CN110475790A - 抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗体，该抗体即使在血中的分泌型IgM存在下，与B细胞表面的膜结合型IgM的结合活性也高，且对B细胞发挥增殖抑制效果。一种双特异性抗体，其与IgM和B细胞表面抗原结合。

Description

抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体
技术领域
本发明涉及与IgM和B细胞表面抗原结合的抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体及其利用。
背景技术
免疫球蛋白M(IgM)为抗体和与其具有结构或功能上的关联的蛋白质即免疫球蛋白类别的1种，其存在膜结合型和分泌型。膜结合型IgM作为B细胞受体在参与获得性免疫的主要的淋巴细胞即B细胞中特异表达，参与B细胞的存活与死亡。如果抗原与B细胞受体结合，则B细胞增殖，其一部分分化为浆细胞，浆细胞分泌大量分泌型IgM。分泌型IgM形成5或6聚体，在血中大量存在(0.4～2.8mg/ml)，有助于免疫的早期应答。
已知针对IgM的抗IgM单克隆抗体，在体外(in vitro)，抑制B细胞肿瘤细胞株的细胞增殖，诱导凋亡(非专利文献1、2和3)。
使用抗体的癌治疗，在进入21世纪后伴随利用基因工程的人源化、改性抗体等技术的进步，作为有效的治疗方法被接受。近年，多种抗体医药上市，也促进了新的抗体医药的开发。其中，以癌为直接靶向的抗体医药，将多种多样的抗原作为靶向抗原，作为通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性作用(antibody dependent cell-mediated cytotoxicity：ADCC)、补体依赖性细胞毒性(complement dependent cytotoxicity：CDC)、生长信号转导抑制、抗体药物复合物的药物引起的细胞毒活性的作用机理显示抗肿瘤效果的分子靶向药是有用的。
另一方面，有表达膜结合型IgM的B细胞肿瘤预后不良的报告(非专利文献4和5)，推测膜结合型IgM可成为治疗的靶。但是，目前为止，抗IgM单克隆抗体作为B细胞肿瘤的治疗药没有实现实用化。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1:Carey,G.B.,et al.,Cell Res.,17(11)：942-955,2007.
非专利文献2:Besnault,L.,et al.,J.Immunol.,167(2)：733-740,2001.
非专利文献3:Mongini,P.A.,et al.,Blood,92(10)：3756-3771,1998.
非专利文献4:Miyazaki,K.,et al.,Br.J.Haematol.,142(4)：562-570,2008.
非专利文献5:Cutrona,G.,et al.,ABSSUB-4465,19th Congress of theEuropean Hematology Association,2014.
发明内容
以往的抗IgM单克隆抗体，在给予活体时，与血中大量存在的分泌型IgM结合而最终被中和，不能说与表达膜结合型IgM的B细胞的结合性是充分的。因此，为了在分泌型IgM存在下与表达膜结合型IgM的B细胞结合而发挥增殖抑制效果，必须大量给予抗IgM单克隆抗体。
因此，本发明的课题在于提供一种抗体，该抗体即使在血中的分泌型IgM存在下，也与B细胞表面的膜结合型IgM结合，与该B细胞的结合活性高，并且对该B细胞发挥增殖抑制效果。
因此，本发明人等为了制备与B细胞表面的膜结合型IgM的结合活性高的抗体进行各种研究，结果发现针对IgM和B细胞表面抗原的双特异性抗体，即使在大量的分泌型IgM的存在下，也与B细胞表面的膜结合型IgM结合，与该B细胞的结合活性高，并且对该B细胞显示优异的细胞增殖抑制效果，从而完成本发明。
即，本发明为提供以下〔1〕～〔15〕的发明。
〔1〕一种双特异性抗体，其与IgM和B细胞表面抗原结合。
〔2〕根据〔1〕记载的双特异性抗体，其中，含有与上述IgM结合的第一抗原结合部位、以及与上述B细胞表面抗原结合的第二抗原结合部位。
〔3〕根据〔1〕或〔2〕记载的双特异性抗体，其中，上述B细胞表面抗原选自HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受体、BCMA和TACI。
〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项记载的双特异性抗体，其为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
〔5〕根据〔1〕～〔4〕中任一项记载的双特异性抗体，其中，抗体的可变区含有下述(a)～(f)的重链CDR1～3和轻链CDR1～3以及下述(g)～(l)的重链CDR1～3和轻链CDR1～3。
(a)由选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列、与选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1
(b)由选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列、与选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2
(c)由选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列、与选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3
(d)由选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列、与选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1
(e)由选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列、与选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2
(f)由选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列、与选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3
(g)由选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列、与选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1
(h)由选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列、与选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2
(i)由选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列、与选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3
(j)由选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列、与选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1
(k)由选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列、与选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2
(l)由选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列、与选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3
〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项记载的双特异性抗体，其抑制B细胞的增殖。
〔7〕一种医药组合物，其特征在于，含有〔1〕～〔6〕中任一项记载的双特异性抗体。
〔8〕一种B细胞相关疾病治疗剂，其特征在于，含有〔1〕～〔6〕中任一项记载的双特异性抗体作为有效成分。
〔9〕根据〔8〕记载的B细胞相关疾病治疗剂，其中，上述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
〔10〕〔1〕～〔6〕中任一项记载的双特异性抗体在制造B细胞相关疾病治疗剂中的使用。
〔11〕根据〔10〕记载的使用，其中，上述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
〔12〕根据〔1〕～〔6〕中任一项记载的双特异性抗体，其用于B细胞相关疾病的治疗。
〔13〕根据〔12〕记载的双特异性抗体，其中，上述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
〔14〕一种B细胞相关疾病的治疗方法，其特征在于，给予有效量的〔1〕～〔6〕中任一项记载的双特异性抗体。
〔15〕根据〔14〕记载的B细胞相关疾病治疗方法，其中，上述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
本发明的抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体，具有以下特征，即，即使在大量的分泌型IgM存在下，也与B细胞表面的膜结合型IgM结合，与该B细胞的结合活性高。另外，副作用少。因此，将本发明的双特异性抗体给予B细胞相关疾病、特别是B细胞肿瘤患者时，不会被血中的分泌型IgM中和，与靶向的B细胞表面的膜结合型IgM结合，能够对该B细胞发挥细胞增殖抑制活性。即，能够发挥B细胞肿瘤增殖抑制活性。因此，也可以避免伴随大量给予抗体的患者负担、医疗费增大等问题。
附图说明
图1为表示HH细胞膜表面上的IgM分子数和HLA-DR分子数的图表。
图2为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)和抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体与IgM和HLA-DR的结合性的图表。纵轴表示平均荧光强度(MFI)，横轴表示抗体浓度。
图3为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图4为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM抗体(1)与抗HLA-DR抗体(1)的并用、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图5为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图6为表示人血清非存在下(左侧图表)或存在下(右侧图表)的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示细胞生存率。
图7为表示抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图8为表示抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(2)、抗IgM(1)/CD20(2)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图9为表示抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图10为表示人血清非存在下(左侧图表)或存在下(右侧图表)的抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示细胞生存率。
图11为表示抗IgM抗体(1)、抗CD52抗体、抗IgM(1)/CD52双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图12为表示在分泌型IgM非存在下(各左侧的图)或存在下(各右侧的图)抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照对JeKo-1细胞的细胞周期的影响的图。
图13为表示在人血清非存在下(各左侧的图)或存在下(各右侧的图)抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照对JeKo-1细胞的细胞周期的影响的图。
图14为表示抗IgM抗体、抗HLA-DR抗体(1)和抗IgM/HLA-DR(1)双特异性抗体对大鼠B细胞数量的影响的图。
图15为表示抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对猴血中B细胞数量的影响的图。
图16为表示抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对猴血中T细胞数量的影响的图。
图17为表示抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对猴血中红细胞数量的影响的图。
图18为表示抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对猴血中血小板数量的影响的图。
图19为表示抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对猴体温的影响的图。
图20为表示抗IgM抗体(2)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(2)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图21为表示抗IgM抗体(3)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(3)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图22为表示抗IgM抗体(4)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(4)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图23为表示抗IgM抗体(5)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(5)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图24为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(2)、抗IgM(1)/HLA-DR(2)双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图25为表示抗IgM抗体(1)、抗CD38抗体、抗IgM(1)/CD38双特异性抗体和阴性对照抗体对B104细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图26为表示抗IgM抗体(1)、抗CD81抗体、抗IgM(1)/CD81双特异性抗体和阴性对照抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的图表。纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示添加于培养基的分泌型IgM浓度。
图27为表示抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用的图表。纵轴表示凋亡诱导率。
图28为表示抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(2)、抗IgM(1)/CD20(2)双特异性抗体和阴性对照抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用的图表。纵轴表示凋亡诱导率。
图29为表示抗IgM抗体(1)、抗CD38抗体、抗IgM(1)/CD38双特异性抗体和阴性对照抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用的图表。纵轴表示凋亡诱导率。
具体实施方式
本说明书中，“双特异性抗体”是指能够与不同的抗原结合的具有至少2个抗原结合部位的单克隆抗体。具体而言，“双特异性抗体”，例如，是指由第一抗体的重链可变区和第一抗体的轻链可变区形成的第一抗原结合部位以及由第二抗体的重链可变区和第二抗体的轻链可变区形成的第二抗原结合部位至少各含有1个，且具有识别不同的二种抗原的能力的蛋白质。
作为双特异性抗体的形式，没有特别限定，可以为本技术领域中公知的形式的任意一个，只要保持对二种抗原的特异性则也可以为除此以外的形式。双特异性抗体的形式被分类为IgG样型和低分子型。IgG样型为保持Fc区域的形式。作为IgG样型抗体的形式，不限定于这些，可举出CrossMab、DAF(two-in-one)、DAF(four-in-one)、DutaMab、DT-IgG、knobs-into-holes、knobs-into-holes common LC、SEEDbody、Triomab、κλ-body、DVD-Ig、IgG-scFv、DuoBody等。IgG样型抗体中，由于保持Fc区域，因此可期待ADCC、CDC的效应功能的发挥、精制的容易化、稳定性的改善、血中半衰期的延长。另一方面，低分子型为通常以由重链可变区和轻链可变区构成的Fv区域为基本构成要素的形式。作为低分子型抗体的形式，不限定于这些，可举出Diabody(Db)、BiTE、DART、TandAb、scDb、triple body、miniantibody、minibody、scFv、tandem scFv、F(ab’)2、亮氨酸拉链等。低分子型中，因为其大小，可期待组织透过性的提高、生产率的提高。此外，也包含在保持与抗原的结合能力状态下使氨基酸序列缺失、取代或添加而得到的抗体，糖链的一部分或全部缺失或添加而得到的抗体、添加接头序列等而得到的抗体、与其它蛋白质融合而得到的抗体、介由接头序列使抗体和低分子医药品结合而得的抗体药物复合物(ADC)等改性抗体。本发明的抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体(以下，也简称为本发明的双特异性抗体)的形式，考虑使用目的、制造的容易性等进行适当选择即可，从对B细胞的细胞毒活性的观点出发，优选保持Fc区域。
本发明的双特异性抗体，其特征在于，含有与IgM结合的第一抗原结合部位、以及与B细胞表面抗原结合的第二抗原结合部位。
在此，IgM是指免疫球蛋白M。IgM来源的动物种类没有特别限定，例如，可举出人，猴、小鼠、大鼠、兔子、山羊等非人动物，其中优选为人。对IgM的第一特异性优选通过来自针对IgM的抗体的部位表达，更优选通过来自针对IgM的抗体的重链和轻链的可变区的部位表达，进一步优选通过由针对IgM的抗体的重链和轻链可变区形成的抗原结合部位表达。
另一方面，B细胞表面抗原为膜结合型IgM以外的在B细胞表面表达的抗原即可，没有特别限定，优选为罹患B细胞相关疾病的活体的B细胞中表达的抗原，进一步优选为罹患B细胞肿瘤的活体的B细胞中表达的抗原。B细胞表面抗原来源的动物种类，没有特别限定，例如，可举出人，猴、小鼠、大鼠、兔子、山羊等非人动物，其中优选为人。作为B细胞表面抗原，具体而言，可举出HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP、CD5、CD10、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD28、CD32b、CD37、CD38、CD40、CD43、CD45RA、CD45RO、CD52、CD53、CD54、CD72、CD73、CD74、CDw75、CDw76、CD77、CDw78、CD79a、CD79b、CD80、CD81、CD82、CD83、CDw84、CD85、CD86、CD138、CD272、BAFF受体、BCMA、TACI、PD-1等，优选为HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受体、BCMA和TACI，更优选为HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52和CD81，进一步优选为HLA-DR、CD20、CD38、CD52和CD81。对B细胞表面抗原的第二特异性，优选通过来自针对B细胞表面抗原的抗体的部位表达，更优选通过来自针对B细胞表面抗原的抗体的重链和轻链可变区的部位表达，进一步优选通过由针对B细胞表面抗原的抗体的重链和轻链可变区形成的抗原结合部位表达。
具体而言，本发明的双特异性抗体含有以下多肽：含有具有第一特异性的抗IgM抗体的重链可变区的多肽、含有该抗IgM抗体的轻链可变区的多肽、含有具有第二特异性的抗B细胞表面抗原抗体的重链可变区的多肽和含有该抗B细胞表面抗原抗体的轻链可变区的多肽。更具体而言，含有以下多肽：含有具有第一特异性的抗IgM抗体的重链可变区的互补性决定区域(CDR)的多肽、含有该抗IgM抗体的轻链可变区的CDR的多肽、含有具有第二特异性的抗B细胞表面抗原抗体的重链可变区的CDR的多肽和含有该抗B细胞表面抗原抗体的轻链可变区的CDR的多肽。
CDR为抗体间序列有很大差异的可变区内的序列，重链可变区和轻链可变区分别具有3个CDR，将这些CDR组合形成抗原结合部位，决定抗原特异性。CDR通过Kabat(参照Kabat，E.A.，et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5thedition，Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.，1991.)的序列比较进行定义。如Kabat定义的那样，重链CDR1位于重链可变区的31～35残基附近，重链CDR2位于50～65残基附近，重链CDR3位于95～102残基附近，轻链CDR1位于轻链可变区的24～34残基附近，轻链CDR2位于50～56残基附近，轻链CDR3位于89～97残基附近。
本发明的双特异性抗体中，作为有助于针对IgM的第一特异性的CDR，例如，可举出下述(a)～(f)所示的重链CDR1～CDR3和轻链CDR1～CDR3。
(a)由选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列、与选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1、
(b)由选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列、与选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2、
(c)由选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列、与选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3、
(d)由选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列、与选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1、
(e)由选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列、与选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2、
(f)由选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列、与选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
另外，本发明的双特异性抗体中，作为有助于针对B细胞表面抗原的第二特异性的CDR，例如，可举出下述(g)～(l)所示的重链CDR1～CDR3和轻链CDR1～CDR3。
(g)由选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列、与选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1、
(h)由选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列、与选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2、
(i)由选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列、与选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3、
(j)由选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列、与选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1、
(k)由选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列、与选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2、
(l)由选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列、与选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
作为具有上述(a)～(l)的CDR的双特异性抗体的合适的具体例，可例示后述实施例所示的、具有由表1记载的序列号的氨基酸序列构成的CDR的抗IgM/HLA-DR双特异性抗体、抗IgM/CD20双特异性抗体、抗IgM/CD32b双特异性抗体、抗IgM/CD37双特异性抗体、抗IgM/CD38双特异性抗体、抗IgM/CD52双特异性抗体、抗IgM/CD81双特异性抗体和抗IgM/BCMA双特异性抗体、抗IgM/BAFF受体双特异性抗体和抗IgM/TACI双特异性抗体，但是不限定于这些。
[表1]
[表1]
各数字表示序列号
上述(a)～(1)中，氨基酸序列的同一性为85％以上，优选为90％以上，更优选为95％以上，进一步优选为98％以上。另外，上述氨基酸的缺失、取代或添加的数量优选为1～10个，更优选为1～5个，进一步优选为1～3个。由与序列号1～53和60～101中任一项所示的氨基酸序列或由FDY构成的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列构成的CDR、由序列号1～53和60～101中任一项所示的氨基酸序列或由FDY构成的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的CDR，可使用部位特异变异导入法、随机变异导入法、链替换法、CDR走行法(CDR walking)等公知方法制作。
氨基酸序列的同一性是指对2个氨基酸序列进行序列比对时，两者的序列中相同氨基酸残基存在的位置的数量相对于全长氨基酸残基数量的比例(％)。例如，使用基于采用了遗传信息处理软件GENETYX的Lipman-Pearson法(Lipman，D.J.and Pearson，W.R.，Science，227(4693)：1435-1441，1985.)的同源性解析(Search homology)程序，以参数Unit Size to compare为2进行计算。
“氨基酸”以其最大的含义使用，不仅包括天然氨基酸，也包括氨基酸变异体和衍生物这样的非天然氨基酸。本领域技术人员会考虑该广义定义，作为本说明书中的氨基酸，例如，可举出天然蛋白原性L-氨基酸；D-氨基酸；氨基酸变异体和衍生物等进行化学修饰的氨基酸；正亮氨酸、β-丙氨酸、鸟氨酸等天然非蛋白原性氨基酸；以及具有氨基酸的特征即该技术领域公知特性的化学合成的化合物等。作为非天然氨基酸的示例，可举出α-甲基氨基酸(α-甲基丙氨酸等)、D-氨基酸、组氨酸样氨基酸(2-氨基-组氨酸、β-羟基-组氨酸、高组氨酸(Homohistidine)、α-氟甲基-组氨酸和α-甲基-组氨酸等)、侧链具有多余的亚甲基的氨基酸(“高”氨基酸)和侧链中的羧酸官能团氨基酸被磺酸基取代的氨基酸(磺基丙氨酸等)。
本发明的双特异性抗体也包括加入了糖链添加等修饰的抗体。作为上述抗体，例如，可举出Fc区域结合1个以上N-结合型糖链且不对该N-结合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺结合岩藻糖的抗体。已知可对N-结合型糖链的还原末端的N-乙酰葡糖胺结合岩藻糖，但是在不结合该岩藻糖的情形下，与结合的情形相比ADCC显著上升。另外，本发明的双特异性抗体也包括将IgG1的CH2区域和CH3区域分别替换为IgG3的CH2区域和CH3区域的IgG1/IgG3嵌合抗体这一改性抗体。已知该抗体的补体结合力比IgG1和IgG3强，具有高的CDC。通过这些细胞毒活性的提高，在使用抗体作为医药时可期待减少给予量、减轻副作用的效果，以及治疗费的减少。
本发明的双特异性抗体的免疫球蛋白类别没有特别限定，可以为IgG、IgM、IgA、IgE、IgD、IgY中任意一个免疫球蛋白类别，考虑到精制的容易性等，优选为IgG。另外，本发明的双特异性抗体也包含任意的同型(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的抗体。
本发明的双特异性抗体，可以为非人动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体中的任意一个。作为非人动物的抗体，例如，可举出猴、小鼠、大鼠、兔子、山羊等的抗体，优选为小鼠的抗体。
在此，“嵌合抗体”是以使来源于非人动物且与抗原特异结合的抗体的恒定区具有与人的抗体相同的恒定区的方式进行基因工程改性而得到的抗体，优选为使小鼠抗体的可变区与人抗体的恒定区连接得到的嵌合抗体。另外，“人源化抗体”是将来源于非人动物且与抗原特异结合的抗体的重链和轻链的CDR以外的一级结构基因工程改性为与人的抗体对应的一级结构的抗体。另外，“人抗体”是指完全是来自人的抗体基因的表达产物的抗体。
对本发明的双特异性抗体提供第一特异性的抗体和提供第二特异性的抗体可以为公知的抗体，也可以通过本技术领域中公知的任意的方法制备。
如果是多克隆抗体，则以皮下和腹腔内等适当的途径向小鼠等动物的体内多次注射免疫原和根据需要的佐剂，由此在动物的体内生成抗体，由免疫的动物分离含有抗体的抗血清，使用ELISA、免疫印痕法(Western Blot)、或放射免疫测定等本技术领域中公知的方法，对于具有期望的特异性的抗体的存在进行筛选，从而得到多克隆抗体。作为免疫原，可以使用IgM、B细胞表面抗原蛋白质、它们的部分肽、它们的稳定表达细胞等。
另一方面，如果是单克隆抗体，则使用Kohler，G.and Milstein，C.，Nature，256(5517)：495-497，1975.最初记载的杂交瘤法实质上能够从均质的抗体的总体获得。具体而言，从免疫的动物采取脾细胞，使其与骨髓瘤细胞融合，制作产生单克隆抗体的杂交瘤细胞由此能够获得。使用ELISA、免疫印痕法、或放射免疫测定等本技术领域中公知的方法，选择产生识别目标蛋白质的抗体的杂交瘤细胞。克隆分泌期望抗体的杂交瘤，在适当条件下培养，回收分泌的抗体，可使用本技术领域中公知的方法例如离子交换柱、亲和色谱等进行精制。或者，也可通过重组DNA法(美国专利第4816567号说明书)制备单克隆抗体。
编码抗体或其含有的可变区等各区域的核酸，本领域技术人员可利用公知的方法取得，并确定其碱基序列。例如，该核酸可使用能够与文献记载的编码重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针、或者引物，通过杂交或者聚合酶链式反应(PCR)分离得到。产生上述单克隆抗体的杂交瘤细胞可作为这样的方法中的DNA的供给源使用。应予说明，“核酸”的化学结构和取得途径没有特别限制，例如，包括gDNA、cDNA、化学合成DNA和mRNA等。
将分离的DNA导入表达载体中。接着通过将其转染至适当的宿主细胞，在该重组宿主细胞中能够表达单克隆抗体或其含有的区域。
在此，“表达载体”为DNA(通常为双链)的片段，该DNA可使外源DNA的片段***该DNA中。外源DNA被定义为异源DNA，其为对象宿主细胞中在天然情况下未发现的DNA。载体可用于将外源DNA或异源DNA导入适当的宿主细胞。一旦进入宿主细胞中，则载体与宿主染色体DNA能够独立地复制，随后能够生成载体和***其中的外源DNA的若干拷贝。此外，载体含有能够将外源DNA翻译为多肽所必需的元件。因此，可迅速生物合成由外源DNA编码的多肽的多个分子。
这样的载体是指含有与适当的控制序列按照其发挥功能(即，可使外源DNA编码的蛋白质表达的方式)的方式进行连接而成的DNA序列以便于在适当的宿主中使表达DNA序列编码的蛋白质的DNA构建物。作为这样的控制序列，可举出用于转录的启动子、用于控制这样的转录的任意的操纵子序列、编码适当的mRNA核糖体结合部位的序列、增强子、多腺苷酸化序列、和控制转录或翻译的结束的序列等。进而载体可根据需要适当含有本领域技术人员公知的各种序列，例如限制性内切酶切断部位、耐药性基因等标记物基因(选择基因)、信号序列、前导序列等。这些各种序列或要素，本领域技术人员可根据外源DNA的种类、使用的宿主细胞、培养基等条件适当选择使用。
该载体可以为质粒、噬菌体粒子、或者单纯对宿主基因组的***体等任意的形式。一旦利用转化将其导入适当的宿主中，该载体与宿主的基因组能够独立进行复制和发挥功能。或者，也可以将该载体导入宿主基因组中。
PCR反应可通过该领域公知的方法或者与其实质相同的方法、改变方法进行，例如，可通过Saiki，R.K.，et al.，Science，230(4732)：1350-1354，1985.；Saiki，R.K.，etal.，Science，239(4839)：487-491，1988.；Erlich，H.A.，ed.，PCR Technology，StocktonPress，New York，NY.，1989.；Glover，D.M.and Hames，B.D.，ed.，DNA Cloning，2ndedition，Vol.1，The Practical Approach Series，IRL Press，Oxford，UK，1995.；Innis，M.A.，et al.，ed.，PCR Protocols，Academic Press，New York，NY.，1990.；McPherson，M.J.，et al.，ed.，PCR，IRL Press，Oxford，UK，1991.；FrohmanM.A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，85(23)，8998-9002，1988.等记载的方法或者对其进行改变的方法实施。另外，PCR法可使用适合于PCR法的市售的试剂盒进行，可按照试剂盒制造商或者试剂盒售卖者提供的说明书实施。
关于杂交，可将Grossman，L.，et al.，ed.，Methods in Enzymology，Vol.29，Nucleic Acids and Protein Synthesis，Part E，Academic Press，New York，NY.，1974.等作为参考。DNA等核酸的序列决定，例如可将Sanger，F.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74(12)：5463-5467，1977.等作为参考。另外通常的重组DNA技术，可将Sambrook，J.，et al.，ed.，Molecular Cloning，2nd edition，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.，1989.和Glover，D.M.and Hames，B.D.，ed.，DNACloning，2nd edition.，Vol.1to 4，The Practical Approach Series，IRLPress，Oxford，UK，1995.等参考。
编码如此取得的抗体或其含有的各区域的核酸，可根据目的，通过本领域技术人员公知的手段进行适当改性，以使其编码期望的肽或氨基酸。如此对DNA进行基因改性或修饰的技术，在McPherson，M.J.，ed.，Mutagenesis，IRL Press，Oxford，UK，1991.中记载有综述，例如，可举出位置指定变异导入法(部位特异变异导入法)、盒式诱变和PCR变异生成法。
在此，核酸的“改性”是在指得到的原始核酸中，在编码氨基酸残基的至少一个密码子中进行碱基的***、缺失或取代。例如，存在以下方法：通过将编码原始氨基酸残基的密码子替换为编码其它氨基酸残基的密码子从而对构成多肽的氨基酸序列自身进行改性。或者，不改变氨基酸自身，使用宿主细胞具有的密码子(最适密码子)，也可以对核酸进行改性。通过如此改性为最适密码子，可实现宿主细胞内的多肽的表达效率等的提高。
作为宿主细胞可使用本领域技术人员公知的任意的细胞，例如，作为代表性的宿主细胞，可举出大肠杆菌(E.coli)等原核细胞、以及中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、来自人的细胞等哺乳动物细胞、酵母、昆虫细胞等真核细胞。
由这样的宿主细胞的表达等得到的抗体分子，通常以分泌的多肽的形式可由培养基回收，但是在不具有分泌信号产生该抗体的情况下，可由宿主细胞溶解物回收。
抗体分子的精制操作可适当组合本领域技术人员公知的任意的方法而进行。例如，可通过离心分离、羟基磷灰石色谱、凝胶电泳、透析、在离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、利用二氧化硅的色谱、肝素琼脂糖色谱、阴离子或阳离子树脂色谱(聚天冬氨酸柱等)、色谱聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和亲和色谱适当精制。
对本发明的双特异性抗体提供第一特异性的抗体和提供第二特异性的抗体可以是由非人动物例如小鼠的抗体的重链、轻链可变区和人抗体的重链、轻链的恒定区构成的嵌合抗体。这样的抗体，例如可通过将编码小鼠抗体的可变区的DNA和编码人抗体的恒定区的DNA连接，将其装入表达载体而导入宿主使其产生抗体而得到。
或者，该抗体可以是将非人动物例如小鼠的抗体重链、轻链的CDR移植于人抗体的CDR得到的人源化抗体。该人源化抗体也被称为重构(reshaped)人抗体，已知其常见的基因重组方法。具体而言，利用PCR法由以末端部具有重叠的部分的方式制作的多个寡聚核苷酸合成按照将小鼠抗体的CDR和人抗体的框架区域(FR)连接的方式进行设计的DNA序列。可通过以下方式得到，即，将得到的DNA与编码人抗体恒定区的DNA连接，接着装入表达载体，将其导入宿主使其产生抗体(欧州专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO96/02576)。介由CDR连接的人抗体的FR选自CDR形成良好的抗原结合部位的FR。根据需要，也可以以重构人抗体的CDR形成适当的抗原结合部位的方式置换抗体可变区的FR的氨基酸(Sato，K.et al.，Cancer Res.，53(4)，851-856，1993.)。
或者，该抗体也可以为人抗体。人抗体例如可通过以下方式得到：在体外(invitro)利用期望的抗原或表达期望的抗原的细胞将人淋巴细胞敏化，使敏化淋巴细胞与人骨髓瘤细胞融合，筛选对抗原具有结合活性的期望的人抗体(特公平1-59878)。另外，利用期望的抗原对具有人抗体基因全部的组库(repertoire)的转基因动物进行免疫，由此也可取得期望的人抗体(WO93/12227，WO92/03918，WO94/02602，WO94/25585，WO96/34096，WO96/33735)。此外，也已知使用人抗体文库，利用选淘法(Panning)取得人抗体的技术。例如，以人抗体的可变区为单链抗体(scFv)通过噬菌体显示法使其在噬菌体的表面表达，可选择与抗原结合的噬菌体。如果解析选择的噬菌体的基因，则可决定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果明确了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可制作装有该序列的适当的表达载体，取得人抗体。这些方法已经是公知的，可将WO92/01047，WO92/20791，WO93/06213，WO93/11236，WO93/19172，WO95/01438，WO95/15388作为参考。此外，利用链替换法(chain shuffling)可制作高亲和性(nM数量级的范围)的人抗体(Marks，J.D.，et al.，Bio/Technol.，10(7)：779-783，1992.)。作为用于构建非常大的噬菌体文库的方法，也已知联合感染(combinatorial infection)和体内重组(Waterhouse，P.，et al.，Nuc.AcidsRes.，21(9)：2265-2266，1993.)等。
对本发明的双特异性抗体提供第一特异性的抗体和提供第二特异性的抗体的组合可以为非人动物的抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体的任意的组合。
本发明的双特异性抗体可按照该技术领域公知的各种方法制作。作为IgG样型双特异性抗体的制作方法，例如可举出使产生单克隆抗体的2种杂交瘤融合，由产生的抗体精制目的抗体的四源杂交瘤法(Milestein，C.and Cuello，A.C.，Nature，305(5934)：537-540，1983.等)；基于以下化学合成的方法，即，在将2种抗体的铰链区的二硫键还原后，为防止同种中的重缔合进行化学处理，利用交联剂使其结合从而得到目的双特异性抗体的化学合成(Nitta，T.，et al.，Lancet，335(8686)：368-371，1990.)；利用以下基因重组技术的方法，即，将具有第一特异性的抗体重链基因、轻链的基因、具有第二特异性的抗体的重链基因、和轻链基因导入细胞使其共表达而得到目的抗体的基因重组技术等。在利用基因重组技术的方法中，收集4种仅含有1种基因的载体，或收集2种含有重链基因和轻链基因的载体，转染至适当的宿主细胞，由此可在该重组宿主细胞中使双特异性抗体表达。应予说明，双特异性抗体的产生、精制等按照上述的抗体的产生、精制等进行加即可。
但是，在四源杂交瘤法或使4种基因共表达的方法中，来自对IgM具有第一特异性的抗体的重链和轻链缔合，来自对B细胞表面抗原具有第二特异性的抗体的重链和轻链缔合，它们的重链彼此缔合形成具有目的结构的抗体，除此以外，最终还产生来源不同的重链和轻链缔合形成的抗体、或者来源相同的重链彼此缔合形成的抗体等合计10种的抗体分子。此时，为了得到目的抗体，需要复杂的精制操作，抗体产量也不充分。
因此，双特异性抗体的制造方法中，可应用容易进行精制的技术。作为上述技术，例如已知以下方法，即，如果来自小鼠和大鼠的重链和轻链共存，则不产生不同物种之间的缔合，利用来自小鼠的IgG2的重链与蛋白A结合而来自大鼠的IgG2与蛋白A基本不结合的特性，使用蛋白A柱精制目的抗体的方法(WO98/050431)。或者，也可利用以下方法，即，利用IgG1和IgG3的蛋白A结合能力的差异高效精制目的抗体的方法。
另外，也可应用促进来源不同的重链间的异源缔合的技术。作为上述技术，例如，已知以下方法，即，将一方重链的CH3区域的氨基酸替换为大的氨基酸(knob变异)，将另一方的重链的CH3区域的对应氨基酸替换为立体互补的小的氨基酸(hole变异)，由此促进重链间的异源缔合的方法(Ridgway，J.B.，et al.，Protein Eng.，9(7)：617-621，1996)。也已知以下方法，即，在重链的CH3区域的界面导入带电变异，促进重链间的异源缔合，另一方面通过电荷排斥抑制同源缔合的方法(Gunasekaran，K.，et al.，J.Biol.Chem.，285(25)：19637-19646，2010.)。或者，也已知以下方法，即，通过将IgG和IgA的CH3区域的β股(β-strand)部分相互组合，从而促进重链间的异源缔合的方法(Davis，J.H.，et al.，ProteinEng.Des.Sel.，23(4)：195-202，2010.)。
另外，也可应用避免来源不同的重链和轻链间的缔合的技术。作为上述技术，例如，已知利用噬菌体显示法选择与来源不同的重链能够共同缔合的轻链的方法(Merchant，A.M.，et al.，Nat.Biotechnol.，16(7)：677-681，1998)。也已知以下方法，即，交换重链CH1区域和来源相同的轻链CL区域，促进来源相同的重链和轻链缔合的方法(Schaefer，W.，etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，108(27)：11187-11192，2011.)。也已知以下方法，即，利用2种不同的宿主细胞使由1个重链和1个轻链构成的抗体的构成要素表达，将其进行精制，在体外(in vitro)进行组装制造双特异性抗体的方法(Jackman，J.，et al.，J.Biol.Chem.285(7)：20850-20859，2010)。另外，也已知以下方法，即，在重链和轻链之间导入非天然型二硫键，高效制造具有重链和轻链的特定组合的抗体的方法(WO2014/069647)。
这些公知的技术可单独使用，也可将2种以上技术组合使用。另外，这些公知的技术也可以分别应用于2种重链。
本发明的低分子型双特异性抗体的制作中，作为基本构成单元大多使用利用接头序列将重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)结合而形成的单链Fv(scFv)。该scFv中的VL和VH的配置可以是以下中的任一种：N-末端侧为VL，对其配置接头序列，继而与VH配置(VL-Linker-VH构建体)；N-末端侧为VH，对其配置接头序列，继而与VL配置(VH-Linker-VL构建体)。通过使2种scFv共表达，可得到作为双体(diabody)已知的双特异性抗体(Holliger，P.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90(14)：6444-6448，1993.)。关于双体以外的形式的低分子型双特异性抗体，也可通过各个该技术领域公知的方法制作。
本发明的双特异性抗体与存在于B细胞表面的膜结合型IgM结合，与该B细胞的结合活性高，如后述实施例记载所示，即使在大量分泌型IgM存在下，也会通过使表面表达IgM的B细胞的细胞周期停止，从而对该B细胞显示优异的细胞增殖抑制活性。另外，本发明的双特异性抗体，如后述实施例记载所示，对该B细胞显示优异的凋亡诱导作用。已知抗IgM抗体对B细胞肿瘤细胞株诱导凋亡，但是本发明的双特异性抗体的凋亡诱导作用，出乎意料地，与对双特异性抗体提供第一特异性的抗IgM抗体和提供第二特异性的抗B细胞表面抗原抗体的各自的凋亡诱导作用相比显著增强。而且，本发明的双特异性抗体的副作用少。
本发明中，抗体和抗原的结合活性可利用ELISA、流式细胞术方法、表面等离子体共振(SPR)法等公知方法测定。使用ELISA时，例如，将抗原固定于板，向板添加本发明的双特异性抗体使其反应后，使利用辣根过氧化物酶(HRP)等酶标记的抗IgG抗体等二次抗体反应，添加显色底物(例如TMB显色底物)测定吸光度即可。使用流式细胞术方法时，例如，使本发明的双特异性抗体与未标记的评价对象(例如，可以指包括个体、器官、组织、细胞或它们的片段等的生物试样)结合后，使其与荧光色素结合二次抗体反应，或者对本发明的双特异性抗体直接标记荧光色素(例如，Alexa Fluor647)，利用流式细胞仪检测荧光即可。另外，如果使用SPR法，则可更详细地测定抗体和抗原的结合活性。例如，使用BIAcore***，将抗原固定于感应器芯片，将含有本发明的双特异性抗体的溶液向感应器芯片表面供给一定时间，然后供给缓冲液，监测本发明的双特异性抗体和抗原的结合与解离，可算出结合速度常数(ka)、解离速度常数(kd)和解离常数(KD＝kd/ka)。KD为亲和性的指标，KD越小抗体对抗原的亲和性越强。或者，也可利用结合常数(KA＝1/KD)表示亲和性。
本发明的双特异性抗体，例如，优选以10-6M以下、10-7M以下、10-8M以下、10-9以下、10-10M以下、或10-11M以下的KD与B细胞结合。
本发明中，“细胞周期的停止”是指细胞周期的进行在G1期停止。细胞周期可利用常规方法，例如通过利用流式细胞仪测定细胞的DNA量进行解析。
另外，本发明中，“细胞增殖抑制活性”是指对细胞表面表达IgM的B细胞给予本发明的双特异性抗体，由此可抑制该B细胞的增殖。更具体而言，细胞增殖抑制活性可利用后述的实施例4的式(1)求出。
此外，本发明中，“凋亡诱导作用”是指对细胞诱导细胞自身主动引起的细胞死亡的作用。如果诱导凋亡，则细胞缩小，产生细胞核的凝聚和DNA的片段化，最终变为凋亡小体而被巨噬细胞等吞噬。凋亡诱导作用可利用常规方法，例如通过检测细胞膜的结构变化、细胞核的凝聚和DNA的片段化、Caspase活性等进行评价。
如上述所示，本发明的双特异性抗体对B细胞表面存在的膜结合型IgM的结合性高，对该B细胞显示优异的细胞增殖抑制活性。因此，本发明的双特异性抗体作为B细胞相关疾病的预防治疗剂是有用的。作为B细胞相关疾病，可举出自身免疫性疾病、炎症性疾病、过敏性疾病、移植物抗宿主疾病、B细胞肿瘤等。作为自身免疫性疾病，可举出多发性硬化症、类风湿性关节炎、***性红斑狼疮、牛皮癣、皮炎、***性硬皮病和硬化症、与炎症性肠病相关的反应、克隆病、溃疡性结肠炎、呼吸困难综合症、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、皮炎、脑膜炎、脑炎、葡萄膜炎、结肠炎、肾小球肾炎、过敏引起的症状、湿疹、哮喘、与T细胞的浸润相关的症状和慢性炎症反应、动脉粥样硬化、白细胞粘附缺陷病、真性糖尿病、雷诺综合症、自身免疫性甲状腺炎、过敏性脑脊髓炎、修格兰(Sjorgen)综合症、幼年型糖尿病、与由T淋巴细胞和细胞因子介导的急性和迟发性高血压相关的免疫反应、结核、结节病、多发性肌炎、肉芽肿病、血管炎、恶性贫血(爱迪生氏病)、与白细胞渗出相关的疾病、中枢神经***(CNS)炎症疾病、多器官功能障碍综合征、溶血性贫血、重症肌无力、抗原-抗体复合物介导性疾病、抗肾小球基底膜病、抗磷脂综合征、过敏性神经炎、格雷夫斯病、Lambert-Eaton肌无力综合征、类天疱疮、天疱疮、自身免疫性多腺内分泌紊乱、Reiter综合征、stiff-man综合征、白塞病、巨细胞动脉炎、免疫复合物型肾炎、IgA肾病、IgM多发性神经障碍、慢性疲劳综合征、特发性血小板减少性紫癜(ITP)或自身免疫血小板减少病等。作为炎症性疾病，可举出2型糖尿病、牙周病等。作为过敏性疾病，可举出血型不合的输血引起的溶血性贫血、自己免疫性溶血性贫血、药剂性溶血性贫血、特发性血小板减少性紫癜、粒细胞减少症、Goodpasuture综合征、血清病、过敏性肺炎、过敏性支气管肺曲霉病、多发性硬化症、类风湿性关节炎、肾小球肾炎等。作为B细胞肿瘤，可举出前体B细胞肿瘤和成熟B细胞肿瘤。作为前体B细胞肿瘤，可举出B细胞急性淋巴性白血病/淋巴瘤。作为成熟B细胞肿瘤，可举出慢性淋巴性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、单克隆性B细胞淋巴细胞增加症、B细胞前淋巴细胞性白血病、脾边缘区淋巴瘤、毛细胞白血病、脾B细胞淋巴瘤/白血病、淋巴浆细胞性淋巴瘤、意义未明单克隆免疫球蛋白血症(MGUS)、μ重链病、γ重链病、α重链病、IgM型MGUS、IgG/IgA型MGUS、浆细胞瘤、骨孤立性浆细胞瘤、骨外浆细胞瘤、单克隆免疫球蛋白沉积病、粘膜相关淋巴组织类型的结外边缘区淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、结节性边缘区淋巴瘤、滤泡型淋巴瘤、儿童滤泡型淋巴瘤、伴IRF4易位的大B细胞淋巴瘤、原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、T细胞/组织细胞丰富的大B细胞淋巴瘤、中枢神经原发性DLBCL、皮肤原发性DLBCL、EBV阳性DLBCL、EBV阳性皮肤粘膜溃疡、伴慢性炎症的DLBCL、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、HHV8阳性DLBCL、伯基特淋巴瘤、伴11q异常的伯基特样淋巴瘤、伴MYC和BCL2和/或BCL6重构的高侵袭性B细胞淋巴瘤、高侵袭性B细胞淋巴瘤、介于DLBCL和经典的霍奇金淋巴瘤之间的不能分类的B细胞淋巴瘤等。这些B细胞相关疾病中，优选为成熟B细胞肿瘤，进一步优选为慢性淋巴性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤和DLBCL、浆细胞瘤，进一步优选为慢性淋巴性白血病/小淋巴细胞性淋巴瘤和DLBCL。
含有本发明的双特异性抗体的医药组合物是与本技术领域中公知的药学可接受的载体一起通过混合、溶解、乳化、封入胶囊、冷冻干燥等制剂化。
口服给药应用中，可制剂化为以下剂型，即，使有效量的本发明的双特异性抗体溶解于水、生理食盐水这样的稀释剂得到的液剂，以固体、颗粒含有有效量的本发明的双特异性抗体而得到的胶囊剂、颗粒剂、散剂或片剂，使有效量的本发明的双特异性抗体混悬于适当的分散介质中得到的混悬液剂、使溶解有效量的本发明的双特异性抗体的溶液在适当的分散介质中分散乳化得到的乳剂等。
非口服给药应用中，可将本发明的双特异性抗体与药学可接受的溶剂、赋型剂、结合剂、稳定剂、分散剂等一起制剂化为注射用溶液、混悬液、乳剂、乳膏剂、软膏剂、吸入剂、栓剂等剂型。注射用处方中，可使本发明的双特异性抗体溶解于水性溶液，优选为Hanks溶液、林格溶液、或生理食盐缓冲液等适合生理学的缓冲液中。此外，本发明的医药组合物在油性或水性的载体中，可以采取混悬液、溶液、或乳浊液等形状。或者，可以以粉体的形式制造本发明的双特异性抗体，使用前使用灭菌水等制备水溶液或混悬液。利用吸入的给药用途中，将本发明的双特异性抗体粉末化，可以与乳糖或淀粉等适当的基质一起制成粉末混合物。栓剂处方可以通过将本发明的双特异性抗体与可可脂等惯用的栓剂基质混合而制造。此外，可以将本发明的医药组合物封入聚合物基质等，作为缓释用制剂开出处方。
这些剂型中，优选的方式为注射剂，优选以非口服(例如，静脉内、经皮、皮内、腹腔内、肌内)的方式给药。
有效成分双特异性抗体的给药量可以根据患者的症状、给药途径、体重、年龄等适当设定，例如优选成人每日给药0.001～1000mg/kg，进一步优选给药0.01～100mg/kg。
本发明的医药组合物中除了本发明的双特异性抗体以外，也可以配合对B细胞相关疾病、优选为B细胞肿瘤的治疗有用的成分，例如化学治疗剂、其它抗体医药品等。
实施例
以下举出实施例对本发明做更详细地说明，但是本发明的技术范围不限定于这些实施例。
实施例1表达载体的构建
(1)与人源化抗IgM抗体(1)相关的表达载体的构建
人源化抗IgM抗体(1)重链和轻链可变区的基因，将已知的小鼠抗IgM抗体(GenBank登记号：L17037.1)作为参考，利用常规方法将小鼠框架区域(FR)替换为编码对应的人FR的碱基序列从而得到。表2中，将使用的重链互补性决定区域(CDR)的氨基酸序列示于序列号1～3，另外，将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号4～6。CDR依照Kabat的定义。
[表2]
[表2]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 TYWVN 1
重链CDR 2 RIDPYDSETLYNQKFKD 2
重链CDR 3 ETYDYPFAY 3
轻链CDR 1 KSSQSLLQSSNQKNYLA 4
轻链CDR 2 FASTRES 5
轻链CDR 3 QQHYSTPFT 6
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结公知的细胞外分泌信号序列(Haisma，H.J.，et al.，Blood，92(1)：184-190，1998.)，进而为了使克隆变得容易，在重链的分泌信号序列的上游部连结限制性内切酶KpnI识别序列，并且在可变区3’末端部以不使可变区和恒定区的接合部的氨基酸变异的方式连结限制性内切酶NheI识别序列。同样地，在轻链的分泌信号序列的上游部连结限制性内切酶Hind III识别序列，并且在可变区3’末端部连结限制性内切酶BsiWI识别序列。利用PCR法合成设计的重链和轻链可变区的基因，在克隆载体(p3T等)中克隆PCR产物后，确认碱基序列，选拔具有与设计的基因序列相同的碱基序列的克隆。
人源化抗IgM抗体(1)表达载体是将由***有重链可变区和轻链可变区基因片段的各克隆载体利用特异性限制性内切酶得到的基因片段顺次连结到WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因或潮霉素耐性基因、人源化抗人IgM抗体(1)基因。
(2)人型抗HLA-DR抗体(1)表达载体的构建
人型抗HLA-DR抗体(1)的重链和轻链可变区的基因，基于日本特开2005-325133的实施例12记载的抗体可变区碱基序列设计PCR引物，利用PCR法合成。在克隆载体(p3T等)中克隆PCR产物后，选拔具有与记载的基因序列相同的序列的克隆。表3中，将使用的抗体的重链CDR的氨基酸序列示于序列号7～9，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号10～12。
[表3]
[表3]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SNSASWN 7
重链CDR 2 RTYYRSKWYNDYAVSVKS 8
重链CDR 3 ENFYGSETCHKKYYCYGMDV 9
轻链CDR 1 RASOGISSALA 10
轻链CDR 2 DASSLES 11
轻链CDR 3 QQFNSFPLT 12
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与W02014/069647的实施例1记载的具有人K轻链恒定区基因和人IgGl重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因或嘌呤霉素耐性基因、人型抗HLA-DR抗体(1)基因。
(3)嵌合抗CD20抗体(1)表达载体的构建
嵌合抗CD20抗体(1)的重链和轻链可变区的基因，基于日本特表平8—503468的实施例II记载的抗体可变区碱基序列设计PCR引物，利用PCR法合成。在克隆载体(p3T等)中克隆PCR产物后，选拔具有与记载的基因序列相同的序列的克隆。表4中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号13～15，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号16～18。
[表4]
[表4]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SYNMH 13
重链CDR 2 AIYPGNGDTSYNQKFKG 14
重链CDR 3 STYYGGDWYFNV 15
轻链CDR 1 RASSSVSYIH 16
轻链CDR 2 ATSNLAS 17
轻链CDR 3 QQWTSNPPT 18
按照实施例1(1)在日本特表平8-503468的实施例IIA记载的含有分泌信号序列的重链和轻链可变区基因片段的5’末端部和3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗CD20抗体(1)基因。
(4)嵌合抗CD20抗体(2)表达载体的构建
按照常规方法，利用Ramos细胞(CRL-1596、American Type Culture Collection：ATCC)对BALB/c小鼠进行免疫，建立小鼠抗CD20抗体产生杂交瘤。Ramos细胞为来自人的伯基特淋巴瘤的细胞株，在细胞表面表达CD20、IgM、CD37。Ramos细胞使用Ramos细胞增殖培养基，在37℃、5％CO2条件下培养。Ramos细胞增殖培养基在RPMI1640(Life Technologies)中含有10％胎牛血清(FBS、Life Technologies)、1％青霉素-链霉素溶液(青霉素最终浓度：100units/mL、链霉素最终浓度：0.1mg/mL、Sigma-Aldrich)。由杂交瘤全部RNA合成cDNA，克隆抗体可变区基因。表5中，将取得的抗体的重链CDR的氨基酸序列示于序列号19～21，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号22～24。
[表5]
[表5]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SYNMH 19
重链CDR 2 AIYPGNGDTSYNQKFKG 20
重链CDR 3 AYYGSSYEWYFDV 21
轻链CDR 1 RASSSVRSMH 22
轻链CDR 2 ATSNLAS 23
轻链CDR 3 QQWSSNPPT 24
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗CD20抗体基因(2)。
(5)嵌合抗CD32b抗体表达载体的构建
嵌合抗CD32b抗体的重链和轻链可变区的基因将US2006/0073142A1的实施例1.0记载的抗体可变区的碱基序列作为参考得到。表6中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号25～26，另外，将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号27～29。应予说明，重链CDR3的氨基酸序列为FDY。
[表6]
[表6]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 DAWD 25
重链CDR 2 EIRSKPNNHATYYAESVKG 26
重链CDR 3 FDY
轻链CDR 1 RASQEISGYLS 27
轻链CDR 2 AASALDS 28
轻链CDR 3 LQYVSYPLT 29
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而，在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗CD32b抗体基因。
(6)嵌合抗CD37抗体表达载体的构建
利用常规方法，将Ramos细胞对BALB/c小鼠进行免疫，建立小鼠抗CD37抗体产生杂交瘤。由杂交瘤总RNA合成cDNA，克隆抗体可变区基因。表7中，将克隆的抗体的重链CDR的氨基酸序列示于序列号30～32，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号33～35。
[表7]
[表7]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 RYSVH 30
重链CDR 2 MIWGGGITDYNSALKS 31
重链CDR 3 PWGSSGPFAY 32
轻链CDR 1 RASGNIHNYLA 33
轻链CDR 2 NAKTLAD 34
轻链CDR 3 QHFWTTPLT 35
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗CD37抗体基因。
(7)人源化抗CD52抗体表达载体的构建
人源化抗CD52抗体的重链和轻链可变区的基因将日本特表平2-503514的实施例1记载的抗体可变区的碱基序列作为参考而取得。表8中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号36～38，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号39～41。
[表8]
[表8]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 DFYMN 36
重链CDR 2 FIRDKAKGYTTEYNPSVKG 37
重链CDR 3 EGHTAAPFDY 38
轻链CDR 1 KASQNIDKYLN 39
轻链CDR 2 NTNNLQT 40
轻链CDR 3 LQHISRPRT 41
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、人源化抗CD52抗体基因。
(8)人源化抗BAFF受体抗体表达载体的构建
取得人源化抗BAFF受体抗体的重链和轻链可变区的基因。在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、人源化抗BAFF受体抗体基因。
(9)嵌合抗BCMA抗体表达载体的构建
嵌合抗BCMA抗体的重链和轻链可变区的基因将日本专利第6061469号记载的C12A3.2的可变区的氨基酸序列作为参考而取得。表9中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号42～44，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号45～47。
[表9]
[表9]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 HYSMN 42
重链CDR 2 RINTESGVPIYADDFKG 43
重链CDR 3 DYLYSLDF 44
轻链CDR 1 RASESVTILGSHLIY 45
轻链CDR 2 LASNVQT 46
轻链CDR 3 LQSRTIPRT 47
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗BCMA抗体基因。
(10)嵌合抗TACI抗体表达载体的构建
取得嵌合抗TACI抗体的重链和轻链可变区的基因。在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗TACI抗体基因。
(11)嵌合抗IgM抗体表达载体的构建
利用常规方法，将WKAH/Hkm大鼠B细胞对BALB/c小鼠进行免疫，建立小鼠抗IgM抗体产生杂交瘤。由杂交瘤总RNA合成cDNA，克隆抗体可变区基因。表10中，将取得的抗体的重链CDR的氨基酸序列示于序列号48～50，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号51～53。
[表10]
[表10]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 NYGMN 48
重链CDR 2 WINTYSGEPTYADDFKG 49
重链CDR 3 ETTIFDY 50
轻链CDR 1 RTSDNIYSYLA 51
轻链CDR 2 NTQTLAK 52
轻链CDR 3 QHHYNTPYT 53
在来自小鼠抗IgM抗体的含有分泌信号序列的重链和轻链可变区基因片段的5’末端部和3’末端部按照实施例1(1)连结限制性内切酶识别序列。选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达用载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗IgM抗体基因。
(12)人源化抗EGFR抗体(阴性对照)表达载体的构建
人源化抗EGFR抗体(阴性对照)的重链和轻链可变区的基因将US5558864的实施例4记载的抗体可变区的碱基序列作为参考得到。表11中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号54～56，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号57～59。
[表11]
[表11]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SHWMH 54
重链CDR 2 EFNPSNGRTNYNEKFKS 55
重链CDR 3 RDYDYDGRYFDY 56
轻链CDR 1 SASSSVTYMY 57
轻链CDR 2 DTSNLAS 58
轻链CDR 3 QQWSSHIFT 59
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、人源化抗EGFR抗体基因。
(13)与嵌合抗IgM抗体相关的表达载体的构建
利用常规方法，将人IgM和猴IgM对BALB/c小鼠进行免疫，建立小鼠抗IgM抗体产生杂交瘤4株。由杂交瘤总RNA合成cDNA，克隆抗体可变区基因。表12中，将克隆的抗IgM抗体(2)的重链CDR的氨基酸序列示于序列号60～62，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号63～65。表13中，将克隆的抗IgM抗体(3)的重链CDR的氨基酸序列示于序列号66～68，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号69～71。表14中，将克隆的抗IgM抗体(4)的重链CDR的氨基酸序列示于序列号72～74，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号75～77。表15中，将克隆的抗IgM抗体(5)的重链CDR的氨基酸序列示于序列号78～80，另外，将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号81～83。
[表12]
[表12]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SFGMH 60
重链CDR 2 YISSGSNTIYYADTVKG 61
重链CDR 3 WTGRAMDY 62
轻链CDR 1 KASQDVGTAVG 63
轻链CDR 2 WASTRHT 64
轻链CDR 3 QQYSSYLYT 65
[表13]
[表13]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SYWIE 66
重链CDR 2 EILPGSGSTNYNEKFKG 67
重链CDR 3 QIGYYGLYYGMDY 68
轻链CDR 1 SASSSINYMH 69
轻链CDR 2 GTSNLAS 70
轻链CDR 3 QQRSSYPLT 71
[表14]
[表14]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SFGMH 72
重链CDR 2 YISSGSNTIYYADTVKG 73
重链CDR 3 WTGRAMDY 74
轻链CDR 1 KASQDVGTAVA 75
轻链CDR 2 WASTRHI 76
轻链CDR 3 HQYSSYLYT 77
[表15]
[表15]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SYVMH 78
重链CDR 2 YINPYNDDTKYNENFKG 79
重链CDR 3 VWSYYSAMDY 80
轻链CDR 1 RSSQSVLYSSNQKNYLA 81
轻链CDR 2 WASIRES 82
轻链CDR 3 HQYLSSWT 83
在得到的分泌信号序列、重链和轻链可变区基因片段的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、嵌合抗人IgM抗体(2)基因、嵌合抗人IgM抗体(3)基因、嵌合抗人IgM抗体(4)基因或嵌合抗人IgM抗体(5)基因。
(14)嵌合抗HLA-DR抗体(2)表达载体的构建
嵌合抗HLA-DR抗体(2)的重链和轻链可变区的基因基于US7612180的Fig1和Fig2记载的抗体可变区的碱基序列设计PCR引物，利用PCR法合成。在克隆载体(p3T等)中克隆PCR产物后，选拔具有与记载的基因序列相同的序列的克隆。表16中，将使用的抗体的重链CDR的氨基酸序列示于序列号84～86，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号87～89。
[表16]
[表16]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 NYGMN 84
重链CDR 2 WINTYTREPTYADDFKG 85
重链CDR 3 DITAVVPTGFDY 86
轻链CDR 1 RASENIYSNLA 87
轻链CDR 2 AASNLAD 88
轻链CDR 3 QHFWTTPWA 89
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人κ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因或嘌呤霉素耐性基因、嵌合抗HLA-DR抗体(2)基因。
(15)人源化抗CD38抗体表达载体的构建
人源化抗CD38抗体的重链和轻链可变区的基因将WO2012/092612记载的抗体可变区的碱基序列作为参考而取得。表17中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号90～92，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号93～95。
[表17]
[表17]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 DYGMS 90
重链CDR 2 DISWNGGKTHYVDSVKG 91
重链CDR 3 GSLFHDSSGFYFGH 92
轻链CDR 1 SGSSSNIGDNYVS 93
轻链CDR 2 RDSQRPS 94
轻链CDR 3 QSYDSSLSGSV 95
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人λ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、人源化抗CD38抗体基因。
(16)人源化抗CD81抗体表达载体的构建
人源化抗CD81抗体的重链和轻链可变区的基因将WO2012/077649记载的抗体可变区的碱基序列作为参考而取得。表18中，将重链CDR的氨基酸序列示于序列号96～98，另外将轻链CDR的氨基酸序列示于序列号99～101。
[表18]
[表18]
氨基酸序列 序列号
重链CDR 1 SNYMS 96
重链CDR 2 YISSSSTYTDYADSVKGRF 97
重链CDR 3 YSYGRDNFDY 98
轻链CDR 1 TGSTSNIGAGYDTH 99
轻链CDR 2 GNSNRPS 100
轻链CDR 3 QSYDTNLSVWV 101
在得到的重链和轻链可变区基因片段的上游部连结与实施例1(1)相同的细胞外分泌信号序列，进而在分泌信号序列的上游部和可变区3’末端部连结限制性内切酶识别序列。与实施例1(1)同样进行，选拔具有与目的基因序列相同的碱基序列的克隆后，利用特异性限制性内切酶切取重链和轻链可变区基因片段，与WO2014/069647的实施例1记载的具有人λ轻链恒定区基因和人IgG1重链恒定区基因的抗体表达载体顺次连结。连结的载体在动物细胞内表达新霉素耐性基因、人源化抗CD81抗体基因。
实施例2抗体的制造
(1)单克隆抗体的制造
使用293fectin(Life Technologies)将上述实施例1中制作的抗体表达载体基因导入到FreeStyle293-F细胞(Life Technologies)，或者使用ExpiFectamine(LifeTechnologies)将上述实施例1中制作的抗体表达载体基因导入到ExpiCHO细胞(LifeTtechnologies)。按照制造商说明书，在32～37℃、5～8％CO2条件下培养1～2周后，回收培养上清。使用HiTrap Protein A柱(GE Healthcare)由培养上清精制单克隆抗体。单克隆抗体相对于磷酸缓冲生理食盐水(PBS、pH7.0)进行透析后，在4℃保存至试验使用时。
(2)双特异性抗体的制造
(2-1)Cyslm型双特异性抗体的制造
按照WO2014/069647对上述实施例1中制作的抗体表达载体进行改性。具体而言，为了以蛋白A结合能力的差异为指标高效精制双特异性抗体，在抗IgM抗体(1)的重链中导入H435R和Y436F的变异，由人IgG1型替换为人IgG3型。另外，制备双特异性抗体时的抗IgM抗体(1)的组合对象为嵌合抗CD20抗体(1)时，为了将抗IgM抗体(1)的轻链-重链间的天然型二硫键失效，在轻链中添加C214S的变异，在重链中添加C220S的变异，为了导入非天然型二硫键，在轻链中添加S162C的变异，在重链中添加F170C的变异。组合对象为嵌合抗CD20抗体(1)以外的抗体时，将相同的变异导入对象一方。利用这些变异，可高效制造具有期望的轻链和重链的组合的抗体。同时将得到的抗IgM抗体(1)表达改性载体和抗B细胞表面抗原抗体表达改性载体进行基因导入至FreeStyle293-F细胞或ExpiCHO细胞。根据制造商说明书，在32～37℃、5％～8％CO2存在下培养1～2周后，回收培养上清。使用HiTrap Protein A柱(GE Healthcare)或ProSep-vA High Capacity柱(Merck Millipore)将培养上清精制后，利用CEX色谱分取双特异性抗体。分取使用强阳离子交换柱PL-SCX(Agilent、粒径：8μm、细孔径：)。流动相使用流动相A液(10mM MES、pH6.0)和流动相B液(500mM NaCl、10mM MES、pH6.0)。以流速1mL/min流通柱的5倍容量以上的初期流动相(98％A液、2％B液)预先使柱平衡化，向其注入精制的试样(0min)，使试样与柱电荷性结合。利用初期流动相清洗5分钟后，以B液的最终混合率变为40％的方式以每1分钟增加0.8％的线性梯度在47.5分钟内渐增。然后，立即将B液的混合率设为100％，清洗柱。在此期间，记录280nm的吸收，分取相当于双特异性抗体的保留时间的峰。取得的双特异性抗体相对于PBS(pH7.0)透析后，在4℃保存至试验使用时。
(2-2)Knobs-into-Holes(KIH)型双特异性抗体的制造
作为双特异性抗体的其它方式，按照US5731168A和Marchant，A.M.，et al.，Nat.Biotechnol.，16(7)：677-681，1998.将上述实施例1中制作的抗体表达载体改性。具体而言，在抗IgM抗体(1)的重链中添加T366W的变异，在成为抗IgM抗体(1)的组合对象的抗B细胞表面抗原抗体的重链中导入T366S、L368A、Y407V的变异。通过这些变异，可高效地制造具有期望的重链和重链的组合的抗体。此外，为了以蛋白A结合能力的差异为指标高效精制双特异性抗体，在抗B细胞表面抗原抗体的重链中导入H435R和Y436F的变异，由人IgG1型替换为人IgG3型。将得到的抗IgM抗体(1)表达改性载体和抗B细胞表面抗原抗体表达改性载体进行基因导入至FreeStyle293-F细胞或ExpiCHO细胞。按照制造商说明书，在32～37℃、5％～8％CO2存在下培养1～2周后，回收培养上清。导入有抗IgM抗体(1)表达改性载体的细胞的培养上清，使用HiTrap Protein A柱(GE Healthcare)精制后，相对于PBS(pH7.0)进行透析。导入有抗B细胞表面抗原抗体表达改性载体的细胞的培养上清使用HiTrap ProteinG柱(GE Healthcare)精制后，相对于PBS(pH7.0)进行透析。得到的抗IgM抗体(1)和抗B细胞表面抗原抗体以1:1进行混合，向其添加终浓度20mM还原型谷胱甘肽(Wako)和2mM氧化型谷胱甘肽(Wako)，在25℃反应13～15小时。反应后，利用HiTrap Protein A柱将抗体精制，进而利用体积排阻色谱法(东曹，TSKgel G3000SWXL)分取双特异性抗体。流动相使用0.2MK2HPO4、0.25M KCl(pH7.0)。取得的双特异性抗体相对于PBS(pH7.0)进行透析后，在4℃保存至试验使用时。
(2-3)Cys1m型和KIH型双特异性抗体的制造
按照WO2014/069647将上述实施例1中制作的抗体表达载体进行改性。具体而言，为了以蛋白A结合能力的差异作为指标高效精制双特异性抗体，在与抗IgM抗体(2)～(5)组合的抗B细胞表面抗原抗体的重链中导入H435R和Y436F的变异，由人IgG1型替换为人IgG3型。为了制备双特异性抗体时的成为抗IgM抗体(2)～(5)的组合对象的抗B细胞表面抗原抗体中使轻链-重链间的天然型二硫键失效，在轻链中添加C214S的变异，在重链中添加C220S的变异，为了导入非天然型二硫键，在轻链中添加S162C的变异，在重链中添加F170C的变异(Cys1m型)。另外，按照US5731168A和Marchant，A.M.，et al.，Nat.Biotechnol.，16(7)：677-681，1998.对上述实施例1中制作的抗体表达载体实施改性。具体而言，在抗IgM抗体(2)～(5)的重链中添加T366W的变异，在成为抗IgM抗体(2)～(5)的组合对象的抗B细胞表面抗原抗体的重链中导入T366S、L368A、Y407V的变异(KIH型)。通过这些变异，可高效制造具有期望的轻链和重链的组合的抗体。同时将得到的抗IgM抗体(2)～(5)表达改性载体和抗B细胞表面抗原抗体表达改性载体进行基因导入至FreeStyle293-F细胞或ExpiCHO细胞。根据制造商说明书，在32～37℃、5％～8％CO2存在下培养1～2周后，回收培养上清。使用HiTrap Protein A柱(GE Healthcare)将培养上清精制后，利用CEX色谱分取双特异性抗体。分取使用强阳离子交换柱PL-SCX(Agilent、粒径：8μm、细孔径：)。流动相使用流动相A液(10mM MES、pH6.0)和流动相B液(500mM NaCl、10mM MES、pH6.0)。以流速1mL/min流通柱的5倍容量以上的初期流动相(98％A液、2％B液)预先使柱平衡化，向其注入精制的试样(0min)，使试样与柱电荷性结合。利用初期流动相清洗5分钟后，以B液的最终混合率变为40％的方式以每1分钟增加0.8％的线性梯度在47.5分钟内渐增。然后，立即将B液的混合率设为100％，清洗柱。在此期间，记录280nm的吸收，分取相当于双特异性抗体的保留时间的峰。取得的双特异性抗体相对于PBS(pH7.0)进行透析后，在4℃保存至试验使用时。
实施例3双特异性抗体的抗原结合能力的解析
(1)HH细胞膜表面上的IgM分子数和HLA-DR分子数的测定
为了确认制作的抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体具有对于HLA-DR和IgM的结合性，使用HH细胞。首先，研究HH细胞膜表面上存在的HLA-DR和IgM的分子数。由于HH细胞(CRL-2105、ATCC)为来源于人T细胞性淋巴瘤的细胞株，因此认为IgM不表达，另一方面，已知在细胞膜表面上表达HLA-DR。对于HH细胞，使用含有10％FBS、1％青霉素-链霉素溶液的RPMI1640在37℃、5％CO2条件下培养。
关于HLA-DR和IgM的分子数，使用QIF试剂盒(Dako)测定。具体而言，预先向播种有HH细胞的96孔板(2×105细胞/孔)添加小鼠抗HLA-DR抗体或者小鼠抗IgM抗体(20μg/mL)50μL，在冰上使其反应1小时。然后，利用200μL的含有5％FBS的PBS(5％FBS/PBS)清洗2次。接着，利用5％FBS/PBS将试剂盒附带的FITC标记抗小鼠IgG抗体稀释50倍，在各孔中每孔添加100μL。冰上使其反应45分钟后，利用200μL的5％FBS/PBS清洗2次，利用由PBS稀释的1％甲醛(关东化学)将HH细胞固定。固定的细胞使用流式细胞仪(FC500MPL、Beckman Coulter)和解析软件Cytomics MXP cytometer(Beckman Coulter)测定来自HH细胞的荧光。另外此时，按照附带的说明书，使用试剂盒附带的Setup beads和Calibration Beads制作校正曲线，算出HH细胞膜表面上的HLA-DR和IgM的分子数。将结果示于图1。纵轴表示每个细胞的分子数。
试验的结果，细胞膜表面上的IgM的分子数算出为-0.1×105分子/细胞，HLA-DR的分子数算出为4.4×105分子/细胞。根据使用来自人T细胞的HH细胞的本试验的结果，确认了HH细胞在细胞膜上表达HLA-DR，不表达IgM。
(2)抗IgM/HLA-DR双特异性抗体对于IgM和HLA-DR的结合
使用分泌型IgM和HH细胞确认了抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体与IgM和HLA-DR同时结合。HH细胞如实施例3(1)的实验所述，在细胞膜表面上表达HLA-DR，但是不表达IgM。
因此，使荧光标记的分泌型IgM和双特异性抗体与HH细胞反应时，如果双特异性抗体为杂二聚体，则HH细胞被荧光标记。因此，研究了使用该试验***制造的双特异性抗体与IgM和HLA-DR同时结合。
按照附带的说明书使用LYNX RAPID RPE ANTIBODY CONJUGATION KIT(BIO-RAD)对分泌型IgM(AbD Serotec)进行PE标记。由20μg/mL以公比3将抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体、抗HLA-DR抗体(1)或抗IgM抗体(1)稀释后，以体积比为1:1的方式分别向其添加2μg/mL的PE标记分泌型IgM，在室温静置30分钟。反应后，将该混合液添加至预先播种有HH细胞的96孔板(2×105细胞/孔)，在冰上反应1小时。继而，利用200μL的5％FBS/PBS清洗各孔3次后，利用由PBS稀释的1％甲醛液将细胞固定。使用流式细胞仪测定来自与固定的细胞结合的PE标记的荧光，使用Cytomics MXP cytometer进行解析。将结果示于图2。图的纵轴表示平均荧光强度(MFI)，横轴表示抗体浓度。
由于抗HLA-DR抗体(1)与HH细胞结合但不与分泌型IgM结合，因此检测不到荧光。另外，由于抗IgM抗体(1)与分泌型IgM结合但是不与HH细胞结合，因此HH细胞未进行PE标记，检测不到荧光。另一方面，如果制造的抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体形成目标杂合体，则与HH细胞结合的同时与PE标记分泌型IgM结合，应该能检测到PE标记的HH细胞。因此，使抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体、PE标记的分泌型IgM、HH细胞顺次反应，其结果可检测到PE标记的HH细胞。此外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的结合曲线是同等的，显示不存在制造方法的不同所引起的结合的差异。应予说明，虽然未示出数据，但是在仅存在HH细胞、仅对HH细胞进行分泌型IgM处理、仅对HH细胞进行抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体处理的情况下，均未检测到荧光。
根据以上结果可知，制造的Cys1m型和KIH型的抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体为目标杂二聚体，具有与IgM和HLA-DR同时结合的性质。
实施例4双特异性抗体的细胞增殖抑制作用
(1)将抗IgM抗体和抗HLA-DR抗体组合得到的双特异性抗体
(1-1)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用1
研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和作为阴性对照的抗EGFR抗体对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的变化。JeKo-1细胞(RL-3006、ATCC)为来自人套细胞淋巴瘤的细胞株，细胞表面表达IgM、HLA-DR和CD20。对于JeKo-1细胞，使用JeKo-1细胞增殖培养基，在37℃、5％CO2条件下培养。JeKo-1细胞增殖培养基在RPMI1640中含有20％FBS、1％青霉素-链霉素溶液。增殖抑制活性，由40μg/mL以公比3将利用JeKo-1细胞增殖培养基稀释的分泌型IgM和各抗体(1200ng/mL)以体积比1:1进行混合，在室温静置30分钟。向播种有预先混悬于培养基的JeKo-1细胞的96孔板(2×104细胞/孔)，以体积比为1:1的方式添加上述该混合液，在37℃、5％CO2的条件下培养72小时。此时，准备抗体未添加组和100％细胞死亡组(1％Tween80)。向各孔添加Cell Counting Kit-8(同仁化学研究所)10μL，在37℃、5％CO2的条件下进行3小时显色反应。然后，使用酶标仪(iMark、BIO-RAD)测定450nm的吸光度，利用以下式(1)，算出细胞增殖抑制活性(％)。
将结果示于图3。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。此外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
(1-2)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用2
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM抗体(1)和抗HLA-DR抗体(1)的并用、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的JeKo-1细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为300ng/mL，抗体的并用中抗IgM抗体(1)和抗HLA-DR抗体(1)分别添加300ng/mL(合计600ng/mL)。将结果示于图4。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
并用抗体时的增殖抑制活性，与抗IgM抗体(1)单独添加同样地伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
根据以上情形可知，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体与并用两亲抗体相比增殖抑制活性优异。
(1-3)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，使用B104细胞代替JeKo-1细胞，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体(100ng/mL)对B104细胞的增殖抑制活性的变化。B104细胞(JCRB0117、JCRB细胞库)为来自人的B细胞肿瘤的细胞株，细胞表面表达IgM、HLA-DR、CD20、CD38和CD52。B104细胞，使用B104细胞增殖培养基在37℃、5％CO2条件下培养。B104细胞增殖培养基是在RPMI1640中含有20％FBS、1％青霉素-链霉素溶液。另外，分泌型IgM的稀释使用B104细胞增殖培养基。将试验结果示于图5。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。另外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
分泌型IgM存在下的抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体的增殖抑制活性在JeKo-1细胞、B104细胞这2种细胞中可得到相同的结果，因此认为如果是表达IgM和HLA-DR这两者的细胞，则即使存在分泌型IgM，仍能够发挥抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体的增殖抑制活性。
(1-4)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(2)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(2)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为500ng/mL。将结果示于图20。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(2)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(2)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
(1-5)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(3)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(3)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的JeKo-1细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为500ng/mL。将结果示于图21。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(3)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(3)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
(1-6)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(4)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(4)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为500ng/mL。将结果示于图22。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(4)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(4)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
(1-7)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(5)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(5)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为500ng/mL。将结果示于图23。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(5)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(5)/HLA-DR(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
可知由于与抗B细胞表面抗原抗体组合的抗IgM抗体可得到与克隆无关的同样的结果，因此即使是任意的抗IgM抗体克隆，抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体在分泌型IgM存在下均具有增殖抑制活性。
(1-8)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR(2)抗体、抗IgM(1)/HLA-DR(2)双特异性抗体和阴性对照抗体的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，抗体浓度为500ng/mL。将结果示于图24。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即便分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/HLA-DR(2)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
可知由于与抗B细胞表面抗原抗体组合的抗HLA-DR抗体可得到与克隆无关的同样的结果，因此即使是任意的抗HLA-DR抗体克隆，抗IgM/HLA-DR双特异性抗体在分泌型IgM存在下均具有增殖抑制活性。
(1-9)人血清存在下的对JeKo-1细胞的增殖抑制活性
研究人血清存在下的抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体的对JeKo-1细胞的增殖抑制活性。具体而言，将由正常人受试者採取的血清在56℃处理30分钟。由此使其失活，另外抗体利用PBS以最终浓度的10倍浓度(100μg/mL)的方式制备。生存率的测定使用RealTime-Glo MT Cell Viability Assay(Promega)。试验时，以成为90％人血清/10％抗体液(抗体的最终浓度为10μg/mL)的方式，将人血清与抗体混合，人血清未添加组中为90％JeKo-1细胞增殖培养基/10％抗体液。向预先播种有JeKo-1细胞的96孔板(1.5×104细胞/孔)添加该混合液，进而按照说明书添加反应液10μL。在37℃、5％CO2条件下培养48小时后，使用酶标仪(GloMax Discover、GM3000、Promega)测定发光，利用以下式(2)将细胞生存率(％)数值化。
另外，显著差异检测使用Student’s t-test。将结果示于图6。图的纵轴表示细胞生存率。
在“没有血清”的条件中，抗IgM抗体(1)对B细胞肿瘤细胞显示增殖抑制活性，但是在“有血清”的条件中，抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性消失。另一方面，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体无论是否有无血清均显示增殖抑制活性。此外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
根据以上情形可知，抗IgM抗体在人血清中失去增殖抑制活性，但是如果为抗IgM/HLA-DR双特异性抗体则即使在血清中也维持活性。
应予说明，本试验在2人的人血清中实施试验，但是在两捐赠者的失活血清中也得到同等的结果，未发现捐赠者引起的差异。
(2)将抗IgM抗体和抗CD20抗体组合的双特异性抗体
(2-1)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用1
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体(300ng/mL)的JeKo-1细胞增殖抑制活性的变化。将结果示于图7。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。此外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，未发现制造方法的不同所引起的活性差异。
(2-2)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用2
研究将与实施例4(2-1)使用的抗CD20抗体(1)不同的克隆来源的抗CD20抗体(2)进行组合的双特异性抗体。按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(2)、抗IgM(1)/CD20(2)双特异性抗体和阴性对照抗体(1000ng/mL)对JeKo-1细胞的增殖抑制活性的变化。将结果示于图8。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示在培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD20(2)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
可知由于与抗IgM抗体组合的抗CD20抗体无论是抗CD20抗体(1)还是抗CD20抗体(2)均得到同样的结果，因此即使是任意的抗CD20抗体克隆，抗IgM/CD20双特异性抗在分泌型IgM存在下均具有增殖抑制活性。
(2-3)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体(1000ng/mL)对B104细胞的增殖抑制活性的变化。应予说明，B104细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用B104细胞增殖培养基。将结果示于图9。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。另外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
可知由于分泌型IgM存在下的抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体的增殖抑制活性在JeKo-1细胞、B104细胞这2种细胞中得到同样的结果，因此如果为膜表面表达IgM和CD20这两种抗原的细胞，则即使存在分泌型IgM，利用抗IgM/CD20双特异性抗体也可抑制增殖。
(2-4)人血清存在下的对JeKo-1细胞的增殖抑制活性
按照实施例4(1-9)，研究人血清存在下的抗IgM抗体(1)、抗CD20抗体(1)、抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体和阴性对照抗体(10μg/mL)对JeKo-1细胞的增殖抑制活性。将结果示于图10。显著差异检测使用Student’s t-test。图的纵轴表示生存率。
在“没有血清”的条件中，抗IgM抗体(1)对B细胞肿瘤细胞显示增殖抑制活性，但是在“有血清”的条件中，抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性消失。另一方面，抗IgM(1)/CD20(1)双特异性抗体无论血清的有无均显示增殖抑制活性。另外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的增殖抑制活性同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
根据以上情况可知，抗IgM抗体在人血清中失去增殖抑制活性，但是抗IgM/CD20双特异性抗体在血清中仍维持其活性。
本试验在2人的人血清中实施试验，但是在两捐赠者的失活血清中得到同等的结果，未发现捐赠者引起的不同。
(3)将抗IgM抗体和抗CD32b抗体组合的双特异性抗体
(3-1)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD32b抗体、抗IgM(1)/CD32b抗体和阴性对照抗体(300ng/mL)的JeKo-1细胞增殖抑制活性的变化。
其结果，抗IgM抗体(1)和抗IgM(1)/CD32b抗体的增殖抑制活性显示与实施例4(1-1)的结果相同的趋势。
(4)将抗IgM抗体和抗CD37抗体组合的双特异性抗体
(4-1)对Ramos细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD37抗体、抗IgM(1)/CD37双特异性抗体和阴性对照抗体(1000ng/mL)的Ramos细胞增殖抑制活性的变化。Ramos细胞在细胞表面表达IgM和CD37。应予说明，Ramos细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用Ramos细胞增殖培养基。
其结果，抗IgM抗体(1)和抗IgM(1)/CD37抗体的增殖抑制活性显示与实施例4(1-1)的结果相同的趋势。
(5)将抗IgM抗体和抗CD52抗体组合的双特异性抗体
(5-1)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD52抗体、抗IgM(1)/CD52双特异性抗体和阴性对照抗体(1000ng/mL)的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，B104细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用B104细胞增殖培养基。将结果示于图11。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD52双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
根据实施例4(1)～(5)的结果，提示本发明的抗IgM/B细胞表面抗原抗体无论B细胞表面抗原的种类如何，在分泌型IgM存在下对B细胞均显示细胞增殖抑制效果。
(6)将抗IgM抗体和抗BAFF受体抗体组合的双特异性抗体
(6-1)对Jeko-1细胞或B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体、抗BAFF受体抗体、抗IgM/BAFF受体双特异性抗体和阴性对照抗体的Jeko-1细胞或B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用该细胞的增殖培养基。
(7)将抗IgM抗体和抗BCMA抗体组合的双特异性抗体
(7-1)对Ramos细胞或B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体、抗BCMA抗体、抗IgM/BCMA双特异性抗体和阴性对照抗体的Ramos细胞或B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用该细胞的增殖培养基。
(8)将抗IgM抗体和抗TACI抗体组合的双特异性抗体
(8-1)对Jeko-1细胞或B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体、抗TACI抗体、抗IgM/TACI双特异性抗体和阴性对照抗体的Jeko-1细胞或B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用该细胞的增殖培养基。
(9)将抗IgM抗体和抗CD38抗体组合的双特异性抗体
(9-1)对B104细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD38抗体、抗IgM(1)/CD38双特异性抗体和阴性对照抗体(500ng/mL)的B104细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，B104细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用B104细胞增殖培养基。将结果示于图25。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD38双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
(10)将抗IgM抗体和抗CD81抗体组合的双特异性抗体
(10-1)对JeKo-1细胞的增殖抑制作用
按照实施例4(1-1)，研究分泌型IgM浓度上升所带来的抗IgM抗体(1)、抗CD81抗体、抗IgM(1)/CD81双特异性抗体和阴性对照抗体(500ng/mL)的JeKo-1细胞增殖抑制活性的变化。应予说明，JeKo-1细胞的培养和分泌型IgM的稀释使用JeKo-1细胞增殖培养基。将结果示于图26。图的纵轴表示增殖抑制活性，横轴表示培养基中添加的分泌型IgM浓度。
抗IgM抗体(1)的增殖抑制活性伴随分泌型IgM浓度上升而减弱。另一方面，即使分泌型IgM浓度上升，抗IgM(1)/CD81双特异性抗体仍维持增殖抑制活性。
此外根据实施例4(9)和(10)的结果，提示本发明的抗IgM/B细胞表面抗原抗体无论B细胞表面抗原的种类如何，在分泌型IgM存在下对B细胞均显示细胞增殖抑制效果。
实施例5双特异性抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用
(1)将抗IgM抗体和抗HLA-DR抗体组合的双特异性抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用
研究抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体和阴性对照抗体(1000ng/mL)对Ramos细胞的凋亡诱导效果。将预先混悬于培养基的Ramos细胞播种于6孔板(3.6×105细胞/孔)，在37℃、5％CO2条件下培养3小时。以最终浓度成为1000ng/ml的方式在各孔添加利用PBS将抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)、抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体或阴性对照抗体制备成1mg/ml的溶液，在37℃、5％CO2条件下进一步培养24小时。将利用离心分离回收的各细胞混悬于含有1％戊二醛的PBS，在4℃条件下孵育16小时。再次，利用离心分离回收各细胞后，混悬于40μL的PBS。
将10μL的细胞混悬液和2μL的1mM Hoechst33342(同仁化学研究所)混合后，在荧光显微镜下进行观察。将染色体结构凝聚·片段化的细胞判断为凋亡诱导细胞，计数随机选出的10个视野中的总细胞数和凋亡诱导细胞数。
将结果示于图27。显著差异检测使用Student’s t-test。图的纵轴表示诱导凋亡的细胞的比例。
抗IgM抗体(1)和抗HLA-DR抗体(1)的凋亡诱导率分别为6.0％和4.2％，载体和阴性抗体的凋亡诱导率分别为3.8％和4.3％。双特异性抗体为11.0％，其与任意的抗体相比也显示显著高的凋亡诱导率。
(2)将抗IgM抗体(1)和抗CD20(2)抗体组合的双特异性抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用
按照实施例5(1)，代替将抗IgM抗体(1)和抗HLA-DR抗体(1)组合的双特异性抗体而使用将抗IgM抗体(1)和抗CD20抗体(2)组合的双特异性抗体，研究凋亡诱导率。
将结果示于图28。图纵轴表示被诱导凋亡的细胞的比例。
抗IgM抗体(1)和抗CD20抗体(2)的凋亡诱导率分别为8.7％和7.9％，载体和阴性抗体的凋亡诱导率分别为3.5％和4.1％。另一方面，双特异性抗体为22.4％，与任意的抗体相比也显示显著高的凋亡诱导率。
(3)将抗IgM抗体和抗CD38抗体组合的双特异性抗体对Ramos细胞的凋亡诱导作用
按照实施例5(1)，代替将抗IgM抗体(1)和抗CD38抗体组合的双特异性抗体而使用将抗IgM抗体(1)和抗CD38抗体组合的双特异性抗体，研究凋亡诱导率。
将结果示于图29。图的纵轴表示总细胞中的被诱导凋亡的细胞的比例。
抗IgM抗体(1)和抗CD38抗体的凋亡诱导率分别为4.3％和1.4％，载体和阴性抗体的凋亡诱导率分别为1.3％和1.1％。另一方面，双特异性抗体为16.4％，与任意的抗体相比，也显示显著高的凋亡诱导率。
实施例6将抗IgM抗体和抗HLA-DR抗体组合的双特异性抗体的细胞周期停止作用
(1)分泌型IgM存在下的对JeKo-1细胞的细胞周期停止作用
研究在分泌型IgM存在下抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)和抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体对JeKo-1细胞的细胞周期的影响。具体而言，将利用JeKo-1细胞增殖培养基制备的各抗体(400ng/mL)与分泌型IgM(40μg/mL)以体积比1:1混合，在室温静置30分钟。然后，将预先混悬于培养基的JeKo-1细胞播种于6孔板(3×105细胞/孔)，向各孔以各抗体浓度成为100ng/mL添加各抗体，以及以分泌型IgM浓度成为10μg/mL的方式添加分泌型IgM，在37℃、5％CO2的条件下，培养24小时。阴性对照代替抗体液添加PBS。培养后，利用70％乙醇/PBS将细胞固定，利用碘化丙啶(Sigma-Aldrich)将DNA染色后使用流式细胞仪和解析软件Cytomics MXP cytometer进行细胞周期解析。将结果示于图12。各幻灯片的纵轴表示细胞数，横轴表示每个细胞的DNA含量。
抗HLA-DR抗体(1)与分泌型IgM的存在无关地不对JeKo-1细胞的细胞周期产生影响。抗IgM抗体(1)在分泌型IgM的非存在下使细胞周期停止，但是通过添加分泌型IgM则细胞周期停止作用消失。另一方面，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体与分泌型IgM的存在无关地使细胞周期在G1期停止。另外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的细胞周期停止作用同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
根据该结果，可知通过将抗IgM抗体与针对B细胞表面抗原的抗体制成双特异性抗体，即使在分泌型IgM存在下也使细胞周期停止。
(2)在人血清存在下的对JeKo-1细胞的细胞周期停止作用
按照实施例6(1)，代替分泌型IgM使用人血清，研究在人血清存在下抗IgM抗体(1)、抗HLA-DR抗体(1)和抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体(1μg/mL)对JeKo-1细胞的细胞周期的影响。具体而言，以成为90％人血清/10％抗体液(抗体的最终浓度为1μg/mL)的方式将人血清和抗体混合，添加于JeKo-1细胞。人血清未添加组为90％JeKo-1细胞增殖培养基/10％抗体液。另外，阴性对照，代替抗体液添加PBS。将结果示于图13。各图的纵轴表示细胞数，横轴表示每个细胞的DNA含量。
抗HLA-DR抗体(1)与人血清的存在无关地不对JeKo-1细胞的细胞周期产生影响。抗IgM抗体(1)在人血清非存在下使细胞周期停止，但是通过添加人血清则细胞周期停止作用消失。另一方面，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体与人血清的存在无关地使细胞周期在G1期停止。另外，Cys1m型双特异性抗体和KIH型双特异性抗体的细胞周期停止作用同等，显示不存在制造方法的不同所引起的活性差异。
根据该结果可知，通过将抗IgM抗体与针对B细胞表面抗原的抗体制成双特异性抗体，在人血清存在下也可使细胞周期停止。
应予说明，本试验在2人的人血清中实施试验，但是在两捐赠者的失活血清中得到相同的结果，未发现捐赠者引起的不同。
实施例7将抗IgM抗体和抗HLA-DR抗体组合的双特异性抗体的大鼠给药试验
(1)对大鼠的抗体给药所引起的B细胞减少作用
已知抗HLA-DR抗体(1)与WKAH/Hkm大鼠的B细胞结合。因此，研究抗IgM/HLA-DR(1)双特异性抗体对大鼠的作用。
从WKAH/Hkm大鼠的尾静脉给药抗IgM抗体(1、3、10、30mg/kg)、抗HLA-DR抗体(1)(0.1、0.3、1mg/kg)和抗IgM/HLA-DR(1)双特异性抗体(0.1、0.3、1、3、10、30mg/kg)。给药5小时后，由大鼠尾静脉采血。使其与PE标记抗大鼠CD45RA抗体(BD Pharmingen)反应后使用OptiLyse C(Beckman Coulter)进行溶血处理，使用流式细胞仪和解析软件Cytomics MXPcytometer计数血中的B细胞数。将代替抗体而给药PBS的个体的末梢血中B细胞数作为100％，算出各抗体给药后的末梢血B细胞数的变动。
将抗IgM/HLA-DR(1)双特异性抗体的给药对大鼠活体内的B细胞的影响示于图14。如果抗IgM抗体不给药10mg/kg以上则B细胞数不减少，然而如果是抗IgM/HLA-DR(1)双特异性抗体则在0.3mg/kg给药组中也会使B细胞数减少。抗HLA-DR抗体(1)在给药0.3mg/kg以上的个体中发现镇静、俯卧***等行动异常，进而在给药1mg/kg的个体中，由于严重的副作用无法采血。另外，如果是其以下的给药量则未发现B细胞的充分减少的效果。根据以上结果可知，即使是在大鼠活体内不能发挥抗IgM抗体的活性的低浓度，通过将抗IgM抗体与其它的针对B细胞表面抗原的抗体制成双特异性抗体，也会使B细胞数减少。另外，可知在大鼠活体内即使是低浓度也观察到严重副作用的抗B细胞抗原抗体，通过与抗IgM抗体制成双特异性抗体也可以抑制副作用的表达，使B细胞数减少。
实施例8将抗IgM抗体和抗HLA-DR抗体组合的双特异性抗体的猴给药试验
(1)对食蟹猴的抗体给药所引起的B细胞减少作用
对食蟹猴给药抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体，评价其有效性。向1只雌性食蟹猴的头静脉内给药抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体。给药按照以下方式进行，分别将相当于1、3、10、20mg/kg的抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体从低用量依次给药，每2日实施1次，合计4次进行给药。即将首次给药之前、以及各给药后24小时后，从大腿静脉采血。使APC标记抗CD20抗体(Biolegend)或Alexa Fluor 488标记抗CD3抗体(BD Biosciences)反应，使用流式细胞仪(FACS Calibur、BD Biosciences)和解析软件CellQuest Pro(Version6.0、BD Biosciences)计数B细胞数和T细胞数，与此同时，使用综合血液学检查装置(Siemens healthcare Diagnostics Manufacturing)计数红细胞和血小板数。将给药前的末梢血中的各血细胞数作为100％，算出各给药后的末梢血中的各血细胞数。另外，在整个给药时间观察猴的症状，并在试验结束后通过剖检观察异常的有无。
将结果示于图15-19。抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体通过1mg/kg给药，末梢血中的B细胞数减少约50％。此外该效果浓度依赖地增强，如果给药20mg/kg，则使末梢血中的B细胞消失至给药前的约2％(图15)。此外在抗体给药后制作的腋窝***的苏木精-伊红染色中，观察到***内的淋巴细胞占据的比例显著降低，观察到淋巴小结的萎缩和胚中心(Germinal center)的消失。另一方面，未观察到与B细胞同样在细胞膜表面表达HLA-DR的T细胞的抗体给药依赖性减少(图16)。另外，未观察到细胞膜表面不表达HLA-DR的红细胞和血小板也抗体给药依赖性减少(图17、图18)。此外体温在抗体给药后也没有变化，显示几乎恒定的值(图19)。未确认到认为抗体给药是原因的猴的异常的症状，根据剖检的结果也没有确认异常。
以上结果显示即使在血中存在分泌型IgM的食蟹猴活体内，抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体引起末梢血B细胞的枯竭，强烈提示该双特异性抗体不仅对B细胞肿瘤有效，对来自正常B细胞的B细胞相关疾病的治疗也是有效的。
关于作为抗IgM(1)/HLA-DR(1)双特异性抗体的亲抗体之一的抗HLA-DR抗体(1)，如实施例6所示，从0.3mg/kg开始发现对大鼠的副作用，此外在1mg/kg的给药中发现严重的副作用，可预见对食蟹猴同样也显示严重的副作用。但是，根据以上结果，即使是在食蟹猴活体内担心严重的副作用的抗B细胞抗原抗体，通过与抗IgM抗体制成双特异性抗体，即使使用更高的浓度，也显示出副作用的表达被抑制，使B细胞数减少。
根据实施例7和8的结果可知，抗IgM/B细胞表面抗原双特异性抗体具有对B细胞的优异的增殖抑制活性，并且从副作用角度也具有显著的效果。
序列表
<110> 全药工业株式会社
<120> 抗IgM／B细胞表面抗原双特异性抗体
<130> ZP0001
<150> JP 2017-060131
<151> 2017-03-24
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Arg Thr Ser Asp Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗鼠 IgM Ab 轻链 CDR2
<400> 52
Asn Thr Gln Thr Leu Ala Lys
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗鼠 IgM Ab 轻链 CDR3
<400> 53
Gln His His Tyr Asn Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 重链 CDR1
<400> 54
Ser His Trp Met His
1 5
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 重链 CDR2
<400> 55
Glu Phe Asn Pro Ser Asn Gly Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ser
<210> 56
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 重链 CDR3
<400> 56
Arg Asp Tyr Asp Tyr Asp Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 轻链 CDR1
<400> 57
Ser Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Met Tyr
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 轻链 CDR2
<400> 58
Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-EGFR Ab 轻链 CDR3
<400> 59
Gln Gln Trp Ser Ser His Ile Phe Thr
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 重链 CDR1
<400> 60
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 重链 CDR2
<400> 61
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 62
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 重链 CDR3
<400> 62
Trp Thr Gly Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 63
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 轻链 CDR1
<400> 63
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Gly
1 5 10
<210> 64
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 轻链 CDR2
<400> 64
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (2) 轻链 CDR3
<400> 65
Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 66
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 重链 CDR1
<400> 66
Ser Tyr Trp Ile Glu
1 5
<210> 67
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 重链 CDR2
<400> 67
Glu Ile Leu Pro Gly Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 68
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 重链 CDR3
<400> 68
Gln Ile Gly Tyr Tyr Gly Leu Tyr Tyr Gly Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 69
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 轻链 CDR1
<400> 69
Ser Ala Ser Ser Ser Ile Asn Tyr Met His
1 5 10
<210> 70
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 轻链 CDR2
<400> 70
Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 71
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (3) 轻链 CDR3
<400> 71
Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 72
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 重链 CDR1
<400> 72
Ser Phe Gly Met His
1 5
<210> 73
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 重链 CDR2
<400> 73
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Thr Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 74
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 重链 CDR3
<400> 74
Trp Thr Gly Arg Ala Met Asp Tyr
1 5
<210> 75
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 轻链 CDR1
<400> 75
Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 轻链 CDR2
<400> 76
Trp Ala Ser Thr Arg His Ile
1 5
<210> 77
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (4) 轻链 CDR3
<400> 77
His Gln Tyr Ser Ser Tyr Leu Tyr Thr
1 5
<210> 78
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 重链 CDR1
<400> 78
Ser Tyr Val Met His
1 5
<210> 79
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 重链 CDR2
<400> 79
Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 80
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 重链 CDR3
<400> 80
Val Trp Ser Tyr Tyr Ser Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 轻链 CDR1
<400> 81
Arg Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Ala
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 轻链 CDR2
<400> 82
Trp Ala Ser Ile Arg Glu Ser
1 5
<210> 83
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-IgM Ab (5) 轻链 CDR3
<400> 83
His Gln Tyr Leu Ser Ser Trp Thr
1 5
<210> 84
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 重链 CDR1
<400> 84
Asn Tyr Gly Met Asn
1 5
<210> 85
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 重链 CDR2
<400> 85
Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Arg Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 86
<211> 12
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 重链 CDR3
<400> 86
Asp Ile Thr Ala Val Val Pro Thr Gly Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 87
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 轻链 CDR1
<400> 87
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 88
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 轻链 CDR2
<400> 88
Ala Ala Ser Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 89
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-HLA-DR Ab (2) 轻链 CDR3
<400> 89
Gln His Phe Trp Thr Thr Pro Trp Ala
1 5
<210> 90
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 重链 CDR1
<400> 90
Asp Tyr Gly Met Ser
1 5
<210> 91
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 重链 CDR2
<400> 91
Asp Ile Ser Trp Asn Gly Gly Lys Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 92
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 重链 CDR3
<400> 92
Gly Ser Leu Phe His Asp Ser Ser Gly Phe Tyr Phe Gly His
1 5 10
<210> 93
<211> 13
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 轻链 CDR1
<400> 93
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asp Asn Tyr Val Ser
1 5 10
<210> 94
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 轻链 CDR2
<400> 94
Arg Asp Ser Gln Arg Pro Ser
1 5
<210> 95
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD38 Ab 轻链 CDR3
<400> 95
Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val
1 5 10
<210> 96
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 重链 CDR1
<400> 96
Ser Asn Tyr Met Ser
1 5
<210> 97
<211> 19
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 重链 CDR2
<400> 97
Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly Arg Phe
<210> 98
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 重链 CDR3
<400> 98
Tyr Ser Tyr Gly Arg Asp Asn Phe Asp Tyr
1 5 10
<210> 99
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 轻链 CDR1
<400> 99
Thr Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Thr His
1 5 10
<210> 100
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 轻链 CDR2
<400> 100
Gly Asn Ser Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 101
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗-CD81 Ab 轻链 CDR3
<400> 101
Gln Ser Tyr Asp Thr Asn Leu Ser Val Trp Val
1 5 10

Claims (15)

1.一种双特异性抗体，其与IgM和B细胞表面抗原结合。
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中，含有与所述IgM结合的第一抗原结合部位、以及与所述B细胞表面抗原结合的第二抗原结合部位。
3.根据权利要求1或2所述的双特异性抗体，其中，所述B细胞表面抗原选自HLA-DR、CD20、CD32b、CD37、CD38、CD52、CD81、BAFF受体、BCMA和TACI。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的双特异性抗体，其为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的双特异性抗体，其中，抗体的可变区含有下述(a)～(f)的重链CDR1～3和轻链CDR1～3以及下述(g)～(l)的重链CDR1～3和轻链CDR1～3，
(a)由选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列、与选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号1、48、60、66、72和78中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1，
(b)由选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列、与选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号2、49、61、67、73和79中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2，
(c)由选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列、与选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号3、50、62、68、74和80中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3，
(d)由选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列、与选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号4、51、63、69、75和81中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1，
(e)由选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列、与选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号5、52、64、70、76和82中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2，
(f)由选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列、与选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号6、53、65、71、77和83中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3，
(g)由选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列、与选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号7、13、19、25、30、36、42、84、90和96中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR1，
(h)由选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列、与选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号8、14、20、26、31、37、43、85、91和97中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR2，
(i)由选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列、与选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号9、15、21、FDY、32、38、44、86、92和98中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的重链CDR3，
(j)由选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列、与选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号10、16、22、27、33、39、45、87、93和99中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR1，
(k)由选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列、与选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号11、17、23、28、34、40、46、88、94和100中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR2，
(l)由选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列、与选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列具有85％以上的同一性的氨基酸序列、或者选自序列号12、18、24、29、35、41、47、89、95和101中的氨基酸序列中具有1个～多个氨基酸缺失、取代或添加的氨基酸序列构成的轻链CDR3。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的双特异性抗体，其抑制B细胞的增殖。
7.一种医药组合物，其特征在于，含有权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体。
8.一种B细胞相关疾病治疗剂，其特征在于，含有权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体作为有效成分。
9.根据权利要求8所述的B细胞相关疾病治疗剂，其中，所述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
10.权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体在制造B细胞相关疾病治疗剂中的使用。
11.根据权利要求10所述的使用，其中，所述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
12.根据权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体，其用于B细胞相关疾病的治疗。
13.根据权利要求12所述的双特异性抗体，其中，所述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
14.一种B细胞相关疾病的治疗方法，其特征在于，给予有效量的权利要求1～6中任一项所述的双特异性抗体。
15.根据权利要求14所述的B细胞相关疾病治疗方法，其中，所述B细胞相关疾病为B细胞肿瘤。
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