JP7308034B2 - 最適化二重ヌクレアーゼ融合物および方法 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は、２０１６年７月１日に出願された米国仮出願第６２／３５７７５６号の優先権を主張する。上記出願の内容は、参照によって本明細書に組み込まれる。
背景
死細胞および瀕死細胞からの（リボ）核タンパク質粒子の蓄積は、少なくとも２つの機構によって、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を有する患者において炎症性カスケードを誘導することが公知である：（ｉ）クロマチン／抗クロマチン複合体の沈着またはインサイチュー形成が腎炎を引き起こし、腎機能の喪失につながる；および（ｉｉ）自己抗体と複合体化した核酸が、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）７、８および９ならびにＴＬＲ非依存的経路を介して先天性免疫を活性化する。核タンパク質の放出は、ＳＬＥにおける自己抗体の強力な抗原として機能して、抗原受容体およびＴＬＲの同時嵌合を介したＢ細胞およびＤＣ活性化の増幅を提供し得る。したがって、例えば循環免疫複合体に含まれる核酸を消化することによって、循環免疫複合体を攻撃する長時間作用型ヌクレアーゼ分子を用いて、自己抗体抗原に結合した核酸の除去ならびに／または免疫刺激、免疫増幅および免疫複合体媒介性疾患の軽減を必要とする被験体における自己抗体抗原に結合した核酸を除去し、ならびに／または免疫刺激、免疫増幅および免疫複合体媒介性疾患を軽減するための手段に対する必要性が存在する。
本発明は、部分的には、高いヌクレアーゼ活性で複数の基質に結合することができるタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質またはヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質である最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に関する。いくつかの態様では、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、１つまたはそれを超えるＦｃドメインにタンデムに作動可能に連結された１つまたはそれを超えるＤＮａｓｅ１および１つまたはそれを超えるＲＮａｓｅ１ドメインを含む。いくつかの態様では、ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１ドメインがＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに位置するように、１つまたはそれを超えるＦｃドメインに作動可能に連結された単一ＤＮａｓｅ１ドメインおよび単一ＲＮａｓｅ１ドメインを含む。いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、二重機能ヌクレアーゼ－Ｆｃ鎖を発現する問題を軽減し、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインの潜在的な立体障害を緩和する。いくつかの態様では、ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ヘテロ二量体の形成を最大化するためのＦｃドメインにおける１つまたはそれを超える変異を含む。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよびＦｃ領域を含むタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であり、第１のヌクレアーゼドメインはＤＮａｓｅ１であり、第２のヌクレアーゼドメインはＲＮａｓｅ１であり、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＲＮａｓｅ１にＮ末端からＣ末端にタンデムに作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている。タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて増強した薬物動態活性を示す。このようなタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて変化した、例えば向上した血清半減期を示す。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよびＦｃ領域を含むヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であり、第１のヌクレアーゼドメインはＤＮａｓｅ１であり、第２のヌクレアーゼドメインはＲＮａｓｅ１であり、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、それにより、ヘテロ二量体を形成する。ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて増強した薬物動態活性を示す。このようなヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて変化した、例えば向上した血清半減期を示す。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、図１に表されているものである。
いくつかの態様では、本発明は、ヒトＤＮａｓｅ１、ヒトＲＮａｓｅ１および変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であって、前記ヒトＤＮａｓｅ１が、リンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介してヒトＲＮａｓｅ１にＮ末端からＣ末端に作動可能に連結されており、前記ヒトＲＮａｓｅ１が、リンカーを介して前記変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに作動可能に連結されており、前記変異体ヒトＩｇＧ１が、変異体ヒンジ領域（例えば、セリンなどによるシステイン置換、例えばＳＣＣ）と、Ｆｃγ受容体結合を減少させるための１つまたはそれを超えるＣＨ２変異（例えば、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１ＳまたはＰ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓの両方、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）とを有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ペプチドリンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介してヒトＲＮａｓｅ１に作動可能に連結されたヒトＤＮａｓｅ１を含み（Ｎ末端－ＤＮａｓｅ１－リンカー－ＲＮａｓｅ１－Ｃ末端）、ヒトＲＮａｓｅ１は、ペプチドリンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介して、変異体ヒンジ領域ＳＣＣヒンジと、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓ変異とを有する変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに作動可能に連結されている。さらに別の実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｎ結合型グリコシル化部位に変異、例えばＮ２９７に置換をさらに含む（ナンバリングはＫａｂａｔによる）。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のリンカードメインをさらに含み、第１のヌクレアーゼドメインは、第１のリンカードメインを介して第２のヌクレアーゼドメインに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第２のリンカードメインをさらに含み、第２のヌクレアーゼドメインは、第２のリンカードメインを介してＦｃドメインに作動可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅドメインは、野生型ＲＮａｓｅ、例えば野生型ヒトＲＮａｓｅ１である。他の実施形態では、ＲＮａｓｅドメインは、変異体ＲＮａｓｅ、例えばアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ＲＮａｓｅ１、例えばヒトＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓ（配列番号２８）である。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ含有最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、循環ＲＮＡおよび免疫複合体中のＲＮＡを分解するか、またはインターフェロン－アルファ産生を阻害するか、またはその両方である。さらに他の実施形態では、ＲＮａｓｅの活性は、対照ＲＮａｓｅ分子の活性の約１０倍未満、例えば９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満または２倍未満よりも低いものではない。さらに他の実施形態では、ＲＮａｓｅの活性は、対照ＲＮａｓｅ分子の活性とほぼ同等である。
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅドメインは、野生型ＤＮａｓｅ、例えば野生型ヒトＤＮａｓｅ１である。他の実施形態では、ＤＮａｓｅドメインは、変異体ＤＮａｓｅドメイン、例えば変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆ（配列番号２１）またはアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ヒトＤＮａｓｅ、例えば変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆ（配列番号２４）である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ含有最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、循環ＤＮＡおよび免疫複合体中のＤＮＡを分解するか、またはインターフェロン－アルファ産生を阻害するか、またはその両方である。さらに他の実施形態では、ＤＮａｓｅの活性は、対照ＤＮａｓｅ分子の活性の約１０倍未満、例えば９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満または２倍未満よりも低いものではない。さらに他の実施形態では、ＤＮａｓｅの活性は、対照ＤＮａｓｅ分子の活性とほぼ同等である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｆｃドメインから第１のおよび第２のヌクレアーゼドメインならびに／または第２のヌクレアーゼドメインを分離するｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを有する。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｆｃドメインを含有しない分子と比べて増加した血清半減期および／または活性を有する。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２１に記載されている変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆドメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２４に記載されている変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅドメインは、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｅ１３Ｒ／Ｎ７４Ｋ／Ａ１１４Ｆ／Ｔ２０５Ｋ（配列番号２５）である。他の実施形態では、ＤＮａｓｅドメインは、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｅ１３Ｒ／Ｎ７４Ｋ／Ａ１１４Ｆ／Ｔ２０５Ｋ／Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ（配列番号２６）である。
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１ドメインは、アグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化されている。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅドメインは、変異体ＤＮａｓｅドメイン、例えば変異体ヒトＤＮａｓｅ１およびアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ＤＮａｓｅドメイン、例えばアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ヒトＤＮａｓｅ１である。一実施形態では、ヒトＤＮａｓｅ１は、１つまたはそれを超えるＮ結合型グリコシル化部位、例えばＮ１８およびＮ１０６における変化（例えば、置換）と、Ａ１１４、Ｅ１３、Ｎ７４、Ｔ２０５およびそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つのさらなる変異とを含む。別の実施形態では、ヒトＤＮａｓｅ１は、Ｎ１８、Ｎ１０６またはＮ１８およびＮ１０６の両方における変化（例えば、置換）と、Ａ１１４、Ｅ１３、Ｎ７４、Ｔ２０５およびそれらの組み合わせにおけるさらなる変化（例えば、置換）とを含む。さらに別の実施形態では、ヒトＤＮａｓｅ１は、Ｎ１８、Ｎ１０６、Ａ１１４、Ｅ１３、Ｎ７４およびＴ２０５における変化、例えば置換、例えばＮ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆ／Ｅ１３Ｒ／Ｎ７４Ｋ／Ｔ２０５Ｋ（配列番号２６）を含む。別の実施形態では、変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２７に記載されているヒト野生型ＲＮａｓｅ１ドメインを含む。別の実施形態では、変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２８に記載されているヒト変異体ＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓドメインを含む。
いくつかの態様では、本発明は、配列番号１～１７に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を提供する。他の態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１～１７に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一または少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよびＦｃドメインを含むポリペプチドを含み、第１のヌクレアーゼドメインはＤＮａｓｅ１であり、第２のヌクレアーゼドメインはＲＮａｓｅ１であり、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＲＮａｓｅ１にＮ末端からＣ末端にタンデムに作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃ領域に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずにＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずにＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーを介してＲＮａｓｅ１に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号２に記載されているアミノ酸配列、または配列番号１もしくは配列番号２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、上記ポリペプチドのいずれかを含むホモ二量体である。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインを含むヘテロ二量体であり、第１のヌクレアーゼドメインはＤＮａｓｅ１であり、第２のヌクレアーゼドメインはＲＮａｓｅ１であり、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第２のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている。上記ヘテロ二量体のいくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第２のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。
いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第２のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第２のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第２のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第２のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第２のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第２のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第２のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第２のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、（ｉ）配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号７に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉｉ）配列番号９に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号９に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１０に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｖ）配列番号１１に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｖ）配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択される第１のおよび第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体である。
他の態様は、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよび第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインを含むヘテロ二量体であって、前記第１のヌクレアーゼドメインがＤＮａｓｅ１であり、前記第２のヌクレアーゼドメインがＲＮａｓｅ１であり、
（ｉ）前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、または
（ｉｉ）前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されているヘテロ二量体に関する。
上記ヘテロ二量体のいくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってリンカーによらずに（ｗｉｔｈ ａ ｗｉｔｈｏｕｔ ａ ｌｉｎｋｅｒ）第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの態様では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによって第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。
いくつかの態様では、ヘテロ二量体は、（ｉ）配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択される第１のおよび第２のポリペプチド配列を含む。
いくつかの態様では、上記ヘテロ二量体はいずれも、ヘテロ二量体を優先的に形成するためのＦｃドメイン中における１つまたはそれを超えるＣＨ３変異を含む。いくつかの態様では、ヘテロ二量体は、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含む第１のＦｃドメインと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗを含む第２のＦｃドメインとを含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
本開示の他の態様は、上記ヘテロ二量体のいずれかと、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物に関する。上記ヘテロ二量体をコードする核酸分子、組換え発現ベクター、および組換え発現ベクターにより形質転換された宿主細胞、ならびに上記ヘテロ二量体を作製する方法も開示される。
本明細書に開示されるタンデム最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を作製する方法であって、前記最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること；および前記最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が発現される条件下で前記宿主細胞を維持することを含む方法も本明細書に開示される。
有効量の本明細書に開示される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を、異常免疫応答に関連する状態の処置または予防を必要とする患者に投与することによって異常免疫応答に関連する状態を処置または予防するための方法も本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、状態は、自己免疫疾患である。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験型ブドウ膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、ＩｇＧ４関連病、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ－ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状ＬＥ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および結合組織病からなる群より選択される。いくつかの実施形態では、自己免疫疾患は、ＳＬＥまたはシェーグレン症候群である。
ＳＬＥまたはシェーグレン症候群を処置する方法であって、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する免疫複合体を分解するために有効な量の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質含有組成物を被験体に投与することを含む方法も本明細書に開示される。いくつかの態様では、組成物は、薬学的に許容され得る担体と、本明細書に記載される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質とを含む。他の態様では、組成物は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む。
別の態様では、本発明は、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥの処置において使用するための最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に関する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号４および５に記載されているアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥを処置するための医薬を製造するための最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号５および６に記載されているアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥを処置するための医薬を製造するための最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号７および８に記載されているアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥを処置するための医薬を製造するための最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１３および１４に記載されているアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本発明は、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥを処置するための医薬を製造するための最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の使用に関する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１５および１６に記載されているアミノ酸配列を含む。
本発明のこれらのおよび他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の図面に関してより良く理解されるであろう。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメイン、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインを含むヘテロ二量体であって、前記第１のヌクレアーゼドメインがＤＮａｓｅ１であり、前記第２のヌクレアーゼドメインがＲＮａｓｅ１であり、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第２のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている、ヘテロ二量体。
（項目２）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第２のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目３）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第２のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目４）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第２のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目５）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第２のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目６）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第２のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目７）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第２のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目８）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第２のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目９）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第２のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目１０）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第２のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されている、項目１に記載のヘテロ二量体。
（項目１１）
前記ＲＮａｓｅが、野生型ヒトＲＮａｓｅ１または変異体ＲＮａｓｅ、例えばアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ＲＮａｓｅ１、例えばヒトＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓである、項目１～１０のいずれか一項に記載のヘテロ二量体。
（項目１２）
前記ＲＮａｓｅが野生型ヒトＲＮａｓｅ１である、項目１１に記載のヘテロ二量体。
（項目１３）
前記ＤＮａｓｅが、野生型ヒトＤＮａｓｅ１または変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆまたはアグリコシル化、低グリコシル化もしくは脱グリコシル化変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆである、項目１～１２のいずれか一項に記載のヘテロ二量体。
（項目１４）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目１５）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、セリンによる３つのヒンジ領域システイン残基のうちの１つまたはそれよりも多くの置換を含む、項目１４に記載のヘテロ二量体。
（項目１６）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ＳＣＣ、ＳＳＳ（残基２２０、２２６および２２９）、Ｇ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａからなる群より選択される変異を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目１５に記載のヘテロ二量体。
（項目１７）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ＳＣＣ変異（残基２２０、２２６および２２９）を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目１６に記載のヘテロ二量体。
（項目１８）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１変異を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目１９）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ヘテロ二量体を優先的に形成するための１つまたはそれを超えるＣＨ３変異を含む、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目２０）
前記第１のＦｃドメインが、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃドメインが、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗを含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目１９に記載のヘテロ二量体。
（項目２１）
前記リンカードメインが、ポリペプチドリンカー、例えばｇｌｙ－ｓｅｒリンカーまたはＮＬＧリンカー（ｖｄｇａｓｓｐｖｎｖｓｓｐｓｖｑｄｉ）である、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目２２）
（ｉ）配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号７に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号８に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉｉ）配列番号９に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号９に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１０に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｖ）配列番号１１に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１１に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１２に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｖ）配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択される第１のおよび第２のポリペプチド配列を含む、ヘテロ二量体。
（項目２３）
第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよび第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインを含むヘテロ二量体であって、前記第１のヌクレアーゼドメインがＤＮａｓｅ１であり、前記第２のヌクレアーゼドメインがＲＮａｓｅ１であり、
（ｉ）前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されており、または
（ｉ）前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている、ヘテロ二量体。
（項目２４）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目２３に記載のヘテロ二量体。
（項目２５）
前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってリンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目２３に記載のヘテロ二量体。
（項目２６）
前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによらずに前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目２３に記載のヘテロ二量体。
（項目２７）
前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｎ末端に作動可能に連結されており、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによって前記第１のＦｃドメインの前記Ｃ末端に作動可能に連結されている、項目２３に記載のヘテロ二量体。
（項目２８）
前記ＲＮａｓｅが、野生型ヒトＲＮａｓｅ１または変異体ＲＮａｓｅ、例えばアグリコシル化、低グリコシル化または脱グリコシル化ＲＮａｓｅ１、例えばヒトＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓである、項目２３～２７のいずれか一項に記載のヘテロ二量体。
（項目２９）
前記ＲＮａｓｅが野生型ヒトＲＮａｓｅ１である、項目２８に記載のヘテロ二量体。
（項目３０）
前記ＤＮａｓｅが、野生型ヒトＤＮａｓｅ１または変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆまたはアグリコシル化、低グリコシル化もしくは脱グリコシル化変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆである、項目２３～２９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体。
（項目３１）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目３２）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、セリンによる３つのヒンジ領域システイン残基のうちの１つまたはそれよりも多くの置換を含む、項目３１に記載のヘテロ二量体。
（項目３３）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ＳＣＣ、ＳＳＳ（残基２２０、２２６および２２９）、Ｇ２３６Ｒ、Ｌ３２８Ｒ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａからなる群より選択される変異を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目３２に記載のヘテロ二量体。
（項目３４）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ＳＣＣ変異（残基２２０、２２６および２２９）を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目３３に記載のヘテロ二量体。
（項目３５）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１変異を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目３６）
前記第１のおよび第２のＦｃドメインが、ヘテロ二量体を優先的に形成するための１つまたはそれを超えるＣＨ３変異を含む、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目３７）
前記第１のＦｃドメインが、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、前記第２のＦｃドメインが、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗを含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、項目３６に記載のヘテロ二量体。
（項目３８）
前記リンカードメインが、ポリペプチドリンカー、例えばｇｌｙ－ｓｅｒリンカーまたはＮＬＧリンカー（ｖｄｇａｓｓｐｖｎｖｓｓｐｓｖｑｄｉ）である、上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体。
（項目３９）
（ｉ）配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号５に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号６に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、または
（ｉｉ）配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチド、もしくは配列番号１３に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド；および配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチド、もしくは配列番号１４に記載されているアミノ酸配列と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド
からなる群より選択される第１のおよび第２のポリペプチド配列を含む、ヘテロ二量体。
（項目４０）
上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
（項目４１）
上記項目のいずれかに記載のヘテロ二量体をコードする、核酸分子。
（項目４２）
項目４１に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
（項目４３）
項目４２に記載の組換え発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
（項目４４）
項目１～３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を作製する方法であって、前記ヘテロ二量体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること；および前記ヘテロ二量体が発現される条件下で前記宿主細胞を維持することを含む、方法。
（項目４５）
異常免疫応答に関連する状態を処置または予防するための方法であって、有効量の項目１～３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を被験体に投与することを含む、方法。
（項目４６）
前記状態が自己免疫疾患である、項目４５に記載の方法。
（項目４７）
前記自己免疫疾患が、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験型ブドウ膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ－ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状ＬＥ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および結合組織病からなる群より選択される、項目４６に記載の方法。
（項目４８）
前記自己免疫疾患がＳＬＥである、項目４７に記載の方法。
（項目４９）
前記自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
ＳＬＥを処置する方法であって、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する免疫複合体を分解するために有効な量のヘテロ二量体を被験体に投与することを含み、前記組成物が、薬学的に許容され得る担体と、項目１～３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体とを含む、方法。
（項目５１）
シェーグレン症候群を処置する方法であって、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する免疫複合体を分解するために有効な量のヘテロ二量体を被験体に投与することを含み、前記組成物が、薬学的に許容され得る担体と、項目１～３９のいずれか一項に記載のヘテロ二量体とを含む、方法。
図１は、例示的な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の描写である。
図２は、ＯＤ２６０によって測定したＲＮａｓｅ活性を示すグラフである。
図３は、ＯＤ６２０（左）およびＩＣ５０（右）によって測定したＤＮａｓｅ活性を示す。
詳細な説明
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、自己の核タンパク質に対する高力価自己抗体の存在を特徴とする多系統自己免疫疾患である。ＳＬＥにおける死細胞および死滅中の細胞のクリアランスまたはプロセシングの不全は、主にリボ核タンパク質およびデオキシリボ核タンパク質（核タンパク質と略記される）の蓄積を介して、疾患をもたらすという有力な証拠がある。核タンパク質は、３つの機序を介して損傷を引き起こす：ｉ）先天免疫系を活性化して、炎症性サイトカインを産生する；ｉｉ）抗原として機能して、循環免疫複合体を生成する；および、ｉｉｉ）抗原として機能して、腎臓などの局所部位でインサイチュー複合体形成を生じさせる。
本発明は、有効量の長時間作用型ヌクレアーゼ活性を投与して、ＲＮＡおよびＤＮＡを含有する細胞外免疫複合体を分解することによって、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患、例えばＳＬＥおよびシェーグレン症候群を処置するための方法を提供する。このような処置は、ＳＬＥにおいて顕著なサイトカインであって、疾患活動性および腎炎と強く相関するＩ型インターフェロン（ＩＦＮ）の産生を阻害し得る。
本発明は、部分的には、このような長時間作用型ヌクレアーゼの提供に関する。特に、本発明は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質、例えば、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよびＦｃ領域を含むタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であって、前記第１のヌクレアーゼドメインがＤＮａｓｅ１であり、前記第２のヌクレアーゼドメインがＲＮａｓｅ１であり、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずに前記ＲＮａｓｅ１にＮ末端からＣ末端にタンデムに作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、Ｆｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されているタンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に関する。
他の実施形態では、本発明は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質、例えば、第１のヌクレアーゼドメイン、第２のヌクレアーゼドメインおよびＦｃ領域を含むヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であって、前記第１のヌクレアーゼドメインがＤＮａｓｅ１であり、前記第２のヌクレアーゼドメインがＲＮａｓｅ１であり、前記ＤＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、前記ＲＮａｓｅ１が、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、それにより、ヘテロ二量体を形成するヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に関する。
いくつかの態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて増強した薬物動態活性を示す。このような最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、第１のまたは第２のヌクレアーゼドメインのいずれか単独と比べて変化した、例えば向上した血清半減期を示す。
いくつかの態様では、本発明は、ヒトＤＮａｓｅ１、ヒトＲＮａｓｅ１および変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃを含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であって、前記ヒトＤＮａｓｅ１が、リンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介してヒトＲＮａｓｅ１にＮ末端からＣ末端に作動可能に連結されており、前記ヒトＲＮａｓｅ１が、リンカーを介して前記変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに作動可能に連結されており、前記変異体ヒトＩｇＧ１が、変異体ヒンジ領域（例えば、セリンなどによるシステイン置換、例えばＳＣＣ）と、Ｆｃγ受容体結合を減少させるための１つまたはそれを超えるＣＨ２変異（例えば、Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１ＳまたはＰ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓの両方、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）とを有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を提供する。一実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ペプチドリンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介してヒトＲＮａｓｅ１に作動可能に連結されたヒトＤＮａｓｅ１を含み（Ｎ末端－ＤＮａｓｅ１－リンカー－ＲＮａｓｅ１－Ｃ末端）、ヒトＲＮａｓｅ１は、ペプチドリンカー（例えば、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー）を介して、変異体ヒンジ領域ＳＣＣヒンジと、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓ変異とを有する変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインに作動可能に連結されている。
したがって、一実施形態では、アポトーシス細胞および細胞残屑のクリアランスまたはプロセシングの不全を特徴とする疾患を有する被験体は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が、非コンジュゲートヌクレアーゼドメインと比べて増加したバイオアベイラビリティおよび／または血清半減期を有するように、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１の両方を含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を投与することによって処置される。
定義
特許請求の範囲および本明細書で使用される用語は、他に指定がない限り、以下に記載されるように定義される。
「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにその後に改変されたアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ－カルボキシグルタメートおよびＯ－ホスホセリンなどである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基およびＲ基に結合したα炭素を有する化合物、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどを指す。このような類似体は、改変Ｒ基（例えば、ノルロイシン）または改変ペプチド骨格を有するが、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸模倣体は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様に機能する化合物を指す。
アミノ酸は、本明細書では、一般的に公知のそれらの三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ－ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎによって推奨される一文字記号によって言及され得る。同様に、ヌクレオチドもまた、一般的に認められているそれらの一文字コードによって言及され得る。
「アミノ酸置換」は、所定のアミノ酸配列（出発ポリペプチドのアミノ酸配列）中の少なくとも１つの既存のアミノ酸残基が、第２の異なる「置き換え」アミノ酸残基で置き換えられることを指す。「アミノ酸挿入」は、所定のアミノ酸配列への少なくとも１つのさらなるアミノ酸の組入れを指す。挿入は、通常、１個または２個のアミノ酸残基の挿入からなるが、より大きな「ペプチド挿入」、例えば、約３～約５個、またはさらには最大約１０個、１５個もしくは２０個のアミノ酸残基の挿入が行われ得る。挿入される残基は天然に存在するものであり得るか、または上記に開示される非天然に存在するものであり得る。「アミノ酸欠失」は、所定のアミノ酸配列からの少なくとも１つのアミノ酸残基の除去を指す。
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では、アミノ酸残基のポリマーを指すために互換的に使用される。これらの用語は、１つまたはそれを超えるアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学模倣体であるアミノ酸ポリマーに、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。
「核酸」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、および一本鎖形態または二本鎖形態のいずれかのそれらのポリマーを指す。特に具体的な限定がない限り、この用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの公知の類似体を含有する核酸を包含する。特に指示がない限り、特定の核酸配列はまた、その保存的に改変されたバリアント（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列、ならびに明示的に示されている配列を非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つまたはそれを超える選択（またはすべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ １９９１；１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａら、ＪＢＣ １９８５；２６０：２６０５－８）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Μοｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ １９９４；８：９１－８）。アルギニンおよびロイシンについては、２番目の塩基における改変もまた、保存的であり得る。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡおよび遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと互換的に使用される。
本発明のポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチド（これらは、非改変ＲＮＡもしくはＤＮＡ、または改変ＲＮＡもしくはＤＮＡであり得る）から構成され得る。例えば、ポリヌクレオチドは、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、ならびに一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であるＲＮＡ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子（これは、一本鎖、より典型的には二本鎖または一本鎖領域と二本鎖領域との混合物であり得る）から構成され得る。加えて、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域から構成され得る。ポリヌクレオチドはまた、安定性のために、または他の理由のために改変された１つまたはそれを超える改変塩基またはＤＮＡまたはＲＮＡ骨格を含み得る。「改変」塩基としては、例えば、トリチル化塩基および特殊な塩基、例えばイノシンが挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡに対して、様々な改変が行われ得る；したがって、「ポリヌクレオチド」は、化学的、酵素的または代謝的に改変された形態を包含する。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」または「作動可能にカップリングされた」という用語は、記載されている成分が、それらが意図されるように機能することを可能にする関係にある並置を指す。
本明細書で使用される場合、「グリコシル化」または「グリコシル化された」という用語は、糖部分を分子（例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）に付加するプロセスまたは結果を指す。
本明細書で使用される場合、「変化したグリコシル化」という用語は、アグリコシル化、脱グリコシル化または低グリコシル化された分子を指す。
本明細書で使用される場合、「グリコシル化部位」という用語は、炭水化物部分を潜在的に受容し得る部位、および炭水化物部分が実際に付着されたタンパク質であって、オリゴ糖および／または炭水化物のアクセプターとして作用し得る任意のアミノ酸配列を含むタンパク質内の部位の両方を指す。
本明細書で使用される場合、「アグリコシル化」または「アグリコシル化された」という用語は、（例えば、グリコシル化のアクセプターとして機能するアミノ酸残基を欠くように最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を操作することによる）非グリコシル化形態の分子（例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）の生産を指す。あるいは、例えば、大腸菌において最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を発現させて、アグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を生産し得る。
本明細書で使用される場合、「脱グリコシル化」または「脱グリコシル化された」という用語は、分子上の糖部分の酵素的除去のプロセスまたは結果を指す。
本明細書で使用される場合、「低グリコシル化」または「低グリコシル化された」という用語は、哺乳動物細胞において産生される場合に通常存在するであろう１つまたはそれを超える炭水化物構造が省略、除去、改変または遮蔽されている分子を指す。
本明細書で使用される場合、「Ｆｃ領域」および「Ｆｃドメイン」という用語は、その２本の重鎖の各Ｆｃドメイン（またはＦｃ部分）によって形成されるネイティブな免疫グロブリンの部分であって、抗原に結合する可変領域を有しない部分である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、パパイン切断部位の須玖上流のヒンジ領域において始まり、抗体のＣ末端で終わる。したがって、完全Ｆｃドメインは、少なくともヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含む。特定の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジ（例えば、上部、中央および／または下部ヒンジ領域）ドメイン、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン、ＣＨ４ドメインまたはそれらのバリアント、部分もしくは断片の少なくとも１つを含む。他の実施形態では、Ｆｃドメインは、完全Ｆｃドメイン（すなわち、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含む。一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその部分）に融合されたヒンジドメイン（またはその部分）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメイン（またはその部分）に融合されたＣＨ２ドメイン（またはその部分）を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ３ドメインまたはその部分からなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその部分）およびＣＨ３ドメイン（またはその部分）からなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ＣＨ２ドメイン（またはその部分）およびＣＨ３ドメインからなる。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン（またはその部分）およびＣＨ２ドメイン（またはその部分）からなる。一実施形態では、Ｆｃドメインは、少なくともＣＨ２ドメインの部分（例えば、ＣＨ２ドメインの全部または一部）を欠く。一実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、ＦｃＲｎ結合に必要であることが当技術分野で公知のＦｃ分子の部分を含む。一実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、プロテインＡ結合に必要であることが当技術分野で公知のＦｃ分子の部分を含む。一実施形態では、本発明のＦｃドメインは、少なくとも、プロテインＧ結合に必要であることが当技術分野で公知のＦｃ分子の部分を含む。本明細書におけるＦｃドメインは、一般に、免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの全部または一部を含むポリペプチドを指す。これとしては、限定されないが、ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２および／またはＣＨ３ドメインの全体を含むポリペプチド、ならびに例えばヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのみを含むこのようなペプチドの断片が挙げられる。Ｆｃドメインは、限定されないが、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体を含む、任意の種および／または任意のサブタイプの免疫グロブリンに由来し得る。Ｆｃドメインは、ネイティブなＦｃ分子およびＦｃバリアント分子を包含する。ＦｃバリアントおよびネイティブなＦｃのように、Ｆｃドメインという用語は、全抗体から消化されたかまたは他の手段によって生産されたかにかかわらず、単量体形態または多量体形態の分子を含む。
本明細書に記載されているように、当業者であれば、天然に存在する免疫グロブリン分子のネイティブなＦｃドメインとはアミノ酸配列が異なるように、任意のＦｃドメインを改変し得ることを理解するであろう。
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＦｃドメインは、異なる免疫グロブリン分子に由来し得る。例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＦｃドメインは、ＩｇＧ１分子に由来するＣＨ２および／またはＣＨ３ドメイン、ならびにＩｇＧ３分子に由来するヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１分子に部分的に由来し、ＩｇＧ３分子に部分的に由来するキメラヒンジ領域を含み得る。別の例では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１分子に部分的に由来し、ＩｇＧ４分子に部分的に由来するキメラヒンジを含み得る。野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、配列番号４５に記載されているアミノ酸配列を有する。
本明細書で使用される場合、「血清半減期」という用語は、インビボ血清最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質濃度が５０％低下するために必要な時間を指す。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期が短いほど、治療効果を発揮するために必要な時間は短くなるであろう。
本明細書で使用される場合、「最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質」という用語は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に作動可能に連結された少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸を指す。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質であり、例えば、１つまたはそれを超えるＤＮａｓｅ１ドメインおよび１つまたはそれを超えるＲＮａｓｅ１ドメインは、１つまたはそれを超えるＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかにタンデムに連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質である。
本明細書で使用される場合、「タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質」という用語は、（Ｎ末端からＣ末端に）タンデムに連結された少なくとも２つのヌクレアーゼドメインと、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片とを含むポリペプチド、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸を指す。例えば、一実施形態では、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つのＦｃドメインに作動可能に連結された少なくとも１つのＤＮａｓｅ１ドメインおよび少なくとも１つのＲＮａｓｅ１ドメインを含むポリペプチドである。別の例として、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端に、ＤＮａｓｅ１ドメイン、第１のリンカー、ＲＮａｓｅ１ドメイン、第２のリンカーおよびＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質」という用語は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメインを共に含む第１のおよび第２のポリペプチドと、２つのＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片とを含むヘテロ二量体、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸を指す。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つのＦｃドメインに作動可能に連結された少なくとも１つのＤＮａｓｅ１ドメインおよび少なくとも１つのＲＮａｓｅ１ドメインを含むヘテロ二量体であり、ＤＮａｓｅ１ドメインおよびＲＮａｓｅ１ドメインが、同じ（第１のＦｃドメイン）または異なるＦｃドメイン（第２のＦｃドメイン）のいずれかの逆末端（Ｎ末端またはＣ末端）に位置するように、ＤＮａｓｅ１ドメインは、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されており、ＲＮａｓｅ１ドメインは、リンカーによってまたはリンカーによらずに同じ（第１のＦｃドメイン）または異なるＦｃドメイン（第２のＦｃドメイン）のＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１ドメインが、ヘテロ二量体の同じ末端（Ｎ末端またはＣ末端）にタンデムに位置するように、ヘテロ二量体は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されたＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに第２のＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端に作動可能に連結されたＲＮａｓｅ１ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ヘテロ二量体は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されたＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されたＲＮａｓｅ１ドメインとを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されており、ＤＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずに第１のＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。
本明細書で使用される場合、「バリアント」という用語は、野生型ヌクレアーゼまたはＦｃドメインに由来するポリペプチドであって、１つまたはそれを超える位置における１つまたはそれを超える変化、すなわち置換、挿入および／または欠失によって野生型と異なるポリペプチドを指す。置換は、ある位置を占めるアミノ酸の異なるアミノ酸による置き換えを意味する。欠失は、ある位置を占めるアミノ酸の除去を意味する。挿入は、ある位置を占めるアミノ酸に直接隣接する１個またはそれを超える、例えば１～３個のアミノ酸の付加を意味する。バリアントポリペプチドは必ず、野生型ポリペプチドと１００％未満の配列同一性または類似性を有する。いくつかの実施形態では、バリアントポリペプチドは、野生型ポリペプチドのアミノ酸配列と約７５％～１００％未満のアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有するか、または例えばバリアントポリペプチドの全長に対して約８０％～１００％未満または約８５％～１００％未満または約９０％～１００％未満（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％ｏ、９９％）または約９５％～１００％未満のアミノ酸配列同一性もしくは類似性を有するであろう。
特定の態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、１つまたはそれを超える「リンカードメイン」、例えばポリペプチドリンカーを用いる。本明細書で使用される場合、「リンカードメイン」という用語は、直鎖状ポリペプチド配列における２つまたはそれを超えるペプチドドメインを接続する１つまたはそれを超えるアミノ酸を指す。本明細書で使用される場合、「ポリペプチドリンカー」という用語は、タンパク質の直鎖状アミノ酸配列における２つまたはそれを超えるポリペプチドドメインを接続するペプチドまたはポリペプチド配列（例えば、合成ペプチドまたはポリペプチド配列）を指す。例えば、ポリペプチドリンカーは、第１のおよび第２のヌクレアーゼドメインを互いに、または第１のもしくは第２のヌクレアーゼドメインをＦｃドメインに作動可能に連結するために使用され得る。いくつかの実施形態では、このようなポリペプチドリンカーは、フレキシビリティをポリペプチド分子に提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＤＮａｓｅ１をＲＮａｓｅ１に、および／またはＲＮａｓｅ１をＦｃドメインに接続する（例えば、遺伝的に融合する）ために使用される。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、１つを超えるリンカードメインまたはペプチドリンカーを含み得る。様々なペプチドリンカーが当技術分野で公知である。
本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒポリペプチドリンカー」という用語は、グリシン残基およびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５８）を含む。いくつかの実施形態では、ｎは、１またはそれを超えるもの、例えば２もしくはそれを超えるもの、３もしくはそれを超えるもの、４もしくはそれを超えるもの、５もしくはそれを超えるもの、６もしくはそれを超えるもの、７もしくはそれを超えるもの、８もしくはそれを超えるもの、９もしくはそれを超えるものまたは１０もしくはそれを超えるもの（例えば、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号５９））である。別の例示的なｇｌｙ／ｓｅｒポリペプチドリンカーは、アミノ酸配列Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６０）を含む。いくつかの実施形態では、ｎは、１またはそれを超えるもの、例えば２もしくはそれを超えるもの、３もしくはそれを超えるもの、４もしくはそれを超えるもの、５もしくはそれを超えるもの、６もしくはそれを超えるもの、７もしくはそれを超えるもの、８もしくはそれを超えるもの、９もしくはそれを超えるものまたは１０もしくはそれを超えるもの（例えば、Ｓｅｒ（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）１０（配列番号６１））である。
本明細書で使用される場合、「カップリングされた」、「連結された」、「融合された」または「融合」という用語は互換的に使用される。これらの用語は、化学的コンジュゲーションまたは組換え手段を含むあらゆる手段によって、２つまたはそれを超えるエレメントまたは成分またはドメインを互いに接続することを指す。化学的コンジュゲーションの方法（例えば、ヘテロ二官能性架橋剤を使用する）は、当技術分野で公知である。
指定のポリペプチドまたはタンパク質「に由来する」ポリペプチド配列またはアミノ酸配列は、ポリペプチドの起源を指す。好ましくは、特定の配列に由来するポリペプチド配列またはアミノ酸配列は、その配列もしくはその部分（この部分は、少なくとも１０～２０アミノ酸、好ましくは少なくとも２０～３０アミノ酸、より好ましくは少なくとも３０～５０アミノ酸からなる）と本質的に同一のアミノ酸配列を有するか、または配列中にその起源を有すると当業者が他の方法で同定可能なアミノ酸配列を有する。別のペプチドに由来するポリペプチドは、出発ポリペプチドと比べて１つまたはそれを超える変異、例えば、別のアミノ酸残基で置換されているか、または１つもしくはそれを超えるアミノ酸残基挿入もしくは欠失を有する１つまたはそれを超えるアミノ酸残基を有し得る。
一実施形態では、出発ポリペプチド配列とそれに由来する配列との間において、１個のアミノ酸差異がある。この配列に対する同一性または類似性は、本明細書では、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性のパーセントを達成した後、出発アミノ酸残基と同一の（すなわち、同じ残基）候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。
一実施形態では、本開示のポリペプチドは、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されているアミノ酸配列およびその機能的に活性なバリアントからなるか、それから本質的になるか、またはそれを含む。実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されているアミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されている連続アミノ酸配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の連続アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されているアミノ酸配列の少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個または少なくとも５００個（または、これらの数の範囲内の任意の整数）の連続アミノ酸を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ヌクレオチド配列によってコードされている。本開示のヌクレオチド配列は、クローニング、遺伝子治療、タンパク質の発現および精製、変異の導入、それを必要とする宿主のＤＮＡワクチン接種、例えば受動免疫のための抗体生成、ＰＣＲ、プライマーおよびプローブの生成、ｓｉＲＮＡの設計および生成（例えば、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｓｉＤｅｓｉｇｎウェブサイトを参照のこと）などを含む多くの用途に有用であり得る。いくつかの実施形態では、本開示のヌクレオチド配列は、配列表または配列リストから選択される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列リストまたは配列表のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されているアミノ酸配列をコードする連続ヌクレオチド配列と少なくとも８０％、例えば少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の連続ヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、本明細書に開示される配列リストまたは配列表に記載されているアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の少なくとも１０個、例えば少なくとも１５個、例えば少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、少なくとも４０個、少なくとも４５個、少なくとも５０個、少なくとも５５個、少なくとも６０個、少なくとも６５個、少なくとも７０個、少なくとも７５個、少なくとも８０個、少なくとも８５個、少なくとも９０個、少なくとも９５個、少なくとも１００個、少なくとも２００個、少なくとも３００個、少なくとも４００個または少なくとも５００個（または、これらの数の範囲内の任意の整数）の連続ヌクレオチドを有するヌクレオチド配列を含む。
また、当業者であれば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ネイティブな配列の望ましい活性を保持しながら、それらの成分（例えば、ヌクレアーゼドメイン、リンカードメインおよびＦｃドメイン）が由来する天然に存在する配列またはネイティブな配列とは配列が異なるように改変され得ることを理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基において保存的置換または変化をもたらすヌクレオチドまたはアミノ酸の置換が行われ得る。非天然バリアントをコードする単離された核酸分子は、コードされるタンパク質に１つまたはそれを超えるアミノ酸置換、付加または欠失が導入されるように、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレオチド配列に１つまたはそれを超えるヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作られ得る。変異は、部位特異的変異誘発、およびＰＣＲを介した変異誘発などの標準的な技術によって導入され得る。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、１つまたはそれを超えるアミノ酸残基において、例えば必須または非必須アミノ酸残基において、保存的アミノ酸置換を含み得る。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、類似側鎖を有するアミノ酸残基によって置換されるものである。類似側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分枝側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。したがって、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質中の非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリー由来の別のアミノ酸残基によって置き換えられる。別の実施形態では、一連のアミノ酸の連続鎖は、側鎖ファミリーのメンバーの順序および／または組成が異なる構造的に類似した連続鎖によって置き換えられ得る。あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発法などにより、コード配列の全部または一部にわたってランダムに変異を導入し、得られた変異体を最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に組み入れて、それらが所望の標的に結合する能力活性に関してスクリーニングし得る。
「改善」という用語は、疾患状態、例えば自己免疫性疾患状態（例えば、ＳＬＥ、シェーグレン症候群）の処置（その予防、重症度もしくは進行の軽減、寛解または治癒を含む）における任意の治療的に有益な結果を指す。
「インサイチュー」という用語は、生物とは別個に成長する（例えば、組織培養下で成長する）生細胞において起こる過程を指す。
「インビボ」という用語は、生物において起こる過程を指す。
本明細書で使用される場合、「哺乳動物」または「被験体」または「患者」という用語は、ヒトおよび非ヒトの両方を含み、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ネズミ科動物、ウシ科動物、ウマ科動物およびブタ科動物を含む。
２つまたはそれを超える核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、「同一性」のパーセントという用語は、最大一致について比較およびアラインメントする際、下記配列比較アルゴリズムの１つ（例えば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ、または当業者に利用可能な他のアルゴリズム）を使用して、または目視検査によって測定した場合に同じであるヌクレオチドまたはアミノ酸残基の規定パーセンテージを有する２つまたはそれを超える配列または部分配列を指す。用途に応じて、「同一性」パーセントは、比較する配列のある領域、例えば機能的ドメインにわたって存在し得るか、または代替的に、比較する２つの配列の全長にわたって存在し得る。
配列の比較のために、典型的には、ある配列は、試験配列と比較するための参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じて部分配列の座標を指定して、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。次いで、配列比較アルゴリズムは、指定プログラムのパラメータに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性のパーセントを計算する。
比較のための最適な配列アラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ＆Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ Ａｐｐｌ Ｍａｔｈ １９８１；２：４８２の局所的相同性アルゴリズムにより、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ＆Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９７０；４８：４４３の相同性アラインメントアルゴリズムにより、Ｐｅａｒｓｏｎ＆Ｌｉｐｍａｎ，ＰＮＡＳ １９８８；８５：２４４４の類似性検索法により、これらのアルゴリズムのコンピュータ・インプリメンテーション（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査により行われ得る（一般に、Ａｕｓｕｂｅｌら、下記を参照のこと）。
配列同一性および配列類似性のパーセントを決定するために適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９９０；２１５：４０３－１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを介して公開されている。
「十分量」という用語は、所望の効果を生じさせるために十分な量を意味する。
「治療有効量」という用語は、疾患の症候を改善するために有効な量である。予防は治療とみなされ得るので、治療有効量は、「予防有効量」であり得る。
「約」という用語は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変動するであろう。それが使用される文脈を考慮して当業者に明らかではない用語が使用される場合、「約」は、特定の値の±１０％までを意味するであろう。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意すべきである。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、それが融合されたヌクレアーゼ分子の血清半減期を、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に融合されていないヌクレアーゼ分子と比較して変化させるＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に作動可能にカップリングされたヌクレアーゼドメインを含む。
いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、リンカードメインを介してＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に作動可能にカップリングされている。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、リンカーペプチドである。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、リンカーヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リーダー分子、例えばリーダーペプチドを含む。いくつかの実施形態では、リーダー分子は、ヌクレアーゼドメインのＮ末端に位置するリーダーペプチドである。いくつかの実施形態では、本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、分子のＮ末端にリーダーペプチドを含み、リーダーペプチドは、その後、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質から切断される。組換えタンパク質に融合されたリーダーペプチドをコードする核酸配列を生成するための方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質はいずれも、それらのＮ末端に融合されたリーダーを伴ってまたは伴わずに発現され得る。融合リーダーペプチドの切断後の本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のタンパク質配列は、当業者によって予測および／または推定され得る。
いくつかの実施形態では、リーダーは、ＶＫ３リーダーペプチド（ＶＫ３ＬＰ）であり、リーダーペプチドは、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＮ末端に融合されている。このようなリーダー配列は、哺乳動物細胞における最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の合成および分泌のレベルを向上させ得る。いくつかの実施形態では、リーダーが切断されて、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が生じる。いくつかの実施形態では、本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、そのＮ末端に融合されたリーダーペプチドを伴わずに発現され、得られた最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｎ末端メチオニンを有する。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、互いにタンデムに作動可能にカップリングされた２つのヌクレアーゼドメインであって、同じまたは異なるＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端またはＣ末端にさらに作動可能にカップリングされた２つのヌクレアーゼドメインを含む。
図１は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の例示的な構成を示し、配列表は、様々な構成の例示的な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の配列を提供する。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、細胞外免疫複合体に特異的に結合する同じまたは異なるＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に融合されたマルチヌクレアーゼタンパク質（例えば、異なる基質特異性を有するＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅの両方または２つのＲＮＡもしくはＤＮＡヌクレアーゼ）である。
一実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端に作動可能にカップリングされている（例えば、（例えば、直接的にまたはポリペプチドリンカーを介して）化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されている）。別の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＣ末端に作動可能にカップリングされている（例えば、（例えば、直接的にまたはポリペプチドリンカーを介して）化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されている）。他の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のアミノ酸側鎖を介して作動可能にカップリングされている（例えば、（例えば、直接的にまたはポリペプチドリンカーを介して）化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されている）。
特定の実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、２つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインと、少なくとも１つのＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片とを含む。例えば、ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼドメインとＦｃドメイン、そのバリアントまたは断片との間の任意選択のリンカーによって、同じまたは異なるＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端およびＣ末端の両方に作動可能にカップリングされ得る。いくつかの態様では、ヌクレアーゼドメインは同一のものである（例えば、ＲＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ、またはＤＮａｓｅ１およびＤＮａｓｅ１）。他の実施形態では、ヌクレアーゼドメインは異なるものである（例えば、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ）。
いくつかの実施形態では、２つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインは、（例えば、ポリペプチドリンカーを介して）互いに直列に作動可能にカップリングされており、タンデムに整列したヌクレアーゼドメインは、同じまたは異なるＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端またはＣ末端のいずれかに作動可能にカップリングされている（例えば、（例えば、直接的にまたはポリペプチドリンカーを介して）化学的にコンジュゲートされているか、または遺伝的に融合されている）。他の実施形態では、タンデムに整列したヌクレアーゼドメインは、同じＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端およびＣ末端の両方に作動可能にカップリングされている。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、リンカーによってまたはリンカーによらずに同じまたは異なるＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端にタンデムに（例えば、Ｎ－ＤＮａｓｅ－ＲＮａｓｅ－ＣまたはＮ－ＲＮａｓｅ－ＤＮａｓｅ－Ｃ）作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、タンデム二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ホモ二量体またはヘテロ二量体を形成する。
他の実施形態では、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインは、２つのＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片の間に挿入され得る。例えば、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインは、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のポリペプチドリンカーの全部または一部を形成し得る。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも２つのヌクレアーゼドメイン（例えば、ＲＮａｓｅおよびＤＮａｓｅ）、少なくとも１つのリンカードメイン、および少なくとも１つのＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、上記のようにＦｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含み、それにより、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期およびバイオアベイラビリティを増加させる。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、１つまたはそれを超えるポリペプチド、例えば配列番号１～１７のいずれかに示されているアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
当業者であれば、ヌクレアーゼドメイン間に、および／またはヌクレアーゼドメインとＦｃドメインとの間に任意選択のリンカーを含めることによって、ヌクレアーゼドメインおよびＦｃドメインの他の構成が可能であると理解するであろう。また、試験される特定の構成においてヌクレアーゼドメインが活性である限り、ドメインの方向を変化させ得ると理解されよう。
特定の実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、生物学的効果を媒介する標的分子に特異的な少なくとも１つのヌクレアーゼドメインを有する。別の実施形態では、標的分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）に対する本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の結合は、例えば細胞、組織から、または循環からの標的分子の減少または排除をもたらす。
他の実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、互いにまたは他のポリペプチドと共にアセンブルして、２つまたはそれを超えるポリペプチドを有する結合タンパク質（「多量体」）を形成し得、多量体の少なくとも１つのポリペプチドは、本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質である。例示的な多量体形態としては、二量体、三量体、四量体および六量体の変化結合タンパク質などが挙げられる。一実施形態では、多量体のポリペプチドは同じものである（すなわち、ホモマー変化結合タンパク質、例えばホモ二量体、ホモ四量体）。別の実施形態では、多量体のポリペプチドは異なるものである（例えば、ヘテロマー）。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に融合されていない対応するヌクレアーゼ分子と比べて少なくとも約１．５倍、例えば少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍または１０００倍またはそれを超えて増加した血清半減期を有する。他の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に融合されていない対応するヌクレアーゼ分子と比べて少なくとも約１．５倍、例えば少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍または５００倍またはそれ未満に減少した血清半減期を有する。本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期を決定するために、当技術分野で認められているルーチンな方法が使用され得る。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質中のＲＮａｓｅの活性は、対照ＲＮａｓｅ分子の活性の約１０倍未満、例えば９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満または２倍未満よりも低いものではない。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質中のＲＮａｓｅの活性は、対照ＲＮａｓｅ分子の活性とほぼ同等である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質中のＤＮａｓｅの活性は、対照ＤＮａｓｅ分子の活性の約１０倍未満、例えば９倍未満、８倍未満、７倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満または２倍未満よりも低いものではない。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質中のＤＮａｓｅの活性は、対照ＤＮａｓｅ分子の活性とほぼ同等である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、例えば可溶性形態のまたは不溶性複合体として沈着したＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含有する細胞外免疫複合体に対して活性であり得る。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の活性は、インビトロおよび／またはインビボで検出可能である。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、細胞、悪性細胞または癌細胞に結合し、その生物学的活性を妨害する。
別の態様では、結合特異性を有する別の酵素または抗体、例えば、第１のドメインと同じまたは異なる特異性でＲＮＡまたはＤＮＡまたは第２のヌクレアーゼドメインにターゲティングされるｓｃＦｖに付着された多機能ＲＮａｓｅまたはＤＮａｓｅ分子が提供される。
いくつかの実施形態では、リンカードメインは、リンカーの長さを５アミノ酸進めて変化させる（ｇｌｙ４ｓｅｒ）３、４または５バリアントを含む。別の実施形態では、リンカードメインは、約１８アミノ酸長であり、インビボでプロテアーゼ切断に感受性であり得るＮ結合型グリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位は、リンカードメインにおける切断から最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を保護し得る。いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位は、リンカードメインによって分離された独立した機能的ドメインのフォールディングの分離を支援し得る。
いくつかの実施形態では、リンカードメインは、ＮＬＧリンカー（ＶＤＧＡＳＳＰＶＮＶＳＳＰＳＶＱＤＩ）（配列番号４１）である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅの実質的に全部または少なくとも酵素的に活性な断片を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、Ｉ型分泌ＤＮａｓｅ、好ましくはヒトＤＮａｓｅ、例えば成熟ヒト膵臓ＤＮａｓｅ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ２４８５５、配列番号２０）である。いくつかの実施形態では、減少したアクチン感受性を示す天然に存在するバリアント対立遺伝子Ａ１１４Ｆ（配列番号２１）は、ＤＮａｓｅ１最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に含まれる（Ｐａｎら、ＪＢＣ １９９８；２７３：１８３７４－８１；Ｚｈｅｎら、ＢＢＲＣ １９９７；２３１：４９９－５０４；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚら、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ １９９７；４２：５０７－１３を参照のこと）。他の実施形態では、野生型ＤＮａｓｅ１と比べて高いＤＮａｓｅ活性を示す天然に存在するバリアント対立遺伝子Ｇ１０５Ｒ（配列番号２２）は、ＤＮａｓｅ１最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に含まれる（Ｙａｓｕｄａら、Ｉｎｔ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２０１０；４２：１２１６－２５を参照のこと）。いくつかの実施形態では、ヒトＤＮａｓｅ１のより安定な誘導体を生成するために、この変異が最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に導入される。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、ヒト野生型ＤＮａｓｅ１であるか、またはすべての潜在的なＮ結合型グリコシル化部位、すなわち、配列番号２０に記載されているＤＮａｓｅ１ドメインの位置１８および１０６のアスパラギン残基（これは、ネイティブなリーダーを有する全長膵臓ＤＮａｓｅ１（配列番号２３）のそれぞれ位置４０および１２８のアスパラギン残基に対応する）を除去するように変異されたヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆ（すなわち、ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆ、配列番号２４）である。
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ機能性およびクロマチン切断を増加させるための１つまたはそれを超える塩基性（すなわち、正荷電）アミノ酸置換を含むヒトＤＮａｓｅ１である。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ基質上の負荷電リン酸との結合を増強するために、塩基性アミノ酸がヒトＤＮａｓｅ１のＤＮＡ結合面に導入される（米国特許第７４０７７８５号；米国特許第６３９１６０７号を参照のこと）。この過剰活性ＤＮａｓｅ１は、「クロマチンカッター」と称され得る。
いくつかの実施形態では、１個、２個、３個、４個、５個または６個の塩基性アミノ酸置換がＤＮａｓｅ１に導入される。例えば、ＤＮＡ結合を増強するために、以下の残基の１つまたはそれよりも多くが変異される：Ｇｌｎ９、Ｇｌｕ１３、Ｔｈｒ１４、Ｈｉｓ４４、Ａｓｎ７４、Ａｓｎ１１０、Ｔｈｒ２０５。いくつかの実施形態では、上記アミノ酸の１つまたはそれよりも多くは、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジンおよび／またはヒスチジンで置換される。例えば、変異体ヒトＤＮａｓｅは、以下の置換の１つまたはそれよりも多くを含み得る：Ｑ９Ｒ、Ｅ１３Ｒ、Ｔ１４Ｋ、Ｈ４４Ｋ、Ｎ７４Ｋ、Ｎ１１０Ｒ、Ｔ２０５Ｋ。いくつかの実施形態では、変異体ヒトＤＮａｓｅ１はまた、アクチン感受性を減少させるＡ１１４Ｆ置換を含む（米国特許第６３４８３４３号を参照のこと）。一実施形態では、変異体ヒトＤＮａｓｅ１は、以下の置換を含む：Ｅ１３Ｒ、Ｎ７４Ｋ、Ａ１１４ＦおよびＴ２０５Ｋ。
いくつかの実施形態では、変異体ヒトＤＮａｓｅ１は、潜在的なグリコシル化部位、例えば、配列番号２０に記載されているＤＮａｓｅ１ドメインの位置１８および１０６のアスパラギン残基（これは、ネイティブなリーダーを有する全長膵臓ＤＮａｓｅ１のそれぞれ位置４０および１２８のアスパラギン残基に対応する）を除去するための変異をさらに含む。一実施形態では、変異体ヒトＤＮａｓｅ１は、以下の置換を含む：Ｅ１３Ｒ／Ｎ７４Ｋ／Ａ１１４Ｆ／Ｔ２０５Ｋ／Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ。
いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ１様（ＤＮａｓｅＬ）酵素１～３（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ１３６０９；配列番号４６）である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、３プライム修復エキソヌクレアーゼ１（ＴＲＥＸ１；ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ９ＮＳＵ２；配列番号４７）である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅは、ＤＮａｓｅ２である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ２は、ＤＮＡｓｅ２α（すなわち、ＤＮａｓｅ２；ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリーＯ００１１５配列番号４８）またはＤＮａｓｅ２β（すなわち、ＤＮａｓｅ２様酸ＤＮａｓｅ；ＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢエントリーＱ８ＷＺ７９；配列番号４９）である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１Ｌ３、ＴＲＥＸ１、ＤＮａｓｅ２αまたはＤＮａｓｅ２βのＮ結合型グリコシル化部位は、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を除去するように変異されている。いくつかの実施形態では、２０または２５ａａのリンカードメインを含有するＤＮａｓｅ－リンカー－Ｆｃドメインが作製される。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＲＮａｓｅＡファミリーのＲＮａｓｅ１、好ましくはヒト膵臓ＲＮａｓｅ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＰ０７９９８；配列番号２７）を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＲＮａｓｅ１は、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位、すなわち、配列番号２７に記載されているＲＮａｓｅ１ドメインの位置３４、７６および８８のアスパラギン残基（これは、ネイティブなリーダーを有する全長膵臓ＲＮａｓｅ１（配列番号２９）のそれぞれ位置６２、１０４および１１６のアスパラギン残基に対応する）を除去するように変異されている（ヒトＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓ、配列番号２８）。いくつかの実施形態では、２０または２５ａａのリンカードメインを含有するＲＮａｓｅ１－リンカー－Ｆｃが作製される。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅ－リンカー－ＲＮａｓｅ－Ｆｃを含み、ＲＮａｓｅ１ドメインは、ＦｃのＣＯＯＨ側に位置する。他の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅ－リンカー－ＲＮａｓｅ－Ｆｃを含み、ＲＮａｓｅ１ドメインは、ＦｃのＮＨ２側に位置する。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅ－ＦｃおよびＲＮａｓｅ－Ｆｃ；ＤＮａｓｅ１－Ｆｃ－リンカー－ＲＮａｓｅおよびＦｃドメイン；ＤＮａｓｅ１－ＦｃおよびＦｃ－リンカー－ＲＮａｓｅ；Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅ１およびＦｃ－リンカー－ＲＮａｓｅ；ＲＮａｓｅ－Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅおよびＦｃドメイン；Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅおよびＲｎａｓｅ－Ｆｃ；ならびにＲＮａｓｅ－Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅを含む。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の酵素ドメインと他のドメインとの間の融合接合が最適化される。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＲＮａｓｅ酵素活性の標的は、主に、例えば抗ＲＮＰ自己抗体との免疫複合体に含まれるＲＮＡと、アポトーシスを受ける細胞の表面上で発現されるＲＮＡとからなる細胞外である。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、エンドサイトーシス小胞の酸性環境において活性である。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、細胞外およびエンドサイトーシス環境の両方において活性であるように適合されている。いくつかの態様では、これは、野生型Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片を含む最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が、事前に貪食された免疫複合体による、またはウイルス感染後にＴＬＲ７を活性化するＲＮＡによるＴＬＲ７シグナル伝達を停止することを可能にする。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の野生型ＲＮａｓｅは、ＲＮａｓｅ細胞質阻害剤による阻害に対して耐性ではない。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の野生型ＲＮａｓｅは、細胞の細胞質において活性ではない。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅの両方を含む。いくつかの実施形態では、これらの最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方の組み合わせを含有する免疫複合体を消化または分解し、細胞外において活性であるので、ＳＬＥの治療を向上させる。
Ｆｃドメイン
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインを含むポリペプチドは、足場として、ならびにポリペプチドの血清半減期を増加させるための手段として機能するＦｃドメインに作動可能にカップリングされている。いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインおよび／またはＦｃドメインは、アグリコシル化、脱グリコシル化または低グリコシル化されている。
適切なＦｃドメインは当技術分野で周知であり、限定されないが、ＦｃおよびＦｃバリアント、例えば国際公開第２０１１／０５３９８２号、国際公開第０２／０６０９５５号、国際公開第０２／０９６９４８号、国際公開第０５／０４７３２７号、国際公開第０５／０１８５７２号および米国特許出願公開第２００７／０１１１２８１号（上記の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているものが挙げられる。（変化したグリコシル化の有無にかかわらず）Ｆｃドメインを本明細書に開示される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に導入するためのルーチンな方法（例えば、クローニング、コンジュゲーション）を使用することは、当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば配列番号４５に示されている野生型ヒトＩｇＧ１ Ｆｃである。
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、例えば、アミノ酸付加、欠失または置換をもたらす変異によって変化または改変されている。本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメインバリアント」という用語は、Ｆｃドメインが由来する野生型Ｆｃと比較して、少なくとも１つのアミノ酸改変、例えばアミノ酸置換を有するＦｃドメインを指す。例えば、ＦｃドメインがヒトＩｇＧ１抗体に由来する場合、バリアントは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の対応する位置における野生型アミノ酸と比較して、少なくとも１つのアミノ酸変異（例えば、置換）を含む。Ｆｃバリアントのアミノ酸置換は、その残基が抗体のＦｃ領域において与えられる位置番号に対応するとみなされるＦｃドメイン内の位置に位置し得る（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
一実施形態では、Ｆｃバリアントは、ヒンジ領域またはその一部に位置するアミノ酸位置における１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ２ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置における１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ３ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置における１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ｆｃバリアントは、ＣＨ４ドメインまたはその一部に位置するアミノ酸位置における１つまたはそれを超えるアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｎ８３において変異（すなわち、ＫａｂａｔナンバリングによるＮ２９７）を有し、アグリコシル化Ｆｃ領域（例えば、Ｆｃ Ｎ８３Ｓ；配列番号５０）が生じる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、３つのヒンジ領域システイン（残基２２０、２２６および２２９、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）の１つまたはそれよりも多くにおける変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン中の３つのヒンジシステインの１つまたはそれよりも多くは、ＳＣＣ（配列番号５１）またはＳＳＳ（配列番号５２）に変異され得、「Ｓ」は、セリンによるシステインのアミノ酸置換を表す。したがって、「ＳＣＣ」は、３つのヒンジ領域システインの第１のシステインのみがセリンにアミノ酸置換されていることを示すのに対して（残基２２０、２２６および２２９、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）、「ＳＳＳ」は、ヒンジ領域中の３つのシステインすべてがセリンで置換されていることを示す（残基２２０、２２６および２２９、ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
いくつかの態様では、Ｆｃドメインは、変異体ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメインおよび／またはＣＨ３ドメインにおける１つまたはそれを超える変異を含む。
ＣＨ２置換
いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８Ｓ変異を含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ３３１Ｓ変異を含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８Ｓ変異およびＰ３３１Ｓ変異を含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８Ｓおよび／またはＰ３３１Ｓを含み、３つのヒンジシステイン（残基２２０、２２６および２２９）の１つまたはそれよりも多くにおける変異を含み得る（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８Ｓおよび／もしくはＰ３３１Ｓ、ならびに／または３つのヒンジシステイン（残基２２０、２２６および２２９）における１つまたはそれを超える変異を含む（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８Ｓおよび／もしくはＰ３３１Ｓ、ならびに／またはヒンジシステインにおけるＳＣＣへの変異、もしくは３つのヒンジシステインにおけるＳＳＳへの変異を含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓ、ならびに３つのヒンジシステインの少なくとも１つにおける変異を含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１ＳおよびＳＣＣを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１ＳおよびＳＳＳを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ２３８ＳおよびＳＣＣまたはＳＳＳを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｐ３３１ＳおよびＳＣＣまたはＳＳＳを含む。（ナンバリングはすべてＥＵインデックスに従う）。
いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｎ２９７などのＮ結合型グリコシル化部位における変異、例えばセリンなどの別のアミノ酸によるアスパラギンの置換、例えばＮ２９７Ｓを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｎ２９７などのＮ結合型グリコシル化部位における変異、例えばセリンなどの別のアミノ酸によるアスパラギンの置換、例えばＮ２９７Ｓと、３つのヒンジシステインの１つまたはそれよりも多くにおける変異とを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｎ２９７などのＮ結合型グリコシル化部位における変異、例えばセリンなどの別のアミノ酸によるアスパラギンの置換、例えばＮ２９７Ｓと、３つのヒンジシステインの１つにおけるＳＣＣへの変異、または３つのヒンジシステインのすべてにおけるＳＳＳへの変異とを含む。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、Ｎ２９７などのＮ結合型グリコシル化部位における変異、例えばセリンなどの別のアミノ酸によるアスパラギンの置換、例えばＮ２９７と、ＣＨ２ドメインにおける１つまたはそれを超える変異であって、ＦｃγＲ結合および／または補体活性化を減少させる１つまたはそれを超える変異、例えばＰ２３８またはＰ３３１またはその両方における変異、例えばＰ２３８ＳまたはＰ３３１ＳまたはＰ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓの両方とを含む。いくつかの態様では、このような変異体Ｆｃドメインは、ヒンジ領域における変異、例えばＳＣＣまたはＳＳＳをさらに含み得る。（ナンバリングはすべてＥＵインデックスに従う）。いくつかの態様では、変異体Ｆｃドメインは、本明細書の配列表または配列リストに示されているとおりである。
ＣＨ３置換
ヘテロ二量体は、本明細書に開示されるヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質上のＦｃドメインのＣＨ３ドメインにおける変異によって優先的に形成され得る。最初に、ヘテロ二量体化のために、「ノブ・イントゥ・ホール」戦略（Ｒｉｇｗａｙ Ｂら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（１９９６）ｐｐ．６１７－６２１）を使用して、重鎖を最初に操作した。「ノブ・イントゥ・ホール」という用語は、それらの相互作用面において凸部（ノブ）を一方のポリペプチドに導入し、凹部（ホール）を他方のポリペプチドに導入することによって、２つのポリペプチドがインビトロまたはインビボで互いにペアリングすることを誘導する技術を指す。例えば、国際公開第９６／０２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許出願公開第２００７／０１７８５５２号、国際公開第２００９０８９００４号、米国特許出願公開第２００９０１８２１２７号を参照のこと。特に、ＣＨ３ドメインにおける変異の組み合わせ、例えば「ノブ」重鎖におけるＳ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、および「ホール」重鎖におけるＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖは、ヘテロ二量体を優先的に形成するために使用され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ノブ変異Ｔ３６６Ｗを有する第１のＣＨ３ドメインと、ホール変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを有する第２のＣＨ３ドメインとを含む。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３変異は、Ｚｙｍｅｗｏｒｋｓ（米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）およびＶｏｎ Ｋｒｅｕｄｅｎｓｔｅｉｎ，Ｔ．Ｓら、ｍＡＢｓ，５（２０１３），ｐｐ．６４６－６５４）によって記載されているものであり、以下の変異が挙げられる：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ（第１のＣＨ３ドメイン）；ならびにＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ（第２のＣＨ３ドメイン）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を有する第１のＣＨ３ドメインと、Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２Ｌ、Ｔ３９４Ｗ変異を有する第２のＣＨ３ドメインとを含む。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３変異は、Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｌら、（ｍＡＢｓ，３（２０１１），ｐｐ．５４６－５５７）によって記載されているものであり、以下の変異が挙げられる：Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ（第１のＣＨ３ドメイン）；ならびにＹ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ（第２のＣＨ３ドメイン）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｓ３６４ＨおよびＦ４０５Ａ変異を有する第１のＣＨ３ドメインと、Ｙ３４９ＴおよびＴ３９４Ｆ変異を有する第２のＣＨ３ドメインとを含む。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３変異は、Ｇｕｎａｓｅｋａｒａｎ，Ｋら、（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８５（２０１０），ｐｐ．１９６３７－１９６４６）によって記載されているものであり、以下の変異が挙げられる：Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ（第１のＣＨ３ドメイン）；ならびにＤ３９９ＫおよびＥ３６５Ｋ（第２のＣＨ３ドメイン）。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるヘテロ二量体二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｋ４０９ＤおよびＫ３９２Ｄ変異を有する第１のＣＨ３ドメインと、Ｄ３９９ＫおよびＥ３６５Ｋ変異を有する第２のＣＨ３ドメインとを含む。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、当技術分野で認められているＦｃバリアントであって、エフェクター機能および／またはＦｃＲ結合の変化を付与することが公知のＦｃバリアントを用い得る。例えば、国際公開第８８／０７０８９号、国際公開第９６／１４３３９号、国際公開第９８／０５７８７号、国際公開第９８／２３２８９号、国際公開第９９／５１６４２号、国際公開第９９／５８５７２号、国際公開第００／０９５６０号、国際公開第００／３２７６７号、国際公開第００／４２０７２号、国際公開第０２／４４２１５号、国際公開第０２／０６０９１９号、国際公開第０３／０７４５６９号、国際公開第０４／０１６７５０号、国際公開第０４／０２９２０７号、国際公開第０４／０３５７５２号、国際公開第０４／０６３３５１号、国際公開第０４／０７４４５５号、国際公開第０４／０９９２４９号、国際公開第０５／０４０２１７号、国際公開第０４／０４４８５９号、国際公開第０５／０７０９６３号、国際公開第０５／０７７９８１号、国際公開第０５／０９２９２５号、国際公開第０５／１２３７８０号、国際公開第０６／０１９４４７号、国際公開第０６／０４７３５０号および国際公開第０６／０８５９６７号；米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、米国特許出願公開第２００７／０２３１３２９号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６５号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６６号、米国特許出願公開第２００７／０２３７７６７号、米国特許出願公開第２００７／０２４３１８８号、米国特許出願公開第２００７０２４８６０３号、米国特許出願公開第２００７０２８６８５９号、米国特許出願公開第２００８００５７０５６号；または米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，７３９，２７７号；米国特許第５，８３４，２５０号；米国特許第５，８６９，０４６号；米国特許第６，０９６，８７１号；米国特許第６，１２１，０２２号；米国特許第６，１９４，５５１号；米国特許第６，２４２，１９５号；米国特許第６，２７７，３７５号；米国特許第６，５２８，６２４号；米国特許第６，５３８，１２４号；米国特許第６，７３７，０５６号；米国特許第６，８２１，５０５号；米国特許第６，９９８，２５３号；米国特許第７，０８３，７８４号；および米国特許第７，３１７，０９１号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているアミノ酸位置の１つまたはそれよりも多くにおける変化（例えば、置換）。一実施形態では、特定の変更（例えば、当技術分野で開示されている１つまたはそれを超えるアミノ酸の特定の置換）は、開示されるアミノ酸位置の１つまたはそれよりも多くにおいて行われ得る。別の実施形態では、開示されるアミノ酸位置の１つまたはそれよりも多くにおける異なる変更（例えば、当技術分野で開示されている１つまたはそれを超えるアミノ酸位置の異なる置換）が行われ得る。
Ｆｃドメインにおける他のアミノ酸変異は、Ｆｃγ受容体およびＦｃγ受容体サブタイプに対する結合を減少させると考えられる。Ｆｃドメインへのアミノ酸残基番号の割り当ては、Ｋａｂａｔの定義に従う。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｃｏｎｔｅｎｔｓ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｒｅｇｉｏｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｓｅｃｔｉｏｎｓ），５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ：ＮＩＨ ｖｏｌ．１：６４７－７２３（１９９１）；Ｋａｂａｔら、「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，ＵＳ Ｄｅｐｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ ｖｏｌ．１：ｘｉｉｉ－ｘｃｖｉ（１９９１）；Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７（１９８７）；Ｃｈｏｔｈｉａら、Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７８－８８３（１９８９）（これらはそれぞれ、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
例えば、２００４年５月１８日に発行された米国特許第６，７３７，０５６号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、Ｆｃ領域の位置２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２５５、２５６、２５８、２６５、２６７、２６８、２６９、２７０、２７２、２７９、２８０、２８３、２８５、２９８、２８９、２９０、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９８、３０１、３０３、３０５、３０７、３１２、３１５、３２２、３２４、３２７、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８、３４０、３５６、３６０、３７３、３７６、３７８、３７９、３８２、３８８、３８９、３９８、４１４、４１６、４１９、４３０、４３４、４３５、４３７、４３８または４３９における変異は、結合を変化させ得る。この特許では、ＩｇＧ３におけるＰｒｏ３３１をＳｅｒに変更すると、非変異ＩｇＧ３と比較して６倍低い親和性がもたらされたことが報告されたが、これは、ＦｃγＲＩ結合におけるＰｒｏ３３１の関与を示している。加えて、１９９７年４月２９日に発行された米国特許第５，６２４，８２１号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、位置２３４、２３５、２３６および２３７、２９７、３１８、３２０および３２２におけるアミノ酸改変は、受容体結合親和性を潜在的に変化させると開示されている。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
使用のために企図されるさらなる変異としては、例えば、２００６年１０月１９日に公開された米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。この刊行物には、Ｆｃγ受容体に対する結合の減少、抗体依存性細胞性細胞傷害の減少、または補体依存性細胞傷害の減少を示すＦｃバリアントであって、２３２Ｇ、２３４Ｇ、２３４Ｈ、２３５Ｄ、２３５Ｇ、２３５Ｈ、２３６Ｉ、２３６Ｎ、２３６Ｐ、２３６Ｒ、２３７Ｋ、２３７Ｌ、２３７Ｎ、２３７Ｐ、２３８Ｋ、２３９Ｒ、２６５Ｇ、２６７Ｒ、２６９Ｒ、２７０Ｈ、２９７Ｓ、２９９Ａ、２９９Ｉ、２９９Ｖ、３２５Ａ、３２５Ｌ、３２７Ｒ、３２８Ｒ、３２９Ｋ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｎ、３３０Ｐ、３３０Ｒおよび３３１Ｌ（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）を含む、Ｆｃ領域における少なくとも１つのアミノ酸改変を含むＦｃバリアント、ならびに二重変異体２３６Ｒ／２３７Ｋ、２３６Ｒ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２８Ｒ、２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３７Ｋ／３２８Ｒ、３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ、２６７Ｒ／２６９Ｒ、２３４Ｇ／２３５Ｇ、２３６Ｒ／２３７Ｋ／３２５Ｌ、２３６Ｒ／３２５Ｌ／３２８Ｒ、２３５Ｇ／２３６Ｒ／２３７Ｋおよび２３７Ｋ／３２５Ｌ／３２８Ｒが記載されている。この刊行物に記載されている使用のために企図される他の変異としては、２２７Ｇ、２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｇ、２３４Ｉ、２３４Ｙ、２３５Ｄ、２３５Ｉ、２３５Ｓ、２３６Ｓ、２３９Ｄ、２４６Ｈ、２５５Ｙ、２５８Ｈ、２６０Ｈ、２６４１、２６７Ｄ、２６７Ｅ、２６８Ｄ、２６８Ｅ、２７２Ｈ、２７２Ｉ、２７２Ｒ、２８１Ｄ、２８２Ｇ、２８３Ｈ、２８４Ｅ、２９３Ｒ、２９５Ｅ、３０４Ｔ、３２４Ｇ、３２４Ｉ、３２７Ｄ、３２７Ａ、３２８Ａ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｍ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｔ、３２８Ｖ、３２８Ｙ、３３０Ｉ、３３０Ｌ、３３０Ｙ、３３２Ｄ、３３２Ｅ、３３５Ｄ、位置２３５および２３６の間へのＧの挿入、位置２３５および２３６の間へのＡの挿入、位置２３５および２３６の間へのＳの挿入、位置２３５および２３６の間へのＴの挿入、位置２３５および２３６の間へのＮの挿入、位置２３５および２３６の間へのＤの挿入、位置２３５および２３６の間へのＶの挿入、位置２３５および２３６の間へのＬの挿入、位置２３５および２３６の間へのＧの挿入、位置２３５および２３６の間へのＡの挿入、位置２３５および２３６の間へのＳの挿入、位置２３５および２３６の間へのＴの挿入、位置２３５および２３６の間へのＮの挿入、位置２３５および２３６の間へのＤの挿入、位置２３５および２３６の間へのＶの挿入、位置２３５および２３６の間へのＬの挿入、位置２９７および２９８の間へのＧの挿入、位置２９７および２９８の間へのＡの挿入、位置２９７および２９８の間へのＳの挿入、位置２９７および２９８の間へのＤの挿入、位置３２６および３２７の間へのＧの挿入、位置３２６および３２７の間へのＡの挿入、位置３２６および３２７の間へのＴの挿入、位置３２６および３２７の間へのＤの挿入ならびに位置３２６および３２７の間へのＥの挿入（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）が挙げられる。加えて、米国特許出願公開第２００６／０２３５２０８号に記載されている変異としては、２２７Ｇ／３３２Ｅ、２３４Ｄ／３３２Ｅ、２３４Ｅ／３３２Ｅ、２３４Ｙ／３３２Ｅ、２３４Ｉ／３３２Ｅ、２３４Ｇ／３３２Ｅ、２３５Ｉ／３３２Ｅ、２３５Ｓ／３３２Ｅ、２３５Ｄ／３３２Ｅ、２３５Ｅ／３３２Ｅ、２３６Ｓ／３３２Ｅ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３６Ｓ／３３２Ｄ、２３６Ａ／３３２Ｄ、２３９Ｄ／２６８Ｅ、２４６Ｈ／３３２Ｅ、２５５Ｙ／３３２Ｅ、２５８Ｈ／３３２Ｅ、２６０Ｈ／３３２Ｅ、２６４Ｉ／３３２Ｅ、２６７Ｅ／３３２Ｅ、２６７Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３３２Ｄ、２６８Ｅ／３３２Ｄ、２６８Ｅ／３３２Ｅ、２６８Ｄ／３３２Ｅ、２６８Ｅ／３３０Ｙ、２６８Ｄ／３３０Ｙ、２７２Ｒ／３３２Ｅ、２７２Ｈ／３３２Ｅ、２８３Ｈ／３３２Ｅ、２８４Ｅ／３３２Ｅ、２９３Ｒ／３３２Ｅ、２９５Ｅ／３３２Ｅ、３０４Ｔ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｅ、３２４Ｇ／３３２Ｅ、３２４Ｉ／３３２Ｄ、３２４Ｇ／３３２Ｄ、３２７Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ａ／３３２Ｅ、３２８Ｔ／３３２Ｅ、３２８Ｖ／３３２Ｅ、３２８Ｉ／３３２Ｅ、３２８Ｆ／３３２Ｅ、３２８Ｙ／３３２Ｅ、３２８Ｍ／３３２Ｅ、３２８Ｄ／３３２Ｅ、３２８Ｅ／３３２Ｅ、３２８Ｎ／３３２Ｅ、３２８Ｑ／３３２Ｅ、３２８Ａ／３３２Ｄ、３２８Ｔ／３３２Ｄ、３２８Ｖ／３３２Ｄ、３２８Ｉ／３３２Ｄ、３２８Ｆ／３３２Ｄ、３２８Ｙ／３３２Ｄ、３２８Ｍ／３３２Ｄ、３２８Ｄ／３３２Ｄ、３２８Ｅ／３３２Ｄ、３２８Ｎ／３３２Ｄ、３２８Ｑ／３３２Ｄ、３３０Ｌ／３３２Ｅ、３３０Ｙ／３３２Ｅ、３３０Ｉ／３３２Ｅ、３３２Ｄ／３３０Ｙ、３３５Ｄ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｌ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｉ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３２７Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２８４Ｅ、２３９Ｄ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ、３３２Ｅ／３３０Ｙ／２６８Ｅ／３２７Ａ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／２６８Ｅ／３３０Ｙ／３２７Ａ、挿入Ｇ＞２９７－２９８／３３２Ｅ、挿入Ａ＞２９７－２９８／３３２Ｅ、挿入Ｓ＞２９７－２９８／３３２Ｅ、挿入Ｄ＞２９７－２９８／３３２Ｅ、挿入Ｇ＞３２６－３２７／３３２Ｅ、挿入Ａ＞３２６－３２７／３３２Ｅ、挿入Ｔ＞３２６－３２７／３３２Ｅ、挿入Ｄ＞３２６－３２７／３３２Ｅ、挿入Ｅ＞３２６－３２７／３３２Ｅ、挿入Ｇ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ａ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｓ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｔ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｎ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｄ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｖ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｌ＞２３５－２３６／３３２Ｅ、挿入Ｇ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ａ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ｓ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ｔ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ｎ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ｄ＞２３５－２３６／３３２Ｄ、挿入Ｖ＞２３５－２３６／３３２Ｄおよび挿入Ｌ＞２３５－２３６／３３２Ｄ（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）が挙げられ、使用のために企図される。例えば、２００３年６月１２日に公開された米国特許出願公開第２００３／０１０８５４８号（これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）には、変異体Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａが記載されている。実施形態では、記載されている改変は、個別にまたは組み合わせて含まれる。（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
リンカードメイン
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカードメインを含む。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、複数のリンカードメインを含む。いくつかの実施形態では、リンカードメインは、ポリペプチドリンカーである。特定の態様では、ポリペプチドリンカーを用いて、Ｆｃまたはそのバリアントもしくは断片を１つまたはそれを超えるヌクレアーゼドメインに融合し、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を形成することが望ましい。
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、合成のものである。本明細書で使用される場合、ポリペプチドリンカーに関して「合成」という用語は、それが本来的には元々連結されていない配列（これは、天然に存在するものでもよいし、または天然に存在するものではなくてもよい）（例えば、Ｆｃ配列）に線状アミノ酸配列で連結されたアミノ酸配列（これは、天然に存在するものでもよいし、または天然に存在するものではなくてもよい）を含むペプチド（またはポリペプチド）を含む。例えば、ポリペプチドリンカーは、天然に存在するポリペプチドの改変形態である（例えば、変異、例えば付加、置換または欠失を含む）か、または第１のアミノ酸配列（これは、天然に存在するものでもよいし、または天然に存在するものではなくてもよい）を含む天然に存在しないポリペプチドを含み得る。本発明のポリペプチドリンカーは、例えば、機能的Ｆｃまたはそのバリアントもしくは断片の適切なフォールディングおよび形成を確実にするようにＦｃまたはそのバリアントもしくは断片を確実に並置させるために用いられ得る。好ましくは、本発明と適合するポリペプチドリンカーは、比較的非免疫原性であり、結合タンパク質の単量体サブユニット間におけるいかなる非共有結合的会合も阻害しないであろう。
特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号４１に記載されているＮＬＧリンカーを用いる。
特定の実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ポリペプチドリンカーを用いて、単一ポリペプチド鎖における任意の２つまたはそれを超えるドメインをインフレームで接続する。一実施形態では、２つまたはそれを超えるドメインは、本明細書で議論されるＦｃドメインもしくはそのバリアントもしくは断片またはヌクレアーゼドメインのいずれかから独立して選択され得る。例えば、特定の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、同一のＦｃ断片を融合し、それによりホモ二量体Ｆｃ領域を形成するために使用され得る。他の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、異なるＦｃ断片を融合し、それによりヘテロ二量体Ｆｃ領域を形成するために使用され得る。他の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、第１のＦｃ断片のＣ末端を第２のＦｃ断片のＮ末端に遺伝的に融合して、完全Ｆｃドメインを形成するために使用され得る。
一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片の一部を含む。例えば、一実施形態では、ポリペプチドリンカーは、Ｆｃ断片（例えば、ＣドメインまたはＮドメイン）またはＦｃドメインもしくはそのバリアントの異なる部分を含み得る。
別の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーを含むか、またはそれからなる。本明細書で使用される場合、「ｇｌｙ－ｓｅｒリンカー」という用語は、グリシンおよびセリン残基からなるペプチドを指す。例示的なｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、式（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号６２）（式中、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４または５）である）のアミノ酸配列を含む。好ましいｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４（配列番号６３）である。別の好ましいｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）である。別の好ましいｇｌｙ／ｓｅｒリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）５（配列番号６４）である。特定の実施形態では、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの２つの他の配列（例えば、本明細書に記載されるポリペプチドリンカー配列のいずれか）の間に挿入され得る。他の実施形態では、ｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーの別の配列（例えば、本明細書に記載されるポリペプチドリンカー配列のいずれか）の一方または両方の末端に付着される。さらに他の実施形態では、２つまたはそれを超えるｇｌｙ－ｓｅｒリンカーは、ポリペプチドリンカーに直列に組み込まれる。
他の実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、生物学的に関連性のあるペプチド配列またはその配列部分を含む。例えば、生物学的に関連性のあるペプチド配列としては、限定されないが、拒絶反応抑制ペプチドまたは抗炎症ペプチドに由来する配列が挙げられ得る。前記拒絶反応抑制ペプチドまたは抗炎症ペプチドは、サイトカイン抑制ペプチド、細胞接着抑制ペプチド、トロンビン抑制ペプチドおよび血小板抑制ペプチドからなる群より選択され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドリンカーは、ＩＬ－１抑制性またはアンタゴニストペプチド配列、エリスロポエチン（ＥＰＯ）模倣体ペプチド配列、トロンボポエチン（ＴＰＯ）模倣体ペプチド配列、Ｇ－ＣＳＦ模倣体ペプチド配列、ＴＮＦアンタゴニストペプチド配列、インテグリン結合性ペプチド配列、セレクチンアンタゴニストペプチド配列、抗病原体ペプチド配列、血管作動性腸管ペプチド（ＶＩＰ）模倣体ペプチド配列、カルモジュリンアンタゴニストペプチド配列、マスト細胞アンタゴニスト、ＳＨ３アンタゴニストペプチド配列、ウロキナーゼ受容体（ＵＫＲ）アンタゴニストペプチド配列、ソマトスタチンまたはコルチスタチン模倣体ペプチド配列、ならびにマクロファージおよび／またはＴ細胞抑制性ペプチド配列からなる群より選択されるペプチド配列を含む。例示的なペプチド配列（これらのいずれか１つは、ポリペプチドリンカーとして使用され得る）は、米国特許第６，６６０，８４３号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質において使用するために適切な他のリンカーは当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，５２５，４９１号に開示されているセリンリッチリンカー、Ａｒａｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ ２００１；１４：５２９－３２に開示されているヘリックス形成ペプチドリンカー（例えば、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号６５））およびＣｈｅｎら、Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ ２０１１；８：４５７－６５に開示されている安定リンカー、すなわち、ジペプチドリンカーＬＥ、トロンビン感受性ジスルフィドシクロペプチドリンカーおよびαヘリックス形成リンカーＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥ（配列番号５３）である。
他の例示的なリンカーとしては、ＧＳリンカー（すなわち、（ＧＳ）ｎ）（配列番号６６）、ＧＧＳＧ（配列番号７０）リンカー（すなわち、（ＧＧＳＧ）ｎ（配列番号６７））、ＧＳＡＴリンカー（配列番号４４）、ＳＥＧリンカーおよびＧＧＳリンカー（すなわち、（ＧＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号６８））（式中、ｎは正の整数（例えば、１、２、３、４または５）である）が挙げられる。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質において使用するための他の適切なリンカーは、公的に利用可能なデータベース、例えばリンカーデータベース（ｉｂｉ．ｖｕ．ｎｌ／ｐｒｏｇｒａｍｓ／ｌｉｎｋｅｒｄｂｗｗｗ）を使用して見出され得る。リンカーデータベースは、新規融合タンパク質におけるリンカー候補となる多機能酵素のドメイン間リンカーのデータベースである（例えば、Ｇｅｏｒｇｅら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ２００２；１５：８７１－９を参照のこと）。
これらの例示的なポリペプチドリンカーのバリアント形態は、１つまたはそれを超えるアミノ酸置換、付加または欠失がポリペプチドリンカーに導入されるように、ポリペプチドリンカーをコードするヌクレオチド配列に１つまたはそれを超えるヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することによって作られ得ることが理解されよう。変異は、部位特異的変異誘発、およびＰＣＲを介した変異誘発などの標準的な技術によって導入され得る。
本開示のポリペプチドリンカーは、少なくとも１アミノ酸長であり、様々な長さのものであり得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドリンカーは、約１～約５０アミノ酸長である。この文脈で使用される場合、「約」という用語は、＋／－２アミノ酸残基を示す。リンカーの長さは正の整数でなければならないので、約１アミノ酸から約５０アミノ酸の長さとは、１アミノ酸から４８～５２アミノ酸の長さを意味する。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、約１０～２０アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、約１５～約５０アミノ酸長である。
別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、約２０～約４５アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、約１５～約２５アミノ酸長である。別の実施形態では、本開示のポリペプチドリンカーは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０または６１またはそれを超えるアミノ酸長である。
ポリペプチドリンカーは、当技術分野で公知の技術を使用して、ポリペプチド配列に導入され得る。改変は、ＤＮＡ配列分析によって確認され得る。プラスミドＤＮＡは、産生されるポリペプチドの安定産生のために宿主細胞を形質転換するために使用され得る。
例示的な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質
本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質はモジュール式であり、様々な個別のドメインを組み込むように構成され得る。例えば、一実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、（配列番号２１）に記載されている変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆドメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２４に記載されている変異体ヒトＤＮａｓｅ１ Ｎ１８Ｓ／Ｎ１０６Ｓ／Ａ１１４Ｆドメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２７に記載されているヒト野生型ＲＮａｓｅ１ドメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２８に記載されているヒト変異体ＲＮａｓｅ１ Ｎ３４Ｓ／Ｎ７６Ｓ／Ｎ８８Ｓドメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号３０に記載されている（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３リンカードメインを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号４１に記載されているＮＬＧリンカーを含み得る。別の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＶＫ３ＬＰリーダー（配列番号５４）を含み得る。当業者であれば、これらの個別のドメインを任意の順序で互いに作動可能にカップリングして、酵素的に活性な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を形成し得ると理解するであろう。例えば、以下の特定の実施例に詳述されているように、ＲＮａｓｅ１は、Ｆｃドメインに作動可能にカップリングされ得る。別の例では、ＲＮａｓｅ１は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）リンカードメインを介してＦｃドメインに作動可能にカップリングされ得る。さらに別の例では、ＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆは、Ｆｃドメインに作動可能にカップリングされ得る。さらに別の例では、ＤＮａｓｅ１ Ａ１１４Ｆは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３（配列番号３０）リンカードメインを介してＦｃドメインに作動可能にカップリングされ得る。本明細書、図１および配列表に開示される非限定的な例示的な構成を用いて、他の様々な構成が可能である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＳＣＣヒンジとＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインと、ヒトＲＮａｓｅ１に作動可能にカップリングされた変異ヒトＤＮａｓｅ１ドメインとを含み、それにより、タンデムホモ二量体を形成する。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１は、ペプチドリンカー、例えば本明細書に開示されるＮＬＧリンカーを介してＲＮａｓｅ１に連結されている。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃドメインのＮ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮａｓｅ１は、リンカーによってまたはリンカーによらずにＦｃドメインのＣ末端に作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号２に記載されているアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ホモ二量体またはヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖとを有する第１の変異体Ｆｃドメインまたはそのバリアントもしくは断片に作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む第２の変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインとを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１は両方とも、それらの各ＦｃドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドと、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む第１の変異体Ｆｃドメインまたはその断片と、変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを有する第２の変異体Ｆｃドメインまたはその断片とに両方が作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインおよび野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１は、第１のおよび第２のＦｃドメインのそれぞれＮ末端およびＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号５に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインとを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１は、ＦｃドメインのＮ末端に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、ＦｃドメインのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号７に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインとを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１は両方とも、それらの各ＦｃドメインのＣ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号９に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号１０に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１１に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号１２に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片と、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片とに両方が作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインおよび野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１およびＲＮａｓｅ１は、ＦｃドメインのそれぞれＣ末端およびＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１３に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメインと、リンカーによってまたはリンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８ＳおよびＰ３３１Ｓと、ＣＨ３変異Ｔ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗとを含む変異体Ｆｃドメインまたはその断片に作動可能にカップリングされた野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメインとを含むヘテロ二量体である。いくつかの実施形態では、ＤＮａｓｅ１は、ＦｃドメインのＣ末端に連結されており、ＲＮａｓｅ１は、ＦｃドメインのＮ末端に連結されている。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１５に記載されている配列を含むポリペプチドと、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含むポリペプチドとを含むヘテロ二量体である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、配列番号１～１７のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または少なくとも９９．５％同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１～１７のいずれか１つに記載されているアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、上記最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、リーダー配列を有する。
当業者であれば、リーダーおよびリンカー配列は任意選択のものであり、上記実施形態に記載されているものに限定されないことを理解するであろう。例えば、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅドメインは、Ｆｃまたはそのバリアントもしくは断片のＮ末端および／またはＣ末端に直接融合され得る；リーダードメインは、その意図される目的のために、例えば、タンパク質の発現および／または分泌を増加させるために有用であることが当技術分野で公知のもののいずれであり得る（例えば、Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼシグナルペプチド（ＭＧＶＫＶＬＦＡＬＩＣＩＡＶＡＥＡ；配列番号３１））；リンカーは、当技術分野で公知の任意のリンカー、例えば本明細書に記載される（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ（配列番号５８）、ＮＬＧ（ＶＤＧＡＳＳＰＶＮＶＳＳＰＳＶＱＤＩ；配列番号４１）、ＬＥ、トロンビン感受性ジスルフィドシクロペプチドリンカー、ＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４（配列番号３２）またはインビトロで切断可能なジスルフィドリンカーであり得る。ルーチンなクローニングおよび組換え方法を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列に対して、対応する変更を行うことは当業者の能力の範囲内であることも理解されよう。アミノ酸がＮ結合型グリコシル化のアクセプターとして機能しない限り、ヌクレアーゼドメインにおけるアスパラギン残基（すなわち、ＲＮａｓｅ１におけるＮ３４、Ｎ７６およびＮ８８、ならびにＤＮａｓｅ１におけるＮ１８およびＮ１０６）をセリン以外のアミノ酸（例えば、グルタミン）で置換し得ることもまた理解されよう。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を作製する方法
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、組換えＤＮＡ技術を使用して、形質転換またはトランスフェクト宿主細胞において主に作製され得る。そうするために、ペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子が調製される。このようなＤＮＡ分子を調製する方法は、当技術分野で周知である。例えば、ペプチドをコードする配列は、適切な制限酵素を使用してＤＮＡから切断され得る。あるいは、ＤＮＡ分子は、ホスホルアミデート法などの化学合成技術を使用して合成され得る。また、これらの技術の組み合わせが使用され得る。
本発明はまた、適切な宿主においてペプチドを発現することができるベクターを含む。ベクターは、発現制御配列に作動可能にカップリングされたペプチドをコードするＤＮＡ分子を含む。ＤＮＡ分子をベクターに挿入する前または後のいずれかに、この作動可能な連結に影響を与える方法は周知である。発現制御配列としては、プロモーター、アクチベーター、エンハンサー、オペレーター、リボソームヌクレアーゼドメイン、開始シグナル、終止シグナル、キャップシグナル、ポリアデニル化シグナル、および転写または翻訳の制御に関与する他のシグナルが挙げられる。
その上にＤＮＡ分子を有する得られたベクターは、適切な宿主を形質転換またはトランスフェクトするために使用される。この形質転換またはトランスフェクションは、当技術分野で周知の方法を使用して行われ得る。
多くの利用可能な周知の宿主細胞はいずれも、本発明の実施において使用され得る。特定の宿主の選択は、当技術分野で認められているいくつかの要因に依存する。これらとしては、例えば、選択した発現ベクターとの適合性、ＤＮＡ分子によってコードされるペプチドの毒性、形質転換またはトランスフェクションの比率、ペプチドの回収の容易さ、発現特性、生物学的安全性および費用が挙げられる。すべての宿主が特定のＤＮＡ配列の発現に関して同等に有効であるとは限らないことを理解して、これらの要因のバランスをとらなければならない。これらの一般的なガイドラインでは、有用な微生物宿主としては、培養下にある細菌（大腸菌など）、酵母（サッカロミセスなど）および他の真菌、昆虫、植物、哺乳動物（ヒトを含む）の細胞、または当技術分野で公知である他の宿主が挙げられる。好ましい実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生される。
次に、形質転換またはトランスフェクト宿主を培養および精製する。宿主細胞は、所望の化合物が発現されるように、従来の発酵または培養条件下で培養され得る。このような発酵および培養条件は、当技術分野で周知である。最後に、ペプチドは、当技術分野で周知の方法によって、培養物から精製される。
化合物はまた、合成方法によって作製され得る。例えば、固相合成技術が使用され得る。適切な技術は当技術分野で周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９７３），Ｃｈｅｍ．Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ，ｐｐ．３３５－６１（Ｋａｔｓｏｙａｎｎｉｓ ａｎｄ Ｐａｎａｙｏｔｉｓ ｅｄｓ．）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ（１９６３），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９；Ｄａｖｉｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｉｎｔｌ １９８５；１０：３９４－４１４；Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｙｏｕｎｇ（１９６９），Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；米国特許第３，９４１，７６３号；Ｆｉｎｎら、（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：１０５－２５３；およびＥｒｉｃｋｓｏｎら、（１９７６），Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（３ｒｄ ｅｄ．）２：２５７－５２７に記載されているものが挙げられる。固相合成は、小型ペプチドを作製するために最も費用対効果の高い方法であるので、個別のペプチドを作製するために好ましい技術である。誘導体化ペプチドを含有するか、または非ペプチド基を含有する化合物は、周知の有機化学技術によって合成され得る。
分子発現／合成のための他の方法は、当業者に一般に公知である。
変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質
グリコシル化（例えば、Ｏ結合型またはＮ結合型グリコシル化）は、例えば、マンノースおよびアシアロ糖タンパク質受容体および他のレクチン様受容体による循環からのそれらの除去を最小化することによって、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期に影響を及ぼし得る。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｂｉｎｕｃｌｅａｓｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｔｅｉｎ）は、アグリコシル化、脱グリコシル化または低グリコシル化形態で調製される。好ましくは、Ｎ結合型グリコシル化が変化され、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質がアグリコシル化される。
いくつかの実施形態では、Ａｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは、Ｐｒｏ以外の任意の他の天然に存在するアミノ酸であり得る）コンセンサスに適合する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質におけるすべてのアスパラギン残基は、Ｎ結合型グリコシル化のアクセプターとして機能しない残基（例えば、セリン、グルタミン）に変異され、それにより、タンパク質をグリコシル化する細胞において合成される場合、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化が排除される。
いくつかの実施形態では、Ｎ結合型グリコシル化部位を欠く最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、哺乳動物細胞において産生される。一実施形態では、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞である。したがって、特定の実施形態では、アグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞において産生される。
他の実施形態では、Ｎ－グリコシル化の減少または欠如は、例えば、宿主（例えば、大腸菌などの細菌）、グリコシル化に重要な１つまたはそれを超える酵素を欠くように操作された哺乳動物細胞、またはグリコシル化を防止する薬剤、例えばツニカマイシン（Ｄｏｌ－ＰＰ－ＧｌｃＮＡｃ形成の阻害剤）で処理された哺乳動物細胞において最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を産生することによって達成される。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、高マンノース型糖ではなく複雑なＮ－グリカンを有する糖タンパク質を産生するように操作された下等真核生物において産生される（例えば、米国特許出願公開第２００７／０１０５１２７号を参照のこと）。
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超える炭水化物残基（例えば、１つまたはそれを超えるマンノース、フコースおよび／またはＮ－アセチルグルコサミン残基）を除去するために、または１つまたはそれを超える炭水化物残基を改変もしくは遮蔽するために、グリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において産生されたもの）は、化学的または酵素的に処理される。このような改変または遮蔽は、マンノース受容体および／またはアシアロ糖タンパク質受容体および／または他のレクチン様受容体に対する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の結合を減少させ得る。化学的脱グリコシル化は、例えば、Ｓｏｊａｒら、ＪＢＣ １９８９；２６４：２５５２－９およびＳｏｊａｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１３８：３４１－５０に開示されているように、トリフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳ）で最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を処理することによって、またはＳｏｊａｒら、（１９８７、前掲）に開示されているように、フッ化水素で処理することによって達成され得る。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質からのＮ結合型炭水化物の酵素的除去は、例えば、Ｔｈｏｔａｋｕｒａら、（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９８７；１３８：３５０－９）に開示されているように、タンパク質Ｎ－グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅ）ＡまたはＦで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を処理することによって達成され得る。他の当技術分野で認められている市販の脱グリコシル化酵素であって、使用に適切な脱グリコシル化酵素としては、エンド－α－Ｎ－アセチル－ガラクトサミニダーゼ、エンドグリコシダーゼＦ１、エンドグリコシダーゼＦ２、エンドグリコシダーゼＦ３およびエンドグリコシダーゼＨが挙げられる。いくつかの実施形態では、これらの酵素の１つまたはそれよりも多くは、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を脱グリコシル化するために使用され得る。脱グリコシル化のための代替方法は、例えば、米国特許第８，１９８，０６３号に開示されている。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、部分的に脱グリコシル化されている。部分的な脱グリコシル化は、エンドグリコシダーゼ（例えば、エンドグリコシダーゼＨ）（これは、Ｎ結合型高マンノース炭水化物を切断するが、複合型炭水化物を切断しないので、アスパラギンに連結された単一ＧｌｃＮＡｃ残基が残る）で最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を処理することによって達成され得る。エンドグリコシダーゼＨで処理された最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、高マンノース炭水化物を欠き、その結果、肝臓マンノース受容体との相互作用が減少するであろう。この受容体は末端ＧｌｃＮＡｃを認識するが、タンパク質表面上の単一ＧｌｃＮＡｃとの生産的相互作用の可能性は、インタクトな高マンノース構造の場合ほど大きくない。
他の実施形態では、血液からの最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のクリアランスを減少させるために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化は、例えば、酸化、還元、脱水、置換、エステル化、アルキル化、シアリル化、炭素－炭素結合切断などによって改変される。いくつかの実施形態では、炭水化物構造を改変するために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムで処理される。過ヨウ素酸塩処理は、隣接ジオールを酸化し、炭素－炭素結合を切断し、アルデヒド基でヒドロキシル基を置き換える；水素化ホウ素は、アルデヒドをヒドロキシルに還元する。多くの糖残基は、ビシナルジオールを含むので、この処理によって切断される。過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムによる血清半減期の延長は、これらの薬剤によるリソソーム酵素β－グルクロニダーゼの連続処理によって例示される（例えば、Ｈｏｕｂａら、（１９９６）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９９６：７：６０６－１１；Ｓｔａｈｌら、ＰＮＡＳ １９７６；７３：４０４５－９；Ａｃｈｏｒｄら、Ｐｅｄｉａｔ．Ｒｅｓ １９７７；１１：８１６－２２；Ａｃｈｏｒｄら、Ｃｅｌｌ １９７８；１５：２６９－７８を参照のこと）。過ヨウ素酸塩および水素化ホウ素ナトリウムによる処理のための方法は、Ｈｉｃｋｍａｎら、ＢＢＲＣ １９７４；５７：５５－６１に開示されている。リシンの血清半減期および組織分布を増加させる過ヨウ素酸塩およびシアノ水素化ホウ素による処理のための方法は、Ｔｈｏｒｐｅら、Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８５；１４７：１９７－２０６に開示されている。
一実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の炭水化物構造は、マンノース、アシアロ糖タンパク質受容体または他のレクチン様受容体による構造の認識を妨害する１つまたはそれを超えるさらなる部分（例えば、炭水化物基、リン酸基、アルキル基など）の追加によって遮蔽され得る。
いくつかの実施形態では、１つまたはそれを超える潜在的グリコシル化部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする核酸の変異によって除去され、それにより、タンパク質をグリコシル化する細胞、例えば哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ細胞において合成される場合に、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化（低グリコシル化）を減少させる。いくつかの実施形態では、例えば、低グリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が増加した活性を示すか、または血清半減期の増加に寄与する場合には、その中の潜在的Ｎ結合型グリコシル化部位を変異させることによって、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼドメインを選択的に低グリコシル化することが望ましい場合がある。他の実施形態では、例えば、このような改変が最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期を向上させる場合には、ヌクレアーゼドメイン以外の領域がＮ－グリコシル化を欠くように、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の一部を低グリコシル化することが望ましい場合がある。あるいは、グリコシル化アクセプターの近傍の他のアミノ酸を改変して、正常にグリコシル化されるアミノ酸を必ずしも変更せずにグリコシル化酵素の認識モチーフを破壊し得る。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化は、グリコシル化部位を導入することによって変化され得る。例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列は、Ａｓｐ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）のＮ結合型グリコシル化のコンセンサス配列を導入するように改変され得る。さらなるＮ結合型グリコシル化部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列における任意の場所に追加され得る。好ましくは、グリコシル化部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ）活性を実質的に減少させないアミノ酸配列における位置において導入される。
Ｏ結合型グリコシル化部位の追加は、タンパク質、例えば成長ホルモン、卵胞刺激ホルモン、ＩＧＦＢＰ－６、第ＩＸ因子および多くの他のものの血清半減期を変化させることが報告されている（例えば、Ｏｋａｄａら、Ｅｎｄｏｃｒ Ｒｅｖ ２０１１；３２：２－３４２；Ｗｅｅｎｅｎら、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ Ｍｅｔａｂ ２００４；８９：５２０４－１２；Ｍａｒｉｎａｒｏら、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２０００；１４２：５１２－６；米国特許出願公開第２０１１／０１５４５１６号に開示されているように）。したがって、いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の（セリン／トレオニン残基上の）Ｏ結合型グリコシル化は変化される。Ｏ結合型グリコシル化を変化させるための方法は当技術分野でルーチンであり、例えば、β脱離によって（例えば、Ｈｕａｎｇら、Ｒａｐｉｄ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍａｓｓ Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ ２００２；１６：１１９９－２０４；Ｃｏｎｒａｄ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００１；Ｃｈａｐｔｅｒ １７：Ｕｎｉｔ１７．１５Ａ；Ｆｕｋｕｄａ，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００１；Ｃｈａｐｔｅｒ １７；Ｕｎｉｔ １７．１５Ｂ；Ｚａｃｈａｒａら、Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２０１１；Ｕｎｉｔ １７．６；を参照のこと）；市販のキット（例えば、ＧｌｙｃｏＰｒｏｆｉｌｅ（商標）Ｂｅｔａ－Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ，Ｓｉｇｍａ）を使用することによって；または最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を、Ｇａｌ β１－３ＧａｌＮＡｃおよび／またはＧｌｃＮＡｃ β１－３ＧａｌＮＡｃのみが残るまで、一連のエキソグリコシダーゼ、例えば限定されないが、β１－４ガラクトシダーゼおよびβ－Ｎ－アセチルグルコサミニダーゼによる処理に供し、続いて、例えばエンド－α－Ｎ－アセチルガラクトサミニダーゼ（すなわち、Ｏ－グリコシダーゼ）による処理に供することによって達成され得る。このような酵素は、例えばＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓから市販されている。さらに他の実施形態では、例えばＯｋａｄａら、（前掲）、Ｗｅｅｎｅｎら、（前掲）、米国特許出願公開第２００８／０２７４９５８号；および米国特許出願公開第２０１１／０１７１２１８号に開示されているように、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質においてＯ結合型グリコシル化を導入するように変化される。いくつかの実施形態では、ＣＸＸＧＧＴ／Ｓ－Ｃ（配列番号３３）（ｖａｎ ｄｅｎ Ｓｔｅｅｎら、Ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｍｉｃｈａｅｌ Ｃｏｘ，ｅｄ．，１９９８；３３：１５１－２０８）、ＮＳＴ－Ｅ／Ｄ－Ａ（配列番号３４）、ＮＩＴＱＳ（配列番号３５）、ＱＳＴＱＳ（配列番号３６）、Ｄ／Ｅ－ＦＴ－Ｒ／Ｋ－Ｖ（配列番号３７）、Ｃ－Ｅ／Ｄ－ＳＮ（配列番号３８）およびＧＧＳＣ－Ｋ／Ｒ（配列番号３９）などの１つまたはそれを超えるＯ結合型グリコシル化コンセンサス部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質に導入される。さらなるＯ結合型グリコシル化部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列における任意の場所に追加され得る。好ましくは、グリコシル化部位は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ）活性を実質的に減少させないアミノ酸配列における位置において導入される。あるいは、例えば国際公開第８７／０５３３０号およびＡｐｌｉｎら、ＣＲＣ Ｃｒｉｔ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９８１；２５９－３０６）に記載されているように、Ｏ結合型糖部分は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸を化学的に改変することによって導入される。
いくつかの実施形態では、Ｎ結合型およびＯ結合型グリコシル化部位は両方とも、好ましくは最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ（例えば、ＲＮａｓｅおよび／またはＤＮａｓｅ）活性を実質的に減少させないアミノ酸配列における位置において導入される。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質においてグリコシル化（例えば、Ｎ結合型またはＯ結合型グリコシル化）を導入、減少または排除し、グリコシル化状態のこのような改変が最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ活性または血清半減期を増加または減少させるかを、当技術分野におけるルーチンな方法を使用して決定することは十分に当業者の能力の範囲内である。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、変化した糖型（例えば、非フコシル化グリカンまたはフコースを含まないグリカン）を含み得る。
いくつかの実施形態では、変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、対応するグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が変異されていない最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）と比べて少なくとも約１．５倍、例えば少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１０００倍または１０００倍またはそれを超えて増加した血清半減期を有する。当技術分野で認められているルーチンな方法は、変化したグリコシル化状態を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の血清半減期を決定するために使用され得る。
いくつかの実施形態では、変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、アグリコシル化、脱グリコシル化または低グリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）は、対応するグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が変異されていない最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）の活性の少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％または１００％を保持する。
いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化状態の変化は、酵素活性を直接増加させることによって、またはバイオアベイラビリティ（例えば、血清半減期）を増加させることによって、ヌクレアーゼ活性を増加させ得る。したがって、いくつかの実施形態では、変化したグリコシル化を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ活性は、対応するグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（例えば、潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が変異されていない最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質）と比べて少なくとも１．３倍、例えば少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍または１０倍またはそれを超えて増加している。
当業者であれば、当技術分野で認められている方法を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化状態を容易に決定し得る。好ましい実施形態では、グリコシル化状態は、質量分析を使用して決定される。他の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が低グリコシル化されているかを決定するために、コンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）との相互作用が評価され得る。低グリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、対応するグリコシル化最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質と比較した場合、ＣｏｎＡ－セファロースに対する減少した結合を示すと予想される。低グリコシル化タンパク質および対応するグリコシル化タンパク質の移動度を比較するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析も使用され得る。低グリコシル化タンパク質は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥでは、グリコシル化タンパク質と比較して大きな移動度を有すると予想される。タンパク質グリコシル化状態を分析するための他の適切な当技術分野で認められている方法は、例えば、Ｒｏｔｈら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１２；１－１０に開示されている。
異なるグリコシル化状態を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の薬物動態、例えば血清半減期は、ルーチンな方法を使用して、例えば、マウスにおいて最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を例えば静脈内に導入し、所定の時点において血液サンプルを採取し、サンプル中の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のレベルおよび／または酵素活性をアッセイおよび比較することによってアッセイされ得る。
医薬組成物
特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、単独で投与される。特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与と同時に投与される。特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与後に投与される。他の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つの他の治療剤の投与前に投与される。当業者によって認識されるように、いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、他の薬剤／化合物と組み合わされる。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および他の薬剤は、同時に投与される。いくつかの実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および他の薬剤は同時に投与されず、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、薬剤の投与前または投与後に投与される。いくつかの実施形態では、被験体は、同じ予防期間、障害発生および／または処置期間の間に、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および他の薬剤の両方を受ける。
本発明の医薬組成物は、併用療法で、すなわち、他の薬剤と組み合わせて投与され得る。特定の実施形態では、併用療法は、少なくとも１つの他の薬剤と組み合わせて、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む。薬剤としては、限定されないが、インビトロで合成的に調製された化学組成物、抗体、抗原結合領域ならびにそれらの組み合わせおよびコンジュゲートが挙げられる。特定の実施形態では、薬剤は、アゴニスト、アンタゴニスト、アロステリックモジュレーターまたは毒素として作用し得る。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと一緒に、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、本発明は、薬学的に許容され得る希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、保存剤および／またはアジュバントと一緒に、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質と、治療有効量の少なくとも１つのさらなる治療剤とを含む医薬組成物を提供する。
特定の実施形態では、許容され得る製剤化材料は、好ましくは、用いられる投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性である。いくつかの実施形態では、製剤化材料は、皮下および／または静脈内投与のためのものである。特定の実施形態では、医薬組成物は、例えば組成物のｐＨ、浸透圧、粘度、清澄度、色調、等張性、香り、滅菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着性または浸透性を改変、維持または保存するための製剤化材料を含有し得る。特定の実施形態では、適切な製剤化材料としては、限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなど）；抗菌薬；抗酸化物質（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス－ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸など）；増量剤（マンニトールまたはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β－シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル－β－シクロデキストリンなど）；フィラー；単糖類；二糖類；および他の糖質（グルコース、マンノースまたはデキストリンなど）；タンパク質（ゼラチンなど）；着色・香味・希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成性対イオン（ナトリウムなど）；保存剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート類、例えばポリソルベート２０、ポリソルベート８０など、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサポールなど）；安定性強化剤（スクロースまたはソルビトールなど）；張性増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、ならびに／または薬学的アジュバントが挙げられる。（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ（１９９５）。いくつかの実施形態では、製剤は、ＰＢＳ；２０ｍＭ ＮａＯＡＣ、ｐＨ５．２、５０ｍＭ ＮａＣｌ；および／または１０ｍＭ ＮＡＯＡＣ、ｐＨ５．２、９％スクロースを含む。
特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および／または治療用分子は、当技術分野で公知の半減期延長ビヒクルに連結される。このようなビヒクルとしては、限定されないが、ポリエチレングリコール、グリコーゲン（例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のグリコシル化）およびデキストランが挙げられる。このようなビヒクルは、例えば、米国特許出願第０９／４２８，０８２号、現在は米国特許第６，６６０，８４３号および公開されている国際公開第９９／２５０４４号に記載されている。
特定の実施形態では、最適な医薬組成物は、例えば、目的の投与経路、送達方式および所望の投与量に応じて、当業者によって決定される。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲を参照のこと。特定の実施形態では、このような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出速度およびインビボ排出速度に影響を及ぼし得る。
特定の実施形態では、医薬組成物における主要なビヒクルまたは担体は、性質が水性または非水性のいずれであり得る。例えば、特定の実施形態では、適切なビヒクルまたは担体は、非経口投与のための組成物において一般的な他の材料が場合により補充された注射用水、生理的食塩液または人工脳脊髄液であり得る。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、等張リン酸緩衝生理食塩水を含む。特定の実施形態では、医薬組成物は、約ｐＨ７．０～８．５のトリス緩衝液、または約Ｈ４．０～５．５の酢酸緩衝液（これは、ソルビトールまたはその適切な代替物をさらに含み得る）を含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む組成物は、貯蔵のために、所望の純度を有する選択組成物と、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態の任意選択の製剤化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、前掲）とを混合することによって調製され得る。さらに、特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む組成物は、スクロースなどの適切な賦形剤を使用して、凍結乾燥物として製剤化され得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口送達のために選択され得る。特定の実施形態では、組成物は、吸入のために、または消化管を介した送達（例えば、経口）のために選択され得る。このような薬学的に許容され得る組成物の調製は、当業者の能力の範囲内である。
特定の実施形態では、製剤成分は、投与部位にとって許容され得る濃度で存在する。特定の実施形態では、生理的ｐＨで、またはわずかに低いｐＨで、典型的には約５～約８のｐＨ範囲内で組成物を維持するために、緩衝剤が使用される。
特定の実施形態では、非経口投与が企図される場合、治療用組成物は、薬学的に許容され得るビヒクル中に、さらなる治療剤と共にまたはさらなる治療剤なしで所望の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む非経口に許容され得るパイロジェンフリー水溶液の形態であり得る。特定の実施形態では、非経口注射のためのビヒクルは、さらなる治療剤と共にまたはさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が、適切に保存された滅菌性等張液として製剤化された滅菌蒸留水である。特定の実施形態では、調製は、生成物の制御放出または持続放出を提供し得る薬剤、例えば注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、高分子化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームと共に、所望の分子を製剤化することを伴い得、次いで、これは、デポー注射を介して送達され得る。特定の実施形態では、ヒアルロン酸も使用され得、循環中で持続期間を促進する効果を有し得る。特定の実施形態では、所望の分子を導入するために、埋め込み型薬物送達デバイスが使用され得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、吸入のために製剤化され得る。特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで、吸入のための乾燥粉末として製剤化され得る。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む吸入用溶液は、エアロゾル送達のための噴霧剤と共に製剤化され得る。特定の実施形態では、溶液は、噴霧され得る。肺投与は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５号（これには、化学改変タンパク質の肺送達が記載されている）にさらに記載されている。
特定の実施形態では、製剤が経口投与され得ることが企図される。特定の実施形態では、この様式で投与される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで、錠剤およびカプセル剤などの固体剤形の調合に通常使用される担体と共にまたは前記担体なしで製剤化され得る。特定の実施形態では、カプセルは、バイオアベイラビリティが最大化され、全身前分解が最小化される際に、消化管内で製剤の活性部分を放出するように設計され得る。特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および／または任意のさらなる治療剤の吸収を促進するために、少なくとも１つのさらなる薬剤が含められ得る。特定の実施形態では、希釈剤、香味剤、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤も用いられ得る。
特定の実施形態では、医薬組成物は、錠剤の製造に適切な非毒性賦形剤との混合物中に、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで、有効量の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を伴い得る。特定の実施形態では、錠剤を滅菌水または別の適切なビヒクルに溶解することによって、溶液は、単位用量形態として調製され得る。特定の実施形態では、適切な賦形剤としては、限定されないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素ナトリウム、ラクトース、もしくはリン酸カルシウムなどの不活性希釈剤；またはデンプン、ゼラチンもしくはアラビアゴムなどの結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくはタルクなどの滑剤が挙げられる。
持続送達製剤または制御送達製剤中に、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む製剤を含むさらなる医薬組成物は、当業者に明らかであろう。特定の実施形態では、様々な他の持続送達手段または制御送達手段、例えばリポソーム担体、生体内分解性微粒子または多孔性ビーズおよびデポー注射を製剤化するための技術もまた、当業者に公知である。例えば、医薬組成物の送達のための多孔性高分子微粒子の制御放出が記載されている国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９号を参照のこと。特定の実施形態では、持続放出調製物は、例えば、成形品、例えばフィルムまたはマイクロカプセルの形態の半透過性ポリマーマトリックスを含み得る。持続放出マトリックスは、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開第０５８，４８１号）、Ｌ－グルタミン酸とγエチル－Ｌ－グルタメートとの共ポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ，２２：５４７－５５６（１９８３））、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｍａｔｅｒ Ｒｅｓ，１５：１６７－２７７（１９８１）およびＬａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，１２：９８－１０５（１９８２））、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、前掲）またはポリ－Ｄ（－）－３－ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開第１３３，９８８号）を含み得る。特定の実施形態では、持続放出組成物はまた、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかによって調製され得るリポソームを含み得る。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、ＰＮＡＳ，８２：３６８８－３６９２（１９８５）；欧州特許出願公開第０３６，６７６号；欧州特許出願公開第０８８，０４６号および欧州特許出願公開第１４３，９４９号を参照のこと。
インビボ投与に使用すべき医薬組成物は、典型的には滅菌性である。特定の実施形態では、これは、滅菌ろ過膜によるろ過によって達成され得る。特定の実施形態では、組成物が凍結乾燥される場合、この方法を使用した滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれかに行われ得る。特定の実施形態では、非経口投与のための組成物は、凍結乾燥形態で、または溶液で保存され得る。特定の実施形態では、非経口組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射用針によって貫通可能なストッパーを有する静脈注射用溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
特定の実施形態では、医薬組成物が製剤化されたら、それは、適切な滅菌バイアル中に、溶液、懸濁液、ゲル、乳濁液、固形物として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として貯蔵され得る。特定の実施形態では、このような製剤は、即時使用形態で、または投与前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれかで貯蔵され得る。
特定の実施形態では、単回用量投与単位を生産するためのキットが提供される。特定の実施形態では、キットは、乾燥タンパク質を有する第１の容器、および水性製剤を有する第２の容器の両方を含有し得る。特定の実施形態では、単一および複数チャンバー型プレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびリオシリンジ）を含有するキットが含まれる。
特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで、治療的に用いるべき最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む医薬組成物の有効量は、例えば、治療状況および目的に依存するであろう。当業者であれば、したがって、処置のための適切な投与量レベルは、特定の実施形態によれば、部分的には、分子が送達される際に、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質が使用される適応症、投与経路、ならびに患者のサイズ（体重、体表面積または器官サイズ）および／または状態（年齢および全般的健康状態）に応じて変動することを認識するであろう。特定の実施形態では、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投与量を設定し、投与経路を改変し得る。特定の実施形態では、典型的な投与量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲またはそれを超えるものであり得る。特定の実施形態では、投与量は、０．１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ；または１μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇ；または５μｇ／ｋｇ～最大約１００ｍｇ／ｋｇの範囲であり得る。
特定の実施形態では、投与頻度は、使用される製剤中の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および／または任意のさらなる治療剤の薬物動態パラメータを考慮するであろう。特定の実施形態では、臨床医は、所望の効果を達成する投与量に達するまで、組成物を投与するであろう。特定の実施形態では、したがって、組成物は、単回投与として、または経時的な２回もしくはそれを超える投与（これは、同じ量の所望の分子を含有していてもよいし、または含有していなくてもよい）として、または埋め込みデバイスもしくはカテーテルを介した連続注入として投与され得る。適切な投与量のさらなる微修正は、当業者によってルーチンに行われ、当業者によってルーチンに実施される作業の範囲内である。特定の実施形態では、適切な投与量は、適切な用量反応データを使用することによって確定され得る。
特定の実施形態では、医薬組成物の投与経路は、公知の方法、例えば静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、皮下、眼内、動脈内、門脈内もしくは病巣内経路による注射を介して経口による；持続放出システムによる、または埋め込みデバイスによるものである。特定の実施形態では、組成物は、ボーラス注射によって投与され得るか、または注入によって連続的に投与され得るか、または埋め込みデバイスによって投与され得る。
特定の実施形態では、組成物は、所望の分子が吸着または封入された膜、スポンジまたは別の適切な材料の埋め込みを介して局所投与され得る。特定の実施形態では、埋め込みデバイスが使用される場合、デバイスは、任意の適切な組織または器官に埋め込まれ得、所望の分子の送達は、拡散、持続放出ボーラスまたは連続的投与によるものであり得る。
特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む医薬組成物をエクスビボ様式で使用することが望ましい場合がある。このような場合では、患者から取り出され細胞、組織および／または器官は、少なくとも１つのさらなる治療剤と共にまたは少なくとも１つのさらなる治療剤なしで最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を含む医薬組成物に曝露され、その後続いて、細胞、組織および／または器官が患者の体内に再び埋め込まれる。
特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質および／または任意のさらなる治療剤は、本明細書に記載されている方法などの方法を使用して、ポリペプチドを発現および分泌するように遺伝子操作された特定の細胞を埋め込むことによって送達され得る。特定の実施形態では、このような細胞は、動物細胞またはヒト細胞であり得、自己、異種またはゼノジェニックであり得る。特定の実施形態では、細胞は、不死化され得る。特定の実施形態では、免疫学的応答の機会を減少させるために、細胞を封入して周囲組織の浸潤を回避し得る。特定の実施形態では、封入材料は、典型的には、タンパク質産物の放出を可能にするが、患者の免疫系による、または周囲組織からの他の有害因子による細胞の破壊を防止する生体適合性半透性ポリマー封入物または膜である。
インビトロアッセイ
本発明の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有効性を評価するために、当技術分野で公知の様々なインビトロアッセイが使用され得る。
例えば、正常またはループス患者ＰＢＭＣ由来の培養ヒトＰＢＭＣを単離し、培養し、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の存在下または非存在下、様々な刺激（例えば、ＴＬＲリガンド、共刺激抗体、免疫複合体および正常血清または自己免疫血清）で処理する。刺激細胞によるサイトカイン産生は、様々なサイトカイン（例えば、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γおよびＴＮＦ－α）のための市販の試薬、例えばＢｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）製の抗体ペアキットを使用して測定され得る。アッセイのために必要に応じて様々な時点（例えば、２４時間、４８時間またはそれよりも後の時点）において培養上清を回収して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質がサイトカイン産生に及ぼす効果を決定する。ＩＦＮ－α産生は、例えば、ＰＢＬ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｓｏｕｒｃｅ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手可能な抗ヒトＩＦＮ－α抗体および標準曲線試薬を使用して測定される。同様のアッセイは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ）から入手可能な市販の磁気ビーズベースの単離キットを使用して精製されたヒトリンパ球亜集団（単離された単球、Ｂ細胞、ｐＤＣ、Ｔ細胞など）を使用して実施される。
当技術分野で認められているルーチンな方法を使用して、刺激後の様々な時点において、ＰＢＭＣまたは単離された細胞亜集団におけるリンパ球活性化受容体、例えばＣＤ５、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ２５の発現を測定することによって、免疫細胞活性化に対する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の効果を評価するために、マルチカラーフローサイトメトリーが使用され得る。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有効性はまた、例えば、Ａｈｌｉｎら、Ｌｕｐｕｓ ２０１２：２１：５８６－９５；Ｍａｔｈｓｓｏｎら、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２００７；１４７：５１３－２０；およびＣｈｉａｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０１１；１８６：１２７９－１２８８に記載されているように、ＳＬＥ患者血清を正常ヒトｐＤＣと共にインキュベートして、ＩＦＮアウトプットを活性化することによって試験され得る。理論に縛られるものではないが、ＳＬＥ患者血清中の循環核酸含有免疫複合体は、Ｆｃ受容体媒介性エンドサイトーシスを介したｐＤＣエンドソームへの核酸抗原侵入、続いて、エンドソームＴＬＲ７、８および９に対する核酸の結合およびそれらの活性化を促進する。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の影響を評価するために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質でＳＬＥ患者血清または血漿を前処理し、続いて、健常志願者から単離されたｐＤＣ細胞の培養物に追加する。次いで、複数の時点において、産生されたＩＦＮ－αのレベルを決定する。免疫複合体を含有する核酸を分解することによって、有効な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、産生されるＩＦＮ－αの量を減少させると予想される。
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有効性は、本明細書に開示される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質で処理された細胞からのアッセイの結果と、対照製剤で処理された細胞からのアッセイの結果とを比較することによって実証される。処理後、上記様々なマーカー（例えば、サイトカイン、細胞表面受容体、増殖）のレベルは、一般に、有効な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質処理群では、処理前に存在するマーカーレベルと比べて、または対照群において測定されたレベルと比べて改善される。
処置の方法
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、自己免疫障害または異常免疫応答の処置において特に有効である。これに関して、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、外部抗原および自己抗原の両方に対する望ましくない免疫応答を制御、抑制、モジュレート、処置または排除するために使用され得ると認識されよう。
別の態様では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、治療有効量または十分量の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を、それを必要とする哺乳動物に投与することによって、哺乳動物における疾患または障害、例えば自己免疫疾患を予防（予防的）または処置（治療的）するために適合され、疾患は予防または処置される。所望の効果を達成するために適切な任意の投与経路が本発明によって企図される（例えば、静脈内、筋肉内、皮下）。疾患状態の処置は、状態に関連する症候の減少（これは、長期的なものでもよいし、または短期的なものでもよいし、または一時的に有益な効果でさえもよい）をもたらし得る。
多数の疾患状態が、本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質による処置に適切である。例えば、いくつかの態様では、疾患または障害は、自己免疫疾患または癌である。いくつかのこのような態様では、自己免疫疾患は、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験型ブドウ膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ－ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状ＬＥ、ＳＬＥまたは結合組織病である。
特定の実施形態では、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、ＳＬＥまたはシェーグレン症候群を予防または処置するために使用される。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有効性は、本明細書に開示される最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質で処置された哺乳動物におけるＩＦＮ－αレベル、ＩＦＮ－α応答遺伝子レベル、自己抗体力価、腎臓機能および病状、ならびに／または循環免疫複合体レベルと、対照製剤で処置された哺乳動物とを比較することによって実証される。
例えば、処置を必要とするヒト被験体が選択または同定される（例えば、ＳＬＥに関するＡｍｅｒｉｃａｎ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ基準を満たす患者、またはＡｍｅｒｉｃａｎ－Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ Ｓｊｏｇｒｅｎ’ｓ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａを満たす患者）。被験体は、例えば、ＳＬＥまたはシェーグレン症候群の原因または症候の軽減を必要とし得る。被験体の同定は、臨床環境において、または他の場所において、例えば被験体の自宅において、被験体自身が自己試験キットを使用することによって行われ得る。
０時間の時点において、適切な初回用量の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を被験体に投与する。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、本明細書に記載されるように製剤化される。初回投与後の期間、例えば７日、１４日および２１日後に、例えば、ＩＦＮ－αレベル、ＩＦＮ－α応答遺伝子レベル、自己抗体力価、腎臓機能および病状、ならびに／または循環免疫複合体レベルを測定することによって、被験体の状態を評価する。他の関連基準も測定され得る。投与の回数および強度は、被験体の要求にしたがって調整される。処置後、被験体のＩＦＮ－αレベル、ＩＦＮ－α応答遺伝子レベル、自己抗体力価、腎臓機能および病状、ならびに／または循環免疫複合体レベルは、処置前に存在するレベルと比べて、または未処置である以外は同様に罹患している／対照被験体において測定されたレベルと比べて低下および／または向上する。
別の例では、処置を必要とする齧歯類被験体が選択または同定される（例えば、実施例７を参照のこと）。被験体の同定は、研究室環境において、または他の場所において行われ得る。０時間の時点において、適切な初回用量の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を被験体に投与する。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、本明細書に記載されるように製剤化される。初回投与後の期間、例えば７日、１４日および２１日後に、例えば、ＩＦＮ－αレベル、ＩＦＮ－α応答遺伝子レベル、自己抗体力価、腎臓機能および病状、ならびに／または循環免疫複合体レベルを測定することによって、被験体の状態を評価する。他の関連基準も測定され得る。投与の回数および強度は、被験体の要求にしたがって調整される。
処置後、被験体のＩＦＮ－αレベル、ＩＦＮ－α応答遺伝子レベル、自己抗体力価、腎臓機能および病状、ならびに／または循環免疫複合体レベルは、処置前に存在するレベルと比べて、または未処置である以外は同様に罹患している／対照被験体において測定されたレベルと比べて低下および／または向上する。
本発明の別の態様は、１つまたはそれを超える最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を用いて、障害、疾患および状態を処置または予防するための遺伝子治療方法を使用することである。遺伝子治療方法は、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡおよびアンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ）配列をそれを必要とする動物に導入して、１つまたは複数の本開示のポリペプチドの発現を達成することに関する。この方法は、プロモーターと、標的組織によるポリペプチドの発現に必要な他の任意の遺伝的エレメントとに作動可能にカップリングされた本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードする１つまたはそれを超えるポリヌクレオチドの導入を含み得る。
遺伝子治療用途では、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成するために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質遺伝子が細胞に導入される。「遺伝子治療」は、単回処置によって持続効果が達成される従来の遺伝子治療、および治療的に有効なＤＮＡまたはｍＲＮＡの１回または反復投与を伴う遺伝子治療剤の投与の両方を含む。オリゴヌクレオチドは、例えば、それらの負荷電ホスホジエステル基を非荷電基で置換することによって、それらの取り込みを増強するように改変され得る。
以下は、本発明を行うための特定の実施形態の例である。実施例は、例示目的のみのために提供されるものであり、決して本発明の範囲を限定することを意図しない。使用される数字（例えば、量、温度など）に関して、精度を確保するための努力がなされているが、当然のことながら、いくらかの実験誤差および偏差は許容されるべきである。
特に指示がない限り、本発明の実施は、当技術分野の技術範囲内のタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術および薬理学の従来の方法を用いる。このような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ ａｎｄ Ｎ．Ｋａｐｌａｎ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）；Ｃａｒｅｙ ａｎｄ Ｓｕｎｄｂｅｒｇ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３ｒｄＥｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ Ａ ａｎｄ Ｂ（１９９２）を参照のこと。
実施例１
発現ベクターをコードする最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の生成
本開示の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の様々な実施形態は図１に示されており、各アミノ酸配列は配列表に示されている。例示的な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質として、図１に示されている構成を有する二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を構築した。具体的には、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のアミノ酸配列から出発して、哺乳動物細胞における最適な発現を可能にするためにＧｅｎｅｓｃｒｉｐｔ（Ｇｅｎｅｓｃｒｉｐｔ，Ｐｉｓｃａｔａｗｙ，Ｎ．Ｊ．）によるコドン最適化を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを直接合成した。最適化のプロセスは、例えば、可能な場合には非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有量の領域を回避することと、シス作用配列モチーフ、例えば内部ＴＡＴＡボックス、カイ部位およびリボソーム侵入部位、ＡＴリッチなまたはＧＣリッチな配列ストレッチ、ＲＮＡ不安定性モチーフ、反復配列およびＲＮＡ二次構造、ならびに高等真核生物における潜在的スプライスドナーおよびアクセプター部位を回避することとを伴っていた。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードするＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１＋哺乳動物発現ベクターにクローニングする。以下の構成を有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を生成した。
タンデムホモ二量体ＲＳＬＶ－１４５（配列番号１）は、ＤＮａｓｅ－リンカー－ＲＮａｓｅ－Ｆｃという構成を有し、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、リンカーによらずに、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓ（配列番号５５）とを含む変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされており、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＮＬＧリンカー（配列番号４１）を介してＲＮａｓｅ１ドメインのＮ末端に作動可能にカップリングされている。
ヘテロ二量体を優先的に形成するために、以下の構築物における各Ｆｃドメインは、相補的ＣＨ３変異：Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｙ、Ｆ４０５ＡおよびＹ４０７Ｖ；ならびにＴ３５０Ｖ、Ｔ３６６Ｌ、Ｋ３９２ＬおよびＴ３９４Ｗを含んでいた（ナンバリングはＥＵインデックスに従う）。
タンデムヘテロ二量体ＲＳＬＶ－１４７は、ＤＮａｓｅ－Ｆｃ（配列番号３）およびＲＮａｓｅ－Ｆｃ（配列番号４）という構成を有し、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第１の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされており、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第２の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされている。
ヘテロ二量体ＲＳＬＶ－１４８は、ＤＮａｓｅ－第１のＦｃドメイン－リンカー－ＲＮａｓｅ（配列番号５）および第２の変異体Ｆｃドメイン（ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む）（配列番号６）（ＣＣＣヒンジにおいて第１のシステインを含むＮ末端切断型）という構成を有し、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第１の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされており、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、ＮＬＧリンカーを介して第１のＦｃ領域のＣ末端に作動可能にカップリングされている。
ヘテロ二量体ＲＳＬＶ－１４９は、ＤＮａｓｅ－Ｆｃ（配列番号７）およびＦｃ－リンカー－ＲＮａｓｅ（配列番号８）という構成を有し、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第１の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされており、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、ＮＬＧリンカーを介して、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第２の変異体Ｆｃ領域（配列番号６）のＣ末端に作動可能にカップリングされている。
ヘテロ二量体ＲＳＬＶ－１５２は、ＲＮａｓｅ－第１の変異体Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅ（配列番号１３）および第２の変異体Ｆｃドメイン（ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む）（配列番号１４）という構成を有し、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第１の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされており、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＮＬＧリンカー（ＮＬＧ ｌｉｎｅｒ）を介して第１の変異体Ｆｃ領域のＣ末端に作動可能にカップリングされている。
ヘテロ二量体ＲＳＬＶ－１５３は、Ｆｃ－リンカー－ＤＮａｓｅ（配列番号１５）およびＲＮａｓｅ－Ｆｃ（配列番号１６）という構成を有し、変異体ヒトＤＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２５）は、ＮＬＧリンカーを介して、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第１の変異体Ｆｃ領域のＣ末端に作動可能にカップリングされており、野生型ヒトＲＮａｓｅ１ドメイン（配列番号２７）は、ＳＣＣヒンジと、ＣＨ２変異Ｐ２３８Ｓ、Ｐ３３１Ｓと、ＣＨ３変異とを含む第２の変異体Ｆｃ領域のＮ末端に作動可能にカップリングされている。
構築物ＲＬＳＶ－３２７（ヒト血清アルブミンに連結されたＲＮａｓｅ１およびＤＮａｓｅ１を含有する二重ヌクレアーゼ；ＲＮａｓｅ－リンカー－ＨＳＡ－リンカー－ＤＮａｓｅ Ｅ１３Ｒ／Ｎ７４Ｋ／Ａ１１４Ｆ／Ｔ２０５Ｋ）およびＲＳＬＶ－１３２（ＲＮａｓｅ－Ｆｃ）（ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ部分を含有する）を対照として使用した。
実施例２
最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を発現する安定哺乳動物細胞株の一過性発現
一過性発現のために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質インサートを含有する実施例１の発現ベクターを、製造業者が推奨するトランスフェクションプロトコールを使用し、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬を使用して、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えばＣＨＯ－Ｓ細胞（例えば、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ－Ｓ細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に一過性にトランスフェクトする。２ｍＭ Ｌ－グルタミンおよびペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＣＨＯ発現培地中で、ＣＨＯ－Ｓ細胞を維持する。
当技術分野で公知のルーチンな方法を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を発現する安定ＣＨＯ－Ｓ細胞株を生成する。例えば、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の核酸配列と、例えばフローサイトメトリーまたは磁気ビーズ分離（例えば、ＭＡＣＳｅｌｅｃｔ（商標）システム）を使用して選択されるマーカー（例えば、ＧＦＰ、磁気ビーズによって選択可能な表面マーカー）をコードする核酸配列とを含むウイルス（例えば、レトロウイルス、レンチウイルス）をＣＨＯ－Ｓ細胞に感染させ得る。あるいは、当技術分野で公知の任意のトランスフェクション方法、例えばエレクトロポレーション（Ｌｏｎｚａ）または上記ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の核酸配列と、選択可能なマーカーとを含むベクターをＣＨＯ－Ｓ細胞にトランスフェクトし、続いて、例えばフローサイトメトリーを使用して選択する。選択可能なマーカーを、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質をコードするものと同じベクターまたは別個のベクターに組み込み得る。
プロテインＡセファロースビーズを充填したカラムを使用して分子を捕捉し、続いて、カラム洗浄緩衝液（例えば、９０ｍＭトリス、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％アジ化ナトリウム）で洗浄し、適切な溶出緩衝液（例えば、０．１Ｍクエン酸緩衝液、ｐＨ３．０）を使用してカラムから分子を放出させることによって、培養上清から最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質を精製する。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮器を使用してＰＢＳ中で連続スピンによって緩衝液交換し、続いて、０．２μｍフィルタデバイスによってろ過することによって、溶出物質をさらに濃縮する。標準的な分光光度法（例えば、Ｂｒａｄｆｏｒｄ，ＢＣＡ，Ｌｏｗｒｙ，Ｂｉｕｒｅｔアッセイ）を使用して、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の濃度を決定する。
実施例３
精製最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のヌクレアーゼ活性
マウス血清中に存在する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＲＮａｓｅ活性を分析した。５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．３）中、１２．５～１００ｎｇから２．５ｍｇ／ｍｌのポリ－ＩＣ（Ｓｉｇｍａ）の用量でタンパク質を追加し、５０分間３７℃でインキュベートした。ＴＣＡを５％の最終濃度まで追加し、氷上で放置した。サンプルをろ過して沈殿物を除去し、ＯＤ２６０の読み取りのために、ろ液を収集した。結果は、図２に示されている。ＲＳＬＶ－１３２およびＲＳＬＶ－１４５（これらは両方とも、構築物１モル当量当たり２つのＲＮａｓｅ部分を含有する）は両方とも活性であり、ＲＳＬＶ－１４５は、ＲＳＬＶ－１３２よりも活性であった。モル基準で１つのＲＮａｓｅ部分のみを含有する他の構築物（ＲＳＬＶ－１４７、ＲＳＬＶ－１５２、ＲＳＬＶ－１５３およびＲＳＬＶ－３２７）は同程度であり、ＲＳＬＶ－１３２と一致していた。驚くべきことに、ＲＳＬＶ－１４８およびＲＬＳＶ－１４９は、ＲＳＬＶ－１３２および他の単一ＲＮａｓｅ構築物よりも高い活性を有していた。これらの構築物はそれぞれ、ＦｃドメインのＣ末端に付着されたＲＮａｓｅ部分を含有する。
ＯＤＮ－２００６－Ｇ５（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｔｌｒｌ－２００６ｇ５）（ＴＬＲ９のＤＮＡオリゴヌクレオチドアゴニスト）を使用して、ＤＮａｓｅ１ドメインを含有する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質のＤＮａｓｅ１活性を測定した。２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、０．２４ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌの範囲の投与量のタンパク質をＯＤＮ－２００６－Ｇ５と共に３７℃で１時間インキュベートした。反応混合物を、ＴＬＲ９アゴニストに応答してアルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を分泌するように操作したｈＴＬＲ９ ＨＥＫＢｌｕｅ細胞に３７℃で一晩適用した。培養培地を回収し、比色基質を使用してＳＥＡＰについてアッセイし、次いで、ＯＤ６２０で読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ（登録商標）バージョン６．０ｅソフトウェアを使用して、ＩＣ５０値を計算した。結果は、図３に示されている。６つの構築物（ＲＳＬＶ－１４５、ＲＳＬＶ－１４７、ＲＳＬＶ－１４８、ＲＳＬＶ－１４９、ＲＳＬＶ－１５２およびＲＳＬＶ－１５３）はすべて、ロバストなＤＮａｓｅ活性を有しており、組換え体ｈｕＤＮａｓｅ１よりも少なくとも５０００倍活性であった。ＲＳＬＶ－１４５は、他のヘテロ二量体構築物およびＲＳＬＶ－３２７よりも約２倍活性であると思われたが、これはおそらく、他の構築物におけるＤＮａｓｅドメインが１つであることと比較して、ＲＳＬＶ－１４５におけるＤＮａｓｅドメインは２つであることに起因する。ＲＳＬＶ－１５２は、一貫して最低活性の構築物であった。
実施例４
インビトロにおける最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有効性
サイトカイン発現に対する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の効果
正常患者およびループス患者からヒトＰＢＭＣを単離し、培養する。実施例２の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有無の下、様々な刺激性ＴＬＲリガンド、共刺激抗体、免疫複合体および正常血清または自己免疫血清で細胞を処理する。様々な時点（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間など）において培養上清を収集し、例えばＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．製の市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ヒトＩＬ－６、ＩＬ－８、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－αおよびＴＮＦ－αを含む一団のサイトカインのレベルを測定する。有効な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、対照と比べて、刺激ＰＢＭＣによって産生されるサイトカインのレベルを減少させると予想される。
リンパ球活性化受容体発現に対する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の効果
正常患者およびループス患者からヒトＰＢＭＣを単離し、培養する。実施例２の最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の有無の下、様々な刺激性ＴＬＲリガンド、共刺激抗体、免疫複合体および正常血清または自己免疫血清で細胞を処理する。次いで、細胞をマルチカラーフローサイトメトリーに供して、刺激後の様々な時点（例えば、６時間、１２時間、２４時間、４８時間など）において、当技術分野で認められているルーチンな方法を使用して、リンパ球活性化受容体ＣＤ５、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＣＤ８０、ＣＤ８６およびＣＤ２５の発現を測定する。これらの受容体のための適切な抗体は、例えばＢＤ／ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎから市販されている。有効な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、対照と比較して、刺激ＰＢＭＣにおけるリンパ球活性化受容体の発現を減少させると予想される。
形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）インターフェロンアウトプットに対する最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の効果
当技術分野で認められている方法または市販のキット、例えばＥａｓｙＳｅｐ（商標）Ｈｕｍａｎ ＥｐＣＡＭ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、健常志願者由来のｐＤＣを単離する。例えば、９６ウェル平底プレートにおいて、０．１ｍｌの適切な培地（例えば、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、５５μＭ β－メルカプトエタノール、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有する完全ＲＰＭＩ培地）中、５×１０４～２．５×１０５個／ウェルの範囲の密度で、単離ｐＤＣを培養する。培養培地によって１：５の比率で希釈した個々のＳＬＥ患者由来の血清または血漿を追加することによって、培養ｐＤＣを活性化し、０．１ｍｌのこれらのサンプルを細胞含有ウェルに追加する（最終患者血清濃度は１０％である）。培養物を３７℃で４０時間インキュベートし、その後、馴化培地を回収し、市販のＥＬＩＳＡキットを使用して、ＩＦＮα含有量について評価する。健常志願者から得た血清サンプルを対照として使用する。最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質の影響を評価するために、最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質（１～１０μｇ／ｍｌ）でＳＬＥ患者の血清または血漿を３０分間前処理し、ｐＤＣ培養物に追加する。有効な最適化二重ヌクレアーゼ融合タンパク質は、核酸含有ＩＣを分解する結果として、産生されるＩＦＮαの量を減少させると予想される。
好ましい実施形態および様々な代替的な実施形態を参照して、本発明を特に示して説明したが、当業者であれば、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、形態および詳細における様々な変更が行われ得ると理解するであろう。
本明細書の本文内で引用されている参考文献、発行特許および特許出願はすべて、任意の目的のために、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
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Claims (26)

  1. 第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体であって、前記第１のポリペプチドが配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体。
  2. 第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体であって、前記第１のポリペプチドが配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体。
  3. 第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体であって、前記第１のポリペプチドが配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体。
  4. 第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体であって、前記第１のポリペプチドが配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体。
  5. 第１のポリペプチド配列および第２のポリペプチド配列を含むヘテロ二量体であって、前記第１のポリペプチドが配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含み、前記第２のポリペプチドが配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含む、ヘテロ二量体。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体と、薬学的に許容され得る担体とを含む、組成物。
  7. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  8. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を形成するための組成物であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体の前記第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、前記ヘテロ二量体が、
    配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、または
    配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む
    ことを特徴とする、組成物。
  9. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を形成するための組成物であって、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体の前記第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含み、前記ヘテロ二量体が、
    配列番号３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号７に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号８に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号１５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号１６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、
    配列番号５に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号６に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含むか、または
    配列番号１３に記載されているアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドと、配列番号１４に記載されているアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドとを含む
    ことを特徴とする、組成物。
  10. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体の前記第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、前記第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列とを含む、核酸分子。
  11. 前記核酸分子が組換え発現ベクターとして存在する、請求項８に記載の組成物。
  12. 前記核酸分子が組換え発現ベクターとして存在する、請求項９に記載の組成物。
  13. 請求項７または１０に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
  14. 宿主細胞が前記組換え発現ベクターにより形質転換される、請求項１１または１２に記載の組成物。
  15. 請求項１３に記載の組換え発現ベクターにより形質転換された、宿主細胞。
  16. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を作製する方法であって、前記ヘテロ二量体をコードする核酸配列を含む宿主細胞を提供すること；および前記ヘテロ二量体が発現される条件下で前記宿主細胞を維持することを含む、方法。
  17. 請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を発現するために形質転換された宿主細胞を培養する工程を含む、ヘテロ二量体を製造する方法。
  18. ヘテロ二量体を製造する方法であって、請求項１５に記載の細胞を、前記ヘテロ二量体の発現を許容する条件下で維持する工程を含む、方法。
  19. 前記ヘテロ二量体を取得する工程をさらに含む、請求項１６～１８のいずれか一項に記載の方法。
  20. 異常免疫応答に関連する状態を処置または予防するための、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体を含む、組成物。
  21. 前記状態が自己免疫疾患である、請求項２０に記載の組成物。
  22. 前記自己免疫疾患が、インスリン依存性真性糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験型ブドウ膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺中毒症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早発閉経、男性不妊症、若年型糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、特発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、活動性慢性肝炎Ｈｂｓ－ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性筋炎、皮膚筋炎、円板状ＬＥ、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）および結合組織病からなる群より選択される、請求項２１に記載の組成物。
  23. 前記自己免疫疾患がＳＬＥである、請求項２１に記載の組成物。
  24. 前記自己免疫疾患がシェーグレン症候群である、請求項２１に記載の組成物。
  25. ＳＬＥを処置するための、薬学的に許容され得る担体と、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体とを含む組成物であって、前記ヘテロ二量体の量が、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する免疫複合体を分解するために有効である、組成物。
  26. シェーグレン症候群を処置するための、薬学的に許容され得る担体と、請求項１～５のいずれか一項に記載のヘテロ二量体とを含む組成物であって、前記ヘテロ二量体の量が、ＲＮＡ、ＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含有する免疫複合体を分解するために有効である、組成物。
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