CN111246884A

CN111246884A - 新颖的含有tnf家族配体三聚体的抗原结合分子

Info

Publication number: CN111246884A
Application number: CN201880067804.XA
Authority: CN
Inventors: H·杜尔; C·费拉拉·科勒; G·乔治; F·黑森; S·伊姆霍夫-荣格; C·克劳斯; W·徐
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2017-11-01
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2020-06-05
Also published as: JP2021500902A; WO2019086499A1; US20200347115A1; EP3703746A1

Abstract

本发明涉及新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两条不同的融合多肽,包含间隔物域,抗原结合域和三个TNF配体成员外域或其片段,其中所述外域中两个通过包含至少25个氨基酸的间隔物域彼此分开且其中两条融合多肽在间隔物域中彼此共价联合。

Description

新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子

发明领域

本发明涉及新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含两条不同的融合多肽,包含间隔物域,抗原结合域和三个TNF配体成员外域或其片段,其中所述外域中两个通过包含至少25个氨基酸的间隔物域彼此分开且其中两条融合多肽在间隔物域中彼此共价联合。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中一些可另外包含轻链。本发明进一步涉及生成这些分子的方法和使用它们的方法。

发明背景

与TNF(肿瘤坏死因子)受体超家族的分子相互作用的配体在免疫***的组织和功能中具有关键作用。在调节正常功能诸如免疫应答,造血和形态发生的同时,TNF家族配体(也称作细胞因子)在肿瘤发生,移植排斥,脓毒性休克,病毒复制,骨吸收,类风湿性关节炎和糖尿病中发挥作用(Aggarwal,Nat.Rev.Immunol.2003,3(9),745-56)。TNF配体家族包含编码19种II型(即细胞内N端和细胞外C端)跨膜蛋白质的18种基因,其特征在于构成“TNF同源域”(THD)的保守C端域的存在。这个域负责受体结合且因此对于TNF配体家族成员的生物学活性是至关紧要的。家族成员之间的序列同一性是约20-30％(Bodmer et al.,Trendsin Biochemical Sciences 2002,27(1),19-26)。TNF配体家族的成员以自装配的非共价三聚体发挥其生物学功能(Banner et al.,Cell1993,73,431-445)。因此,TNF家族配体形成能够结合并活化TNFR超家族的相应受体的三聚体。

TNF受体超家族的一个成员,4-1BB(CD137)最初被鉴定为其表达通过T细胞活化而诱导的分子(Kwon and Weissman,Proc Natl Acad Sci USA 1989,86,1963-1967)。后续研究证明4-1BB在T和B淋巴细胞(Snell et al.,Immunol Rev 2011,244,197-217；Zhang etal.,J Immunol 2010,184,787-795),NK细胞(Lin et al.,Blood 2008,112,699-707),NKT细胞(Kim et al.,J Immunol 2008,180,2062-2068),单核细胞(Kienzle and vonKempis,Int Immunol 2000,12,73-82；Schwarz et al.,Blood 1995,85,1043-1052),嗜中性细胞(Heinisch et al.,Eur J Immunol 2000,30,3441-3446),肥大细胞(Nishimoto etal.,Blood 2005,106,4241-4248)和树突细胞以及非造血起源的细胞诸如内皮和平滑肌细胞(Broll et al.,Am J Clin Pathol 2001,115,543-549；Olofsson et al.,Circulation2008,117,1292-1301)中的表达。4-1BB在不同细胞类型中的表达大多通过各种刺激性信号,诸如T细胞受体(TCR)或B细胞受体触发,以及经由共刺激性分子或促炎性细胞因子的受体诱导的信号传导而可诱导和驱动(Diehl et al.,J Immunol 2002,168,3755-3762；von Kempis et al.,Osteoarthritis Cartilage 1997,5,394-406；Zhang etal.,J Immunol 2010,184,787-795)。已知CD137信号传导刺激NK细胞的IFNγ分泌和增殖(Buechele et al.,Eur J Immunol 2012,42,737-748；Lin et al.,Blood 2008,112,699-707；Melero et al.,Cell Immunol 2008,190,167-172)以及促进DC活化(如通过其升高的存活和分泌细胞因子的能力指示的)并上调共刺激性分子(Choi et al.,J Immunol 2009,182,4107-4115；Futagawa et al.,Int Immunol 2002,14,275-286；Wilcox et al.,JImmunol 2002,168,4262-4267)。然而,CD137最好表征为调控T细胞的CD4+和CD8+子集二者中的TCR诱导的活化的共刺激性分子。与TCR触发组合,已经显示4-1BB激动剂(激动性4-1BB特异性抗体)增强T细胞的增殖,刺激淋巴因子分泌并降低T淋巴细胞对活化诱导的细胞死亡的敏感性(综述见Snell et al.,Immunol Rev 2011,244,197-217)。

4-1BB配体(4-1BBL或CD137L)的表达更受限制且在专职抗原呈递细胞(APC)诸如B细胞,树突细胞(DC)和巨噬细胞上观察到。4-1BB的可诱导表达对于包括αβ和γδT细胞子集二者在内的T细胞,和内皮细胞是特征性的(综述见Shao and Schwarz,J Leukoc Biol2011,89,21-29)。在4-1BB激动剂对不同淋巴细胞子集的直接作用以外,经由肿瘤血管内皮上的血管细胞粘附分子1(VCAM1)和细胞间粘附分子1(ICAM1)的4-1BB介导的上调,4-1BB激动剂还能诱导肿瘤中活化的T细胞的浸润和保留(Palazon et al.,Cancer Res 2011,71,801-811)。4-1BB触发还可逆转由暴露于可溶性抗原诱导的T细胞无反应性的状态,这可能有助于破坏肿瘤微环境中或慢性感染期间的免疫学耐受(Wilcox et al.,Blood 2004,103,177-184)。

可得的临床前和临床数据清楚地证明,对有效4-1BB激动剂的临床需求较高。然而,新一代药物候选应当不仅有效啮合造血和内皮细胞的表面上的4-1BB,而且能够经由与结合Fc受体不同的机制实现这一点,从而避免不可控制的副作用。后者可以经由对肿瘤特异性或肿瘤相关模块的优先结合和寡聚化来实现。

融合蛋白由4-1BB配体的一个细胞外结构域和单链抗体片段构成(Mueller etal.,J.Immunother.2008,31,714-722；Hornig et al.,J.Immunother.2012,35,418-429)。然而,这些分子难以以技术规模生成且具有不利的药动学概况。

如此,需要开发以能够稳定形成共刺激性TNF配体三聚体的方式构成且对于在药学上有用足够稳定的新的抗原结合分子。

本发明描述如何能将三聚体TNF配体有效融合至抗体构造,使得三聚体配体是正确组装的且功能完全的。聚焦于基于抗体的构造得到一般抗体的优秀药动学特性指导。该抗体构造与其它蛋白质相比是稳定的；它们使用不同细胞系的表达也是非常强健的。它们的Fc部分与FcRn受体相互作用且因此保护分子免于经由细胞内降解快速消除。新颖的构建物是以合理的较好滴度可表达的且生成较好比率的希望产物。

发明概述

在一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

(a)第一融合多肽,其包含第一TNF配体家族成员外域或其片段,间隔物域和第二所述TNF配体家族成员外域或其片段,其中

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

-第一TNF配体家族成员外域或其片段或是直接或是经由第一肽接头融合至间隔物域的N端,且

-第二所述TNF配体家族成员外域或其片段或是直接或是经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,

(b)第二融合多肽,其包含抗原结合域的第一部分和间隔物域,其中间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

抗原结合域的第二部分或是直接或是经由第三肽接头融合至间隔物域的C端或以轻链的形式存在,和

(c)第三所述TNF配体家族成员外域或其片段,其或是直接或是经由第四肽接头融合至

-或是第一融合多肽中的第二所述TNF配体家族成员外域的C端或第二融合多肽中的间隔物域的C端,或

-在抗原结合域的第二部分融合至第二融合蛋白的间隔物域的C端的情况中,第一融合多肽中的第二所述TNF配体家族成员外域的C端,

其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合。

在一个特定的方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域且抗原结合域的第二部分包含抗体轻链可变域或反之。更加特别地,抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。在一个方面,抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。

如上文描述的,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含第一和第二融合多肽,均包含间隔物域,其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合。

在本发明的一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其(C端)片段和抗体CH2域或其(N端)片段。在另一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。在本发明的又一个方面,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。在一个特定的方面,依照节入穴方法第一融合多肽的间隔物域包含穴且第二融合多肽的间隔物域包含节。在又一个方面,本发明包含一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和IgG1Fc域。特别地,IgG1 Fc域包含降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合的一处或多处氨基酸替代。更加特别地,IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照KabatEU索引)。

在本发明的又一个方面,TNF家族配体是共刺激人T细胞激活的。如此,本发明涉及一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其共刺激人T细胞激活。在本发明的一个特定的方面,TNF家族配体是4-1BBL。

如此,在本发明的一个方面,TNF配体家族成员外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ IDNO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一个特定的方面,TNF配体家族成员(4-1BBL)外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含三个TNF配体家族成员外域,而且特别是,所有三个TNF配体家族成员外域包含相同的氨基酸序列。

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子进一步包含由第一和第二部分组成的抗原结合域。在一个方面,抗原结合域能够特异性结合肿瘤相关抗原。在又一个方面,抗原结合域能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)或CD19。

在一个方面,抗原结合域能够特异性结合FAP。特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

(a)重链可变区(V_HFAP),其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(V_LFAP),其包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或

(b)重链可变区(V_HFAP),其包含(i)包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(V_LFAP),其包含(iv)包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列的CDR-L3。

在一个特定的方面,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP),和包含与SEQ ID NO:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP),或(b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP),和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP)。特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含(a)包含SEQ IDNO:21的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP),或(b)包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP)和包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP)。更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP)和包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP)。

在另一个方面,抗原结合域能够特异性结合CD19。特别地,能够特异性结合CD19的抗原结合域包含

(a)重链可变区(V_HCD19),其包含(i)包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(V_LCD19),其包含(iv)包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列的CDR-L3,或

(b)重链可变区(V_HCD19),其包含(i)包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(V_LCD19),其包含(iv)包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列的CDR-L3。

特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含(a)包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19),和包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19),或(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19),和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19)。更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19)和包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19),或(b)包含SEQ ID NO:39的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19)和包含SEQ ID NO:40的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19)。更加特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含(a)包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19)和包含SEQ IDNO:38的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19)。

在一个方面,本发明涉及如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中第一,第二,第三和第四肽接头是存在的且由选自由SEQ ID NO:41,SEQ IDNO:42,SEQ ID NO:43,SEQ ID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ IDNO:48,SEQ ID NO:49,SEQ ID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ IDNO:54,SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56组成的组的氨基酸序列组成。特别是,肽接头由选自SEQ ID NO:42和SEQ ID NO:44的氨基酸序列组成。更加特别地,肽接头由SEQ ID NO:42的氨基酸序列组成。

在另一个方面,本发明涉及分离的核酸,其编码如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。本发明进一步提供一种载体,特别是一种表达载体,其包含本发明的分离的核酸,或一种宿主细胞,其包含本发明的分离的核酸或载体。在一些方面,宿主细胞是真核细胞,特别是哺乳动物细胞。

在另一个方面,提供的是一种用于生成本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法,其包含在适合于抗原结合分子表达的条件下培养本发明的宿主细胞。在又一个方面,方法进一步包含自宿主细胞回收含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

本发明进一步提供一种药学组合物,其包含本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一个药学可接受赋形剂。

本发明还涵盖的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药学组合物,其用作药物。在一个方面提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药学组合物,其用在有需要的个体中于治疗疾病。在一个具体的施方案中,提供的是本发明含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,或本发明的药学组合物,其用于治疗癌症。

还提供的是本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造用于在有需要的个体中治疗疾病的药物中的用途,特别是用于制造用于治疗癌症的药物,以及制造用于刺激免疫应答的药物。

此外,提供的是一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对所述个体施用有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或药学组合物。方法可进一步包含将另外的治疗剂施用于个体。在任何上述实施方案中,个体优选是哺乳动物,特别是人。

附图简述

图1A显示如实施例2.1中更加详细描述的FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1199的示意图。

在图1B中提供如实施例2.2中描述的FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1235的示意图。

在图1C中显示的是如实施例2.3中描述的FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1259的示意图。

在图1D中图示如实施例2.4中描述的FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA9626。

图1E显示如实施例2.6中更加详细描述的非靶向性(DP47种系)含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子的示意图。在本文中使用这种分子作为阴性对照D。在图1F中提供的是阳性对照分子构建物2.4的示意图,即一种FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子。在实施例2.6中更加详细描述这两种分子(对照D以及构建物2.4)。

在图2A至2C中显示不同FAP靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子对NFκB信号传导途径的激活。在图2A中使用FAP表达性细胞系WM-266-4,图2B显示在FAP表达性NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下的NFκB激活,而图2C显示在FAP表达性细胞缺失(无)下的NFκB激活。显示的是释放光单位(URL),为0.5s/孔测量,相对于FAP靶向性含有4-1BBL配体三聚体的抗原结合分子或对照以nM计的添加浓度。通过减去基线光发射对所有URL值进行基线修正。所有测试的FAP靶向性4-1BBL构建物能够以剂量依赖性以及FAP交联依赖性方式激活NFκB。在FAP表达性细胞缺失下(c)对FAP靶向性4-1BBL分子只能看到微小活性,在非靶向性4-1BBL(对照D)的基线以上。这是由于报告细胞自身的最低限度FAP表达。FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子P1AA1199,P1AA1259,P1AA1235和P1AA9626显示与早就描述的构建物2.4相似的活性。P1AA1199显示与其它测试的FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子相比略微更低的EC₅₀值和更低的平台。非靶向性4-1BBL分子(对照D)不能诱导NFκB激活且在所有设置中充当基线。在实施例3中给出EC₅₀值。

图3A至3D指亚最佳TCR触发的TCR PBMC的4-1BB介导的共刺激和通过细胞表面FAP的超交联。作为CD8⁺T细胞(图3A)和CD4⁺T细胞群体(图3B)中阳性细胞的百分比,显示的是表面表达的低亲和力IL-2-受体α链CD25的上调。CD25在IL-2存在下在T细胞激活之后上调以提高T细胞增殖和存活且充当T细胞激活标志物。在图3C和图3D中,分别作为CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞群体中阳性细胞的百分比显示细胞表面上4-1BB(CD137)的表达。针对FAP靶向性4-1BBL构建物2.4或非靶向性4-1BBL对照D或本发明的FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子(P1AA1199)的浓度展示所有测量值。对于相同的测量参数,与HeLa-人4-1BB-NFκB-luc报告细胞系测定法(图2A至2C)相似,P1AA1199显示在展示的曲线(CD137(4-1BB)表达)中展示与构建物2.4相比更低的EC₅₀值(CD25表达)或更低的平台的趋势。显示的是每个测量点的三个技术副本的均值+/-SD。

图4展现本发明的CD19靶向性含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子对CD19⁺B细胞的结合与对照分子CD19(2B11)靶向性含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子构建物4.4(CD19-4-1BBL Ab)的结合相当。

在图5A至5C中显示本发明的不同CD19靶向性含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子(P1AA1233,P1AA0776和P1AA1258)对激活的CD4+T细胞(图5A),激活的CD8+T细胞(图5B)和NK细胞(图5C)上的4-1BB的结合。数据与对构建物4.4(CD19-4-1BBL Ab)获得的那些相当。

在图6中显示的是本发明的不同CD19靶向性含有4-1BB配体三聚体的抗原结合分子(P1AA1233,P1AA0776和P1AA1258)的生物学活性。在PBMC中基于4-1BB共刺激的T细胞和NK细胞的效应器功能分子IFNγ的释放测量分子的生物学活性。本发明的分子能够激活T细胞和NK细胞以生成与构建物4.4(CD19-4-1BBL Ab)相比相似量的IFNγ,而非靶向性对照D不能诱导IFNγ释放。

发明详述

定义

除非另有定义,本文中使用的技术和科学术语具有与此发明所属领域中一般使用的相同的含义。出于解释此说明书的目的,会应用下述定义,而且在适宜时,以单数使用的术语还会包括复数,反之亦然。

如本文中使用的,术语“抗原结合分子”以其最广义指特异性结合抗原性决定簇的分子。抗原结合分子的例子是抗体,抗体片段和支架抗原结合蛋白。

术语“抗原结合域”指抗原结合分子中特异性结合抗原性决定簇的部分。在一个方面,抗原结合域能够经由它的靶细胞抗原激活信号传导。在一个特定方面,抗原结合域能够将其附着的实体(例如TNF家族配体三聚体)引导至靶位点,例如携带抗原性决定簇的特定类型的肿瘤细胞或肿瘤基质或到T细胞上。抗原结合域包括抗体中与部分或整个抗原特异性结合和互补的区域或片段。另外,抗原结合域包括如本文中进一步定义的支架抗原结合蛋白,例如基于设计的重复蛋白或设计的重复域的结合域(参见例如WO 2002/020565)。特别地,抗原结合域由第一部分和第二部分构成,其中第一部分包含抗体轻链可变区(VL)且第二部分包含抗体重链可变区(VH)或反之。

术语“抗体”在本文中以最广义使用且涵盖各种抗体结构,包括但不限于单克隆抗体,多克隆抗体,单特异性和多特异性抗体(例如双特异性抗体),和抗体片段,只要它们展现期望的抗原结合活性。

如本文中使用的术语“单克隆抗体”指自实质性同质的抗体群体获得的抗体,即构成该群体的抗体个体是同一的和/或结合相同表位,除了可能的抗体变体,例如,含有天然发生的突变的或在单克隆抗体制备物的生成期间产生的,此类变体一般以微小量存在。与典型地包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物形成对比,单克隆抗体制备物中的每个单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。

如本文中使用的术语“单特异性”抗体表示具有一个或多个结合位点的抗体,每个该位点结合相同抗原的相同表位。术语“双特异性”意味着抗原结合分子能够特异性结合至少两种截然不同的抗原性决定簇。典型地,双特异性抗原结合分子包含两个抗原结合位点,其每个是对不同抗原性决定簇特异性的。在某些实施方案中,双特异性抗原结合分子能够同时结合两种抗原性决定簇,特别是在两种截然不同的细胞上表达的两种抗原性决定簇。

如本文中使用的术语“价”表示抗原结合分子中规定数目的抗原结合域的存在。照此,术语“二价”,“四价”,和“六价”分别表示抗原结合分子中两个结合位点,四个结合位点,和六个结合位点的存在。因而,“单价”意味着分子中只存在一个能够特异性结合抗原的抗原结合域。

术语“全长抗体”,“完整抗体”,和“全抗体”在本文中可互换使用,指具有与天然抗体结构实质性相似的结构的抗体。“天然抗体”指具有不同结构的天然发生的免疫球蛋白分子。例如,天然IgG类抗体是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白,由成二硫键的两条轻链和两条重链构成。自N端至C端,每条重链具有一个可变区(VH),也称作可变重域或重链可变域,接着是三个恒定域(CH1,CH2,和CH3),也称作重链恒定区。类似地,自N端至C端,每条轻链具有一个可变区(VL),也称作可变轻域或轻链可变域,接着是一个轻链恒定域(CL),也称作轻链恒定区。抗体的重链可指派至五种型之一,称作α(IgA),δ(IgD),ε(IgE),γ(IgG),或μ(IgM),其中一些可进一步分成亚型,例如γ1(IgG1),γ2(IgG2),γ3(IgG3),γ4(IgG4),α1(IgA1)和α2(IgA2)。基于其恒定域的氨基酸序列,抗体的轻链可指派至两种型之一,称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

“抗体片段”指与完整抗体不同的分子,其包含完整抗体中与完整抗体所结合的抗原结合的部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv,Fab,Fab’,Fab’-SH,F(ab’)₂；双抗体,三抗体,四抗体,交叉Fab片段；线性抗体；单链抗体分子(例如scFv)；和单域抗体。关于某些抗体片段的综述,参见Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)。关于scFv片段的综述,参见例如Plückthun,in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)；还参见WO93/16185；和美国专利No.5,571,894和5,587,458。关于包含挽救受体结合表位残基且具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段的讨论,参见美国专利No.5,869,046。双抗体是具有两个抗原结合位点的抗体片段,其可以是二价或双特异性的,参见例如EP 404,097；WO1993/01161；Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)；和Hollinger et al.,Proc NatlAcad Sci USA 90,6444-6448(1993)。Hudson et al.,Nat Med 9,129-134(2003)中还描述了三抗体和四抗体。单域抗体是包含抗体的重链可变域的全部或一部分或轻链可变域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中,单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA；参见例如美国专利No.6,248,516B1)。可以通过各种技术来生成抗体片段,包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞(例如大肠杆菌或噬菌体)的生成,如本文中描述的。

完整抗体的木瓜蛋白酶消化生成两个同一的抗原结合片段,称作“Fab”片段,每个含有重和轻链可变域,还有轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。如此,如本文中使用的,术语“Fab片段”指包含包含轻链的VL域和恒定域(CL)的轻链片段,和重链的VH域和第一恒定域(CH1)的抗体片段。Fab’片段因在重链CH1域的羧基末端增加少数残基而与Fab片段不同,包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab’-SH是其中恒定域的半胱氨酸残基携带游离硫醇基团的Fab’片段。胃蛋白酶处理产生具有两个抗原结合位点(两个Fab片段)和Fc区的一部分的F(ab’)₂片段。

术语“Fab片段”还包括“交叉Fab片段”或“xFab片段”或“交换Fab片段”。此术语指其中重和轻链的可变区或恒定区任一交换的Fab片段。交换Fab分子的两种不同链组成是可能的且包含在本发明的双特异性抗体中:一方面,Fab重和轻链的可变区交换,即交换Fab分子包含由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链,和由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(VLVH)。另一方面,当Fab重和轻链的恒定区交换时,交换Fab分子包含由重链可变区(VH)和轻链恒定区(CL)构成的肽链,和由轻链可变区(VL)和重链恒定区(CH1)构成的肽链。这种交换Fab分子也称作CrossFab_(CLCH1)。

“单链Fab片段”或“scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CH1-接头-VL-CL,b)VL-CL-接头-VH-CH1,c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；且其中所述接头是至少30个氨基酸,优选32至50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段经由CL域和CH1域之间的天然二硫键而稳定化。另外,这些单链Fab分子可通过经由半胱氨酸残基的***(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。

“交换单链Fab片段”或“x-scFab”是由抗体重链可变域(VH),抗体恒定域1(CH1),抗体轻链可变域(VL),抗体轻链恒定域(CL)和接头组成的多肽,其中所述抗体域和所述接头以N端至C端方向具有下述次序之一:a)VH-CL-接头-VL-CH1和b)VL-CH1-接头-VH-CL；其中VH和VL一起形成特异性结合抗原的抗原结合位点,且其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽。另外,这些x-scFab分子可通过经由半胱氨酸残基的***(例如依照Kabat编号方式的可变重链中的位置44和可变轻链中的位置100)生成链间二硫键而进一步稳定化。

“单链可变片段(scFv)”是以10至约25个氨基酸的短接头肽连接的抗体的重(V_H)和轻(V_L)链可变区的融合蛋白。接头经常富含出于柔性的甘氨酸,以及出于溶解性的丝氨酸或苏氨酸,而且可将V_H的N端与V_L的C端连接,或反之亦然。尽管去除恒定区并引入接头,此蛋白质保留原始抗体的特异性。scFv抗体描述于例如Houston,J.S.,Methods inEnzymol.203(1991)46-96。另外,抗体片段包含具有VH域的特征(即能够与VL域一起装配)或VL域的特征(即能够与VH域一起装配)的单链多肽,VH域与VL域一起装配成功能性抗原结合位点并由此提供全长抗体的抗原结合特性。

“支架抗原结合蛋白”在本领域中是已知的,例如,纤连蛋白和设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)已经用作抗原结合域的备选支架,参见例如Gebauer and Skerra,Engineered protein scaffolds as next-generation antibody therapeutics.CurrOpin Chem Biol 13:245-255(2009)和Stumpp et al.,Darpins:A new generation ofprotein therapeutics.Drug Discovery Today 13:695-701(2008)。在本发明的一个方面,支架抗原结合蛋白选自由CTLA-4(Evibody),脂质运载蛋白(Anticalin),蛋白A衍生的分子,诸如蛋白A的Z域(Affibody),A域(Avimer/Maxibody),血清转铁蛋白(trans-body)；设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin),抗体轻链或重链的可变域(单域抗体,sdAb),抗体重链的可变域(纳米抗体,aVH),V_NAR片段,纤连蛋白(AdNectin),C型凝集素域(Tetranectin)；新的抗原受体β-内酰胺酶的可变域(V_NAR片段),人γ-晶体蛋白或泛素(Affilin分子)；人蛋白酶抑制剂的kunitz型域,微体,诸如来自knottin家族的蛋白质,肽适体和纤连蛋白(adnectin)组成的组。

CTLA-4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)是一种主要在CD4+T细胞上表达的CD28家族受体。它的胞外域具有可变域样Ig折叠。可以用异源序列替代与抗体CDR对应的环以赋予不同的结合特性。改造成具有不同结合特异性的CTLA-4分子也称作Evibody(例如US7166697B1)。Evibody的尺寸与抗体的分离的可变区(例如域抗体)大致相同。进一步的详情参见Journal of Immunological Methods 248(1-2),31-45(2001)。

脂质运载蛋白是一个细胞外蛋白质家族,其转运小的疏水性分子,诸如类固醇,胆红素,类视黄醇和脂质。它们具有刚性β-片层二级结构,在锥形结构的开口端具有一些环,能改造成结合不同靶抗原。Anticalin的尺寸介于160-180个氨基酸之间,而且衍生自脂质运载蛋白。进一步的详情参见Biochim Biophys Acta 1482:337-350(2000),US7250297B1和US20070224633。

Affibody是一种自金黄色葡萄球菌蛋白A衍生的支架,能改造成结合抗原。该域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化生成了文库。进一步的详情参见Protein Eng.Des.Sel.17,455-462(2004)和EP1641818A1。

Avimer是自A域支架家族衍生的多域蛋白。大约35个氨基酸的天然域采取限定的成二硫键的结构。多样性是通过由A域家族展现的天然变异的改组而产生的。进一步的详情参见Nature Biotechnology 23(12),1556-1561(2005)和Expert Opinion onInvestigational Drugs 16(6),909-917(June 2007)。

转铁蛋白是一种单体血清转运糖蛋白。通过在允许的表面环中***肽序列,转铁蛋白能改造成结合不同靶抗原。经过改造的转铁蛋白支架的例子包括Trans-body。进一步的详情参见J.Biol.Chem 274,24066-24073(1999)。

设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)衍生自锚蛋白,锚蛋白是介导整合膜蛋白附着至细胞骨架的一个蛋白质家族。单个锚蛋白重复是一个33个残基的基序,由两个α-螺旋和一个β-转角组成。通过随机化每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基,它们能改造成结合不同靶抗原。通过增加模块的数目(亲和力成熟的一种方法)能增加它们的结合界面。进一步的详情参见J.Mol.Biol.332,489-503(2003),PNAS 100(4),1700-1705(2003)和J.Mol.Biol.369,1015-1028(2007)和US20040132028A1。

单域抗体是由单个单体可变抗体域组成的抗体片段。第一种单域是自来自骆驼科动物(camelids)的抗体重链的可变域衍生的(纳米抗体或V_HH片段)。而且,术语单域抗体包括自主的(autonomous)人重链可变域(aVH)或自鲨鱼衍生的V_NAR片段。

纤连蛋白是一种能改造成结合抗原的支架。Adnectin由人纤连蛋白III型(FN3)的15个重复单元的第10个域的天然氨基酸序列的主链组成。可以改造β-夹心一端处的三个环,使得Adnectin能够特异性识别感兴趣的治疗靶。进一步的详情参见ProteinEng.Des.Sel.18,435-444(2005),US20080139791,WO2005056764和US6818418B1。

肽适体是由恒定支架蛋白组成的组合识别分子,所述恒定支架蛋白典型地是含有在活性位点处***的受到约束的可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。进一步的详情参见ExpertOpin.Biol.Ther.5,783-797(2005)。

微体衍生自长度为25-50个氨基酸的天然发生微蛋白,其含有3-4个半胱氨酸桥-微蛋白的例子包括KalataBI和芋螺毒素和knottin。微蛋白具有能改造成包括多达25个氨基酸而不影响微蛋白的总体折叠的环。经过改造的knottin域的进一步详情参见WO2008098796。

与参照分子“结合相同表位的抗原结合分子”指如下的抗原结合分子,抗原结合分子在竞争测定法中将参照分子对其抗原的结合阻断50％或更多,相反,参照分子在竞争测定法中将抗原结合分子对其抗原的结合阻断50％或更多。

如本文中使用的,术语“抗原性决定簇”与“抗原”和“表位”同义,而且指多肽大分子上的如下位点(例如氨基酸的连续区段或由不连续氨基酸的不同区域构成的构象构造),抗原结合模块与该位点结合,形成抗原结合模块-抗原复合物。有用的抗原性决定簇可以例如在肿瘤细胞的表面上,在病毒感染的细胞的表面上,在其它患病细胞的表面上,在免疫细胞的表面上,游离在血清中,和/或在细胞外基质(ECM)中找到。作为本文中的抗原有用的蛋白质可以是来自任何脊椎动物来源的蛋白质的任何天然形式,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在一个特定实施方案中,抗原是人蛋白质。在提及本文中的特定蛋白质的情况中,该术语涵盖“全长”未加工的蛋白质以及源自细胞中的加工的任何形式的蛋白质。该术语还涵盖蛋白质的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。

“特异性结合”意味着结合对于抗原是选择性的且可以与不想要的或非特异性的相互作用区分开。抗原结合分子结合特定抗原的能力可经由酶联免疫吸附测定法(ELISA)或本领域技术人员熟悉的其它技术来测量,例如表面等离振子共振(SPR)技术(在BIAcore仪器上分析)(Liljeblad et al.,Glyco J 17,323-329(2000)),和传统的结合测定法(Heeley,Endocr Res 28,217-229(2002))。在一个实施方案中,抗原结合分子对无关蛋白质的结合的程度小于抗原结合分子对抗原的结合的约10％,如通过例如SPR测量的。在某些实施方案中,结合抗原的分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更小,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(Kd)。

“亲和力”或“结合亲和力”指分子(例如抗体)的单一结合位点和其结合配偶(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另外指明,如本文中使用的,“结合亲和力”指反映结合对(例如抗体和抗原)的成员之间的1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶Y的亲和力一般可以用解离常数(Kd)来代表,它是解离和结合速率常数(分别是k_off和k_on)的比。如此,等同的亲和力可包含不同的速率常数,只要速率常数的比保持相同。可以通过本领域已知的常用方法来测量亲和力,包括本文中描述的那些。用于测量亲和力的一种特定方法是表面等离振子共振(SPR)。

如本文中使用的,“肿瘤相关抗原”指靶细胞的表面上呈现的抗原性决定簇,其中靶细胞是肿瘤中的细胞,诸如癌细胞,肿瘤基质的细胞或B细胞。在某些实施方案中,肿瘤相关抗原是成纤维细胞激活蛋白(FAP)或CD19。

术语“能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)”指能够以足够亲和力结合FAP,使得该抗原结合分子在靶向FAP中作为诊断和/或治疗剂是有用的抗原结合分子。抗原结合分子包括但不限于抗体,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,和VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面,抗FAP抗原结合分子结合无关的,非FAP的蛋白质的程度小于该抗原结合分子对FAP的结合的约10％,如例如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更少,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_d)。在某些实施方案中,抗FAP抗原结合分子结合来自不同物种的FAP。特别地,抗FAP抗原结合分子结合人,食蟹猴和小鼠FAP。

术语“成纤维细胞激活蛋白(FAP)”,也称作脯氨酰内肽酶FAP或分离酶(Seprase)(EC 3.4.21),指来自任何脊椎动物来源的任何天然FAP,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。该术语包括“全长”未加工的FAP以及源自细胞中的加工的任何形式的FAP。该术语还涵盖FAP的天然发生变体,例如剪接变体或等位变体。在一个实施方案中,本发明的抗原结合分子能够特异性结合人,小鼠和/或食蟹猴FAP。人FAP的氨基酸序列在UniProt(www.uniprot.org)登录号Q12884(版本149,SEQ ID NO:57),或NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)RefSeq NP_004451.2中显示。人FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至760。小鼠FAP的氨基酸序列在UniProt登录号P97321(版本126,SEQ ID NO:58),或NCBI RefSeq NP_032012.1中显示。小鼠FAP的细胞外结构域(ECD)自氨基酸位置26延伸至761。优选地,本发明的抗FAP结合分子结合FAP的细胞外结构域。例示性抗FAP结合分子描述于国际专利申请号WO 2012/020006A2。

术语“能够特异性结合CD19”指能够以足够亲和力结合CD19,使得该抗原结合分子在靶向CD19中作为诊断和/或治疗剂是有用的抗原结合分子。抗原结合分子包括但不限于抗体,Fab分子,交换Fab分子,单链Fab分子,Fv分子,scFv分子,单域抗体,和VH和支架抗原结合蛋白。在一个方面,抗CD19抗原结合分子结合无关的,非CD19的蛋白质的程度小于该抗原结合分子对CD19的结合的约10％,如例如通过表面等离振子共振(SPR)测量的。特别地,能够特异性结合CD19的抗原结合分子具有≤1μM,≤100nM,≤10nM,≤1nM,≤0.1nM,≤0.01nM,或≤0.001nM(例如10^-8M或更少,例如10^-8M至10^-13M,例如10^-9M至10^-13M)的解离常数(K_d)。在某些实施方案中,抗CD19抗原结合分子结合人CD19。

术语“CD19”指B淋巴细胞抗原CD19,也称作B淋巴细胞表面抗原B4或T细胞表面抗原Leu-12且包括来自任何脊椎动物来源的任何天然CD19,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。人CD19的氨基酸序列在Uniprot登录号P15391(版本160,SEQ ID NO:59)中显示。该术语包括“全长”未加工的人CD19以及源自细胞中的加工的任何形式的人CD19,只要本文中报道的抗体结合它。CD19是在人B细胞的表面上表达的结构上不同的细胞表面受体,包括但不限于前B细胞,处于早期发育的B细胞(即未成熟B细胞),通过终末分化成浆细胞的成熟B细胞,和恶性B细胞。CD19由大多数前B急性成淋巴细胞性白血病(ALL),非霍奇金氏淋巴瘤,B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL),前淋巴细胞性白血病,毛细胞白血病,常见急性淋巴细胞性白血病,和一些无标志(Null)-急性成淋巴细胞性白血病表达。CD19在浆细胞上的表达进一步提示它可能在已分化的B细胞肿瘤,诸如多发性骨髓瘤上表达。因此,CD19抗原是非霍奇金氏淋巴瘤,慢性淋巴细胞性白血病和/或急性成淋巴细胞性白血病的治疗中的免疫疗法的靶物。本发明的例示性抗FAP结合分子结合FAP的胞外域。例示性抗CD19抗体描述于国际专利申请号WO2017/055328或WO 2017/055541 A1。

术语“可变区”或“可变域”指抗体重或轻链中牵涉抗原结合分子结合抗原的域。天然抗体的重链和轻链的可变域(分别是VH和VL)一般具有相似的结构,每个域包含四个保守的框架区(FR)和三个高变区(HVR)。参见例如Kindt et al.,Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,p.91(2007)。单个VH或VL域可足以赋予抗原结合特异性。

如本文中使用的,术语“高变区”或“HVR”指抗体可变域中在序列上高变的(“互补决定区”或“CDR”)和/或形成结构上限定的环的(“高变环”)和/或含有抗原接触残基的(“抗原接触”)每一个区域。一般地,抗体包含六个HVR:三个在VH中(H1,H2,H3),三个在VL中(L1,L2,L3)。本文中的例示性HVR包括:

(a)高变环,其存在于氨基酸残基26-32(L1),50-52(L2),91-96(L3),26-32(H1),53-55(H2),和96-101(H3)(Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987))；

(b)CDR,其存在于氨基酸残基24-34(L1),50-56(L2),89-97(L3),31-35b(H1),50-65(H2),和95-102(H3)(Kabat et al.,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))；

(c)抗原接触,其存在于氨基酸残基27c-36(L1),46-55(L2),89-96(L3),30-35b(H1),47-58(H2),和93-101(H3)(MacCallum et al.,J.Mol.Biol.262:732-745(1996))；和

(d)(a),(b),和/或(c)的组合,包括HVR氨基酸残基46-56(L2),47-56(L2),48-56(L2),49-56(L2),26-35(H1),26-35b(H1),49-65(H2),93-102(H3),和94-102(H3)。

除非另外指明,HVR(例如CDR)残基和可变域中的其它残基(例如FR残基)在本文中依照Kabat等人,见上文编号。

Kabat等人还定义了可应用于任何抗体的可变区序列的编号***。本领域普通技术人员能明确地将“Kabat编号方式”的这种***指派给任何可变区序列,不依赖于超出序列本身的任何实验数据。如本文中使用的,“Kabat编号方式”是指由Kabat et al.,U.S.Dept.of Health and Human Services,"Sequence of Proteins of ImmunologicalInterest"(1983)中列出的编号***。除非另有规定,抗体可变区中具体氨基酸残基位置的编号的提及依照Kabat编号***。

如本文中使用的,在抗原结合分子(例如抗体)的语境中术语“亲和力成熟的”指如下的抗原结合分子,其例如通过突变而自参照抗原结合分子衍生,与参照抗体结合相同抗原,优选结合相同表位；且对抗原具有比参照抗原结合分子要高的亲和力。亲和力成熟一般牵涉修饰抗原结合分子的一个或多个CDR中的一个或多个氨基酸残基。典型地,亲和力成熟的抗原结合分子与初始参照抗原结合分子结合相同表位。

“框架”或“FR”指除了高变区(HVR)残基之外的可变域残基。可变域的FR一般由四个FR域组成:FR1,FR2,FR3,和FR4。因而,HVR和FR序列一般在VH(或VL)中以下述顺序出现:FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。

出于本文中的目的,“受体人框架”是包含自如下文定义的人免疫球蛋白框架或人共有框架衍生的轻链可变域(VL)框架或重链可变域(VH)框架的氨基酸序列的框架。“自”人免疫球蛋白框架或人共有框架“衍生”的受体人框架可包含其相同的氨基酸序列,或者它可含有氨基酸序列变化。在一些实施方案中,氨基酸变化的数目是10或更少,9或更少,8或更少,7或更少,6或更少,5或更少,4或更少,3或更少,或2或更少。在一些实施方案中,VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列同一。

术语“嵌合”抗体指如下的抗体,其中重和/或轻链的一部分自特定来源或物种衍生,而重和/或轻链的剩余部分自不同来源或物种衍生。

抗体的“类”指其重链拥有的恒定域或恒定区的类型。有五大类抗体:IgA,IgD,IgE,IgG,和IgM,而且其中若干可进一步分为亚类(同种型),例如IgG₁,IgG₂,IgG₃,IgG₄,IgA₁,和IgA₂。与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α,δ,ε,γ,和μ。

“人源化”抗体指包含来自非人HVR的氨基酸残基和来自人FR的氨基酸残基的嵌合抗体。在某些实施方案中,人源化抗体会包含至少一个,通常两个实质性整个如下的可变域,其中整个或实质性整个HVR(例如CDR)对应于非人抗体的那些,而且整个或实质性整个FR对应于人抗体的那些。人源化抗体任选可包含自人抗体衍生的抗体恒定区的至少一部分。抗体,例如非人抗体的“人源化形式”指经历人源化的抗体。本发明涵盖的其它形式的“人源化抗体”是其中恒定区已经自原始抗体的恒定区另外修饰或变化以生成依照本发明的特性,尤其是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合的那些。

“人”抗体是拥有与由人或人细胞生成的或自利用人抗体全集或其它人抗体编码序列的非人来源衍生的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列的抗体。人抗体的这种定义专门排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。

本文中的术语“Fc域”或“Fc区”用于定义含有恒定区的至少一部分的抗体重链的C端区。该术语包括天然序列Fc区和变体Fc区。IgG Fc区包含IgG CH2和IgG CH3域。人IgG Fc区的“CH2域”通常自约位置231处的氨基酸残基延伸至约位置340处的氨基酸残基(依照Kabat的EU编号***)。在一个实施方案中,碳水化合物链附着于CH2域。本文中的CH2域可以是天然序列CH2域或变体CH2域。在一个方面,CH2域包含SEQ ID NO:60的氨基酸序列。“CH3域”包含Fc区中在CH2域C端的那段残基(即自IgG的约位置341处的氨基酸残基至约位置447处的氨基酸残基)。在一个方面,CH3域包含SEQ ID NO:61的氨基酸序列(无C末端赖氨酸)。本文中的CH3区可以是天然序列CH3域或变体CH3域(例如具有在其一条链中引入的“***”(“节”)和在其另一条链中相应引入的“空腔”(“穴”)的CH3域；参见美国专利No.5,821,333,通过援引明确收入本文)。如本文中描述的,此类变体CH3域可用于促进两条不相同抗体重链的异二聚化。在一个实施方案中,人IgG重链Fc区自Cys226或自Pro230延伸至重链的羧基末端。然而,Fc区的C末端赖氨酸(Lys447)可以存在或不存在。除非本文中另有规定,Fc区或恒定区中的氨基酸残基的编号依照EU编号***,也称作EU索引,如Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中描述的。

术语“野生型Fc域”指与在自然界中找到的Fc域的氨基酸序列相同的氨基酸序列。野生型人Fc域包括天然人IgG1 Fc区(非A和A同种异型),天然人IgG2 Fc区,天然人IgG3 Fc区,和天然人IgG4 Fc区以及其天然发生变体。野生型Fc区显示于SEQ ID NO:106(IgG1,高加索人同种异型),SEQ ID NO:107(IgG1,非洲裔美国人同种异型),SEQ ID NO:108(IgG2),SEQ ID NO:109(IgG3)和SEQ ID NO:110(IgG4)。

术语“变体(人)Fc域”指因至少一处“氨基酸突变”而与“野生型”(人)Fc域的氨基酸序列不同的氨基酸序列。在一个方面,变体Fc区具有与天然Fc区相比的至少一处氨基酸突变,例如约一处至约十处氨基酸突变,和,在一个方面,天然Fc区中的约一处至约五处氨基酸突变。在一个方面,(变体)Fc区与野生型Fc区具有至少约95％同源性。

“节-入-穴”技术在例如US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway et al.,Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中描述。一般地,该方法牵涉在第一多肽的界面处引入***(“节”)并在第二多肽的界面中引入相应的空腔(“穴”),使得该***可放置在该空腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过将来自第一多肽的界面的小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换来构建***。通过将大氨基酸侧链用较小侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换而在第二多肽的界面中创建与***相同或相似大小的补偿性空腔。可通过改变编码多肽的核酸,例如通过位点特异性诱变,或通过肽合成来生成***和空腔。在一个具体实施方案中,节修饰包含Fc域的两个亚基之一中的氨基酸替代T366W,而穴修饰包含Fc域的两个亚基之另一中的氨基酸替代T366S,L368A和Y407V。在又一个具体实施方案中,Fc域中包含节修饰的亚基另外包含氨基酸替代S354C,而Fc域中包含穴修饰的亚基另外包含氨基酸替代Y349C。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc区的两个亚基之间形成二硫桥,如此进一步稳定化二聚体(Carter,J Immunol Methods248,7-15(2001))。编号方式依照Kabat et al.,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD,1991中的EU索引。

“与免疫球蛋白的Fc区等同的区域”意图包括免疫球蛋白的Fc区的天然发生等位变体以及具有生成替代,添加,或删除的改变但并不实质性降低免疫球蛋白介导效应器功能(诸如抗体依赖性细胞的细胞毒性)的能力的变体。例如,可以自免疫球蛋白的Fc区的N端或C端删除一个或多个氨基酸,生物学功能没有实质性损失。可以依照本领域已知的一般规则来选择此类变体,从而对活性具有最小限度影响(参见例如Bowie,J.U.et al.,Science247:1306-10(1990))。

术语“CH1域”指抗体重链多肽中大约自EU位置118延伸至EU位置215的部分(EU编号***)。在一个实施方案中,CH1域包含SEQ ID NO:62的氨基酸序列。通常,后面是具有氨基酸序列EPKSC(SEQ ID NO:99)的区段,用于将CH1域连接至铰链区。

术语“铰链区”指抗体重链多肽中在野生型抗体重链中连接CH1域和CH2域的部分,例如依照Kabat的EU编号***自约位置216至约位置230,或依照Kabat的EU编号***自约位置226至约位置230。可以通过与IgG1亚类序列的铰链区半胱氨酸残基比对来确定其它IgG亚类的铰链区。铰链区在正常情况下是由具有相同氨基酸序列的两条多肽组成的二聚体分子。铰链区一般包含多至25个氨基酸残基且是柔性的,容许相关靶物结合位点独立移动。铰链区可以细分成三个域:上,中,和下铰链域(参见例如Roux et al.,J.Immunol.161(1998)4083)。在一个方面,铰链区具有氨基酸序列DKTHTCPXCP(SEQ ID NO:63),其中X是S或P。在一个方面,铰链区具有氨基酸序列HTCPXCP(SEQ ID NO:64),其中X是S或P。在一个方面,铰链区具有氨基酸序列CPXCP(SEQ ID NO:65),其中X是S或P。

术语“效应器功能”指那些可归于抗体的Fc区的生物学活性,其随抗体同种型而变化。抗体效应器功能的例子包括:C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC),Fc受体结合,抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),细胞因子分泌,免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,细胞表面受体(例如B细胞受体)的下调,和B细胞活化。

“活化性Fc受体”是在受到抗体的Fc区啮合后引发刺激携带该受体的细胞实施效应器功能的信号传导事件的Fc受体。活化性Fc受体包括FcγRIIIa(CD16a),FcγRI(CD64),FcγRIIa(CD32),和FcαRI(CD89)。一种特定活化性Fc受体是人FcγRIIIa(参见UniProt登录号P08637,版本141)。

术语“TNF配体家族成员”或“TNF家族配体”指促炎性细胞因子。细胞因子,特别是TNF配体家族的成员,一般在免疫***的刺激和协调中发挥至关紧要的作用。目前,基于序列,功能,和结构相似性,已经将19种细胞因子鉴定为TNF(肿瘤坏死因子)配体超家族的成员。所有这些配体都是具有C端细胞外结构域(外域),N端细胞内结构域和单个跨膜结构域的II型跨膜蛋白。称作TNF同源域(THD)的C端细胞外结构域在超家族成员之间具有20-30％氨基酸同一性且负责结合受体。TNF外域还负责TNF配体形成受到其特异性受体识别的三聚体复合物。

TNF配体家族的成员选自由淋巴毒素α(也称作LTA或TNFSF1),TNF(也称作TNFSF2),LTβ(也称作TNFSF3),OX40L(也称作TNFSF4),CD40L(也称作CD154或TNFSF5),FasL(也称作CD95L,CD178或TNFSF6),CD27L(也称作CD70或TNFSF7),CD30L(也称作CD153或TNFSF8),4-1BBL(也称作TNFSF9),TRAIL(也称作APO2L,CD253或TNFSF10),RANKL(也称作CD254或TNFSF11),TWEAK(也称作TNFSF12),APRIL(也称作CD256或TNFSF13),BAFF(也称作CD257或TNFSF13B),LIGHT(也称作CD258或TNFSF14),TL1A(也称作VEGI或TNFSF15),GITRL(也称作TNFSF18),EDA-A1(也称作外胚层发育异常蛋白A1)和EDA-A2(也称作外胚层发育异常蛋白A2)组成的组。该术语指来自任何脊椎动物来源的任何天然TNF家族配体,包括哺乳动物,诸如灵长类(例如人),非人灵长类(例如食蟹猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠),除非另外指明。在本发明的具体实施方案中,TNF配体家族成员选自由OX40L,FasL,CD27L,TRAIL,4-1BBL,CD40L和GITRL组成的组。在一个特定实施方案中,TNF配体家族成员是4-1BBL。

可以自公众可获取的数据库,诸如Uniprot(www.uniprot.org)获得TNF配体家族成员的别的信息,特别是序列。例如,人TNF配体具有下述氨基酸序列:人淋巴毒素α(UniProt登录号P01374,SEQ ID NO:66),人TNF(UniProt登录号P01375,SEQ ID NO:67),人淋巴毒素β(UniProt登录号Q06643,SEQ ID NO:68),人OX40L(UniProt登录号P23510,SEQID NO:69),人CD40L(UniProt登录号P29965,SEQ ID NO:70),人FasL(UniProt登录号P48023,SEQ ID NO:71),人CD27L(UniProt登录号P32970,SEQ ID NO:72),人CD30L(UniProt登录号P32971,SEQ ID NO:73),4-1BBL(UniProt登录号P41273,SEQ ID NO:74),TRAIL(UniProt登录号P50591,SEQ ID NO:75),RANKL(UniProt登录号O14788,SEQ ID NO:76),TWEAK(UniProt登录号O43508,SEQ ID NO:77),APRIL(UniProt登录号O75888,SEQ IDNO:78),BAFF(UniProt登录号Q9Y275,SEQ ID NO:79),LIGHT(UniProt登录号O43557,SEQID NO:80),TL1A(UniProt登录号O95150,SEQ ID NO:81),GITRL(UniProt登录号Q9UNG2,SEQ ID NO:82)和外胚层发育异常蛋白A(UniProt登录号Q92838,SEQ ID NO:83)。

“外域”是膜蛋白中延伸入细胞外空间(即靶细胞以外的空间)的结构域。外域通常是蛋白质中启动与表面接触的部分,这导致信号转导。如此,如本文中定义的TNF配体家族成员的外域指TNF配体蛋白中延伸入细胞外空间的部分(细胞外结构域),但还包括负责三聚化和结合相应的TNF受体的更短部分或其片段。如此,术语“TNF配体家族成员的外域或其片段”指TNF配体家族成员中形成细胞外结构域的细胞外结构域或其仍然能够结合受体的部分(受体结合域)。

术语“共刺激性TNF配体家族成员”或“共刺激性TNF家族配体”指能够共刺激T细胞的增殖和细胞因子生成的TNF配体家族成员亚群。这些TNF家族配体能在与其相应的TNF受体相互作用时共刺激TCR信号,而且与其受体的相互作用导致TNFR相关因子(TRAF)的募集,这启动导致T细胞活化的信号传导级联。共刺激性TNF家族配体选自由4-1BBL,OX40L,GITRL,CD70,CD30L和LIGHT组成的组,更加特别地,共刺激性TNF配体家族成员选自4-1BBL和OX40L。

如本文中之前描述的,4-1BBL是一种II型跨膜蛋白且是TNF配体家族的一个成员。已经描述了具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的完整或全长4-1BBL在细胞的表面上形成三聚体。通过4-1BBL的外域的特定基序而实现三聚体的形成。所述基序在本文中命名为“三聚化区”。人4-1BBL序列的氨基酸50-254(SEQ ID NO:84)形成4-1BBL的细胞外结构域,但是甚至其片段也能够形成三聚体。在本发明的具体实施方案中,术语“4-1BBL的外域或其片段”指具有选自SEQ ID NO:4(人4-1BBL的氨基酸52-254),SEQ ID NO:1(人4-1BBL的氨基酸71-254),SEQ ID NO:3(人4-1BBL的氨基酸80-254)和SEQ ID NO:2(人4-1BBL的氨基酸85-254)的氨基酸序列的多肽或具有选自SEQ ID NO:5(人4-1BBL的氨基酸71-248),SEQ ID NO:8(人4-1BBL的氨基酸52-248),SEQ ID NO:7(人4-1BBL的氨基酸80-248)和SEQ ID NO:6(人4-1BBL的氨基酸85-248)的氨基酸序列的多肽,但是能够三聚化的外域的其它片段也包括在本文中。

术语“肽接头”指包含一个或多个氨基酸,典型地约2-20个氨基酸的肽。肽接头在本领域中是已知的或在本文中描述。合适的非免疫原性接头肽是例如(G₄S)_n,(SG₄)_n或G₄(SG₄)_n肽接头,其中“n”一般是介于1和10之间,典型地介于1和4之间的数目,特别是2,即肽选自由GGGGS(SEQ ID NO:41),GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:42),SGGGGSGGGG(SEQ ID NO:43),GGGGGSGGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:44),(G₄S)₃或GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO:45),GGGGSGGGGSGGGG或G₄(SG₄)₂(SEQ ID NO:46),和(G₄S)₄或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ IDNO:47)组成的组,但是还包括序列GSPGSSSSGS(SEQ ID NO:48),GSGSGSGS(SEQ ID NO:49),GSGSGNGS(SEQ ID NO:50),GGSGSGSG(SEQ ID NO:51),GGSGSG(SEQ ID NO:52),GGSG(SEQID NO:53),GGSGNGSG(SEQ ID NO:54),GGNGSGSG(SEQ ID NO:55)和GGNGSG(SEQ ID NO:56)。特别感兴趣的肽接头是(G₄S)₁或GGGGS(SEQ ID NO:41),(G₄S)₂或GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:42)和GGGGGSGGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:44),更加特别是(G₄S)₂或GGGGSGGGGS(SEQ IDNO:42)。

依照本发明的“间隔物域”是在折叠后形成结构域的多肽。如此,间隔物域可以小于100个氨基酸残基,但是需要在结构上受限以固定结合基序。例示性的间隔物域是五聚体卷曲螺旋,抗体铰链区或抗体Fc区或其片段。间隔物域是二聚化域,即间隔物域包含能够提供二聚化功能性的氨基酸。

如此申请内使用的术语“氨基酸”表示天然发生羧基α-氨基酸的组,包含丙氨酸(三字母代码:ala,单字母代码:A),精氨酸(arg,R),天冬酰胺(asn,N),天冬氨酸(asp,D),半胱氨酸(cys,C),谷氨酰胺(gln,Q),谷氨酸(glu,E),甘氨酸(gly,G),组氨酸(his,H),异亮氨酸(ile,I),亮氨酸(leu,L),赖氨酸(lys,K),甲硫氨酸(met,M),苯丙氨酸(phe,F),脯氨酸(pro,P),丝氨酸(ser,S),苏氨酸(thr,T),色氨酸(trp,W),酪氨酸(tyr,Y),和缬氨酸(val,V)。

如本文中使用的“融合多肽”或“单一融合多肽”指由直接或经由肽接头彼此融合的不同构件,诸如TNF配体家族成员的外域构成的单链多肽。“融合”或“连接”意味着各构件(例如多肽和所述TNF配体家族成员的外域)通过肽键,或是直接地或是经由一个或多个肽接头连接。

关于参照多肽(蛋白质)序列的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为在比对序列和在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性之后,而且不考虑任何保守替代作为序列同一性的一部分,候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基同一的氨基酸残基的百分比。出于确定百分比氨基酸序列同一性目的的比对可以以本领域的技能内的多种方式实现,例如使用公众可得的计算机软件,诸如BLAST,BLAST-2,ALIGN.SAWI或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能确定用于比对序列的适宜参数,包括在所比较的序列的全长上实现最大比对需要的任何算法。然而,出于本文中的目的,使用序列比较计算机程序ALIGN-2生成％氨基酸序列同一性值。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写,而且源代码已经与用户文档一起提交美国版权局(Washington D.C.,20559),以美国版权注册号TXU510087注册。公众自Genentech公司(South San Francisco,California)可得到ALIGN-2程序,或者可以自源代码编译。ALIGN-2程序应当编译成在UNIX操作***,包括数码UNIX V4.0D上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设置且不变。在采用ALIGN-2进行氨基酸序列比较的情况中,给定氨基酸序列A相对于(to),与(with),或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为给定氨基酸序列A具有或包含相对于,与,或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性)如下计算:

100乘分数X/Y

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B的比对中打分为同一匹配的氨基酸残基的数目,且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。会领会的是,在氨基酸序列A的长度不等于氨基酸序列B的长度的情况中,A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有具体说明,本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值是如上一段中所述使用ALIGN-2计算机程序获得的。

在某些实施方案中,涵盖本文中提供的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体。例如,可能想要改善含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的结合亲和力和/或其它生物学特性。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的氨基酸序列变体可通过将适宜修饰引入编码该分子的核苷酸序列,或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列内的残基的删除,和/或***和/或替代。可进行删除,***,和替代的任何组合来得到最终的构建物,前提是最终的构建物拥有想要的特征,例如抗原结合。替代诱变感兴趣的位点包括HVR和框架(FR)。保守替代在表A中在标题“优选替代”下提供且在下文中提及氨基酸侧链类别(1)至(6)进一步描述。可将氨基酸替代引入感兴趣的分子并对产物筛选想要的活性,例如保留/改善的抗原结合,降低的免疫原性,或改善的ADCC或CDC。

表A

氨基酸可以依照共同的侧链特性来分组:

(1)疏水性的:正亮氨酸,Met,Ala,Val,Leu,Ile；

(2)中性亲水性的:Cys,Ser,Thr,Asn,Gln；

(3)酸性的:Asp,Glu；

(4)碱性的:His,Lys,Arg；

(5)影响链取向的残基:Gly,Pro；

(6)芳香族的:Trp,Tyr,Phe。

非保守替代会需要用这些类别之一的成员替换另一类别。

术语“氨基酸序列变体”包括其中在亲本抗原结合分子(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残基中有氨基酸替代的实质性变体。一般地,为进一步研究选择的所得变体相对于亲本抗原结合分子会具有某些生物学特性的改变(例如改善)(例如升高的亲和力,降低的免疫原性)和/或会实质性保留亲本抗原结合分子的某些生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体,其可以例如使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术诸如本文中所描述的那些技术来方便地生成。简言之,将一个或多个HVR残基突变并将变体抗原结合分子在噬菌体上展示并对其筛选特定的生物学活性(例如结合亲和力)。在某些实施方案中,可以在一个或多个HVR内发生替代,***,或删除,只要此类变化不实质性降低抗原结合分子结合抗原的能力。例如,可以在HVR中进行不实质性降低结合亲和力的保守改变(例如如本文中提供的保守替代)。一种对于鉴定抗体中可以作为诱变靶位的残基或区域有用的方法称作“丙氨酸扫描诱变”,如由Cunningham and Wells(1989)Science,244:1081-1085描述的。在此方法中,鉴定残基或靶残基的组(例如带电荷的残基,诸如Arg,Asp,His,Lys,和Glu)并用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多丙氨酸)替换以测定抗体与抗原的相互作用是否受到影响。可以在对初始替代表明功能敏感性的氨基酸位置引入进一步的替代。或者/另外,利用抗原-抗原结合分子复合物的晶体结构来鉴定抗体和抗原之间的接触点。作为替代的候选,可以靶向或消除此类接触残基和邻近残基。可以筛选变体以确定它们是否含有想要的特性。

氨基酸序列***包括长度范围为1个残基至含有100或更多个残基的多肽的氨基和/或羧基端融合,以及单个或多个氨基酸残基的序列内***。末端***的例子包括具有N端甲硫氨酰基残基的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。分子的其它***变体包括与延长含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的血清半衰期的多肽的N或C端的融合。

在某些方面,改变本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以提高或降低抗体糖基化的程度。可以通过改变氨基酸序列,使得创建或去除一个或多个糖基化位点来方便地获得分子的糖基化变体。在含有TNF配体三聚体的抗原结合分子包含Fc区的情况中,可改变附着于其的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的双触角寡糖,其一般通过N连接附着至Fc区的CH2域的Asn297。参见例如Wright et al.,TIBTECH15:26-32(1997)。寡糖可包括各种碳水化合物,例如甘露糖,N-乙酰葡糖胺(GlcNAc),半乳糖,和唾液酸,以及附着于双触角寡糖结构的“主干”中的GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中,可进行含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中的寡糖的修饰以创建具有某些改良特性的变体。在一个方面,提供具有缺乏(直接或间接)附着于Fc区的岩藻糖的碳水化合物结构的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的变体。此类岩藻糖基化变体可具有改善的ADCC功能,参见例如美国专利公开号US 2003/0157108(Presta,L.)或US2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的别的变体包括那些具有两分寡糖的,例如,其中附着于Fc区的双触角寡糖通过GlcNAc两分。此类变体可具有降低的岩藻糖基化和/或改善的ADCC功能,参见例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美国专利No.6,602,684(Umana等人)；和US 2005/0123546(Umana等人)。还提供附着于Fc区的寡糖中具有至少一个半乳糖残基的变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能且在例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；和WO 1999/22764(Raju,S.)中描述。

在某些实施方案中,可能想要创建本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的半胱氨酸工程化改造的变体,例如“thioMAb”,其中分子的一个或多个残基用半胱氨酸残基替代。在特定实施方案中,替代的残基出现于分子的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基,由此反应性硫醇基团放置在抗体的可及位点且可用于将抗体与其它模块诸如药物模块或接头-药物模块缀合以创建免疫缀合物。在某些实施方案中,可以用半胱氨酸替代任一个或多个下述残基:轻链的V205(Kabat编号方式)；重链的A118(EU编号方式)；和重链Fc区的S400(EU编号方式)。可以如例如美国专利No.7,521,541中所述生成半胱氨酸工程化改造的抗原结合分子。

在某些方面,可一步修饰本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子以含有本领域已知且容易获得的另外的非蛋白质模块。适合于抗体衍生化的模块包括但不限于水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG),乙二醇/丙二醇共聚物,羧甲基纤维素,右旋糖苷,聚乙烯醇,聚乙烯吡咯烷酮,聚-1,3-二氧戊环,聚-1,3,6-三噁烷,乙烯/马来酸酐共聚物,聚氨基酸(或是均聚物或是随机共聚物),和右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇,丙二醇均聚物,环氧丙烷/环氧乙烷共聚物,聚氧乙烯化多元醇(例如甘油),聚乙烯醇,及其混合物。由于其在水中的稳定性,聚乙二醇丙醛在制造中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量,而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物的数目可以变化,而且如果附着了超过一个聚合物,那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言,可基于下述考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型,包括但不限于抗体要改进的特定特性或功能,双特异性抗体衍生物是否会用于限定条件下的疗法,等。在另一个方面,提供抗体和可以通过暴露于辐射选择性加热的非蛋白质性质模块的缀合物。在一个实施方案中,非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam,N.W.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102(2005)11600-11605)。辐射可以是任何波长的,而且包括但不限于对普通细胞没有损害,但是将非蛋白质性质模块加热至抗体-非蛋白质性质模块附近的细胞被杀死的温度的波长。

在另一个方面,可获得本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的免疫缀合物。“免疫缀合物”是与包括但不限于细胞毒剂在内的一个或多个异源分子缀合的抗体。

术语“核酸”指分离的核酸分子或构建物,例如信使RNA(mRNA),病毒衍生的RNA,或质粒DNA(pDNA)。核酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规键(例如酰胺键,诸如在肽核酸(PNA)中找到的)。术语“核酸”指多核苷酸中存在的任一个或多个核酸区段,例如DNA或RNA片段。

“分离的”核酸分子或多核苷酸意指已经自其天然环境移出的核酸分子,DNA或RNA。例如,出于本发明的目的,认为载体中包含的编码多肽的重组核酸是分离的。分离的核酸的别的例子包括在异源宿主细胞中维持的重组多核苷酸或溶液中(部分或实质性)纯化的多核苷酸。分离的核酸包括通常含有该多核苷酸分子的细胞中含有的多核苷酸分子,但是该多核苷酸分子存在于染色体外或与其天然染色***置不同的染色***置。分离的RNA分子包括本发明的体内或体外RNA转录物,以及正和负链形式,和双链形式。依照本发明的分离的多核苷酸或核酸进一步包括合成生成的此类分子。另外,多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件,诸如启动子,核糖体结合位点,或转录终止子。

具有与本发明的参照核苷酸序列至少例如95％“同一”的核苷酸序列的核酸或多核苷酸意指除了该多核苷酸序列可包括至多该参照核苷酸序列的每100个核苷酸的5个点突变之外,该多核苷酸的核苷酸序列与参照序列同一。换言之,为了获得具有与参照核苷酸序列至少95％同一的核苷酸序列的多核苷酸,参照序列中至多5％的核苷酸可以删除或用另一种核苷酸替代,或者,在参照序列中,总核苷酸的至多5％的数目的多个核苷酸可***参照序列。参照序列的这些改变可发生于参照核苷酸序列的5’或3’端位置或那些末端位置之间的任何地方,或是在参照序列中的残基间个别散布或是以一个或多个连续组在参照序列内散布。实际上,使用已知的计算机程序,诸如上文关于多肽讨论的(例如ALIGN-2),可常规确定任何特定多核苷酸序列是否与本发明的核苷酸序列至少80％,85％,90％,95％,96％,97％,98％或99％同一。

术语“表达盒”指重组或合成生成的多核苷酸,具有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列规定核酸元件。重组表达盒可并入质粒,染色体,线粒体DNA,质体DNA,病毒,或核酸片段。典型地,在其它序列以外,表达载体的重组表达盒部分包括要转录的核酸序列和启动子。在某些实施方案中,本发明的表达盒包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列。

术语“载体”或“表达载体”与“表达构建物”同义且指用于将与其可操作联合的特定基因导入靶细胞并指导表达的DNA分子。该术语包括作为自身复制性核酸结构的载体以及并入其已经导入的宿主细胞的基因组的载体。本发明的表达载体包含表达盒。表达载体容许大量稳定mRNA的转录。一旦表达载体在靶细胞内,则由细胞转录和/或翻译机制生成由该基因编码的核糖核酸分子或蛋白质。在一个实施方案中,本发明的表达载体包含包含编码本发明的双特异性抗原结合分子或其片段的多核苷酸序列的表达盒。

术语“宿主细胞”,“宿主细胞系”,和“宿主细胞培养物”可互换使用且指其中已经导入外源核酸的细胞,包括此类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体/转化子”和“转化细胞”,其包括原代转化细胞和自其衍生的后代,不管传代的次数。后代在核酸内容方面与亲本细胞可以不是完全同一,但是可含有突变。具有与在原始转化细胞中筛选或选择相同的功能或生物学活性的突变体后代包括在本文中。宿主细胞是可用于生成本发明的双特异性抗原结合分子的任何类型的细胞***。宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,诸如CHO细胞,BHK细胞,NS0细胞,SP2/0细胞,YO骨髓瘤细胞,P3X63小鼠骨髓瘤细胞,PER细胞,PER.C6细胞或杂交瘤细胞,酵母细胞,昆虫细胞,和植物细胞,仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。

药剂的“有效量”指在接受其施用的细胞或组织中导致生理变化必需的量。

药剂(例如药用组合物)的“治疗有效量”指在剂量和时间段方面有效实现想要的治疗或预防结果必需的量。例如,治疗有效量的药剂消除,减轻/减少,延迟,最小化或预防疾病的不利影响。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如牛,绵羊,猫,犬,和马),灵长类(例如人和非人灵长类,诸如猴),家兔,和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。特定地,个体或受试者是人。

术语“药用组合物”指其为此类形式的制剂,所述形式允许其中含有的活性组分的生物学活性是有效的,而且所述制剂不含另外的对会接受该配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的成分。

“药学可接受赋形剂”指药用组合物中除了活性组分以外,对受试者无毒的组分。药学可接受赋形剂包括但不限于缓冲剂,稳定剂,或防腐剂。

术语“包装插页”用于指通常包括在治疗性产品的商业包装中的说明书,其含有关于关注此类治疗性产品的使用的适应症,用法,剂量,施用,组合疗法,禁忌症和/或警告的信息。

如本文中使用的,“治疗/处理”指试图改变所治疗个体的自然进程的临床干预,而且可以或是为了预防或是在临床病理学的过程中实施的。治疗的期望效果包括但不限于预防疾病的发生或复发,缓解症状,削弱疾病的任何直接或间接病理学后果,预防转移,减缓疾病进展的速率,改善或减轻疾病状态,和消退或改善的预后。在一些实施方案中,使用本发明的分子来延迟疾病的发生或减缓疾病的进展。

如本文中使用的术语“癌症”指增殖性疾病,诸如淋巴瘤,癌瘤,淋巴瘤,母细胞瘤,肉瘤,白血病,淋巴细胞性白血病,肺癌,非小细胞肺(NSCL)癌,支气管肺泡细胞肺癌,骨癌,胰腺癌,皮肤癌,头或颈癌,皮肤或眼内黑素瘤,子宫癌,卵巢癌,直肠癌,***区癌,胃癌,胃的癌,结肠直肠癌(CRC),胰腺癌,乳腺癌,三重阴性乳腺癌,子宫癌,输卵管癌,子宫内膜癌,***,***癌,外阴癌,霍奇金(Hodgkin)氏病,食管癌,小肠癌,内分泌***的癌症,甲状腺癌,甲状旁腺癌,肾上腺癌,软组织肉瘤,尿道癌,***癌,***癌,膀胱癌,肾或输尿管癌,肾细胞癌,肾盂癌,间皮瘤,肝细胞癌,胆道癌,中枢神经***(CNS)赘生物,脊索瘤,脑干胶质瘤,多形性成胶质细胞瘤,星形细胞瘤,施旺细胞瘤,室管膜瘤,成神经管细胞瘤,脑膜瘤,鳞状细胞癌,垂体腺瘤和尤因氏肉瘤,黑素瘤,多发性骨髓瘤,B细胞癌(淋巴瘤),慢性淋巴细胞性白血病(CLL),急性成淋巴细胞性白血病(ALL),毛细胞白血病,慢性成髓细胞性白血病,包括任何上述癌症的顽固性形式,或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子

本发明提供新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其具有特别有利特性,诸如可生产性,稳定性,结合亲和力,生物学活性,靶向效率和降低的毒性。

特别是,本发明描述如何能将三聚体TNF配体有效融合至抗体,使得三聚体配体是正确组装的且功能完全的。对于意图朝向临床应用开发的分子,不得不避免功能活性分子的聚集物,意味着天然配体融合物的纯度和稳定性是非常关键的。重要的是,在本发明的抗原结合分子中,所有三个TNF配体融合至抗体的重链。如此,可以避免重和轻链之间正确配对的问题。

聚焦于基于抗体的构造得到一般抗体的优秀药动学特性的指导。该抗体构造与其它蛋白质相比是稳定的；它们使用不同细胞系的表达也是非常强健的。它们的Fc部分与FcRn受体相互作用且因此保护分子免于经由细胞内降解的快速消除。同样重要的是,该构建物可以以合理的较好的滴度表达且生成较好比率的希望产物。该抗体构造与其它蛋白质相比是稳定的；它们使用不同细胞系的表达也是非常强健的。

在这里,我们展现与Contorsbody原理组合使用该抗体构造的优点。最新构造由在二聚化或多聚化间隔物域(在这种情况中,单体Fc模块)的N端融合抗原结合域的一个部分,例如Fab分子的重链部分,并将另一部分,例如Fab分子的轻链部分融合至相同二聚化或多聚化间隔物域的C端组成。

在三聚体TNF配体的情况中,可以将配体的二聚体融合至Fc的C端部分,而可以将第三配体融合至Fc的N端部分以形成完整抗原结合分子的第一半。另一个套标准的链配对形成“标准”Fab-Fc组合作为抗原结合分子的第二半。或者,分子的第二半由单个环状融合多肽构成,其中Fab的重链融合至Fc的N端且Fab的轻链融合至Fc的C端(“Contorsbody”)。由于使用Fc“节-入-穴”技术来区分两条重链,因此在两个不同Fc部分之间发生异二聚化以形成最终的分子。在一条链上具有所有3个配体有助于自相同链得到单体的联合；一旦多肽构建且实现每个亚域的折叠,立刻不同部分优选与来自相同多肽的配偶组装,原因在于最新构造与来自另一条多肽的域相比相对较高浓度。如果分子的不完全三聚化能够与另一个单价或二价形式的融合TNF配体形成复合物的话,这导致副产物,或是高分子量种类或是非三聚体形式的配体。在另一个备选方案,可以将一个TNF配体融合至Fc的N端部分,而可以将第二配体融合至相同Fc的C端部分且可以将第三配体融合至第二Fc的C端部分。同样在这种情况中,所有三个配体优选彼此组装,就像它们都融合至通过二硫键彼此密切连接的Fc部分。

由于不同多肽链的表达速率是触发进一步联合的一个关键要素,因此本发明建议避免将TNF配体融合至短多肽链(即轻链),因为这可能比更长的多肽链表达快得多。在此类情况中,短多肽链可以与自身联合并生成主要的副产物,缺乏最终分子的Fc部分和抗原结合域的三聚体TNF配体。消减短链并不妨碍重链经由它们的Fc部分联合。如果具有通过自身三聚化的趋势的TNF配体没有融合至短链或甚至缺少短链(轻链)的话,如此可以避免不完整分子的聚集。

本发明的另一个焦点是保持第一融合多肽和第二融合多肽二者具有相似的长度。如果一个TNF配体融合至“常规”抗体重链的C端而在互补Fc部分的两侧上融合其它两个TNF配体的话,这特别得到了满足。两条含有Fc链均具有65kD左右的分子量且因而假设相似快速加工和折叠以在培养基中得到1:1化学计量。然后含有节和含有穴的Fc部分之间的预期联合驱动由两条多肽链提供的三聚体配体的联合。

如此,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子特征特别在于它们的可生产性(在制备期间构建聚集产物的趋势低)和它们的稳定性。该分子也称作“TNF配体Contorsbody”。

在第一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

-第二所述TNF配体家族成员外域或其片段,其或是直接或是经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,

(b)第二融合多肽,其包含抗原结合域的第一部分和间隔物域,其中

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

-或是第一融合多肽中的第二所述TNF配体家族成员外域的C端或是第二融合多肽中的间隔物域的C端,或

-在抗原结合域的第二部分融合至第二融合蛋白的间隔物域的C端的情况中,第一融合多肽中的第二所述TNF配体家族成员外域的C端,其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合。

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

-第二外域和第三所述TNF配体家族成员外域或其片段彼此且或是直接或是经由第二肽接头融合至间隔物域的C端,和

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

抗原结合域的第二部分以轻链的形式存在,且

在第二个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

抗原结合域的第二部分或是直接或是经由第三肽接头融合至间隔物域的C端,且

在第三个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

抗原结合域的第二部分以轻链的形式存在且第三所述TNF配体家族成员外域或其片段或是直接或是经由第四肽接头融合至间隔物域的C端,且

在一个特定的方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域且抗原结合域的第二部分包含抗体轻链可变域或反之。在一个具体的方面,抗体重链可变域融合至间隔物域的N端且抗体轻链可变域融合至相同间隔物域的C端。在另一个方面,抗体重链可变域融合至间隔物域的C端且抗体轻链可变域在不同的链,特别是轻链上存在。在又一个方面,本发明提供如本文中之前定义的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。在一个具体的方面,抗体重链Fab片段融合至间隔物域的N端且抗体轻链Fab片段融合至相同间隔物域的C端。在一个方面,抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。

在本发明的一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其(C端)片段和抗体CH2域或其(N端)片段。在另一个方面,间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。在又一个方面,本发明包含一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和人Fc区(域)。特别是,人Fc域是人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc域,更加特别地,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的间隔物域包含人IgG1域。

在本发明的又一个方面,第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。在一个特定的方面,依照节入穴方法第一融合多肽的间隔物域包含穴且第二融合多肽的间隔物域包含节。

促进异二聚化的Fc域修饰

在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(a)如本文中前面定义的第一融合多肽和如本文中前面定义的第二融合多肽,其中第一和第二融合多肽包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。典型地,在Fc域中引入这些修饰。两种结构不同的融合多肽的重组共表达和后续二聚化会导致两条多肽的数种可能组合。为了改善重组生成中含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的产率和纯度,在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域中引入促进想要的多肽的联合的修饰如此会是有利的。

人IgG Fc域的两个亚基之间最广泛蛋白质-蛋白质相互作用的位点在Fc域的CH3域中。如此,所述修饰特别是在Fc域的CH3域中。

在一个具体方面,所述修饰是所谓的“节-入-穴”修饰,包含Fc域的两个亚基之一中的“节”修饰和Fc域的两个亚基之另一中的“穴”修饰。如此,在一个特定方面,本发明涉及如本文中之前描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包括IgG分子,其中第一重链的Fc部分包含第一二聚化模块且第二重链的Fc部分包含第二二聚化模块,容许IgG分子的两条重链异二聚化,而且依照节入穴技术,第一二聚化模块包含节且第二二聚化模块包含穴。

“节入穴”技术例如描述于US 5,731,168；US 7,695,936；Ridgway等人Prot Eng9,617-621(1996)和Carter,J Immunol Meth 248,7-15(2001)中。通常,该方法包括在第一多肽的界面处引入突起(“节”)并且在第二多肽的界面中引入相应的腔(“穴”),使得该突起可以定位在该腔中,从而促进异二聚体形成并阻碍同二聚体形成。通过用较大的侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换第一多肽的界面的小氨基酸侧链而构建突起。通过用较小的氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换大的氨基酸侧链,在第二多肽的界面中产生与突起具有相同或相似大小的补偿腔。

可以通过例如WO 96/027011；Ridgway,J.B.,et al.,Protein Eng.9(1996)617-621；和Merchant,A.M.,et al.,Nat.Biotechnol.16(1998)677-681中以数个例子详细描述的“节-入-穴”技术改变如本文中报告的第一和第二融合多肽中的CH3域。在这种方法中,改变两个CH3域的相互作用表面以提高含有这两种CH3域的两条重链的异二聚化。(两条重链的)两种CH3域中的每一个可以是“节”,而另一个是“穴”。引入二硫桥进一步使异二聚体稳定(Merchant,A.M.,et al.,Nature Biotech.16(1998)677-681；Atwell,S.,et al.,J.Mol.Biol.270(1997)26-35)并提高产率。

因此,在一个特定方面,在本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域的第一亚基的CH3域中,将氨基酸残基替换为具有较大侧链体积的氨基酸残基,由此在第一亚基的CH3域内产生可定位于第二亚基的CH3域内的腔中的突起；并且在Fc域的第二亚基的CH3域中,将氨基酸残基替换为具有较小侧链体积的氨基酸残基,由此在第二亚基的CH3域内产生可将第一亚基的CH3域内的突起定位在其中的腔。

在一个具体方面,在Fc域的第一亚基(“节链”)的CH3域中,第366位的苏氨酸残基替换为色氨酸残基(T366W),而在Fc域的第二亚基的CH3域中,第407位酪氨酸残基替换为缬氨酸残基(Y407V)。更加特别地,在Fc域的第二亚基(“穴链”)中,另外将366位的苏氨酸残基替换为丝氨酸残基(T366S),将368位的亮氨酸残基替换为丙氨酸残基(L368A)。更加特别地,在Fc域的第一亚基中,另外将第354位的丝氨酸残基替换为半胱氨酸残基(S354C),而在Fc域的第二亚基中,另外将第349位酪氨酸残基替换为半胱氨酸残基(Y349C)。引入这两个半胱氨酸残基导致在Fc域的两个亚基之间形成二硫桥。二硫桥进一步使二聚体稳定(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

但是,或者/另外,还可以使用其它节入穴技术,如EP 1870459 A1描述的。在一个实施方案中,如本文中报告的多环状融合多肽包含“节链”的CH3域中的R409D和K370E突变和“穴链”的CH3域中的D399K和E357K突变(编号方式依照Kabat EU索引)。

在又一个方面,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可包含两个CH3域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3域之另一中的S354C,T366S,L368A和Y407V突变,或者如本文中报告的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含两个CH3域之一中的Y349C和T366W突变和两个CH3域之另一中的S354C,T366S,L368A和Y407V突变和另外地“节链”的CH3域中的R409D和K370E突变和“穴链”的CH3域中的D399K和E357K突变(编号方式依照KabatEU索引)。

在一个替代方面,促进Fc域的第一和第二亚基的联合的修饰包括介导静电操纵效应的修饰,例如,如PCT公开WO 2009/089004中所述。通常,这种方法包括通过将两个Fc域亚基的界面处的一个或多个氨基酸残基替换为带电荷的氨基酸残基,使得在静电方面不利于同二聚体形成,但在静电方面有利于异二聚化。

除了“节入穴技术”以外,本领域还知道用于修饰重链的CH3域以强化异二聚化的其它技术。本文中涵盖这些技术作为“节入穴技术”的备选,与如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子组合,尤其是WO 96/27011,WO 98/050431,EP 1870459,WO2007/110205,WO 2007/147901,WO 2010/129304,WO 2011/90754,WO 2011/143545,WO2012/058768,WO 2013/157954和WO 2013/096291中描述的。

在一个方面,引入第一和第二重链二者之间的CH3/CH3域界面中的特定氨基酸位置处具有相反电荷的带电荷氨基酸以进一步促进期望多肽的联合。因而,这个方面涉及如本文中公开的抗原结合分子,其中在抗体的三级结构中第一重链的CH3域和第二重链的CH3域形成界面,位于相应抗体CH3域之间,其中相应的第一重链的CH3域和第二重链的CH3域的氨基酸序列每个包含位于环状融合多肽的三级结构中的所述界面内的一组氨基酸,且其中来自位于一条重链的CH3域中的界面中的一组氨基酸的第一氨基酸用带正电荷的氨基酸替代且来自位于另一条重链的CH3域中的界面中的一组氨基酸的第二氨基酸用带负电荷的氨基酸替代。依照这个方面的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在本文中还称作“CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子”(其中缩写“+/-”代表在相应CH3域中引入的带相反电荷的氨基酸)。在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的一个方面,带正电荷的氨基酸选自K,R和H,且带负电荷的氨基酸选自E或D。在另一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中,带正电荷的氨基酸选自K和R,且带负电荷的氨基酸选自E或D。在又一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中,带正电荷的氨基酸是K,且带负电荷的氨基酸是E。在一个方面,在如本文中报告的所述CH3(+/-)改造的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中,在一条重链的CH3域中位置409处的氨基酸R用D替代且位置370处的氨基酸K用E替代,且在另一条重链的CH3域中位置399处的氨基酸D用K替代且位置357处的氨基酸E用K替代(编号方式依照Kabat EU索引)。

在本发明的又一个方面,IgG1 Fc域包含降低对Fc受体,特别是Fcγ受体的结合的一处或多处氨基酸替代。

降低Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域修饰

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可包含免疫球蛋白分子的重链域作为间隔物域。例如,免疫球蛋白G(IgG)分子的Fc域是二聚体,其每个亚基包含CH2和CH3IgG重链恒定域。Fc域的两个亚基能够彼此稳定联合。Fc域赋予本发明的抗原结合分子以有利的药动学特性,包括长血清半衰期,其有助于在靶组织中的较好积累和有利的组织-血液分配比。

在某些方面,提供的是拥有一些但不是所有效应器功能的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,使其成为如下应用的期望候选物,其中体内半衰期是重要的,而某些效应器功能(诸如CDC和ADCC)是不必要的或有害的。可以进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如,可以进行Fc受体(FcR)结合测定法以确保环状融合多肽缺乏FcγR结合(因此有可能缺乏ADCC活性),但是保留FcRn结合能力。

因而,在特定方面,与天然IgG1 Fc域相比,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域展现降低的对Fc受体的结合亲和力和/或降低的效应器功能。在一个方面,Fc并不实质性结合Fc受体和/或并不诱导效应器功能。在一个特定方面,Fc受体是Fcγ受体。在一个方面,Fc受体是人Fc受体。在一个具体方面,Fc受体是活化性人Fcγ受体,更具体地是人FcγRIIIa,FcγRI或FcγRIIa,最具体地是人FcγRIIIa。在一个方面,Fc域并不诱导效应器功能。降低的效应器功能可包括但不限于下述一种或多种:降低的补体依赖性细胞毒性(CDC),降低的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC),降低的抗体依赖性细胞吞噬(ADCP),降低的细胞因子分泌,降低的免疫复合物介导的抗原呈递细胞对抗原的摄取,降低的对NK细胞的结合,降低的对巨噬细胞的结合,降低的对单核细胞的结合,降低的对多形核细胞的结合,降低的诱导凋亡的直接信号传导,降低的树突细胞成熟,或降低的T细胞引发。

在某些方面,可以将一处或多处氨基酸修饰引入本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc区,由此生成Fc区变体。Fc区变体可包含包含一个或多个氨基酸位置处的氨基酸修饰(例如替代)的人Fc区序列(例如人IgG1,IgG2,IgG3或IgG4 Fc区)。

在一个特定方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含Fc域,Fc域包含一处或多处降低对Fc受体,特别是对Fcγ受体的结合的氨基酸替代。

在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的Fc域包含一处或多处降低Fc域对Fc受体的结合亲和力和/或效应器功能的氨基酸突变。典型地,在Fc域的两个亚基的每一个中存在相同的一处或多处氨基酸突变。特别是,Fc域包含位置E233,L234,L235,N297,P331和P329(EU编号方式)处的氨基酸替代。特别是,Fc域包含IgG重链的位置234和235(EU编号方式)和/或329(EU编号方式)处的氨基酸替代。更特别地,提供的是依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含具有IgG重链中的氨基酸替代L234A,L235A和P329G(“P329G LALA”,EU编号方式)的Fc域。氨基酸替代L234A和L235A指所谓的LALA突变。“P329G LALA”氨基酸替代组合几乎完全消除人IgG1 Fc域的Fcγ受体结合且在国际专利申请公开号WO 2012/130831A1中描述,其还描述了制备此类突变体Fc域的方法及用于测定其特性诸如Fc受体结合或效应器功能的方法。“EU编号方式”指依照Kabatet al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991的EU索引的编号方式。

具有降低的Fc受体结合和/或效应器功能的Fc域还包括那些具有Fc域残基238,265,269,270,297,327和329中的一个或多个的替代的(美国专利No.6,737,056)。此类Fc突变体包括在氨基酸位置265,269,270,297和327中的两处或更多处具有替代的Fc突变体,包括残基265和297替代成丙氨酸的所谓的“DANA”Fc突变体(美国专利No.7,332,581)。

在另一个方面,Fc域是IgG4 Fc域。与IgG1抗体相比,IgG4抗体展现降低的对Fc受体的结合亲和力和降低的效应器功能。在一个更具体方面,Fc域是包含位置S228(Kabat编号方式)处的氨基酸替代,特别是氨基酸替代S228P的IgG4 Fc域。在一个更具体方面,Fc域是包含氨基酸替代L235E和S228P和P329G(EU编号方式)的IgG4 Fc域。此类IgG4 Fc域突变体和其Fcγ受体结合特性也在WO 2012/130831中描述。

突变体Fc域可使用本领域公知的遗传或化学方法通过氨基酸删除,替代,***或修饰来制备。遗传方法可包括编码DNA序列的位点特异性诱变,PCR,基因合成,等等。正确的核苷酸变化可例如通过测序来验证。

可以例如通过ELISA或通过使用诸如BIAcore仪(GE Healthcare)的标准仪器的表面等离振子共振(SPR)容易地确定与Fc受体的结合,并且可以诸如通过重组表达获得Fc受体。适合的此类结合测定法描述于本文中。或者,可以使用已知表达特定Fc受体的细胞系诸如表达FcγIIIa受体的人NK细胞来评估Fc域或包含Fc域的细胞活化性含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子针对Fc受体的结合亲和力。

可以通过本领域已知的方法测量Fc域或包含Fc域的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的效应器功能。适合的用于测量ADCC的测定法描述于本文中。评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的其他实例描述于美国专利No.5,500,362；Hellstrom等人,Proc.Natl Acad Sci USA83,7059-7063(1986)和Hellstrom等人,Proc Natl AcadSci USA 82,1499-1502(1985)；美国专利No.5,821,337；Bruggemann等人,J Exp Med 166,1351-1361(1987)。或者,可以采用非放射性测定方法(参见,例如ACTI^TMnon-radioactivecytotoxicity assay for flow cytometry(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；和CytoTox

non-radioactive cytotoxicity assay(Promega,Madison,WI))。用于这种测定法的有用的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。替代地,或另外地,可以在体内,例如,在Clynes等人,Proc Natl Acad Sci USA 95,652-656(1998)中公开的动物模型中评估感兴趣分子的ADCC活性。

在一些实施方案中,Fc域对补体成分,具体是C1q的结合降低。因而,在其中将Fc域工程化改造成具有降低的效应器功能的一些实施方案中,所述降低的效应器功能包括降低的CDC。可以进行C1q结合测定法来确定本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是否能够结合C1q并因此具有CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO 2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为了评估补体活化,可实施CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro etal.,J Immunol Methods 202,163(1996)；Cragg et al.,Blood 101,1045-1052(2003)；和Cragg and Glennie,Blood 103,2738-2743(2004))。

在特定方面,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含(所有位置依照Kabat的EU索引)

i)人IgG1亚类的同二聚体Fc区,任选具有突变P329G,L234A和L235A,或

ii)人IgG4亚类的同二聚体Fc区,任选具有突变P329G,S228P和L235E,或

iii)人IgG1亚类的同二聚体Fc区,任选具有突变P329G,L234A,L235A,I253A,H310A,和H435A,或任选具有突变P329G,L234A,L235A,H310A,H433A,和Y436A,或

iv)异二聚体Fc区,其中

a)一条Fc区多肽包含突变T366W,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A和Y407V,或

b)一条Fc区多肽包含突变T366W和Y349C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V,和S354C,或

c)一条Fc区多肽包含突变T366W和S354C,且另一条Fc区多肽包含突变T366S,L368A,Y407V和Y349C,或

v)人IgG1亚类的异二聚体Fc区,其中两条Fc区多肽均包含突变P329G,L234A和L235A,且

vi)人IgG4亚类的异二聚体Fc区,其中两条Fc区多肽均包含突变P329G,S228P和L235E,且

vii)i),ii),和iii)之一与iv),v)和vi)之一的组合。

如本文中报告的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中包含的Fc域的C端可以是以氨基酸残基PGK结束的完整C端。C端可以是缩短的C端,其中去除了一个或两个C端氨基酸残基。在一个优选的实施方案中,C端是以氨基酸残基PG结束的缩短的C端。

特定的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子

在另一个方面,本发明提供一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

-在由可变抗原结合域和恒定域组成的Fab分子的第二部分融合至第二融合蛋白的间隔物域的C端的情况中,第一融合多肽中的第二所述TNF配体家族成员外域的C端,

其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域通过二硫键彼此共价联合且其中TNF配体家族成员是共刺激人T细胞激活的。

如此,本发明涉及一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其共刺激人T细胞激活。在本发明的一个特定的方面,TNF家族配体是4-1BBL。本发明的包含4-1BBL三聚体的抗原结合分子在本文中称作4-1BBL Contorsbody。

在又一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中TNF配体家族成员的外域如此包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ IDNO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。更加特别地,TNF配体家族成员的外域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

在还有另一个方面,提供的是一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中分子包含三个TNF配体家族成员外域,而且特别是,所有三个TNF配体家族成员外域包含相同的氨基酸序列。

在一个方面,抗原结合域能够特异性结合FAP。其中抗原结合域能够特异性结合FAP且其中TNF家族配体是4-1BBL的分子在本文中称作FAP-4-1BBL Contorsbody。

特别地,能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

在一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含

(a)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第一融合多肽,

(b)包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的轻链。

在另一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含

(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第一融合多肽,

(b)包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列的轻链。

(a)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第一融合多肽,

在又一个方面,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子包含

(a)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第一融合多肽,和

(b)包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列的第二融合多肽,或

(a)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第一融合多肽,和

(b)包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列的第二融合多肽。

在另一个方面,抗原结合域能够特异性结合CD19。其中抗原结合域能够特异性结合CD19且其中TNF家族配体是4-1BBL的分子在本文中称作CD19-4-1BBL Contorsbody。

特别是,能够特异性结合CD19的抗原结合域包含

(a)包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列的第一融合多肽,

(b)包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链。

(a)包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列的第一融合多肽,

(b)包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链。

(a)包含SEQ ID NO:85的氨基酸序列的第一融合多肽,

(b)包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列的第二融合多肽,和包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列的轻链。

多核苷酸

本发明进一步提供分离的核酸,其编码如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其片段。

该分离的编码本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子的核酸可以作为编码整个抗原结合分子的单一多核苷酸或作为共表达的多种(例如两种或更多种)多核苷酸表达。由共表达的核酸编码的多肽可经由例如二硫键或其它手段联合以形成功能性抗原结合分子。例如,免疫球蛋白的轻链部分与免疫球蛋白的重链部分可以由分开的多核苷酸编码。当共表达时,重链多肽会与轻链多肽联合以形成免疫球蛋白。

在一些方面,该分离的核酸编码整个依照如本文中描述的发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。特别地,该分离的核酸编码该依照如本文中描述的发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子中包含的多肽。

在一个方面,本发明涉及分离的核酸,其编码一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中该核酸包含(a)编码如本文中之前描述的第一融合多肽的序列,(b)编码如本文中之前描述的第二融合多肽的序列和任选地(c)编码轻链的序列。

在某些方面,该多核苷酸或核酸是DNA。在其它实施方案中,本发明的多核苷酸是RNA,例如以信使RNA(mRNA)的形式。本发明的RNA可以是单链的或双链的。

重组方法

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可使用例如如US4,816,567中描述的重组方法和组合物来生成。对于重组生成,分离编码例如如上文描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸并***一个或多个载体供进一步克隆和/或宿主细胞中的表达。此类多核苷酸可使用常规规程容易地分离和测序。在本发明的一个方面,提供包含本发明的核酸的载体,优选表达载体。可使用本领域技术人员公知的方法来构建含有含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(片段)的编码序列连同适宜的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术,合成技术和体内重组/遗传重组。参见例如Maniatis et al.,MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Cold SpringHarbor Laboratory,N.Y.(1989)；和Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,Greene Publishing Associates and Wiley Interscience,N.Y.(1989)中描述的技术。表达载体可以是病毒,质粒的部分,或者可以是核酸片段。表达载体包括其中与启动子和/或其它转录或翻译控制元件可操作联合地克隆编码含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸(即编码区)的表达盒。如本文中使用的,“编码区”是核酸中由翻译成氨基酸的密码子组成的部分。虽然“终止密码子”(TAG,TGA,或TAA)不翻译成氨基酸,但是如果存在的话,它可考虑作为编码区的一部分,但是任何侧翼序列,例如启动子,核糖体结合位点,转录终止子,内含子,5’和3’非翻译区,等等不是编码区的部分。两个或更多个编码区可存在于单个多核苷酸构建物中,例如在单个载体上,或在分开的多核苷酸构建物中,例如在分开的(不同的)载体上。而且,任何载体可含有单个编码区,或者可包含两个或更多个编码区,例如,本发明的载体可编码一种或多种多肽,其经由蛋白水解切割在翻译后或共翻译地分开成最终的蛋白质。另外,本发明的载体,多核苷酸,或核酸可编码异源编码区,或是与编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段,或其变体或衍生物的多核苷酸融合或是不融合。异源编码区包括但不限于专门的元件或基序,诸如分泌信号肽或异源功能域。可操作联合是这样一种方式,当基因产物,例如多肽的编码区与一种或多种调节序列这样联合时,将基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导导致编码想要的基因产物的mRNA转录的话且如果两个DNA片段之间的连接的性质不干扰表达调节序列指导基因产物表达的能力或不干扰DNA模板被转录的能力的话,两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其联合的启动子)是“可操作联合的”。如此,如果启动子能够影响编码多肽的核酸的转录的话,启动子区与该核酸会是可操作联合的。启动子可以是仅仅在预定细胞中指导DNA实质性转录的细胞特异性启动子。在启动子以外,其它转录控制元件,例如增强子,操纵基因,阻抑物,和转录终止信号可与多核苷酸可操作联合以指导细胞特异性转录。

本文中公开了合适的启动子和其它转录控制区。多种转录控制区是本领域技术人员知道的。这些包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥功能的转录控制区,诸如但不限于来自巨细胞病毒(例如立即早期启动子,连同内含子A),猿病毒40(例如早期启动子),和逆转录病毒(诸如例如劳斯(Rous)肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括那些自脊椎动物基因诸如肌动蛋白,热休克蛋白,牛生长激素和兔α珠蛋白衍生的,以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。另外的合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及诱导型启动子(例如四环素诱导型启动子)。类似地,多种翻译控制元件是本领域普通技术人员知道的。这些包括但不限于核糖体结合位点,翻译起始和终止密码子,和自病毒***衍生的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES,也称作CITE序列)。表达盒还可包括其它特征,诸如复制起点,和/或染色体整合元件,诸如逆转录病毒长末端重复(LTR),或腺伴随病毒(AAV)反向末端重复(ITR)。

本发明的多核苷酸和核酸编码区可以与另外的编码分泌或信号肽(其指导由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌)的编码区联合。例如,如果想要分泌含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的话,可以将编码信号序列的DNA放置在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的上游。依照信号假说,由哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列,其在一旦启动生长中的蛋白质链输出穿过粗面内质网时自成熟蛋白质切割下来。本领域普通技术人员知道脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N端融合的信号肽,其自翻译的多肽切割下来以生成分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中,使用天然信号肽,例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽,或该序列保留指导与其可操作联合的多肽分泌的能力的功能性衍生物。或者,可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如,野生型前导序列可以用人组织纤溶酶原活化物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸糖苷酶的前导序列替代。

编码可用于推动稍后纯化(例如组氨酸标签)或辅助标记融合蛋白的短蛋白质序列的DNA可以包括在编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的多核苷酸的内部或末端。

在本发明的又一个方面,提供包含本发明的核酸的宿主细胞。在某些实施方案中,提供包含本发明的一种或多种载体的宿主细胞。多核苷酸和载体分别可单一地或组合地并入本文中关于多核苷酸和载体描述的任何特征。在一个方面,宿主细胞包含(例如已经转化或转染)包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子(的一部分)的多核苷酸的载体。如本文中使用的,术语“宿主细胞”指可以工程化改造以生成本发明的融合蛋白或其片段的任何种类的细胞***。适合于复制和支持抗原结合分子表达的宿主细胞是本领域公知的。可以用特定的表达载体适当地转染或转导此类细胞,并且可以培养大量的含有载体的细胞供接种大规模发酵罐以获得足够数量的抗原结合分子供临床应用。合适的宿主细胞包括原核微生物,诸如大肠杆菌,或各种真核细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,昆虫细胞,等等。例如,特别是在不需要糖基化时,可以在细菌中生成多肽。表达后,多肽可以在可溶性级分中自细菌细胞糊分离且可以进一步纯化。在原核生物以外,真核微生物诸如丝状真菌或酵母对于编码多肽的载体是合适的克隆或表达宿主,包括其糖基化途径已经“人源化”,导致生成具有部分或完全人糖基化样式的多肽的真菌和酵母株。参见Gerngross,Nat Biotech 22,1409-1414(2004),和Li et al.,Nat Biotech 24,210-215(2006)。

对于表达(糖基化)多肽合适的宿主细胞也源自多细胞生物体(无脊椎动物和脊椎动物)。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了可以与昆虫细胞联合使用,特别是用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞的众多杆状病毒株。植物细胞培养物也可用作宿主。参见例如美国专利No.5,959,177,6,040,498,6,420,548,7,125,978,和6,417,429(描述用于在转基因植物中生成抗体的PLANTIBODIES^TM技术)。脊椎动物细胞也可用作宿主。例如,适应在悬浮液中生长的哺乳动物细胞系可能是有用的。有用的哺乳动物宿主细胞系的其它例子是经SV40转化的猴肾CV1系(COS-7),人胚肾细胞系(例如Graham et al.,J Gen Virol 36,59(1977)中描述的293或293T细胞),幼仓鼠肾细胞(BHK),小鼠塞托利(Sertoli)细胞(如例如Mather,Biol Reprod 23,243-251(1980)中描述的TM4细胞),猴肾细胞(CV1),非洲绿猴肾细胞(VERO-76),人***细胞(HELA),犬肾细胞(MDCK),牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A),人肺细胞(W138),人肝细胞(Hep G2),小鼠***肿瘤细胞(MMT 060562),TRI细胞(如例如Mather et al.,Annals N.Y.Acad Sci 383,44-68(1982)中描述的),MRC 5细胞,和FS4细胞。其它有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,包括dhfr-CHO细胞(Urlaub et al.,Proc Natl Acad Sci USA 77,4216(1980))；和骨髓瘤细胞系诸如YO,NS0,P3X63和Sp2/0。关于适合于蛋白质生成的某些哺乳动物宿主细胞系的综述,参见例如Yazaki and Wu,Methods in Molecular Biology,Vol.248(B.K.C.Lo,ed.,Humana Press,Totowa,NJ),pp.255-268(2003)。

宿主细胞包括培养的细胞,例如培养的哺乳动物细胞,酵母细胞,昆虫细胞,细菌细胞和植物细胞,在此仅列举少数,但是还有转基因动物,转基因植物或培养的植物或动物组织内包含的细胞。在一个方面,宿主细胞是真核细胞,优选哺乳动物细胞,诸如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞,人胚肾(HEK)细胞或淋巴样细胞(例如Y0,NS0,Sp20细胞)。

在一个方面,提供一种生成本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的方法,其中该方法包含在适于本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段表达的条件下培养如本文中提供的包含编码本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段的核酸的宿主细胞,和自宿主细胞(或宿主细胞培养液)回收本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其多肽片段。

如本文中所述制备的本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子可通过本领域已知的技术来纯化,诸如高效液体层析术,离子交换层析术,凝胶电泳,亲和层析术,大小排阻层析术,等等。用于纯化特定蛋白质的实际条件会部分取决于诸如净电荷,疏水性,亲水性等因素,而且对于本领域技术人员会是显而易见的。对于亲和层析术纯化,可使用含有TNF配体三聚体的抗原结合分子结合的抗体,配体,受体或抗原。例如,对于本发明的融合蛋白的亲和层析术纯化,可使用具有蛋白A或蛋白G的基质。可以本质上如实施例中所述使用顺序蛋白A或G亲和层析术和大小排阻层析术来分离抗原结合分子。含有TNF配体三聚体的抗原结合分子或其片段的纯度可通过多种公知的分析方法任一来测定,包括凝胶电泳,高压液体层析术,等等。例如,如实施例中所述表达的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子显示是完整的且正确装配的,如通过还原性和非还原性SDS-PAGE证明的。

测定法

本文中提供的抗原结合分子可通过本领域已知的多种测定法来鉴定,筛选,或表征其物理/化学特性和/或生物学活性。生物学活性可包括例如增强不同免疫细胞,尤其是T细胞的活化和/或增殖的能力。例如,它们增强免疫调控性细胞因子(例如干扰素-伽马(IFN-γ)和/或肿瘤坏死因子阿尔法(TNFα))的分泌。增强的或能增强的其它免疫调控性细胞因子是例如IL12,粒酶B等。生物学活性还可包括食蟹猴结合交叉反应性,以及对不同细胞类型的结合。还提供在体内和/或在体外具有此类生物学活性的抗原结合分子。

1.亲和力测定法

本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的TNF受体的亲和力可依照实施例中提出的方法通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对FAP或CD19的亲和力也可以通过表面等离振子共振(SPR),使用标准仪器诸如BIAcore仪器(GE Healthcare),和受体或靶蛋白(诸如可通过重组表达获得的)来测定。用于测量结合亲和力的一种具体的说明性和例示性实施方案在实施例4中描述。依照一个方面,于25℃使用

T100机器(GE Healthcare)通过表面等离振子共振测量K_d。

2.结合测定法和其它测定法

本文中提供的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的表达受体的细胞的结合可例如通过流式细胞术(FACS),使用表达特定受体或靶抗原的细胞系来评估。在一个方面,在结合测定法中使用表达TNF受体的新鲜外周血单个核细胞(PBMC)。在分离后(幼稚PMBC)或刺激后(活化的PMBC)直接使用这些细胞。在另一个方面,使用活化的小鼠脾细胞(表达TNF受体分子)来证明本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子对相应的表达TNF受体的细胞的结合。

在又一个方面,使用表达FAP或CD19的细胞系来证明抗原结合分子对此靶细胞抗原的结合。

在另一个方面,可以使用竞争测定法来鉴定与特定抗体或抗原结合分子分别竞争结合靶或TNF受体的抗原结合分子。在某些实施方案中,此类竞争性抗原结合分子结合的表位(例如线性或构象表位)与特定抗靶抗体或特定抗TNF受体抗体结合的相同。用于抗体结合的表位的作图的详细例示性方法在Morris(1996)“Epitope Mapping Protocols”,inMethods in Molecular Biology vol.66(Humana Press,Totowa,NJ)中提供。

3.活性测定法

在一个方面,提供用于鉴定具有生物学活性的结合特定靶细胞抗原和特定TNF受体的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的测定法。生物学活性可包括例如经由表达靶细胞抗原的细胞上的TNF受体的激动性信号传导。还提供通过该测定法鉴定为在体外具有此类生物学活性的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

在某些方面,对本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子测试此类生物学活性。用于检测本发明的分子的生物学活性的测定法的例子是实施例4和5中描述的那些。生物学活性可例如通过评估它们对多种淋巴细胞子集诸如NK细胞,NKT细胞或γδT细胞的存活,增殖和淋巴因子分泌的影响或评估它们调控抗原呈递细胞诸如树突细胞,单核细胞/巨噬细胞或B细胞的表型和功能的能力来评估。

药用组合物,配制剂和施用路径

在又一个方面,本发明提供药用组合物,其包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,例如供任何下述治疗方法中使用。在一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种药学可接受赋形剂。在另一个实施方案中,药用组合物包含本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和至少一种例如如下文描述的另外的治疗剂。

本发明的药用组合物包含溶解或分散在药学可接受赋形剂中的治疗有效量的一种或多种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。短语“药用或药学可接受”指在采用的剂量和浓度一般对接受者无毒,即在适当施用于动物,诸如例如人时不产生不利的,变应性的或其它不想要的反应的分子实体和组合物。含有至少一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和任选地另外的活性组分的药用组合物的制备会是本领域技术人员根据本公开内容知道的,如由Remington's Pharmaceutical Sciences,18^th Ed.Mack PrintingCompany,1990例示的,通过援引收入本文。特别地,组合物是冻干配制剂或水溶液。如本文中使用的,“药学可接受赋形剂”包括任何和所有溶剂,缓冲剂,分散介质,包衣,表面活性剂,抗氧化剂,防腐剂(例如抗细菌剂,抗真菌剂),等张剂,盐,稳定剂和其组合,正如本领域普通技术人员会知道的。

胃肠外组合物包括那些为通过注射,例如皮下,皮内,损害内,静脉内,动脉内,肌肉内,鞘内或腹膜内注射的施用而设计的。对于注射,可以在水溶液中,优选在生理学相容缓冲液诸如汉克斯(Hanks)氏溶液,林格(Ringer)氏溶液,或生理盐水缓冲液中配制本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。溶液可含有配制用剂,诸如悬浮,稳定和/或分散剂。或者,融合蛋白可处于粉末形式,供在使用前用合适的媒介,例如无菌无热原水建构。根据需要,通过与下文列举的多种其它组分一起以要求的量在适宜的溶剂中掺入本发明的融合蛋白来制备无菌可注射溶液。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。一般地,通过将多种经过灭菌的活性组分掺入含有基础分散介质和/或其它组分的无菌媒介中来制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液,悬浮液或乳状液的无菌粉末的情况中,优选的制备方法是真空干燥或冷冻干燥技术,其自其先前无菌过滤的液体介质产生活性组分加任何另外的想要的组分的粉末。液体介质在必要时应当适当缓冲且在注射前首先用足够的盐水或葡萄糖使得液体稀释剂变成等张。组合物在制造和贮存条件下必须是稳定的,而且针对微生物,诸如细菌和真菌的污染作用防腐。会领会的是,内毒素污染应当最低限度保持在安全水平,例如小于0.5ng/mg蛋白质。合适的药学可接受赋形剂包括但不限于:缓冲剂,诸如磷酸盐,柠檬酸盐,和其它有机酸；抗氧化剂,包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化六甲双铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；酚,丁或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯,诸如对羟基苯甲酸甲或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质,诸如血清清蛋白,明胶,或免疫球蛋白；亲水性聚合物,诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸,诸如甘氨酸,谷氨酰胺,天冬酰胺,组氨酸,精氨酸,或赖氨酸；单糖,二糖,和其它碳水化合物,包括葡萄糖,甘露糖,或糊精；螯合剂,诸如EDTA；糖,诸如蔗糖,甘露醇,海藻糖或山梨醇；成盐反荷离子,诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子型表面活性剂,诸如聚乙二醇(PEG)。水性注射悬浮液可含有提高悬浮液的粘度的化合物,诸如羧甲基纤维素钠,山梨醇,右旋糖酐,等等。任选地,悬浮液还可含有合适的稳定剂或提高化合物的溶解度以容许制备高度浓缩溶液的药剂。另外,活性化合物的悬浮液可制备为适宜的油性注射悬浮液。合适的亲脂性溶剂或媒介包括脂肪油诸如芝麻油,或合成脂肪酸酯,诸如油酸乙酯或甘油三酯,或脂质体。

可以将活性组分包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊),在胶体药物投递***(例如脂质体,清蛋白微球体,微乳液,纳米颗粒和纳米胶囊)中或在粗乳液中。此类技术在Remington's Pharmaceutical Sciences(18th Ed.Mack Printing Company,1990)中公开。可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有多肽的固体疏水性聚合物的半透性基质,所述基质处于成形物品的形式,例如薄膜,或微胶囊。在特定实施方案中,通过在组合物中使用延迟吸收的药剂,诸如例如单硬脂酸铝,明胶或其组合,可带来延长的可注射组合物的吸收。

本文中的例示性药学可接受赋形剂进一步包括间质药物分散剂,诸如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP),例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白,诸如rHuPH20(

Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP和使用方法(包括rHuPH20)在美国专利公开文本No.2005/0260186和2006/0104968中描述。在一个方面,将sHASEGP与一种或多种另外的糖胺聚糖酶诸如软骨素酶组合。

例示性冻干抗体配制剂在美国专利No.6,267,958中描述。水性抗体配制剂包括美国专利No.6,171,586和WO 2006/044908中描述的那些,后者的配制剂包括组氨酸-乙酸盐缓冲剂。

在先前描述的组合物以外,融合蛋白还可配制成贮库制剂。此类长效配制剂可通过植入(例如皮下或肌肉内)或通过肌肉内注射来施用。如此,例如,融合蛋白可以用合适的聚合或疏水性材料(例如作为可接受油中的乳液)或离子交换树脂,或作为微溶衍生物,例如作为微溶盐配制。

包含本发明的融合蛋白的药用组合物可依靠常规混合,溶解,乳化,封装,包埋或冻干工艺来制造。可以使用推动将蛋白质加工成药学上可使用的制剂的一种或多种生理学可接受载剂,稀释剂,赋形剂或助剂以常规方式配制药用组合物。适当的配制剂取决于所选择的施用路径。

可以以游离酸或碱,中性或盐形式将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子配制成组合物。药学可接受盐是实质性保留游离酸或碱的生物学活性的盐。这些包括酸加成盐,例如那些与蛋白质性质组合物的游离氨基形成的或那些与无机酸诸如例如盐酸或磷酸,或有机酸诸如乙酸,草酸,酒石酸或扁桃酸形成的。与游离羧基形成的盐也可以衍生自无机碱,诸如例如氢氧化钠,钾,铵,钙或铁；或有机碱,诸如异丙胺,三甲胺,组氨酸或普鲁卡因。与相应的游离碱形式相比,药用盐趋于在水性和其它质子溶剂中溶解度更高。

在所治疗的特定适应症需要时,本文中的组合物还可含有超过一种活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。此类活性组分以对于预定目的有效的量适当地组合存在。

要用于体内施用的配制剂一般是无菌的。无菌性可例如通过穿过无菌滤膜过滤而容易地实现。

治疗方法和组合物

本文中提供的任何含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子均可在治疗方法中使用。

为了在治疗方法中使用,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以以符合优秀医学实践的方式配制,定剂量和施用。在这种背景中考虑的因素包括所治疗的特定病症,所治疗的特定哺乳动物,患者个体的临床状况,病症的起因,药剂的投递部位,施用方法,施用进度表,和医学从业人员知道的其它因素。

在一个方面,提供供作为药物使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在别的方面,提供供在治疗疾病中使用,特别是供在治疗癌症中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面,提供供在治疗方法中使用的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面,本发明提供供在有所需要的个体中治疗疾病中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在某些方面,本发明提供供在治疗具有疾病的个体的方法中使用的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,该方法包含对该个体施用治疗有效量的融合蛋白。在某些方面,要治疗的疾病是癌症。癌症的例子包括实体瘤,膀胱癌,肾细胞癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,***,子宫内膜癌,食管癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,***癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌,黑素瘤,B细胞淋巴瘤,B细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤和急性成淋巴细胞性白血病。如此,提供供在治疗癌症中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。需要治疗的受试者,患者,或“个体”典型地是哺乳动物,更具体地是人。

在另一个方面,提供的是供在治疗感染性疾病,特别是供治疗病毒感染中使用的如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

在又一个方面,本发明涉及含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于在有所需要的个体中治疗疾病的药物中的用途。在一个方面,该药物供在治疗疾病的方法中使用,该方法包含对具有该疾病的个体施用治疗有效量的该药物。在某些实施方案中,要治疗的疾病是增殖性病症,特别是癌症。如此,在一个方面,本发明涉及本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗癌症的药物中的用途。癌症的例子包括实体瘤,膀胱癌,肾细胞癌,脑癌,头和颈癌,胰腺癌,肺癌,乳腺癌,卵巢癌,子宫癌,***,子宫内膜癌,食管癌,结肠癌,结肠直肠癌,直肠癌,胃癌,***癌,血癌,皮肤癌,鳞状细胞癌,骨癌,和肾癌,黑素瘤,B细胞淋巴瘤,B细胞白血病,非霍奇金淋巴瘤和急性成淋巴细胞性白血病。使用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以治疗的其它细胞增殖病症包括但不限于位于腹部,骨,乳腺,消化***,肝,胰腺,腹膜,内分泌腺(肾上腺,甲状旁腺,垂体,睾丸,卵巢,胸腺,甲状腺),眼,头和颈,神经***(中枢和周围),淋巴***,骨盆,皮肤,软组织,脾,胸区,和泌尿生殖***中的赘生物。还包括的是癌前状况或损害和癌症转移。在某些实施方案中,癌症选自由肾细胞癌,皮肤癌,肺癌,结肠直肠癌,乳腺癌,脑癌,头和颈癌组成的组。技术人员可认识到在一些情况中含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可能不提供治愈但可能仅提供部分益处。在一些方面,具有一些益处的生理变化也认为是治疗上有益的。如此,在一些方面,提供生理变化的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的量认为是“有效量”或“治疗有效量”。

在又一个方面,本发明涉及如本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子在制造或制备用于治疗感染性疾病,特别是用于治疗病毒感染或用于治疗自身免疫疾病,例如狼疮疾病的药物中的用途。

在又一个方面,本发明提供一种用于在个体中治疗疾病的方法,该方法包含对所述个体施用治疗有效量的本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。在一个方面,对所述个体施用包含处于药学可接受形式的本发明的融合蛋白的组合物。在某些方面,要治疗的疾病是增殖性病症。在一个特定方面,该疾病是癌症。在另一个方面,该疾病是感染性疾病或自身免疫疾病。在某些方面,该方法进一步包含对该个体施用治疗有效量的至少一种另外的治疗剂,例如抗癌剂,如果要治疗的疾病是癌症的话。依照任何上述实施方案的“个体”可以是哺乳动物,优选人。

为了预防或治疗疾病,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的适宜剂量(当单独或与一种或多种其它另外的治疗剂组合使用时)会取决于要治疗的疾病的类型,施用路径,患者的体重,抗原结合分子的类型,疾病的严重程度和过程,施用融合蛋白是出于预防还是治疗目的,先前或并行的治疗性干预,患者的临床史和对融合蛋白的响应,和主治医师的斟酌。在任何情况下,负责施用的从业人员会决定组合物中活性组分的浓度和对于受试者个体适宜的剂量。本文中涵盖各种剂量给药进度表,包括但不限于在多个时间点上的多次或单次施用,推注施用,和脉冲输注。

以一次或以一系列治疗适当地将含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子施用于患者。取决于疾病的类型和严重程度,约1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以是用于对患者施用的初始候选剂量,例如无论是通过一次或多次分开的施用,还是通过连续输注。取决于上面提到的因素,一种典型的日剂量可能范围为约1μg/kg至100mg/kg或更多。对于数天或更长的反复施用,取决于状况,治疗一般会持续直至发生想要的疾病症状的遏制。融合蛋白的一种例示性剂量会在约0.005mg/kg至约10mg/kg的范围中。在其它例子中,剂量还可以包含每次施用自约1μg/kg体重,约5μg/kg体重,约10μg/kg体重,约50μg/kg体重,约100μg/kg体重,约200μg/kg体重,约350μg/kg体重,约500μg/kg体重,约1mg/kg体重,约5mg/kg体重,约10mg/kg体重,约50mg/kg体重,约100mg/kg体重,约200mg/kg体重,约350mg/kg体重,约500mg/kg体重,至约1000mg/kg体重或更多,和其中可派生的任何范围。在自本文中列出的数字可派生的范围的例子中,基于上文描述的数字,可以施用约5mg/kg体重至约100mg/kg体重,约5μg/kg体重至约500mg/kg体重等范围。如此,可以将约0.5mg/kg,2.0mg/kg,5.0mg/kg或10mg/kg(或其任何组合)的一或多剂施用于患者。此类剂量可以间歇施用,例如每周或每三周(例如,使得患者接受约2剂至约20剂,或例如约6剂融合蛋白)。可以施用一个初始的较高加载剂量,接着是一个或多个较低剂量。然而,其它剂量方案可能是有用的。这种疗法的进展容易通过常规技术和测定法来监测。

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子一般会以有效实现预定目的的量使用。对于治疗或预防疾病状况的用途,以治疗有效量施用或应用本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或其药用组合物。治疗有效量的确定完全在本领域技术人员的能力内,尤其是根据本文中提供的详细公开内容。

对于***施用,可以首先自体外测定法,诸如细胞培养物测定法估算治疗有效剂量。然后可以在动物模型中确定实现包括如在细胞培养物中确定的IC₅₀的循环浓度范围的剂量。此类信息可以用于更精确地确定在人中有用的剂量。

也可以使用本领域公知的技术自体内数据(例如动物模型)估算初始剂量。本领域普通技术人员能容易地基于动物数据优化对人的施用。

可以个别地调整剂量和间隔以提供足以维持治疗效果的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的血浆水平。通过注射施用的常用患者剂量范围为约0.1至50mg/kg/天,典型地是约0.5至1mg/kg/天。治疗有效血浆水平可以通过每天施用多剂来实现。血浆中的水平可以例如通过HPLC来测量。

在局部施用或选择性摄取的情况中,含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的有效局部浓度可能与血浆浓度无关。本领域技术人员会能够优化治疗有效局部剂量而无需过度实验。

本文中描述的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的治疗有效剂量一般会提供治疗益处而不引起实质性毒性。融合蛋白的毒性和治疗功效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学规程来确定。可使用细胞培养物测定法和动物研究来确定LD₅₀(对群体的50％致死的剂量)和ED₅₀(在群体的50％中治疗上有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数,它可以表述为比率LD₅₀/ED₅₀。展现较大治疗指数的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子是优选的。在一个实施方案中,依照本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子展现高治疗指数。自细胞培养物测定法和动物研究获得的数据可以在配制适合于在人中使用的剂量范围中使用。剂量优选在具有很小或没有毒性的包括ED₅₀的循环浓度范围内。剂量可以在这个范围内取决于多种因素而变化,例如所采用的剂型,所利用的施用路径,受试者的状况,等等。考虑到患者的状况,确切的配制剂,施用路径和剂量可以由医师个体选择(参见例如Fingl et al.,1975,in:The Pharmacological Basis ofTherapeutics,Ch.1,p.1,通过援引完整收入本文)。

用本发明的融合蛋白治疗的患者的主治医师会知道如何和何时由于毒性,器官功能障碍,等等而终止,中断,或调整施用。相反,如果临床反应不足(排除毒性),主治医师也会知道将治疗调整至更高水平。在感兴趣的病症的管理中施用的剂量的大小会随着要治疗的状况的严重程度,施用路径,等等而变化。状况的严重程度可以例如部分地通过标准预后评估方法来评估。而且,剂量和可能剂量频率也会依照患者个体的年龄,体重,和响应而变化。

其它药剂和治疗

本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子可以在疗法中与一种或多种其它药剂组合施用。例如,本发明的融合蛋白可以与至少一种另外的治疗剂共施用。术语“治疗剂”涵盖可以为了在需要此类治疗的个体中治疗症状或疾病而施用的任何药剂。此类另外的治疗剂可包含任何适合于所治疗的特定适应症的活性组分,优选那些具有彼此没有不利影响的互补活性的。在某些实施方案中,另外的治疗剂是另一种抗癌剂。

此类其它药剂以对于预定目的有效的量适当地组合存在。此类其它药剂的有效量取决于所使用的融合蛋白的量,病症或治疗的类型,和上文讨论的其它因素。含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子一般以与本文中所述相同的剂量和施用路径,或本文中描述的剂量的约1至99％,或以凭经验/在临床上确定为适宜的任何剂量和任何路径使用。

上述提到的此类组合疗法涵盖组合施用(其中两种或更多种治疗剂包括在同一组合物或分开的组合物中)和分开施用,在该情况中,本发明的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的施用可以在另外的治疗剂和/或佐剂的施用之前,同时,和/或之后发生。

制品

在本发明的另一个方面,提供一种制品,其含有对于治疗,预防和/或诊断上文描述的病症有用的材料。制品包含容器和在容器上或与容器联合的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶,管形瓶,注射器,IV溶液袋,等。容器可以自多种材料诸如玻璃或塑料形成。容器装有本身或与另一种组合物组合有效治疗,预防和/或诊断状况的组合物且可具有无菌存取口(例如,容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的管形瓶或静脉内溶液袋)。组合物中的至少一种活性剂是本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子。

标签或包装插页指示组合物用于治疗选择的状况。此外,制品可包含(a)其中装有组合物的第一容器,其中该组合物包含本发明的含有TNF配体三聚体的抗原结合分子；和(b)其中装有组合物的第二容器,其中该组合物包含别的细胞毒性或其它方面的治疗剂。本发明的这个实施方案中的制品可进一步包含指示组合物可用于治疗特定状况的包装插页。

或者/另外,制品可进一步包含第二(或第三)容器,其包含药学可接受缓冲剂,诸如抑菌性注射用水(BWFI),磷酸盐缓冲盐水,林格(Ringer)氏溶液和右旋糖溶液。它可进一步包括从商业和用户立场看想要的其它材料,包括其它缓冲剂,稀释剂,滤器,针,和注射器。

表B(序列)

关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th ed.,Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中给出。抗体链的氨基酸依照如上文定义的依照Kabat的EU编号***(Kabat,E.A.,et al.,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,5th ed.,Public Health Service,National Institutesof Health,Bethesda,MD(1991))进行编号和提及。

下述编号段落(段)描述本发明的各方面:

1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,且

2.段1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域且抗原结合域的第二部分包含抗体轻链可变域或反之。

3.段1或2的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。

4.段1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分和抗原结合域的第二部分通过二硫键彼此共价联合。

5.段1至4任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其(C端)片段和抗体CH2域或其(N端)片段。

6.段1至5任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。

7.段1至6任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。

8.段1至7任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中依照节入穴方法第一融合多肽的间隔物域包含穴和第二融合多肽的间隔物域包含节。

9.段1至8任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和IgG1 Fc域。

10.段1至9任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

11.段1至10任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中TNF配体家族成员是4-1BBL。

12.段1至11任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中TNF配体家族成员外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

13.段1至12任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域能够特异性结合肿瘤相关抗原。

14.段1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)或CD19。

15.段1至14任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

16.段1至15任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

(a)包含与SEQ ID NO:21的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP),和包含与SEQ IDNO:22的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP),或

(b)包含与SEQ ID NO:23的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HFAP),和包含与SEQ ID NO:24的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LFAP)。

17.段1至14任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合CD19的抗原结合域包含

18.段1至15任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

(a)包含与SEQ ID NO:37的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19),和包含与SEQ ID NO:38的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19),或

(b)包含与SEQ ID NO:39的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的重链可变区(V_HCD19),和包含与SEQ ID NO:40的氨基酸序列至少约95％,96％,97％,98％,99％或100％同一的氨基酸序列的轻链可变区(V_LCD19)。

19.段1至18任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中第一,第二,第三和第四肽接头是存在的且由选自由SEQ ID NO:41,SEQ ID NO:42,SEQ ID NO:43,SEQID NO:44,SEQ ID NO:45,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:47,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:49,SEQID NO:50,SEQ ID NO:51,SEQ ID NO:52,SEQ ID NO:53,SEQ ID NO:54,SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56组成的组的氨基酸序列组成。

20.分离的核酸,其编码段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

21.一种宿主细胞,其包含段20的核酸。

22.一种生成含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子的方法,其包含在适合于含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子表达的条件下培养段21的宿主细胞。

23.段22的方法,其进一步包含自宿主细胞回收含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

24.一种药学组合物,其包含段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和药学可接受赋形剂。

25.段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物,其用作药物。

26.段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物,其用于治疗癌症。

27.段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

28.段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物在制造用于刺激免疫应答的药物中的用途。

29.一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对个体施用有效量的段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物。

30.段29的方法,其进一步包含将另外的治疗剂施用于个体。

31.一种在具有癌症的个体中刺激免疫应答的方法,其包含对个体施用有效量的段1至19任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或段24的药学组合物。

实施例

下面是本发明的方法和组合物的实施例。理解的是,鉴于上文提供的一般性描述,可以实践各种其它实施方案。

重组DNA技术

使用标准方法来操作DNA,如Sambrook et al.,Molecular cloning:Alaboratory manual；Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NewYork,1989中描述的。依照制造商的说明书使用分子生物学试剂。关于人免疫球蛋白轻和重链的核苷酸序列的一般信息在Kabat,E.A.et al.,(1991)Sequences of Proteins ofImmunological Interest,Fifth Ed.,NIH Publication No91-3242中给出。

DNA测序

通过双链测序测定DNA序列。

基因和寡核苷酸合成

在Geneart AG(Regensburg,Germany)通过自动化基因合成自合成的寡核苷酸通过化学合成制备期望的基因区段。将合成的基因片段克隆入大肠杆菌质粒进行繁殖/扩增。通过DNA测序来检验亚克隆的基因片段的DNA序列。或者,通过化学合成的寡核苷酸的退火或经由PCR来组装短合成DNA片段。由metabion GmbH(Planegg-Martinsried,Germany)制备各自寡核苷酸。

细胞培养技术

使用标准细胞培养技术,如Current Protocols in Cell Biology(2000),Bonifacino,J.S.,Dasso,M.,Harford,J.B.,Lippincott-Schwartz,J.and Yamada,K.M.(eds.),John Wiley&Sons,Inc.中描述的。

试剂

如果没有另外说明的话,依照制造商的方案以提供的那样使用所有商品化化学药品,抗体和试剂盒。

实施例1

含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(4-1BBL Contorsbody)的生成

1.1用于含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(4-1BBL Contorsbody)的表达质粒的构建

为了表达如本文中报告的含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子,使用包含下面的功能元件的转录单元:

-包括内含子A的来自人巨细胞病毒(P-CMV)的立即早期增强子和启动子,

-人重链免疫球蛋白5’-非翻译区(5’UTR),

-鼠免疫球蛋白重链信号序列,

-编码相应环状融合多肽的核酸,和

-牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH pA)。

在包括要表达的期望基因的表达单元/盒以外,基本/标准哺乳动物表达质粒含有

-容许这种质粒在大肠杆菌中复制的来自载体pUC18的复制起点,和

-在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性的β-内酰胺酶基因。

1.2含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(4-1BBL Contorsbody)的表达

用293-free转染试剂(Novagen)在适应悬浮的HEK293F(FreeStyle 293-F细胞；Invitrogen)细胞中实施含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的瞬时表达。

在融化之后在125ml摇瓶中通过稀释将细胞传代至少四次(体积30ml)(于37℃,7％CO₂,85％湿度,135rpm温育/摇动)。在250ml体积中将细胞扩充至3x10⁵个细胞/ml。三天后,分拆细胞并在1升摇瓶中在250ml体积中以7x10⁵个细胞/ml的密度重新接种。转染会在24小时后,以1.4-2.0x 10⁶个细胞/ml左右的细胞密度。

在转染之前在10ml的终体积中稀释250μg质粒DNA,与预热(水浴；37℃)的Opti-MEM(Gibco)一起。温和混合溶液并于室温温育不超过5分钟。然后将333.3μl 293-free转染试剂添加至DNA-OptiMEM溶液。之后温和混合溶液并于室温温育15-20分钟。将整个体积的混合物添加至1L摇瓶,具有250ml HEK细胞培养体积。

于37℃,7％CO₂,85％湿度,135rpm温育/摇动6或7天。

通过第一离心步骤(2,000rpm,4℃,10分钟)收获上清液。然后将上清液转移入新的离心烧瓶进行第二离心(4,000rpm,4℃,20分钟)。之后将无细胞上清液过滤穿过0.22μm瓶顶滤器并保存在冰箱中(-20℃)。

1.3含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(4-1BBL Contorsbody)的纯化

将含有抗原结合分子的培养物上清液过滤并通过两个层析步骤来纯化。使用用PBS(1mM KH₂PO₄,10mM Na₂HPO₄,137mM NaCl,2.7mM KCl),pH7.4平衡的HiTrapMabSelectSuRe(GE Healthcare)通过亲和层析捕捉抗体。通过用平衡缓冲液清洗来去除未结合的蛋白质,并用50mM柠檬酸盐缓冲液,pH 2.8回收抗原结合分子,并在洗脱之后立即用1M Tris碱,pH 9.0中和至pH6.0。使用Superdex 200^TM(GE Healthcare)上的大小排阻层析作为第二纯化步骤。在20mM组氨酸缓冲液,0.14M NaCl,pH 6.0中实施大小排阻层析。用配备有Biomax-SK膜(Millipore,Billerica,MA)的Ultrafree-CL离心滤器单元将含有含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的溶液浓缩并保存于-80℃。

1.4含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(4-1BBL Contorsbody)的质谱分析

自Roche Diagnostics GmbH获得PNGase F(14.3U/μl；磷酸钠,EDTA和甘油中的溶液)。在消化之前自冻干物新鲜重建在IgG抗体的铰链区中特异性切割的蛋白酶。

用PNGase F进行的酶促去糖基化

用10mM磷酸钠缓冲液,pH 7.1将50μg抗原结合分子稀释至0.6mg/ml的终浓度,并用1μl PNGase F于37℃去糖基化16小时。

酶促切割

用200mM Tris缓冲液,pH 8.0将经过去糖基化的样品稀释至0.5mg/ml的终浓度,并随后用IgG特异性蛋白酶于37℃消化1小时。

ESI-QTOF质谱术

使用含2％甲酸(v/v)的40％乙腈通过Sephadex G25柱(Kronlab,5x250mm,TAC05/250G0-SR)上的HPLC将样品脱盐。经由配备有TriVersa NanoMate源(Advion)的maXis 4GUHR-QTOF MS***(Bruker Daltonik)上的ESI-QTOF MS测定总质量。用碘化钠(Waters ToFG2样品试剂盒2部分:700008892-1)实施校准。对于经过消化的抗原结合分子,于1000-4000m/z(ISCID:30eV)进行数据采集。评估原始质谱并转换成各个相对摩尔质量。为了显现结果,使用专有软件生成解卷积质谱。

实施例2

FAP靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(FAP-4-1BBLContorsbody)的制备

2.1 FAP(4B9)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA1199的制备

克隆包含两条融合多肽和轻链的抗原结合分子,如图1A中描绘的:

-第一融合多肽(自N至C端):4-1BBL(71-248),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,4-1BBL(71-248),(G4S)2连接头,4-1BBL(71-248),

-第二融合多肽(自N至C端):VH(FAP),CH1,IgG1铰链,Fc节,和轻链(自N至C端):VL(FAP)-Cκ。

已经依照国际专利申请公开号WO 2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。使用节入穴异二聚化技术,节链的CH3域中的S354C/T366W突变和穴链的CH3域中的相应Y349C/T366S/L368A/Y407V突变(Carter,J Immunol Methods 248,7-15(2001))。

表1显示FAP(4B9)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1199的氨基酸序列。

表1:P1AA1199的序列

2.2 FAP(4B9)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA1235的制备

克隆包含两条融合多肽和轻链的抗原结合分子,如图1B中描绘的:

-第一融合多肽(自N至C端):4-1BBL(71-248),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,(G4S)2连接头,4-1BBL(71-248),

-第二融合多肽(自N至C端):VH(FAP),CH1,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,4-1BBL(71-248),和轻链(自N至C端):VL(FAP)-Cκ。

表2显示FAP(4B9)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1235的氨基酸序列。

表2:P1AA1235的序列

2.3 FAP(4B9)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA1259的制备

克隆包含两条融合多肽和轻链的抗原结合分子,如图1C中描绘的:

-第一融合多肽(自N至C端):4-1BBL(71-248),(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc穴,GGGGSGGGGSSGGGGS(SEQ ID NO:44)连接头,4-1BBL(71-248),

表3显示FAP(4B9)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1259的氨基酸序列。

表3:P1AA1259的序列

2.4 FAP(4B9)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA9626的制备

克隆包含两条融合多肽的抗原结合分子,如图1D中描绘的:

-第二融合多肽(自N至C端):VH(FAP),CH1,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(FAP),Cκ。

表4显示FAP(4B9)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA9626的氨基酸序列。

表4:P1AA9626的序列

或者,第二融合多肽包含(自N至C端):VH(FAP),CH1,(G4S)2连接头,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,VL(FAP),Cκ。在表5中提供相应分子的序列。表5:具有另外的(G4S)2连接头的分子的序列

2.5纯化后分子的生化分析

表6汇总FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。

表6:FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的生化分析

构建物	MW[kD]	单体[％](SEC)	产率[mg/l]
				Contorsbody P1AA1199	155.3	88.0	4.8
Contorsbody P1AA1235	155.2	100	1.8
				Contorsbody P1AA1259	155.6	100	1.0
Contorsbody P1AA9626	191.0	100	4.3

2.6 FAP靶向性和非靶向性含有人4-1BB配体三聚体的对照分子的制备

作为阳性对照,使用如WO 2016/075278,实施例2.1.4中描述的构建物2.4。这种分子是含有CH-CL交换及带电荷残基的单价FAP(4B9)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。将编码与人CL域融合的二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆(Merchant,Zhu et al.,Nature Biotechnol.1998,16,677-681)。将含有一个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1-CH1域融合。在构建物2.4中,为了改善正确配对,在交叉的CH-CL中另外引入下述突变(带电荷变体)。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中,E123R和Q124K,在与人CH1融合的单体4-1BB配体中,K147E和K213E。

将编码对FAP特异性的结合物,克隆4B9的重和轻链可变区DNA序列与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。已经依照WO2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗FAP-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗FAP轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab的异二聚体(图1F)。通过用种系DP47替换FAP结合物相应制备非靶向性型式(图1E)。

表7:实验中使用的对照分子

实施例3

CD19靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc融合抗原结合分子(CD19-4-1BBLContorsbody)的制备

3.1 CD19(2B11)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA1233的制备

-第二融合多肽(自N至C端):VH(CD19),CH1,IgG1铰链,Fc节,(G4S)2连接头,4-1BBL(71-248),和轻链(自N至C端):VL(CD19)-Cκ。

表8显示CD19(4B9)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1233的氨基酸序列。

表8:P1AA1233的序列

3.2 CD19(2B11)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA1258的制备

表9显示CD19(2B11)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA1259的氨基酸序列。

表9:P1AA1258的序列

3.3 CD19(2B11)-4-1BB配体(71-248)Contorsbody P1AA0776的制备

-第二融合多肽(自N至C端):VH(CD19),CH1,IgG1铰链,Fc节,和轻链(自N至C端):VL(CD19)-Cκ。

表10显示CD19(2B11)-含有人4-1BB配体(71-248)三聚体的抗原结合分子P1AA10776的氨基酸序列。

表10:P1AA0776的序列

3.4纯化后分子的生化分析

表11汇总CD19(2B11)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的产率和最终单体含量。

表11:CD19(2B11)靶向性含有4-1BB配体三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子的生化分析

构建物	MW[kD]	单体[％](SEC)	产率[mg/l]
				Contorsbody P1AA1233	156.9	100	1.3
Contorsbody P1AA1258	157.3	100	2.2
				Contorsbody P1AA0776	157.0	93.9	3.1

3.5 CD19靶向性和非靶向性含有人4-1BB配体三聚体的对照分子的制备

作为阳性对照,使用如WO 2016/075278,实施例7.2.6中描述的构建物4.4。这种分子是含有CH-CL交换及带电荷残基的单价CD19(2B11)靶向性含有4-1BB配体(71-248)三聚体的Fc(kih)融合抗原结合分子。将编码与人CL域融合的二聚体4-1BB配体的多肽与节上的人IgG1重链CH2和CH3域同框亚克隆(Merchant,Zhu et al.,Nature Biotechnol.1998,16,677-681)。将含有一个4-1BB配体外域的多肽与人IgG1-CH1域融合。在构建物2.4中,为了改善正确配对,在交叉的CH-CL中另外引入下述突变(带电荷变体)。在与人CL融合的二聚体4-1BB配体中,E123R和Q124K,在与人CH1融合的单体4-1BB配体中,K147E和K213E。

将编码对CD19特异性的结合物,克隆8B8-2B11的重和轻链可变区DNA序列与穴的恒定重链或人IgG1的恒定轻链任一同框亚克隆。已经依照WO2012/130831中描述的方法在节和穴重链的恒定区中引入Pro329Gly,Leu234Ala和Leu235Ala突变以消除对Fc伽马受体的结合。二聚体配体-含有S354C/T366W突变的Fc节链,单体CH1融合物,靶向性抗CD19-含有Y349C/T366S/L368A/Y407V突变的Fc穴链和抗CD19轻链的组合容许生成包括装配好的三聚体4-1BB配体和FAP结合性Fab的异二聚体(图1F)。通过用种系DP47替换FAP结合物相应制备非靶向性型式(图1E)。

表12:实验中使用的对照分子

实施例4

本发明的FAP靶向性含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的功能特性

4.1表达人4-1BB和报告基因NFκB-萤光素酶的HeLa细胞

4-1BB对它的配体的激动性结合经由核因子κB(NFκB)的激活诱导下游信号传导并促进CD8 T细胞的存活和活性(Lee HW,Park SJ,Choi BK,Kim HH,Nam KO,Kwon BS.4-1BBpromotes the survival of CD8(⁺)T lymphocytes by increasing expression of Bcl-x(L)and Bfl-1.J Immunol 2002；169:4882-4888)。生成重组报告细胞系HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26以在它的表面上表达人4-1BB。另外,它包含在NFκB敏感性增强子区段控制下的萤光素酶基因,容许以快速且容易的方式监测4-1BB激活。4-1BB触发诱导NFκB的剂量依赖性激活,它在核中易位,在那里它在报告质粒的NFκB敏感性增强子上结合以提高萤光素酶蛋白质表达。萤光素酶催化萤光素氧化,产生发射光的氧化萤光素。这可以通过照度计来量化。

如此,作为生物活性的度量分析各种含有4-1BBL的分子在HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26报告细胞中诱导NFκB激活的能力。我们测试不同的FAP靶向性的基于4-1BBL抗原结合分子的分子的NFκB激活能力,与之前描述的构建物2.4和它的对照D(WO 2016/075278)比较。在介导超交联的FAP表达性细胞存在或缺失下将所有测试的FAP靶向性的基于4-1BBL抗原结合分子的分子以不同浓度与报告细胞系HeLa_hu4-1BB_NFκB_Luc克隆26细胞系一起温育。作为FAP表达性细胞,添加或是人骨髓瘤细胞系WM-266-4(ATCC CRL-1676)或是NIH/3T3-huFAP克隆19,一种经人成纤维细胞激活蛋白(huFAP)转染的小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3细胞系(ATCC CRL-1658)。

将贴壁HeLa_hu4-1BB_NFκB_Luc克隆26细胞以0.2x10⁵个细胞/孔的细胞密度在组织培养物处理的白色平底96孔板中在测定培养基(供应有10％FBS和1％GlutaMAX-I的DMEM培养基)中培养过夜。次日,在FAP表达性细胞WM-266-4或NIH/3T3-huFAP克隆19存在(以报告细胞系和FAP表达性细胞之间的1:5比率)或缺失下添加滴定的FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子(四种不同Contorsbody,构建物2.4和对照D)。

温育后,吸出测定上清液并用DPBS清洗板。使用萤光素酶100测定***和报告物裂解缓冲液(均来自Promega,目录号E4550和目录号E3971)依照制造商的说明书进行光发射的量化。简言之,通过添加50μL/孔1x裂解缓冲液将细胞于-20℃裂解过夜。将细胞于37℃融化20分钟,之后添加100μL/孔提供的萤光素酶测定试剂。立即用SpectraMax M5/M5e微量板读数仪(Molecular Devices,USA)量化光发射,使用500ms积分时间,没有任何滤光片以收集所有波长。通过HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26细胞的基础发光来修正发射的相对光单元(URL)并使用Prism4(GraphPad Software,USA)针对对数一抗浓度绘图。使用内置的S形剂量响应拟合曲线(四参数,强健拟合)。

在图2A至2C中显示对测试分子测量的活性,而在下文表13中提供相应的以nM计的测量EC₅₀值(顶部)和激活曲线的曲线下面积(底部)。

表13:以nM计的测量EC₅₀值(顶部)和激活曲线的曲线下面积(底部)。显示的是计算均值。

如图2A至2C中显示的,在人4-1BB表达性报告细胞系HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26中,所有FAP靶向性含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子(构建物2.4和Contorsbody)的存在诱导NFκB激活。经由FAP表达性细胞(WM-266-4或NIH/3T3-huFAP)的超交联以FAP依赖性方式提高所有分子的NFκB激活。在FAP表达性细胞缺失下(图2C),看到由FAP靶向性4-1BBL(构建物2.4和Contorsbody)诱导的基线活性,但是通过添加非靶向性4-1BBL(对照D)没有。这可以通过HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc克隆26报告细胞系的某种基线FAP表达来解释。在WM-266-4或NIH/3T3-huFAP细胞存在下,所有构建物显示浓度依赖性活性,在0.5-1nM左右达到激活曲线高台。在FAP表达性细胞存在下,EC₅₀值介于0.01至0.13nM之间(表13)。在不同FAP靶向性4-1BBL构建物之间观察不到显著差异,只有P1AA1199 Contorbody显示朝向更低EC₅₀和更低最大高台值的趋势。由于更低的EC₅₀值,这种高台中的差异没有以显著方式降低曲线下面积值(表13)。

4.2 FAP靶向性4-1BBL介导的亚最佳TCR触发的静息的人PBMC的共刺激和通过细胞表面FAP的高交联

实施例4.1中显示添加FAP⁺肿瘤细胞能强烈提高人4-1BB阳性报告细胞系中由FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子(构建物2.4和本申请的分子)通过提供4-1BB受体的强寡聚化诱导的NFκB活性。同样地,我们在NIH/3T3-huFAP克隆19细胞存在下对FAP靶向性4-1BBL(构建物2.4和本申请的分子)测试它们促进和提高静息的人PBMC细胞的亚最佳CD3刺激的能力。

人PBMC制备物含有(1)静息的4-1BB阴性CD4⁺和CD8⁺T细胞和(2)在它们的细胞表面上具有各种Fcγ受体分子的抗原呈递细胞,例如B细胞和单核细胞。人IgG1同种型的抗人CD3抗体能以它的Fc部分结合静息的4-1BB阴性CD4⁺和CD8⁺T细胞上存在的Fcγ受体分子并介导延长的CD3激活。这些T细胞然后在数小时内开始表达4-1BB。针对4-1BB的功能性激动性化合物能经由激活的CD8⁺和CD4⁺T细胞上存在的4-1BB受体发信号并支持TCR介导的刺激。

在经过照射的FAP⁺NIH/3T3-huFAP克隆19细胞和滴定的FAP靶向性4-1BBL分子存在下将静息的CFSE标记的人PBMC用亚最佳浓度的抗CD3抗体刺激5天。使用荧光标记的抗体和流式细胞术来监测对T细胞的影响,诸如增殖(CFSE稀释),CD25和4-1BB(CD137)。

于37℃使用细胞解离缓冲液(Invitrogen,目录号13151-014)收获小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3-huFAP克隆19细胞10分钟。将细胞用DPBS清洗一次。将经50戈瑞辐照(X射线辐照仪)NIH/3T3-huFAP克隆19细胞以0.2x10⁵个细胞/孔的密度在T细胞培养基中在无菌96孔圆底贴壁组织培养板(TPP,目录号92097)中在温箱(Hera Cell 150)中于37℃和5％CO₂培养过夜。对NIH/3T3-huFAP克隆19的X射线辐照防止稍后成纤维细胞细胞系过度生长超过人PBMC。

通过Ficoll密度离心分离人PBMC。以0.75x10⁵个细胞/孔的密度将细胞添加至每个孔。添加2nM终浓度的抗人CD3抗体(克隆V9,人IgG1)和指定浓度的FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子(四种不同Contorsbody,构建物2.4和对照D)。将细胞在温箱(Hera Cell 150)中于37℃和5％CO₂激活4天。

然后,将细胞在DPBS中用活/死可固定Aqua死细胞染料(Molecular Probes,目录号L34957)在黑暗中于4℃表面染色30分钟。用DPBS清洗细胞后,将细胞在黑暗中于4℃在供应有2％FBS和5mM EDTA(FACS缓冲液)和荧光染料缀合的抗体抗人CD4-BV421(克隆RPA-T4,BioLegend,目录号300532),CD8-APC-Cy7(克隆RPA-T8,BioLegend,目录号301016),CD25-APC(克隆BC96,BioLegend,目录号3302610)和CD137(4-1BB)-PerCP-Cy5.5(克隆4B4-1,BioLegend,目录号309814)的PBS中进一步温育30分钟。将细胞用DPBS清洗两次并用DPBS中的4％PFA固定染色。最后在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮板并使用偶联Cytomat的MACSQuant分析仪10(ThermoFisher)采集。使用FlowJo v10(FlowJo LLC,USA)和Prism4(GraphPad Software,USA)分析流式细胞仪数据。使用内置的S形剂量响应(四参数,强健拟合)拟合曲线。

在图3A和3B中作为CD8⁺T细胞(图3A)和CD4⁺T细胞群体(图3B)中阳性细胞的百分比显示由FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子引起的表面表达的低亲和力IL-2受体α链CD25的上调。对作为CD8⁺T细胞和CD4⁺T细胞群体中阳性细胞的百分比显示的细胞表面上4-1BB(CD137)的表达的影响分别在图3C和3D中显示。在下文表14中提供相应的以nM计的测量EC₅₀值(顶部)和激活曲线的曲线下面积(底部)。

表14:以nM计的测量EC₅₀值(顶部)和激活曲线的曲线下面积(底部)。显示的是计算均值。

如图3A和3B中显示的,用非靶向性4-1BBL抗原结合分子对照D(空心黑色菱形,点线)的共刺激并不挽救亚最佳TCR刺激的CD4和CD8 T细胞。NIH/3T3-huFAP克隆19细胞的存在对FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子(构建物2.4或Contorsbody P1AA1199)的超交联在人CD4和CD8 T细胞中强烈促进增强激活表型,作为升高的CD25和CD137(4-1BB)表达显示。然而,Contorsbody P1AA1199诱导CD4和CD8 T细胞上升高的CD25表达,具有更低的EC₅₀值。另一方面,Contorsbody P1AA1199展示CD8和CD4 T细胞上更低频率的4-1BB(CD137)表达(图3C和3D)。这可能反映与构建物2.4相比不同的T细胞激活动力学或效力。没有看见T细胞增殖的差异(未显示)。

4.3结果的汇总

可以证明,本发明的FAP靶向性4-1BBL抗原结合分子显示与先前描述的构建物2.4相似的激活潜力且因此是功能性的。P1AA1199显示在两种不同功能测定法中展示的略微不同的激活特性。在HeLa-hu4-1BB-NFκB-luc报告细胞系中P1AA1199展示(尤其在WM-266-4存在下)更低的剂量依赖性NFκB-萤光素酶激活的EC₅₀值(图2A)以及更低的最大高台激活。这两种差异仅仅是一种趋势且对激活曲线的总曲线下面积几乎没有影响(表13)。在使用静息的人PBMC的激活测定法中P1AA1199再次展示活性差异。与构建物2.4相比,如果是通过添加P1AA1199而诱导的话,CD4和CD8 T细胞上CD25表达的剂量依赖性升高显示更低的EC₅₀值。另一方面,与构建物2.4相比,如果是通过添加P1AA1199而诱导的话,CD4和CD8 T细胞上升高的4-1BB(CD137)表达在百分比上更低。差异可以通过不同活性潜力或不同T细胞激活动力学来解释。

实施例5

本发明的CD19靶向性含有4-1BBL三聚体的抗原结合分子的功能特性

5.1结合CD19的CD19-4-1BBL Contorsbody

在原代人B细胞上测量CD19-4-1BBL Contorsbody P1AA1233,P1AA1258和P1AA0776对CD19的结合特性。简言之,自来自健康供体的血沉棕黄层纯化总PBMC。将在DPBS(Gibco by Life Technologies,目录号14190 326)中重悬浮的细胞添加至圆底悬浮细胞96孔板(greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔。将细胞用200μL DPBS清洗一次。在100μL/孔4℃冷的含有1:5000稀释的可固定存活力染料eFluor 660(eBioscience,目录号65-0864-18)的DPBS缓冲液中重悬浮细胞并将板于4℃温育30分钟。将细胞用200μL/孔4℃冷DPBS缓冲液清洗一次并在含有一系列浓度的构建物(CD19-4-1BBL ContorsbodyP1AA1233,P1AA1258和P1AA0776)的50μL/孔4℃冷FACS缓冲液(供应有2％FBS,5mM EDTA pH8(Amresco,目录号E177)和7.5mM叠氮化钠(Sigma-Aldrich S2002)的DPBS)中重悬浮,继以于4℃温育1小时。对照是来自WO 2016/075278的构建物4.4(CD19-4-1BBL Ab)或对照D(非靶向性4-1BBL Ab,见实施例3.5)。广泛清洗后,将细胞进一步用50μL/孔4℃冷的含有5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG F(ab`)2片段特异性山羊F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch,目录号109 116 098),和APC-H7缀合的CD20 Ab(BD,目录号560734),和APC缀合的抗CD3 Ab(Biolegend,目录号300312),和/或FITC缀合的抗CD19 Ab(BD)的FACS缓冲液于4℃染色30分钟。将细胞用200μL/孔4℃FACS缓冲液清洗两次并在50μL/孔含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的DPBS中固定细胞。在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮细胞并使用FACS LSR II(BD Biosciences)采集。使用FlowJo V10(FlowJo,LLC)和GraphPadPrism 6.04(GraphPad Software,Inc)分析数据。

对CD3-CD20⁺活群体门控细胞,并将PE缀合的AffiniPure抗人IgG IgG Fcγ片段特异性山羊F(ab`)₂片段的荧光强度的几何均值针对构建物的滴定浓度绘图。如图4中显示的,所有Contorsbody以与CD19-4-1BBL Ab(构建物4.4)相似的样式以剂量依赖性方式结合人B细胞,而非靶向性-4-1BBL(对照D)不结合B细胞。这些数据指示CD19-4-1BBLContorsbody显示对CD19的特异性结合。

5.2 CD19-4-1BBL Contorsbody结合激活的T细胞和NK细胞上的4-1BB

为了检查CD19-4-1BBL Contorsbody P1AA1233,P1AA1258和P1AA0776对4-1BB表达性T细胞或NK细胞的结合,通过TCR刺激来预激活人PBMC以上调T细胞和NK细胞上的4-1BB达48小时。将纯化的PBMC稀释成2.8x10⁶/ml的浓度,在RPMI培养基(Gibco,目录号72400-054)加10％FBS(Gibco,目录号20012-068)和1％青霉素-链霉素(Gibco,目录号15070-063)和50μM 2-巯基乙醇(Gibco,目录号31350-010)中重悬浮。将90μl细胞添加至圆底96孔板(greiner bio-one,cellstar,目录号650185)的每个孔。然后将另外50μl抗CD3和抗CD28微珠(Life Technologies,目录号11131D)以8x10⁵粒珠/ml添加至孔。2天后,将细胞用冷PBS(Gibco,20012-068)清洗一次,用90μl冷PBS重悬浮,并与10μl含有CD19靶向性4-1BBL抗原结合分子(CD19-4-1BBL Contorsbody P1AA1233,P1AA1258和P1AA0776,构建物4.4,非靶向性对照D)的溶液一起于4℃温育1小时。广泛清洗后,将细胞进一步用50μL/孔冷FACS缓冲液含有5μg/mL PE缀合的AffiniPure抗人IgG F(ab`)₂片段特异性山羊F(ab`)2片段(JacksonImmunoResearch,目录号109 116 098),和另外用抗人CD3(Biolegend,目录号300312),CD4(Biolegend,目录号317434),CD8(Biolegend,目录号344710),CD56(Biolegend,目录号362504)抗体于4℃染色30分钟。将细胞用200μL/孔4℃冷FACS缓冲液清洗两次并在50μL/孔含有1％甲醛(Sigma,HT501320-9.5L)的DPBS中固定细胞。在100μL/孔FACS缓冲液中重悬浮细胞并使用FACS LSR II(BD Biosciences)采集。使用FlowJo V10(FlowJo,LLC)和GraphPad Prism 6.04(GraphPad Software,Inc)分析数据。

对CD4⁺和CD8⁺T细胞的纯群体,和CD56⁺NK细胞门控特异性结合。分别如在图5A,5B和5C中能看到的,CD19-4-1BBL Contorsbody显示以剂量依赖性方式对4-1BB表达性CD4⁺,CD8⁺T细胞和CD56⁺NK细胞的优异结合,与CD19-4-1BBL Ab(构建物4.4)的结合亲和力相似。

5.3CD19-4-1BBL Contorsbody显示生物学活性

为了测量生理学设置中的生物学活性,我们使用激活的人PBMC,通过用CD19-4-1BBL Contorsbody共刺激T细胞和NK细胞来检查效应器功能分子IFNγ的释放。简言之,以一系列浓度将用CD19-4-1BBL Contorsbody P1AA1233,P1AA1258和P1AA0776共刺激的纯化的PBMC添加至孔,并以8x10⁵粒珠/ml提供另外50μl抗CD3和抗CD28微珠(LifeTechnologies,目录号11131D)。温育48小时后,收集上清液用于通过ELISA测量IFN-γ(DuoSet人IFNg ELISA试剂盒,R&D Systems,目录号DY285)。图6显示CD19-4-1BBLContorsbody P1AA1233和P1AA1258均刺激PBMC以剂量依赖性方式以与由CD19-4-1BBL Ab(构建物4.4)诱导的相似的量生成IFNγ,而非靶向性4-1BBL构建物(阴性对照D)由于缺乏交联而不激活T或NK细胞。在那些中,构建物P1AA0776激活4-1BB⁺T细胞和NK细胞的效力较低。

序列表

<110> 豪夫迈·罗氏有限公司（F. Hoffmann-LA Roche AG）

<120> 新颖的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子

<130> P34511-WO

<150> EP17199593.9

<151> 2017-11-01

<160> 110

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 184

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 1

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

180

<210> 2

<211> 170

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 2

Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala

20 25 30

Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu

35 40 45

Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu

50 55 60

Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala

65 70 75 80

Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

85 90 95

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala

100 105 110

Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu

115 120 125

Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu

130 135 140

Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

145 150 155 160

Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

165 170

<210> 3

<211> 175

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 3

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

1 5 10 15

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

20 25 30

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

35 40 45

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

50 55 60

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

115 120 125

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

130 135 140

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

145 150 155 160

Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

165 170 175

<210> 4

<211> 203

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 4

Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser

1 5 10 15

Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly

20 25 30

Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn

35 40 45

Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu

50 55 60

Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys

65 70 75 80

Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu

85 90 95

Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu

100 105 110

Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

130 135 140

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg

145 150 155 160

Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln

165 170 175

Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu

180 185 190

Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200

<210> 5

<211> 178

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 5

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu

<210> 6

<211> 164

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 6

Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val

1 5 10 15

Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala

20 25 30

Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu

35 40 45

Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu

50 55 60

Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala

65 70 75 80

Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala

85 90 95

Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala

100 105 110

Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu

115 120 125

Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu

130 135 140

Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile

145 150 155 160

Pro Ala Gly Leu

<210> 7

<211> 169

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 7

Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu

1 5 10 15

Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser

20 25 30

Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys

35 40 45

Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val

50 55 60

Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly

65 70 75 80

Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly

85 90 95

Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu

100 105 110

Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser

115 120 125

Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg

130 135 140

His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg

145 150 155 160

Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

165

<210> 8

<211> 197

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 8

Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala Ala Ser

1 5 10 15

Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly

20 25 30

Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn

35 40 45

Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu

50 55 60

Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys

65 70 75 80

Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu

85 90 95

Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu

100 105 110

Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu

115 120 125

Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser

130 135 140

Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg

145 150 155 160

Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln

165 170 175

Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu

180 185 190

Ile Pro Ala Gly Leu

195

<210> 9

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H1

<400> 9

Ser Tyr Ala Met Ser

1 5

<210> 10

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H2

<400> 10

Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 11

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-H3

<400> 11

Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr

1 5

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L1

<400> 12

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 13

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L2

<400> 13

Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr

1 5

<210> 14

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) CDR-L3

<400> 14

Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 15

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-H1

<400> 15

Ser His Ala Met Ser

1 5

<210> 16

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-H2

<400> 16

Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 17

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-H3

<400> 17

Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr

1 5

<210> 18

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-L1

<400> 18

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 19

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-L2

<400> 19

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

1 5

<210> 20

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) CDR-L3

<400> 20

Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 21

<211> 117

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) VH

<400> 21

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(4B9) VL

<400> 22

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 23

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) VH

<400> 23

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Trp Ala Ser Gly Glu Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys Gly Trp Leu Gly Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 24

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> FAP(28H1) VL

<400> 24

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Arg Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Ile Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Val Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 25

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L1

<400> 25

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 26

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L2

<400> 26

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 27

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-L3

<400> 27

Leu Gln Leu Leu Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 28

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H1

<400> 28

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 29

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H2

<400> 29

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) CDR-H3

<400> 30

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 31

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-H1

<400> 31

Asp Tyr Ile Met His

1 5

<210> 32

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-H2

<400> 32

Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-H3

<400> 33

Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 34

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-L1

<400> 34

Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn

1 5 10 15

<210> 35

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-L2

<400> 35

Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser

1 5

<210> 36

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) CDR-L3

<400> 36

Leu Gln Leu Thr His Val Pro Tyr Thr

1 5

<210> 37

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) VH

<400> 37

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 38

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-2B11) VL

<400> 38

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 39

<211> 121

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) VH

<400> 39

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Ser Ala Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (8B8-018) VL

<400> 40

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Asn Pro

20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 41

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头G4S

<400> 41

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 42

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)2

<400> 42

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(SG4)2

<400> 43

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 44

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头细节

<400> 44

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10 15

Ser

<210> 45

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)3

<400> 45

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 46

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头G4(SG4)2

<400> 46

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 47

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头(G4S)4

<400> 47

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 48

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSPGSSSSGS

<400> 48

Gly Ser Pro Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser

1 5 10

<210> 49

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSGSGSGS

<400> 49

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5

<210> 50

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GSGSGNGS

<400> 50

Gly Ser Gly Ser Gly Asn Gly Ser

1 5

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSGSGSG

<400> 51

Gly Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 52

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSGSG

<400> 52

Gly Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 53

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGSG

<400> 53

Gly Gly Ser Gly

1

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GGSGNGSG

<400> 54

Gly Gly Ser Gly Asn Gly Ser Gly

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGNGSGSG

<400> 55

Gly Gly Asn Gly Ser Gly Ser Gly

1 5

<210> 56

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 肽接头GGNGSG

<400> 56

Gly Gly Asn Gly Ser Gly

1 5

<210> 57

<211> 760

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 57

Met Lys Thr Trp Val Lys Ile Val Phe Gly Val Ala Thr Ser Ala Val

1 5 10 15

Leu Ala Leu Leu Val Met Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val His

20 25 30

Asn Ser Glu Glu Asn Thr Met Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Phe Phe Pro Asn Trp Ile Ser Gly

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Ala Asp Asn Asn Ile Val Leu Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Gly Gln Ser Tyr Thr Ile Leu Ser Asn Arg Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Ser Asn Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Ser Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Asn

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Phe Asn Gly Arg Glu Asn Lys Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asn Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Ala

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Thr Asp Ile Pro Val Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Glu Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Ile Phe Ile Ile Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

Ala Tyr Val Gly Pro Gln Glu Val Pro Val Pro Ala Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Thr Asp Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp Gln Thr Trp Asp Cys Pro Lys Thr Gln

325 330 335

Glu His Ile Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Val Phe Ser Tyr Asp Ala Ile Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Asn Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Glu Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Ser Tyr

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Asp Tyr Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Ile Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Lys Ile Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ala Leu Lys Asn Ile Gln Leu Pro Lys Glu Glu Ile Lys Lys Leu Glu

500 505 510

Val Asp Glu Ile Thr Leu Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Arg Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Ser Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Met Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Leu Leu Tyr Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Ile Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Lys Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Val Tyr Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Leu

725 730 735

Ser Gly Leu Ser Thr Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe Leu

740 745 750

Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210> 58

<211> 761

<212> PRT

<213> 小鼠（Mus musculus）

<400> 58

Met Lys Thr Trp Leu Lys Thr Val Phe Gly Val Thr Thr Leu Ala Ala

1 5 10 15

Leu Ala Leu Val Val Ile Cys Ile Val Leu Arg Pro Ser Arg Val Tyr

20 25 30

Lys Pro Glu Gly Asn Thr Lys Arg Ala Leu Thr Leu Lys Asp Ile Leu

35 40 45

Asn Gly Thr Phe Ser Tyr Lys Thr Tyr Phe Pro Asn Trp Ile Ser Glu

50 55 60

Gln Glu Tyr Leu His Gln Ser Glu Asp Asp Asn Ile Val Phe Tyr Asn

65 70 75 80

Ile Glu Thr Arg Glu Ser Tyr Ile Ile Leu Ser Asn Ser Thr Met Lys

85 90 95

Ser Val Asn Ala Thr Asp Tyr Gly Leu Ser Pro Asp Arg Gln Phe Val

100 105 110

Tyr Leu Glu Ser Asp Tyr Ser Lys Leu Trp Arg Tyr Ser Tyr Thr Ala

115 120 125

Thr Tyr Tyr Ile Tyr Asp Leu Gln Asn Gly Glu Phe Val Arg Gly Tyr

130 135 140

Glu Leu Pro Arg Pro Ile Gln Tyr Leu Cys Trp Ser Pro Val Gly Ser

145 150 155 160

Lys Leu Ala Tyr Val Tyr Gln Asn Asn Ile Tyr Leu Lys Gln Arg Pro

165 170 175

Gly Asp Pro Pro Phe Gln Ile Thr Tyr Thr Gly Arg Glu Asn Arg Ile

180 185 190

Phe Asn Gly Ile Pro Asp Trp Val Tyr Glu Glu Glu Met Leu Ala Thr

195 200 205

Lys Tyr Ala Leu Trp Trp Ser Pro Asp Gly Lys Phe Leu Ala Tyr Val

210 215 220

Glu Phe Asn Asp Ser Asp Ile Pro Ile Ile Ala Tyr Ser Tyr Tyr Gly

225 230 235 240

Asp Gly Gln Tyr Pro Arg Thr Ile Asn Ile Pro Tyr Pro Lys Ala Gly

245 250 255

Ala Lys Asn Pro Val Val Arg Val Phe Ile Val Asp Thr Thr Tyr Pro

260 265 270

His His Val Gly Pro Met Glu Val Pro Val Pro Glu Met Ile Ala Ser

275 280 285

Ser Asp Tyr Tyr Phe Ser Trp Leu Thr Trp Val Ser Ser Glu Arg Val

290 295 300

Cys Leu Gln Trp Leu Lys Arg Val Gln Asn Val Ser Val Leu Ser Ile

305 310 315 320

Cys Asp Phe Arg Glu Asp Trp His Ala Trp Glu Cys Pro Lys Asn Gln

325 330 335

Glu His Val Glu Glu Ser Arg Thr Gly Trp Ala Gly Gly Phe Phe Val

340 345 350

Ser Thr Pro Ala Phe Ser Gln Asp Ala Thr Ser Tyr Tyr Lys Ile Phe

355 360 365

Ser Asp Lys Asp Gly Tyr Lys His Ile His Tyr Ile Lys Asp Thr Val

370 375 380

Glu Asn Ala Ile Gln Ile Thr Ser Gly Lys Trp Glu Ala Ile Tyr Ile

385 390 395 400

Phe Arg Val Thr Gln Asp Ser Leu Phe Tyr Ser Ser Asn Glu Phe Glu

405 410 415

Gly Tyr Pro Gly Arg Arg Asn Ile Tyr Arg Ile Ser Ile Gly Asn Ser

420 425 430

Pro Pro Ser Lys Lys Cys Val Thr Cys His Leu Arg Lys Glu Arg Cys

435 440 445

Gln Tyr Tyr Thr Ala Ser Phe Ser Tyr Lys Ala Lys Tyr Tyr Ala Leu

450 455 460

Val Cys Tyr Gly Pro Gly Leu Pro Ile Ser Thr Leu His Asp Gly Arg

465 470 475 480

Thr Asp Gln Glu Ile Gln Val Leu Glu Glu Asn Lys Glu Leu Glu Asn

485 490 495

Ser Leu Arg Asn Ile Gln Leu Pro Lys Val Glu Ile Lys Lys Leu Lys

500 505 510

Asp Gly Gly Leu Thr Phe Trp Tyr Lys Met Ile Leu Pro Pro Gln Phe

515 520 525

Asp Arg Ser Lys Lys Tyr Pro Leu Leu Ile Gln Val Tyr Gly Gly Pro

530 535 540

Cys Ser Gln Ser Val Lys Ser Val Phe Ala Val Asn Trp Ile Thr Tyr

545 550 555 560

Leu Ala Ser Lys Glu Gly Ile Val Ile Ala Leu Val Asp Gly Arg Gly

565 570 575

Thr Ala Phe Gln Gly Asp Lys Phe Leu His Ala Val Tyr Arg Lys Leu

580 585 590

Gly Val Tyr Glu Val Glu Asp Gln Leu Thr Ala Val Arg Lys Phe Ile

595 600 605

Glu Met Gly Phe Ile Asp Glu Glu Arg Ile Ala Ile Trp Gly Trp Ser

610 615 620

Tyr Gly Gly Tyr Val Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ser Gly Thr Gly Leu

625 630 635 640

Phe Lys Cys Gly Ile Ala Val Ala Pro Val Ser Ser Trp Glu Tyr Tyr

645 650 655

Ala Ser Ile Tyr Ser Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

660 665 670

Asn Leu Glu His Tyr Lys Asn Ser Thr Val Met Ala Arg Ala Glu Tyr

675 680 685

Phe Arg Asn Val Asp Tyr Leu Leu Ile His Gly Thr Ala Asp Asp Asn

690 695 700

Val His Phe Gln Asn Ser Ala Gln Ile Ala Lys Ala Leu Val Asn Ala

705 710 715 720

Gln Val Asp Phe Gln Ala Met Trp Tyr Ser Asp Gln Asn His Gly Ile

725 730 735

Ser Ser Gly Arg Ser Gln Asn His Leu Tyr Thr His Met Thr His Phe

740 745 750

Leu Lys Gln Cys Phe Ser Leu Ser Asp

755 760

<210> 59

<211> 556

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 59

Met Pro Pro Pro Arg Leu Leu Phe Phe Leu Leu Phe Leu Thr Pro Met

1 5 10 15

Glu Val Arg Pro Glu Glu Pro Leu Val Val Lys Val Glu Glu Gly Asp

20 25 30

Asn Ala Val Leu Gln Cys Leu Lys Gly Thr Ser Asp Gly Pro Thr Gln

35 40 45

Gln Leu Thr Trp Ser Arg Glu Ser Pro Leu Lys Pro Phe Leu Lys Leu

50 55 60

Ser Leu Gly Leu Pro Gly Leu Gly Ile His Met Arg Pro Leu Ala Ile

65 70 75 80

Trp Leu Phe Ile Phe Asn Val Ser Gln Gln Met Gly Gly Phe Tyr Leu

85 90 95

Cys Gln Pro Gly Pro Pro Ser Glu Lys Ala Trp Gln Pro Gly Trp Thr

100 105 110

Val Asn Val Glu Gly Ser Gly Glu Leu Phe Arg Trp Asn Val Ser Asp

115 120 125

Leu Gly Gly Leu Gly Cys Gly Leu Lys Asn Arg Ser Ser Glu Gly Pro

130 135 140

Ser Ser Pro Ser Gly Lys Leu Met Ser Pro Lys Leu Tyr Val Trp Ala

145 150 155 160

Lys Asp Arg Pro Glu Ile Trp Glu Gly Glu Pro Pro Cys Leu Pro Pro

165 170 175

Arg Asp Ser Leu Asn Gln Ser Leu Ser Gln Asp Leu Thr Met Ala Pro

180 185 190

Gly Ser Thr Leu Trp Leu Ser Cys Gly Val Pro Pro Asp Ser Val Ser

195 200 205

Arg Gly Pro Leu Ser Trp Thr His Val His Pro Lys Gly Pro Lys Ser

210 215 220

Leu Leu Ser Leu Glu Leu Lys Asp Asp Arg Pro Ala Arg Asp Met Trp

225 230 235 240

Val Met Glu Thr Gly Leu Leu Leu Pro Arg Ala Thr Ala Gln Asp Ala

245 250 255

Gly Lys Tyr Tyr Cys His Arg Gly Asn Leu Thr Met Ser Phe His Leu

260 265 270

Glu Ile Thr Ala Arg Pro Val Leu Trp His Trp Leu Leu Arg Thr Gly

275 280 285

Gly Trp Lys Val Ser Ala Val Thr Leu Ala Tyr Leu Ile Phe Cys Leu

290 295 300

Cys Ser Leu Val Gly Ile Leu His Leu Gln Arg Ala Leu Val Leu Arg

305 310 315 320

Arg Lys Arg Lys Arg Met Thr Asp Pro Thr Arg Arg Phe Phe Lys Val

325 330 335

Thr Pro Pro Pro Gly Ser Gly Pro Gln Asn Gln Tyr Gly Asn Val Leu

340 345 350

Ser Leu Pro Thr Pro Thr Ser Gly Leu Gly Arg Ala Gln Arg Trp Ala

355 360 365

Ala Gly Leu Gly Gly Thr Ala Pro Ser Tyr Gly Asn Pro Ser Ser Asp

370 375 380

Val Gln Ala Asp Gly Ala Leu Gly Ser Arg Ser Pro Pro Gly Val Gly

385 390 395 400

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Tyr Glu Glu Pro Asp Ser Glu Glu

405 410 415

Asp Ser Glu Phe Tyr Glu Asn Asp Ser Asn Leu Gly Gln Asp Gln Leu

420 425 430

Ser Gln Asp Gly Ser Gly Tyr Glu Asn Pro Glu Asp Glu Pro Leu Gly

435 440 445

Pro Glu Asp Glu Asp Ser Phe Ser Asn Ala Glu Ser Tyr Glu Asn Glu

450 455 460

Asp Glu Glu Leu Thr Gln Pro Val Ala Arg Thr Met Asp Phe Leu Ser

465 470 475 480

Pro His Gly Ser Ala Trp Asp Pro Ser Arg Glu Ala Thr Ser Leu Gly

485 490 495

Ser Gln Ser Tyr Glu Asp Met Arg Gly Ile Leu Tyr Ala Ala Pro Gln

500 505 510

Leu Arg Ser Ile Arg Gly Gln Pro Gly Pro Asn His Glu Glu Asp Ala

515 520 525

Asp Ser Tyr Glu Asn Met Asp Asn Pro Asp Gly Pro Asp Pro Ala Trp

530 535 540

Gly Gly Gly Gly Arg Met Gly Thr Trp Ser Thr Arg

545 550 555

<210> 60

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH2域

<400> 60

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Trp Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

35 40 45

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

50 55 60

Glu Ser Thr Tyr Arg Trp Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

65 70 75 80

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

85 90 95

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

100 105

<210> 61

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH3域

<400> 61

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

100 105

<210> 62

<211> 98

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1域

<400> 62

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 63

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链区, 其中X为S或P

<220>

<221> 混杂特征

<222> (8)..(8)

<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸

<400> 63

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro

1 5 10

<210> 64

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 更短的铰链区, 其中X为S或P

<220>

<221> 混杂特征

<222> (5)..(5)

<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸

<400> 64

His Thr Cys Pro Xaa Cys Pro

1 5

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最短的铰链区, 其中X为S或P

<220>

<221> 混杂特征

<222> (3)..(3)

<223> Xaa可以是任何天然发生氨基酸

<400> 65

Cys Pro Xaa Cys Pro

1 5

<210> 66

<211> 205

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 66

Met Thr Pro Pro Glu Arg Leu Phe Leu Pro Arg Val Cys Gly Thr Thr

1 5 10 15

Leu His Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Val Leu Leu Pro Gly Ala

20 25 30

Gln Gly Leu Pro Gly Val Gly Leu Thr Pro Ser Ala Ala Gln Thr Ala

35 40 45

Arg Gln His Pro Lys Met His Leu Ala His Ser Thr Leu Lys Pro Ala

50 55 60

Ala His Leu Ile Gly Asp Pro Ser Lys Gln Asn Ser Leu Leu Trp Arg

65 70 75 80

Ala Asn Thr Asp Arg Ala Phe Leu Gln Asp Gly Phe Ser Leu Ser Asn

85 90 95

Asn Ser Leu Leu Val Pro Thr Ser Gly Ile Tyr Phe Val Tyr Ser Gln

100 105 110

Val Val Phe Ser Gly Lys Ala Tyr Ser Pro Lys Ala Thr Ser Ser Pro

115 120 125

Leu Tyr Leu Ala His Glu Val Gln Leu Phe Ser Ser Gln Tyr Pro Phe

130 135 140

His Val Pro Leu Leu Ser Ser Gln Lys Met Val Tyr Pro Gly Leu Gln

145 150 155 160

Glu Pro Trp Leu His Ser Met Tyr His Gly Ala Ala Phe Gln Leu Thr

165 170 175

Gln Gly Asp Gln Leu Ser Thr His Thr Asp Gly Ile Pro His Leu Val

180 185 190

Leu Ser Pro Ser Thr Val Phe Phe Gly Ala Phe Ala Leu

195 200 205

<210> 67

<211> 233

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 67

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

100 105 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

115 120 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

130 135 140

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

145 150 155 160

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

165 170 175

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

180 185 190

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

210 215 220

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

225 230

<210> 68

<211> 244

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 68

Met Gly Ala Leu Gly Leu Glu Gly Arg Gly Gly Arg Leu Gln Gly Arg

1 5 10 15

Gly Ser Leu Leu Leu Ala Val Ala Gly Ala Thr Ser Leu Val Thr Leu

20 25 30

Leu Leu Ala Val Pro Ile Thr Val Leu Ala Val Leu Ala Leu Val Pro

35 40 45

Gln Asp Gln Gly Gly Leu Val Thr Glu Thr Ala Asp Pro Gly Ala Gln

50 55 60

Ala Gln Gln Gly Leu Gly Phe Gln Lys Leu Pro Glu Glu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Thr Asp Leu Ser Pro Gly Leu Pro Ala Ala His Leu Ile Gly Ala Pro

85 90 95

Leu Lys Gly Gln Gly Leu Gly Trp Glu Thr Thr Lys Glu Gln Ala Phe

100 105 110

Leu Thr Ser Gly Thr Gln Phe Ser Asp Ala Glu Gly Leu Ala Leu Pro

115 120 125

Gln Asp Gly Leu Tyr Tyr Leu Tyr Cys Leu Val Gly Tyr Arg Gly Arg

130 135 140

Ala Pro Pro Gly Gly Gly Asp Pro Gln Gly Arg Ser Val Thr Leu Arg

145 150 155 160

Ser Ser Leu Tyr Arg Ala Gly Gly Ala Tyr Gly Pro Gly Thr Pro Glu

165 170 175

Leu Leu Leu Glu Gly Ala Glu Thr Val Thr Pro Val Leu Asp Pro Ala

180 185 190

Arg Arg Gln Gly Tyr Gly Pro Leu Trp Tyr Thr Ser Val Gly Phe Gly

195 200 205

Gly Leu Val Gln Leu Arg Arg Gly Glu Arg Val Tyr Val Asn Ile Ser

210 215 220

His Pro Asp Met Val Asp Phe Ala Arg Gly Lys Thr Phe Phe Gly Ala

225 230 235 240

Val Met Val Gly

<210> 69

<211> 183

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 69

Met Glu Arg Val Gln Pro Leu Glu Glu Asn Val Gly Asn Ala Ala Arg

1 5 10 15

Pro Arg Phe Glu Arg Asn Lys Leu Leu Leu Val Ala Ser Val Ile Gln

20 25 30

Gly Leu Gly Leu Leu Leu Cys Phe Thr Tyr Ile Cys Leu His Phe Ser

35 40 45

Ala Leu Gln Val Ser His Arg Tyr Pro Arg Ile Gln Ser Ile Lys Val

50 55 60

Gln Phe Thr Glu Tyr Lys Lys Glu Lys Gly Phe Ile Leu Thr Ser Gln

65 70 75 80

Lys Glu Asp Glu Ile Met Lys Val Gln Asn Asn Ser Val Ile Ile Asn

85 90 95

Cys Asp Gly Phe Tyr Leu Ile Ser Leu Lys Gly Tyr Phe Ser Gln Glu

100 105 110

Val Asn Ile Ser Leu His Tyr Gln Lys Asp Glu Glu Pro Leu Phe Gln

115 120 125

Leu Lys Lys Val Arg Ser Val Asn Ser Leu Met Val Ala Ser Leu Thr

130 135 140

Tyr Lys Asp Lys Val Tyr Leu Asn Val Thr Thr Asp Asn Thr Ser Leu

145 150 155 160

Asp Asp Phe His Val Asn Gly Gly Glu Leu Ile Leu Ile His Gln Asn

165 170 175

Pro Gly Glu Phe Cys Val Leu

180

<210> 70

<211> 261

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 70

Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly

1 5 10 15

Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu

20 25 30

Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg

35 40 45

Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val

50 55 60

Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser

65 70 75 80

Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys

85 90 95

Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu

100 105 110

Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser

115 120 125

Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly

130 135 140

Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln

145 150 155 160

Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr

165 170 175

Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser

180 185 190

Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala

195 200 205

Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His

210 215 220

Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn

225 230 235 240

Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe

245 250 255

Gly Leu Leu Lys Leu

260

<210> 71

<211> 281

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 71

Met Gln Gln Pro Phe Asn Tyr Pro Tyr Pro Gln Ile Tyr Trp Val Asp

1 5 10 15

Ser Ser Ala Ser Ser Pro Trp Ala Pro Pro Gly Thr Val Leu Pro Cys

20 25 30

Pro Thr Ser Val Pro Arg Arg Pro Gly Gln Arg Arg Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro

50 55 60

Pro Leu Pro Leu Pro Pro Leu Lys Lys Arg Gly Asn His Ser Thr Gly

65 70 75 80

Leu Cys Leu Leu Val Met Phe Phe Met Val Leu Val Ala Leu Val Gly

85 90 95

Leu Gly Leu Gly Met Phe Gln Leu Phe His Leu Gln Lys Glu Leu Ala

100 105 110

Glu Leu Arg Glu Ser Thr Ser Gln Met His Thr Ala Ser Ser Leu Glu

115 120 125

Lys Gln Ile Gly His Pro Ser Pro Pro Pro Glu Lys Lys Glu Leu Arg

130 135 140

Lys Val Ala His Leu Thr Gly Lys Ser Asn Ser Arg Ser Met Pro Leu

145 150 155 160

Glu Trp Glu Asp Thr Tyr Gly Ile Val Leu Leu Ser Gly Val Lys Tyr

165 170 175

Lys Lys Gly Gly Leu Val Ile Asn Glu Thr Gly Leu Tyr Phe Val Tyr

180 185 190

Ser Lys Val Tyr Phe Arg Gly Gln Ser Cys Asn Asn Leu Pro Leu Ser

195 200 205

His Lys Val Tyr Met Arg Asn Ser Lys Tyr Pro Gln Asp Leu Val Met

210 215 220

Met Glu Gly Lys Met Met Ser Tyr Cys Thr Thr Gly Gln Met Trp Ala

225 230 235 240

Arg Ser Ser Tyr Leu Gly Ala Val Phe Asn Leu Thr Ser Ala Asp His

245 250 255

Leu Tyr Val Asn Val Ser Glu Leu Ser Leu Val Asn Phe Glu Glu Ser

260 265 270

Gln Thr Phe Phe Gly Leu Tyr Lys Leu

275 280

<210> 72

<211> 193

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 72

Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly

1 5 10 15

Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile

20 25 30

Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His

50 55 60

Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala

65 70 75 80

Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu

85 90 95

Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu

100 105 110

Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu

115 120 125

Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg

180 185 190

Pro

<210> 73

<211> 234

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 73

Met Asp Pro Gly Leu Gln Gln Ala Leu Asn Gly Met Ala Pro Pro Gly

1 5 10 15

Asp Thr Ala Met His Val Pro Ala Gly Ser Val Ala Ser His Leu Gly

20 25 30

Thr Thr Ser Arg Ser Tyr Phe Tyr Leu Thr Thr Ala Thr Leu Ala Leu

35 40 45

Cys Leu Val Phe Thr Val Ala Thr Ile Met Val Leu Val Val Gln Arg

50 55 60

Thr Asp Ser Ile Pro Asn Ser Pro Asp Asn Val Pro Leu Lys Gly Gly

65 70 75 80

Asn Cys Ser Glu Asp Leu Leu Cys Ile Leu Lys Arg Ala Pro Phe Lys

85 90 95

Lys Ser Trp Ala Tyr Leu Gln Val Ala Lys His Leu Asn Lys Thr Lys

100 105 110

Leu Ser Trp Asn Lys Asp Gly Ile Leu His Gly Val Arg Tyr Gln Asp

115 120 125

Gly Asn Leu Val Ile Gln Phe Pro Gly Leu Tyr Phe Ile Ile Cys Gln

130 135 140

Leu Gln Phe Leu Val Gln Cys Pro Asn Asn Ser Val Asp Leu Lys Leu

145 150 155 160

Glu Leu Leu Ile Asn Lys His Ile Lys Lys Gln Ala Leu Val Thr Val

165 170 175

Cys Glu Ser Gly Met Gln Thr Lys His Val Tyr Gln Asn Leu Ser Gln

180 185 190

Phe Leu Leu Asp Tyr Leu Gln Val Asn Thr Thr Ile Ser Val Asn Val

195 200 205

Asp Thr Phe Gln Tyr Ile Asp Thr Ser Thr Phe Pro Leu Glu Asn Val

210 215 220

Leu Ser Ile Phe Leu Tyr Ser Asn Ser Asp

225 230

<210> 74

<211> 254

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 74

Met Glu Tyr Ala Ser Asp Ala Ser Leu Asp Pro Glu Ala Pro Trp Pro

1 5 10 15

Pro Ala Pro Arg Ala Arg Ala Cys Arg Val Leu Pro Trp Ala Leu Val

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Ala Ala Cys Ala Val Phe

35 40 45

Leu Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser

50 55 60

Ala Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp

65 70 75 80

Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val

85 90 95

Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp

100 105 110

Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu

115 120 125

Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe

130 135 140

Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala

165 170 175

Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala

180 185 190

Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala

195 200 205

Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His

210 215 220

Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val

225 230 235 240

Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

245 250

<210> 75

<211> 281

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 75

Met Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys

1 5 10 15

Val Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala

20 25 30

Val Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys

35 40 45

Tyr Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr

50 55 60

Trp Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val

65 70 75 80

Lys Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser

85 90 95

Glu Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro

100 105 110

Leu Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly

115 120 125

Thr Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu

130 135 140

Lys Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly

145 150 155 160

His Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile

165 170 175

His Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe

180 185 190

Gln Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln

195 200 205

Tyr Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys

210 215 220

Ser Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr

225 230 235 240

Ser Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile

245 250 255

Phe Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala

260 265 270

Ser Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly

275 280

<210> 76

<211> 317

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 76

Met Arg Arg Ala Ser Arg Asp Tyr Thr Lys Tyr Leu Arg Gly Ser Glu

1 5 10 15

Glu Met Gly Gly Gly Pro Gly Ala Pro His Glu Gly Pro Leu His Ala

20 25 30

Pro Pro Pro Pro Ala Pro His Gln Pro Pro Ala Ala Ser Arg Ser Met

35 40 45

Phe Val Ala Leu Leu Gly Leu Gly Leu Gly Gln Val Val Cys Ser Val

50 55 60

Ala Leu Phe Phe Tyr Phe Arg Ala Gln Met Asp Pro Asn Arg Ile Ser

65 70 75 80

Glu Asp Gly Thr His Cys Ile Tyr Arg Ile Leu Arg Leu His Glu Asn

85 90 95

Ala Asp Phe Gln Asp Thr Thr Leu Glu Ser Gln Asp Thr Lys Leu Ile

100 105 110

Pro Asp Ser Cys Arg Arg Ile Lys Gln Ala Phe Gln Gly Ala Val Gln

115 120 125

Lys Glu Leu Gln His Ile Val Gly Ser Gln His Ile Arg Ala Glu Lys

130 135 140

Ala Met Val Asp Gly Ser Trp Leu Asp Leu Ala Lys Arg Ser Lys Leu

145 150 155 160

Glu Ala Gln Pro Phe Ala His Leu Thr Ile Asn Ala Thr Asp Ile Pro

165 170 175

Ser Gly Ser His Lys Val Ser Leu Ser Ser Trp Tyr His Asp Arg Gly

180 185 190

Trp Ala Lys Ile Ser Asn Met Thr Phe Ser Asn Gly Lys Leu Ile Val

195 200 205

Asn Gln Asp Gly Phe Tyr Tyr Leu Tyr Ala Asn Ile Cys Phe Arg His

210 215 220

His Glu Thr Ser Gly Asp Leu Ala Thr Glu Tyr Leu Gln Leu Met Val

225 230 235 240

Tyr Val Thr Lys Thr Ser Ile Lys Ile Pro Ser Ser His Thr Leu Met

245 250 255

Lys Gly Gly Ser Thr Lys Tyr Trp Ser Gly Asn Ser Glu Phe His Phe

260 265 270

Tyr Ser Ile Asn Val Gly Gly Phe Phe Lys Leu Arg Ser Gly Glu Glu

275 280 285

Ile Ser Ile Glu Val Ser Asn Pro Ser Leu Leu Asp Pro Asp Gln Asp

290 295 300

Ala Thr Tyr Phe Gly Ala Phe Lys Val Arg Asp Ile Asp

305 310 315

<210> 77

<211> 249

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 77

Met Ala Ala Arg Arg Ser Gln Arg Arg Arg Gly Arg Arg Gly Glu Pro

1 5 10 15

Gly Thr Ala Leu Leu Val Pro Leu Ala Leu Gly Leu Gly Leu Ala Leu

20 25 30

Ala Cys Leu Gly Leu Leu Leu Ala Val Val Ser Leu Gly Ser Arg Ala

35 40 45

Ser Leu Ser Ala Gln Glu Pro Ala Gln Glu Glu Leu Val Ala Glu Glu

50 55 60

Asp Gln Asp Pro Ser Glu Leu Asn Pro Gln Thr Glu Glu Ser Gln Asp

65 70 75 80

Pro Ala Pro Phe Leu Asn Arg Leu Val Arg Pro Arg Arg Ser Ala Pro

85 90 95

Lys Gly Arg Lys Thr Arg Ala Arg Arg Ala Ile Ala Ala His Tyr Glu

100 105 110

Val His Pro Arg Pro Gly Gln Asp Gly Ala Gln Ala Gly Val Asp Gly

115 120 125

Thr Val Ser Gly Trp Glu Glu Ala Arg Ile Asn Ser Ser Ser Pro Leu

130 135 140

Arg Tyr Asn Arg Gln Ile Gly Glu Phe Ile Val Thr Arg Ala Gly Leu

145 150 155 160

Tyr Tyr Leu Tyr Cys Gln Val His Phe Asp Glu Gly Lys Ala Val Tyr

165 170 175

Leu Lys Leu Asp Leu Leu Val Asp Gly Val Leu Ala Leu Arg Cys Leu

180 185 190

Glu Glu Phe Ser Ala Thr Ala Ala Ser Ser Leu Gly Pro Gln Leu Arg

195 200 205

Leu Cys Gln Val Ser Gly Leu Leu Ala Leu Arg Pro Gly Ser Ser Leu

210 215 220

Arg Ile Arg Thr Leu Pro Trp Ala His Leu Lys Ala Ala Pro Phe Leu

225 230 235 240

Thr Tyr Phe Gly Leu Phe Gln Val His

245

<210> 78

<211> 250

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 78

Met Pro Ala Ser Ser Pro Phe Leu Leu Ala Pro Lys Gly Pro Pro Gly

1 5 10 15

Asn Met Gly Gly Pro Val Arg Glu Pro Ala Leu Ser Val Ala Leu Trp

20 25 30

Leu Ser Trp Gly Ala Ala Leu Gly Ala Val Ala Cys Ala Met Ala Leu

35 40 45

Leu Thr Gln Gln Thr Glu Leu Gln Ser Leu Arg Arg Glu Val Ser Arg

50 55 60

Leu Gln Gly Thr Gly Gly Pro Ser Gln Asn Gly Glu Gly Tyr Pro Trp

65 70 75 80

Gln Ser Leu Pro Glu Gln Ser Ser Asp Ala Leu Glu Ala Trp Glu Asn

85 90 95

Gly Glu Arg Ser Arg Lys Arg Arg Ala Val Leu Thr Gln Lys Gln Lys

100 105 110

Lys Gln His Ser Val Leu His Leu Val Pro Ile Asn Ala Thr Ser Lys

115 120 125

Asp Asp Ser Asp Val Thr Glu Val Met Trp Gln Pro Ala Leu Arg Arg

130 135 140

Gly Arg Gly Leu Gln Ala Gln Gly Tyr Gly Val Arg Ile Gln Asp Ala

145 150 155 160

Gly Val Tyr Leu Leu Tyr Ser Gln Val Leu Phe Gln Asp Val Thr Phe

165 170 175

Thr Met Gly Gln Val Val Ser Arg Glu Gly Gln Gly Arg Gln Glu Thr

180 185 190

Leu Phe Arg Cys Ile Arg Ser Met Pro Ser His Pro Asp Arg Ala Tyr

195 200 205

Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Val Phe His Leu His Gln Gly Asp Ile

210 215 220

Leu Ser Val Ile Ile Pro Arg Ala Arg Ala Lys Leu Asn Leu Ser Pro

225 230 235 240

His Gly Thr Phe Leu Gly Phe Val Lys Leu

245 250

<210> 79

<211> 285

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 79

Met Asp Asp Ser Thr Glu Arg Glu Gln Ser Arg Leu Thr Ser Cys Leu

1 5 10 15

Lys Lys Arg Glu Glu Met Lys Leu Lys Glu Cys Val Ser Ile Leu Pro

20 25 30

Arg Lys Glu Ser Pro Ser Val Arg Ser Ser Lys Asp Gly Lys Leu Leu

35 40 45

Ala Ala Thr Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Cys Leu Thr Val Val

50 55 60

Ser Phe Tyr Gln Val Ala Ala Leu Gln Gly Asp Leu Ala Ser Leu Arg

65 70 75 80

Ala Glu Leu Gln Gly His His Ala Glu Lys Leu Pro Ala Gly Ala Gly

85 90 95

Ala Pro Lys Ala Gly Leu Glu Glu Ala Pro Ala Val Thr Ala Gly Leu

100 105 110

Lys Ile Phe Glu Pro Pro Ala Pro Gly Glu Gly Asn Ser Ser Gln Asn

115 120 125

Ser Arg Asn Lys Arg Ala Val Gln Gly Pro Glu Glu Thr Val Thr Gln

130 135 140

Asp Cys Leu Gln Leu Ile Ala Asp Ser Glu Thr Pro Thr Ile Gln Lys

145 150 155 160

Gly Ser Tyr Thr Phe Val Pro Trp Leu Leu Ser Phe Lys Arg Gly Ser

165 170 175

Ala Leu Glu Glu Lys Glu Asn Lys Ile Leu Val Lys Glu Thr Gly Tyr

180 185 190

Phe Phe Ile Tyr Gly Gln Val Leu Tyr Thr Asp Lys Thr Tyr Ala Met

195 200 205

Gly His Leu Ile Gln Arg Lys Lys Val His Val Phe Gly Asp Glu Leu

210 215 220

Ser Leu Val Thr Leu Phe Arg Cys Ile Gln Asn Met Pro Glu Thr Leu

225 230 235 240

Pro Asn Asn Ser Cys Tyr Ser Ala Gly Ile Ala Lys Leu Glu Glu Gly

245 250 255

Asp Glu Leu Gln Leu Ala Ile Pro Arg Glu Asn Ala Gln Ile Ser Leu

260 265 270

Asp Gly Asp Val Thr Phe Phe Gly Ala Leu Lys Leu Leu

275 280 285

<210> 80

<211> 240

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 80

Met Glu Glu Ser Val Val Arg Pro Ser Val Phe Val Val Asp Gly Gln

1 5 10 15

Thr Asp Ile Pro Phe Thr Arg Leu Gly Arg Ser His Arg Arg Gln Ser

20 25 30

Cys Ser Val Ala Arg Val Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Met Gly

35 40 45

Ala Gly Leu Ala Val Gln Gly Trp Phe Leu Leu Gln Leu His Trp Arg

50 55 60

Leu Gly Glu Met Val Thr Arg Leu Pro Asp Gly Pro Ala Gly Ser Trp

65 70 75 80

Glu Gln Leu Ile Gln Glu Arg Arg Ser His Glu Val Asn Pro Ala Ala

85 90 95

His Leu Thr Gly Ala Asn Ser Ser Leu Thr Gly Ser Gly Gly Pro Leu

100 105 110

Leu Trp Glu Thr Gln Leu Gly Leu Ala Phe Leu Arg Gly Leu Ser Tyr

115 120 125

His Asp Gly Ala Leu Val Val Thr Lys Ala Gly Tyr Tyr Tyr Ile Tyr

130 135 140

Ser Lys Val Gln Leu Gly Gly Val Gly Cys Pro Leu Gly Leu Ala Ser

145 150 155 160

Thr Ile Thr His Gly Leu Tyr Lys Arg Thr Pro Arg Tyr Pro Glu Glu

165 170 175

Leu Glu Leu Leu Val Ser Gln Gln Ser Pro Cys Gly Arg Ala Thr Ser

180 185 190

Ser Ser Arg Val Trp Trp Asp Ser Ser Phe Leu Gly Gly Val Val His

195 200 205

Leu Glu Ala Gly Glu Lys Val Val Val Arg Val Leu Asp Glu Arg Leu

210 215 220

Val Arg Leu Arg Asp Gly Thr Arg Ser Tyr Phe Gly Ala Phe Met Val

225 230 235 240

<210> 81

<211> 251

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 81

Met Ala Glu Asp Leu Gly Leu Ser Phe Gly Glu Thr Ala Ser Val Glu

1 5 10 15

Met Leu Pro Glu His Gly Ser Cys Arg Pro Lys Ala Arg Ser Ser Ser

20 25 30

Ala Arg Trp Ala Leu Thr Cys Cys Leu Val Leu Leu Pro Phe Leu Ala

35 40 45

Gly Leu Thr Thr Tyr Leu Leu Val Ser Gln Leu Arg Ala Gln Gly Glu

50 55 60

Ala Cys Val Gln Phe Gln Ala Leu Lys Gly Gln Glu Phe Ala Pro Ser

65 70 75 80

His Gln Gln Val Tyr Ala Pro Leu Arg Ala Asp Gly Asp Lys Pro Arg

85 90 95

Ala His Leu Thr Val Val Arg Gln Thr Pro Thr Gln His Phe Lys Asn

100 105 110

Gln Phe Pro Ala Leu His Trp Glu His Glu Leu Gly Leu Ala Phe Thr

115 120 125

Lys Asn Arg Met Asn Tyr Thr Asn Lys Phe Leu Leu Ile Pro Glu Ser

130 135 140

Gly Asp Tyr Phe Ile Tyr Ser Gln Val Thr Phe Arg Gly Met Thr Ser

145 150 155 160

Glu Cys Ser Glu Ile Arg Gln Ala Gly Arg Pro Asn Lys Pro Asp Ser

165 170 175

Ile Thr Val Val Ile Thr Lys Val Thr Asp Ser Tyr Pro Glu Pro Thr

180 185 190

Gln Leu Leu Met Gly Thr Lys Ser Val Cys Glu Val Gly Ser Asn Trp

195 200 205

Phe Gln Pro Ile Tyr Leu Gly Ala Met Phe Ser Leu Gln Glu Gly Asp

210 215 220

Lys Leu Met Val Asn Val Ser Asp Ile Ser Leu Val Asp Tyr Thr Lys

225 230 235 240

Glu Asp Lys Thr Phe Phe Gly Ala Phe Leu Leu

245 250

<210> 82

<211> 199

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 82

Met Thr Leu His Pro Ser Pro Ile Thr Cys Glu Phe Leu Phe Ser Thr

1 5 10 15

Ala Leu Ile Ser Pro Lys Met Cys Leu Ser His Leu Glu Asn Met Pro

20 25 30

Leu Ser His Ser Arg Thr Gln Gly Ala Gln Arg Ser Ser Trp Lys Leu

35 40 45

Trp Leu Phe Cys Ser Ile Val Met Leu Leu Phe Leu Cys Ser Phe Ser

50 55 60

Trp Leu Ile Phe Ile Phe Leu Gln Leu Glu Thr Ala Lys Glu Pro Cys

65 70 75 80

Met Ala Lys Phe Gly Pro Leu Pro Ser Lys Trp Gln Met Ala Ser Ser

85 90 95

Glu Pro Pro Cys Val Asn Lys Val Ser Asp Trp Lys Leu Glu Ile Leu

100 105 110

Gln Asn Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Gly Gln Val Ala Pro Asn Ala Asn

115 120 125

Tyr Asn Asp Val Ala Pro Phe Glu Val Arg Leu Tyr Lys Asn Lys Asp

130 135 140

Met Ile Gln Thr Leu Thr Asn Lys Ser Lys Ile Gln Asn Val Gly Gly

145 150 155 160

Thr Tyr Glu Leu His Val Gly Asp Thr Ile Asp Leu Ile Phe Asn Ser

165 170 175

Glu His Gln Val Leu Lys Asn Asn Thr Tyr Trp Gly Ile Ile Leu Leu

180 185 190

Ala Asn Pro Gln Phe Ile Ser

195

<210> 83

<211> 391

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 83

Met Gly Tyr Pro Glu Val Glu Arg Arg Glu Leu Leu Pro Ala Ala Ala

1 5 10 15

Pro Arg Glu Arg Gly Ser Gln Gly Cys Gly Cys Gly Gly Ala Pro Ala

20 25 30

Arg Ala Gly Glu Gly Asn Ser Cys Leu Leu Phe Leu Gly Phe Phe Gly

35 40 45

Leu Ser Leu Ala Leu His Leu Leu Thr Leu Cys Cys Tyr Leu Glu Leu

50 55 60

Arg Ser Glu Leu Arg Arg Glu Arg Gly Ala Glu Ser Arg Leu Gly Gly

65 70 75 80

Ser Gly Thr Pro Gly Thr Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Gly Gly Leu

85 90 95

Asp Pro Asp Ser Pro Ile Thr Ser His Leu Gly Gln Pro Ser Pro Lys

100 105 110

Gln Gln Pro Leu Glu Pro Gly Glu Ala Ala Leu His Ser Asp Ser Gln

115 120 125

Asp Gly His Gln Met Ala Leu Leu Asn Phe Phe Phe Pro Asp Glu Lys

130 135 140

Pro Tyr Ser Glu Glu Glu Ser Arg Arg Val Arg Arg Asn Lys Arg Ser

145 150 155 160

Lys Ser Asn Glu Gly Ala Asp Gly Pro Val Lys Asn Lys Lys Lys Gly

165 170 175

Lys Lys Ala Gly Pro Pro Gly Pro Asn Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

180 185 190

Pro Pro Gly Pro Gln Gly Pro Pro Gly Ile Pro Gly Ile Pro Gly Ile

195 200 205

Pro Gly Thr Thr Val Met Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly Pro Pro Gly

210 215 220

Pro Gln Gly Pro Pro Gly Leu Gln Gly Pro Ser Gly Ala Ala Asp Lys

225 230 235 240

Ala Gly Thr Arg Glu Asn Gln Pro Ala Val Val His Leu Gln Gly Gln

245 250 255

Gly Ser Ala Ile Gln Val Lys Asn Asp Leu Ser Gly Gly Val Leu Asn

260 265 270

Asp Trp Ser Arg Ile Thr Met Asn Pro Lys Val Phe Lys Leu His Pro

275 280 285

Arg Ser Gly Glu Leu Glu Val Leu Val Asp Gly Thr Tyr Phe Ile Tyr

290 295 300

Ser Gln Val Glu Val Tyr Tyr Ile Asn Phe Thr Asp Phe Ala Ser Tyr

305 310 315 320

Glu Val Val Val Asp Glu Lys Pro Phe Leu Gln Cys Thr Arg Ser Ile

325 330 335

Glu Thr Gly Lys Thr Asn Tyr Asn Thr Cys Tyr Thr Ala Gly Val Cys

340 345 350

Leu Leu Lys Ala Arg Gln Lys Ile Ala Val Lys Met Val His Ala Asp

355 360 365

Ile Ser Ile Asn Met Ser Lys His Thr Thr Phe Phe Gly Ala Ile Arg

370 375 380

Leu Gly Glu Ala Pro Ala Ser

385 390

<210> 84

<211> 205

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 84

Ala Cys Pro Trp Ala Val Ser Gly Ala Arg Ala Ser Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Ser Pro Arg Leu Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro

20 25 30

Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala

35 40 45

Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro

50 55 60

Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp

65 70 75 80

Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe

85 90 95

Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val

100 105 110

Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg

130 135 140

Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly

145 150 155 160

Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala

165 170 175

Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr

180 185 190

Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Pro Ser Pro Arg Ser Glu

195 200 205

<210> 85

<211> 790

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一融合多肽(P1AA1199)

<400> 85

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His

180 185 190

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

195 200 205

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

210 215 220

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

225 230 235 240

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

245 250 255

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260 265 270

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

275 280 285

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

290 295 300

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

325 330 335

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

340 345 350

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

370 375 380

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

385 390 395 400

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro

420 425 430

Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

435 440 445

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

450 455 460

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr

465 470 475 480

Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr

485 490 495

Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser

500 505 510

Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala

515 520 525

Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser

530 535 540

Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu

545 550 555 560

Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala

565 570 575

Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe

580 585 590

Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala

610 615 620

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625 630 635 640

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645 650 655

Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr

660 665 670

Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln

675 680 685

Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser

690 695 700

Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala

705 710 715 720

Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn

725 730 735

Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln

740 745 750

Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp

755 760 765

Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro

770 775 780

Glu Ile Pro Ala Gly Leu

785 790

<210> 86

<211> 446

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二融合多肽(P1AA1199)

<400> 86

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

<210> 87

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 轻链(P1AA1199, P1AA1235)

<400> 87

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

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Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 88

<211> 602

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一融合多肽(P1AA1235)

<400> 88

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His

180 185 190

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

195 200 205

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

210 215 220

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

225 230 235 240

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

245 250 255

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

260 265 270

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

275 280 285

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

290 295 300

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

325 330 335

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

340 345 350

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

370 375 380

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

385 390 395 400

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro

420 425 430

Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

435 440 445

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

450 455 460

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr

465 470 475 480

Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr

485 490 495

Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser

500 505 510

Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala

515 520 525

Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser

530 535 540

Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu

545 550 555 560

Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala

565 570 575

Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe

580 585 590

Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

595 600

<210> 89

<211> 634

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二融合多肽(P1AA1235, P1AA1259)

<400> 89

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

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Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

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Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

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Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

435 440 445

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro

450 455 460

Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln

465 470 475 480

Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr

485 490 495

Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr

500 505 510

Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr

515 520 525

Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser

530 535 540

Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala

545 550 555 560

Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser

565 570 575

Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu

580 585 590

Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala

595 600 605

Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe

610 615 620

Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

625 630

<210> 90

<211> 608

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第一融合多肽(P1AA1259)

<400> 90

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His

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Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

195 200 205

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210 215 220

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275 280 285

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Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

305 310 315 320

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

325 330 335

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

340 345 350

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

355 360 365

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

370 375 380

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

385 390 395 400

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Gly Gly

405 410 415

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu

420 425 430

Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg

435 440 445

Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp

450 455 460

Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu

465 470 475 480

Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala

485 490 495

Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val

500 505 510

Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln

515 520 525

Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp

530 535 540

Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln

545 550 555 560

Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu

565 570 575

His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala

580 585 590

Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

595 600 605

<210> 91

<211> 672

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二融合多肽(P1AA9626), 无接头

<400> 91

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

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260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly

435 440 445

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser

450 455 460

Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys

465 470 475 480

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln

485 490 495

Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg

500 505 510

Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp

515 520 525

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595 600 605

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660 665 670

<210> 92

<211> 682

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 第二融合多肽(有(G4S)2接头)

<400> 92

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

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Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

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Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

225 230 235 240

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

245 250 255

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

260 265 270

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

275 280 285

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

290 295 300

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

305 310 315 320

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

325 330 335

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

340 345 350

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

355 360 365

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

370 375 380

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

385 390 395 400

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

405 410 415

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

420 425 430

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

435 440 445

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

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Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

465 470 475 480

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

485 490 495

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Met Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

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Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

595 600 605

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

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Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

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Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

645 650 655

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660 665 670

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

675 680

<210> 93

<211> 710

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 二聚体hu 4-1BBL (71-248) - CL* Fc节链(构建物2.4)

<400> 93

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro

180 185 190

Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

195 200 205

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro

210 215 220

Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly

225 230 235 240

Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala

245 250 255

Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

260 265 270

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu

275 280 285

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro

290 295 300

Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg

305 310 315 320

Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr

325 330 335

Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val

340 345 350

Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu Gly Gly

355 360 365

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val

370 375 380

Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser

385 390 395 400

Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln

405 410 415

Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val

420 425 430

Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu

435 440 445

Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu

450 455 460

Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg

465 470 475 480

Gly Glu Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

485 490 495

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

500 505 510

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

515 520 525

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

530 535 540

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

545 550 555 560

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

565 570 575

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

580 585 590

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

595 600 605

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

610 615 620

Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

625 630 635 640

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

645 650 655

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

660 665 670

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

675 680 685

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

690 695 700

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

705 710

<210> 94

<211> 291

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 单体hu 4-1BBL (71-248) - CH1* (构建物2.4)

<400> 94

Arg Glu Gly Pro Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Gln Gly Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu

20 25 30

Ile Asp Gly Pro Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val

35 40 45

Ser Leu Thr Gly Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg

65 70 75 80

Arg Val Val Ala Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His

85 90 95

Leu Gln Pro Leu Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr

100 105 110

Val Asp Leu Pro Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly

115 120 125

Phe Gln Gly Arg Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val

130 135 140

His Leu His Thr Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln

145 150 155 160

Gly Ala Thr Val Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala

165 170 175

Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ser Thr Lys

180 185 190

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

195 200 205

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

210 215 220

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

225 230 235 240

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

245 250 255

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

260 265 270

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro

275 280 285

Lys Ser Cys

290

<210> 95

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗FAP (4B9) Fc穴链(构建物2.4)

<400> 95

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 96

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗FAP (4B9)轻链(构建物2.4)

<400> 96

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

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Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

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Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 97

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47 Fc穴链

<400> 97

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Ser Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

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340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

355 360 365

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370 375 380

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385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 98

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> DP47轻链

<400> 98

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

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115 120 125

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130 135 140

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Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 99

<211> 638

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AA1233的第二融合多肽

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

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180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

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210 215 220

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

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260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

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450 455 460

Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

465 470 475 480

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro

485 490 495

Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly

500 505 510

Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala

515 520 525

Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

530 535 540

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545 550 555 560

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro

565 570 575

Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg

580 585 590

Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr

595 600 605

Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val

610 615 620

Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

625 630 635

<210> 100

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD19 (2B11)轻链

<400> 100

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 101

<211> 638

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AA1258的第二融合多肽

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

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100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Glu Gly Pro

450 455 460

Glu Leu Ser Pro Asp Asp Pro Ala Gly Leu Leu Asp Leu Arg Gln Gly

465 470 475 480

Met Phe Ala Gln Leu Val Ala Gln Asn Val Leu Leu Ile Asp Gly Pro

485 490 495

Leu Ser Trp Tyr Ser Asp Pro Gly Leu Ala Gly Val Ser Leu Thr Gly

500 505 510

Gly Leu Ser Tyr Lys Glu Asp Thr Lys Glu Leu Val Val Ala Lys Ala

515 520 525

Gly Val Tyr Tyr Val Phe Phe Gln Leu Glu Leu Arg Arg Val Val Ala

530 535 540

Gly Glu Gly Ser Gly Ser Val Ser Leu Ala Leu His Leu Gln Pro Leu

545 550 555 560

Arg Ser Ala Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ala Leu Thr Val Asp Leu Pro

565 570 575

Pro Ala Ser Ser Glu Ala Arg Asn Ser Ala Phe Gly Phe Gln Gly Arg

580 585 590

Leu Leu His Leu Ser Ala Gly Gln Arg Leu Gly Val His Leu His Thr

595 600 605

Glu Ala Arg Ala Arg His Ala Trp Gln Leu Thr Gln Gly Ala Thr Val

610 615 620

Leu Gly Leu Phe Arg Val Thr Pro Glu Ile Pro Ala Gly Leu

625 630 635

<210> 102

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P1AA10776的第二融合多肽

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 103

<211> 451

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD19(8B8-2B11) Fc穴链

<400> 103

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Ile Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Gly Ser Lys Tyr Thr Glu Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Ser Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Tyr Tyr Tyr Gly Pro Gln Leu Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 104

<211> 219

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD19(8B8-2B11)轻链

<400> 104

Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Glu Thr Ser

20 25 30

Thr Gly Thr Thr Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Val Ser Lys Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 105

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CH1连接头

<400> 105

Glu Pro Lys Ser Cys

1 5

<210> 106

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 106

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 107

<211> 330

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 107

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

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210 215 220

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Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 108

<211> 326

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 108

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

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Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

115 120 125

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

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Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn

165 170 175

Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp

180 185 190

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro

195 200 205

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu

210 215 220

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225 230 235 240

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

245 250 255

Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

260 265 270

Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

275 280 285

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

290 295 300

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

305 310 315 320

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325

<210> 109

<211> 377

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 109

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

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Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg

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Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys

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Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

145 150 155 160

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

165 170 175

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

180 185 190

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Lys Trp Tyr

195 200 205

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

210 215 220

Gln Tyr Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

225 230 235 240

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

245 250 255

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln

260 265 270

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met

275 280 285

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

290 295 300

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Ser Gly Gln Pro Glu Asn Asn

305 310 315 320

Tyr Asn Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

325 330 335

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Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

370 375

<210> 110

<211> 327

<212> PRT

<213> 人（Homo sapiens）

<400> 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

1 5 10 15

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

65 70 75 80

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro

100 105 110

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

115 120 125

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

130 135 140

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

145 150 155 160

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

165 170 175

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

180 185 190

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

195 200 205

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210 215 220

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

225 230 235 240

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

245 250 255

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

260 265 270

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

275 280 285

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

290 295 300

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

305 310 315 320

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

325

Claims

1.一种含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其包含

-间隔物域是多肽且包含至少25个氨基酸残基,

2.权利要求1的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分包含抗体重链可变域且抗原结合域的第二部分包含抗体轻链可变域或反之。

3.权利要求1或2的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域的第一部分是抗体重链Fab片段且抗原结合域的第二部分是抗体轻链Fab片段或反之。

4.权利要求1至3任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段,抗体CH2域,和抗体CH3域或其片段。

5.权利要求1至4任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中第一融合多肽的间隔物域和第二融合多肽的间隔物域包含促进第一和第二融合多肽联合的修饰。

6.权利要求1至5任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中间隔物域包含抗体铰链区或其片段和IgG1 Fc域。

7.权利要求1至6任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中IgG1 Fc域包含氨基酸替代L234A,L235A和P329G(编号方式依照Kabat EU索引)。

8.权利要求1至7任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中TNF配体家族成员是4-1BBL。

9.权利要求1至8任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中TNF配体家族成员外域包含选自由SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2,SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8组成的组的氨基酸序列,特别是SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:5的氨基酸序列。

10.权利要求1至9任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域能够特异性结合肿瘤相关抗原。

11.权利要求1至10任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中抗原结合域能够特异性结合成纤维细胞激活蛋白(FAP)或CD19。

12.权利要求1至11任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合FAP的抗原结合域包含

(a)重链可变区(V_HFAP),其包含(i)包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列的CDR-H1,(ii)包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列的CDR-H2,和(iii)包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列的CDR-H3,和轻链可变区(V_LFAP),其包含(iv)包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列的CDR-L1,(v)包含SEQID NO:13的氨基酸序列的CDR-L2,和(vi)包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列的CDR-L3,或

13.权利要求1至14任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子,其中能够特异性结合CD19的抗原结合域包含

14.分离的核酸,其编码权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子。

15.一种宿主细胞,其包含权利要求14的核酸。

16.一种药学组合物,其包含权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子和药学可接受赋形剂。

17.权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或权利要求16的药学组合物,其用作药物。

18.权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或权利要求16的药学组合物,其用于治疗癌症。

19.权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或权利要求16的药学组合物在制造用于治疗癌症的药物中的用途。

20.一种治疗具有癌症的个体的方法,其包含对个体施用有效量的权利要求1至13任一项的含有TNF家族配体三聚体的抗原结合分子或权利要求16的药学组合物。