトープ内に含まれないことを示す）：
－ ＴＣＢフォーマット：
－ 第１および第２のＦａｂ断片であって、第１および第２のＦａｂ断片の各結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、第１および第２のＦａｂ断片と、
－ 第３のＦａｂ断片であって、第３のＦａｂ断片の結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）と可変重鎖ドメイン（ＶＨ）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含む、第３のＦａｂ断片と、
－ Ｆｃ領域であって、第１のＦｃ領域のポリペプチドと第２のＦｃ領域のポリペプチドとを含む、Ｆｃ領域を含み、
第１のＦａｂ断片および第２のＦａｂ断片は、それぞれ、重鎖断片および完全長軽鎖を含み、
第１のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第１のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されており、
第２のＦａｂ断片の重鎖断片のＣ末端は、第３のＦａｂ断片の可変軽鎖ドメインのＮ末端に融合されており、第３のＦａｂ断片トの重鎖定常ドメイン１のＣ末端は、第２のＦｃ領域ポリペプチドのＮ末端に融合されている二重特異性抗体。
－ 脳－シャトル（ｂｒａｉｎ－ｓｈｕｔｔｌｅ）フォーマット（ＢＳ）：
ａ）（完全長）抗体軽鎖と（完全長）抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの（完全長）抗体であって、（完全長）重鎖と（完全長）軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの（完全長）抗体と、
ｂ）１つのさらなるＦａｂ断片であって、（完全長）抗体の１つの重鎖の任意のＣ末端に融合されており、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２抗原に特異的に結合する、さらなるＦａｂ断片とを含み、
第２抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）と定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含み、
第１の抗原が脳標的であり、第２の抗原がヒトトランスフェリン受容体である。

一実施形態では、二重特異性抗体はＣｒｏｓｓＭａｂである。

一実施形態では、二重特異性抗体は一アーム一本鎖抗体である。

一実施形態では、二重特異性抗体は二アーム一本鎖抗体である。

一実施形態では、二重特異性抗体は共通の軽鎖二重特異性抗体である。

一実施形態では、二重特異性抗体は二重特異性Ｆａｂである。

一実施形態では、二重特異性抗体はＴＣＢである。

一実施形態では、二重特異性抗体はＢＳである。

多価多重特異性抗体は、異なる標的に特異的に結合し、各標的に対して異なる親和性および複雑な安定性を有する可能性が最も高い。完全に活性な多価多重特異性抗体のみが全ての標的に結合することができ、対応するアッセイにおいて完全な生物学的活性を示す。

Ａ．例示的二重特異性抗体：抗ヒトＡ－ベータ／ヒトトランスフェリン受容体抗体
特定の実施形態では、本発明による方法で決定される治療用抗体は、ヒトＡ－βおよびヒトトランスフェリン受容体に結合する抗体である。この抗体は、全長コア抗体と、一定のドメインが公差的に交換されている融合Ｆａｂ断片とからなる二重特異性抗体である。したがって、得られる二重特異性抗体は非対称である。したがって、二重特異性抗体は、いわゆるノブ変異を持つ第１重鎖（ＨＣノブ）と、いわゆるホール変異を持つ第２重鎖（ＨＣホール）とを用いて、ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅｓ）と呼ばれるヘテロ二量体化技術を用いて作製される。

例示的抗体００１２は、配列番号０４～０７のアミノ酸配列を有する４つのポリペプチドから構成される。

例示的抗体００１５は、配列番号０８～１１のアミノ酸配列を有する４つのポリペプチドから構成される。

例示的抗体００２０は、配列番号１２～１４のアミノ酸配列を有する３つのポリペプチドから構成される。

例示的抗体００２４は、配列番号１５～１８のアミノ酸配列を有する４つのポリペプチドから構成される。

一態様では、二重特異性抗体は、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）さらなるＦａｂ断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、さらなるＦａｂ断片とを含み、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）の１２３番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに；Ｅ１２３Ｒ変異）および１２４番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに；Ｑ１２４Ｋ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第１定常重鎖ドメイン（ＣＨ１）の１４７番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに；Ｋ１４７Ｅ変異）および２１３番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに；Ｋ２１３Ｅ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
第２抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）と定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含み、
第１抗原はヒトＡ－ベータタンパク質であり、かつ第２抗原はヒトトランスフェリン受容体である。

別の実施形態では、治療用抗体は、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）さらなるＦａｂ断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、さらなるＦａｂ断片とを含み、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）の１２３番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに；Ｅ１２３Ｒ変異）および１２４番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに；Ｑ１２４Ｋ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第１定常重鎖ドメイン（ＣＨ１）の１４７番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに；Ｋ１４７Ｅ変異）および２１３番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに；Ｋ２１３Ｅ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、
第２抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）と定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含む二重特異性抗体であって、
第１抗原はヒトＡ－ベータタンパク質であり、かつ第２抗原はヒトトランスフェリン受容体であり、
ヒトＡ－ベータ結合部位が、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列、および配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含み、
ヒトトランスフェリン受容体結合部位が、配列番号２１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列と、配列番号２２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列とを含む。

特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列に対して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む結合部位は、その抗原に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号１９または２１において置換、挿入、および／または欠失されている特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。

特定の実施形態では、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有するＶＬ配列が、参照配列と比較して置換（例えば、保存的置換）、挿入または欠失を含むが、その配列を含む結合部位は、その抗原に結合する能力を保持している。特定の実施形態では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号２０または２２において置換、挿入、および／または欠失されている。特定の実施形態では、置換、挿入、または欠失は、ＨＶＲの外側の領域で（すなわち、ＦＲで）生じる。

一実施形態では、ヒトＡ－ベータ結合部位は、配列の翻訳後修飾を含む配列番号１９におけるようなＶＨ配列、および配列番号２０におけるようなＶＬ配列を含む。

一実施形態では、ヒトトランスフェリン受容体結合部位は、配列の翻訳後修飾を含む、配列番号２１のようなＶＨ配列および配列番号２２のようなＶＬ配列を含む。

一実施形態では、二重特異性抗体は、
ｉ）配列番号２３と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％以上の配列同一性を有する軽鎖と、
ｉｉ）配列番号２４と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％以上の配列同一性を有する重鎖と、
ｉｉｉ）配列番号２５と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％以上の配列同一性を有する軽鎖と、
ｉｖ）配列番号２６と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または９５％以上の配列同一性を有する重鎖Ｆａｂ断片とを含み、
上記配列中、
配列番号２３は、アミノ酸配列ＤＩＶＬＴＱＳＰＡＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＳＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＳＳＲＡＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＥＰＥＤＦＡＴＹＹＣＬＱＩＹＮＭＰＩＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＲＫＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣを有し、
配列番号２４は、アミノ酸配列ＱＶＥＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＡＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＮＡＳＧＴＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＫＧＮＴＨＫＰＹＧＹＶＲＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＥＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＥＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＣＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＳＣＡＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＶＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧを有し、
配列番号２５は、アミノ酸配列ＡＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＡＳＴＬＡＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＮＹＡＳＳＮＶＤＮＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣを有し、
配列番号２６は、アミノ酸配列ＱＳＭＱＥＳＧＰＧＬＶＫＰＳＱＴＬＳＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＡＭＳＷＩＲＱＨＰＧＫＧＬＥＷＩＧＹＩＷＳＧＧＳＴＤＹＡＳＷＡＫＳＲＶＴＩＳＫＴＳＴＴＶＳＬＫＬＳＳＶＴＡＡＤＴＡＶＹＹＣＡＲＲＹＧＴＳＹＰＤＹＧＤＡＳＧＦＤＰＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣを有する。

別の実施形態では、治療用抗体は、
ａ）完全長抗体軽鎖と完全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖と完全長軽鎖のそれぞれの対により形成される結合部位が、第１の抗原に特異的に結合する、１つの完全長抗体と、
ｂ）さらなるＦａｂ断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、さらなるＦａｂ断片とを含み、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）の１２３番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに；Ｅ１２３Ｒ変異）および１２４番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに；Ｑ１２４Ｋ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第１定常重鎖ドメイン（ＣＨ１）の１４７番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに；Ｋ１４７Ｅ変異）および２１３番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに；Ｋ２１３Ｅ変異）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、二重特異性抗体であり、
第２抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）と定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含む二重特異性抗体であって、
第１抗原はヒトＡ－ベータタンパク質であり、かつ第２抗原はヒトトランスフェリン受容体であり、
ヒトＡ－ベータ結合部位が、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、
ヒトトランスフェリン受容体結合部位が、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含む。

別の実施形態では、治療用抗体は、
ａ）全長抗体軽鎖および全長抗体重鎖のそれぞれ２対を含む１つの完全長抗体であって、完全長重鎖および完全長軽鎖の対のそれぞれによって形成される結合部位が第１の抗原に特異的に結合し、完全長抗体が、２つの完全長重鎖の、それぞれがＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含むＦｃ領域ポリペプチドによって形成されるＦｃ領域を含み、
ｂ）さらなるＦａｂ断断片であって、完全長抗体の１つの重鎖のＣ末端に融合されており、さらなるＦａｂ断片の結合部位が第２の抗原に特異的に結合する、さらなるＦａｂ断片とを含み、
完全長抗体軽鎖のそれぞれは、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）の１２３番目にアミノ酸残基アルギニン（野生型のグルタミン酸残基の代わりに；Ｅ１２３Ｒ変異）および１２４番目にアミノ酸残基リジン（野生型のグルタミン残基の代わりに；Ｑ１２４Ｋ変異）を含み（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）、
完全長抗体重鎖のそれぞれは、第１定常重鎖ドメイン（ＣＨ１）の１４７番目にグルタミン酸残基（野生型のリジン残基の代わりに；Ｋ１４７Ｅ変異）および２１３番目にグルタミン酸残基（野生型のリジンアミノ酸残基の代わりに；Ｋ２１３Ｅ変異）を含む（ナンバリングはＫａｂａｔ ＥＵインデックスに従う）、二重特異性抗体であり、
第２抗原に特異的に結合するさらなるＦａｂ断片が、定常軽鎖ドメイン（ＣＬ）と定常重鎖ドメイン１（ＣＨ１）とが互いに置換されるようにドメイン交差を含む二重特異性抗体であって、
第１抗原はヒトＡ－ベータタンパク質であり、かつ第２抗原はヒトトランスフェリン受容体であり、
ヒトＡ－ベータ結合部位が、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、
ヒトトランスフェリン受容体結合部位が、配列番号２１のアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と、配列番号２２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とを含み、
Ｆｃ領域ポリペプチドは以下である：
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１、
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４、
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ、およびＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４、
ｅ）両方のＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、およびＰ３２９Ｇ、ならびに１つのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ、ならびに他のそれぞれのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１、
ｆ）両方のＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｓ２２８ＰおよびＰ３２９Ｇ、ならびに１つのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ、ならびに他のそれぞれのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４、
ｇ）両方のＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、およびＨ４３５Ａ、ならびに１つのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ、ならびに他のそれぞれのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１、
ｈ）両方のＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ、Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、およびＴ２５６Ｅ、ならびに１つのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃ、ならびに他のそれぞれのＦｃ領域ポリペプチド中の変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１。

Ｂ．例示的な抗トランスフェリン受容体抗体
本発明による方法で決定される治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、適切なＢＢＢシャトリングを確実にするために、一定の範囲内にあるヒトトランスフェリン受容体への結合のオフレートを有する。この範囲は、一端では、カニクイザルトランスフェリン受容体に対する表面プラズモン共鳴によって決定されるマウス抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１（配列番号２７および２８で与えられる可変ドメインアミノ酸配列）のオフレートによって定義され、他端では、そのオフレートの５％（すなわち、２０倍遅い解離）によって定義される。ヒトトランスフェリン受容体のオフレートは、０．１ １／ｓ～０．００５ １／ｓであるべきである。

本明細書に記載の一態様は、ヒトトランスフェリン受容体およびカニクイザルトランスフェリン受容体に特異的に結合する抗トランスフェリン受容体抗体であって、
ｉ）配列番号２９の重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、
ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含み、
抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に対するオフレートが、カニクイザルトランスフェリン受容体に対する抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１のオフレート以下（すなわち、最大で）であり、
オフレートは表面プラズモン共鳴によって決定され、
抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１は、配列番号２７の重鎖可変ドメインおよび配列番号２８の軽鎖可変ドメインを有する。

一実施形態では、ヒトトランスフェリン受容体のオフレートは、０．１ １／ｓ～０．００５ １／ｓである。

一実施形態では、抗体は、８０位の軽鎖可変ドメインにおいて、プロリンアミノ酸残基（Ｐ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、９１位の軽鎖可変ドメインにおいて、アスパラギンアミノ酸残基（Ｎ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、９３位の軽鎖可変ドメインにおいて、アラニンアミノ酸残基（Ａ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、１００ｇ位の重鎖可変ドメインにおいて、セリンアミノ酸残基（Ｓ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、１００ｇ位の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、６５位の重鎖可変ドメインにおいて、セリンアミノ酸残基（Ｓ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体は、１０５位の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）を有する。

一実施形態では、抗体が、８０位の軽鎖可変ドメインにおいて、プロリンアミノ酸残基（Ｐ）を有し、９１位の軽鎖可変ドメインにおいて、アスパラギンアミノ酸残基（Ｎ）を有し、９３位の軽鎖可変ドメインにおいて、アラニンアミノ酸残基（Ａ）を有し、１００ｇ位の重鎖可変ドメインにおいて、セリンアミノ酸残基（Ｓ）を有し、６５位の重鎖可変ドメインにおいて、セリンアミノ酸残基（Ｓ）を有し、１０５位の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）を有する（ナンバリングはＫａｂａｔによる）。

一実施形態では、抗体が、８０位の軽鎖可変ドメインにおいて、プロリンアミノ酸残基（Ｐ）を有し、９１位の軽鎖可変ドメインにおいて、アスパラギンアミノ酸残基（Ｎ）を有し、９３位の軽鎖可変ドメインにおいて、アラニンアミノ酸残基（Ａ）を有し、１００ｇ位置の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）を有し、６５位の重鎖可変ドメインにおいて、セリンアミノ酸残基（Ｓ）を有し、１０５位の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）を有する（ナンバリングはＫａｂａｔによる）

そのような抗トランスフェリン受容体二重特異性抗体は、血液脳関門を通過して脳内に脳エフェクターエンティティを送達するための血液脳関門シャトルモジュールとして使用し得る。血液脳関門シャトルモジュールは、ヒトトランスフェリン受容体に特異的に結合する一価の結合エンティティである。血液脳関門シャトルモジュールとして使用される場合の抗トランスフェリン受容体二重特異性抗体は、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病およびアルツハイマー病とパーキンソン病の併存症などの神経障害の診断または処置に有用である。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、ヒトトランスフェリン受容体に関して結合オフレートに関するカニクイザルトランスフェリン受容体に対するマウス抗体１２８．１の結合特性を反映する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインを含む。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、ヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）およびカニクイザルトランスフェリン受容体（ｃｙＴｆＲ）に特異的に結合し、ｉ）配列番号２９の重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含み、軽鎖可変ドメインは、８０位にプロリンアミノ酸残基（Ｐ）、９１位にアスパラギンアミノ酸残基（Ｎ）および位置９３にアラニンアミノ酸残基（Ａ）を有する（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、１００ｇ位の重鎖可変ドメインにおいて、、セリンアミノ酸残基（Ｓ）をさらに有する（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、６５位の重鎖可変ドメインにおいて、、セリンアミノ酸残基（Ｓ）をさらに有する（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、１０５位の重鎖可変ドメインにおいて、グルタミンアミノ酸残基（Ｑ）をさらに有する（ナンバリングはＫａｂａｔに従う）。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、ヒトトランスフェリン受容体（ｈｕＴｆＲ）およびカニクイザルトランスフェリン受容体（ｃｙＴｆＲ）に特異的に結合し、ｉ）配列番号２９の重鎖可変ドメインに由来するヒト化重鎖可変ドメインと、ｉｉ）配列番号３０の軽鎖可変ドメインに由来するヒト化軽鎖可変ドメインとを含み、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体についての単位１／ｓで表したオフレートが、カニクイザルトランスフェリン受容体についての抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１の単位１／ｓで表したオフレート以下であり（すなわち、最大で）、オフレートは表面プラズモン共鳴によって決定され、抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１は、配列番号２７の重鎖可変ドメインと配列番号２８の軽鎖可変ドメインとを有する。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、ヒトトランスフェリン受容体についての単位１／ｓで表したオフレートを有し、ｉ）カニクイザルトランスフェリン受容体についての抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１の単位１／ｓで表したオフレート以下（すなわち、最大で）であり、ｉｉ）カニクイザルトランスフェリン受容体についての抗トランスフェリン受容体抗体１２８．１の単位１／ｓでのオフレートの５％以上（すなわち、少なくとも）である。

一実施形態では、治療用抗体の抗トランスフェリン受容体結合部位は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３５、３６または３７、好ましい一実施形態では、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

上記の実施形態のいずれかにおいて、抗トランスフェリン受容体結合部位はヒト化されている。一実施形態では、抗トランスフェリン受容体結合部位は、上記の実施形態のいずれかのＨＶＲを含み、アクセプターヒトフレームワーク、例えばヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワークをさらに含む。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインとの少なくとも一対と、ヒトＣＤ２０に対する配列番号４１の重鎖可変ドメインおよび配列番号４２の軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。一実施形態では、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔによる１１位のアミノ酸残基の、ロイシン以外の任意のアミノ酸による置換を含む。一実施形態では、置換は、Ｋａｂａｔによる１１位のアミノ酸残基の非極性アミノ酸による置換を含む。好ましい一実施形態では、置換は、配列番号４１の重鎖可変ドメインのＫａｂａｔによるによる１１位のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基による置換を含む。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号４３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４４の軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号４５に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号４６に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号４７に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号４８に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号４９に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５０に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号５１に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５２に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ヒトアルファ－シヌクレインに対する配列番号５３に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５４に由来するヒト化軽鎖可変ドメイン結合部位の少なくとも一対とを含む二重特異性抗体である。

一実施形態では、抗体は、トランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの少なくとも一対と、ｉ）配列番号５５のアミノ酸配列を有するグルセレブロシダーゼ、またはｉｉ）少なくとも７０％の配列同一性を有する配列番号５５の機能的バリアント、またはｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸の変異、欠失もしくは挿入を有する配列番号５５の機能的バリアント、またはｉｖ）Ｎ末端もしくはＣ末端もしくはアミノ酸配列内に少なくとも１つのアミノ酸残基が欠失した配列番号５５の切断型機能的バリアント、またはｖ）ｉｉｉ）およびｉｖ）の組み合わせに対する結合部位とを有する二重特異性抗体である。

別の実施形態では、治療用抗体は多重特異性抗体である。そのような一実施形態では、多重特異性抗体は、ＴｆＲに結合する第１の抗原結合部位と、脳抗原に結合する第２の抗原結合部位とを含む。そのような一態様では、脳抗原は、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、Ａベータ、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ（ＡｐｏＥ）、アルファ－シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、グルコセレブロシダーゼ、およびカスパーゼ６からなる群から選択される。別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴｆおよびＢＡＣＥ１のいずれにも結合する。別の実施形態では、多重特異性抗体はＴｆＲおよびＡベータのいずれにも結合する。別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴｆＲおよびアルファシヌクレインのいずれにも結合する。別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴｆＲおよびＣＤ２０のいずれにも結合する。別の実施形態では、多重特異性抗体は、ＴｆＲおよびグルコセレブロシダーゼのいずれにも結合する。別の実施形態では、治療化合物は神経障害治療用抗体である。

一実施形態では、エフェクター機能は、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変によって低減または排除される。一実施形態では、エフェクター機能または補体活性化機能は、Ｆｃ領域の全部または一部の欠失によって、またはエフェクター機能または補体活性化機能に適格なＦｃ領域または非Ｆｃ領域を含まないように抗体を設計することによって、低減または排除される。一実施形態では、Ｆｃ領域の少なくとも１つの改変は、以下の位置から選択される１つ以上のＦｃ受容体への結合を阻害するＦｃ領域の点変異から選択される。２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３０ ３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８、４３９；以下の位置から選択されるＣ １ ｑへの結合を阻害するＦｃ領域の点変異：２７０、３２２、３２９、３２１；Ｆｃ領域の一部または全部、およびＣＨ １ドメインの１３２位における点変異を排除すること。一実施形態では、改変は、以下の位置から選択されるＣ１ｑへの結合を阻害するＦｃ領域の点変異である。２７０、３２２、３２９、および３２１。別の実施形態では、改変は、Ｆｃ領域の一部または全部の除去である。別の実施形態では、補体トリガー機能は、Ｆｃ領域の全部または一部の欠失によって、または補体経路に係合するＦｃ領域を含まないように抗体を設計することによって低減または排除される。一実施形態では、抗体は、Ｆａｂまたは一本鎖抗体から選択される。別の実施形態では、抗体の非Ｆｃ領域は、抗体による補体経路の活性化を低減または排除するように修飾される。一実施形態では、改変は、Ｃ３への結合を阻害するＣＨ１領域の点突然変異である。一実施形態では、点突然変異は、１３２位にある（例えば、Ｖｉｄａｒｔｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６（２００１）３８２１７－３８２２３を参照されたい）。

上記実施形態の一態様では、ＴｆＲに対する親和性が低下していない同じアイソタイプの野生型抗体と比較して、ＴｆＲに対する抗体の親和性が低下している。１つのそのような態様では、抗体は、ＴｆＲについて約１ｐＭ～約１００μＭのＫ_ＤまたはＩＣ_５０を有する。

一実施形態では、本明細書に報告された抗体は、エフェクター機能を有しない。一実施形態では、抗体はエフェクター機能を有しない。一実施形態では、抗体はヒトＩｇＧ１サブクラスのものであり、両方の重鎖に突然変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを有する（ナンバリングはＫａｂａｔのＥＵインデックスに従う）。

一実施形態では、抗体は、
ａ）ヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、または
ｂ）ヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、または
ｃ）変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、
ｄ）変異Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５ＥおよびＰ３２９Ｇを伴うヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体、
ｅ）両方の重鎖における変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇならびに１つの重鎖における変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃならびにそれぞれの他の重鎖における変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを伴うヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体、または
ｆ）両方の重鎖に変異Ｓ２２８Ｐ、および場合によりＰ３２９Ｇを有し、一方の重鎖に変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを有し、それぞれの他方の重鎖に変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体である。

一実施形態では、二重特異性治療用抗体は、
ｉ）場合により、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、およびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、または
ｉｉ）場合により、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＬ２３５Ｅを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ領域、または
ｉｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含み、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
もしくは
ｉｖ）両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含み、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域
または
ｖ）両方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８Ｐ、およびＬ２３５Ｅを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域、
ａ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｗを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、もしくは
ｂ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＳ３５４Ｃを含み、もしくは
ｃ）一方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、かつ他方のＦｃ領域ポリペプチドが変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、およびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ領域である。

イムノアッセイ
種々のイムノアッセイの原理は、当技術分野に記載されている。例えば、Ｈａｇｅ，Ｄ．Ｓ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．７１（１９９９）２９４Ｒ－３０４Ｒ）Ｌｕ，Ｂ．ら（Ａｎａｌｙｓｔ １２１（１９９６）２９Ｒ－３２Ｒ）は、イムノアッセイに使用するための抗体の配向固定化を報告している。アビジン－ビオチン媒介イムノアッセイは、例えば、Ｗｉｌｃｈｅｋ，Ｍ．，およびＢａｙｅｒ，Ｅ．Ａ．，ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８４（１９９０）４６７－４６９に報告されている。

モノクローナル抗体およびそれらの定常ドメインは、ポリペプチド／タンパク質、ポリマー（例えば、ＰＥＧ、セルロースまたはポリスチロール）、または酵素などの結合対のメンバーに結合するためのいくつかの反応性アミノ酸側鎖を含む。アミノ酸の化学反応性基は、例えば、アミノ基（リシン、アルファ－アミノ基）、チオール基（シスチン、システインおよびメチオニン）、カルボン酸基（アスパラギン酸、グルタミン酸）、および糖アルコール基である。そのような方法は、例えば、「Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ」、ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｒｅｆ．Ｌｔｄ．，１９９９，ｐａｇｅｓ ５０－１００に記載されている。

抗体の最も一般的な反応基の１つは、アミノ酸リジンの脂肪族ε－アミンである。一般に、ほぼ全ての抗体は豊富なリジンを含有する。リジンアミンは、ｐＨ８．０（ｐＫａ＝９．１８）を超えると適度に良好な求核剤であるため、様々な試薬と容易かつ清浄に反応して安定な結合を形成する。アミン反応性試薬は、主にリシンおよびタンパク質のα－アミノ基と反応する。反応性エステル、特にＮ－ヒドロキシ－スクシンイミド（ＮＨＳ）エステルは、アミン基の修飾のために最も一般的に使用される試薬の１つである。水性環境下での反応に最適なｐＨはｐＨ８．０～９．０である。イソチオシアネートはアミン修飾試薬であり、タンパク質とチオ尿素結合を形成する。それらは、水溶液中のタンパク質アミン（最適にはｐＨ９．０～９．５で）と反応する。アルデヒドは、穏やかな水性条件下で脂肪族および芳香族アミン、ヒドラジン、およびヒドラジドと反応して、イミン中間体（シッフ塩基）を形成する。シッフ塩基は、穏やかなまたは強い還元剤（水素化ホウ素ナトリウムまたはシアノ水素化ホウ素ナトリウムなど）で選択的に還元されて、安定なアルキルアミン結合を誘導することができる。アミンを修飾するために使用されている他の試薬は、酸無水物である。例えば、ジエチレントリアミン五酢酸無水物（ＤＴＰＡ）は、２つのアミン反応性無水物基を含有する二官能性キレート剤である。これは、アミノ酸のＮ末端およびε－アミン基と反応してアミド結合を形成し得る。無水物環は開環して、配位錯体中の金属に強く結合することができる多価の金属キレート化アームを生成する。

抗体における別の一般的な反応基は、硫黄含有アミノ酸シスチンおよびその還元生成物システイン（または半シスチン）からのチオール残基である。システインは、アミンよりも求核性であり、一般にタンパク質中で最も反応性の官能基である遊離チオール基を含有する。チオールは一般に中性ｐＨで反応性であるため、アミンの存在下で他の分子に選択的に結合することができる。遊離スルフヒドリル基は比較的反応性であるため、これらの基を有するタンパク質は、ジスルフィド基またはジスルフィド結合としてそれらの酸化形態で存在することが多い。そのようなタンパク質では、反応性遊離チオールを生成するためにジチオトレイトール（ＤＴＴ）などの試薬によるジスルフィド結合の還元が必要である。チオール反応性試薬は、ポリペプチド上のチオール基に結合してチオエーテル結合生成物を形成する試薬である。これらの試薬は、わずかな酸性から中性のｐＨで迅速に反応し、したがってアミン基の存在下で選択的に反応することができる。文献は、トラウト試薬（２－イミノチオラン）、スクシンイミジル（アセチルチオ）アセテート（ＳＡＴＡ）およびスルホスクシンイミジル６－［３－（２－ピリジルジチオ）プロピオンアミド］ヘキサノエート（Ｓｕｌｆｏ－ＬＣ－ＳＰＤＰ）などのいくつかのチオール化架橋試薬の使用を報告して、反応性アミノ基を介して複数のスルフヒドリル基を導入する効率的な方法を提供する。ハロアセチル誘導体、例えばヨードアセトアミドは、チオエーテル結合を形成し、チオール修飾のための試薬である。さらなる有用な試薬はマレイミドである。マレイミドとチオール反応性試薬との反応は、ヨードアセトアミドと本質的に同じである。マレイミドは、わずかな酸性から中性のｐＨで迅速に反応する。

抗体における別の一般的な反応基はカルボン酸である。抗体は、Ｃ末端位置およびアスパラギン酸およびグルタミン酸の側鎖内にカルボン酸基を含有する。水中のカルボン酸の比較的低い反応性は、通常、ポリペプチドおよび抗体を選択的に修飾するためにこれらの基を使用することを困難にする。この際、カルボン酸基は、通常、水溶性カルボジイミドを用いて反応性エステルに変換され、アミン、ヒドラジド、ヒドラジン等の求核試薬と反応する。アミン含有試薬は、リジンのより高度に塩基性のε－アミンの存在下で活性化カルボン酸と選択的に反応して安定なアミド結合を形成するために、弱塩基性でなければならない。ｐＨが８．０を超えて上昇すると、タンパク質架橋が起こり得る。

過ヨウ素酸ナトリウムを使用して、抗体に結合した炭水化物部分内の糖のアルコール部分をアルデヒドに酸化することができる。各アルデヒド基は、カルボン酸について記載されるように、アミン、ヒドラジド、またはヒドラジンと反応させることができる。炭水化物部分は主に抗体の結晶化可能な断片領域（Ｆｃ領域）上に見出されるので、抗原結合部位から離れた炭水化物の部位特異的修飾によってコンジュゲーションを達成することができる。シアノ水素化ホウ素ナトリウム（穏やかで選択的）または水素化ホウ素ナトリウム（強い）水溶性還元剤による中間体の還元によってアルキルアミンに還元することができるシッフ塩基中間体が形成される。

トレーサーおよび/または捕捉および/または検出抗体とそのコンジュゲーションパートナーとのコンジュゲーションは、化学結合または結合対を介した結合などの異なる方法によって行うことができる。本明細書で使用される「コンジュゲーションパートナー」という用語は、例えば固体支持体、ポリペプチド、検出可能な標識、特異的結合対のメンバーを示す。一実施形態では、捕捉および／またはトレーサおよび／または検出抗体とその結合パートナーとの結合は、Ｎ末端および／またはε－アミノ基（リジン）、異なるリジンのε－アミノ基、抗体のアミノ酸骨格のカルボキシ－、スルフヒドリル－、ヒドロキシル－、および／またはフェノール官能基、ならびに／あるいは抗体の炭水化物構造の糖アルコール基を介して化学的に結合することによって行われる。一実施形態では、捕捉抗体は、結合対を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲートされる。１つの好ましい実施形態では、捕捉抗体はビオチンにコンジュゲート化され、固体支持体への固定化は、アビジンまたはストレプトアビジンが固定化された固体支持体を介して行われる。一実施形態では、捕捉抗体は、結合対を介してそのコンジュゲーションパートナーにコンジュゲートされる。好ましい一実施形態では、トレーサー抗体は、検出可能な標識として共有結合によってジゴキシゲニンにコンジュゲートされる。

色素原（蛍光または発光基および色素）、酵素、ＮＭＲ活性基または金属粒子、ハプテン、例えばジゴキシゲニンは、「検出可能な標識」の例である。検出可能な標識はまた、光活性化可能な架橋基、例えばアジドまたはアジリン基であり得る。電気化学発光によって検出し得る金属キレートも好ましいシグナル放出基であり、ルテニウムキレート、例えばルテニウム（ビスピリジル）３２＋キレートが特に好ましい。適切なルテニウム標識基は、例えば、ＥＰ０５８０９７９、国際公開第９０／０５３０１号、国際公開第９０／１１５１１号および国際公開第９２／１４１３８号に記載されている。直接検出のために、標識基は、任意の既知の検出可能なマーカー基、例えば色素、発光標識基、例えば化学発光基、例えばアクリジニウムエステルもしくはジオキセタン、または蛍光色素、例えばフルオレセイン、クマリン、ローダミン、オキサジン、レゾルフィン、シアニンおよびそれらの誘導体から選択し得る。標識基の他の例は、ルテニウムまたはユーロピウム錯体などの発光金属錯体、例えばＥＬＩＳＡまたはＣＥＤＩＡ（クローニングされた酵素ドナーイムノアッセイ、例えば、ＥＰ－Ａ－００６１８８８）に使用される酵素、および放射性同位体である。

間接検出システムは、例えば、検出試薬、例えば検出抗体が結合対の第１のパートナーで標識されることを含む。適切な結合対の例は、抗原／抗体、ビオチンまたはビオチン類似体、例えばアミノビオチン、イミノビオチンまたはデスチオビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン、糖／レクチン、核酸または核酸類似体／相補的核酸、および受容体／リガンド、例えばステロイドホルモン受容体／ステロイドホルモンである。好ましい一実施形態では、第１の結合対メンバーは、ハプテン、抗原およびホルモンを含む。好ましい一実施形態では、ハプテンは、ジゴキシン、ジゴキシゲニンおよびビオチンならびにそれらの類似体からなる群から選択される。そのような結合対の第２のパートナー、例えば抗体、ストレプトアビジンなどは、通常、例えば上記のような標識による直接検出を可能にするように標識される。

イムノアッセイは、一般に３つの異なるフォーマットで行うことができる。１つは直接検出によるもの、１つは間接検出によるもの、またはサンドイッチアッセイによるものである。直接検出イムノアッセイは、直接測定することができる検出（またはトレーサー）抗体を使用する。酵素または他の分子は、シグナルを可視化または測定することを可能にする色、蛍光または発光を生成するシグナルの生成を可能にする（今日では一般的に使用されていないが、放射性同位元素も使用することができる。）。間接アッセイでは、分析物に結合する一次抗体を使用して、一次抗体によって提供される標的に特異的に結合する二次抗体（トレーサー抗体）のための定義された標的を提供する（検出器またはトレーサー抗体と呼ばれる）。二次抗体は、測定可能なシグナルを生成する。サンドイッチアッセイは、捕捉抗体およびトレーサー（検出器）抗体の２つの抗体を利用する。捕捉抗体は、溶液からの分析物に結合（固定化）するため、または溶液中で分析物に結合するために使用される。これにより、検体をサンプルから特異的に除去することができる。トレーサー（検出器）抗体を第２の工程で使用して、シグナルを生成する（上記のように直接的または間接的のいずれかで）。サンドイッチ形式は、それぞれが標的分子上に異なるエピトープを有する２つの抗体を必要とする。さらに、両方の抗体が同時に標的に結合しなければならないので、それらは互いに干渉してはならない。

イムノアッセイにおける二重特異性抗体の決定のための異なる原理が当業者に知られている。
１）撮影
－ 抗原の１つ；
－ 結合部位の１つに対する抗イディオタイプ抗体；
２）使用する検出
－ それぞれの他の抗原；
－ それぞれの他の結合部位に対する抗イディオタイプ抗体；

これらは互いに独立して組み合わせ得る。

本発明による方法の血液脳関門透過抗体
本発明は、一態様では、脳組織中の患者における疾患の処置において使用するための二重特異性抗体の濃度の決定であって、
二重特異性治療用抗体が、
ｉ）（エフェクター機能コンピテント）Ｆｃ領域、
ｉｉ）第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する２つの結合部位、および
ｉｉｉ）第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する１つの結合部位を含み
処置は、投与後の副作用を低減し、
副作用は、血管拡張、気管支収縮、喉頭浮腫、心圧低下および低体温からなる群より選択される１種以上である、二重特異性抗体である、抗体の濃度の決定に関する。

一実施形態では、第１の標的に特異的に結合する２つの結合部位および第２の標的に特異的に結合する結合部位は、反対方向に配置され、すなわち、一方はＦｃ領域のＮ末端にコンジュゲートされ、他方はＦｃ領域のＣ末端にコンジュゲートされる。

一実施形態では、第１の（細胞表面）標的および第２の（細胞表面）標的は異なる。

一実施形態では、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位および第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位は、反対側の末端に位置する（すなわち、第１の標的に特異的に結合する結合部位は、両方とも／それぞれが（完全長）抗体重鎖のＮ末端にあり、第２の標的に結合する結合部位は、二重特異性抗体の（完全長）抗体重鎖の１つのＣ末端にある）。

一態様では、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位および第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位は、二重特異性抗体の反対側に位置し、すなわち、第１の標的に特異的に結合する結合部位の一方はＦｃ領域の第１のＮ末端にコンジュゲートし、他方はＦｃ領域の第２のＮ末端にコンジュゲートし、第２の標的に特異的に結合する結合部位はＦｃ領域のＣ末端の一方にコンジュゲートしている。

一実施形態では、第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位は、ペプチドリンカーによって、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位の１つに連結している。一実施形態では、ペプチド性リンカーは配列番号５６または５７のアミノ酸配列を有する。

一実施形態では、第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位はＦｃ領域内にあり、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、またはＣＨ４ドメインのいずれかの少なくとも１つの構造ループ領域は、前記少なくとも１つの修飾ループ領域の第２の（細胞表面）標的への結合を可能にする少なくとも１つの修飾を含み、修飾されていない免疫グロブリン定常ドメインは前記標的に結合しない。

一実施形態では、結合部位は、抗体重鎖可変ドメインと抗体軽鎖可変ドメインの対である。

一実施形態では、、二重特異性治療用抗体は、
ｉ）第１の抗体軽鎖と第１の抗体重鎖との対、
ｉｉ）第２の抗体軽鎖と第２の抗体重鎖との対、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ断片、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択される更なる抗体断片を含み、
ｉ）およびｉｉ）の抗体鎖のペアは、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位を含み、ｉｉｉ）の更なる抗体断片は、第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位を含む。

一実施形態では、ｉｉｉ）のさらなる抗体断片は、第１の抗体重鎖または第２の抗体重鎖のいずれかに直接またはペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲートしている。一実施形態では、ｉｉｉ）のさらなる抗体断片は、ｉ）またはｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に、直接またはペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲートしている。一実施形態では、Ｆｃ領域は配列番号５６または５７のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、第１抗体軽鎖および第２抗体軽鎖は同じアミノ酸配列を有し、第１抗体重鎖および第２抗体重鎖はヘテロ二量体化に必要な変異によって異なる。一実施形態では、ヘテロ二量体化に必要な変異は、ノブ・イントゥ・ホール変異である。一実施形態では、ｉｉｉ）のさらなる抗体断片にコンジュゲートされていない抗体重鎖は、ｉ）Ｃ末端リジン残基またはｉｉ）Ｃ末端グリシン－リジンジペプチドを含まない。

一実施形態では、第１の標的は脳標的であり、第２の標的はヒトトランスフェリン受容体である。一実施形態では、第１の標的は脳標的であり、第２の標的はヒトトランスフェリン受容体１である。

一実施形態では、脳標的は、ベータ－セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、ヒトアミロイドベータ（Ａベータ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、ヒトアルファ－シヌクレイン、ヒトＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、ガンマセクレターゼ、細胞死受容体６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）およびカスパーゼ６からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、脳標的は、ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレインおよびヒトアミロイドベータタンパク質からなる群から選択される。好ましい一実施形態では、脳標的はヒトアミロイドベータタンパク質である。一実施形態では、脳標的は、配列番号５８、５９、６０、０１、６１から選択される。

好ましい一実施形態では、二重特異性治療用抗体は、
ｉ）ヒトＣＤ２０、ヒトタウタンパク質、リン酸化ヒトタウタンパク質、ヒトアルファ－シヌクレインおよびヒトアミロイドベータタンパク質からなる群から選択される脳標的に特異的に結合する第１の結合部位を形成する、第１の軽鎖可変ドメインおよび第１の重鎖可変ドメインを含む第１の抗体軽鎖および第１の抗体重鎖の対と、
ｉｉ）第１の結合部位と同じ脳標的に特異的に結合する第２の結合部位を形成する、第２の軽鎖可変ドメインおよび第２の重鎖可変ドメインを含む、第２の抗体軽鎖および第２の抗体重鎖の対と、
ｉｉｉ）ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂ、ｄＡｂ断片、ＤｕｔａＦａｂおよびＣｒｏｓｓＦａｂからなる群から選択され、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に特異的に結合する第３の結合部位を形成する第３の軽鎖可変ドメインおよび第３の重鎖可変ドメインを含むる追加の抗体断片と、
ｉｖ）（ヒトＩｇＧ１サブクラスの）（ヒト）エフェクター機能コンピテントＦｃ領域とを含み、
ｉｉｉ）のさらなる抗体断片は、ｉ）またはｉｉ）の抗体重鎖のＣ末端に直接またはペプチドリンカーを介してのいずれかでコンジュゲートしている。

一実施形態では、さらなる抗体断片は、第２の抗原に特異的に結合し、ペプチドリンカーを介してｉ）またはｉｉ）の重鎖の一方のＣ末端に融合しているＦａｂ断片であり、第２軽鎖および第２重鎖の定常ドメインＣＬおよびＣＨ１は互いに置き換えられており、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に特異的に結合する第３結合部位を形成する第３軽鎖可変ドメインおよび第３重鎖可変ドメインを含む。

一実施形態では、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号３３または６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３４または６３または３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３６、３７または６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号３８または６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；および（ｆ）配列番号６６または４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

一実施形態では、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に特異的に結合する結合部位は、（ａ）配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ１；（ｂ）配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ２；（ｃ）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｈ３；（ｄ）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ１；（ｅ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ２；（ｆ）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ－Ｌ３を含む。

一実施携帯では、治療用抗体は、トランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアミロイドベータタンパク質（Ａベータ）に対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号１９の重鎖可変ドメインおよび配列番号２０の軽鎖可変ドメインとの少なくとも１つの（すなわち、１または２）対とを含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインと１対、ならびにヒトＣＤ２０に対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号４１の重鎖可変ドメインおよび配列番号４２の軽鎖可変ドメインの２対を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は、Ｋａｂａｔによる１１位のアミノ酸残基の、ロイシン以外の任意のアミノ酸による置換を含む。一実施形態では、置換は、Ｋａｂａｔによる１１位のアミノ酸残基の非極性アミノ酸による置換を含む。好ましい一実施形態では、置換は、配列番号４１の重鎖可変ドメインのＫａｂａｔによるによる１１位のアミノ酸残基を、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、およびフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸残基による置換を含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号４３の重鎖可変ドメインおよび配列番号４４の軽鎖可変ドメインの２対を含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位を形成する配列番号４５由来のヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号４６由来のヒト化軽鎖可変ドメインの２対を含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの一対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号４７に由来するヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号４８に由来するヒト化軽鎖可変ドメインの２対を含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号４９由来のヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５０由来のヒト化軽鎖可変ドメインの２対を含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号５１由来のヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５２由来のヒト化軽鎖可変ドメインの２対と含む。

一実施形態では、治療用抗体は、ヒトトランスフェリン受容体（トランスフェリン受容体１）に対する結合部位を形成する配列番号３１の重鎖可変ドメインおよび配列番号３２の軽鎖可変ドメインの１対、ならびにヒトアルファ－シヌクレインに対する結合部位をそれぞれ形成する配列番号５３由来のヒト化重鎖可変ドメインおよび配列番号５４由来のヒト化軽鎖可変ドメインの２対を含む。

一実施形態では、疾患は神経障害である。一実施形態では、疾患は、ニューロパシー、アミロイドーシス、がん、眼疾患または障害、ウイルス感染症または微生物感染症、炎症、虚血、神経変性疾患、発作、行動障害、リソソーム蓄積症、レビー小体病、ポリオ後症候群、シャイ・ドレーガー症候群、オリーブ橋小脳萎縮症、パーキンソン病、多系統萎縮症、線条体黒質変性症、タウオパチー、アルツハイマー病、核上性麻痺、プリオン病、ウシ海綿状脳症、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ症候群、クールー、ゲストマン・シュトラースラー・シュレインカー病、慢性消耗性疾患および家族性不眠症、球麻痺、運動ニューロン疾患、神経系ヘテロ変性障害、カナバン病、ハンチントン病、ニューロン性脂質異常症、アレキサンダー病、トゥレット症候群、メンケス・キンキー（Ｍｅｎｋｅｓｋｉｎｋｙ）毛髪症候群、コケイン症候群、ハラルボルデン－スパッツ（Ｈａｌｅｒｖｏｒｄｅｎ－Ｓｐａｔｚ）症候群、ラフォラ病、レット症候群、肝皮質変性症、レッシュ－ナイハン症候群、ウンベルリッチ－ランドボルグ症候群、認知症、ピック病、脊髄小脳失調症、ＣＮＳおよび／または脳の癌（身体の他の場所の癌に起因する脳転移を含む）からなる神経障害疾患の群から選択される。一実施形態では、疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ＣＮＳおよび／または脳のがん（体内の他の場所のがんに起因する脳転移を含む）、およびタウオパチーからなる神経障害の群から選択される。一実施形態では、疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病およびタウオパチーからなる神経障害の群から選択される。

一実施形態では、治療用抗体はエフェクター機能コンピテントＦｃ領域を含む。一実施形態では、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域は、ヒトＦｃγＲに特異的に結合する／ヒトＦｃγＲによって特異的に結合し得るＦｃ領域である。一実施形態では、エフェクター機能コンピテントＦｃ領域はＡＤＣＣを誘発し得る。

一実施形態では、二重特異性抗体により（注射時／第２の（細胞表面）標的に結合している間）に誘発されるＡＤＣＣは、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する１つ、すなわち、正確に１つの結合部位および第２の（細胞表面）標的に特異的に結合する（正確に）１つの結合部位のみを有する、すなわち、第１の（細胞表面）標的に特異的に結合する結合部位の１つを欠いている、二価の二重特異性抗体により誘発されるＡＤＣＣより低い。一実施形態では、ＡＤＣＣは、１０倍以上低い。

一実施形態では、投与は、静脈内、皮下、または筋肉内投与である。

一実施形態では、（ｉ）の）第１の抗体重鎖および（ｉｉ）の）第２の抗体重鎖は、ヘテロ二量体を形成する。一実施形態では、第１抗体重鎖および第２抗体重鎖は、ヘテロ二量体の形成を支持する変異を含む。

一実施形態では、
ａ）抗体重鎖はヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖はヒトサブクラスＩｇＧ４の完全長抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の一方は、変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体重鎖であり、他方の抗体重鎖は、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて突然変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において突然変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の完全長抗体重鎖であるか、または
ｆ）両抗体重鎖は、変異Ｔ３０７ＨおよびＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖である。

一実施形態では、
ａ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｂ）抗体重鎖は、ヒトサブクラスＩｇＧ４の抗体重鎖であるか、
ｃ）抗体重鎖の１つは、変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、他の抗体重鎖は、変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｄ）両抗体重鎖は、変異Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０ＡおよびＨ４３５Ａを有し、抗体重鎖の１つにおいて変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、
ｅ）両抗体重鎖は、変異Ｍ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴおよびＴ２５６Ｅを有し、抗体重鎖の１つにおいて変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であるか、または
ｆ）両抗体重鎖は、変異Ｔ３０７ＨおよびＮ４３４Ｈを有し、抗体重鎖の１つにおいて変異Ｔ３６６Ｗおよび場合によりＳ３５４ＣまたはＹ３４９Ｃを、他の各抗体重鎖において変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖおよび場合によりＹ３４９ＣまたはＳ３５４Ｃを有するヒトサブクラスＩｇＧ１の抗体重鎖であり、
Ｃ末端リシンまたはグリシン－リシンジペプチドは存在しまたは存在しない。

本発明による方法の具体的な実施形態
ＣＳＦ、血液脳関門および血液の間の関係は、以下のようにＫａｔｓｉｎｅｌｏｓ，Ｔ．，ら（Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２０１９）１１３９）によって概説されている。
ＩｇＧレベルは、ヒト血清中で約１０ｍｇ／ｍｌに維持される。脳は、ＩｇＧを含む大きな巨大分子に対して不透過性である血液脳関門（ＢＢＢ）によって血清から単離される（Ｎｅｕｗｅｌｔ，Ｅ．Ａ．，ら，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１２（２０１１）１６９－１８２）。代わりに、脳は脳脊髄液（ＣＳＦ）に浸され、これは血液の濾過および脈絡叢を横切るイオンの輸送後に生成される。結果として生じるＣＳＦ中のＩｇＧの濃度は、血清中よりも約５００～１，０００倍低い。事実上、脳内におけるこの低濃度の抗体は、ＣＮＳ抗原を、通常は末梢に投与される受動免疫療法の標的として魅力的ではないものにする。これは、抗体の定常状態レベルが維持される機構が十分に理解されていないことによって悪化する。ＣＳＦは、脊髄神経および脳神経に沿って、リンパ系への排液を介してＣＮＳを出る前に、脳の周囲に流れている（Ｌｏｕｖｅａｕ，Ａ．，ら，Ｎａｔｕｒｅ ５２３（２０１５）３３７－３４１；Ａｓｐｅｌｕｎｄ，Ａ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１２（２０１５）９９１－９９９）。髄腔内投与されたＩｇＧは、主にこのバルク流を介して脳から迅速に除去され、脳からの選択的輸送に寄与する可能性がある。新生児型Ｆｃ受容体ＦｃＲｎは、ＢＢＢにおいて豊富に発現される（Ｓｃｈｌａｃｈｅｔｚｋｉ，Ｆ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．８１（２００２）２０３－２０６）。胎盤全体にわたる抗体のトランスサイトーシスにおけるＦｃＲｎの役割を考えると、ＦｃＲｎは、ＣＮＳの低ＩｇＧ環境を維持するのを助けるために逆トランスサイトーシスを行い得ることが示唆されている。脳からの抗体クリアランスの一部は抗体Ｆｃドメインによって媒介されるという証拠があり（Ｚｈａｎｇ，Ｙ．およびＰａｒｄｒｉｄｇｅ，Ｗ．Ｍ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１１４（２００１）１６８－１７２；Ｃｏｏｐｅｒ，Ｐ．Ｒ．，ら，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ．１５３４（２０１３）１３－２１）、ＦｃＲｎ欠損マウスでは抗Ａβモノクローナル抗体の排出が減少した（Ｄｅａｎｅ，Ｒ．，ら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２５（２００５）１１４９５－１１５０３）。しかしながら、末梢投与されたＩｇＧの脳濃度は、野生型マウスとＦｃＲｎを欠くマウスとの間で有意に異ならなかった（Ａｂｕｑａｙｙａｓ，Ｌ．およびＢａｌｔｈａｓａｒ，Ｊ．Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａ．１０（２０１３）１５０５－１５１３）。

小さな実験動物の場合、灌流によるサンプリングの前に脳から血液を除去する。例えば、マウスに氷冷ＰＢＳを２ｍｌ／分の速度で８分間経心的に灌流させ得、その後、脳を採取する。

多重特異性抗体、例えば、１つ以上のキャリア分子および１つ以上のカーゴ分子を含む二重特異性抗体または三重特異性抗体を使用して、受容体媒介トランスサイトーシス経路を介して、血液脳関門を越えて治療用抗体を輸送する方法が現在研究されている。例えば、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）結合抗体（およびその変異体）をキャリアとして使用し得、カーゴ分子に融合すると、血液脳関門を通過し得る二重特異性抗体が産生される（例えば、参照として本明細書に組み込まれる、Ｚｕｃｈｅｒｏ，Ｙ．Ｊ，Ｙ．，ら，Ｎｅｕｒｏｎ ８９（１２０１６）７０－８２；Ｂｉｅｎ－Ｌｙ，Ｎ．，ら．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１１（２０１４）２３３－２４４；米国特許出願公開第２０１８／８００２４３３号；カナダ特許第３，０００，５６０号を参照されたい）。あるいは、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ－１Ｒ）結合抗体をキャリアとして使用し、カーゴ分子に融合させると、血液脳関門を通過する二重特異性抗体を産生し得る（例えば、参照として本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／１３１２５６号；国際公開第２０１５／１３１２５７号；国際公開第２０１５／１３１２５８号を参照されたい）。

脳内の量の堅牢で正確な決定のために、血液脳関門を通過して脳内に輸送される治療用抗体の溶解物は、サンプル中の残留血液からの干渉を排除する必要がある。上記に概説したように、結果として得られるＣＳＦ中のＩｇＧの濃度は、血清中よりも約５００～１，０００倍低く、脳は血管の織り合わされた網によってスパンされる。したがって、脳組織サンプル中の残留血液の可能性は無視できない。さらに、少量の残留血液でさえ、脳組織における抗体の定量を著しく妨げる可能性がある。

したがって、脳溶解物サンプル中の残留血液中の治療用抗体の量による補正、すなわち減少を行わなければならない。

したがって、灌流相の間に脳内に有意に拡散しない定量的血液補正マーカーの使用が必要とされるしかしながら、これらが定常状態で決定される場合、一定の低濃度がＢＢＢの背後に存在する。

本発明は、少なくとも部分的には、脳溶解物中の残留血液の量が、脳サンプルが採取される直前に補正抗体を適用することによって決定され得るという知見に基づいている。脳サンプルが得られる実験動物のいかなる標的にも特異的に結合しない抗体、最も好ましくはヒト生殖細胞系抗体を参照抗体として使用することが特に有利であることが分かった。

したがって、本明細書では、血液脳関門を通過して血液から実験動物の脳に輸送された治療用抗体の量を決定する方法が報告される。この量は、好ましくは脳溶解物サンプル中で決定される。本発明の要旨は、血液脳関門を通過して輸送される治療用抗体の量が決定されなければならない脳サンプルを得る直前に、血液脳関門を通過して輸送されない不活性抗体をさらに適用することにある。不活性抗体を適用することにより、脳サンプル中の残存血液中に存在する治療用抗体の量の補正値が得られる。この残留血液に由来する量は、脳に位置しない抗体について決定された量を補正するために使用される。補正なしの決定により、サンプル中の治療用抗体の総量、すなわち血液脳関門を通過して脳に輸送される量およびサンプル中の残留血液中の量が決定される。血液中の抗体の約０．１％のみが血液脳関門を通過するので、残留血液中の治療用抗体の量は無視できない。したがって、血液中の治療用抗体の濃度は、脳内の治療用抗体の濃度を少なくとも２桁、最大３桁上回る。それにより、得られた結果は、本発明による方法で補正しない場合には高すぎる。

これは、ＩｇＧのクリアランスに近いクリアランスを有する対照ＩｇＧまたは脳シャトルにとって特に重要である。なぜなら、分子をゆっくりと除去すると血液中の濃度が高く維持され、その量が脳内で比較的非常に少ない場合、少量の血液汚染が脳濃度の決定を圧倒する可能性があるからである。
本発明による方法は、血液を除去するために使用される方法とは無関係に、任意の脳組織サンプルに適用し得る。

本発明による方法は、異種間アッセイの利用可能性、十分なアッセイのロバスト性、精度および正確性を有し、感度範囲が広い。

簡単に説明すると、本発明は、実験動物の脳サンプル中の残留血液を決定するための方法であって、
－ 灌流の直前、すなわち最大で５分前に、第２の不活性ＩｇＧを投与し、血漿サンプルを採取し、灌流を行い、脳および血漿濃度を測定し、補正する方法を提供し、
－ 利点は、血液脳関門を通過する量が制限されることであり、それにより、第２の不活性抗体の濃度は血漿体積のみを反映し、
－ 治療用抗体についての第１の特異的アッセイおよび第２の不活性抗体についての第２の特異的アッセイが使用され、
－ 測定を混乱させ得る抗治療抗体陽性動物に関する問題を防止し得た。

図１は、（脳）組織サンプル中の血液汚染を決定するための不活性抗体の使用を利用する例示的な計算を提供する。

例えば、従来のＥＬＩＳＡを使用して、血漿中ならびに均質化脳組織サンプル中の治療用モノクローナル抗体（ｔｍＡｂ）および不活性参照モノクローナル抗体（ｒｅｆｍＡｂ）の濃度を決定する。ＥＬＩＳＡの結果は、通常、ＳＩ単位［ｇ／Ｌ］を用いて質量濃度として得られる。第１の工程では、ｔｍＡｂおよびｒｅｆｍＡｂについてそれぞれ決定された質量濃度の各々は、決定された質量濃度をサンプルの脳組織濃度で除算することによって単位［ｇ／ｇ］を有する質量分率に変換される。第２の工程では、脳組織サンプル中の残留血漿の量、すなわち血漿汚染は、第１の工程で得られた不活性抗体の質量分率が決定されたｒｅｆｍＡｂの血漿濃度で割ることによって算出される。これにより、脳サンプルの重量当たりの残留血漿の体積が得られる。第３の工程では、血漿汚染に由来する脳組織サンプル中のｔｍＡｂの質量分率が、ｔｍＡｂの血漿濃度に脳サンプルの重量当たりの残留血漿の体積を乗算することによって算出される。第４の工程および最後の工程では、第１の工程でｔｍＡｂについて決定された質量分率から、第３の工程で得られた血漿汚染に由来する脳組織サンプル中のｔｍＡｂの質量分率を減算することによって、ｔｍＡｂの真の脳濃度が得られる。

本発明による方法は、カニクイザル脳溶解物中のＴｆＲおよび治療標的１または２にそれぞれ結合する２つの二重特異性抗体の分析に適用された。抗体のそれぞれの構造を図２に示す。治療用抗体および参照抗体の検出アッセイをそれぞれ図３に示す。

実施例１に概説されるように、不活性抗体を決定するためのアッセイは８ｎｇ／ｍｌの感度を有する、すなわち約１．１－１．５μＬ血漿／１ｇのカニクイザル脳を検出し得る（これは約２．２～３μＬ血液／１ｇのカニクイザル脳に対応する）。

５つの異なる脳領域：小脳、海馬、線条体、皮質および脈絡叢が分析されている。

４種の異なる動物を分析したところ、動物１～３の脳サンプルには残留血液が含まれていなかったが、動物４は光分析によって決定された通りであった（データは示さず）。

本発明による方法では、この汚染を検出し得、したがって、それぞれの値をそれに応じて補正し得る。

さらなる研究では、１５匹の動物に２０ｍｇ／ｋｇの抗Ａベータ抗体を投与し、１５匹の動物に１０ｍｇ／ｋｇの抗Ａベータ／ＴｆＲ抗体を投与した。投与後の種々の時点の後、それぞれのサンプルを分析した。全てのサンプルにおいて、残留血液がそれぞれの脳組織サンプルにおいて検出されている。したがって、これらの場合にも、本発明による方法を用いて補正値を得た。

本発明による方法の一般的な適用性を示すために、Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウスにおいて、第２の抗体、抗ＴｆＲ／標的＿２抗体を用いて同じ分析を行った。

１％カニクイザル脳溶解物（ＣＢＬ；ｃｙｎｏＢＬ）および１％マウス脳溶解物（ＭＢＬ；ｍｕＢＬ）の存在下での不活性参照抗体の検出アッセイの検量線の重ね合わせを図４に示す。マトリックスの起源はアッセイに影響を及ぼさないことが分かる。

１％ ＭＢＬの存在下でのアッセイの測定範囲は、８．４ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬである。最大１０μｇ／ｍＬの治療用抗体が、１％ ＭＢＬの存在下で干渉なしにアッセイ系に存在し得る。

１％マウスプール血漿（ＭＰＰ）の存在下でのアッセイの測定範囲は、１１ｎｇ／ｍＬ～２２０ｎｇ／ｍＬである。最大２０μｇ／ｍＬの治療用抗体が、１％ ＭＰＰの存在下で干渉なしにアッセイ系中に存在し得る。

２０ｍｇ／ｍｌの単回用量の抗体を適用し、適用の２４時間後、４８時間後、９６時間後、１６８時間後、３３６時間後、５０４時間後および６７２時間後にサンプルを分析した。脳溶解物および血漿中のそれぞれの濃度を決定した。図５では、脳溶解物中の処理された抗体の決定された濃度が、補正されていない脳濃度対補正された脳濃度の比として示されている。すなわち、補正が値に影響を及ぼさない場合、比率は１である。残留血漿値による補正のために、第２の抗体の決定された濃度が低下した場合、値は１よりも小さくなる。この差は、より多くの抗体が血液脳関門を通過して輸送されるにつれて時間とともに増大する。図５から、比率が時間とともに小さくなることが分かる。それにより、本発明による方法に従って行われた補正により、脳サンプル中の残留血液からの干渉が排除されたことが分かる。第２の抗体の決定に使用されるそれぞれのアッセイを図６に示す。

本発明による方法の不活性参照モノクローナル抗体
本発明による方法において有用な不活性参照モノクローナル抗体は、好ましくはヒト免疫グロブリン分子、特に抗原への特異的結合能を有しないヒト免疫グロブリン分子である。

例示的な不活性参照モノクローナル抗体は、抗体ＤＰ４７ＧＳである。ＤＰ４７ＧＳは、ヒトＶＨ３－２３生殖系列配列に基づく重鎖可変領域配列およびヒトＶｋ３－２０生殖系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体はＩｇＧクラス免疫グロブリン分子、特にＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリン分子である。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体はヒト免疫グロブリン分子である。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、抗原への特異的結合能を有しない。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、ヒトＶＨ３－２３生殖細胞系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６７の重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、ヒトＶｋ３－２０生殖細胞系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６８の軽鎖可変領域配列を含む。さらにより具体的な実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６７の重鎖可変領域配列および配列番号６８の軽鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、抗原への特異的結合能を有さず、ヒトＶＨ３－２３生殖細胞系列配列に基づく重鎖可変領域配列およびヒトＶｋ３－２０生殖細胞系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。

一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、ヒトＶＨ３－２３生殖細胞系列配列に基づく重鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である重鎖可変領域配列を含む。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、ヒトＶｋ３－２０生殖細胞系列配列に基づく軽鎖可変領域配列を含む。特定の実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である軽鎖可変領域配列を含む。さらにより具体的な実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６７の重鎖可変領域配列および配列番号６８の軽鎖可変領域配列を含む。これらの可変領域配列を含む免疫グロブリン分子は、抗原、特にヒト抗原に特異的に結合し得ない。それらは、正常組織ならびにＰＢＭＣへ結合できず、多反応性を有さず、画像化によってインビボで非特異的蓄積を示さない（データは示さず）。可変領域配列は、非結合免疫グロブリンを生成するためにＧＳＧ配列が導入されている重鎖ＣＤＲ３を除いて、全体的にヒト生殖細胞系配列に基づいている。

一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒトＩｇＧ１定常領域とを有する重鎖、および配列番号６８のアミノ酸配列を有する可変ドメインとヒトカッパ軽鎖定常ドメインとを有する軽鎖を含む。一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、重鎖Ｆｃ領域に変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（ナンバリングはＫａｂａｔＥＵインデックスに従う）を含む。

一実施形態では、前記不活性参照モノクローナル抗体は、配列番号６９のアミノ酸配列を有する重鎖と、配列番号７０のアミノ酸配列を有する軽鎖とを含む。

比較方法および結果
比較技術的アプローチ：
灌流なしの残存血液量による補正
Ｆｒｉｄｅｎら（Ｊ．Ｃｅｒｅｂｒａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｆｌｏｗ＆Ｍｅｔ ３０（２０１０）１５０－１６１）は、脳血管空間に関する文献から利用可能な情報を収集した（Ｆｒｉｄｅｎらの表１を参照されたい）。

最も一般的に使用される１４Ｃ－デキストラン法に基づくと、脳血漿値は約１８．１μＬ／脳組織１ｇに相当する。この補正を適用すると、決定された全ての値が負になった。

したがって、単純に脳組織サンプルで総脳血漿値が示されると考えることは正しくなかった。

したがって、絶対値を適用することはできなかったが、共決定された補正係数が必要であった。

したがって、種々の補正係数が必要であった。

灌流が行われることになるので、残りの血液汚染に対する制御が必要である。これは、ＩｇＧのクリアランスに近いクリアランスを有する比較ＩｇＧまたは脳シャトルにとって特に重要である－なぜか？分子をゆっくりと除去すると血液中の濃度が高く維持されるため、脳内の量が比較的非常に少ない場合、少量の血液汚染が脳濃度の決定を圧倒する可能性がある。

したがって、脳内への適用および灌流相中に有意に拡散しない定量的血液補正マーカーを使用する必要がある。

比較マーカー：
それらの試験前に、本発明による方法における補正手段として同様に適していると考えられた異なる他の非抗体不活性参照分子は、分子量が高く、内因性血中レベルが高い他の内因性タンパク質である。

補体因子Ｈの決定
繻子の刊行物には、カニクイザル脳脊髄液（脳脊髄液）ならびにカニクイザル脳溶解物中に補体因子Ｈが存在しないことが示されており、これは非ＣＳＦまたは非脳組織において一般的である。したがって、補体因子Ｈの検出は、ｃＣＳＦおよびＣＢＬサンプル中の残留汚染血液の決定のための実行可能な代用マーカーであると考えられている。

陽性対照として、ヒトプール血清（ＨＰＳ；２００μｇ／ｍＬ～８００μｇ／ｍＬ補体因子Ｈ）およびヒトプール血漿（ＨＰＰ；約３００μｇ／ｍＬの補体因子Ｈ）が入手可能であった。

アッセイをＥｌｅｃｓｙｓアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ（マンハイム、ドイツ））として構成した。それぞれの検量線を図７に示す。このアッセイの測定範囲は、７．８μｇ／ｍＬ～２０００μｇ／ｍＬであった。

したがって、アッセイは十分に高感度ではないので、補体因子Ｈの決定は、残留汚染血液の代用マーカーとして適していないことが分かった。

アルファ－２－マクログロブリンの決定
種々の刊行物に、カニクイザル脳脊髄液（脳脊髄液）およびカニクイザル脳溶解物ではα２－マクログロブリンが存在しないことが示されており、非ＣＳＦまたは非脳組織（１５００～２０００μｇ／ｍＬ）では一般的である。したがって、α２－マクログロブリンの検出は、ｃＣＳＦおよびＣＢＬサンプル中の残留汚染血液の決定のための実行可能な代用マーカーであると考えられている。

α２－マクログロブリンを決定するためのＥＬＩＳＡアッセイのアッセイ原理を図８に示し、それぞれの検量線を図９に示す。

アッセイは、０．６２ｎｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ）～３９ｎｇ／ｍＬ（ＵＬＯＱ）の測定範囲を有していた。

血清および血漿の期待値を確認し得たが、カニクイザルプール血清では、期待量の１／２５，０００しか検出し得なかった。したがって、この値は、カニクイザル脳脊髄液および脳溶解物を希釈形態で定量するには低すぎる。したがって、α２－マクログロブリンの決定は代用マーカーとして適していない。

補体成分５ａ（Ｃ５ａ）の決定
種々の刊行物に、カニクイザル脳脊髄液（脳脊髄液）およびカニクイザル脳溶解物では補体成分５ａが存在しないことが示されており、これは非ＣＳＦまたは非脳組織で一般的である（ヒト血清中６０～１１０μｇ／ｍＬ）。したがって、補体成分Ｃ５ａの検出は、ｃＣＳＦおよびＣＢＬサンプル中の残留汚染血液の決定のための実行可能な代用マーカーであると考えられている。

α２－マクログロブリンと同様に、ＥＬＩＳＡは、捕捉抗体としてのマウス抗ヒトＣ５ａ抗体および検出抗体としてのビオチン化マウス抗ヒトＣ５ａ抗体を用いて設定されており、これにより、両抗体がヒトＣ５ａ上の非干渉性エピトープに結合する。それぞれの検量線を図１０に示す。

アッセイは、０．０３ｎｇ／ｍＬ（ＬＬＯＱ）～２ｎｇ／ｍＬ（ＵＬＯＱ）の測定範囲を有していた。

したがって、ＣＢＬサンプル中のＣ５ａを決定し得ることが分かった。

したがって、Ｃ５ａの決定は代用マーカーとして適していない。

Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）の使用
Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）（ガドペンテト－ジメグルミン）は、ＭＲＴ造影剤である。Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）は血液脳関門を通過しないと考えられた。

薬物動態研究により、最大１５分まで、測定された脳濃度のみが血液区画を正確に表すことが示された。この時間の後、Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標）が脳組織に拡散し、適用された補正を混乱させる。それぞれの経時変化を図１１に示す。５－分の時点で、血漿量は１４．１μＬ／脳１ｇとして推定される。

したがって、灌流にかかる時間が血液脳関門を通過するＭａｇｎｅｖｉｓｔの拡散をもたらし、残留血液補正を混乱させるため、このアプローチは灌流には使用できない。

カニクイザル脳脊髄液（ｃＣＳＦ）中のカニクイザルＩｇＧの決定
種々の刊行物に、カニクイザル脳脊髄液（脳脊髄液）には少量のカニクイザルＩｇＧしか存在しないことが示されている。したがって、ｃＣＳＦ中の総Ｉｇの検出は、輸送された治療用抗体の直接決定のための実行可能な代用マーカーであると考えられている。したがって、図１２に示すように架橋ＥＬＩＳＡを構成した。マトリックス効果を排除するために、ｃＣＳＦを磁気ビーズに結合した抗ヒトＣＨ１／カッパ抗体とインキュベートすることによって、ヒトＩｇＧ枯渇ｃＣＳＦを生成した。

緩衝液およびヒトＩｇＧ枯渇ｃＣＳＦを用いたそれぞれの検量線を図１３に示す。マトリックス効果が生じていないことが分かる。

アッセイは、１２０ｎｇ／ｍｌ～７．２ｎｇ／ｍＬ ＩｇＧの測定範囲を有していた。

このアッセイを使用して、カニクイザルプール血漿サンプル（ＣＰＰ）では約１１～１９ｍｇ／ｍＬのＩｇＧが検出され得るが、ｃＣＳＦサンプルでは約４～１８μｇ／ｍＬのカニクイザルＩｇＧの相当量が検出され得ることが分かった。
＊＊＊

以下の実施例、配列および図面は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明の真の範囲は、添付の特許請求の範囲に記載されている。本発明の思想から逸脱することなく、定められた手順に変更を加えることができると理解される。

配列の説明

ｔｍＡｂの残留血漿補正脳溶解物濃度を決定するための例示的な計算。 本発明による方法の実施例で使用される例示的な脳シャトル構築物の構造。 実施例で使用する治療用抗体および参照抗体の検出アッセイ。 それぞれカニクイザルおよびマウスの１％脳溶解物の存在下での不活性参照抗体についての実施例１による検出アッセイの検量線の重ね合わせ。 マウス脳溶解物中の抗体２の補正濃度対非補正濃度の比。 抗体２を決定するためのＥＬＩＳＡ。 補体因子Ｈ Ｅｌｅｃｓｙｓアッセイの検量線。 ｃＣＳＦ中のα２－マクログロブリンの定量のためのＥＬＩＳＡ。捕捉抗体は、マウス抗ヒトα２－マクログロブリン抗体である。検出抗体は、ビオチン化ヤギ抗ヒトα２－マクログロブリン抗体である。 図ＺのＥＬＩＳＡの検量線。 補体成分５ａのＥＬＩＳＡアッセイの検量線。 血漿および脳組織におけるＰＫ研究におけるＭａｇｎｅｖｉｓｔの経時変化 ｃＣＳＦ中のカニクイザルＩｇＧの定量のためのＥＬＩＳＡ。捕捉ｍＡｂは抗カニクイザルＩｇＧ抗体である。検出ｍＡｂは、第１の抗体に対する非干渉エピトープに結合する抗カニクイザルＩｇＧ抗体である。 図ＸのＥＬＩＳＡの検量線。

一般的方法：
カニクイザル脳組織ホモジネートの調製
３００ｍｇの凍結カニクイザル／マウス脳組織サンプルを室温で２時間解凍した。８００μＬの溶解緩衝液、５０ｍＬの組織抽出試薬Ｉ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に溶解した１錠のｃＯｍｐｌｅｔｅプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓＧｍｂＨ）を、解凍した脳組織に添加した。次いで、サンプルをＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ装置（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）において６５００ｒｐｍで２０秒間均質化した。次いで、組織ホモジネートを、Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４３０（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）を用いて１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。最後に、上清をさらなる分析のために１．５ｍＬのイアルに移すか、または－８０℃で保存した。

実施例１
脳溶解物中のＤＰ４７ＧＳ－ＰＧＬＡＬＡの定量のためのＥＬＩＳＡ
カニクイザル脳溶解物サンプル中の不活性参照モノクローナル抗体ＤＰ４７ＧＳ－ＰＧＬＡＬＡ（配列番号６９および７０）を定量するために、連続サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ＥＬＩＳＡ手順では、全てのサンプルおよび対照を、所望の１％最終アッセイ濃度までアッセイ希釈液中で最初の１：１００前希釈に供する。

ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＳＡ－ＭＴＰ）に、捕捉抗体（抗ＤＰ４７ＧＳ抗体、ビオチン化）、希釈標準物質（ＤＰ４７ＧＳ－ＰＧＬＡＬＡ）、ならびに希釈品質対照およびサンプル、検出試薬（抗ＰＧＬＡＬＡ抗体クローンＭ－１．７．２４、ジゴキシゲニル化）および抗ジゴキシゲニン抗体－ＰＯＤコンジュゲートを連続的に添加する。試薬をＭＴＰシェーカー上５００ｒｐｍで１時間インキュベートし、各工程の後、ＭＴＰを３００μＬの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、残留流体を除去した。その後、形成された固定化免疫複合体を、西洋ワサビＰＯＤ基質であるＡＢＴＳ溶液を添加することによって可視化し、これを着色反応生成物に変換した。最後に、色強度を測光法で決定した（４０５ｎｍ－４９０ｎｍ基準波長での吸収）。シグナルは、脳溶解物サンプル中の分析物濃度に比例する。ＤＰ４７ＧＳ－ＰＧＬＡＬＡの定量は、重み付けによる非線形４パラメータＷｉｅｍｅｒ－Ｒｏｄｂａｒｄ曲線フィッティング関数を用いた対応する検量線を使用して吸光度値の逆計算によって行った。

捕捉試薬を用いたコーティングは、５００ｎｇ／ｍＬのビオチン化抗ＤＰ４７ＧＳ抗体を含む１００μＬの溶液を各ＳＡ－ＭＴＰウェルにピペッティングすることによって達成される。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー上で１時間インキュベートする（５００ｒｐｍ）。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、１００μｌのそれぞれの標準物質、品質対照およびサンプルを、被覆ＭＴＰの指定されたウェルへ添加する。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、１２５ｎｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのジゴキシゲニル化抗ＰＧＬＡＬＡ抗体クローンＭ－１．７．２４を各ＭＴＰウェルに添加する。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

５０ｍＵ／ｍＬの濃度の１００μＬの抗ジゴキシゲニン抗体－ＰＯＤ－コンジュゲートを各ＭＴＰウェルに添加する。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、１００μＬのＡＢＴＳ溶液を各ＭＴＰウェルに添加する。二連の標準物質サンプル１の平均シグナルが４０５ｎｍの測定波長（基準波長４９０ｎｍ）で１．８－２．２ＡＵに達するまで、吸光度を測定する。

実施例２
ＣＳＦ中のカニクイザルＩｇＧの定量化のためのＥＬＩＳＡ
カニクイザル脳脊髄液中のカニクイザルＩｇＧを定量するために、連続サンドイッチ酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用した。ＥＬＩＳＡ手順では、全てのサンプルおよび対照を、所望の１％最終アッセイ濃度までアッセイ希釈液中で初期予備希釈に供する。

ストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＳＡ－ＭＴＰ）に、捕捉抗体（抗カニクイザルＩｇＧ抗体１；エピトープ１；ビオチン化）、希釈した標準物質、ならびに希釈した品質対照およびサンプル、検出試薬（抗カニクイザルＩｇＧ抗体２；エピトープ２、エピトープ１を妨害しない；ジゴキシゲニル化）および抗ジゴキシゲニン抗体－ＰＯＤコンジュゲートを連続的に添加する。試薬をＭＴＰシェーカー上５００ ｒｐｍで１時間インキュベートし、各工程の後、ＭＴＰを３００μＬの洗浄緩衝液（１×ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄し、残留流体を除去した。その後、形成された固定化免疫複合体を、西洋ワサビＰＯＤ基質であるＡＢＴＳ溶液を添加することによって可視化し、これを着色反応生成物に変換した。最後に、色強度を測光法で決定した（４０５ｎｍ－４９０ｎｍ基準波長での吸収）。シグナルは、脳溶解物サンプル中の分析物濃度に比例する。カニクイザルＩｇＧの定量は、重み付けを伴う非線形４パラメータＷｉｅｍｅｒ－Ｒｏｄｂａｒｄ曲線フィッティング関数を用い、対応する検量線を使用して吸光度値の逆計算によって行った。

捕捉試薬によるコーティングは、２５０ｎｇ／ｍＬのビオチン化抗カニクイザルＩｇＧ抗体１を含む１００μＬの溶液を各ＳＡ－ＭＴＰウェルにピペッティングすることによって達成される。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、１００μｌのそれぞれの標準物質、品質対照およびサンプルを、コーティングされたＭＴＰの指定されたウェルへ添加し、その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー上で１時間インキュベートする（５００ｒｐｍ）。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、２５０ｎｇ／ｍＬの濃度の１００μＬのジゴキシゲニル化抗カニクイザル抗体２を各ＭＴＰウェルに添加する。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

２５ｍＵ／ｍＬの濃度の１００μＬの抗ジゴキシゲニン抗体－ＰＯＤ－コンジュゲートを各ＭＴＰウェルに添加する。その後、ＭＴＰを接着性カバーフォイルで覆い、ＭＴＰシェーカー（５００ｒｐｍ）上で１時間インキュベートする。上清を除去し、ＭＴＰの各ウェルを３００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ）で３回洗浄する。残留洗浄緩衝液を慎重に除去する。

次いで、１００μＬのＡＢＴＳ溶液を各ＭＴＰウェルに添加する。二連の標準物質サンプル１の平均シグナルが４０５ｎｍの測定波長（基準波長４９０ｎｍ）で１．８－２．２ＡＵに達するまで、吸光度を測定する。

実施例３
脳組織溶解物の製造
最初に、溶解緩衝液を製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；組織抽出試薬Ｉ；カタログ番号．ＦＮＮ００７１）の指示に従って新たに調製した。５０ｍｌの溶解緩衝液あたり、１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，マンハイム、ドイツ；カタログ番号．１１６９７４９８００１）を添加する。

第２に、脳組織サンプルに、約１００～３００ｍｇ、６００μＬ～８００μＬの溶解緩衝液を添加する。場合により、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｂｅａｄｓを添加する。

第三に、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，マンハイム、ドイツ）中で、サンプルを６５００ｒｐｍで２０秒間置いた。

第四に、ＭａｇＮＡ Ｌｙｓｅｒ中でのインキュベーション後、サンプルを１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５４３０）。

第五に、上清（５００－７００μＬ）を回収し、さらなる分析まで－８０℃で保存した。

Claims (15)

1. 実験動物の組織中の治療用抗体の濃度を決定するための方法またはアッセイであって、前記組織が前記動物の血液循環に対するバリアを有し、前記治療用抗体が前記実験動物に投与されており、前記組織中の治療用抗体の濃度を決定するために使用される、前記実験動物の組織サンプル中の残留血液からの干渉が低減され、前記方法が、以下：
   ｉ）前記実験動物の血液サンプル中の前記治療用抗体の濃度を決定する工程、
   ｉｉ）前記実験動物の前記組織サンプル中の前記治療用抗体の濃度を決定する工程、
   ｉｉｉ）前記実験動物の前記血液サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
   ｉｖ）前記実験動物の前記組織サンプル中の不活性参照抗体の濃度を決定する工程、
   ｖ）前記組織サンプル中の組織濃度を決定する工程、および
   以下の式：
   

   

   
   （式中、
   Ｃ_{ｔｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉ）の治療用抗体の濃度
   Ｃ_{ｔｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉ）の治療用抗体の濃度
   Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、組織、ｄｅｔ．}＝ｉｉｉ）の治療用抗体の濃度
   Ｃ_{ｒｅｆｍＡｂ、血漿、ｄｅｔ．}＝ｉｖ）の治療用抗体の濃度
   Ｃ_{組織、サンプル}＝ｖ）の組織濃度）
   を用いて前記実験動物の前記組織中の前記治療用抗体の濃度を決定する工程
   を含み、
   －前記不活性参照抗体は、前記組織と前記血液循環との間の前記バリアを通過せず、
   －ｉ）前記治療用抗体の投与後５分以内に前記サンプルを採取する場合は前記治療用抗体と一緒に、またはｉｉ）前記組織サンプルを採取する２～１０分前のいずれかで、前記不活性参照抗体が投与されており、
   －前記血液サンプルが前記組織サンプルの直前に採取される、
   方法またはアッセイ。
2. 前記組織が脳組織であり、前記治療用抗体が血液脳関門を通過し得るか、または前記組織が眼組織であり、前記治療抗体が血液眼関門を通過し得るかのいずれかである、請求項１に記載の方法。
3. 前記治療用抗体が二重特異性抗体である、請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
4. 前記治療用抗体がヒトトランスフェリン受容体および脳標的に特異的に結合する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記脳標的が、ヒトＣＤ２０またはヒトＡベータまたはヒトアルファ－シヌクレインまたはヒトタウまたはヒトグルコセレブロシダーゼまたはヒトリンゴ－１またはヒトハンチンチンである、請求項４に記載の方法。
6. 前記実験動物が、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ヒツジ、類人猿およびサルから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記実験動物が、体重１００ｇ超１５ｋｇ未満の非ヒト実験動物である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記実験動物がカニクイザルである、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記不活性参照抗体がヒト生殖細胞系抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記不活性参照抗体がＤＰ４７ＧＳである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記不活性参照抗体が、その適用後１５分以内に検出可能な量で前記バリアを通過しない、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 前記不活性参照抗体が、その適用後１０分以内に検出可能な量で前記バリアを通過しない、請求項１１に記載の方法。
13. 前記不活性抗体を、前記組織サンプルを採取する約５分前に投与する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記組織を、前記血液サンプルを採取した直後かつ前記組織サンプルを採取する前に、水溶液で灌流する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記濃度の決定が架橋ＥＬＩＳＡによるものである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

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