KR20220159426A - 감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포 - Google Patents

감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포 Download PDF

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KR20220159426A
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마이클 윌슨 레어드
샤람 마사기
에이미 쉔
안토니 톰린슨
인 후암 유크
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제넨테크, 인크.
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Abstract

본 발명은 관심 생성물, 예컨대, 재조합 단백질을 제조하는 방법, 세포 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 개선된 포유동물 세포를 제공하는데, 여기서 이러한 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포)는 특정 숙주 세포 단백질, 예를 들어, 특정 리파제, 에스테라제, 및/또는 하이드롤라제를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 효소의 감소 또는 제거된 활성, 예를 들어, 발현을 가진다.

Description

감소된 숙주 세포 단백질을 보유하는 변형된 포유동물 세포
관련된 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2020년 3월 26일에 출원된 미국 가출원 번호 63/000,464, 2020년 12월 21일에 출원된 미국 가출원 번호 63/128,419 및 2021년 3월 1일에 출원된 미국 가출원 번호 63/155,225의 이익을 주장하며, 이들 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
1. 발명의 분야
본 발명은 특정 숙주 세포 단백질, 예를 들어, 특정 리파제, 에스테라제 및 하이드롤라제를 포함하나 이에 제한되지 않는 숙주 세포 효소의 활성이 감소되거나 제거된 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 및/또는 이러한 세포의 제조 방법, 및 관심 생성물, 예를 들어, 재조합 단백질의 생산에 이러한 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
2. 배경
포유동물 세포, 예를 들어 CHO 세포는 세포 성장, 생존 및/또는 생산성에 필수적이지 않은 많은 단백질을 발현한다. 그러나 이러한 숙주 세포 단백질의 발현은 상당한 세포 에너지와 DNA/단백질 빌딩 블록을 소모한다. 이러한 단백질의 발현을 감소시키거나 제거하면 세포 성장을 보다 효율적이게 할 수 있다. 더욱이, 세포가 관심 생성물, 예를 들어 재조합 단백질의 생산을 위해 사용되는 상황에서, 이들 단백질 중 일부는 관심 생성물과 동시 정제될 수 있어서, 추가 정제 공정과 관련된 비용을 증가시키고 및/또는 생성된 생성물의 유통 기한을 감소시킨다. 예를 들어, 관심 생성물과 동시 정제되는 특정 잔류 숙주 세포 단백질은 최종 의약품에서 계면활성제로 사용되는 폴리소르베이트를 분해하여 입자 형성을 유발할 수 있다(Dixit 외, J Pharm Sci, 2016, Volume 105, Issue 5, 1657-1666 페이지). 따라서, 관심 생성물을 발현하는 세포에서 세포 성장, 생존 및/또는 생산성에 필수적이지 않은 특정 숙주 세포 단백질, 예를 들어, 특정 리파제, 에스테라제 및/또는 하이드롤라제를 비롯한(그러나 이에 제한되지 않음) 효소의 활성, 예를 들어, 발현이 감소 또는 제거된 경우, 관심 생성물, 예를 들어 재조합 단백질을 생산하기 위한 방법, 세포 및 조성물이 당업계에 필요하다. 예를 들어, mAb와 공동 정제된 후 의약품에서 폴리소르베이트를 분해하는 잔류 CHO 숙주 세포 단백질의 가수분해 활성을 감소시키기 위한 연구에 의해 지단백질 리파제(LPL)가 확인되었다. LPL이 녹아웃된 CHO 세포주는 야생형 대응물보다 폴리소르베이트 분해가 41-57% 적은 세포 배양 수확물을 생성했다(Chiu 외, Biotechnol Bioeng, 2017, Volume 114, Issue 5, 1006-1015 페이지). 이러한 효소의 발현을 줄이거나 제거함으로써 관련 효소 활성의 부정적인 영향(예: 잔류 하이드롤라제에 의한 의약품 내 폴리소르베이트의 가수분해)이 완화될 수 있다. 그러나 상기 연구는 세포 배양물 수확 단계에서 LPL 녹아웃에 대하여 관찰된 이점들이 하류 처리 전반에 걸쳐 유지되었는지 여부를 결정하지 못했다. 녹아웃 세포주에서 생성된 정제된 물질들을 테스트하여 정제 후의 이점들을 입증하고 이들을 의약품에서의 이점으로 전환하는 것이 중요하다.
3. 요약
본 발명은 특정 숙주 세포 단백질, 예를 들어, 특정 리파제, 에스테라제 및 하이드롤라제를 포함하나 이에 제한되지 않는 숙주 세포 효소의 활성이 감소되거나 제거된 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 및/또는 이러한 세포의 제조 방법, 및 관심 생성물, 예를 들어, 재조합 단백질의 생산에 이러한 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 이 세포는 변형되지 않은 세포 내 하나 이상의 효소의 활성에 비해 이러한 효소의 활성이 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 지단백질 리파제(LPL); 포스포리파제 B-도메인 함유 2(PLBL2/PLBD2); 리파제 A(리소좀산 리파제/콜레스테릴 에스테르 하이드롤라제, 리파제)(LIPA); 포스포리파제 A-2-활성화 단백질(PLAA); 포스포리파제 D3(PLD3); 포스포리파제 A2 그룹 XV(LPLA2); 포스포리파제 C 베타 1(PLCB1); 포스포리파제 C 델타 1(PLCD1); 단백질 1(단편)을 포함하는 DDHD 도메인(DDHD1); 라이소포스포리파제-유사 단백질 1(LYPLAL1); 포스포리파제 A2 그룹 XIIA(PLA2G12A); 퍼옥시레독신 6(PRDX6); 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(SMPD1); 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(PPT1); 이소아밀 아세테이트 가수분해 에스테라제 1(추정)(IAH1); OTU 데유비퀴티나제, 유비퀴틴 알데히드 결합 1(OTUB1); 라이소포스포리파제2(아실-단백질 티오에스테라제2)(LYPLA2); 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 13(ACOT13); 지방산 합성효소(FASN); 포스포리파제 A2 그룹 VII(PLA2G7); 유비퀴틴 특이적 펩티다제 5(USP5); N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(산 세라미다제)(ASAH1); 리파제 성숙 인자 1(LMF1); 아포지단백질-CII(APOC2); 아실카르니틴 하이드롤라제(HACH); 카르복실에스테라아제 1F(CES1F) 또는 간 카르복실에스테라아제 B-1-유사(CES-B1L); 라이소포스포리파제 1(LYPLA1); 카르복실에스테라제 1(CES1); 포스포리파제 A1 구성원 A(PLA1A); 및 시알산 아세틸에스테라제(SIAE).
특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포에서 다음: a) PPT1; b) LPLA2; LPL; 및 LIPA; c) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1; d) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A; e) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SPD1; f) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13; g) LPLA2; LPL; 및 PPT1; h) LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1; i) HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; j) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; k) SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; l) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; m) LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; n) LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; o) LMF1 및 APOC2의 활성이 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포에서 하나 이상의 효소의 활성은 (a) 효소의 발현을 녹다운; (b) 효소의 발현을 녹아웃; 또는 (c) 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 변경함으로써 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 검출가능한 효소 활성이 없다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태들에서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합된다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합되는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 변형된 세포는 검출가능한 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 발현하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 활성을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 활성이 감소된 세포들을 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하고, 그 결과 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; SIAE 중 하나 이상이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 관심 생성물을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 포유동물 세포는 관심 생성물을 발현하고 다음 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 여기서 포유동물 세포는 관심 생성물을 발현하고 다음: LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 코딩 영역의 파괴에 의해 변경된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 이중대립유전자 변경을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 1개 이상의 염기쌍, 2개 이상의 염기쌍, 3개 이상의 염기쌍, 4개 이상의 염기쌍, 5개 이상의 염기쌍, 6개 이상의 염기쌍, 7개 이상의 염기쌍, 8개 이상의 염기쌍, 9개 이상의 염기쌍, 10개 이상의 염기쌍, 11개 이상의 염기쌍, 12개 이상의 염기쌍, 13개 이상의 염기쌍, 14개 또는 더 많은 염기쌍, 15개 이상의 염기쌍, 16개 이상의 염기쌍, 17개 이상의 염기쌍, 18개 이상의 염기쌍, 19개 이상의 염기쌍, 또는 20개 이상의 염기쌍의 결실을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자는 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다.
전술한 특정 실시형태들에서, CRISPR/Cas9 시스템은 다음을 포함한다: (a) Cas9 분자, 및 (b) LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 인코딩하는 유전자 내 표적 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA).
전술한 특정 실시형태들에서, 유전자 조작 시스템은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA를 포함하고, 여기서 RNA는 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 유전자 중 하나 이상에 의해 발현되는 mRNA의 일부에 상보적이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템 또는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포에서 다음: a) PPT1; b) LPLA2; LPL; 및 LIPA; c) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1; d) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A; e) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SPD1; f) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13 또는 g) LPLA2; LPL; 및 PPT1; h) LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1; i) HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; j) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; k) SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; l) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; m) LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; n) LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; o) LMF1 및 APOC2의 활성이 감소 또는 제거된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 관심 생성물의 정제, 관심 생성물의 수확, 및/또는 관심 생성물의 제형화를 추가로 포함한다.
전술한 특정 실시형태들에서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트의 분해가 감소된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 폴리소르베이트 20(PS20 또는 Tween 20)의 분해가 감소된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 폴리소르베이트 80(PS80 또는 Tween 80)의 분해가 감소된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 세포는 포유동물 세포이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 세포는 관심 생성물을 발현한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코딩된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물이 단백질, 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체이다. 전술한 특정 실시형태들에서 항체는 단클론 항체이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, 및 LIPA도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, 및 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LMF1 및 APOC2도 발현하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, 및 LIPA 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, 및 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LMF1 및 APOC2의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2; LPL; LIPA 및 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LMF1 및 APOC2의 활성을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 BBAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, ? SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, 및 LIPA을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, 및 LIPA이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, 및 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며서, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며서, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LMF1 및 APOC2를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LMF1 및 APOC2가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LMF1 및 APOC2의 활성을 가진다.
특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LMF1 및 APOC2의 활성을 가진다.
4. 도면의 간단한 설명
도 1. 세 가지 다른 단클론 항체들의 정제 과정에서 다양한 단계에서 채취한 농축 샘플들에서 발견된 효소들을 보여주는 표이다.
도 2. 바탕 CHO 숙주 세포의 생성에 사용되는 다중 녹아웃(KO) 접근 방식.
도 3. 각 바탕 CHO 숙주들에서 조절되거나 녹아웃된 유전자들을 보여주는 표.
도 4A-4C. PLBL2 KO 세포는 모체 숙주 세포와 비교하여 유사하거나 더 우수한 역가를 갖는다. 누적 생존 세포 농도(IVCC)로 표현한 성장 속도가 도 4A에 도시되어 있다. PLBL2-KO 숙주 세포주들로부터 유래한 MAb-A 생산 풀들은 도 4B에 도시된 바와 같이 모체 숙주 세포에 비해 유사하거나 더 높은 역가를 가졌으며, 이는 도 4C에 도시된 바와 같이 더 높은 비 생산성(Qp)으로 인한 것이었다.
도 5A-5C. 3X KO 세포는 모체 숙주 세포와 비교하여 유사하거나 더 우수한 비 생산성(Qp)을 갖는다. 성장 속도는 도 5A에 도시되어 있다. 3X KO 숙주 세포주에서 유래된 MAb-B 생산 풀들은 도 5B에 도시되어 있다. mAb-B의 비 생산성(Qp)은 도 5C에 도시되어 있다.
도 6A-6C. 7X KO 바탕 숙주 성능. 누적 생존 세포 농도(IVCC)로 표현된 세포 성장이 도 6A에 도시되어 있다. 생존력 및 젖산 축적이 각각 도 6B 및 6C에 도시되어 있다.
도 7A-7C. 7X KO 숙주 세포에 의한 세 가지 다른 항체들의 생산. IVCC에 의해 발현되는 3가지 상이한 mAb를 발현하는 7X KO 숙주 세포의 성장은 도 7A에 도시되어 있다. 7X KO 숙주 세포들에 의해 발현되는 3가지 상이한 mAb의 역가는 도 7B에 도시되어 있다. mAb-B, mAb-C 및 mAb-D의 비 생산성(Qp)이 도 7C에 도시되어 있다.
도 8A-8C. 8X KO 및 Bax Bak KO 바탕 숙주 성능. 누적 생존 세포 농도(IVCC)로 표현된 세포 성장이 도 8A에 도시되어 있다. 생존력 및 젖산 축적이 각각 도 8B 및 8C에 도시되어 있다.
도 9A-9C. 3X, 7X 및 12X KO 바탕 숙주 성능. 누적 생존 세포 농도(IVCC)로 표현된 세포 성장이 도 9A에 도시되어 있다. 생존력 및 젖산 축적이 각각 도 9B 및 9C에 도시되어 있다.
도 10A-10C. 7X KO 숙주 세포 클론에 의한 mAb-2의 생산. 평균 D10 역가가 도 10A에 도시되어 있다. 평균 D10 IVCC가 도 10B에 도시되어 있다. 평균 D10 Qp가 도 10C에 도시되어 있다.
도 11A-11C. 7X KO 숙주 세포 클론에 의한 mAb-1의 생산. 역가가 도 11A에 도시되어 있다. IVCC가 도 11B에 도시되어 있다. Qp가 도 11C에 도시되어 있다.
도 12. PS20 분해. 낮은 PS20 분해는 7X KO mAb-B 생성 RMCE 풀에서 관찰되었다.
도 13A-13K. 다음과 같은 정제된 효소에 대한 SDS PAGE: a. PPT1; b. ASAH1; c. LIPA; d. LPLA1; e. HACH; f. CESB1L; g. LYPLA1; h. SMPD1; i. CES1; j. PLA1A; k. SIAE
도 14A-14C. a. 재조합적으로 정제된 하이드롤라제 효소들 (PPT1, rhLPL, ASAH1, LIPA) 첨가 후 30 mg/mL의 mAb 2 용액에서 HPLC와 ELSD 혼합 모드로 측정한 초기 PS20 농도의 백분율; b. 재조합적으로 정제된 하이드롤라제 효소들 (HACH, LYPLA1, CES-B1L, LPLA2)의 첨가 후 배합 완충 용액에서 HPLC와 ELSD 혼합 모드로 측정한 초기 PS20 농도의 백분율; c. 재조합적으로 정제된 하이드롤라제 효소들 (PLA1A, SIAE, CES1, SMPD1)의 첨가 후 배합 완충 용액에서 HPLC와 ELSD 혼합 모드로 측정한 초기 PS20 농도의 백분율.
도 15. 정제된 mAb 샘플들에서 폴리소르베이트 분해에 대한 리파제/에스테라제 KO의 영향. 정제된 샘플들에서 폴리소르베이트 분해에 대한 효소 활성이 PS20 분해 분석에 의해 평가되었다. 각 mAb 내에서 PS20 분해의 감소는 KO 세포에 의해 생성된 정제된 물질을 대조군 세포(즉, KO가 수행되지 않음)와 비교함으로써 평가되었다. 모든 KO mAb 생성 세포들은 CHO 바탕 KO 숙주(도 3에 나타난 바와 같이 7X KO 또는 12X KO)를 상응하는 mAb 유전자로 형질감염시켜 생성되었다.
도 16. 정제된 mAb T 샘플들에서 폴리소르베이트 분해에 대한 리파제/에스테라제 KO의 영향. 정제된 mAb T 샘플들에서 폴리소르베이트 분해에 대한 효소 활성이 PS20 분해 분석에 의해 평가되었다. PS20 분해의 감소는 KO 세포에 의해 생성된 정제된 물질을 대조군 세포(즉, KO가 수행되지 않음)와 비교함으로써 평가되었다. 모든 KO 세포(1X, 2X, 3X 및 6X)는 모체 mAb T 세포주에서 리파제/에스테라제 유전자를 순차적으로 녹아웃함으로써 생성되었다.
5. 상세한 설명
명료함을 위해, 하지만 제한 없이, 본원에서 개시된 발명의 상세한 설명은 다음과 같은 하위섹션들로 나뉜다:
5.1 정의;
5.2 효소 활성 조절;
5.3 유전자 특이적 변형을 포함하는 세포;
5.4 세포 배양 방법; 및
5.5 생성물.
5.1. 정의
본 명세서에서 사용된 용어는 일반적으로 본 발명의 내용에서 그리고 각 용어가 사용되는 특정 문맥에서 당해 분야의 통상적인 의미를 갖는다. 특정 용어는 명세서의 구성 및 방법을 설명하고, 이를 작성하고 사용하는 방법에 대해 숙련된 기술자에게 추가 지침을 제공하기 위해 아래 또는 다른 곳에서 논의된다.
본원에서 사용되는 단어 “하나 (a 또는 an)”의 사용은, 청구범위 및/또는 명세서에서 용어 “포함하는”과 함께 사용될 때, “하나 (one)”를 의미할 수 있으나 이는 또한 “하나 이상의”, “최소 하나” 및 “하나 또는 이상”의 의미와 동일하다.
본원에서 사용되는 용어 “포함하다”, “비롯하다”, “가지는”, “가지다”, “~ 수 있다”, “내포하다” 및 이의 변화형들은, 추가적인 작용 또는 구조 가능성을 배제하지 않는 열린 말단의 변이형 어구들, 용어들 또는 단어들인 것으로 한다. 본 발명은 또한 명시적으로 제시되었는지 여부와 관계없이, 본 명세서에 제시된 실시형태들 또는 요소들 “을 포함하는”, “로 구성된” 및 “로 본질적으로 구성된” 다른 실시형태들을 고려한다.
용어 “약” 또는 “대략”은 해당 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 결정된 특정 수치에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있음을 의미하며, 이는 부분적으로 그 수치가 어떻게 측정 또는 결정되는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, “약”은 해당 기술 분야의 실제에 따르면 3 또는 3 초과의 표준 편차 이내임을 의미할 수 있다. 대안적으로, “약”은 주어진 수치의 최대 20%, 바람직하게는 최대 10%, 더욱 바람직하게는 최대 5%, 그리고 더욱 바람직하게는 또한 최대 1% 범위를 의미할 수 있다. 대안적으로, 특히 생물학적 시스템 또는 과정들과 관련하여, 이 용어는 하나의 값의 바람직하게는 5-배 이내, 그리고 더욱 바람직하게는 2-배 이내의 자리수에 속함을 의미할 수 있다.
용어 “세포 배양 배지”및 “배양 배지”는 일반적으로 다음 범주 중 하나 이상으로부터 최소 하나의 성분을 제공하는 포유동물 세포 성장에 사용되는 영양 용액을 지칭한다:
1) 일반적으로 포도당과 같은 탄수화물 형태의 에너지원;
2) 모든 필수 아미노산, 일반적으로 20개의 아미노산과 시스테인의 기본 세트;
3) 저 농도로 필요한 비타민 및/또는 기타 유기 화합물;
4) 유리 지방산; 및
5) 미량 원소, 여기서 미량 원소는 일반적으로 마이크로 몰 범위의 매우 낮은 농도로 일반적으로 필요한 무기 화합물 또는 자연 발생 원소로 정의된다.
영양 용액은 선택적으로 다음 범주들 중 하나 이상의 성분들로 보충 될 수 있다:
1) 예를 들어 인슐린, 트랜스페린 및 표피 성장 인자와 같은 호르몬 및 기타 성장 인자;
2) 예를 들어 칼슘, 마그네슘 및 인산염과 같은 염 및 완충액;
3) 예를 들어, 아데노신, 티미딘 및 하이포잔틴과 같은 뉴클레오시드 및 염기; 및
4) 단백질 및 조직 가수분해물.
세포 “배양”은 세포의 생존 및/또는 성장 및/또는 증식에 적합한 조건하에서 세포를 세포 배양 배지와 접촉시키는 것을 지칭한다.
“회분식 배양”은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 과정 시작시 배양 생물반응기에 공급되는 배양을 의미한다.
본원에서 사용되는 “유가식 세포 배양”은 세포들 및 배양 배지가 초기에 배양 생물반응기에 공급되고, 배양 과정 동안 추가 배양 영양소가, 연속하여 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급되고, 배양 종료 전 주기적 세포 및/또는 생성물을 수확하거나 수확하지 않는, 회분식 배양을 지칭한다.
때때로 연속 배양으로 지칭되는 “관류 배양”은 이에 의해 세포들이 예컨대, 여과, 캡슐화, 마이크로담체에 대한 고정, 등에 의하여 배양물에서 억제되고 배양 배지가 연속으로, 단계적으로 또는 간헐적으로 도입되고 (또는 이들의 조합) 배양 생물반응기로부터 제거되는 배양이다.
본원에서 사용되는 용어 “세포”는 동물 세포들, 포유동물 세포들, 배양된 세포들, 숙주 세포들, 재조합 세포들 및 재조합 숙주 세포들을 지칭한다. 이러한 세포들은 적절한 영양소 및/또는 성장 인자들을 내포하는 배지에 배치될 때 성장 및 생존할 수 있는 포유동물 조직들로부터 얻거나 유래된 세포주들이다.
용어 “숙주 세포”, “숙주 세포주”, 및 “숙주 세포 배양물”은 호환적으로 이용되며, 외인성 핵산이 도입될 수 있는 또는 도입되어 있는 세포를 지칭하고 이러한 세포들의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 “형질전환체” 및 “형질전환된 세포”를 포함하며, 이는 계대 수에 관계없이 1차 형질전환된 세포 및 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에 있어서 모체 세포와 완벽하게 동일할 필요는 없으며, 돌연변이를 포함할 수 있다. 최초로 형질전환된 세포에서 스크리닝되거나 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이 자손이 본원에 포함된다.
용어 “포유동물 숙주 세포”또는 “포유동물 세포”는 적절한 영양분 및 성장 인자를 함유하는 배지에서 단층 배양 또는 현탁 배양에 배치 될 때 성장 및 생존 할 수 있는 포유동물로부터 유래된 세포주를 지칭한다. 특정 세포주에 필요한 성장 인자는 Mammalian Cell Culture (Mather, J. P. ed., Plenum Press, N.Y. 1984), 및 Barnes and Sato, (1980) Cell, 22:649에 설명된 바와 같이 과도한 실험없이 경험적으로 용이하게 결정된다. 전형적으로, 세포는 배양 배지 내로 관심있는 특정 단백질, 예를 들어, 당단백질을 대량으로 발현하고 분비 할 수 있다. 본 발명의 내용과 관련하여 적합한 포유동물 숙주 세포의 예는 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); dp12.CHO 세포 (EP 307,247, 1989년 3월 15일 공개); CHO-K1 (ATCC, CCL-61); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 계통(현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포, Graham 외, J. Gen Virol., 36:59 1977); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK, ATCC CCL 10); 마우스 세르톨리 세포(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 1980); 원숭이 신장 세포 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76, ATCC CRL-1587); 인간 자궁경부암 세포 (HELA, ATCC CCL 2); 개 신장 세포 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간 세포 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간 세포 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포 (Mather 외, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 1982); MRC 5 세포; FS4 세포; 및 인간 간암종 계통 (Hep G2)을 포함할 수 있다. 특정 실시형태에서, 포유동물 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub 및 Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 1980); dp12.CHO 세포(EP 307,247, 1989년 3월 15일 공개)를 포함한다.
세포 배양물의 “성장 단계”는 세포들이 일반적으로 급속하게 분열 중인 지수적 세포 성장 기간 (대수기)을 지칭한다. 세포들이 성장 단계에서 유지되는 시기는, 예를 들면, 세포-유형, 세포들의 성장 속도 및/또는 배양 조건에 기초하여 달라질 수 있다. 특정 실시형태들에서, 이러한 단계 동안, 세포들은 일정 시기 동안, 일반적으로 1-4 일, 그리고 세포 성장이 최대화되는 조건하에서 배양된다. 숙주 세포에 대한 성장 주기의 결정은 계획된 특정 숙주 세포에 대해 과도한 실험없이 결정될 수 있다. “세포 성장이 최대화되는 시기 및 조건하에서” 등은, 특정 세포주에 대해, 세포 성장 및 분열에 최적인 것으로 결정되는 배양 조건들을 지칭한다. 특정 실시형태들에서, 성장 단계 동안, 세포들은 특정 세포주에 대해 최적의 성장이 구현되도록 일반적으로 약 30°-40°C의 가습되고 제어된 대기에서 필요한 첨가제들을 함유하는 영양 배지에서 배양된다. 특정 실시형태들에서, 세포들은 약 1일 내지 4일, 일반적으로 2 내지 3일의 기간 동안 성장 단계에서 유지된다.
세포 배양물의 “생산 단계”는 세포 성장이 정체되는/정체되었던 중의 시기를 지칭한다. 대수 세포 성장은 통상적으로 이러한 시기 이전 또는 도중에 감소하며 단백질 생산이 이어진다. 생산 단계 동안, 로그 세포 성장은 종료되었고, 단백질 생산이 일순위가 된다. 이러한 시기 동안 배지는 일반적으로 지속적인 단백질 생산을 지원하고 원하는 당단백질 생성물을 구현하기 위해 보충된다. 유가식 및/또는 관류 세포 배양 과정은 원하는 세포 밀도, 생존력 및 또는 재조합 단백질 산물 역가를 달성 및/또는 유지하기 위해 이 단계 동안 세포 배양 배지를 보충하거나 새로운 배지를 제공한다. 생산 단계는 대규모로 수행될 수 있다.
단백질의 활성과 관련하여 본원에 사용된 용어 “활성”은 효소 활성, 리간드 결합, 약물 수송, 이온 수송, 단백질 국재화, 수용체 결합, 및/또는 구조적 활성을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 단백질 활성을 지칭한다. 이러한 활성은 단백질의 발현을 감소 또는 제거함으로써, 단백질의 존재를 감소 또는 제거하여 조절, 예를 들어, 감소 또는 제거될 수 있다. 이러한 활성은 또한 단백질을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여, 생성된 변형된 단백질이 야생형 단백질에 비해 감소되거나 제거된 활성을 나타내도록 함으로써, 조절, 예를 들어 감소 또는 제거될 수 있다.
용어 “발현” 또는 “발현하다”는 숙주 세포 내에서 발생하는 전사 및 번역을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 숙주 세포에서 생성물 유전자의 발현 수준은 세포에 존재하는 상응하는 mRNA의 양 또는 세포에 의해 생성되는 생성물 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 양에 기초하여 결정될 수 있다. 예를 들어, 생성물 유전자로부터 전사된 mRNA는 바람직하게는 노던 혼성화에 의해 정량화된다. Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 7.3-7.57 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). 생성물 유전자에 의해 인코딩된 단백질은, 단백질의 생물학적 활성을 분석하거나 이러한 활성과 무관한 분석법, 가령, 단백질과 반응 할 수 있는 항체를 사용한 웨스턴 블롯팅 또는 방사면역분석법을 사용하여 정량화 될 수 있다. Sambrook 외, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, pp. 18.1-18.88 (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
본원에 사용된 “폴리펩티드”는 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 보유하는 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 이러한 폴리펩티드는 숙주 세포에 상동성일 수 있거나, 또는 바람직하게는, 외인성 (이는 이용되는 숙주 세포에 대해 이종, 즉, 외래임을 의미), 예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소 세포에 의해 생성된 인간 단백질, 또는 포유동물 세포에 의해 생성된 효모 폴리펩티드 일 수 있다. 특정 실시형태들에서, 포유동물 폴리펩티드 (원래 포유동물 유기체로부터 유래된 폴리펩티드), 보다 바람직하게는 배지로 직접 분비되는 폴리펩티드가 사용된다.
용어 “단백질”은 사슬 길이가 더 높은 수준의 3차 및/또는 4차 구조를 생성하기에 충분한 아미노산 서열을 지칭하는 것으로 한다. 이는 이러한 구조를 갖지 않는 “펩티드” 또는 기타 저분자량 약물과 구별하기 위한 것이다. 전형적으로, 본원의 단백질은 최소 약 15-20 kD, 바람직하게는 최소 약 20 kD의 분자량을 가질 것이다. 본원의 정의에 포함되는 단백질의 예는 숙주 세포 단백질, 뿐만 아니라, 모든 포유동물 단백질, 특히 치료 및 진단 항체와 같은 치료 및 진단 단백질, 및 일반적으로 하나 이상의 이황화 결합을 포함하는 단백질을 포함하며, 하나 이상의 사슬간 및/또는 사슬내 이황화 결합을 포함하는 다중 사슬 폴리펩티드를 포함한다.
용어 “항체”는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되며, 원하는 항원-결합 활성을 나타내는 한 단클론 항체, 다클론 항체, 단일특이성 항체 (예를 들어, 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열로 구성된 항체, 이러한 쌍의 다량체 포함), 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체) 및 항체 단편을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 항체 구조를 포함한다.
본원에서 사용되는 “항체 단편”, 항체의 “항원 결합 부분” (또는 간단히 “항체 부분”) 또는 항체의 “항원-결합 단편”은, 온전한 항체가 결합하는 항원에 결합하는 온전한 항체의 일부를 포함하는 온전한 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 쇄 항체 분자 (예컨대, scFv, 및 scFab); 단일 도메인 항체들 (dAbs); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 특정 항체 단편들에 대한 검토는, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)를 참고한다.
용어 “키메라” 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 출처 또는 종으로부터 유래되지만, 중쇄 및/또는 경쇄의 잔부는 상이한 출처 또는 종들로부터 유래한 항체를 지칭한다.
항체의 “분류(class)”란 항체의 중쇄가 보유하는 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체에는 5가지 주요 분류가 있다: IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM, 그리고 이들 중 몇몇은 하위분류(아이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 더욱 세분될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 항체는 IgG1 아이소형의 항체이다. 특정 실시형태들에서, 항체는 IgG2 아이소형의 항체이다. 상이한 면역글로불린 분류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 차례로 α, δ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 2가지 유형 소위 카파 (κ) 및 람다 (λ) 중 하나로 지정될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “역가”는 세포 배양에 의해 생성된 재조합적으로 발현된 항체의 총량을 주어진 양의 배지 부피로 나눈 것을 지칭한다. 역가는 통상적으로 배지 밀리리터 또는 리터 당 항체 밀리그램 단위 (mg/ml 또는 mg/L)로 표현된다. 특정 실시형태들에서, 역가는 배지 리터 당 항체의 그램으로 표현된다 (g/L). 역가는 상이한 배양 조건하에서 단백질 생성물을 얻는 것과 비교했을 때 역가의 백분율 증가와 같은 상대적 측정값의 관점에서 표현되거나 평가 될 수 있다.
용어 “핵산”, “핵산 분자” 또는 “폴리뉴클레오티드”는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특히 퓨린- 또는 피리미딘 염기 (즉, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (즉, 데옥시리보스 또는 리보스) 및 포스페이트 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기 서열로 기재되며, 이에 의해 상기 염기는 핵산 분자의 1차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기들의 서열은 일반적으로 5'으로부터 3'으로 제시된다. 본원에서, 용어 핵산 분자는, 예를 들어, 상보적 DNA (cDNA) 및 게놈 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히, 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태들, 그리고 둘 이상의 이러한 분자들을 포함하는 혼합 중합체를 포함한다. 핵산 분자는 선형 또는 원형일 수 있다. 또한, 핵산 분자라는 용어는 센스 및 안티센스 가닥 모두, 뿐만 아니라, 단일 가닥 및 이중 가닥 형태를 포함한다. 더욱이, 본원에 기재된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 예에는 유도된 당 또는 포스페이트 백본 연결부 또는 화학적으로 변형된 잔기가 있는 변형된 뉴클레오티드 염기가 포함된다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이러한 DNA (예를 들어, cDNA) 또는 RNA (예를 들어, mRNA) 벡터는 비변형 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 개선하기 위하여 화학적으로 변형될 수 있으며, 이러한 mRNA는 대상체에 주사되어 생체내에서 항체를 생성할 수 있다 (예를 들어, 2017년 6월 12일 온라인으로 공개된 Stadler 등, Nature Medicine 2017, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1 참고).
본원에서 사용되는 용어 “벡터”는 이것에 연결된 또다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다.
“인간 항체”는 인간 또는 인간 세포에 의해 생성되거나 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 이용하는 비-인간 출처로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 인간 항체의 정의에서 특히 비-인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 제외한다.
“인간화” 항체는 비인간 CDR들로부터의 아미노산 잔기 및 인간 FR들로부터의 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 특정 양상들에 있어서, 인간화 항체는 실질적으로 최소한 하나의, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 모두 포함하는데, 이때 CDR들의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 비-인간 항체에 대응하며, FRs의 모든 또는 실질적으로 모든 것은 인간 항체의 것에 대응한다. 인간화 항체는 선택적으로 인간 항체로부터 유도된 항체 불변 영역의 최소한 일부를 포함할 수 있다. 항체의 “인간화 형태”, 예를 들어, 비-인간 항체는 인간화를 거친 항체를 지칭한다.
본원에서 사용되는 용어 “초가변 영역” 또는 “HVR”은 서열에서 초가변적이고, 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인 영역들 각각, 예를 들면, “상보성 결정 영역들” (“CDR들”)을 지칭한다.
일반적으로, 항체들은 6개의 HVR: VH에 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 및 VL에 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3)를 포함한다. 본원에서 예시적인 CDR들은 다음을 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 및 96-101 (H3)에서 나타나는 초가변 루프 (Chothia 및 Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 및 95-102 (H3)에서 나타나는 CDR (Kabat 등, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)); 및
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 및 93-101 (H3)에서 나타나는 항원 접촉부 (MacCallum 외 J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)).
달리 지시되지 않는 한, CDR들은 상기 Kabat 외의 문헌에 따라 결정된다. 당업자는 CDR 표시가 또한 상기 Chothia, 상기 McCallum의 문헌, 또는 임의의 다른 과학적으로 허용되는 명명법에 따라 결정될 수 있음을 이해할 것이다.
“면역접합체”는, 비제한적으로 세포독성제를 포함한, 하나 이상의 이종 분자(들)에 접합된 항체이다.
용어 “단클론 항체(monoclonal antibody)”는 본원에서 이용된 바와 같이 실질적으로 동질 항체의 집단으로부터 수득한 항체, 예를 들어, 이러한 집단을 포함하는 개별 항체는 동일하거나 및/또는 동일한 에피토프에 결합하지만, 예로써, 자연 발생적 돌연변이를 포함하는 또는 단클론 항체 제재를 제조하는 동안 발생되는 가능한 변이체 항체의 경우는 제외되며, 이러한 변이체들은 일반적으로 소량 존재한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대항하는 상이한 항체를 일반적으로 함유하는 다중클론성 항체 제재들과 대조적으로, 단클론 항체 제재들의 각 단클론 항체는 항원에 있는 단일 결정인자에 대해 지시된다. 따라서, 수식어 “단클론(monoclonal)”은 실질적으로 동질성 항체 모집단으로부터 수득되는 항체의 특성을 나타내며, 임의의 특정 방법에 의한 항체 제조를 필요로 하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 예를 들면, 본원에 개시된 발명에 따른 단클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 유전자좌 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
“가변 영역” 또는 “가변 도메인”은 항체가 항원에 결합하는데 관여하는 항체 중쇄 또는 경쇄 도메인을 지칭한다. 천연 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인(각각, VH 및 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 가지며, 각 도메인은 4개의 보존된 프레임워크 영역(FRs) 및 3개의 상보성 결정 영역(CDRs)을 포함한다. (예컨대, Kindt 외. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., 91 페이지 (2007) 참조.) 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다. 더욱이, 특정 항원에 결합하는 항체는 상보성 VH 또는 VL 도메인의 라이브러리를 스크린하기 위하여 항원에 결합하는 항체의 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 분리될 수 있다. 예를 들어, Portolano 외, J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson 외, Nature 352:624-628 (1991) 참조.
본원에서 사용되는 용어 “세포 밀도”는 주어진 부피의 배지 내 세포수를 지칭한다. 특정 실시형태에서, 높은 세포 밀도는 더 높은 단백질 생산성으로 이어질 수 있다는 점에서 바람직하다. 세포 밀도는 배양물에서 샘플을 추출하고, 상업적으로 이용가능한 세포 계수 장치를 사용하거나 생물 반응기 자체에 (또는 배지와 부유 세포가 통과 한 다음 생물 반응기로 되돌아가는 루프에) 도입되는 상업적으로 이용가능한 적합한 프로브를 사용하여 현미경으로 세포를 분석하는 것을 포함하는 (그러나 이에 제한되지 않는) 당업계에 공지된 임의의 기술에 의해 모니터링 될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “재조합 세포”는 이들이 유래되는 원래의 모세포로부터 일부 유전적 변형을 갖는 세포를 지칭한다. 이러한 유전적 변형은 유전자 산물, 예를 들어, 재조합 단백질을 발현시키기 위한 이종 유전자 도입의 결과 일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 “재조합 단백질”은 일반적으로 항체를 비롯한 펩티드 및 단백질을 지칭한다. 이러한 재조합 단백질은 “이종”이다, 즉, CHO 세포들에 의해 생성되는 항체와 같이, 이용될 숙주 세포에 대해 외인성이다.
용어 “PS20”은 폴리소르베이트 20 또는 Tween 20을 지칭한다. 용어 “PS80”은 폴리소르베이트 80 또는 Tween 80을 지칭한다. PS20 및 PS80은 지방산 에스테르 모이어티와 긴 폴리옥시에틸렌 사슬을 가진 폴리소르베이트 계면활성제이다.
5.2. 효소 활성 조절
특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 숙주 세포 단백질의 활성, 예를 들어 리파제, 에스테라제 또는 하이드롤라제를 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 효소 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어, 제한 없이, 리파제, 에스테라제, 및/또는 하이드롤라제 단백질을 비롯한 (그러나 이에 제한되지 않는) 숙주 세포에서 효소 활성을 조절하는 방법은 상응하는 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 변형되지 않은 세포 내 하나 이상의 숙주 세포 단백질의 활성에 비해 이러한 단백질의 활성이 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 지단백질 리파제(LPL); 포스포리파제 B-도메인 함유 (PLBL2/PLBD2); 리파제 A(리소좀산 리파제/콜레스테릴 에스테르 하이드롤라제, 리파제)(LIPA); 포스포리파제 A-2-활성화 단백질(PLAA); 포스포리파제 D3(PLD3); 포스포리파제 A2 그룹 (LPLA2); 포스포리파제 C 베타 1(PLCB1); 포스포리파제 C 델타 1(PLCD1); 단백질 1(단편)을 포함하는 DDHD 도메인(DDHD1); 라이소포스포리파제-유사 단백질 1(LYPLAL1); 포스포리파제 A2 그룹 XIIA(PLA2G12A); 퍼옥시레독신 6(PRDX6); 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(SMPD1); 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(PPT1); 이소아밀 아세테이트 가수분해 에스테라제 1(IAH1); OTU 데유비퀴티나제, 유비퀴틴 알데히드 결합 1(OTUB1); 라이소포스포리파제2(아실-단백질 티오에스테라제2)(LYPLA2); 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 13(ACOT13); 지방산 합성효소(FASN); 포스포리파제 A2 그룹 VII(PLA2G7); 유비퀴틴 특이적 펩티다제 5(USP5); N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(산 세라미다제)(ASAH1); 리파제 성숙 인자 1(LMF1); 아포지단백질-CII(APOC2); 아실카르니틴 하이드롤라제(HACH); 카르복실에스테라아제 1F(CES1F) 또는 간 카르복실에스테라아제 B-1-유사(CES-B1L); 라이소포스포리파제 1(LYPLA1); 카르복실에스테라제 1(CES1); 포스포리파제 A1 구성원 A(PLA1A); 및 시알산 아세틸에스테라제(SIAE)의 활성이 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, PPT1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; 및 LIPA의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SPD1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; 및 PPT1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 활성이 감소 또는 제거된다. 특정 실시형태에서, LMF1 및 APOC2의 활성이 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, 참조 세포는 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성이 조절되지 않는, 예를 들어 감소 또는 제거되지 않는 세포이다. 특정 실시형태에서, 참조 세포는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 코딩하는 유전자(들)의 야생형 대립유전자 중 최소 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포이다. 예를 들어 (그러나 제한은 아님), 참조 세포는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 코딩하는 유전자(들)의 두 야생형 대립유전자 모두를 가지는 세포이다. 특정 실시형태에서, 참조 세포는 WT CHO 세포이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 최소 약 90%, 최소 약 80%, 최소 약 70%, 최소 약 60%, 최소 약 50%, 최소 약 40%, 최소 약 30%, 최소 약 20%, 최소 약 10%, 최소 약 5%, 최소 약 4%, 최소 약 3%, 최소 약 2% 또는 최소 약 1%이다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 최소 약 90%, 최소 약 80%, 최소 약 70%, 최소 약 60%, 최소 약 60%, 최소 약 50%, 최소 약 40%, 최소 약 30%, 최소 약 20%, 최소 약 10%, 최소 약 5%, 최소 약 4%, 최소 약 3%, 최소 약 2% 또는 최소 약 1%이다.
특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 40% 이하이다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다.
특정 실시형태들에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이러한 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 실시형태들에서, 상기 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 실시형태에서, 상기 폴리펩티드의 활성을 감소 또는 제거하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 활성은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포의 상응하는 폴리펩티드 활성의 약 5% 내지 약 40%이다. 상이한 참조 세포들(예를 들어, 상응하는 유전자의 야생형 대립유전자들 중 최소 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포들)에서 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성은 달라질 수 있다.
특정 실시형태에서, 유전자 조작 시스템이 특정 폴리펩티드의 활성 (예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 활성)을 조절 (예를 들어, 감소 또는 제거)하기 위해 사용된다. 당업계에 공지된 다양한 유전자 조작 시스템들이 본원에 개시된 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 비 제한적인 예로는 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템 및 유전자 침묵에 의한 단백질 녹다운을 위한 기타 툴들, 가령, 짧은 간섭 RNA들 (siRNAs), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)의 사용이 포함된다. 종래의, 개선된 또는 변형된 Cas 시스템들을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 CRISPR/Cas 시스템들, 뿐만 아니라 현존하는 다른 세균 기반 게놈 절제 툴, 가령, Cpf-1을 본원에 개시된 방법들과 함께 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 유전자, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부가, 상응하는 폴리펩티드의 활성을 조절, 예를 들어, 감소 또는 제거하도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 상기 유전자의 최소 약 2%, 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 약 60%, 최소 약 65%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85% 또는 최소 약 90%가 변형된다. 특정 실시형태들에서, 상기 유전자의 약 2% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하 또는 약 90% 이하가 변형된다. 특정 실시형태에서, 상기 유전자의 약 2% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 2% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 2% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 2% 내지 약 5%가 변형된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 숙주 세포에서 하나 이상의 유전자, 예를 들어, 리파제, 에스테라제 또는 하이드롤라제를 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 효소를 인코딩하는 유전자의 활성을 조절하는 방법에 관한 것이다. 예를 들어 (그러나 제한은 아님), 리파제, 에스테라제, 및/또는 하이드롤라제 유전자를 비롯한(그러나 이에 제한되지 않는) 하나 이상의 효소 유전자의 활성을 조절하는 방법은 상기 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현을 녹아웃 또는 녹다운시키는 것을 포함한다. 특정 실시형태에서, LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; (LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, PLBL2의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; 및 LIPA의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SMPD1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; 및 PPT1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 특정 실시형태에서, LMF1 및 APOC2의 발현이 녹다운 또는 녹아웃된다. 본원에서 사용되는, 녹아웃된 발현은, 참조 세포와 비교하여, 세포에서 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현의 제거를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 녹다운된 발현은, 참조 세포와 비교하여, 세포에서 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현의 감소를 지칭한다.
특정 실시형태에서, 참조 세포는 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현이 조절되지 않는, 예를 들어 감소되지 않는 세포이다. 특정 실시형태에서, 참조 세포는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 코딩하는 유전자(들)의 야생형 대립유전자 중 최소 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포이다. 예를 들어 (그러나 제한은 아님), 참조 세포는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 코딩하는 유전자(들)의 두 야생형 대립유전자 모두를 가지는 세포이다. 특정 실시형태에서, 참조 세포는 WT CHO 세포이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 최소 약 90%, 최소 약 80%, 최소 약 70%, 최소 약 60%, 최소 약 50%, 최소 약 40%, 최소 약 30%, 최소 약 20%, 최소 약 10%, 최소 약 5%, 최소 약 4%, 최소 약 3%, 최소 약 2% 또는 최소 약 1%이다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 최소 약 90%, 최소 약 80%, 최소 약 70%, 최소 약 60%, 최소 약 50%, 최소 약 40%, 최소 약 30%, 최소 약 20%, 최소 약 10%, 최소 약 5%, 최소 약 4%, 최소 약 3%, 최소 약 2% 또는 최소 약 1%이다.
특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다. 특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 40% 이하이다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서의 폴리펩티드 발현의 약 90% 이하, 약 80% 이하, 약 70% 이하, 약 60% 이하, 약 50% 이하, 약 40% 이하, 약 30% 이하, 약 20% 이하, 약 10% 이하, 약 5% 이하, 약 4% 이하, 약 3% 이하, 약 2% 이하 또는 약 1% 이하이다.
특정 실시형태들에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이러한 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 발현은 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 1% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 1% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 1% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 1% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 1% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 1% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 1% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 1% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 1% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 30%, 약 5% 내지 약 40%이다.
특정 실시형태에서, 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 이들 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 5% 내지 약 40%이다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 발현을 녹다운하도록 변형되어 있는 세포에서 폴리펩티드의 발현은, 참조 세포, 예컨대, WT CHO 세포에서 상응하는 폴리펩티드 발현의 약 5% 내지 약 40%이다. 상이한 참조 세포들(예를 들어, 상응하는 유전자의 야생형 대립유전자들 중 최소 하나 또는 둘 모두를 포함하는 세포들)에서 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현 수준은 달라질 수 있다.
특정 실시형태에서, 유전자 조작 시스템이 특정 폴리펩티드의 발현 (예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 발현)을 조절 (예를 들어, 녹다운 또는 녹아웃)하기 위해 사용된다. 당업계에 공지된 다양한 유전자 조작 시스템들이 본원에 개시된 방법들에서 사용될 수 있다. 이러한 시스템의 비 제한적인 예로는 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자 유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템 및 유전자 침묵에 의한 단백질 녹다운을 위한 기타 툴들, 가령, 짧은 간섭 RNA들 (siRNAs), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)의 사용이 포함된다. 종래의, 개선된 또는 변형된 Cas 시스템들을 비롯하여 당업계에 공지된 임의의 CRISPR/Cas 시스템들, 뿐만 아니라 현존하는 다른 세균 기반 게놈 절제 툴, 가령, Cpf-1을 본원에 개시된 방법들과 함께 사용할 수 있다.
특정 실시형태에서, 유전자, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 일부가, 상응하는 폴리펩티드의 발현을 조절, 예를 들어, 녹다운 또는 녹아웃하도록 결실된다. 특정 실시형태에서, 유전자의 최소 약 2%, 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 약 60%, 최소 약 65%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85% 또는 최소 약 90%가 결실된다. 특정 실시형태들에서, 상기 유전자의 약 2% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하 또는 약 90% 이하가 결실된다. 특정 실시형태에서, 상기 유전자의 약 2% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 2% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 2% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 2% 내지 약 5%가 결실된다.
특정 실시형태에서, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 최소 하나의 엑손이 최소 부분적으로 결실된다. 본원에서 사용되는 “부분적으로 결실된”은, 해당 영역, 예컨대, 엑손의 약 2% 이상, 약 5% 이상, 약 10% 이상, 약 15% 이상, 약 20% 이상, 약 25% 이상, 약 30% 이상, 약 35% 이상, 약 40% 이상, 약 45% 이상, 약 50% 이상, 약 55% 이상, 약 60% 이상, 약 65% 이상, 약 70% 이상, 약 75% 이상, 약 80% 이상, 약 85% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 2% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하, 약 15% 이하, 약 20% 이하, 약 25% 이하, 약 30% 이하, 약 35% 이하, 약 40% 이하, 약 45% 이하, 약 50% 이하, 약 55% 이하, 약 60% 이하, 약 65% 이하, 약 70% 이하, 약 75% 이하, 약 80% 이하, 약 85% 이하, 약 90% 이하, 약 95% 이하, 약 2% 내지 약 90%, 약 10% 내지 약 90%, 약 20% 내지 약 90%, 약 25% 내지 약 90%, 약 30% 내지 약 90%, 약 40% 내지 약 90%, 약 50% 내지 약 90%, 약 60% 내지 약 90%, 약 70% 내지 약 90%, 약 80% 내지 약 90%, 약 85% 내지 약 90%, 약 2% 내지 약 80%, 약 10% 내지 약 80%, 약 20% 내지 약 80%, 약 30% 내지 약 80%, 약 40% 내지 약 80%, 약 50% 내지 약 80%, 약 60% 내지 약 80%, 약 70% 내지 약 80%, 약 75% 내지 약 80%, 약 2% 내지 약 70%, 약 10% 내지 약 70%, 약 20% 내지 약 70%, 약 30% 내지 약 70%, 약 40% 내지 약 70%, 약 50% 내지 약 70%, 약 60% 내지 약 70%, 약 65% 내지 약 70%, 약 2% 내지 약 60%, 약 10% 내지 약 60%, 약 20% 내지 약 60%, 약 30% 내지 약 60%, 약 40% 내지 약 60%, 약 50% 내지 약 60%, 약 55% 내지 약 60%, 약 2% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 50%, 약 20% 내지 약 50%, 약 30% 내지 약 50%, 약 40% 내지 약 50%, 약 45% 내지 약 50%, 약 2% 내지 약 40%, 약 10% 내지 약 40%, 약 20% 내지 약 40%, 약 30% 내지 약 40%, 약 35% 내지 약 40%, 약 2% 내지 약 30%, 약 10% 내지 약 30%, 약 20% 내지 약 30%, 약 25% 내지 약 30%, 약 2% 내지 약 20%, 약 5% 내지 약 20%, 약 10% 내지 약 20%, 약 15% 내지 약 20%, 약 2% 내지 약 10%, 약 5% 내지 약 10%, 또는 약 2% 내지 약 5%가 결실됨을 지칭한다.
특정 비제한적 실시형태에서, CRISPR/Cas9 시스템이 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 사용된다. 클러스터링된 규칙적 간격의 짧은 회문식 반복서열(CRISPR) 시스템은 원핵 세포들에서 발견된 게놈 편집 툴이다. 게놈 편집에 사용되는 경우, 이러한 시스템은 Cas9 (그 가이드로서 crRNA를 이용하여 DNA를 변형시킬 수 있는 단백질), CRISPR RNA (crRNA, tracrRNA (일반적으로 헤어핀 루프 형태)에 결합하여 Cas9와 활성 복합체를 형성하는 영역과 함께 숙주 DNA의 올바른 구획으로 이를 유도하는, Cas9에 의해 사용되는 RNA를 내포), 및 트랜스-활성화 crRNA (tracrRNA, crRNA에 결합하여 Cas9와 활성 복합체를 형성함)를 포함한다. 용어 “가이드 RNA” 및 “gRNA”는 세포의 표적 서열, 예를 들어, 게놈 또는 에피솜 서열에 대한 RNA-유도된 뉴클레아제, 가령, Cas9의 특이적 결합 (또는 “표적화”)을 촉진시키는 임의의 핵산을 지칭한다. gRNA들은 단분자 (단일 RNA 분자를 포함, 그리고 대안적으로 키메라로 지칭됨) 또는 모듈 (하나 이상, 그리고 통상적으로 2개의 별도의 RNA 분자들, 가령, crRNA 및 tracrRNA를 포함, 이들은 일반적으로, 예를 들어, 듀플렉싱에 의해 서로 결합됨) 일 수 있다.
CRISPR/Cas9 전략들은 벡터를 사용하여 포유동물 세포를 형질감염시킬 수 있다. 가이드 RNA (gRNA)는 Cas9가 세포에서 표적 DNA를 확인하고 직접 결합하는 데 사용하는 서열이므로 각 응용 분야에 맞게 설계 될 수 있다. 다수의 crRNA와 tracrRNA가 함께 포장되어 단일 가이드 RNA (sgRNA)를 형성 할 수 있다. sgRNA는 세포내에 형질 감염되도록 하기 위해 Cas9 유전자와 함께 결합되어 벡터로 만들어질 수 있다.
특정 실시형태에서, 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 조절하는데 사용하기 위한 CRISPR/Cas9 시스템은 Cas9 분자 및 관심 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자의 표적 서열에 상보적인 표적화 도메인을 포함하는 하나 이상의 gRNA를 포함한다. 특정 실시형태에서, 표적 유전자는 관심 폴리펩티드, 예를 들어 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 영역이다. 표적 서열은 유전자 내의 임의의 엑손 또는 인트론 영역일 수 있다.
특정 실시형태들에서, gRNA들은 단일 벡터에서 세포에 투여되고 Cas9 분자는 제2 벡터에서 세포에 투여된다. 특정 실시형태들에서, gRNA들 및 Cas9 분자는 단일 벡터에서 세포에 투여된다. 대안적으로, gRNA들 및 Cas9 분자 각각은 별도의 벡터들에 의해 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, CRISPR/Cas9 시스템은 하나 이상의 gRNA와 복합체화된 Cas9 단백질을 포함하는 리보핵단백질 복합체 (RNP)로서 세포에 전달 될 수 있는데, 예를 들어, 전기천공에 의해 전달 될 수 있다 (예컨대, 세포에 RNP를 전달하는 또 다른 방법은 DeWitt 외, Methods 121-122:9-15 (2017) 참조). 특정 실시형태에서, 세포에 대한 CRISPR/Cas9 시스템의 투여는 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 녹아웃 또는 녹다운시킨다.
특정 실시형태에서, 유전자 조작 시스템은 포유동물 세포의 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 ZFN 시스템이다. ZFN은 징크 핑거 DNA 결합 도메인과 DNA 절단 도메인을 결합하여 생성되는 제한 효소 역할을 할 수 있다. 징크 핑거 도메인은 징크-핑거 뉴클레아제가 게놈 내에서 원하는 서열을 표적화 할 수 있도록 하는 특정 DNA 서열들을 표적하도록 조작 될 수 있다. 개별 ZFN의 DNA 결합 도메인은 일반적으로 복수의 개별 징크 핑거 반복서열들을 포함하며 각각 복수의 염기쌍을 인식 할 수 있다. 새로운 징크-핑거 도메인을 생성하는 가장 일반적인 방법은 특이성이 공지된 더 작은 징크-핑거 “모듈”들을 조합하는 것이다. ZFN에서 가장 일반적인 절단 도메인은 II형 제한 엔도뉴클레아제 FokI로부터의 비특이적 절단 도메인이다. ZFN은 표적 DNA 서열에서 이중-가닥 절단(DSB)를 생성하여 단백질들의 발현을 조절하며, 이는 상동성 템플릿의 부재시, 비-상동 말단 결합 (NHEJ)에 의해 복구될 것이다. 이러한 복구는 염기쌍을 결실 또는 삽입시켜 프레임 이동을 생성하고 유해한 단백질의 생성을 방지 할 수 있다 (Durai 외, Nucleic Acids Res.; 33 (18): 5978-90 (2005)). 또한 여러 쌍의 ZFN을 사용하여 게놈 서열의 전체 큰 세그먼트들을 완전히 제거 할 수도 있다 (Lee 외, Genome Res.; 20 (1): 81-9 (2010)).
특정 실시형태에서, 유전자 조작 시스템은 포유동물 세포의 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위한 TALEN 시스템이다. TALEN은 특정 DNA 서열을 절단하도록 조작 할 수 있는 제한 효소이다. TALEN 시스템들은 ZFN과 유사한 원리로 작동한다. TALEN은 전사 활성인자-유사 효과기 DNA-결합 도메인을 DNA 절단 도메인과 조합하여 생성된다. 전사 활성인자-유사 효과기들 (TALEs)은 특정 뉴클레오티드를 강력하게 인지하는 2개의 가변 위치들을 가진 33-34개 아미노산 반복 모티프들로 구성된다. 이들 TALE의 어레이를 조립함으로써, TALE DNA-결합 도메인은 원하는 DNA 서열에 결합하도록 조작 될 수 있으며, 이에 따라 뉴클레아제가 게놈의 특정 위치에서 이를 절단하도록 유도 할 수 있다 (Boch 외, Nature Biotechnology; 29(2):135-6 (2011)). 특정 실시형태에서, 표적 유전자는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 인코딩한다.
특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 발현은 상응하는 핵산 (예를 들어, mRNA)에 상보적인 서열들을 가지는 올리고뉴클레오티드들을 사용하여 녹다운 될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 비제한적인 예는 짧은 간섭 RNA (siRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA) 및 마이크로 RNA (miRNA)를 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 올리고뉴클레오티드들은 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 핵산 서열의 최소 일부에 상동성일 수 있으며, 상응하는 핵산 서열에 대한 상기 일부의 상동성은 최소 약 75 또는 최소 약 80 또는 최소 약 85 또는 최소 약 90 또는 최소 약 95 또는 최소 약 98 퍼센트이다. 비제한적 특정 실시형태들에서, 상기 상보적 일부는 최소 10개 뉴클레오티드 또는 최소 15개 뉴클레오티드 또는 최소 20개 뉴클레오티드 또는 최소 25개 뉴클레오티드 또는 최소 30개 뉴클레오티드를 구성할 수 있으며 안티센스 핵산, shRNA, mRNA 또는 siRNA 분자는 최대 15 또는 최대 20 또는 최대 25 또는 최대 30 또는 최대 35 또는 최대 40 또는 최대 45 또는 최대 50 또는 최대 75 또는 최대 100개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 안티센스 핵산, shRNA, mRNA 또는 siRNA 분자는 DNA 또는 비정형 또는 비자연 발생 잔기, 예를 들어, 포스포로티오에이트 잔기를 포함 할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
본원에 개시된 유전자 조작 시스템은 바이러스 벡터, 예를 들어, 감마레트로바이러스 벡터 및 렌티바이러스 벡터와 같은 레트로바이러스 벡터를 사용하여 포유동물 세포 내로 전달 될 수 있다. 레트로바이러스 벡터와 적절한 패키징 세포주의 조합들이 적절한데, 이 때 캡시드 단백질은 인간 세포들을 감염시킴에 기능적일 것이다. PA12 (Miller, 외, (1985) Mol. Cell. Biol. 5:431-437); PA317 (Miller, 외, (1986) Mol. Cell. Biol. 6:2895-2902); 및 CRIP (Danos, 외, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:6460-6464)를 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 다양한 양친화성 바이러스-생성 세포주들이 공지되어 있다. 비-양친화성 입자들, 예컨대, VSVG, RD114 또는 GALV 외피를 가진 슈도형의 입자들 및 해당 분야에 공지된 기타 입자들도 적합하다. 또한 가능한 형질도입 방법은, 세포들을 예를 들어, Bregni, 외, (1992) Blood 80:1418-1422의 방법에 의해 생산자 세포들과 직접 공동 배양하는 것, 또는 예를 들어, Xu, 외, (1994) Exp. Hemat. 22:223-230; 및 Hughes, 외, (1992) J. Clin. Invest. 89:1817의 방법에 의해 적절한 성장 인자 및 다중양이온이 있거나 없는 농축된 벡터 스톡 또는 바이러스 상청액 단독과 함께 배양하는 것을 포함한다.
다른 형질도입 바이러스 벡터들을 사용하여 본원에 개시된 포유동물 세포를 변형시킬 수 있다. 특정 실시형태들에서, 선택된 벡터는 높은 감염 효율성 및 안정한 통합 빛 발현을 나타낸다 (예컨대, Cayouette 외, Human Gene Therapy 8:423-430, 1997; Kido 외, Current Eye Research 15:833-844, 1996; Bloomer 외, Journal of Virology 71:6641-6649, 1997; Naldini 외, Science 272:263-267, 1996; 및 Miyoshi 외, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94:10319, 1997 참고). 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터들은, 예를 들면, 예를 들어, 아데노바이러스, 렌티바이러스 및 아데나-관련 바이러스 벡터, 우두 바이러스, 소 유두종 바이러스 또는 엡스타인-바 바이러스와 같은 헤르페스 바이러스를 포함한다 (또한, 예를 들면, Miller, Human Gene Therapy 15-14, 1990; Friedman, Science 244:1275-1281, 1989; Eglitis 외, BioTechniques 6:608-614, 1988; Tolstoshev 외, Current Opinion in Biotechnology 1:55-61, 1990; Sharp, The Lancet 337:1277-1278, 1991; Cornetta 외, Nucleic Acid Research and Molecular Biology 36:311-322, 1987; Anderson, Science 226:401-409, 1984; Moen, Blood Cells 17:407-416, 1991; Miller 외, Biotechnology 7:980-990, 1989; LeGal La Salle 외, Science 259:988-990, 1993; 및 Johnson, Chest 107:77S-83S, 1995에 기재된 벡터들을 참고). 레트로바이러스 벡터들은 특히 잘 개발되었으며 임상 환경에서 사용되어왔다 (Rosenberg 외, N. Engl. J. Med 323:370, 1990; Anderson 외, 미국 특허 제 5,399,346).
비-바이러스 접근법들 또한 본원에 개시된 포유동물 세포의 유전자 조작을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵산 분자는 리포펙션의 존재 하에 핵산을 투여함으로써 (Feigner 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987; Ono 외, Neuroscience Letters 17:259, 1990; Brigham 외, Am. J. Med. Sci. 298:278, 1989; Staubinger 외, Methods in Enzymology 101:512, 1983), 아시알로오로소뮤코이드-폴리리신 접합에 의해 (Wu 외, Journal of Biological Chemistry 263:14621, 1988; Wu 외, Journal of Biological Chemistry 264:16985, 1989), 또는 외과적 조건하에서 미세 주입에 의해(Wolff 외, Science 247:1465, 1990) 포유동물 세포 내로 도입될 수 있다. 유전자 전달을 위한 다른 비-바이러스 수단은 칼슘 포스페이트, DEAE 덱스트란, 전기천공 및 원형질체 융합을 사용한 시험관내 형질감염을 포함한다. 또한 리포좀도 핵산 분자를 세포로 전달하는데 잠재적으로 유익 할 수 있다. 또한 대상체의 감염된 조직으로의 정상 유전자 이식도 정상 핵산을 생체외 배양가능한 세포 유형 (예컨대, 자가 또는 이종 일차 세포 또는 이의 자손)으로 전달한 후, 세포 (또는 그 후손) 표적 조직에 주사되거나 전신 주사하여 이루어질 수 있다.
5.3 유전자 특이적 변형을 포함하는 세포
한 양상에서, 본 발명은 하나 이상의 폴리펩티드, 예를 들어 하나 이상의 효소, 예를 들어, 하나 이상의 리파제, 스테라제, 및 /또는 하이드롤라제의 감소된 또는 제거된 활성을 가진 세포 또는 이러한 하나 이상의 세포, 예를 들어, 포유동물 세포를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 세포는 BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 PLBL2의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; 및 LIPA의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SMPD1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SMPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SMPD1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SMPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; 및 PPT1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 PPT1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LPLA2; LMF1; APOC2; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 세포는 LMF1 및 APOC2의 감소된 또는 제거된 활성을 가진다.
본원에서 사용되는, 제거된 활성은, 참조 세포와 비교하여, 세포에서 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성의 제거를 지칭한다. 본원에서 사용되는, 감소된 활성은, 참조 세포와 비교하여, 세포에서 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성의 감소를 지칭한다.
본원 발명과 관련하여 유용한 세포들의 비-제한적 예들에는 CHO 세포들 (예컨대, DHFR CHO 세포들), dp12.CHO 세포들, CHO-K1 (ATCC, CCL-61), SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 계통 (예컨대, COS-7 ATCC CRL-1651), 인간 배아 신장 계통 (예컨대, 현탁 배양에서 성장을 위해 서브클로닝된 293 또는 293 세포들), 새끼 햄스터 신장 세포들 (예컨대, BHK, ATCC CCL 10), 마우스 정소 세포들 (예컨대 TM4), 원숭이 신장 세포들 (예컨대, CV1 ATCC CCL 70), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포들 (예컨대, VERO-76, ATCC CRL-1587), 인간 자궁경부 암종 세포들 (예컨대, HELA, ATCC CCL 2), 개과 신장 세포들 (예컨대, MDCK, ATCC CCL 34), 버팔로 래트 간 세포들 (예컨대, BRL 3A, ATCC CRL 1442), 인간 폐 세포들 (예컨대, W138, ATCC CCL 75), 인간 간 세포들 (예컨대, Hep G2, HB 8065), 마우스 포유동물 종양 (예컨대, MMT 060562, ATCC CCL51), TRI 세포들, MRC 5 세포들, FS4 세포들, 인간 간암종 계통 (예컨대, Hep G2), 골수종 세포주들 (예컨대, Y0, NS0 및 Sp2/0)이 포함된다. 특정 실시형태들에서, 세포들은 CHO 세포들이다. CHO 숙주 세포들의 또 다른 비-제한적 예들에는 CHO K1SV 세포들, CHO DG44 세포들, CHO DUKXB-11 세포들, CHOK1S 세포들 및 CHO K1M 세포들이 포함된다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포들은 관심 생성물을 발현한다. 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 재조합 단백질이다. 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 단클론 항체이다. 관심 생성물의 추가적인 비-제한적 예들은 섹션 5.5에 제공된다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포들은 상업적으로 유용한 양의 관심 생성물의 생산을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 세포는 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에 비해 생산 공정의 성분들의 분해 수준 감소를 유도함으로써 적어도 부분적으로는 상업적으로 유용한 양의 관심 생성물의 생산을 촉진한다. 특정 실시형태에서, 생산 공정의 성분들은 지질 함유 성분들이다. 특정 실시형태에서, 지질 함유 성분들은 세제이다. 특정 실시형태에서, 세제는 폴리소르베이트 함유 성분이다. 특정 실시형태에서, 폴리소르베이트 함유 성분은 PS20(폴리소르베이트 20 또는 Tween 20)이다. 특정 실시형태에서, 폴리소르베이트 함유 성분은 PS80(폴리소르베이트 80 또는 Tween 80)이다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 세포는 생산 공정의 성분, 예를 들어, PS20의 분해를, 참조 세포, 예를 들어, WT CHO 세포에서 관찰된 상응하는 PS20 분해의 약 90% 미만, 약 80% 미만, 약 70% 미만, 약 60% 미만, 약 50% 미만, 약 40% 미만, 약 30% 미만, 약 20% 미만, 약 10% 미만, 약 5% 미만, 약 4% 미만, 약 3% 미만, 약 2% 미만 또는 약 1% 미만으로 감소시킬 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산을 포함 할 수 있다. 일정한 실시형태에서, 핵산은 하나 또는 그 이상의 벡터, 예를 들면, 발현 벡터 내에 존재할 수 있다. 한 유형의 벡터는 “플라스미드”이며, 이는 추가적인 DNA 세그먼트가 결찰될 수 있는 환형 이중 가닥 DNA 루프를 지칭한다. 또다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기서 추가적인 DNA 세그먼트가 바이러스 유전체 내에 결찰될 수 있다. 특정 벡터(예를 들면, 세균 복제 기점을 갖는 세균 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터)는 그들이 도입되는 숙주 세포에서 자동 복제할 수 있다. 다른 벡터 (예를 들면, 비-에피솜 포유동물 벡터)는 숙주 세포 내로 도입 시에 숙주 세포의 유전체 내로 통합되고, 그리고 따라서, 숙주 유전체와 함께 복제된다. 또한, 특정 벡터, 발현 벡터는 이들이 작동가능하게 연결된 유전자의 발현을 지시 할 수 있다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 플라스미드 (벡터)의 형태이다. 본원에서 사용하기 위한 발현 벡터들의 또 다른 비-제한적 예들에는 동등한 기능들을 제공하는 바이러스 벡터들 (예컨대, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)이 포함된다.
특정 실시형태들에서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산이 본원에 개시된 숙주 세포에 도입될 수 있다. 일정한 실시형태에서, 세포 내로 핵산의 도입은 형질감염, 전기천공, 미량주사, 핵산 서열을 내포하는 바이러스 또는 박테리오파지 벡터로 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 마이크로세포-매개된 유전자 전달, 스페로플라스트 융합 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는, 당해 분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 실행될 수 있다. 특정 실시형태에서, 상기 숙주 세포는 진핵, 예컨대 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구 세포 (예컨대, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
특정 실시형태에서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 무작위로 통합 될 수 있다 (“무작위 통합” 또는 “RI”). 예를 들어(그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 감소된 또는 제거된 활성을 가지도록 조절되어 있는 세포의 게놈에 무작위 통합될 수 있다.
특정 실시형태들에서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 표적화된 방식으로 통합될 수 있다 (“표적화된 통합” 또는 “TI”). 예를 들어(그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 감소된 또는 제거된 활성을 가지도록 조절되어 있는 세포의 게놈에 표적화된 방식으로 통합될 수 있다. “통합 부위”는 숙주 세포 게놈 내부의 핵산 서열을 포함하며 이 안에 외인성 뉴클레오티드 서열이 삽입된다. 특정 실시형태들에서, 통합 부위는 숙주 세포 게놈상의 2개의 인접한 뉴클레오티드들 사이에 존재한다. 특정 실시형태들에서, 통합 부위는 뉴클레오티드 서열들의 스트레치를 포함한다. 특정 실시형태들에서, 통합 부위는 CHO 숙주 세포 게놈의 특정 유전자좌 내에 위치한다. 특정 실시형태들에서, 통합 부위는 CHO 숙주 세포의 내인성 유전자 내부에 존재한다. 당업계에 공지된 임의의 통합 부위는 본원에 개시된 발명에 따라 조절되고 이와 함께 사용될 수 있다. 표적화된 통합은 당업계에 공지된 방법들 및 시스템들에 의해 매개될 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 본원에 그 전문 내용이 참고문헌으로 포함되는 2018년 12월 21일에 출원된 국제 특허 출원 제 PCT/US18/067070에 개시된 방법 및 시스템들이 표적화된 통합을 위해 사용될 수 있다.
특정 실시형태들에서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 트랜스포사제-기반 통합을 사용하여 숙주 세포 게놈에 통합될 수 있다. 트랜스포사제 기반 통합 기술은 예를 들어, Trubitsyna 외, Nucleic Acids Res. 45(10):e89 (2017), Li 외, PNAS 110(25):E2279-E2287 (2013) 및 WO 2004/009792에 개시되어 있으며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태에서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 숙주 세포 게놈에 무작위로 통합 될 수 있다 (“무작위 통합” 또는 “RI”). 특정 실시형태들에서, 무작위 통합은 당업계에 공지된 임의의 방법 또는 시스템들에 의해 매개될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 무작위 통합은 MaxCyte STX® 전기천공 시스템에 의해 매개된다.
특정 실시형태들에서, 표적화 통합은 무작위 통합과 조합될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 표적화 통합 후 무작위 통합이 이어질 수 있다. 특정 실시형태들에서, 무작위 통합 후 표적화 통합이 이어질 수 있다. 예를 들어(그러나 제한은 아님), 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 감소 또는 제거된 활성을 가지도록 조절되어 있는 세포의 게놈에 무작위 통합될 수 있으며, 동일한 관심 생성물을 인코딩하는 핵산은 표적화된 방식으로 세포 게놈에 통합될 수 있다.
특정 실시형태에서, 본원에 개시된 숙주 세포들은 하나 이상의 변경된 효소 유전자들을 포함한다. 특정 실시형태에서, 효소 유전자에 대한 변경은 효소 활성을 감소 또는 제거한다. 특정 실시형태에서, 본원에 개시된 숙주 세포는 하나 이상의 변형된 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 유전자들을 포함한다. 특정 실시형태에서, 후속되는 변경된 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 유전자의 전사는 감소 또는 제거된 활성을 가지는 단백질을 코딩한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 코딩 영역의 파괴에 의해 변경된다. 특정 실시형태에서, 유전자 변경은 2대립유전자 변경을 포함한다. 특정 실시형태에서, 효소 유전자 변경은 1개 이상의 염기쌍, 2개 이상의 염기쌍, 3개 이상의 염기쌍, 4개 이상의 염기쌍, 5개 이상의 염기쌍, 6개 이상의 염기쌍, 7개 이상의 염기쌍, 8개 이상의 염기쌍, 9개 이상의 염기쌍, 10개 이상의 염기쌍, 11개 이상의 염기쌍, 12개 이상의 염기쌍, 13개 이상의 염기쌍, 14개 또는 더 많은 염기쌍, 15개 이상의 염기쌍, 16개 이상의 염기쌍, 17개 이상의 염기쌍, 18개 이상의 염기쌍, 19개 이상의 염기쌍, 또는 20개 이상의 염기쌍의 결실을 포함한다.
5.4. 세포 배양 방법
한 양상에서, 본 발명은 본원에 개시된 세포를 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 생산 방법을 제공한다. 당업계에 공지된 포유동물 세포에 대한 적합한 배양 조건들을 본원에서 세포를 배양하기 위해 사용할 수 있거나 (J. Immunol. Methods (1983) 56:221-234), 또는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다 (예를 들어, Animal Cell Culture: A Practical Approach 2nd Ed., Rickwood, D. and Hames, B. D., eds. Oxford University Press, New York (1992) 참조).
포유동물 세포 배양은 배양되는 특정 세포에 적합한 배지에서 준비될 수 있다. 상업적으로 구입가능한 배지, 가령, Ham사의 F10 (Sigma), 최소 필수 배지 (MEM, Sigma), RPMI-1640 (Sigma) 및 Dulbecco사의 변형된 Eagle 배지 (DMEM, Sigma)는 예시적인 영양 솔루션이다. 또한, Ham 및 Wallace, (1979) Meth. Enz., 58:44; Barnes and Sato, (1980) Anal. Biochem., 102:255; 미국 특허 제4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; 5,122,469 또는 미국 특허 제4,560,655; 국제 특허출원 공개공보 제WO 90/03430; 및 WO 87/00195에 기재된 임의의 배지 (이들 모두의 개시내용은 본원에 참고로 포함됨)가 배양 배지로 사용될 수 있다. 이러한 배지는 필요에 따라 호르몬 및/또는 기타 성장 인자 (가령, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피 성장 인자), 염 (가령, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘 및 포스페이트), 완충액 (가령, HEPES), 뉴클레오시드 (가령, 아데노신 및 티미딘), 항생제 (가령, 겐타마이신 (겐타미신), 미량 원소 (일반적으로 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기 화합물로 정의됨), 지질 (가령, 리놀레산 또는 기타 지방산) 및 이들의 적합한 담체, 포도당 또는 균등한 에너지원으로 보충 될 수 있다. 임의의 다른 필요한 보충제들은 또한 당업자들에게 공지된 적절한 농도로 포함될 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 및/또는 제거하도록 변형되어 있는 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 임의의 적합한 배지를 사용하여 CHO 세포를 배양할 수 있다. 특정 실시형태에서, CHO 세포를 배양하기 위한 적합한 배지는, 예를 들어, 일부 성분들, 예를 들어, 아미노산, 염, 설탕 및 비타민, 그리고 선택적으로 글리신, 하이포잔틴 및 티미딘; 재조합 인간 인슐린, 가수분해된 펩톤, 예를 들어, Primatone HS 또는 Primatone RL(Sheffield, 영국), 또는 등가물; 세포 보호제, 예를 들어, 플루로닉 F68 또는 균등한 플루로닉 폴리올; 젠타마이신; 및 미량 원소의 농도가 변형된 기본 배지 성분, 예를 들어, DMEM/HAM F-12계 제형 (DMEM 및 HAM F12 배지의 조성에 대해서는, 미국 표준 균주(American Type Culture Collection) 카탈로그인 Cell Lines and Hybridomas, Sixth Edition, 1988, 346-349 페이지의 배양 배지 제형 참조) (미국 특허 제5,122,469호에 기술된 배지의 제형이 특히 적절함)을 함유할 수 있다.
특정 실시형태에서, 특정 폴리펩티드, 예를 들어, BAX; BAK; LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 폴리펩티드의 활성을 감소 및/또는 제거하도록 변형되어 있는 포유동물 세포는 재조합 단백질을 발현하는 세포이다. 재조합 단백질은 다양한 세포 배양 조건들하에서 관심 생성물을 발현하는 세포들을 성장시킴으로써 제조될 수 있다. 예를 들면, 대규모 또는 소규모 단백질 생산을 위한 세포 배양 절차는 본 발명의 내용에서 잠재적으로 유용하다. 유동층 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 롤러 병 배양, 진탕 플라스크 배양, 또는 교반식 탱크 생물반응기 시스템을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 절차들이 마이크로담체가 존재 또는 부재하는 후자의 2개 시스템에서 사용될 수 있으며 대안적으로 회분식, 유가식, 또는 연속식으로 작동될 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본 발명의 세포 배양은 교반식 탱크 생물반응기 시스템에서 수행되고 유가식 배양 절차가 사용된다. 유가식 배양에서, 포유동물 숙주 세포들 및 배양 배지는 초기에 배양 용기에 공급되고 추가적인 배양 영양소들은 배양하는 동안 연속으로 또는 별개의 증분으로 배양물에 공급되며, 배양 종료 전 주기적으로 세포 및/또는 생성물을 수집하거나 수집하지 않는다. 유가식 배양은, 예를 들면, 반-연속 유가식 배양을 포함할 수 있으며, 여기서 주기적으로 전체 배양물 (세포들 및 배지 포함)이 제거되고 새로운 배지로 대체된다. 유가식 배양은 세포 배양을 위한 모든 성분 (세포 및 모든 배양 영양소 포함)이 배양 과정 시작시 배양 용기에 공급되는 단순 회분식 배양과 구별된다. 유가식 배양은 과정 중에 상청액이 배양 용기로부터 제거되지 않는 한 관류 배양과도 또한 구별 될 수 있다 (관류 배양에서, 세포는, 예컨대, 여과, 캡슐화, 마이크로담체에 고정, 등에 의해 배양물에서 제한되며, 배양 배지는 연속적으로 또는 간헐적으로 도입하고 배양 용기로부터 제거된다).
특정 실시형태들에서, 배양 세포들은 특정 숙주 세포 및 고려되는 특정 생산 계획에 적합할 수 있는 임의의 계획 또는 경로에 따라 증폭될 수 있다. 따라서, 본 발명은 단일 단계 또는 다단계 배양 절차를 고려한다. 단일 단계 배양에서, 숙주 세포는 배양 환경에 접종되고, 본 발명의 공정들이 세포 배양의 단일 생산 단계 동안 사용된다. 대안적으로, 다단계 배양이 구상된다. 다단계 배양에서 세포들은 여러 단계들 또는 기들에서 배양 될 수 있다. 예를 들면, 세포들은 제1 단계 또는 성장 단계 배양에서 성장될 수 있으며, 여기서 저장으로부터 제거될 수 있는 세포들은, 성장 촉진 및 높은 생존력에 적합한 배지에 접종된다. 숙주 세포 배양물에 신선한 배지를 첨가함으로써 세포는 적절한 시기 동안 성장 단계에서 유지 될 수 있다.
특정 실시형태들에서, 유가식 또는 연속식 세포 배양 조건들은 세포 배양의 성장 단계에서 포유동물 세포들의 성장을 향상시키기 위해 고안된다. 성장 단계에서 세포는 성장에 최대화된 조건하에서 그리고 이러한 시기동안 성장된다. 온도, pH, 용존 산소 (dO2) 등과 같은 배양 조건이 특정 숙주와 함께 사용되며 이는 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 일반적으로 pH는 산 (예컨대, CO2) 또는 염기 (예컨대, Na2CO3 또는 NaOH)를 사용하여 약 6.5와 7.5 사이의 수준으로 조정된다. CHO 세포와 같은 포유동물 세포를 배양하는데 적합한 온도 범위는 약 30° 내지 38°C이고 적합한 dO2는 공기 포화도의 5-90%이다.
특정 단계에서 세포들을 사용하여 생산 단계 또는 세포 배양 단계를 접종 할 수 있다. 대안적으로, 전술한 바와 같이, 상기 생산 단계 또는 생산기는 접종 또는 성장 단계 또는 성장기와 연속일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본 발명에 기재된 배양 방법들은 세포 배양으로부터, 예컨대, 세포 배양의 생산 단계로부터 생성물을 수확하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본 발명의 세포 배양 방법들에 의해 생산된 생성물은 제3 생물반응기, 예컨대, 생산 생물반응기로부터 수확될 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 개시된 방법들은 세포 배양의 생산 단계 완료시 생성물을 수확하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 생산 단계가 완료되기 전에 생성물을 수확 할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 특정 세포 밀도가 도달되었으면 세포 배양물로부터 생성물을 수확할 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 세포 밀도는 수확 전 약 2.0 x 107개 세포들/mL 내지 약 5.0 x 107개 세포들/mL 일 수 있다.
특정 실시형태들에서, 세포 배양물로부터 생성물을 수확하는 것은 원심분리, 여과, 음향파 분리, 응집 및 세포 제거 기술 중 하나 이상을 포함 할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 숙주 세포로부터 분비 될 수 있거나 막-결합, 세포질 또는 핵 단백질 일 수 있다. 특정 실시형태들에서, 폴리펩티드의 가용성 형태들은 조절된 세포 배양 배지로부터 정제될 수 있고, 폴리펩티드의 막-결합 형태들은 발현 세포들로부터 전체 막 분획을 제조하고 TRITON® X-100 (EMD Biosciences, San Diego, Calif.)와 같은 비이온성 세재로 이들 막을 추출함으로써 정제될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 세포질 또는 핵 단백질은 숙주 세포들을 용해시키고 (예컨대, 물리적 힘, 초음파 및/또는 세제에 의해), 세포막 분획을 원심분리하여 제거하고 상청액을 보유함으로써 준비될 수 있다.
5.5 생성물
본 발명의 세포 및/또는 방법을 사용하여 본원에 개시된 세포에 의해 발현 될 수 있는 임의의 관심 생성물을 생성 할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본 발명의 세포 및/또는 방법은 폴리펩티드, 예컨대, 포유동물 폴리펩티드의 생산을 위해 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 입자의 생산에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 비-제한적인 예는 호르몬, 수용체, 융합 단백질, 조절 인자, 성장 인자, 보체 시스템 인자, 효소, 응고 인자, 항-응고 인자, 키나제, 사이토카인, CD 단백질, 인터루킨, 치료 단백질, 진단 단백질 및 항체를 포함한다. 본 발명의 세포들 및/또는 방법들은 생산되는 분자, 예컨대, 항체에 특이적이지 않다.
특정 실시형태들에서, 본 발명의 방법들은 치료 및 진단 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항체의 생산에 사용될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본 발명의 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 단일특이성 항체 (예컨대, 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열로 구성된 항체, 이러한 쌍의 다량체 포함), 다중특이성 항체 및 이의 항원 결합 단편일 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 다중특이성 항체는 이중특이성 항체, 이중에피토프 항체, T-세포-의존성 이중특이성 항체 (TDB), 이중 작용 FAb (DAF) 또는 이의 항원 결합 단편들일 수 있다.
5.5.1 다중특이성 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생산된 항체는 다중특이성 항체, 예컨대, 이중특이성 항체이다. “다중특이성 항체”는 최소 2가지 상이한 부위들, 즉, 상이한 항원들 상의 상이한 에피토프 (즉, 이중특이성) 또는 동일한 항원 상의 상이한 에피토프 (즉, 이중에피토프)에 대한 결합 특이성을 가지는 단클론 항체들이다. 특정 양상들에서, 다중특이성 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 가진다. 다중특이성 항체는 본원에 기재된 전장 항체 또는 항체 단편들로 준비될 수 있다.
다중특이성 항체를 제조하는 기술들에는 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 동시발현 (Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)) 및 “놉-인-홀” 조작기술 (예를 들어, 미국 특허 제 5,731,168, 및 Atwell 등, J. Mol. Biol. 270:26 (1997) 참조)이 포함되지만 이에 제한되지는 않는다. 다중특이성 항체는 또한 항체 Fc-이종이량체 분자를 만들기 위해 정전기 조정 효과를 조작하여 (예를 들어, WO　2009/089004 참조); 2개 이상의 항체 또는 단편을 가교결합하여 (예를 들어, 미국 특허 제4,676,980, 및 Brennan 외, Science, 229: 81 (1985) 참조); 류신 지퍼를 사용하여 이중특이성 항체를 생산하여 (예를 들어, Kostelny 외, J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605 참조); 경쇄 미스페어링 문제를 피하기 위한 통상적인 경쇄 기술을 사용하여(예: WO 98/50431 참조); “디아바디” 기술을 사용하여 이중특이성 항체 단편들을 제조하여 (예를 들어, Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) 참조); 그리고 단일-사슬 Fv (sFv) 이량체들을 사용하여 (예를 들어, Gruber 외, J. Immunol., 152:5368 (1994) 참조); 그리고 예를 들어, Tutt 외, J. Immunol. 147: 60 (1991)에 기재된 바와 같이 삼중특이성 항체를 제조하여 제조될 수 있다.
예를 들면, “옥토퍼스 항체”, 또는 DVD-Ig를 비롯한, 3개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이성 항체의 다른 비-제한적인 예는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 찾을 수 있다. 이중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, “이중 작용 Fab” 또는 “DAF”를 포함한다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539).
다중특이성 항체는 또한 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결함 아암들에서 도메인 교차에 의해, 즉, VH/VL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447 참조), CH1/CL 도메인들 (예컨대, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 아암들 (예컨대, WO 2009/080251, WO 2016/016299 참고, 또한 Schaefer 외, PNAS, 108 (2011) 1187-1191, 및 Klein 외, MAbs 8 (2016) 1010-20 참고)을 교환함으로써 비대칭 형태로 제공될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 다중특이성 항체는 교차-Fab 단편을 포함한다. 용어 “교차-Fab 단편” 또는 “xFab 단편” 또는 “교차 Fab 단편”은 중쇄 및 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역이 교환된 Fab 단편을 지칭한다. 교차 Fab 단편은 경쇄 가변 영역(VL)과 중쇄 불변 영역 1(CH1)로 구성된 폴리펩티드 사슬, 및 중쇄 가변 영역(VH)과 경쇄 불변 영역(CL)으로 구성된 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭 Fab 팔은 또한, 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입하여 정확한 Fab 페어링을 지시하도록 함으로써 조작될 수 있다. 예를 들어, WO 2016/172485 참조.
다중특이성 항체에 대한 다양한 추가적인 분자 형태들이 당업계에 공지되어 있으며 본원에 포함된다 (예를 들어, Spiess 외, Mol. Immunol. 67 (2015) 95-106 참조).
특정 실시형태들에서, 본원에 또한 포함되는 특정 유형의 다중특이성 항체는 표적 세포를 사멸시키기 위한 T 세포들의 재표적화를 위해, 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 상의 표면 항원 및 T 세포 수용체 (TCR) 복합체, 가령, CD3의 활성화 불변 성분에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이성 항체이다.
이러한 목적에 유용할 수 있는 이중특이성 항체 형태들의 추가적인 비제한적 예들에는 2개의 scFv 분자가 가요성 링커에 의해 융합되는 이른바 “BiTE” (이중특이성 T 세포 관여자) 분자 (참조: 예를 들면, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 및 WO 2008/119567, Nagorsen and B
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uerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); 디아바디 (Holliger 외, Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이들의 유도체, 예컨대 탠덤 디아바디 (“TandAb”; Kipriyanov 외, J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); 디아바디 형태에 기반하나 추가 안정화를 위한 C 말단 이황화 다리를 특징으로 하는 “DART” (이중 친화성 재표적화) 분자 (Johnson 외, J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), 그리고 전체 하이브리드 마우스/래트 IgG 분자인 이른바 트리오맙 (Seimetz 외, Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)에서 검토)이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 본원에 포함되는 특정한 T 세포 이중특이성 항체 형태들은 WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac 외, Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498에 기재되어 있다.
5.5.2 항체 단편
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 항체 단편이다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH 또는 F(ab')2 단편, 특히, Fab 단편이다. 온전한 항체들의 파파인 분해는 각각 중쇄 및 경쇄 가변 도메인(각각 VH 및 VL) 및 경쇄의 불변 도메인(CL) 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1) 또한 함유하는 2개의 동일한 항원-결합 단편들, 소위 “Fab” 단편들을 생성한다. 따라서 용어 “Fab 단편”은 VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄 및 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge)의 영역으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함하여 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기들의 부가에 의해, Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 본 명세서에서 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 보유하는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위(2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 생성한다. 구제(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고, 생체내 반감기가 증가된 Fab 및 F(ab')2 단편들의 논의는 미국 특허 제 5,869,046을 참조한다.
특정 실시형태에서, 항체 단편은 디아바디, 트리바디 또는 테트라바디이다. “디아바디”는 이가 또는 이중특이성일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 가진 항체 단편들이다. 예를 들어, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)를 참조하라. 트리아바디 및 테트라바디 또한 Hudson 외, Nat. Med. 9:129-134 (2003)에 기재되어 있다.
한 추가 양상에서, 항체 단편은 단일 사슬 Fab 단편이다. “단일 사슬 Fab 단편”또는 “scFab”은 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 연결기로 구성된 폴리펩티드로서, 여기서 상기 항체 도메인 및 상기 연결기는 N-말단에서 C-말단 방향으로 다음 순서 중 하나를 갖는다: a) VH-CH1-연결기-VL-CL, b) VL-CL-연결기-VH-CH1, c) VH-CL-연결기-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-연결기-VH-CL. 특히, 상기 링커는 최소 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 내지 50개 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인과 CH1 도메인 사이의 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 또한, 이들 단일 사슬 Fab 단편은 (예를 들어, Kabat 넘버링에 따라 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100) 시스테인 잔기의 삽입을 통한 사슬간 이황화 결합의 생성에 의해 추가로 안정화 될 수 있다.
다른 양상에서, 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다. “단일 사슬 가변 단편” 또는 “scFv”는 링커에 의해 연결된, 항체의 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 링커는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 그리고 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이 단백질은 불변 영역의 제거와 링커의 도입에도 불구하고 원래 항체의 특이성을 유지한다. scFv 단편들의 리뷰는 예로써, Pluckth
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n, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994); WO 93/16185; 그리고 미국 특허 제 5,571,894 및 5,587,458을 또한 참고한다.
다른 양상에서, 항체 단편은 단일 도메인 항체이다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부 또는 경쇄 가변 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 양상에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면, 미국 특허 제6,248,516 B1).
항체 단편은 다양한 기술에 의해 제조될 수 있으며, 이에는 온전한 항체의 단백질분해 절단을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
5.5.3 키메라 및 인간화 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 키메라 항체이다. 특정 키메라 항체는, 예를 들어, 미국 특허 제4,816,567; 및 Morrison 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에 기재되어 있다. 한 예에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역(예를 들면, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 한 추가 예에서, 키메라 항체는 분류 또는 하위분류가 모체 항체의 분류로부터 변화되어 있는 “분류 전환된” 항체이다. 키메라 항체는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
일정한 양상에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비-인간 항체는 비-인간 모체 항체의 특이성 및 친화도를 유지하면서 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDRs (또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FRs (또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 또는 그 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화된 항체는 임의선택적으로 인간 불변 영역의 최소한 일부분을 또한 포함할 것이다. 일정한 실시형태에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, CDR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이의 제조 방법은, 예를 들어, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에 논의되어 있으며, 예를 들어, Riechmann 외, Nature 332:323-329 (1988); Queen 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); 미국 특허 제5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321, 및 7,087,409; Kashmiri 외, Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 이식을 기재); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (“표면노출잔기변형(resurfacing)”을 기재); Dall'Acqua 외, Methods 36:43-60 (2005) (“FR 셔플링”을 기재); 및 Osbourn 외, Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka 외, Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링으로의 “유도된 선별” 접근법을 기재)에 상세히 기재되어 있다. 인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하나, 이에 제한되지 않는다: “최적-적합 (best-fit)” 방법을 이용하여 선별된 프레임워크 영역 (예로써, Sims 외, J. Immunol. 151:2296 (1993) 참조); 경쇄 또는 중쇄 가변적 영역의 특정 하위 집단의 인간항체의 공통 서열로부터 유도된 프레임워크영역 (예로써, Carter 외, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 그리고 Presta 외, J. Immunol., 151:2623 (1993) 참조); 인간 성숙 (체세포 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (예로써, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008) 참조); 그리고 FR 라이브러리 스크리닝으로부터 유도된 프레임워크 영역(예로써, Baca 외, J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok 외, J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996) 참조).
5.5.4 인간 항체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 해당 분야에 공지된 다양한 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에 기재되어 있다.
인간 항체는 항원 공격에 반응하여 온전한 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 갖는 온전한 항체를 생산하도록 변형된 형질전환 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이러한 동물은 일반적으로 내인성 면역글로불린 유전자좌를 대체하는, 또는 염색체외에 존재하거나 동물의 염색체에 무작위로 통합된, 인간 면역글로불린 유전자좌의 전체 또는 일부를 포함한다. 이러한 유전자삽입 마우스에서 상기 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화 되어 있다. 유전자삽입 동물로부터 인간 항체를 획득하는 방법은 Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)을 참조하라. 또한, 예로써, 미국 특허 제 6,075,181 및 6,150,584에서는 XENOMOUSETM 기술을 설명하고; 미국 특허 제 5,770,429에서는 HUMAB® 기술을 설명하고; 미국 특허 제 7,041,870에서는 K-M MOUSE® 기술을 설명하고, 그리고 미국 공개특허출원 US 2007/0061900에서는 VELOCIMOUSE® 기술을 설명한다. 그러한 동물에 의해 생성된 손상되지 않은 항체로부터 얻은 인간 가변 영역은 예를 들어, 상이한 인간 불변 영역과 결합시킴으로써 추가로 변형될 수 있다.
인간 항체는 하이브리도마 기반 방법으로도 만들 수 있다. 인간 단클론 항체를 만들기 위한 인간 골수종 및 마우스-인간 이종골수종 세포주가 설명된 바 있다. (예컨대, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur 외, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner 외, J. Immunol., 147: 86 (1991)참조) 인간 B-세포 하이브리도마 기술을 통하여 생성된 인간 항체가 Li 외, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법들은 예를 들면, 미국 특허 제7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기술 (Trioma 기술)은 또한 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에 기재되어 있다.
5.5.5 표적 분자
본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체에 의해 표적화 될 수 있는 분자의 비-제한적인 예는 가용성 혈청 단백질 및 이들의 수용체 및 기타 막 결합 단백질 (예를 들어, 아데신)을 포함한다. 특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (APO3L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO.k로 구성된 그룹에서 선택된, 하나, 둘 이상의 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및 사이토카인 수용체들에 결합할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CCLI (1-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/엑소두스-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR- L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 구성된 그룹에서 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질에 결합할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 항체 (예컨대, 다중특이성 항체, 가령, 이중특이성 항체)는 다음에서 선택된 하나 이상의 표적 분자들에 결합할 수 있다: 0772P (CA125, MUC16) (즉, 난소 암 항원), ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그리칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; 아밀로이드 베타; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1 (아스파테이트 베타-하이드록실라제 도메인; LOC253982); AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-유형 IB); BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; 브레비칸; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3β); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3α); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-Iβ); CCL5(RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRβ/RA);CCR3 (CKR/CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6); CCR7 (CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 동형); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A (CD79α, 면역글로불린-관련 알파, B 세포-특이적 단백질); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (클라우딘-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, 및 DCAL2); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; 보체 인자 D; CR2; CRP; CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-결합된 수용체); CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR (엔도텔린 B형 수용체); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1); FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 고정 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FEL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GDNF-Ra1 (GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10); GPR19 (G 단백질-결합된 수용체 19; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81 (FKSG80); GPR172A (G 단백질-결합된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (CIO); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 소단위 (Ia 항원); HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; ILIA; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); 인플루엔자 A; 인플루엔자 B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRTA2 (면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전위 관련 2); ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 인테그린); α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); LGR5 (류신-풍부 반복서열-함유 G 단백질-결합된 수용체 5; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복서열 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질); Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226); MACMARCKS; MAG 또는 OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP; MIB1; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린); MS4A1; MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-111); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MY088; Napi3b (NaPi2b로도 공지) (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 패밀리 34 (소듐 포스페이트), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b); NCA; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; OX40; P2RX7; P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트된 이온 채널 5); PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA; POGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자); PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (ret 원-종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); RGSI; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYEI (상피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7가지 트롬보스폰딘 반복서열 (유형 1 및 유형 1-유사), 막경유 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINE1(PAI-1); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP (전립선의 6가지 막경유 상피 항원); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1, 전립선 암 관련 단백질 1, 전립선 2의 6가지 막경유 상피 항원, 6가지 막경유 전립선 단백질); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2 (추정 막경유 프로테오글리칸); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인들 1을 가지는 막경유 단백질; 토모레귤린-1); TMEM46 (시사 상동체 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSFS (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; 톨-유사 수용체; TOP2A (국소이성화효소 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118 (링 핑거 단백질, 막경유 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; 및 ZFPM2.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CD 단백질, 가령, CD3, CD4, CD5, CD16, CD19, CD20, CD21 (CR2 (보체 수용체 2) 또는 C3DR (C3d/엡스타인 바 바이러스 수용체) 또는 Hs.73792); CD33; CD34; CD64; CD72 (B-세포 분화 항원 CD72, Lyb-2); CD79b (CD79B, CD79β, IGb (면역글로불린-관련 베타), B29); ErbB 수용체 패밀리, 가령, EGF 수용체, HER2, HER3, 또는 HER4 수용체의 CD200 구성원; 세포 부착 분자, 가령, LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, 알파4/베타7 인테그린, 및 이의 알파 또는 베타 소단위를 포함하는 알파v/베타3 인테그린 (예컨대, 항-CD11a, 항-CD18, 또는 항-CD11b 항체); 성장 인자, 가령, VEGF-A, VEGF-C; 조직 인자 (TF); 알파 인터페론 (알파IFN); TNF알파, 인터루킨, 가령, IL-1 베타, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-9, IL-13, IL 17 AF, IL-1S, IL-13R 알파1, IL13R 알파2, IL-4R, IL-5R, IL-9R, IgE; 혈액형 항원들; flk2/flt3 수용체; 비만 (OB) 수용체; mpl 수용체; CTLA-4; RANKL, RANK, RSV F 단백질, 단백질 C 등에 결합할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법은 보체 단백질 C5에 특이적으로 결합하는 항체 (또는 다중특이성 항체, 가령, 이중특이성 항체) (예컨대, 인간 C5에 특이적으로 결합하는 항-C5 작용제 항체)를 생산하는데 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 항-C5 항체는 (a) SSYYMA (서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호 26)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DAGYDYPTHAMHY (서열 번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) RASQGISSSLA (서열 번호 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) GASETES (서열 번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) QNTKVGSSYGNT (서열 번호 30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 항-C5 항체는 (a) SSYYMA (서열 번호 1)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) AIFTGSGAEYKAEWAKG (서열 번호 26)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DAGYDYPTHAMHY (서열 번호 27)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열; 및/또는 (d) RASQGISSSLA (서열 번호 28)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) GASETES (서열 번호 29)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) QNTKVGSSYGNT (서열 번호 30)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL) 서열을 포함한다. 상기 중쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3 및 경쇄 가변 영역의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 서열은 US 2016/0176954에 각각 서열 번호 117, 서열 번호 118, 서열 번호 121, 서열 번호 122, 서열 번호 123, 및 서열 번호 125로서 개시되어 있다. (US 2016/0176954의 표 7 및 8 참조.)
특정 실시형태에서, 항-C5 항체는 VH 및 VL 서열들
QVQLVESGGG LVQPGRSLRL SCAASGFTVH SSYYMAWVRQ APGKGLEWVG AIFTGSGAEY KAEWAKGRVT ISKDTSKNQV VLTMTNMDPV DTATYYCASD AGYDYPTHAM HYWGQGTLVT VSS (서열 번호 31)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQGIS SSLAWYQQKP GKAPKLLIYG ASETESGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQN TKVGSSYGNT FGGGTKVEIK (서열 번호 32) 각각을 포함하고, 이들 서열의 번역 후 변형도 포함된다. 상기 VH 및 VL 서열들은 US 2016/0176954에 각각 서열 번호 106 및 서열 번호 111로 개시되어 있다. (US 2016/0176954의 표 7 및 8 참조.) 특정 실시형태들에서, 항-C5 항체는 305L015이다 (US 2016/0176954 참고).
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 방법에 의해 생성된 항체는 OX40에 결합할 수 있다 (예컨대, 인간 OX40에 특이적으로 결합하는 항-OX40 작용제 항체). 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 (a) DSYMS(서열 번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) DMYPDNGDSSYNQKFRE(서열 번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) APRWYFSV(서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) RASQDISNYLN(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 CDR1; (e) YTSRLRS(서열 번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 CDR2; 및 (f) QQGHTLPPT(서열 번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 (a) DSYMS(서열 번호 2)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) DMYPDNGDSSYNQKFRE(서열 번호 3)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및 (c) APRWYFSV(서열 번호 4)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH) 서열; 및/또는 (a) RASQDISNYLN(서열번호 5)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 CDR1; (b) YTSRLRS(서열 번호 6)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변영역 CDR2; 및 (c) QQGHTLPPT(서열 번호 7)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 또는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 VH 및 VL 서열들
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT DSYMSWVRQA PGQGLEWIGD MYPDNGDSSY NQKFRERVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCVLAP RWYFSVWGQG TLVTVSS (서열 번호 8)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKLLIYY TSRLRSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ GHTLPPTFGQ GTKVEIK (서열 번호 9) 각각을 포함하고, 이들 서열의 번역 후 변형도 포함된다.
특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 (a) NYLIE(서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) VINPGSGDTYYSEKFKG(서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; (c) DRLDY(서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3; (d) HASQDISSYIV(서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (e) HGTNLED(서열 번호 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (f) VHYAQFPYT(서열 번호 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개 CDR을 포함한다. 예를 들어, 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 (a) NYLIE(서열 번호 10)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR1; (b) VINPGSGDTYYSEKFKG(서열 번호 11)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR2; 및 (c) DRLDY(서열 번호 12)의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개 CDR을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH); 및/또는 (a) HASQDISSYIV(서열 번호 13)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR1; (b) HGTNLED(서열 번호 14)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR2; 및 (c) VHYAQFPYT(서열 번호 15)의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역 CDR3으로부터 선택된 1, 2 또는 3개 CDR을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다. 특정 실시형태에서, 항-OX40 항체는 VH 및 VL 서열들
EVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYAFT NYLIEWVRQA PGQGLEWIGV INPGSGDTYY SEKFKGRVTI TRDTSTSTAY LELSSLRSED TAVYYCARDR LDYWGQGTLV TVSS (서열 번호 16)
및
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCHASQDIS SYIVWYQQKP GKAPKLLIYH GTNLEDGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCVH YAQFPYTFGQ GTKVEIK (서열 번호 17) 각각을 포함하고, 이들 서열의 번역 후 변형도 포함된다.
항-OX40 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2015/153513에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 인플루엔자 바이러스 B 적혈구응집소, 즉, “fluB”에 결합 할 수 있다 (예컨대, 시험관내에서 및/또는 생체내에서 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 인플루엔자 B 바이러스의 빅토리아 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 인플루엔자 B 바이러스의 조상 계통의 적혈구응집소에 결합하는, 또는 인플루엔자 B 바이러스의 야마가타 계통, 빅토리아 계통, 및 조상 계통의 적혈구응집소에 결합하는 항체). 항-FluB 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2015/148806에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 저밀도 지단백질 수용체 관련 단백질 (LRP)-1 또는 LRP-8 또는 트랜스페린 수용체에 결합 할 수 있으며, 베타-세크레타제 (BACE1 또는 BACE2), 알파-세크레타제, 감마-세크레타제, 타우-세크레타제, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP), 사멸 수용체 6 (DR6), 아밀로이드 베타 펩티드, 알파-시누클레인, 파킨, 헌팅틴, p75 NTR, CD40 및 카스파제-6으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 표적에 결합 할 수 있다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 항체는 CD40에 대한 인간 IgG2 항체이다. 특정 실시형태들에서, 항-CD40 항체는 RG7876이다.
특정 실시형태들에서, 본 발명의 세포 및 방법을 사용하여 폴리펩티드를 생성 할 수 있다. 예를 들면 (그러나 제한은 아님), 폴리펩티드는 표적화된 면역사이토카인이다. 특정 실시형태들에서, 표적화된 면역사이토카인은 CEA-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 실시형태들에서, CEA-IL2v 면역사이토카인은 RG7813이다. 특정 실시형태들에서, 표적화된 면역사이토카인은 FAP-IL2v 면역사이토카인이다. 특정 실시형태들에서, FAP-IL2v 면역사이토카인은 RG7461이다.
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 세포 또는 방법에 의해 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 CEA 및 최소 하나의 추가 표적 분자에 결합 할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 종양 표적화 사이토카인 및 최소 하나의 추가 표적 분자에 결합 할 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 IL2v (즉, 인터루킨 2 변이체)에 융합되고 IL1 기반 면역 사이토카인 및 최소 하나의 추가 표적 분자에 결합한다. 특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 T-세포 이중특이성 항체 (즉, 이중특이성 T-세포 관여자 또는 BiTE)이다.
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 다음으로부터 선택된 최소 2개의 표적 분자들에 결합할 수 있다: IL-1 알파 및 IL- 1 베타, IL-12 및 IL-1S; IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-5 및 IL-4; IL-13 및 IL-1베타; IL-13 및 IL- 25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MEF; IL-13 및 TGF-~; IL-13 및 LHR 작용제; IL-12 및 TWEAK, IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; IL-13 및 ADAMS, IL-13 및 PED2, IL17A 및 IL17F, CEA 및 CD3, CD3 및 CD19, CD138 및 CD20; CD 138 및 CD40; CD19 및 CD20; CD20 및 CD3; CD3S 및 CD13S; CD3S 및 CD20; CD3S 및 CD40; CD40 및 CD20; CD-S 및 IL-6; CD20 및 BR3, TNF 알파 및 TGF-베타, TNF 알파 및 IL-1 베타; TNF 알파 및 IL-2, TNF 알파 및 IL-3, TNF 알파 및 IL-4, TNF 알파 및 IL-5, TNF 알파 및 IL6, TNF 알파 및 IL8, TNF 알파 및 IL-9, TNF 알파 및 IL-10, TNF 알파 및 IL-11, TNF 알파 및 IL-12, TNF 알파 및 IL-13, TNF 알파 및 IL-14, TNF 알파 및 IL-15, TNF 알파 및 IL-16, TNF 알파 및 IL-17, TNF 알파 및 IL-18, TNF 알파 및 IL-19, TNF 알파 및 IL-20, TNF 알파 및 IL-23, TNF 알파 및 IFN 알파, TNF 알파 및 CD4, TNF 알파 및 VEGF, TNF 알파 및 MIF, TNF 알파 및 ICAM-1, TNF 알파 및 PGE4, TNF 알파 및 PEG2, TNF 알파 및 RANK 리간드, TNF 알파 및 Te38, TNF 알파 및 BAFF,TNF 알파 및 CD22, TNF 알파 및 CTLA-4, TNF 알파 및 GP130, TNF a 및 IL-12p40, VEGF 및 안지오포이에틴, VEGF 및 HER2, VEGF-A 및 HER2, VEGF-A 및 PDGF, HER1 및 HER2, VEGFA 및 ANG2,VEGF-A 및 VEGF-C, VEGF-C 및 VEGF-D, HER2 및 DR5,VEGF 및 IL-8, VEGF 및 MET, VEGFR 및 MET 수용체, EGFR 및 MET, VEGFR 및 EGFR, HER2 및 CD64, HER2 및 CD3, HER2 및 CD16, HER2 및 HER3; EGFR (HER1) 및 HER2, EGFR 및 HER3, EGFR 및 HER4, IL-14 및 IL-13, IL-13 및 CD40L, IL4 및 CD40L, TNFR1 및 IL-1 R, TNFR1 및 IL-6R 및 TNFR1 및 IL-18R, EpCAM 및 CD3, MAPG 및 CD28, EGFR 및 CD64, CSPGs 및 RGM A; CTLA-4 및 BTN02; IGF1 및 IGF2; IGF1/2 및 Erb2B; MAG 및 RGM A; NgR 및 RGM A; NogoA 및 RGM A; OMGp 및 RGM A; POL-I 및 CTLA-4; 및 RGM A 및 RGM B.
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 항-CEA/항-CD3 이중특이성 항체이다. 특정 실시형태들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이성 항체는 RG7802이다. 특정 실시형태들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이성 항체는 이하에서 제공되는 서열 번호 18-21에 제시된 아미노산 서열들을 포함한다:
DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCKASAAVG TYVAWYQQKP GKAPKLLIYS ASYRKRGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCHQ YYTYPLFTFG QGTKLEIKRT VAAPSVFIFP
PSDEQLKSGT ASVVCLLNNF YPREAKVQWK VDNALQSGNS QESVTEQDSK DSTYSLSSTL
TLSKADYEKH KVYACEVTHQ GLSSPVTKSF NRGEC (서열 번호 18)
QAVVTQEPSL TVSPGGTVTL TCGSSTGAVT TSNYANWVQE KPGQAFRGLI GGTNKRAPGT
PARFSGSLLG GKAALTLSGA QPEDEAEYYC ALWYSNLWVF GGGTKLTVLS SASTKGPSVF
PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS SGLYSLSSVV
TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSC (서열 번호 19)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMGW INTKTGEATY
VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMDY WGQGTTVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTSG VHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDGGGGS GGGGSEVQLL
ESGGGLVQPG GSLRLSCAAS GFTFSTYAMN WVRQAPGKGL EWVSRIRSKY NNYATYYADS
VKGRFTISRD DSKNTLYLQM NSLRAEDTAV YYCVRHGNFG NSYVSWFAYW GQGTLVTVSS
ASVAAPSVFI FPPSDEQLKS GTASVVCLLN NFYPREAKVQ WKVDNALQSG NSQESVTEQD
SKDSTYSLSS TLTLSKADYE KHKVYACEVT HQGLSSPVTK SFNRGECDKT HTCPPCPAPE
AAGGPSVFLF PPKPKDTLMI SRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE
EQYNSTYRVV SVLTVLHQDW LNGKEYKCKV SNKALGAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPP
CRDELTKNQV SLWCLVKGFY PSDIAVEWES NGQPENNYKT TPPVLDSDGS FFLYSKLTVD
KSRWQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPGK (서열 번호 20)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT EFGMNWVRQA PGQGLEWMG WINTKTGEATY
VEEFKGRVTF TTDTSTSTAY MELRSLRSDD TAVYYCARWD FAYYVEAMD YWGQGTTVTVS
SASTKGPSVF PLAPSSKSTS GGTAALGCLV KDYFPEPVTV SWNSGALTS GVHTFPAVLQS
SGLYSLSSVV TVPSSSLGTQ TYICNVNHKP SNTKVDKKVE PKSCDKTHT CPPCPAPEAAG
GPSVFLFPPK PKDTLMISRT PEVTCVVVDV SHEDPEVKFN WYVDGVEVH NAKTKPREEQY
NSTYRVVSVL TVLHQDWLNG KEYKCKVSNK ALGAPIEKTI SKAKGQPRE PQVCTLPPSRD
ELTKNQVSLS CAVKGFYPSD IAVEWESNGQ PENNYKTTPP VLDSDGSFF LVSKLTVDKSR
WQQGNVFSCS VMHEALHNHY TQKSLSLSPG K (서열 번호 21)
항-CEA/항-CD3 항체에 관한 추가 세부 사항은 WO 2014/121712에 제공되며, 이 문헌은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 세포 및 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이성 항체이다. 특정 실시형태들에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이성 항체는 크로스맙 (Crossmab)이다. 특정 실시형태들에서, 항-VEGF/항-안지오포이에틴 이중특이성 항체는 RG7716이다. 특정 실시형태들에서, 항-CEA/항-CD3 이중특이성 항체는 이하에서 제공되는 서열 번호 22-25에 제시된 아미노산 서열들을 포함한다:
EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYDFT HYGMNWVRQA PGKGLEWVGW INTYTGEPTY
AADFKRRFTF SLDTSKSTAY LQMNSLRAED TAVYYCAKYP YYYGTSHWYF DVWGQGTLVT
VSSASTKGPS VFPLAPSSKS TSGGTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL
QSSGLYSLSS VVTVPSSSLG TQTYICNVNH KPSNTKVDKK VEPKSCDKTH TCPPCPAPEA
AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV HNAKTKPREE
QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR EPQVYTLPPC
RDELTKNQVS LWCLVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF FLYSKLTVDK
SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (서열 번호 22)
QVQLVQSGAE VKKPGASVKV SCKASGYTFT GYYMHWVRQA PGQGLEWMGW INPNSGGTNY
AQKFQGRVTM TRDTSISTAY MELSRLRSDD TAVYYCARSP NPYYYDSSGY YYPGAFDIWG
QGTMVTVSSA SVAAPSVFIF PPSDEQLKSG TASVVCLLNN FYPREAKVQW KVDNALQSGN
SQESVTEQDS KDSTYSLSST LTLSKADYEK HKVYACEVTH QGLSSPVTKS FNRGECDKTH
TCPPCPAPEA AGGPSVFLFP PKPKDTLMAS RTPEVTCVVV DVSHEDPEVK FNWYVDGVEV
HNAKTKPREE QYNSTYRVVS VLTVLAQDWL NGKEYKCKVS NKALGAPIEK TISKAKGQPR
EPQVCTLPPS RDELTKNQVS LSCAVKGFYP SDIAVEWESN GQPENNYKTT PPVLDSDGSF
FLVSKLTVDK SRWQQGNVFS CSVMHEALHN AYTQKSLSLS PGK (서열 번호 23)
DIQLTQSPSS LSASVGDRVT ITCSASQDIS NYLNWYQQKP GKAPKVLIYF TSSLHSGVPS
RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ YSTVPWTFGQ GTKVEIKRTV AAPSVFIFPP
SDEQLKSGTA SVVCLLNNFY PREAKVQWKV DNALQSGNSQ ESVTEQDSKD STYSLSSTLT
LSKADYEKHK VYACEVTHQG LSSPVTKSFN RGEC (서열 번호 24)
SYVLTQPPSV SVAPGQTARI TCGGNNIGSK SVHWYQQKPG QAPVLVVYDD SDRPSGIPER
FSGSNSGNTA TLTISRVEAG DEADYYCQVW DSSSDHWVFG GGTKLTVLSS ASTKGPSVFP
LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT
VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSC (서열 번호 25)
특정 실시형태들에서, 본원에 제공된 방법에 따라 생성된 다중특이성 항체 (가령, 이중특이성 항체)는 항-Ang2/항-VEGF 이중특이성 항체이다. 특정 실시형태들에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이성 항체는 RG7221이다. 특정 실시형태들에서, 항-Ang2/항-VEGF 이중특이성 항체는 CAS 번호 1448221-05-3이다.
선택적으로 다른 분자에 접합된 가용성 항원 또는 이의 단편은 항체를 생성하기 위한 면역원으로 사용될 수 있다. 수용체와 같은 막횡단 분자의 경우, 이들의 단편 (예를 들어, 수용체의 세포외 도메인)을 면역원으로 사용할 수 있다. 대안적으로, 막횡단 분자를 발현하는 세포는 면역원으로 사용될 수 있다. 이러한 세포는 천연 공급원 (예를 들어, 암 세포주)으로부터 유래될 수 있거나 또는 막횡단 분자를 발현하기 위해 재조합 기술에 의해 형질전환되어 있는 세포일 수 있다. 항체 제조에 유용한 다른 항원 및 이의 형태는 당업자에게 자명할 것이다.
특정 실시형태들에서, 본원에 개시된 세포 및 방법에 의해 생성된 폴리펩티드 (예컨대, 항체)는 화학 분자, 가령, 염료 또는 세포독성제, 가령, 화학요법제, 약물, 성장 억제제, 독소 (예컨대, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편들), 또는 방사성 동위원소 (즉, 방사성접합체)에 추가로 접합될 수 있다. 본원에 기재된 방법을 사용하여 생성된 항체 또는 이중특이성 항체를 포함하는 면역접합체는 중쇄 중 하나만 또는 경쇄 중 하나만 불변 영역에 접합된 세포독성제를 함유 할 수 있다.
5.5.6 항체 변이체
특정 양상들에서, 본원에 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체, 예컨대, 섹션 5.5.5에 제공된 항체가 고려된다. 예를 들면, 항체의 상기 결합 친화도 및/또는 다른 생물학적 성질들을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형은, 예를 들면, 항체의 아미노산 서열 내의 잔기의 결실, 및/또는 삽입 및/또는 치환을 포함한다. 최종 구조체가 원하는 특성, 예를 들어, 항원 결합을 보유하는 한, 최종 구조체에 도달하기 위한 어떠한 결실, 삽입 및 치환의 조합이라도 이루어질 수 있다.
5.5.6.1 치환, 삽입, 및 결실 변이체
특정 양상들에서, 1개 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체들이 제공된다. 치환 돌연변이유발을 위한 관심 부위에는 CDR들 및 FR들이 포함된다. 보존적 치환들을 표 1에서 “바람직한 치환”이라는 제목으로 나타낸다. 더 많은 실질적인 변화가 표 1의 “예시적 치환”이라는 제목하에 제시되며, 이는 아미노산 측쇄 분류를 참조하여 이하에서 추가로 설명된다. 아미노산 치환들은 바람직한 활성, 예컨대, 유지된/개선된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 개선된 ADCC 또는 CDC에 대하여 스크린된 관심 항체 및 생성물 내부에 도입될 수 있다.
표 1
Figure pct00003
아미노산은 다음과 같이 공통적인 측쇄 성질들에 따라 그룹화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 측쇄 방향에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비-보존성 치환들은 이들 분류 중 하나의 구성원을 또 다른 분류의 구성원으로 교환하게 할 것이다.
치환 변이체의 한 유형은 모체 항체 (예를 들어, 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 포함한다. 일반적으로, 추가 연구를 위하여 선별된 생성된 변이체(들)은 모체 항체와 비교하였을 때, 특정 생물학적 성질들(예를 들어, 증가된 친화도, 감소된 면역원성)의 변형(예를 들어, 개선)을 가지거나 및/또는 모체 항체의 특정 생물학적 성질들을 실질적으로 보유할 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화도 성숙 항체이며, 이는 예를 들어, 본원에 기재된 것과 같은 파지 디스플레이 기반 친화도 성숙 기술을 사용하여 편리하게 생성될 수 있다. 간략하게 설명하자면, 하나 또는 그 이상의 CDR 잔기는 돌연변이되며, 변이체 항체는 파지 상에서 디스플레이되며, 그리고 특정 생물학적 활성 (예컨대, 결합 친화도)에 대하여 스크리닝된다.
예를 들어, 항체 친화도를 개선하기 위해 CDR에서 변경 (예를 들어, 치환)이 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 CDR에서 “핫스팟(hotspot)”, 즉, 체세포 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이 되는 코돈에 의해 인코딩되는 잔기 (즉, Chowdhury Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)), 및/또는 항원을 접촉하는 잔기들에서 생성될 수 있고, 생성된 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화도에 대하여 검사된다. 제2 라이브러리를 구축하고, 재선별함에 의한 친화도 성숙은 예컨대, Hoogenboom 외. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien 외, ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001))에서 설명되어 있다. 친화도 성숙의 일부 양상들에서, 다양성은 성숙을 위해 선택된 가변 유전자 내부로 임의의 다양한 방법 (예를 들어, 에러-프론 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-지정 돌연변이유발)에 의해 도입된다. 이어서 제2 라이브러리가 생성된다. 그런 다음 라이브러리를 스크리닝하여 원하는 친화도를 가진 항체 변이체를 식별한다. 다양성을 도입하는 또다른 방법은 CDR-지시된 접근법을 포함하는데, 이때 몇개 CDR 잔기 (예를 들어, 한번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관여하는 CDR 잔기는 예를 들어, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모델링을 사용하여 구체적으로 식별될 수 있다. 특히 CDR-H3 및 CDR-L3이 표적이 되는 경우가 많다.
특정 양상들에 있어서, 치환, 삽입, 또는 결실은 이러한 변경으로 이 항체가 항원에 결합하는 능력이 실질적으로 감소되지 않는 한, 하나 또는 그 이상의 CDR들에서 나타날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화력을 실질적으로 감소시키지 않는 보존적 변경 (예컨대, 본 명세서에서 제공된 보존적 치환)이 CDR들에 이루어질 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어, CDR들의 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 상기 제공된 특정 변이체 VH 및 VL 서열들에서, 각각의 CDR은 변경되지 않거나 1개, 2개 또는 3개 이하의 아미노산 치환을 포함한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역을 식별하는데 유용한 방법은 “알라닌 스캐닝 돌연변이유발”로 지칭되며, Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 기재되어 있다. 이 방법에서, 표적 잔기 또는 표적 잔기들의 그룹 (예를 들어, 하전된 잔기, 가령 arg, asp, his, lys, 및 glu)이 식별되고, 중성 또는 음 전하 아미노산 (예를 들어, 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체되어, 항원과 항체의 상호작용이 영향을 받았는지를 판단한다. 추가 치환은 초기 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 위치에 도입될 수 있다. 대안으로, 또는 추가로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 이용하여 항체와 항원 간의 접촉점을 동정할 수 있다. 이러한 접촉 잔기 및 인접 잔기는 치환 후보로서 표적화되거나 제거될 수 있다. 변이체들이 원하는 성질을 포함하는지 여부를 결정하기 위해 이들을 스크리닝할 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기 내지 100개 이상의 잔기를 함유하는 폴리펩티드에 이르는 길이 범위의 아미노- 및/또는 카르복실-말단 융합, 뿐만 아니라 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 예는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 상기 항체 분자의 다른 삽입 변이체들은 효소(예컨대, ADEPT (항체 지시된 효소 전구약물 요법)의 경우)에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합 또는 상기 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드에 항체의 N- 또는 C-말단의 융합을 포함한다.
5.5.6.2 당화 변이체
특정 양상들에서, 본원에서 제공된 항체는 이 항체가 당화되는 정도를 증가 또는 감소시키기 위하여 변경된다. 항체에 대한 당화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 당화 부위가 생성되거나 제거되도록 아미노산 서열을 변경함으로써 편리하게 이루어질 수 있다.
상기 항체가 Fc 영역을 포함할 때, 이에 부착된 올리고당이 변경될 수 있다. 포유동물 세포들에 의해 만들어지는 천연 항체는 Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연결부에 의해 일반적으로 부착된 분지화된, 이촉각성(biantennary) 올리고사카라이드를 전형적으로 포함한다. 예를 들어, Wright 외 TIBTECH 15:26-32 (1997) 참조. 상기 올리고사카라이드는 다양한 탄수화물, 예로써, 만노스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토스, 및 시알산, 뿐만 아니라 상기 바이안테너리 올리고사카라이드 구조의 “스템(stem)”에 GlcNAc에 부착된 푸코스를 포함할 수 있다. 일부 양상들에서, 특정한 개선된 특성을 갖는 항체 변이체를 생성하기 위해 본 발명의 항체의 올리고당의 변형이 이루어질 수 있다.
한 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비-푸코실화된 올리고당류, 다시 말하면 올리고당류 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이런 비-푸코실화된 올리고당 (“아푸코실화된” 올리고당으로서 또한 지칭됨)는 특히 N-연결된 올리고당인데, 이것은 이촉각성 올리고당 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기를 결여한다. 한 양상에서, 선천적 또는 모체 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화 올리고당을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들어, 비-푸코실화 올리고당의 비율은 최소 약 20%, 최소 약 40%, 최소 약 60%, 최소 약 80% 또는 심지어 약 100% (즉, 푸코실화 올리고당이 존재하지 않음) 일 수 있다. 비-푸코실화 올리고당의 백분율은, 예를 들어, WO 2006/082515에 설명되어 있는 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분석법에 의해 측정된 Asn 297에 부착된 모든 올리고당 (예컨대, 복합체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조들)의 합에 대한 푸코스 잔기가 없는 올리고당의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역에서 대략 위치 297(Fc 영역 잔기의 Eu 넘버링)에 위치한 아스파라긴 잔기를 지칭하지만; Asn297은 항체에서 소수의 서열 변이로 인하여 위치 297의 상류 또는 하류의 약 ± 3의 아미노산, 예를 들어, 위치 294와 300 사이에 또한 위치할 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비율의 비-푸코실화된 올리고당류를 갖는 이러한 항체는 향상된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 향상된 효과기 기능, 특히 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 예를 들어, US 2003/0157108; US 2004/0093621 참조.
푸코실화가 감소된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 예에는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포 (Ripka 외, Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); 미국 특허출원 US 2003/0157108; 및 WO　2004/056312, 특히 실시예 11), 및 녹아웃 세포주, 예를 들어, 알파-1,6-푸코실트랜스퍼라제 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (예를 들어, Yamane-Ohnuki 외, Biotech. Bioeng. 87: 614 (2004); Kanda, Y. 외, Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO2003/085107 참조), 또는 GDP-푸코스 합성 또는 수송체 단백질의 활성이 감소되거나 제거된 세포 (예를 들어, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282 참조)가 포함된다.
한 추가 양상에서, 항체의 Fc 영역의 이촉각성 올리고당이 GlcNAc에 의해 양분되어 있는, 양분된 올리고당을 가진 항체 변이체들이 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 상기 기재한 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 개선된 ADCC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체들의 예들은, 예컨대, Umana 외, Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara 외, Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에 기재되어 있다.
Fc 영역에 부착된 올리고당에 최소한 한 개의 갈락토스 잔기를 가진 항체 변이체들이 또한 제공된다. 이러한 항체 변이체들은 개선된 CDC 기능을 보유할 수 있다. 이러한 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에 설명되어 있다.
5.5.6.3 Fc 영역 변이체
특정 양상들에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어 Fc 영역 변이체를 생성할 수 있다. 상기 Fc 영역 변이체는 하나 또는 그 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형(예를 들어, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들어, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)를 포함할 수 있다.
특정 양상들에서, 본 발명은 전체 효과기 기능이 아닌 일부만을 보유하는 항체 변이체를 고려하는데, 이들 변이체는 항체의 반감기도 중요하지만, 특정 효과기 기능 (가령, 보체-의존적 세포독성 (CDC) 및 항체-의존적 세포-매개 세포독성 (ADCC))은 불필요하거나 또는 유해한 용도에 바람직한 후보물질이 될 수 있다. 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 분석을 실행하여 CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확인할 수 있다. 예를 들면, Fc 수용체 (FcR) 결합 분석을 실행하여, 상기 항체는 FcγR 결합 (이로 인하여 ADCC 활성이 결여될 가능성이 있음)은 없지만, 여전히 FcRn 결합 능력은 유지하고 있다는 것을 확인할 수 있다. ADCC를 조정하는 주요 세포, NK 세포들은 오직 FcgRIII만을 발현시키지만, 단핵구는 FcgRI, FcgRII 및 FcgRIII를 발현시킨다. 조혈 세포들에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 페이지 464의 표 3에 요약되어 있다. 관심 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 분석의 비제한적 실시예는 미국 특허 제 5,500,362 (예컨대, Hellstrom, I. 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986) 참고) 및 Hellstrom, I 외, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. 외, J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987) 참고)에 설명되어 있다. 대안으로, 비-방사능활성 분석 방법들이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유동 세포측정을 위한 ACTI™ 비-방사능활성 세포독성 분석 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); 그리고 CytoTox 96® 비-방사능활성 세포독성 분석 (Promega, Madison, WI) 참고). 이러한 분석에 유용한 효과기 세포들은 말초 혈액 단핵 세포들 (PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포들을 포함한다. 대안으로, 또는 추가적으로, 관심 분자의 ADCC 활성은, 예컨대, Clynes 외. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 공개된 바와 같은 동물 모델에서 생체내에서 평가될 수 있다. 상기 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 이로 인하여 CDC 활성이 결여된다는 것을 확인하기 위하여 C1q 결합 분석이 또한 실행될 수 있다. 예로써, WO　2006/029879와 WO　2005/100402에서 C1q 및 C3c 결합 ELISA 참조. 보체 활성화를 평가하기 위하여, CDC 분석이 실행될 수 있다 (예를 들면, Gazzano-Santoro 외. J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. 외. Blood. 101:1045-1052 (2003); 그리고 Cragg, M.S. 및 M.J. Glennie Blood. 103:2738-2743 (2004) 참고). 또한 FcRn 결합과 생체내 제거율/반감기 결정은 해당 분야에 공지된 방법들을 이용하여 또한 실시될 수 있다 (예컨대, Petkova, S.B. 외. Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006) WO 2013/120929 Al 참조).
감소된 효과기 기능을 가진 항체들은 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중 하나 또는 그 이상의 치환을 가진 것들을 포함한다(미국 특허 제6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 “DANA” Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 또는 그 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다(US 특허 번호 7,332,581).
FcRs에 대한 결합이 개선된 또는 감소된 특정 항체 변이체들이 기재되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,737,056; WO 2004/056312, 및 Shields 외, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001) 참조.)
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 ADCC를 개선시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기는 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다.
특정 양상들에서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 감소시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 234 및 235(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A(LALA)이다. 특정 양상들에서, 상기 항체 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에 D265A 및/또는 P329G를 추가로 포함한다. 한 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (예를 들어, WO 2012/130831 참조). 또 다른 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역의 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다.
일부 양상들에서, Fc 영역 안에 예로써, 미국 특허 제 6,194,551, WO　99/51642, 및 Idusogie 외 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (예를 들어, 개선된 또는 감소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존적 세포독성 (CDC)을 변경시키는 변경이 이루어진다.
태아로 모계 IgGs의 전달을 담당하는, 증가된 반감기와 신생아의 Fc 수용체 (FcRn)에 대한 결합이 개선된 항체들(Guyer 외, J. Immunol. 117:587 (1976) 그리고 Kim 외, J. Immunol. 24:249 (1994))은 US2005/0014934 (Hinton 외)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 대한 Fc 영역의 결합을 개선시키는 하나 또는 그 이상의 치환들을 가진 Fc 영역을 내부에 포함한다. 이러한 Fc 변이체들에는 다음 중 하나 이상의 Fc 영역 잔기에서 치환을 갖는 것들이 포함된다: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434, 예컨대 Fc 영역 잔기 434의 치환(예컨대, 미국 특허 제 7,371,826; Dall'Acqua, W.F., 외, J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524를 참조).
마우스 Fc-마우스 FcRn 상호작용에 중요한 Fc 영역 잔기는 부위 지정 돌연변이유발에 의해 확인되었다(예컨대, Dall'Acqua, W.F., 외, J. Immunol 169 (2002) 5171-5180을 참조). 잔기 I253, H310, H433, N434, 및 H435 (EU 색인 넘버링)는 상호작용에 관여한다 (Medesan, C., 외, Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., 외, Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310 및 H435는 인간 Fc와 뮤린 FcRn의 상호작용에 중요한 것임이 밝혀졌다(Kim, J.K., 외, Eur.J.Immunol.29 (1999) 2819). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체에 관한 연구는 잔기 I253, S254, H435, 및 Y436이 이러한 상호작용에 중요함을 보여주었다(Firan, M., 외, Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., 외, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y. A. 외(J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에서, 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체가 보고 및 조사되었다.
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc-영역의 위치 253, 및/또는 310, 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 이러한 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 I253A, H310A 및 H435A이다. 예를 들어, Grevys, A., 외, J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508를 참고하라.
특정 양상들에 있어서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환들, 예컨대 Fc 영역의 위치 310, 및/또는 433, 및/또는 436(잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 H310A, H433A 및 Y436A이다. (예를 들어, WO 2014/177460 A1 참조).
특정 양상들에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 예로써, Fc 영역의 위치 252, 및/또는 254, 및/또는 256 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 가진 Fc 영역을 포함한다. 특정 양상들에서, 항체 변이체는 위치 252, 254, 및 256에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 한 양상에서, 상기 치환은 인간 IgG1 Fc-영역으로부터 유래된 Fc 영역에서의 M252Y, S254T 및 T256E이다. Fc 영역 변이체들의 다른 예들에 관하여 Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); 미국 특허 제5,648,260; 미국 특허 제5,624,821; 그리고 WO 94/29351 참조.
본원에 보고된 항체 중쇄의 C-말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C-말단 일 수 있다. 중쇄의 C-말단은 C 말단 아미노산 잔기 중 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C-말단일 수 있다. 한 바람직한 양상에서, 중쇄의 C-말단은 PG로 끝나는 단축된 C-말단이다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, 아미노산 위치의 Kabat EU 색인 넘버링)를 포함한다. 본원에 보고된 모든 양상들 중 한 양상에서, 본원에 명시된 바와 같은 C-말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C-말단 글리신 잔기 (G446, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다.
5.5.6.4 시스테인 조작된 항체 변이체
특정 양상들에 있어서, 항체의 하나 또는 그 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 대체된, 시스테인 조작된 항체, 예컨대, THIOMAB™ 항체를 만드는 것이 바람직할 수 있다. 특정 양상들에서, 상기 치환된 잔기는 상기 항체의 접근가능한 부위에서 나타난다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올기는 이러한 항체의 접근가능한 부위에 위치하게 되고, 다른 모이어티, 예를 들어, 하기에서 설명되는 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 이 항체가 접합되어 면역접합체가 생성될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, 미국 특허 제 7,521,541, 8,30,930, 7,855,275, 9,000,130, 또는 WO 2016040856에서 설명된 것과 같이 생성될 수 있다.
5.5.6.5 항체 유도체
특정 양상들에서, 본원에서 제공된 항체는 해당 분야에서 공지되고 쉽게 이용가능한 추가 비단백질성 모이어티를 내포하도록 더욱 변형될 수 있다. 상기 항체의 유도체화에 적합한 모이어티들은 수용성 중합체들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 수용성 중합체들의 비-제한적 예들에는, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 에틸렌 글리콜/프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리-1, 3-디옥솔란, 폴리-1,3,6-트라이옥세인, 에틸렌/말레산 무수물 공중합체, 폴리아미노산(동종중합체 또는 무작위 공중합체), 및 덱스트란 또는 폴리(n-비닐 피롤리돈)폴리에틸렌 글리콜, 프로프로필렌 글리콜 동종중합체, 폴리프로필렌 옥사이드/에틸렌 옥사이드 공중합체, 폴리옥시에틸화 폴리올(예를 들어, 글리세롤), 폴리비닐 알콜, 및 이의 혼합물이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 폴리에틸렌 글리콜 프로피온알데하이드는 물에서의 안정성으로 인하여 제조에 있어 장점을 가질 수 있다. 중합체는 임의의 분자량일 수 있고, 분지형 또는 비-분지형일 수 있다. 상기 항체에 부착된 중합체의 수는 가변적일 수 있으며, 하나 이상의 중합체가 부착된 경우, 이들은 동일하거나 또는 상이한 분자들일 수 있다. 일반적으로, 유도체화에 이용된 중합체의 수 및/또는 유형은 개선되는 항체의 특정 성질들 또는 기능들, 상기 항체 유도체가 특정 조건하에서 치료에 이용되는지의 여부를 포함하는 고려사항들에 근거하여 결정될 수 있다.
5.5.7 면역접합체
본 발명은 또한 세포독성제, 화학요법제 또는 약물, 성장 억제제, 독소(예를 들어, 단백질 독소, 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 이의 단편), 또는 방사성 동위 원소와 같은 하나 이상의 치료제에 접합된(화학적으로 결합된) 본원에 개시된 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
한 양상에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)인데, 여기서 항체는 전술된 치료제 중에서 하나 또는 그 이상에 접합된다. 항체는 전형적으로, 링커를 이용하여 상기 치료제 중 하나 이상에 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 예시를 포함하는 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68:3-19 (2016)에 제시되어 있다.
또 다른 양상에서, 면역접합체는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, (슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 유래) 외독소 A 쇄, 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모덱신 A 쇄, 알파-사르신, 유동(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 미국 자리공(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 젤로닌, 미토젤린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테센을 포함하지만 이에 제한되지 않는 효소 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에 기재된 바와 같은 항체를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 면역접합체는 방사성 원자에 접합되어 방사성접합체를 형성하는 본원에 기재된 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사성접합체의 생산을 위해 사용가능하다. 예에는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소가 포함된다. 상기 방사성접합체가 검출용으로 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면 tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (또는 자기 공명 영상화, MRI로도 공지됨)를 위한 회전 라벨, 이를 테면, 다시 요오드-123, 요오드-131, 인듐-111, 플루오린-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 또한 함유할 수 있다.
항체와 세포독성 물질의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 커플링 물질, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트(SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트(SMCC), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체들(예를 들어, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체들(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 플로린 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta 외, Science 238:1098 (1987)에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오티드를 항체에 접합시키기 위한 예시적인 킬레이트제이다. WO 94/11026 참조. 상기 링커는 세포 안에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 “절단가능한 링커”일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 광 불안정 링커, 다이메틸 링커 또는 이황화물-함유 링커 (Chari 외, Cancer Res. 52:127-131 (1992); 미국 특허 제 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원의 면역접합체 또는 ADC는, 상업적으로 이용가능한(예를 들어, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A), BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 설포-EMCS, 설포-GMBS, 설포-KMUS, 설포-MBS, 설포-SIAB, 설포-SMCC, 설포-SMPB, 그리고 SVSB(숙신이미딜-(4-비닐설폰)벤조에이트)를 비롯한 가교-결합 시약들(그러나 이에 제한되는 것은 아님)을 사용하여 준비되는 접합체들을 명확히 고려하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
5.5.6 바이러스 입자
특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 입자의 생산에 사용될 수 있다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 방법은 바이러스 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 특정 실시형태들에서, 본 발명의 방법은 폴리펩티드, 예컨대, 바이러스 폴리펩티드의 발현을 위해 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 비제한적인 예는 바이러스 단백질, 바이러스 구조(Cap) 단백질, 바이러스 패키징(Rep) 단백질, AAV 캡시드 단백질 및 바이러스 헬퍼 단백질을 포함한다. 일부 실시형태에서, 바이러스 폴리펩티드는 AAV 바이러스 폴리펩티드이다.
특정 실시형태에서, 본원에 기재된 방법들에 의해 생산된 바이러스 입자에 의해 운반될 수 있는 관심 유전자들의 예에는 포유동물 폴리펩티드, 예컨대 예를 들면, 레닌; 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬; 성장 호르몬 방출 인자; 부갑상선 호르몬; 갑상선 자극 호르몬; 지질단백질; 알파-1-항트립신; 인슐린 A-사슬; 인슐린 B-사슬; 프로인슐린; 난포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 렙틴; 응고 인자, 예컨대 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 그리고 폰빌레브란트 인자; 항응고 인자, 예컨대 단백질 C; 심방 나트륨이뇨 인자; 폐 계면활성인자; 플라스미노겐 활성인자, 예컨대 우로키나아제 또는 인간 소변 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성인자 (t-PA); 봄베신; 트롬빈; 조혈 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파와 -베타; 종양 괴사 인자 수용체, 예컨대 사멸 수용체 5 및 CD120; TNF-관련된 아폽토시스-유도 리간드 (TRAIL); B-세포 성숙 항원 (BCMA); B-림프구 자극기 (BLyS); 증식-유도 리간드 (APRIL); 엔케팔리나아제; RANTES (활성화 시에 조절된 정상적으로 T-세포 발현된 및 분비된); 인간 대식세포 염증성 단백질 (MIP-1-알파); 혈청 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민; 뮤에레리안-저해 물질; 렐락신 A-사슬; 렐락신 B-사슬; 프로렐락신; 생쥐 성선자극호르몬-연관된 펩티드; 미생물 단백질, 예컨대 베타 락타마아제; DNA분해효소; IgE; 세포독성 T-림프구 연관된 항원 (CTLA), 예컨대 CTLA-4; 인히빈; 액티빈; 혈소판-유래된 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF); 혈관 내피 성장 인자 패밀리 단백질 (예를 들면, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, 그리고 P1GF); 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 패밀리 단백질 (예를 들면, PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D, 그리고 이들의 이량체); 섬유모세포 성장 인자 (FGF) 패밀리, 예컨대 aFGF, bFGF, FGF4 및 FGF9; 표피 성장 인자 (EGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체, 예컨대 VEGF 수용체(들) (예를 들면, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), 표피 성장 인자 (EGF) 수용체(들) (예를 들면, ErbB1, ErbB2, ErbB3 및 ErbB4 수용체), 혈소판 유래 성장 인자 (PDGF) 수용체(들) (예를 들면, PDGFR-α 및 PDGFR-β), 그리고 섬유모세포 성장 인자 수용체(들); TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2); 안지오포이에틴 수용체, 예컨대 TIE1 및 TIE2; 단백질 A 또는 D; 류마티스성 인자; 신경영양 인자, 예컨대 뼈-유래된 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5, 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5, 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예컨대 NGF-b; 전환 성장 인자 (TGF), 예컨대 TGF-알파 및 TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 또는 TGF-β5를 비롯한 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I과 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBPs); CD 단백질, 예컨대 CD3, CD4, CD8, CD19 및 CD20; 에리트로포이에틴; 뼈유도성 인자; 면역독소; 뼈 형성 단백질 (BMP); 케모킨, 예컨대 CXCL12 및 CXCR4; 인터페론, 예컨대 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 집락 자극 인자 (CSFs), 예를 들면, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 사이토킨, 예컨대 인터류킨 (ILs), 예를 들면, IL-1 내지 IL-10; 미드킨; 초과산화물 디스무타아제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 붕괴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예컨대 예를 들면, AIDS 외피의 부분; 수송 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 인테그린, 예컨대 CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 및 VCAM; 에프린; Bv8; 델타-유사 리간드 4 (DLL4); Del-1; BMP9; BMP10; 폴리스타틴; 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF); Alk1; Robo4; ESM1; 퍼레칸; EGF-유사 도메인, 복수 7 (EGFL7); CTGF 및 이의 패밀리의 구성원; 트롬보스폰딘, 예컨대 트롬보스폰딘1 및 트롬보스폰딘2; 콜라겐, 예컨대 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII; 뉴로필린, 예컨대 NRP1 및 NRP2; 플레이오트로핀 (PTN); 프로그래눌린; 프로리페린; Notch 단백질, 예컨대 Notch1 및 Notch4; 세마포린, 예컨대 Sema3A, Sema3C 및 Sema3F; 종양 연관된 항원, 예컨대 CA125 (난소암 항원); 면역부착소; 그리고 상기-열거된 폴리펩티드 중에서 어느 하나의 단편 및/또는 변이체, 뿐만 아니라, 예를 들면, 임의의 상기-열거된 단백질을 비롯한 하나 이상의 단백질에 결합하는 항체 및 항체 단편이 포함된다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 숙주 세포들에 의해 생산된 바이러스 입자들에 의해 운반되는 관심 유전자는 8MPI, 8MP2, 8MP38 (GDFIO), 8MP4, 8MP6, 8MP8, CSFI (M-CSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (G-CSF), EPO, FGF1 (αFGF), FGF2 (βFGF), FGF3 (int-2), FGF4 (HST), FGF5, FGF6 (HST-2), FGF7 (KGF), FGF9, FGF10, FGF11, FGF12, FGF12B, FGF14, FGF16, FGF17, FGF19, FGF20, FGF21, FGF23, IGF1, IGF2, IFNA1, IFNA2, IFNA4, IFNA5, IFNA6, IFNA7, IFN81, IFNG, IFNWI, FEL1, FEL1 (EPSELON), FEL1 (ZETA), IL 1A, IL 1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL 11, IL 12A, IL 12B, IL 13, IL 14, IL 15, IL 16, IL 17, IL 17B, IL 18, IL 19, IL20, IL22, IL23, IL24, IL25, IL26, IL27, IL28A, IL28B, IL29, IL30, PDGFA, PDGFB, TGFA, TGFB1, TGFB2, TGFBb3, LTA (TNF-β), LTB, TNF (TNF-α), TNFSF4 (OX40 리간드), TNFSF5 (CD40 리간드), TNFSF6 (FasL), TNFSF7 (CD27 리간드), TNFSF8 (CD30 리간드), TNFSF9 (4-1 BB 리간드), TNFSF10 (TRAIL), TNFSF11 (TRANCE), TNFSF12 (AP03L), TNFSF13 (April), TNFSF13B, TNFSF14 (HVEM-L), TNFSF15 (VEGI), TNFSF18, HGF (VEGFD), VEGF, VEGFB, VEGFC, IL1R1, IL1R2, IL1RL1, IL1RL2, IL2RA, IL2RB, IL2RG, IL3RA, IL4R, IL5RA, IL6R, IL7R, IL8RA, IL8RB, IL9R, IL10RA, IL10RB, IL 11RA, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL15RA, IL17R, IL18R1, IL20RA, IL21R, IL22R, IL1HY1, IL1RAP, IL1RAPL1, IL1RAPL2, IL1RN, IL6ST, IL18BP, IL18RAP, IL22RA2, AIF1, HGF, LEP (렙틴), PTN, 및 THPO.k로 구성된 그룹에서 선택된 사이토카인, 사이토카인-관련 단백질, 및 사이토카인 수용체들을 비롯한 (그러나 이에 제한되는 것은 아님) 임의의 단백질에 결합하거나 이와 상호작용하는 단백질들을 인코딩할 수 있다.
일부 실시형태들에서, 본 발명의 숙주 세포들에 의해 생산된 바이러스 입자들에 의해 운반되는 관심 유전자는 CCLI (1-309), CCL2 (MCP -1/MCAF), CCL3 (MIP-Iα), CCL4 (MIP-Iβ), CCL5 (RANTES), CCL7 (MCP-3), CCL8 (mcp-2), CCL11 (에오탁신), CCL 13 (MCP-4), CCL 15 (MIP-Iδ), CCL 16 (HCC-4), CCL 17 (TARC), CCL 18 (PARC), CCL 19 (MDP-3b), CCL20 (MIP-3α), CCL21 (SLC/엑소두스-2), CCL22 (MDC/ STC-1), CCL23 (MPIF-1), CCL24 (MPIF-2 /에오탁신-2), CCL25 (TECK), CCL26 (에오탁신-3), CCL27 (CTACK / ILC), CCL28, CXCLI (GROI), CXCL2 (GR02), CXCL3 (GR03), CXCL5 (ENA-78), CXCL6 (GCP-2), CXCL9 (MIG), CXCL 10 (IP 10), CXCL 11 (1-TAC), CXCL 12 (SDFI), CXCL 13, CXCL 14, CXCL 16, PF4 (CXCL4), PPBP (CXCL7), CX3CL 1 (SCYDI), SCYEI, XCLI (림포탁틴), XCL2 (SCM-Iβ), BLRI (MDR15), CCBP2 (D6/JAB61), CCRI (CKRI/HM145), CCR2 (mcp-IRB IRA), CCR3 (CKR3/CMKBR3), CCR4, CCR5 (CMKBR5/ChemR13), CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/DRY6), CCR7 (CKR7/EBII), CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1), CCR9 (GPR-9-6), CCRL1 (VSHK1), CCRL2 (L-CCR), XCR1 (GPR5/CCXCR1), CMKLR1, CMKOR1 (RDC1), CX3CR1 (V28), CXCR4, GPR2 (CCR10), GPR31, GPR81 (FKSG80), CXCR3 (GPR9/CKR-L2), CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo), HM74, IL8RA (IL8Rα), IL8RB (IL8Rβ), LTB4R (GPR16), TCP10, CKLFSF2, CKLFSF3, CKLFSF4, CKLFSF5, CKLFSF6, CKLFSF7, CKLFSF8, BDNF, C5, C5R1, CSF3, GRCC10 (C10), EPO, FY (DARC), GDF5, HDF1, HDF1α, DL8, PRL, RGS3, RGS13, SDF2, SLIT2, TLR2, TLR4, TREM1, TREM2, 및 VHL로 구성된 그룹에서 선택된 케모카인, 케모카인 수용체, 또는 케모카인-관련 단백질에 결합하거나 이와 상호작용하는 단백질을 인코딩 할 수 있다. 일부 실시형태들에서, 본 발명의 숙주 세포들에 의해 발현되는 폴리펩티드는, 0772P (CA125, MUC16) (즉, 난소 암 항원), ABCF1; ACVR1; ACVR1B; ACVR2; ACVR2B; ACVRL1; ADORA2A; 아그리칸; AGR2; AICDA; AIF1; AIG1; AKAP1; AKAP2; AMH; AMHR2; 아밀로이드 베타; ANGPTL; ANGPT2; ANGPTL3; ANGPTL4; ANPEP; APC; APOC1; AR; ASLG659; ASPHD1 (아스파테이트 베타-하이드록실라제 도메인; LOC253982); AZGP1 (아연-a-당단백질); B7.1; B7.2; BAD; BAFF-R (B 세포-활성화 인자 수용체, BLyS 수용체 3, BR3; BAG1; BAI1; BCL2; BCL6; BDNF; BLNK; BLRI (MDR15); BMP1; BMP2; BMP3B (GDF10); BMP4; BMP6; BMP8; BMPR1A; BMPR1B (골 형태형성 단백질 수용체-유형 IB); BMPR2; BPAG1 (플렉틴); BRCA1; 브레비칸; C19orf10 (IL27w); C3; C4A; C5; C5R1; CANT1; CASP1; CASP4; CAV1; CCBP2 (D6/JAB61); CCL1 (1-309); CCL11 (에오탁신); CCL13 (MCP-4); CCL15 (MIP1δ); CCL16 (HCC-4); CCL17 (TARC); CCL18 (PARC); CCL19 (MIP-3β); CCL2 (MCP-1); MCAF; CCL20 (MIP-3α); CCL21 (MTP-2); SLC; 엑소두스-2; CCL22 (MDC/STC-1); CCL23 (MPIF-1); CCL24 (MPIF-2/에오탁신-2); CCL25 (TECK); CCL26 (에오탁신-3); CCL27 (CTACK/ILC); CCL28; CCL3 (MTP-Iα); CCL4 (MDP-Iβ); CCL5(RANTES); CCL7 (MCP-3); CCL8 (mcp-2); CCNA1; CCNA2; CCND1; CCNE1; CCNE2; CCR1 (CKRI/HM145); CCR2 (mcp-IRβ/RA);CCR3 (CKR/CMKBR3); CCR4; CCR5 (CMKBR5/ChemR13); CCR6 (CMKBR6/CKR-L3/STRL22/ DRY6); CCR7 (CKBR7/EBI1); CCR8 (CMKBR8/TER1/CKR-L1); CCR9 (GPR-9-6); CCRL1 (VSHK1); CCRL2 (L-CCR); CD164; CD19; CD1C; CD20; CD200; CD22 (B-세포 수용체 CD22-B 동형); CD24; CD28; CD3; CD37; CD38; CD3E; CD3G; CD3Z; CD4; CD40; CD40L; CD44; CD45RB; CD52; CD69; CD72; CD74; CD79A (CD79α, 면역글로불린-관련 알파, B 세포-특이적 단백질); CD79B; CDS; CD80; CD81; CD83; CD86; CDH1 (E-카드헤린); CDH10; CDH12; CDH13; CDH18; CDH19; CDH20; CDH5; CDH7; CDH8; CDH9; CDK2; CDK3; CDK4; CDK5; CDK6; CDK7; CDK9; CDKN1A (p21/WAF1/Cip1); CDKN1B (p27/Kip1); CDKN1C; CDKN2A (P16INK4a); CDKN2B; CDKN2C; CDKN3; CEBPB; CER1; CHGA; CHGB; 키티나제; CHST10; CKLFSF2; CKLFSF3; CKLFSF4; CKLFSF5; CKLFSF6; CKLFSF7; CKLFSF8; CLDN3;CLDN7 (클라우딘-7); CLL-1 (CLEC12A, MICL, 및 DCAL2); CLN3; CLU (클러스테린); CMKLR1; CMKOR1 (RDC1); CNR1; COL 18A1; COL1A1; COL4A3; COL6A1; 보체 인자 D; CR2; CRP; CRIPTO (CR, CR1, CRGF, CRIPTO, TDGF1, 기형암종-유래 성장 인자); CSFI (M-CSF); CSF2 (GM-CSF); CSF3 (GCSF); CTLA4; CTNNB1 (b-카테닌); CTSB (카텝신 B); CX3CL1 (SCYDI); CX3CR1 (V28); CXCL1 (GRO1); CXCL10 (IP-10); CXCL11 (I-TAC/IP-9); CXCL12 (SDF1); CXCL13; CXCL14; CXCL16; CXCL2 (GRO2); CXCL3 (GRO3); CXCL5 (ENA-78/LIX); CXCL6 (GCP-2); CXCL9 (MIG); CXCR3 (GPR9/CKR-L2); CXCR4; CXCR5 (버킷 림프종 수용체 1, G 단백질-결합된 수용체); CXCR6 (TYMSTR/STRL33/Bonzo); CYB5; CYC1; CYSLTR1; DAB2IP; DES; DKFZp451J0118; DNCLI; DPP4; E16 (LAT1, SLC7A5); E2F1; ECGF1; EDG1; EFNA1; EFNA3; EFNB2; EGF; EGFR; ELAC2; ENG; ENO1; ENO2; ENO3; EPHB4; EphB2R; EPO; ERBB2 (Her-2); EREG; ERK8; ESR1; ESR2; ETBR (엔도텔린 B형 수용체); F3 (TF); FADD; FasL; FASN; FCER1A; FCER2; FCGR3A; FcRH1 (Fc 수용체-유사 단백질 1); FcRH2 (IFGP4, IRTA4, SPAP1A (포스파타제 고정 단백질 1a를 함유하는 SH2 도메인), SPAP1B, SPAP1C); FGF; FGF1 (αFGF); FGF10; FGF11; FGF12; FGF12B; FGF13; FGF14; FGF16; FGF17; FGF18; FGF19; FGF2 (bFGF); FGF20; FGF21; FGF22; FGF23; FGF3 (int-2); FGF4 (HST); FGF5; FGF6 (HST-2); FGF7 (KGF); FGF8; FGF9; FGFR; FGFR3; FIGF (VEGFD); FEL1 (EPSILON); FIL1 (ZETA); FLJ12584; FLJ25530; FLRTI (피브로넥틴); FLT1; FOS; FOSL1 (FRA-1); FY (DARC); GABRP (GABAa); GAGEB1; GAGEC1; GALNAC4S-6ST; GATA3; GDF5; GDNF-Ra1 (GDNF 패밀리 수용체 알파 1; GFRA1; GDNFR; GDNFRA; RETL1; TRNR1; RET1L; GDNFR-알파1; GFR-알파-1); GEDA; GFI1; GGT1; GM-CSF; GNASI; GNRHI; GPR2 (CCR10); GPR19 (G 단백질-결합된 수용체 19; Mm.4787); GPR31; GPR44; GPR54 (KISS1 수용체; KISS1R; GPR54; HOT7T175; AXOR12); GPR81 (FKSG80); GPR172A (G 단백질-결합된 수용체 172A; GPCR41; FLJ11856; D15Ertd747e);GRCCIO (CIO); GRP; GSN (겔솔린); GSTP1; HAVCR2; HDAC4; HDAC5; HDAC7A; HDAC9; HGF; HIF1A; HOP1; 히스타민 및 히스타민 수용체; HLA-A; HLA-DOB (MHC 클래스 II 분자의 베타 소단위 (Ia 항원); HLA-DRA; HM74; HMOXI; HUMCYT2A; ICEBERG; ICOSL; 1D2; IFN-a; IFNA1; IFNA2; IFNA4; IFNA5; IFNA6; IFNA7; IFNB1; IFN감마; DFNW1; IGBP1; IGF1; IGF1R; IGF2; IGFBP2; IGFBP3; IGFBP6; IL-1; IL10; IL10RA; IL10RB; IL11; IL11RA; IL-12; IL12A; IL12B; IL12RB1; IL12RB2; IL13; IL13RA1; IL13RA2; IL14; IL15; IL15RA; IL16; IL17; IL17B; IL17C; IL17R; IL18; IL18BP; IL18R1; IL18RAP; IL19; ILIA; IL1B; ILIF10; IL1F5; IL1F6; IL1F7; IL1F8; IL1F9; IL1HY1; IL1R1; IL1R2; IL1RAP; IL1RAPL1; IL1RAPL2; IL1RL1; IL1RL2, ILIRN; IL2; IL20; IL20Rα; IL21 R; IL22; IL-22c; IL22R; IL22RA2; IL23; IL24; IL25; IL26; IL27; IL28A; IL28B; IL29; IL2RA; IL2RB; IL2RG; IL3; IL30; IL3RA; IL4; IL4R; IL5; IL5RA; IL6; IL6R; IL6ST (당단백질 130); 인플루엔자 A; 인플루엔자 B; EL7; EL7R; EL8; IL8RA; DL8RB; IL8RB; DL9; DL9R; DLK; INHA; INHBA; INSL3; INSL4; IRAKI; IRTA2 (면역글로불린 수퍼패밀리 수용체 전위 관련 2); ERAK2; ITGA1; ITGA2; ITGA3; ITGA6 (a6 인테그린); ITGAV; ITGB3; ITGB4 (b4 인테그린); α4β7 및 αEβ7 인테그린 이종이량체; JAG1; JAK1; JAK3; JUN; K6HF; KAI1; KDR; KITLG; KLF5 (GC Box BP); KLF6; KLKIO; KLK12; KLK13; KLK14; KLK15; KLK3; KLK4; KLK5; KLK6; KLK9; KRT1; KRT19 (케라틴 19); KRT2A; KHTHB6 (모발-특이적 유형 H 케라틴); LAMAS; LEP (렙틴); LGR5 (류신-풍부 반복서열-함유 G 단백질-결합된 수용체 5; GPR49, GPR67); Lingo-p75; Lingo-Troy; LPS; LTA (TNF-b); LTB; LTB4R (GPR16); LTB4R2; LTBR; LY64 (림프구 항원 64 (RP105), 류신 풍부 반복서열 (LRR) 패밀리의 유형 I 막 단백질); Ly6E (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 E; Ly67,RIG-E,SCA-2,TSA-1); Ly6G6D (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 G6D; Ly6-D, MEGT1); LY6K (림프구 항원 6 복합체, 유전자좌 K; LY6K; HSJ001348; FLJ35226); MACMARCKS; MAG 또는 OMgp; MAP2K7 (c-Jun); MDK; MDP; MIB1; 미드카인; MEF; MIP-2; MKI67; (Ki-67); MMP2; MMP9; MPF (MPF, MSLN, SMR, 거핵구 증강 인자, 메소텔린); MS4A1; MSG783 (RNF124, 가설 단백질 FLJ20315);MSMB; MT3 (메탈로티오넥틴-111); MTSS1; MUC1 (뮤신); MYC; MY088; Napi3b (NaPi2b로도 공지) (NAPI-3B, NPTIIb, SLC34A2, 용질 담체 패밀리 34 (소듐 포스페이트), 구성원 2, 유형 II 나트륨-의존성 포스페이트 전달체 3b); NCA; NCK2; 뉴로칸; NFKB1; NFKB2; NGFB (NGF); NGFR; NgR-Lingo; NgR-Nogo66 (Nogo); NgR-p75; NgR-Troy; NME1 (NM23A); NOX5; NPPB; NR0B1; NR0B2; NR1D1; NR1D2; NR1H2; NR1H3; NR1H4; NR112; NR113; NR2C1; NR2C2; NR2E1; NR2E3; NR2F1; NR2F2; NR2F6; NR3C1; NR3C2; NR4A1; NR4A2; NR4A3; NR5A1; NR5A2; NR6A1; NRP1; NRP2; NT5E; NTN4; ODZI; OPRD1; OX40; P2RX7; P2X5 (퓨린성 수용체 P2X 리간드-게이트된 이온 채널 5); PAP; PART1; PATE; PAWR; PCA3; PCNA; PD-L1; PD-L2; PD-1; POGFA; POGFB; PECAM1; PF4 (CXCL4); PGF; PGR; 포스파칸; PIAS2; PIK3CG; PLAU (uPA); PLG; PLXDC1; PMEL17 (은 상동체; SILV; D12S53E; PMEL17; SI; SIL); PPBP (CXCL7); PPID; PRI; PRKCQ; PRKDI; PRL; PROC; PROK2; PSAP; PSCA hlg (2700050C12Rik, C530008016Rik, RIKEN cDNA 2700050C12, RIKEN cDNA 2700050C12 유전자); PTAFR; PTEN; PTGS2 (COX-2); PTN; RAC2 (p21 Rac2); RARB; RET (ret 원-종양유전자; MEN2A; HSCR1; MEN2B; MTC1; PTC; CDHF12; Hs.168114; RET51; RET-ELE1); RGSI; RGS13; RGS3; RNF110 (ZNF144); ROBO2; S100A2; SCGB1D2 (리포필린 B); SCGB2A1 (맘마글로빈2); SCGB2A2 (맘마글로빈 1); SCYEI (상피 단핵구-활성화 사이토카인); SDF2; Serna 5b (FLJ10372, KIAA1445, Mm.42015, SEMA5B, SEMAG, 세마포린 5b Hlog, 세마 도메인, 7가지 트롬보스폰딘 반복서열 (유형 1 및 유형 1-유사), 막경유 도메인 (TM) 및 짧은 세포질 도메인, (세마포린) 5B); SERPINA1; SERPINA3; SERP1NB5 (마스핀); SERPINE1(PAI-1); SERPDMF1; SHBG; SLA2; SLC2A2; SLC33A1; SLC43A1; SLIT2; SPPI; SPRR1B (Sprl); ST6GAL1; STABI; STAT6; STEAP (전립선의 6가지 막경유 상피 항원); STEAP2 (HGNC_8639, IPCA-1, PCANAP1, STAMP1, STEAP2, STMP, 전립선 암 관련 유전자 1, 전립선 암 관련 단백질 1, 전립선 2의 6가지 막경유 상피 항원, 6가지 막경유 전립선 단백질); TB4R2; TBX21; TCPIO; TOGFI; TEK; TENB2 (추정 막경유 프로테오글리칸); TGFA; TGFBI; TGFB1II; TGFB2; TGFB3; TGFBI; TGFBRI; TGFBR2; TGFBR3; THIL; THBSI (트롬보스폰딘-1); THBS2; THBS4; THPO; TIE (Tie-1); TMP3; 조직 인자; TLR1; TLR2; TLR3; TLR4; TLR5; TLR6; TLR7; TLR8; TLR9; TLR10; TMEFF1 (EGF-유사 및 2개의 폴리스타틴-유사 도메인들 1을 가지는 막경유 단백질; 토모레귤린-1); TMEM46 (시사 상동체 2); TNF; TNF-a; TNFAEP2 (B94); TNFAIP3; TNFRSFIIA; TNFRSF1A; TNFRSF1B; TNFRSF21; TNFRSF5; TNFRSF6 (Fas); TNFRSF7; TNFRSF8; TNFRSF9; TNFSF10 (TRAIL); TNFSF11 (TRANCE); TNFSF12 (AP03L); TNFSF13 (April); TNFSF13B; TNFSF14 (HVEM-L); TNFSF15 (VEGI); TNFSF18; TNFSF4 (OX40 리간드); TNFSF5 (CD40 리간드); TNFSF6 (FasL); TNFSF7 (CD27 리간드); TNFSFS (CD30 리간드); TNFSF9 (4-1 BB 리간드); TOLLIP; 톨-유사 수용체; TOP2A (국소이성화효소 Ea); TP53; TPM1; TPM2; TRADD; TMEM118 (링 핑거 단백질, 막경유 2; RNFT2; FLJ14627); TRAF1; TRAF2; TRAF3; TRAF4; TRAF5; TRAF6; TREM1; TREM2; TrpM4 (BR22450, FLJ20041, TRPM4, TRPM4B, 일시적 수용체 전위 양이온 채널, 서브패밀리 M, 구성원 4); TRPC6; TSLP; TWEAK; 티로시나제 (TYR; OCAIA; OCA1A; 티로시나제; SHEP3);VEGF; VEGFB; VEGFC; 베르시칸; VHL C5; VLA-4; XCL1 (림포탁틴); XCL2 (SCM-1b); XCRI(GPR5/ CCXCRI); YY1; 및/또는 ZFPM2에 결합하거나 이와 상호작용 할 수 있다.
많은 다른 바이러스 성분들 및/또는 관심 유전자들이 본 발명에 따른 숙주 세포에 의해 패키징될 수 있으며, 상기 목록은 제한을 의미하지 않는다.
본 발명의 방법은 관심 바이러스 입자들의 제조 규모 생산에 사용될 수 있다. 치료 단백질 또는 기타 단백질의 “제조 규모” 생산은 생산되는 단백질 및 수요에 따라 약 400 L에서 약 80,000 L 범위의 세포 배양을 이용한다. 전형적으로, 이러한 제조 규모 생산은 약 400 L 내지 약 25,000 L의 세포 배양 크기를 이용한다. 이 범위안에서, 특정 세포 배양 크기, 예를 들어, 4,000 L, 약 6,000 L, 약 8,000, 약 10,000, 약 12,000 L, 약 14,000 L, 또는 약 16,000 L가 이용될 수 있다.
6. 예시적인 실시형태
본 발명은 특정 숙주 세포 단백질, 예를 들어, 특정 리파제, 에스테라제 및 하이드롤라제를 포함하나 이에 제한되지 않는 숙주 세포 효소의 활성이 감소되거나 제거된 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포) 및/또는 이러한 세포의 제조 방법, 및 관심 생성물, 예를 들어, 재조합 단백질의 생산에 이러한 세포를 사용하는 방법에 관한 것이다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 이 세포는 변형되지 않은 세포 내 하나 이상의 효소의 활성에 비해 이러한 효소의 활성이 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택된다: 지단백질 리파제(LPL); 포스포리파제 B-도메인 함유 2(PLBL2/PLBD2); 리파제 A(리소좀산 리파제/콜레스테릴 에스테르 하이드롤라제, 리파제)(LIPA); 포스포리파제 A-2-활성화 단백질(PLAA); 포스포리파제 D3(PLD3); 포스포리파제 A2 그룹 XV(LPLA2); 포스포리파제 C 베타 1(PLCB1); 포스포리파제 C 델타 1(PLCD1); 단백질 1(단편)을 포함하는 DDHD 도메인(DDHD1); 라이소포스포리파제-유사 단백질 1(LYPLAL1); 포스포리파제 A2 그룹 XIIA(PLA2G12A); 퍼옥시레독신 6(PRDX6); 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(SMPD1); 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(PPT1); 이소아밀 아세테이트 가수분해 에스테라제 1(추정)(IAH1); OTU 데유비퀴티나제, 유비퀴틴 알데히드 결합 1(OTUB1); 라이소포스포리파제2(아실-단백질 티오에스테라제2)(LYPLA2); 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 13(ACOT13); 지방산 합성효소(FASN); 포스포리파제 A2 그룹 VII(PLA2G7); 유비퀴틴 특이적 펩티다제 5(USP5); N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(산 세라미다제)(ASAH1); 리파제 성숙 인자 1(LMF1); 아포지단백질-CII(APOC2); 아실카르니틴 하이드롤라제(HACH); 카르복실에스테라아제1F(CES1F) 또는 간 카르복실에스테라아제 B-1-유사(CES-B1L); 라이소포스포리파제 1(LYPLA1); 카르복실에스테라제 1(CES1); 포스포리파제 A1 구성원 A(PLA1A); 및 시알산 아세틸에스테라제(SIAE).
특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포에서 다음: a) PPT1; b) LPLA2; LPL; 및 LIPA; c) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1; d) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A; e) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SPD1; f) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13; g) LPLA2; LPL; 및 PPT1; h) LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1; i) HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; j) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; k) SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; l) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; m) LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; n) LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; o) LMF1 및 APOC2의 활성이 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포에서 하나 이상의 효소의 활성은 (a) 효소의 발현을 녹다운; (b) 효소의 발현을 녹아웃; 또는 (c) 효소를 인코딩하는 핵산 서열을 변경함으로써 감소 또는 제거된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포에 관한 것이다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 검출가능한 효소 활성이 없다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시형태들에서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합된다. 특정 실시형태에서, 재조합 숙주 세포는 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합되는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 특정 실시형태에서, 변형된 세포는 검출가능한 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 발현하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 본 발명에 기재된 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 활성을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 활성이 감소된 세포들을 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; 및/또는 ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; 및 ASAH1 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하고, 그 결과 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상은 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 관심 생성물을 생산하는 방법을 제공하며, 여기서 포유동물 세포는 관심 생성물을 발현하고 다음 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 여기서 포유동물 세포는 관심 생성물을 발현하고 다음: LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 코딩 영역의 파괴에 의해 변경된다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 이중대립유전자 변경을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 1개 이상의 염기쌍, 2개 이상의 염기쌍, 3개 이상의 염기쌍, 4개 이상의 염기쌍, 5개 이상의 염기쌍, 6개 이상의 염기쌍, 7개 이상의 염기쌍, 8개 이상의 염기쌍, 9개 이상의 염기쌍, 10개 이상의 염기쌍, 11개 이상의 염기쌍, 12개 이상의 염기쌍, 13개 이상의 염기쌍, 14개 또는 더 많은 염기쌍, 15개 이상의 염기쌍, 16개 이상의 염기쌍, 17개 이상의 염기쌍, 18개 이상의 염기쌍, 19개 이상의 염기쌍, 또는 20개 이상의 염기쌍의 결실을 포함한다. 특정 실시형태에서, 하나 이상의 효소 유전자는 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템 및 이의 조합으로 구성된 그룹에서 선택된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템이다.
전술한 특정 실시형태들에서, CRISPR/Cas9 시스템은 다음을 포함한다: (a) Cas9 분자, 및 (b) LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE를 인코딩하는 유전자 내 표적 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA).
전술한 특정 실시형태들에서, 유전자 조작 시스템은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA를 포함하고, 여기서 RNA는 LPL; PLBL2/PLBD2; LIPA; PLAA; PLD3; LPLA2; PLCB1; PLCD1; DDHD1; LYPLAL1; PLA2G12A; PRDX6; SMPD1; PPT1; IAH1; OTUB1; LYPLA2; ACOT13; FASN; PLA2G7; USP5; ASAH1; LMF1; APOC2; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; CES1; PLA1A; 및/또는 SIAE 유전자 중 하나 이상에 의해 발현되는 mRNA의 일부에 상보적이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 상기 유전자 조작 시스템은 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템 또는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포에서 다음: a) PPT1; b) LPLA2; LPL; 및 LIPA; c) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; 및 SPD1; d) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; PLAA; IAH1; OTUB1; LYPLA2; 및 PLA2G12A; e) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLD3; 및 SPD1; f) BAX; BAK; LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; PLBL2; PLD3; SPD1; CLU; PRDX1; PLAA; 및 ACOT13 또는 g) LPLA2; LPL; 및 PPT1; h) LPLA2; LPL; LIPA; 및 PPT1; i) HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; j) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; k) SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; l) LPLA2; LPL; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; LYPLA1; SMPD1; CES1; PLA1A; 및 SIAE; m) LPLA2; LMF1; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; n) LPLA2; LMF1; APOC2; LIPA; PPT1; HACH; CES1F/CES-B1L; 및 LYPLA1; o) LMF1 및 APOC2의 활성이 감소 또는 제거된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 본 발명에서 제공되는 방법은 관심 생성물의 정제, 관심 생성물의 수확, 및/또는 관심 생성물의 제형화를 추가로 포함한다.
전술한 특정 실시형태들에서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트의 분해가 감소된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 폴리소르베이트 20(PS20 또는 Tween 20)의 분해가 감소된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 폴리소르베이트 80(PS80 또는 Tween 80)의 분해가 감소된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 세포는 포유동물 세포이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다.
전술한 특정 실시형태들에서, 세포는 관심 생성물을 발현한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 포유동물 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코딩된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 상기 핵산 서열은 표적된 위치에서 상기 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코딩된다.
전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물이 단백질, 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 구성된다. 전술한 특정 실시형태들에서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체이다. 전술한 특정 실시형태들에서 항체는 단클론 항체이다.
특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, 및 LIPA도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, 및 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1도 발현하지 않는다. 특정 실시형태에서, 본 발명의 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LMF1 및 APOC2도 발현하지 않는다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, 및 LIPA 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, 및 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 재조합 숙주 세포를 제공하며, 여기서 세포는 LMF1 및 APOC2 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2; LPL; LIPA 및 PPT1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시킨다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LMF1 및 APOC2의 활성을 감소시킨다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 PPT1을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 LIPA 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, 및 PPT1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 LMF1 및 APOC2 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 BBAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, ? SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 세포에 LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공한다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, 및 LIPA을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, 및 LIPA이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, 및 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며서, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며서, 여기서 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 유전자 조작 시스템은 LMF1 및 APOC2를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LMF1 및 APOC2가 감소 또는 제거된 효소 활성을 가진다.
특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들을 배양하는 것을 포함하는 관심 생성물의 제조 방법을 제공하며, 상기 포유동물 세포들은 관심 생성물을 발현하고 감소 또는 제거된 LMF1 및 APOC2의 활성을 가진다.
특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 LIPA의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 가진다. 특정 실시형태들에서, 본 발명은 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포들의 집단을 배양하는 방법을 제공하며, 이 때 포유동물 세포들은 감소 또는 제거된 LMF1 및 APOC2의 활성을 가진다.
7. 실시예
다음 실시예는 단순히 본원에 개시된 발명에 관한 예시일 뿐이며 어떠한 방식으로든 제한으로 간주되어서는 안된다.
재료 및 방법
발현 플라스미드의 제작
중쇄 및 경쇄 cDNA 모두 거대세포바이러스(CMV) 극초기 유전자 프로모터 및 인핸서의 제어하에 있었다. 각 CMV 전사 시작 부위에 이어 최종 전사체에서 제거되는 인트론을 정의하는 스플라이스 공여자 및 수용체 서열이 뒤따른다 (Lucas 외, 1996).
항체 플라스미드 DNA 구조체 구조
단일 플라스미드 항체 구조체를 제작하기 위해, 항체 중쇄(HC) 및 경쇄(LC) 유전자를 보유하는 단편들을 L3 및 2L 서열과 퓨로마이신 N-아세틸-트랜스퍼라제(pac) 선별 마커를 포함하는 벡터에 클로닝했다. 2-플라스미드 항체 구조체를 제작하기 위해, 항체 HC 및 LC 유전자 단편을 L3 및 LoxFAS 서열을 포함하는 전방 벡터와 LoxFAS 및 2L 서열 및 pac 선별 마커를 포함하는 후방 벡터에 클로닝했다. 2-플라스미드 시스템에서 pac의 시작 코돈은 전방 벡터의 단부에 있고 나머지 pac 코딩 서열은 후방 벡터의 시작 부분에 있다. 모든 항체 유전자들은 앞에 CMV 프로모터가 오고 SV40 폴리(A) 서열이 뒤따랐다. 이전에 설명된 Cre 재조합효소 플라스미드(pOG231)는 모든 RMCE 프로세스에 사용되었다(O'Gorman S, Dagenais NA, Qian M, Marchuk Y. Proc Natl Acad Sci US A. 1997 Dec 23;94(26):14602-7).
L3 서열: 5' ATAACTTCGTATAAAGTCTCCTATACGAAGTTAT
LoxFAS 서열: 5' ATAACTTCGTATAGAAAGGTATATACGAAGTTAT
2L 서열: 5' ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT
세포 배양물
CHO 세포는 37 ℃ 및 5% CO2, 150 rpm에서 125 ml 진탕 플라스크 용기 내 전용 DMEM/F12-기반 배지에서 배양되었다. 세포는 3 내지 4일마다 3x105/mL의 씨딩 밀도로 계대되었다.
안정적인 형질감염 및 단백질 생산
CHO 세포는 제조업체의 권고 (Invitrogen, Carlsbad, CA)에 따라서 리포펙타민 2000 CD를 이용하여 형질감염되었다. 형질감염된 세포를 원심분리하고 다양한 농도의 메티오닌 설폭시민(MSX)이 포함된 DMEM/F-12 기반 선별 (글루타민이 없음) 배지에 씨딩했다. 씨딩 후 약 3주 후에 개별 콜로니들을 96-웰 플레이트에 넣었다. 넣은 콜로니들을 ELISA 분석을 위해 상청액을 채취하여 항체 생산에 대해 평가하였다. 상위 클론들을 14일 유가식 배양 공정을 사용하여 항체를 생산하도록 규모를 확장하였으며 3일차 온도를 35도로 변경하였다.
TI 안정성 세포주 개발
발현 플라스미드를 MaxCyte STX 전기천공법(MaxCyte, Gaithersburg, MD)에 의해 형질감염시켰다. 그런 다음 형질감염된 세포를 퓨로마이신 및 1-(2'-데옥시-2'-플루오로-1-베타-D-아라비노퓨라노실-5-아이오도) 우라실(FIAU)(Moravek)로 선별하였다. 풀 선별 후, 단일 세포 클로닝(SCC)을 수행했다. 클론들을 HTRF 분석에 의해 항체 역가에 대해 스크리닝하고 추가 평가를 위해 최고 역가의 클론들의 규모를 확장시켰다.
유가식 생산의 세포 배양 성능에 관한 분석
유가식 생산 배양은 화학적으로 정의된 전용 생산 배지를 사용하여 진탕 플라스크 또는 ambr15 용기 (Sartorius Stedim)에서 수행되었다. 세포들을 0일차에 1x106개 세포/ml로 씨딩하고, 3일차에 온도를 37°C에서 35°C로 변경하였다. 3, 7 및 10일차에 배양물들에 전용 공급 배지를 제공하였다. Vi-Cell XR 기기(Beckman Coulter)를 사용하여 0, 3, 7, 10 및 14일차에 배양된 세포의 생존 세포 수(VCC) 및 생존율을 측정했다. Bioprofile 400 분석장치 (Nova Biomedical)를 사용하여 7, 10 및 14일차에 포도당 및 젖산 농도를 측정하였다. 14일차 역가를 UV 검출에 따른 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 사용하여 측정하였다.
재조합 리파제의 발현 및 정제
C-말단 6xHis-또는 이중 6xHis-Flag 에피토프에 융합되고 포유동물 거대세포바이러스(CMV) 프로모터에 의해 구동되는, 효소 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(Uniprot 접근번호 G3HN89), N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(Uniprot 접근번호 G3GZB2), 리파제 A(Uniprot 접근번호 G3HQY6), 포스포리파제 A2 그룹 15(Uniprot 접근번호 G3HKV9), 아실카르니틴 하이드롤라제 (Uniprot 접근번호 G3IIG1), 간 카르복실에스테라제 B-1-유사 단백질(Uniprot 접근번호 A0A061IAA7), 라이소포스포리파제 1(Uniprot 접근번호 A0A098KXH0), 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(Uniprot 접근번호 G3IMH4), 카르복실에스테라제 1 (Uniprot 접근번호 A0A061ID92), 포스포리파제 A1 멤버 A (Uniprot 접근번호 G3I1J5) 및 시알산 아세틸에스테라제(Uniprot 접근번호 G3IIB1)는 유전자 합성 후 pRK5 발현 벡터 내부로 서브클로닝되어 생성되었다. 발현 구조체들은 DNA 시퀀싱에 의해 검증되었고 일시적으로 CHO 세포에 형질감염되었다. 형질감염 후 10일차에 분비된 재조합 리파제를 수확하고 Ni-NTA, 크기 배제 및 항-His 친화성 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 정제된 리파제를 원하는 완충액에 투석시키고 -80°C에서 보관했다.
평가를 위해 재조합 인간 지단백질 리파제(Uniprot 접근번호 Q6IAV0)를 외부 공급업체로부터 구입했다(R&D Systems 카탈로그 # 9888-LL-100).
식별된 HCP들의 하위집합에서 폴리소르베이트 분해 활성 평가
mAb 2 약물 물질(DS)에 팔미토일-티오에스테라제 1(PPT1), 재조합 인간 지단백질 리파제(rhLPL), N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(ASAH1) 및 리파제 A(LIPA)를 각각 10μg/mL, 0.6μg/mL, 10μg/mL 및 2.5μg/mL의 최종 농도로 첨가하였다. 이들 용액을 온도가 25°C로 조절된 Agilent 1200 오토샘플러에서 인큐베이션하였다. 10-15시간에 걸쳐 선택된 시점들에서 20μL를 샘플링하고 주입하여 ELSD와 커플링된 혼합 모드 HPLC로 PS20 함량을 결정했다.
생물-약학적으로 대표적인 배합 완충제(히스티딘-아세테이트, pH 6.0, 120mM 수크로스, 0.02% 또는 0.04% PS20(w:v) 포함)에 정제된 효소들을 다음 농도로 첨가하였다: 0.5 μg/mL의 포스포리파제 A2 그룹 15(LPLA2), 5 μg/mL의 아실카르니틴 하이드롤라제(HACH), 5 μg/mL의 간 카르복실에스테라제 B-1 유사 단백질(CES-B1L), 0.5 μg/mL의 라이소포스포리파제 1(LYPLA1), 52μg/mL의 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(SMPD1), 50μg/mL의 카르복실에스테라제 1(CES1), 31μg/mL의 포스포리파제 A1 멤버 A(PLA1A), 70μg/mL의 시알산 아세틸에스테라제(SIAE). 이들 용액을 온도가 25°C로 조절된 Agilent 1200 오토샘플러에서 인큐베이션하였다. 6-15시간에 걸쳐 선택된 시점들에서 20μL를 샘플링하고 주입하여 ELSD와 커플링된 혼합 모드 HPLC로 PS20 함량을 결정했다.
PS20 분해 분석을 사용한, CHO 세포들로부터 정제된 mAb에 대한 리파제/에스테라제 녹아웃(KO) 평가
폴리소르베이트 분해에 대한 KO의 영향은, 녹아웃된 리파제/에스테라제 유전자가 있는 재조합 mAb-생산 CHO 세포주를 사용하여 생성된 정제된 mAb 샘플을, 유전자가 녹아웃되지 않은 상응하는 mAb-생산 CHO 세포주와 비교함으로써 평가되었다. 각각의 mAb에 대해, mAb-생산 CHO 세포들의 생산 배양이 동일한 배양 조건을 사용하여 소규모(2-L) 생물반응기에서 수행되었다. 생산 생물반응기에서 약 2주 후, 배양물을 수확하고 정제했다. 각 mAb에 대해 배양 상청액을 동일한 하류 처리 단계(친화도 및 연마 크로마토그래피) 및 조건을 통해 채취하여 테스트를 위한 정제된 물질을 생성했다. 이러한 방식으로, 주어진 mAb에 대해, 상류 및 하류 처리 단계들과 조건들이 동일하기 때문에 정제된 샘플들은 KO 세포 또는 대조군 세포의 용도에 있어서만 상이하였다. 세포 배양물 수확 대신 정제된 물질에 대해 폴리소르베이트 20(PS20) 분해 분석을 수행하는 것이 중요한데, 왜냐하면 정제된 물질은 실시간 장기 보관 중에 폴리소르베이트 분해 및 입자 형성이 발생할 수 있는 의약품을 더 대표하기 때문이다.
PS20 분해 분석을 수행하기 위해, 정제된 샘플들에 PS20(0.04% v/v) 및 메티오닌(20mg/ml)을 첨가하고 약 2주 동안 25°C에서 인큐베이션하였으며 여러 시점에서 샘플을 채취하였다. 인큐베이션 후, 이전에 자세히 설명된 바와 같이(Cheng 외, J Pharm Sci, 2019, Volume 108, Issue 9, Pages 2880 -2886) 효소적 절단으로부터 방출된 유리 지방산(라우르산)을 정량화하여 샘플들을 PS20 가수분해 분해에 대해 분석했다. 라우르산 방출율은 PS20 분해에 대한 효소 활성을 나타낸다. 리파제/에스테라제 유전자가 녹아웃된 세포(즉, KO)에 대한 라우르산 방출율을 대조군 세포(즉, KO 없음)에 대한 라우르산 방출율과 비교했다. PS20 분해 억제에 대한 KO의 효능은, 대조군 세포를 사용하는 상응하는 mAb 샘플에 비해 유전자가 녹아웃된 mAb 샘플에서의 라우르산 방출율의 감소 퍼센트를 계산함으로써 평가되었다(도 15). 예를 들어, KO 세포에서 가수분해 PS20 분해가 완전히 억제되면 PS20 분해 활성이 100% 감소할 것이다(라우르산 방출율로 표시됨).
실시예 1: 3개의 단클론 항체가 풍부한 샘플에서 발견된 28개의 효소
도 1은 정제 과정의 여러 단계에서 채취한 mAb-1, mAb-2 및 mAb-3이 풍부한 샘플에서 28개의 효소가 발견되었음을 나타낸다. 28개의 효소에는 리파제, 에스테라제 및 하이드롤라제가 포함된다. mAb-1 샘플에서 18개의 효소가 발견되었다. mAb-2 샘플에서 15개의 효소가 발견되었다. 또한, mAb-3 샘플에서 8개의 효소가 발견되었다.
실시예 2: 바탕 CHO 숙주 세포 생성을 위한 다중화된 KO 접근법
도 2에 도시된 접근 방식을 사용하여 모체 CHO 숙주 세포주로부터 단일 또는 다중 녹아웃 유전자들이 있는 바탕 CHO 세포주 숙주들이 생성되었다. 1X KO 숙주는 PLBL2 유전자가 녹아웃된 모체 숙주로부터 생성되었다. 모체 숙주로부터 3X 숙주를 생성하기 위해 LPLA2, LPL 및 리파제 A 유전자가 동시에 녹아웃되었다. 3X 숙주로부터 7X 호스트를 생성하기 위해 PPT1, PLD3, PLBL2 및 SMPD1 유전자가 추가로 녹아웃되었다. 7X 숙주로부터 12X 숙주를 생성하기 위해 PLAA, LAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12a 유전자가 추가적으로 녹아웃되었다. Bax-Bak KO 숙주는 모체 숙주를 사용하고 Bax 및 Bak 유전자를 녹아웃시켜 생성되었다. Bax-Bak KO 숙주로부터 8X 숙주를 생성하기 위해 LPLA2, LPL, 리파제 A, PPT1, PLD3 및 SPD1 유전자가 추가적으로 녹아웃되었다. 8X KO 숙주로부터 13X 숙주를 생성하기 위해 Clu, PRDX1, Plaa 및 Acot13 유전자가 추가로 녹아웃되었다. 각 KO 숙주 세포주의 녹아웃된 유전자들은 도 3에 나열되어 있다.
실시예 3: PLBL2 KO 세포는 모체 CHO 숙주 세포주와 유사한 세포 성장 및 생산성을 가진다
mAb-A 발현 세포주의 배양된 씨드 트레인을 사용하여 표준 또는 개선된 공급 전략을 사용하는 생물반응기에서 생산 배양물을 공급하였다. 1X KO 및 모체 CHO 세포주의 성장 및 생존력을 도 4A 및 4C에 나타내었다. 1X KO 세포주의 역가(도 4B)는 모체 CHO 숙주 세포와 유사하거나 더 우수하였다.
실시예 4: 3가지 리파제/에스테라제가 녹아웃된 CHO 세포주들의 세포 성장
CHO 세포주 성장 및 mAb-B의 발현에 대한 3가지 리파제/에스테라제 녹아웃(3X KO) 효과를 평가하였다. 3X KO 세포주의 세포 성장을 모체 CHO 세포주와 비교하였다. mAb-B를 발현하는 3X KO 세포주의 성장(누적 생존 세포 수, IVCC로 나타냄)이 도 5A에 도시되어 있다. 역가 및 비 생산성(Qp)은 각각 도 5B 및 5C에 도시되어 있다.
실시예 5: 7가지 리파제/에스테라제가 녹아웃된 CHO 세포주들의 세포 성장
CHO 세포주 성장에 대한 7가지 리파제/에스테라제의 녹아웃(7X KO) 효과를 평가하였다. 7X KO 세포주의 세포 성장을 모체 CHO 세포주와 비교하였으며, 7X KO 세포 숙주의 성장(누적 생존 세포 수, IVCC로 나타냄)이 모체 CHO 세포주와 유사하였음을 보여주었다(도 6A). 7X KO 숙주의 생존력 및 젖산 축적은 각각 도 6B 및 6C에 도시되어 있다.
실시예 6: 7X 녹아웃 CHO 세포주에서 3가지 다른 항체 생산
세 가지 다른 항체의 발현에 대한 7X KO의 효과도 평가되었다. 3가지 상이한 항체에 대한 7X KO 세포주의 성장(도 7A), 역가(도 7B) 및 생성물 특이성(도 7C)은 모체 CHO 숙주 세포와 유사하거나 더 우수했다.
실시예 7: 8가지 리파제/에스테라제가 녹아웃된 CHO 세포주들의 세포 성장
CHO 세포주 성장에 대한 8가지 리파제/에스테라제의 녹아웃(8X KO) 효과를 평가하였다. Bax Bak KO 숙주 및 8X KO 세포주의 세포 성장을 모체 CHO 세포주와 비교하였으며 8X KO 및 Bax Bak KO 세포 숙주의 성장(누적 생존 세포 수, IVCC로 나타냄)이 모체 CHO 세포주와 유사하였음을 보여주었다(도 8A). 8X KO 및 Bax Bak KO 숙주의 생존력 및 젖산 축적은 각각 도 8B 및 8C에 도시되어 있다.
실시예 8: 12가지 리파제/에스테라제가 녹아웃된 CHO 세포주들의 세포 성장
CHO 세포주 성장에 대한 12가지 리파제/에스테라제의 녹아웃(12X KO) 효과를 평가하였다. 12X KO 세포주의 13일차(D13) 세포 성장을 모체 CHO 세포주, 3X KO 및 7X KO 숙주와 비교하였으며, 12X KO 세포 숙주의 성장(누적 생존 세포 수, IVCC로 나타냄)이 모체 CHO 세포주와 유사하였음을 보여주었다(도 9A). 12X KO 숙주의 D13 생존력 및 젖산 축적은 각각 도 9B 및 9C에 도시되어 있다.
실시예 9: 7X 녹아웃 CHO 세포주에서 mAb-2 생산
mAb-2의 발현에 대한 7X KO의 효과도 평가되었다. mAb-2에 대한 7X KO 세포주의 평균 D10 역가(도 10A), D10 및 D14 성장(도 10B), D10에서의 생성물 특이성(도 10C) 및 D14 젖산 축적(도 10D)은 모체 CHO 숙주 세포와 유사하였다.
실시예 10: 7X 녹아웃 CHO 세포주에서 mAb-1 생산
mAb-1의 발현에 대한 7X KO의 효과도 평가되었다. mAb-2에 대한 7X KO 세포주의 역가(도 11A), 성장(도 11B) 및 생성물 특이성(도 11C)은 모체 CHO 숙주 세포와 유사하였다.
실시예 11: 7X 리파제/에스테라아제 녹아웃 CHO 세포주에서 PS20 분해
PS20 분해에 대한 7가지 리파제/에스테라제 녹아웃(7X KO)의 효과를 mAb-B 생산 세포주에 대해 평가했다. 이러한 세포주는 7X KO CHO 숙주를 형질감염시켜(도 3) mAb-B를 생산함으로써 생성되었다. 생물 반응기에서 세포를 배양한 후, 세포 배양 수확물을 친화도 및 연마 크로마토그래피 단계를 통해 처리했다. PS20 분해는 하류 처리 종료시 얻은 정제된 물질 중의 모체 CHO 세포주와 비교하여 7X KO 리파제 세포주에서 61% 감소되었다(도 12). PS20의 분해 감소는 상당한 정제 공정 최적화를 가능하게 할 수 있으며 더 중요하게는 의약품의 입자 형성 위험을 낮춘다.
실시예 12: 재조합 LIPA, ASAH1, LPL, PPT1, LPLA2, HACH, CES-B1L, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 특성화
PS 가수분해 효소에 대한 이전 보고서와 트리글리세라이드 및 폴리소르베이트의 구조적 유사성을 고려하여, 폴리소르베이트 가수분해 효소의 분해 특성을 보다 자세히 평가하기 위해 LIPA, ASAH1, LPL 및 PPT1을 선택했다. CHO LIPA, ASAH1, PPT1, LPLA2, HACH, CES-B1L, SMPD1, CES1, PLA1A 및 SIAE는 CHO 세포에서 His-태그된 구조체로 발현되었고 방법 섹션에 설명된 대로 정제되었다. 각 효소에 대한 SDS-PAGE를 도 13에 나타내었고, 모든 효소는 온전한 질량 MS에 의해 관심 단백질로 확인되었다(데이터는 나타내지 않음). 또한 재조합 인간 LPL(rhLPL)은 상업적 공급원에서 구입한 반면 테스트된 다른 모든 효소는 C. 그리세우스(C. griseus)에서 구입했다는 점이 언급되어야 한다.
이러한 효소들을 폴리소르베이트를 분해하는 능력에 대해 추가로 특성화하였다. 각 효소를 폴리소르베이트 함유 mAb 제형에 첨가하였다. 효소 활성은 폴리소르베이트 농도를 시간의 함수로서 측정함으로써 측정되었다. 궁극적으로 PPT1, LIPA 및 rhLPL(각각 10μg/mL, 10μg/mL 및 0.6μg/mL)은 10-15시간의 테스트 기간 내에 폴리소르베이트를 분해할 수 있었던 반면 2.5μg/mL의 ASAH1은 도 14a에서 보는 바와 같이 측정가능한 분해를 나타내지 않았다. 또한 HACH, LYPLA1, CES-B1L 및 LPLA2(각각 5μg/mL, 5μg/mL, 0.5μg/mL 및 0.5μg/mL)가 배합 완충 용액에서 폴리소르베이트를 분해할 수 있었던 것으로 나타났다(도 14b). 추가 가수분해 효소 세트인, PLA1A, SIAE, CES1 및 SMPD1(각각 31μg/mL, 70μg/mL, 50μg/mL 및 52μg/mL)도 배합 완충 용액에서 폴리소르베이트를 분해할 수 있었으나, 폴리소르베이트를 분해하려면 이들 재조합적으로 발현된 효소들의 더 높은 농도가 필요했다(도 14c).
실시예 13: 추가 7X 및 12X 리파제/에스테라제 녹아웃 CHO 세포주에서 PS20 분해
PS20 분해에 대한, CHO 세포주의 7가지(7X KO) 및 12가지(12X KO) 유전자 녹아웃 효과를 4개의 추가 mAb 생성 세포주에서 평가하였다. 이들 세포주는 7X KO 또는 12X KO CHO 숙주를 형질감염시켜(도 3) 원하는 mAb를 생성함으로써 생성되었다. 7X KO의 효과는 mAb W 및 mAb X 세포주로 테스트되었으며 12X KO의 효과는 mAb Y 및 mAb Z 세포주로 테스트되었다. 생물반응기에서 세포를 배양한 후, 세포 배양 수확물을 친화도 및 연마 크로마토그래피 단계를 통해 처리했다. 모든 경우에, 정제 종료시에 생성된 물질은 유전자들이 녹아웃되지 않은 대조군 세포주에 비해 7X KO 및 12X KO 세포주에서 PS20 분해에 대한 효소 활성이 감소된 것으로 나타났다(도 15). PS20의 분해 감소는 상당한 정제 공정 최적화를 가능하게 할 수 있으며 더 중요하게는 의약품의 입자 형성 위험을 낮춘다.
실시예 14: 다수의 리파제/에스테라제 유전자가 녹아웃된 mAb T 세포주의 PS20 분해
PS20 분해에 대한, mAb T를 생성하는 재조합 CHO 세포주에서 리파제/에스테라제 유전자의 녹아웃 효과를 평가하였다. 이들 세포주는 CHO 세포주를 생성하는 재조합 mAb T로부터 리파제/에스테라제 유전자를 순차적으로 녹아웃함으로써 생성되었다. 세포주에 대한 1X KO(LPLA2) 및 2X KO(LPLA2 및 LPL)의 효과를 먼저 테스트했다. 그런 다음 세포주에 대한 3X KO(LPLA2, LPL 및 LIPA) 및 6X KO(LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3 및 PLBL2)의 효과를 나중에 테스트하였다. 생물반응기에서 세포를 배양한 후, 세포 배양 수확물을 친화도 및 연마 크로마토그래피 단계를 통해 처리했다. 모든 경우에서, 정제 종료시 생성된 물질들은 유전자가 녹아웃되지 않은 대조군 모체 mAb T 세포주에 비해 1X KO, 2X KO, 3X KO 및 6X KO 세포주에서 PS20 분해에 대한 효소 활성이 감소한 것으로 나타났다(도 16). 3X KO 및 6X KO 세포주에 대한 두 번째 실험 세트는 1X KO 및 2X KO 세포주에 대한 첫 번째 실험 세트보다 더 낮은 PS20 분해 활성을 보여주었다. 종합하면, 이러한 결과는 폴리소르베이트 분해 효소를 발현하는 다수의 관련 리파제/에스테라제 유전자를 녹아웃시키는 것의 잠재적인 이점을 나타낸다. PS20의 분해 감소는 상당한 정제 공정 최적화를 가능하게 할 수 있으며 더 중요하게는 의약품의 입자 형성 위험을 낮춘다.
본원 전반에 걸쳐 인용된 모든 도면 및 모든 참고문헌, 특허문헌 및 공개된 특허 출원 그리고 접근번호들의 내용은 본원에 참고문헌으로 명시적으로 포함된다.
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Thr His Gln Gly Leu Ser 210 215 220 Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Asp Lys Thr His 225 230 235 240 Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val 245 250 255 Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ala Ser Arg Thr 260 265 270 Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu 275 280 285 Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys 290 295 300 Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser 305 310 315 320 Val Leu Thr Val Leu Ala Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys 325 330 335 Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile 340 345 350 Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro 355 360 365 Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala 370 375 380 Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn 385 390 395 400 Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser 405 410 415 Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg 420 425 430 Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu 435 440 445 His Asn Ala Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455 460 <210> 24 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 24 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 25 <211> 213 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide" <400> 25 Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln 1 5 10 15 Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr 35 40 45 Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly 65 70 75 80 Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His 85 90 95 Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser 100 105 110 Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 115 120 125 Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 130 135 140 Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val 145 150 155 160 His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile 180 185 190 Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val 195 200 205 Glu Pro Lys Ser Cys 210 <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 26 Ala Ile Phe Thr Gly Ser Gly Ala Glu Tyr Lys Ala Glu Trp Ala Lys 1 5 10 15 Gly <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide" <400> 27 Asp Ala Gly Tyr Asp Tyr Pro Thr His Ala Met His Tyr 1 5 10 <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> 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Claims (117)

  1. 재조합 숙주 세포이며, 하나 이상의 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  2. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 효소는 다음으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 재조합 숙주 세포: 지단백질 리파제(LPL), 포스포리파제 B-도메인 함유 2(PLBL2/PLBD2), 리파제 A(리소좀산 리파제/콜레스테릴 에스테르 하이드롤라제, 리파제)(LIPA), 포스포리파제 A-2-활성화 단백질(PLAA), 포스포리파제 D3(PLD3), 포스포리파제 A2 그룹 XV(LPLA2), 포스포리파제 C 베타 1(PLCB1), 포스포리파제 C 델타 1(PLCD1), 단백질 1(단편)을 포함하는 DDHD 도메인(DDHD1), 라이소포스포리파제-유사 단백질 1(LYPLAL1), 포스포리파제 A2 그룹 XIIA(PLA2G12A), 퍼옥시레독신 6(PRDX6), 스핑고미엘린 포스포디에스테라제(SMPD1), 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1(PPT1), 이소아밀 아세테이트 가수분해 에스테라제 1(추정)(IAH1), OTU 데유비퀴티나제, 유비퀴틴 알데히드 결합 1(OTUB1), 라이소포스포리파제2(아실-단백질 티오에스테라제2)(LYPLA2), 아실-코엔자임 A 티오에스테라제 13(ACOT13), 지방산 합성효소(FASN), 포스포리파제 A2 그룹 VII(PLA2G7), 유비퀴틴 특이적 펩티다제 5(USP5), N-아실스핑고신 아미도하이드롤라제 1(산 세라미다제)(ASAH1), 리파제 성숙 인자 1(LMF1), 아포지단백질 C-II(APOC2), 아실카르니틴 하이드롤라제(HACH), 카르복실에스테라아제 1F(CES1F) 또는 간 카르복실에스테라아제 B-1-유사(CES-B1L), 라이소포스포리파제 1(LYPLA1), 카르복실에스테라제 1(CES1), 포스포리파제 A1 구성원 A(PLA1A), 및 시알산 아세틸에스테라제(SIAE).
  3. 청구항 2에 있어서, 다음의 활성이 감소 또는 제거되는 것인 재조합 숙주 세포:
    a) PPT1,
    b) LPLA2, LPL, 및 LIPA,
    c) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1,
    d) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A,
    e) BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1,
    f) BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13,
    g) LPLA2, LPL, 및 PPT1,
    h) LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1,
    i) HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    j) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    k) SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE,
    l) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE,
    m) LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    n) LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1, 또는
    o) LMF1 및 APOC2.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 효소의 활성은 다음에 의해 감소 또는 제거되는 것인 재조합 숙주 세포:
    (a) 효소 발현의 녹다운, 또는
    (b) 효소 발현의 녹아웃, 또는
    (c) 효소를 인코딩하는 핵산 서열의 변경.
  5. 청구항 1에 있어서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  6. 청구항 5에 있어서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 검출가능한 효소 활성이 없는 것인 재조합 숙주 세포.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포인 재조합 숙주 세포.
  8. 청구항 7에 있어서, CHO 세포인 재조합 숙주 세포.
  9. 청구항 1-8 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물을 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포.
  10. 청구항 9에 있어서, 관심 생성물은 단백질, 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  11. 청구항 9 또는 10에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  12. 청구항 9-11 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 항체는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 재조합 숙주 세포.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 이루어진 것인 재조합 숙주 세포.
  15. 청구항 12-14 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  16. 청구항 12-15 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론 항체를 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  17. 청구항 9-16 중 어느 한 항에 있어서, 핵산 서열은 표적된 위치에서 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합되는 것인 재조합 숙주 세포.
  18. 청구항 17에 있어서, 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합되는 관심 생성물을 인코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 재조합 숙주 세포.
  19. 청구항 1에 있어서, 변형된 세포는 어떠한 검출가능한 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE도 발현하지 않는 것인 재조합 숙주 세포.
  20. 청구항 1-19 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  21. LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  22. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  23. LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE의 활성이 감소된 세포들을 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  24. LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  25. 세포에 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  26. 세포에 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며,
    유전자 조작 시스템은 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, 및 ASAH1 중 하나 이상을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하고,
    그 결과 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE 중 하나 이상이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  27. 청구항 25 또는 26에 있어서, 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas 시스템, 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템, 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  28. 청구항 27에 있어서, 유전자 조작 시스템은 CRISPR/Cas9 시스템인 방법.
  29. 청구항 28에 있어서, 상기 CRISPR/Cas9 시스템은 다음을 포함하는 것인 방법:
    (a) Cas9 분자, 및
    (b) LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, HACH, LMF1, APOC2, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE를 인코딩하는 유전자 내 표적 서열에 상보적인 표적화 서열을 포함하는 하나 이상의 가이드 RNA(gRNA).
  30. 청구항 25 또는 26에 있어서,
    유전자 조작 시스템은 짧은 헤어핀 RNA(shRNA), 작은 간섭 RNA(siRNA) 및 마이크로RNA(miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 RNA를 포함하고,
    여기서 RNA는 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE 유전자 중 하나 이상에 의해 발현되는 mRNA의 일부에 상보적인 방법.
  31. 청구항 25 또는 26에 있어서, 유전자 조작 시스템은 징크-핑거 뉴클레아제 (ZFN) 시스템 또는 전사 활성인자-유사 효과기 뉴클레아제 (TALEN) 시스템인 방법.
  32. 청구항 21-31 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 포유동물 세포인 방법.
  33. 청구항 32에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 세포인 방법.
  34. 청구항 21-33 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 관심 생성물을 발현하는 것인 방법.
  35. 청구항 34에 있어서, 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 것인 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 핵산 서열은 표적된 위치에서 세포의 세포 게놈에 통합되는 것인 방법.
  37. 청구항 34-36 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코딩되는 것인 방법.
  38. 청구항 34-37 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관심 생성물은 단백질을 포함하는 것인 방법.
  39. 청구항 38에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  40. 청구항 34-39 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  41. 청구항 40에 있어서, 항체는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  42. 청구항 40에 있어서, 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 이루어진 것인 방법.
  43. 청구항 40-42 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체인 방법.
  44. 청구항 40-43 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론 항체인 방법.
  45. 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포를 배양하는 것을 포함하는, 관심 생성물을 생산하는 방법이며, 포유동물 세포는 관심 생성물을 발현하고 다음 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 갖는 것인 방법: LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SMPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE.
  46. 관심 생성물을 발현하는 포유동물 세포 집단을 배양하는 방법이며, 포유동물 세포는 다음 중 하나 이상의 감소 또는 제거된 활성을 갖는 것인 방법: LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, 및 ASAH1.
  47. 청구항 35 또는 36에 있어서, 활성의 감소 또는 제거는 포유동물 세포 내 다음의 활성의 감소 또는 제거인 방법:
    a) PPT1,
    b) LPLA2, LPL, 및 LIPA,
    c) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, 및 SMPD1,
    d) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SMPD1, PLAA, IAH1, OTUB1, LYPLA2, 및 PLA2G12A,
    e) BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLD3, 및 SMPD1,
    f) BAX, BAK, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, PLBL2, PLD3, SPD1, CLU, PRDX1, PLAA, 및 ACOT13,
    g) LPLA2, LPL, 및 PPT1,
    h) LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1,
    i) HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    j) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    k) SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE,
    l) LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE,
    m) LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1,
    n) LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1, 또는
    o) LMF1 및 APOC2.
  48. 청구항 45-47 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포는 CHO 세포인 방법.
  49. 청구항 45-47 중 어느 한 항에 있어서, 포유동물 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 핵산 서열에 의해 인코딩되는 것인 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 핵산 서열은 표적된 위치에서 포유동물 세포의 세포 게놈에 통합되는 것인 방법.
  51. 청구항 45-50 중 어느 한 항에 있어서, 세포에 의해 발현된 관심 생성물은 포유동물 세포의 세포 게놈에 무작위로 통합된 핵산 서열에 의해 추가로 인코딩되는 것인 방법.
  52. 청구항 45-51 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물은 단백질, 바이러스 입자 또는 바이러스 벡터를 포함하는 것인 방법.
  53. 청구항 45-42 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물은 재조합 단백질을 포함하는 것인 방법.
  54. 청구항 45-53 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것인 방법.
  55. 청구항 54에 있어서, 항체는 다중특이성 항체 또는 이의 항원 결합 단편인 방법.
  56. 청구항 54에 있어서, 항체는 단일 중쇄 서열 및 단일 경쇄 서열 또는 이의 항원 결합 단편들로 이루어진 것인 방법.
  57. 청구항 54-56 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 키메라 항체, 인간 항체, 또는 인간화 항체인 방법.
  58. 청구항 54-57 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 단클론 항체인 방법.
  59. 청구항 45-58 중 어느 한 항에 있어서, 관심 생성물을 정제하고, 관심 생성물을 수확하고, 및/또는 관심 생성물을 제형화하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  60. 청구항 21-58 중 어느 한 항에 있어서, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트의 분해가 감소되는 것인 방법.
  61. 청구항 21-58 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트 20(PS20 또는 트윈 20)의 분해가 감소되는 것인 방법.
  62. 청구항 21-58 중 어느 한 항에 있어서, 폴리소르베이트 80(PS80 또는 트윈 80)의 분해가 감소되는 것인 방법.
  63. 하나 이상의 변경된 효소 유전자를 포함하는 재조합 숙주 세포.
  64. 청구항 63에 있어서, 하나 이상의 변경된 효소 유전자는 코딩 영역의 파괴에 의해 변경되는 것인 재조합 숙주 세포.
  65. 청구항 63에 있어서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 이중대립유전자 변경을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  66. 청구항 65에 있어서, 하나 이상의 효소 유전자 변경은 1개 이상의 염기쌍, 2개 이상의 염기쌍, 3개 이상의 염기쌍, 4개 이상의 염기쌍, 5개 이상의 염기쌍, 6개 이상의 염기쌍, 7개 이상의 염기쌍, 8개 이상의 염기쌍, 9개 이상의 염기쌍, 10개 이상의 염기쌍, 11개 이상의 염기쌍, 12개 이상의 염기쌍, 13개 이상의 염기쌍, 14개 이상의 염기쌍, 15개 이상의 염기쌍, 16개 이상의 염기쌍, 17개 이상의 염기쌍, 18개 이상의 염기쌍, 19개 이상의 염기쌍, 또는 20개 이상의 염기쌍의 결실을 포함하는 것인 재조합 숙주 세포.
  67. 청구항 63에 있어서, 하나 이상의 효소 유전자는 LPL, PLBL2/PLBD2, LIPA, PLAA, PLD3, LPLA2, PLCB1, PLCD1, DDHD1, LYPLAL1, PLA2G12A, PRDX6, SPD1, PPT1, IAH1, OTUB1, LYPLA2, ACOT13, FASN, PLA2G7, USP5, ASAH1, LMF1, APOC2, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, CES1, PLA1A, 및/또는 SIAE인 재조합 숙주 세포.
  68. 재조합 숙주 세포이며, LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  69. 재조합 숙주 세포이며, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  70. 재조합 숙주 세포이며, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  71. 재조합 숙주 세포이며, LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  72. 재조합 숙주 세포이며, LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  73. 재조합 숙주 세포이며, LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L 및 LYPLA1 효소의 활성이, 변형되지 않은 세포 내 이들 효소의 활성에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  74. 재조합 숙주 세포이며, LMF1 및 APOC2의 수준이, 변형되지 않은 세포 내 이들의 수준에 비해 감소 또는 제거되도록 변형된 재조합 숙주 세포.
  75. 청구항 68-74 중 어느 한 항의 재조합 숙주 세포를 포함하는 조성물.
  76. LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  77. HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  78. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  79. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  80. LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  81. LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  82. LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  83. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  84. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  85. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  86. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  87. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  88. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  89. 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성을 조절하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법이며, 세포 배양 과정 및/또는 배지 조성의 조절은 LMF1 및 APOC2의 활성을 감소시키는 것인 방법.
  90. LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  91. HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  92. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  93. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  94. LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  95. LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  96. LMF1 및 APOC2의 활성이 감소된 세포를 선택하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  97. LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  98. HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  99. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  100. LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  101. LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  102. LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  103. LMF1 및 APOC2 중 하나 이상을 인코딩하는 유전자를 변경하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소시키는 방법.
  104. 세포에 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  105. 세포에 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  106. 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  107. 세포에 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  108. 세포에 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  109. 세포에 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  110. 세포에 LMF1 및 APOC2의 발현을 녹다운 또는 녹아웃 시키는 유전자 조작 시스템을 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법.
  111. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA 및 PPT1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  112. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  113. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  114. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LPL, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, LYPLA1, SMPD1, CES1, PLA1A, 및 SIAE가 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  115. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  116. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1을 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LPLA2, LMF1, APOC2, LIPA, PPT1, HACH, CES1F/CES-B1L, 및 LYPLA1이 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
  117. 유전자 조작 시스템을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 세포 내 효소 활성을 감소 또는 제거하는 방법이며, 유전자 조작 시스템은 LMF1 및 APOC2를 인코딩하는 핵산 서열을 변경하여 LMF1 및 APOC2가 감소 또는 제거된 효소 활성을 갖는 것인 방법.
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