JP7296467B2 - Ｈｌａ－ａ２／ｍａｇｅ－ａ４に結合する抗体 - Google Patents

Ｈｌａ－ａ２／ｍａｇｅ－ａ４に結合する抗体 Download PDF

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Description

本発明は、全般的に、例えば、Ｔ細胞を活性化するための、多重特異性抗体を含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体に関する。加えて、本発明は、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、並びにそのようなポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞に関する。本発明は、さらに、同抗体を生成するための方法、及び同抗体を疾患の治療に使用する方法に関する。
ＭＡＧＥ－Ａ４（黒色腫関連抗原４）は、がん精巣抗原（ＣＴＡ）のＭＡＧＥファミリーのメンバーである。タンパク質のＭＡＧＥ－Ａファミリーは、Ｘｑ２６－２８でクラスター化された、保存ドメイン（ＭＡＧＥ相同性ドメイン、ＭＨＤ）の存在を特徴とする１２の高度に相同性の遺伝子を包含する。２０年以上前に発見されたにも関わらず、ＭＡＧＥタンパク質の生物的機能は依然としてよく分かっていない。その発現パターンに基づいて、ＭＡＧＥファミリーは２つのサブファミリー、即ちタイプ－Ｉとタイプ－ＩＩに分けることができ、ＭＡＧＥ－Ａグループは、発現が生殖系列及びがん細胞に制限されるタイプ－Ｉのサブファミリーに属する。タイプ－ＩのＭＡＧＥの過剰発現とがんの悪性度、腫瘍増殖、及び患者の予後不良の間の相関が、多くの報告によって示唆された。ＭＡＧＥ－Ａ４などの細胞内タンパク質は、プロテアソーム内で分解され、処理され、Ｔ細胞エピトープとしての主要組織適合複合体（ＭＨＣ）Ｉにより細胞表面に提示されうる。したがって、ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）などのＭＡＧＥ－Ａ４誘導ペプチドは、ＨＬＡ－Ａ２の関連で細胞表面に提示され、Ｔ細胞認識をトリガーすることができる。
その発現パターンを考慮すると、ＭＡＧＥ－Ａ４はがん治療法の有望な標的でありうる。がん（免疫）治療法の標的としてＭＡＧＥ－Ａ４を活用するためにこれまでとられた手法は、多くがＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とするＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の開発と、遺伝子操作されたＴ細胞（国際公開第２０１７／１７４８２４号）又は融合分子（国際公開第２０１７／１７５００６号）におけるその使用に焦点を当てたものである。その二重特異性誘導体（加えてＣＤ３を標的とする）を含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４複合体に対するＴＣＲ様抗体も生成された（国際公開第２０１６／１９９１４１号）。
標的細胞上の表面抗原とＴ細胞上のＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原とに結合する二重特異性抗体（本明細書ではＴ細胞二重特異性抗体又は「ＴＣＢ」とも呼ぶ）は、様々ながんの治療にとって極めて有望である。そのような抗体がその標的の両方に同時に結合することで、標的細胞とＴ細胞の間の一時的相互作用が強まり、Ｔ細胞受容体の架橋、任意の細胞傷害性Ｔ細胞のその後の活性化及びそれに続く標的細胞の溶解が引き起こされる。標的細胞殺傷におけるその力価を考慮すると、標的及び標的抗体の特異性の選択は、Ｔ細胞二重特異性抗体が標的上及び標的外の毒性を回避するために最も重要である。ＭＡＧＥ－Ａ４などの細胞内タンパク質は魅力的な標的を代表しているが、細胞表面上の細胞内タンパク質由来のペプチド抗原を提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に結合するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）様抗体にしか到達できない。ＴＣＲ様抗体に固有の問題は、ＭＨＣ分子自体、又は所望のペプチド以外のペプチドを提示するＭＨＣ分子との交差反応性の可能性であり、これは、臓器又は組織の選択性を損ないうる。
本発明は、多重特異性（例えば二重特異性）抗体を含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合し、治療目的にとって特に好ましい特性を有する新規抗体を提供する。特に、（多重特異性）抗体は、良好な親和性及び顕著な特異性でＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合し、良好な有効性及び生産可能性と低い毒性及び好ましい薬物動態特性とを兼ね備えている。
一態様において、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、
（ｉ）配列番号２５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様において、第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様において、抗体は、多重特異性、特に二重特異性抗体である。
一態様において、抗体は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む。
一態様において、第２の抗原は、特にＣＤ３、最も詳細にはＣＤ３εといったＴ細胞活性化抗原である。
一態様において、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｉｉ）配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５４のＬＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号６６のアミノ酸配列少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
一態様において、抗体は、第３の抗原結合ドメインを含む。一態様において、第３の抗原ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する。第３の抗原結合ドメインは、単独で又は組み合わせで、第１の抗原結合ドメインに関連して本明細書に記載される特徴のいずれかを含みうる。一態様において、第３の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと同一である。
一態様において、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン（存在する場合）及び／又は第３の抗原結合ドメイン（存在する場合）はＦａｂ分子である。
一態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬ及びＶＨ又は定常ドメインＣＬ及びＣＨ１、特に可変ドメインＶＬ及びＶＨが、互いに置き換わっているＦａｂ分子である。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合されている。
一態様では、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている。
一態様では、抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている。
一態様では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特に、ＩｇＧ１のＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体への結合を低減する、及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
発明のさらなる態様によれば、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドと、本発明の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞とが提供される。
別の態様では、（ａ）抗体の発現に適した条件下で本発明の宿主細胞を培養する工程と、任意選択的に、（ｂ）抗体を回収する工程とを含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を生成する方法が提供される。本発明は、本発明の方法によって生成されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体も包含する。
本発明は、本発明の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
本発明には、本発明の抗体及び医薬組成物を使用する方法も包含される。一態様では、本発明は、医薬としての使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物を提供する。一態様では、疾患の治療における使用のための、本発明による抗体又は医薬組成物が提供される。具体的な態様では、疾患は、がんである。
また、医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用、疾患、特にがんの治療のための医薬の製造における本発明による抗体又は医薬組成物の使用が提供される。本発明はまた、個体において疾患を治療する方法であって、前記個体に有効量の本発明による抗体又は医薬組成物を投与することを含む方法を提供する。具体的な態様では、疾患は、がんである。
本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成。（Ａ、Ｄ）「１＋１ ＣｒｏｓｓＭａｂ」分子の図である。（Ｂ、Ｅ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｃ、Ｆ）「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択的修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意選択的に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成。（Ｇ、Ｋ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｈ、Ｌ）「１＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｉ、Ｍ）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｊ、Ｎ）Ｃｒｏｓｓｆａｂ成分とＦａｂ成分の順序が異なる（「反転型」）２個のＣｒｏｓｓＦａｂを有する「２＋１ ＩｇＧ Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択的修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意選択的に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成。（Ｏ、Ｓ）「Ｆａｂ－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｐ、Ｔ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－Ｆａｂ」分子の図である。（Ｑ、Ｕ）「（Ｆａｂ）２－Ｃｒｏｓｓｆａｂ」分子の図である。（Ｒ、Ｖ）「Ｃｒｏｓｓｆａｂ－（Ｆａｂ）２」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択的修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意選択的に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 本発明の二重特異性抗原結合分子の例示的構成。（Ｗ、Ｙ）「Ｆａｂ－（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２」分子の図である。（Ｘ、Ｚ）「（Ｃｒｏｓｓｆａｂ）２－Ｆａｂ」分子の図である。黒点：ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインにおける任意選択的修飾。＋＋、－－：ＣＨ１及びＣＬドメインにおいて任意選択的に導入される反対の電荷のアミノ酸。Ｃｒｏｓｓｆａｂ分子は、ＶＨ領域とＶＬ領域の交換を含むものとして示されるが、ＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインに電荷修飾が導入されていない態様では、代替的にＣＨ１ドメインとＣＬドメインの交換を含む。 実施例において調製されるＴ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体分子を示している。試験されたすべてのＴＣＢ抗体は、電荷修飾（ＣＤ３バインダーにおけるＶＨ／ＶＬ交換、ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーにおける電荷修飾、ＥＥ＝１４７Ｅ，２１３Ｅ；ＲＫ＝１２３Ｒ、１２４Ｋ）を有する「２＋１ ＩｇＧ ＣｒｏｓｓＦａｂ、反転型」として生成された。 異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子によって誘導された、ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）（Ａ）又は無関係なペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ１ｐ１５７－１６５：（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ））（Ｂ）でパルスされたＴ２細胞のＴ細胞媒介性の溶解（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。ＳＤによる三連が示されている。 ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）（Ａ）又は無関係なペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ１ｐ１５７－１６５：（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ））（Ｂ）でパルスされたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞及びＴ２細胞上での異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子のヒトＣＤ３への同時結合時に、発光により決定したＪｕｒｋａｔ活性化。ＳＤによる三連が示されている。 様々な適応症の種々のＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性の溶解と、異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子により誘導されたＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４－ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞との対比である（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。（Ａ）分子Ａ、（Ｂ）分子Ｄ、（Ｃ）分子Ｅ、（Ｄ）分子Ｂ、（Ｅ）分子Ｃ、（Ｆ）分子Ｆ。ＳＤによる三連が示されている。 様々な適応症の種々のＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４－腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性の溶解と、異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子により誘導されたＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋ ＮＣＩ－Ｈ１７５５細胞との対比である（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。（Ａ）分子Ａ、（Ｂ）分子Ｃ、（Ｃ）分子Ｅ、（Ｄ）分子Ｂ、（Ｅ）分子Ｄ、（Ｆ）分子Ｆ。ＳＤによる三連が示されている。 アラニンスキャンによるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢに対するＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドの結合残基の同定。（Ａ）異なるＡＬＡスキャンペプチドでパルスされたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞及びＴ２細胞上での異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子のヒトＣＤ３への同時結合時に、Ｊｕｒｋａｔ活性化により決定したＥＣ５０値。パネル（Ｂ）は、異なる変異ＡＬＡスキャンペプチドに関するＥＣ５０のｘ倍率変化を示す。重要な接触残基が太字で示されている。 ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又は示された３３個の予測標的外ペプチドのうちの１つでパルスされたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞及びＴ２細胞上での異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子のヒトＣＤ３への同時結合時に、発光により決定したＪｕｒｋａｔ活性化。ＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルとＰＯＴＰ誘導シグナルの比がパーセントで示されている（（ＣＰＳ［ＰＯＴＰ］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）／（ＣＰＳ［ＭＡＧＥ－Ａ４］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）＊１００）。比＞２％である標的外ペプチドが、関連性ありと考慮され、グレーで示されている。 ５０９個の予測標的外ペプチド上でＪｕｒｋａｔ活性化アッセイにより評価した、分子Ｄについて同定された標的外ペプチドのまとめ。ＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルとＰＯＴＰ誘導シグナルの比がパーセントで示されている（（ＣＰＳ［ＰＯＴＰ］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）／（ＣＰＳ［ＭＡＧＥ－Ａ４］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）＊１００）。実施した２つのアッセイのうちの１つにおいてシグナル＞２％を示したすべての標的外ペプチドが示されている。 Ｊｕｒｋａｔ活性化アッセイにおける分子Ｄの同定された標的外ペプチドの検証。対象とする標的外ペプチドでパルスしたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞及びＴ２細胞上での分子ＤのヒトＣＤ３への同時結合時に測定された発光が示されている。 ５０９個の予測標的外ペプチド上でＪｕｒｋａｔ活性化アッセイにより評価した、分子Ｇについて同定された標的外ペプチドのまとめ。ＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルとＰＯＴＰ誘導シグナルの比がパーセントで示されている（（ＣＰＳ［ＰＯＴＰ］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）／（ＣＰＳ［ＭＡＧＥ－Ａ４］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）＊１００）。シグナル＞２％を示したすべての標的外ペプチドが示されている。 ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）でパルスしたＩｇＧ分子のＦｃ部分及びＴ２細胞においてＰＧＬＡＬＡ変異指向性ＴＣＲを発現するように遺伝子操作されたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（Ａ）又はＭＡＧＥ－Ａ４－／ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞（Ｂ）に対する、異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧ分子のＰＧＬＡＬＡ修飾Ｆｃドメインの同時結合時のＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ活性化。ＳＤによる三連が示されている。 異なるＭＡＧＥ－Ａ４とＣＤ３バインダーの組み合わせを含む異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子により誘導された、様々な適応症の種々のＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性の溶解（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。ＳＤによる三連が示されている。（Ａ）ＵＭＵＣ－３細胞、（Ｂ）Ａ３７５細胞、（Ｃ）ＮＣＩ－Ｈ２０２３。 ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒによって誘導された、Ａ３７５細胞、ＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作されたＡ３７５細胞及びＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウトを有するＡ３７５細胞のＴ細胞媒介性の溶解（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。 ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒによって誘導された、Ａ３７５細胞、ＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作されたＡ３７５細胞及びＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウト（ｋｏ）を有するＡ３７５細胞のＴ細胞媒介性の溶解時のサイトカイン放出（Ｅ：Ｔ＝１０：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。 ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒによる治療時の異なるＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株の増殖のリアルタイム評価（Ｅ：Ｔ＝５：１、ヒトＰＢＭＣエフェクター細胞）。（Ａ）ＮＣＩ－Ｈ１７５５；（Ｂ）ＵＭＵＣ－３；（Ｃ）Ａ３７５；（Ｄ）ＳｃａＢｅｒ；（Ｅ）ＮＣＩ－Ｈ１７０３；（Ｆ）ＮＣＩ－Ｈ２０２３。 実施例１３に記載される、ヒト化マウスのＩＭ－９異種移植にＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒを用いた試験設計及び用量設定有効性試験群。 実施例１３に記載される、ヒト化マウスのＩＭ－９異種移植にＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒを用いた用量設定有効性試験群のすべてにおける腫瘍増殖動態。（Ａ）平均＋／－ＳＥＭ；（Ｂ－Ｅ）マウス当たりの個々の腫瘍増殖。 実施例１３に記載される、ヒト化マウスのＩＭ－９異種移植にＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ分子Ｒを用いた用量設定有効性試験における腫瘍中Ｔ細胞浸潤（Ｂ）。
Ｉ．定義
用語は、以下に別段の定義がない限り、当技術分野で一般的に使用されるように本明細書で使用される。
本明細書で使用される場合、抗原結合ドメインなどに関する「第１」、「第２」又は「第３」という用語は、各タイプの部分が２つ以上存在するときに区別の便宜のために使用される。これらの用語の使用は、そのように明示的に示されていない限り、部分の特定の順序又は向きを与えることを意図していない。しかしながら、概して、本明細書ではＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインを「第１の抗原結合ドメイン」と（そしてＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合するさらなる抗原結合ドメインが存在する場合，「第３の抗原結合ドメイン」と）呼び、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインを本明細書で「第２の抗原結合ドメイン」と呼ぶ。
用語「抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体」及び「ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体」は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を標的とする診断剤及び／又は治療剤として有用であるために十分な親和性でＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合することのできる抗体を指す。一態様において、無関係な非ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質に対する抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の結合度は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定したとき、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対する抗体の結合の約１０％未満である。一部の態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体は、≦１μＭ、≦５００ｎＭ、≦２００ｎＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、又は≦０．１ｎＭの解離定数（ＫＤ）を有する。
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用又は非特異的な相互作用とは判別することができることを意味する。本発明の抗体の特異性を決定するための適切なアッセイは、本明細書では、例えば後述の実施例９に記載されている。一形態では、無関係なタンパク質に対する抗体の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗体の結合の約１０％未満である。
「抗体」という用語は、本明細書では最も広い意味で使用され、限定されるものではないが、それらが所望の抗原結合活性を呈する限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、及び抗体断片を含めた、様々な抗体構造を包含する。
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ及びｓｃＦａｂ）、単一ドメイン抗体、及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の抗体断片の総説としては、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ａｎｄ Ｈｕｄｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１２６－１１３６（２００５）を参照されたい。
「完全長抗体」、「インタクト抗体」及び「全抗体」という用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で互換可能に用いられる。
用語「モノクローナル抗体」は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、即ち、集合に含まれる個々の抗体は、同一である及び／又は同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異又はモノクローナル抗体調製物の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は含まれず、このようなバリアントは一般的に少量で存在する。一般に異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基を対象とする。したがって、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするものと解釈すべきではない。例えば、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法、組み換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法、例えば、本明細書に記載のモノクローナル抗体を作製するためのそのような方法及び他の例示的な方法を含むが、これらに限定されない多様な技術によって作製されうる。
「単離された」抗体は、その自然環境の構成成分から分離された抗体である。いくつかの態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー）方法によって決定したとき、純度９５％又は９９％を超えるまで精製される。抗体純度の評価のための方法の総説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ． Ｂ ８４８：７９－８７（２００７）を参照されたい。いくつかの態様では、本発明により提供される抗体は、単離抗体である。
「キメラ」抗体という用語は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の供給源又は種に由来し、重鎖及び／又は軽鎖の残りの部分が異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。
「ヒト化」抗体は、非ヒトＣＤＲ由来のアミノ酸残基、及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。一部の態様では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインのすべてを実質的に含み、そのドメイン中ではＣＤＲのすべて又は実質的にすべてが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲのすべて又は実質的にすべてがヒト抗体のＦＲに対応する。このような可変ドメインは、本明細書では「ヒト化可変領域」と呼ばれる。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
「ヒト抗体」は、ヒト若しくはヒト細胞によって生成されるか、又はヒト抗体のレパートリー若しくは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。一部の態様では、ヒト抗体は、非ヒトトランスジェニック哺乳動物、例えば、マウス、ラット、又はウサギに由来する。一部の態様では、ヒト抗体は、ハイブリドーマ細胞株に由来する。ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片も、本発明のヒト抗体又はヒト抗体断片であると考えられる。
用語「抗原結合ドメイン」は、ある抗原の一部又は全部に結合し、且つある抗原の一部又はすべてに相補的な領域を含む抗体の一部を指す。抗原結合ドメインは、例えば、１つ又は複数の抗体可変ドメイン（抗体可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましい態様では、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）と抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）とを含む。
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は、一般に同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と相補性決定領域（ＣＤＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ ｅｔ ａｌ．，Ｋｕｂｙ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６ｔｈ ｅｄ．，Ｗ．Ｈ． Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．，ｐａｇｅ ９１（２００７）を参照されたい。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するために十分でありうる。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体由来のＶＨ又はＶＬドメインを使用してそれぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして単離してもよい。例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５０：８８０－８８７（１９９３）；Ｃｌａｒｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４－６２８（１９９１）を参照されたい。可変領域配列と組み合わせて本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）によって記載される番号付けシステムを指す。
本明細書で使用される場合、重鎖及び軽鎖のすべての定常領域及びドメインのアミノ酸位置は、本明細書では「Ｋａｂａｔによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ番号付け」と呼ばれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）に記載されるＫａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされる。具体的には、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）の６４７－６６０頁参照）を、カッパ及びラムダアイソタイプの軽鎖定常ドメインＣＬに使用し、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付けシステム（６６１－７２３頁を参照）を、重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）に使用し、この場合には、「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け」又は「Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け」と言及することによってさらに明確にしている。
本明細書で使用する場合、用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列内で超可変であり、抗原結合特異性を決定する、抗体可変ドメインの領域、例えば「相補性決定領域」（ＣＤＲ）の各々を指す。通常、抗体は６個のＣＤＲ、即ちＶＨに３個（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）、ＶＬに３個（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）を含む。本明細書における例示的なＣＤＲとしては、
（ａ）アミノ酸残基２６－３２（Ｌ１）、５０－５２（Ｌ２）、９１－９６（Ｌ３）、２６－３２（Ｈ１）、５３－５５（Ｈ２）及び９６－１０１（Ｈ３）に生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １９６：９０１－９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４－３４（Ｌ１）、５０－５６（Ｌ２）、８９－９７（Ｌ３）、３１－３５ｂ（Ｈ１）、５０－６５（Ｈ２）及び９５－１０２（Ｈ３）に生じるＣＤＲ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；並びに
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ－３６（Ｌ１）、４６－５５（Ｌ２）、８９－９６（Ｌ３）、３０－３５ｂ（Ｈ１）、４７－５８（Ｈ２）及び９３－１０１（Ｈ３）に生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２６２：７３２－７４５（１９９６））
が挙げられる。
別段の指示がない限り、ＣＤＲは、上記Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従い決定される。当業者は、ＣＤＲの表記は、上記Ｃｈｏｔｈｉａ、上記ＭｃＣａｌｌｕｍ、又は、任意の他の科学的に認可された命名システムに従い決定することができることを理解するであろう。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、通常ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序で現れる：ＦＲ１－ＨＣＤＲ１（ＬＣＤＲ１）－ＦＲ２－ＨＣＤＲ２（ＬＣＤＲ２）－ＦＲ３－ＨＣＤＲ３（ＬＣＤＲ３）－ＦＲ４。
別段の指示がない限り、ＣＤＲ残基及び可変ドメイン内の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、本明細書では上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．に従って番号付けされる。
本明細書の目的のために、「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義されるように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」アクセプターヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよいか、又はアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの態様では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、又は２以下である。いくつかの態様では、ＶＬアクセプターヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列又はヒトコンセンサスフレームワーク配列と配列が同一である。
「ヒトコンセンサスフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨフレームワーク配列の選択において、最も一般的に生じるアミノ酸残基を表すフレームワークである。通常、ヒト免疫グロブリンＶＬ又はＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループから行われる。通常、配列のサブグループは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ ＭＤ（１９９１），ｖｏｌｓ． １－３にあるようなサブグループである。
用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端に向かって、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＨ）と、それに続く重鎖定常領域とも呼ばれる３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）とを有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端に向かって、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる可変ドメイン（ＶＬ）と、それに続く軽鎖定常領域とも呼ばれる定常軽鎖（ＣＬ）ドメインとを有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）又はμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類のうちの１つに割り当てられ、このうちのいくつかは、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）及びα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプにさらに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうちの１つに割り当てることができる。免疫グロブリンは、本質的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する２つのＦａｂ分子と１つのＦｃドメインからなる。
抗体又は免疫グロブリンの「クラス」は、抗体又は免疫グロブリンの重鎖が保有する定常ドメイン又は定常領域の種類を指す。抗体の５つの主要なクラス、即ち：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭが存在し、これらのうちの複数は、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。
「Ｆａｂ分子」は、免疫グロブリンの重鎖（「Ｆａｂ重鎖」）のＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインと、免疫グロブリンの軽鎖（「Ｆａｂ軽鎖」）のＶＬドメイン及びＣＬドメインとからなるタンパク質を指す。
「クロスオーバー」Ｆａｂ分子（「Ｃｒｏｓｓｆａｂ」とも呼ばれる）は、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメイン又は定常ドメインが交換された（即ち、互いにより置き換えられた）Ｆａｂ分子を意味し、即ち、クロスオーバーＦａｂ分子は、軽鎖可変ドメインＶＬ及び重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１（ＶＬ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖と、重鎖可変ドメインＶＨ及び軽鎖定常ドメインＣＬ（ＶＨ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）で構成されるペプチド鎖とを含む。明確性のために、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖定常ドメイン１ ＣＨ１を含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。逆に、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子において、重鎖可変ドメインＶＨを含むペプチド鎖は、本明細書では（クロスオーバー）Ｆａｂ分子の「重鎖」と呼ばれる。
これとは対照的に、「従来の」Ｆａｂ分子は、その天然のフォーマットのＦａｂ分子、即ち、重鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される重鎖（ＶＨ－ＣＨ１、Ｎ末端からＣ末端方向に）と、軽鎖可変ドメイン及び定常ドメインで構成される軽鎖（ＶＬ－ＣＬ、Ｎ末端からＣ末端方向に）とを含むＦａｂ分子を意味する。
「Ｆｃドメイン」又は「Ｆｃ領域」という用語は、本明細書では、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を規定するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域と変異Ｆｃ領域とを含む。一態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びる。しかしながら、宿主細胞によって産生される抗体は、重鎖のＣ末端から１つ又は複数の、特に１つ又は２つのアミノ酸の翻訳後開裂を受けてもよい。したがって、完全長重鎖をコードする特定の核酸分子の発現によって、宿主細胞によって産生する抗体は、完全長重鎖を含んでいてもよいか、又は全長重鎖の開裂したバリアントを含んでいてもよい。これは、重鎖の最終的な２つのＣ末端アミノ酸がグリシン（Ｇ４４６）及びリジン（Ｋ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）である場合でありうる。したがって、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）、又はＣ末端グリシン（Ｇｌｙ４４６）及びリジン（Ｌｙｓ４４７）が存在してもよく、又は存在していなくてもよい。Ｆｃ領域（又は本明細書に定義されるＦｃドメインのサブユニット）を含む重鎖のアミノ酸配列は、別段の指示がない場合、本明細書ではＣ末端グリシン－リジンジペプチドを含まないもが示される。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン－リジンジペプチド（Ｇ４４６及びＫ４４７、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。一態様では、本発明による抗体に含まれる、本明細書に明記されるＦｃ領域（サブユニット）を含む重鎖は、さらなるＣ末端グリシン残基（Ｇ４４６、Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１（上記も参照）に記載される、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。Ｆｃドメインの「サブユニット」は、本明細書で使用される場合、二量体Ｆｃドメインを形成する２つのポリペプチドのうちの１つ、即ち、安定した自己会合が可能な、免疫グロブリン重鎖のＣ末端定常領域を含むポリペプチドを指す。例えば、ＩｇＧ Ｆｃドメインのサブユニットは、ＩｇＧ ＣＨ２及びＩｇＧ ＣＨ３定常ドメインを含む。
「融合した」が意味するのは、構成要素（例えばＦａｂ分子及びＦｃドメインサブユニット）が、ペプチド結合によって直接的に又は１つ若しくは複数のペプチドリンカーを介して連結されていることである。
「多重特異性」という用語は、抗体が、少なくとも２つの別個の抗原決定基に特異的に結合することができることを意味する。多重特異性抗体は、例えば、二重特異性抗体でありうる。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それらの各々が異なる抗原決定基に対して特異的である。一部の態様では、多重特異性（例えば二重特異性）抗体は、２つの抗原決定基、特に、２つの別個の細胞で発現する２つの抗原決定基に同時に結合することができる。
用語「価数」は、本明細書で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の抗原結合部位の存在を示す。したがって、用語「抗原に対する一価の結合」は、抗原結合分子内の抗原に特異的な１つ（及び１つを超えない）抗原結合部位の存在を示す。
「抗原結合部位」は、抗原との相互作用を与える抗原結合分子の部位、即ち１つ又は複数のアミノ酸残基を指す。例えば、抗体の抗原結合部位は、相補性決定領域（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。ネイティブ免疫グロブリン分子は、典型的には、２つの抗原結合部位を含み、Ｆａｂ分子は、典型的には、１つの抗原結合部位を有する。
本明細書で使用される場合、「抗原決定基」又は「抗原」という用語は、抗原結合ドメイン－抗原複合体を形成する、抗原結合ドメインが結合するポリペプチド高分子上の部位（例えば、アミノ酸の連続伸長部又は異なる領域の非連続アミノ酸から構成される配座構成）を指す。有用な抗原決定基は、例えば、腫瘍細胞の表面上に、ウイルス感染した細胞の表面上に、他の疾患細胞の表面上に、免疫細胞の表面上に、血清中で遊離して、及び／又は細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に認めることができる。好ましい態様では、抗原はヒトタンパク質である。
本明細書で使用される「Ｔ細胞活性化抗原」は、抗原結合分子との相互作用によりＴ細胞の活性化を誘導することのできる、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の表面上に発現される抗原決定基を指す。具体的には、抗原結合分子のＴ細胞活性化抗原との相互作用は、Ｔ細胞受容体複合体のシグナル伝達のカスケードをトリガーすることによりＴ細胞活性化を誘導することができる。特定の態様では、Ｔ細胞活性化抗原は、ＣＤ３、特にＣＤ３のイプシロンサブユニットである。
「ＣＤ３」は、別段の指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のネイティブＣＤ３を指す。この用語は、「完全長」の、未処理ＣＤ３、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＣＤ３を包含する。この用語は、ＣＤ３の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様では、ＣＤ３は、ヒトＣＤ３、特にヒトＣＤ３のイプシロンサブユニット（ＣＤ３ε）である。ヒトＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号７６（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ０７７６６（バージョン１８９）、又はＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）ＲｅｆＳｅｑ ＮＰ＿０００７２４．１を参照されたい。別の態様では、ＣＤ３は、カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）ＣＤ３、特にカニクイザルＣＤ３εである。カニクイザルＣＤ３εのアミノ酸配列は、配列番号７７（シグナルペプチドを有しない）に示される。また、ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ番号ＢＡＢ７１８４９．１を参照されたい。一部の態様では、本発明の抗体は、異なる種由来のＣＤ３抗原、特にヒトＣＤ３及びカニクイザルＣＤ３の中に保存されているＣＤ３のエピトープに結合する。好ましい態様では、抗体は、ヒトＣＤ３に結合する。
「標的細胞抗原」は、本明細書で使用される場合、標的細胞、例えば、がん細胞又は（「腫瘍細胞抗原」の場合）腫瘍間質細胞といった腫瘍内の細胞の表面に提示された抗原決定基を意味する。本発明によれば、標的細胞抗原は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４、特にＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９である。
「ＭＡＧＥ－Ａ４」は、がん精巣抗原（ＣＴＡ）のＭＡＧＥファミリーのメンバーである「黒色腫関連抗原４」を表す。タンパク質のＭＡＧＥ－Ａファミリーは、Ｘｑ２６－２８でクラスター化された、保存ドメイン（ＭＡＧＥ相同性ドメイン、ＭＨＤ）の存在を特徴とする１２の高度に相同性の遺伝子を包含する。ヒトＭＡＧＥ－Ａ４は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｐ４３３５８（入力バージョン１６３）に記載されており、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４のアミノ酸配列は本明細書の配列番号７４にも示されている。本明細書で使用されるＭＡＧＥ－Ａ４は、別段の指示がない限り、霊長類（例えばヒト）、非ヒト霊長類（例えばカニクイザル）及び齧歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物供給源由来の任意のネイティブＭＡＧＥ－Ａ４を指す。この用語は、「完全長」の、未処理ＭＡＧＥ－Ａ４、及び、細胞内での処理によりもたらされる任意の形態のＭＡＧＥ－Ａ４を包含する。この用語は、ＭＡＧＥ－Ａ４の天然に存在するバリアント、例えば、スプライスバリアント又は対立遺伝子バリアントも包含する。一態様において、ＭＡＧＥ－Ａ４は、ヒトＭＡＧＥ－Ａ４、特に配列番号７４のタンパク質である。
「ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９」又は「ｐ２３０－２３９ペプチド」が意味するのは、アミノ酸配列ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ（配列番号７３；配列番号７４のＭＡＧＥ－Ａ４タンパク質の位置２３０－２３９）を有するペプチド由来のＭＡＧＥ－Ａ４である。
「ＨＬＡ－Ａ２」、「ＨＬＡ－Ａ＊０２」、「ＨＬＡ－Ａ０２」、又は「ＨＬＡ－Ａ＊２」（互換可能に使用される）は、ＨＬＡ－Ａセロタイプ群のヒト白血球抗原セロタイプを指す。ＨＬＡ－Ａ２タンパク質（それぞれのＨＬＡ遺伝子によりコードされた）は、それぞれのクラスＩ ＭＨＣ（主要組織適合複合体）タンパク質のα鎖を構成し、これはβ２ミクログロブリンサブユニットをさらに含む。特異的なＨＬＡ－Ａ２タンパク質は、ＨＬＡ－Ａ２０１（ＨＬＡ－Ａ０２０１、ＨＬＡ－Ａ０２．０１、又はＨＬＡ－Ａ＊０２：０１とも呼ばれる）である。特定の態様では、本明細書に記載のＨＬＡ－Ａ２タンパク質はＨＬＡ－Ａ２０１である。
「ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４」は、ＨＬＡ－Ａ２分子と、ＭＡＧＥ－Ａ４から得られるペプチド（本明細書では「ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド」とも呼ぶ）、具体的にはｐ２３０－２３９ペプチド（「ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９」）の複合体を指す。
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とその結合相手（例えば、抗原）との間の、合計の非共有性相互作用の強度を指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される場合、「結合親和性」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）によって表し得る。親和性は、本明細書に説明するものを含め、当技術分野で公知の十分に確立された方法によって測定することができる。親和性を測定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
「親和性成熟」抗体とは、変化を有しない親抗体と比較して、１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）において１つ又は複数の変化を有し、かかる改変によって抗原に対する抗体の親和性を改善する、抗体を指す。
「結合の低減」、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減は、例えば、ＳＰＲによって測定される場合、それぞれの相互作用についての親和性の低下を指す。明確性のために、この用語は、親和性がゼロ（又は分析方法の検出限界を下回る）まで低減すること、即ち、相互作用が完全に失われることも含む。逆に、「結合の増加」は、それぞれの相互作用に対する結合親和性の増加を指す。
本明細書で使用する「Ｔ細胞活性化」は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害性活性、及び活性化マーカーの発現から選択される、Ｔリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の１つ又は複数の細胞応答を指す。Ｔ細胞活性化を測定するために適したアッセイは、本技術分野で既知であり、本明細書に記載されている。
「Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾」は、ホモ二量体を形成するためのＦｃドメインサブユニットを含むペプチドと同一のポリペプチドとの会合を低減又は防止する、ペプチド骨格の操作又はＦｃドメインサブユニットの翻訳後修飾である。会合を促進する修飾は、本明細書で使用される場合、好ましくは、会合することが望ましい２つのＦｃドメインサブユニット（即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニット）の各々に対して行われる別個の改変を含み、この修飾は、２つのＦｃドメインサブユニットの会合を促進するために互いに相補性である。例えば、会合を促進する修飾は、それぞれ立体的又は静電的に好ましい会合を行うために、Ｆｃドメインサブユニットの一方又は両方の構造又は電荷を変えてもよい。したがって、（ヘテロ）二量体化は、第１のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドと、第２のＦｃドメインサブユニットを含むポリペプチドとの間で起こり、サブユニットの各々に融合するさらなる構成要素（例えば抗原結合ドメイン）が同じではないという意味で、同一ではなくてもよい。いくつかの態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメイン内のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。好ましい態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの各々における別個のアミノ酸変異、具体的にはアミノ酸置換を含む。
「エフェクター機能」という用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例としては、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）の下方制御、及びＢ細胞活性化。
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃドメインによる係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。ヒト活性化Ｆｃ受容体としては、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）及びＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。
抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）は、免疫エフェクター細胞による、抗体で被覆された標的細胞の溶解を引き起こす免疫機構である。標的細胞は、Ｆｃ領域を含む抗体又はその誘導体が、通常はＦｃ領域に対してＮ末端であるタンパク質部分を介して、特異的に結合する細胞である。本明細書で使用される用語「ＡＤＣＣの低減」は、上記に定義されたＡＤＣＣの機序により、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の所与の濃度において、所与の時間内に溶解する標的細胞の数の低減、及び／又はＡＤＣＣの機序により、所与の時間内における所与の数の標的細胞の溶解を達成するために必要な、標的細胞を取り囲む培地中の抗体の濃度の上昇と定義される。ＡＤＣＣの低減は、同じ標準の生成、精製、調合、及び貯蔵の方法（当業者に既知の）を使用して同種の宿主細胞により生成されたが操作されていない、同じ抗体により媒介されるＡＤＣＣに対するものである。例えば、そのＦｃドメインに、ＡＤＣＣを低下させるアミノ酸置換を含む抗体によって媒介されるＡＤＣＣの低下は、Ｆｃドメイン中にこのアミノ酸置換を含まない同じ抗体によって媒介されるＡＤＣＣに対するものである。ＡＤＣＣを測定するために適したアッセイは、当技術分野で周知である（例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号又は国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照）。
本明細書で使用される用語「操作する」、「操作された」、「操作すること」は、天然に存在するポリペプチド又は組み換えポリペプチド又はこれらの断片のペプチド骨格の何らかの操作又は翻訳後修飾を含むと考えられる。操作することは、アミノ酸配列の修飾、グリコシル化パターンの修飾、又は個々のアミノ酸の側鎖基の修飾、及びこれらのアプローチの組み合わせを含む。
「アミノ酸変異」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入及び修飾を包含することを意味している。置換、欠失、挿入及び修飾の任意の組み合わせは、最終構築物が、所望の特徴、例えば、Ｆｃ受容体に対する結合の低減、又は別のペプチドとの会合の増加を有する限り、最終構築物に到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失及び挿入は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端のアミノ酸の欠失及び挿入を含む。好ましいアミノ酸変異はアミノ酸置換である。例えば、Ｆｃ領域の結合特性を変更する目的のために、非保存的アミノ酸置換、即ち、１つのアミノ酸を、構造特性及び／又は化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えることが特に好ましい。アミノ酸の置換には、非天然アミノ酸による置き換え、又は２０の標準的なアミノ酸の天然に存在するアミノ酸誘導体（例えば、４－ヒドロキシプロリン、３－メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５－ヒドロキシリジン）による置き換えが含まれる。アミノ酸変異は、当技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を使用して生じさせることができる。遺伝的方法には、特定部位の突然変異誘発、ＰＣＲ、遺伝子合成などが含まれ得る。遺伝子工学以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変更する方法、例えば化学修飾も有用でありうると考慮される。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書で様々な名称を使用することができる。例えば、Ｆｃドメインの位置３２９のプロリンからグリシンへの置換は、３２９Ｇ、Ｇ３２９、Ｇ３２９、Ｐ３２９Ｇ又はＰｒｏ３２９Ｇｌｙと示すことができる。
基準となるポリペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、配列同一性最大パーセントが得られるように、配列をアライメントし、必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の部分として考慮せずに、基準となるポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定するためのアラインメントは、当技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要とされる任意のアルゴリズムを含め、配列を整列させるために適切なパラメータを決定することができる。或いは、同一性パーセントの値は、配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ－２を使用して生成することができる。ＡＬＩＧＮ－２配列比較コンピュータプログラムは、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．によって作成されたものであり、ソースコードは、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｏｆｆｉｃｅ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，２０５５９）のユーザドキュメンテーションにファイルされており、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｐｙｒｉｇｈｔ Ｒｅｇｉｓｔｒａｔｉｏｎ Ｎｏ．ＴＸＵ５１００８７の下に登録されており、かつ、国際公開第２００１／００７６１１号に記載されている。
別段の指定がない限り、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、又はその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ及びＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ”、ＰＮＡＳ ８５（１９８８）２４４４－２４４８），Ｗ． Ｒ． Ｐｅａｒｓｏｎ（“Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ” Ｍｅｔｈ． Ｅｎｚｙｍｏｌ． ２６６（１９９６）２２７－ ２５８）、及びＰｅａｒｓｏｎ ｅｔ． ａｌ．（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４６（１９９７）２４－３６）により作成されたものであり、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ ｏｒ ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に入手可能である。代替的に、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラム及びデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：－１０；ｅｘｔ：－２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性パーセントは、アウトプットアラインメントヘッダーで与えられる。
「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基、具体的には、プリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）又はウラシル（Ｕ））、糖（即ちデオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。多くの場合、核酸分子は塩基配列によって記載され、それにより、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線状構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’～３’へと表される。本明細書では、核酸分子という用語は、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを含む、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。核酸分子は、線状又は環状でありうる。これに加えて、核酸分子という用語は、センス鎖及びアンチセンス鎖、並びに一本鎖形態及び二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書に記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチド又は天然に存在しないヌクレオチドを含みうる。誘導体化された糖又はホスフェート骨格結合又は化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主又は患者において、インビトロ及び／又はインビボで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、又は修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされた分子の発現を増強するために化学修飾することができ、その結果、ｍＲＮＡを対象に注射して、インビボで抗体を生成することができる（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２３：８１５－８１７、又はＥＰ２ １０１ ８２３号Ｂ１を参照されたい）。
「単離された」核酸分子は、その自然環境の構成要素から分離された核酸分子を指す。単離された核酸分子には、通常核酸分子を含む細胞内に含まれる核酸分子が含まれるが、この核酸分子は、染色体外に存在するか、又はその本来の染色***置とは異なる染色***置に存在する。
「抗体をコードする単離ポリヌクレオチド（又は核酸）」は、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド分子を指し、単一のベクター又は別個のベクターにおいて、このようなポリヌクレオチド分子（複数可）が宿主細胞の１つ又は複数の位置に存在するこのようなポリヌクレオチド分子（複数可）を含む。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、連結している別の核酸を増殖することのできる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、及びベクターが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれるベクターを含む。一部のベクターは、動作可能に連結された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターを、本明細書では「発現ベクター」と呼ぶ。
「宿主細胞」、「宿主細胞株」及び「宿主細胞培養」という用語は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、これらには、初代形質転換細胞及び継代の数に関わらず宿主細胞に由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸含有量の点で完全に同一でない場合があるが、変異を含んでもよい。元の形質転換細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異体の子孫は本明細書に含まれる。宿主細胞は、本発明の抗体を生成するために使用可能な任意の種類の細胞系である。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、哺乳動物培養細胞、例えば、数例を挙げると、ＨＥＫ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯ骨髄腫細胞、Ｐ３Ｘ６３マウス骨髄腫細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞又はハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、本発明の宿主細胞は、真核細胞、特に哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
「医薬組成物」又は「薬学的製剤」という用語は、調製物の中に含有される有効成分の生物活性が有効になるような形態であり、組成物が投与されるであろう対象にとって許容できない有毒を有する追加の成分を何も含有しない調製物を指す。
「薬学的に許容される担体」は、有効成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分であって、対象にとって非毒性である成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は防腐剤が含まれるが、これらに限定されない。
本明細書で使用される場合、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」（及びその文法的な変化形、例えば、「治療する（ｔｒｅａｔ）」又は「治療すること」（ｔｒｅａｔｉｎｇ））は、治療される個体において疾患の本来の経過を変える試行における臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理の経過の間に行うことができる。治療の所望の効果としては、疾患の発症又は再発を予防すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減弱、転移を予防すること、疾患進行速度を低下させること、病状の寛解又は緩和、及び回復又は改善された予後が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの態様では、本発明の抗体は、疾患の発症を遅延させるために、又は疾患の進行を遅らせるために使用される。
「個体」又は「対象」は、哺乳動物である。哺乳動物としては、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及びサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス及びラット）が挙げられる。一部の態様では、個体又は対象は、ヒトである。
薬剤、例えば、医薬組成物の「有効量」は、所望の治療結果又は予防結果を達成するために必要な投与量及び期間において有効な量を指す。
「添付文書」という用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品の使用に関して適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌及び／又は警告についての情報を含む。
ＩＩ．組成物及び方法
本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４及び第２の抗原に結合する多重特異性抗体を含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供する。この（多重特異性）抗体は、例えば有効性及び安全性、薬物動態、並びに生産可能性に関して、治療的用途のための他の好ましい特性との組み合わせで、良好な親和性と顕著な特異性を示す。本発明の抗体は、例えば、がんなどの疾患の治療に有用である。
Ａ．抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体
一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供する。一態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する単離抗体が提供される。一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合する抗体を提供する。
一態様において、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、
（ｉ）配列番号２５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号２５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２９のＬＣＤＲ２、及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト化抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ちヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
一態様では、抗体は、ヒト抗体である。一態様では、抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ちヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様では、ＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト可変領域である。
一態様において、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択される重鎖可変領域配列、特に配列番号３１の重鎖可変領域配列の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列と、少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９又は配列番号４７のアミノ酸配列内で、置換されている、挿入されている、及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは、配列番号７、配列番号１５、配列番号２３、配列番号３１、配列番号３９及び配列番号４７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３１のアミノ酸配列を含み、それにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択される軽鎖可変領域配列、特に配列番号３２の軽鎖可変領域配列の１つ又は複数の軽鎖フレームワーク配列（即ちＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３２のアミノ酸配列と、少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様において、少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体はＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計１～１０個のアミノ酸が、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０又は配列番号４８のアミノ酸配列内で、置換されている、挿入されている、及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３２のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは、配列番号８、配列番号１６、配列番号２４、配列番号３２、配列番号４０及び配列番号４８からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に配列番号３２のアミノ酸配列を含み、それにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む。
一態様において、第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であえるアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。一形態では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬとを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
別の態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、
（ｉ）配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号４８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号１５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号１６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号２４のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号４０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬ
を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨ及び配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬを含む第１の抗原結合ドメインを含む。
さらなる態様では、第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号３２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｉ）配列番号７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号４７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号４８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｉｖ）配列番号１５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号１６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖ）配列番号２３のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号２４のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列；
（ｖｉ）配列番号３９のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３のアミノ酸配列と、配列番号４０のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３のアミノ酸配列
を含む。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号３１のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号３２のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様において、第１の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ；
（ｉ）配列番号７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ；
（ｉ）配列番号４７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号４７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号４８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号４８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ；
（ｉ）配列番号１５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１５のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号１６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号１６のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ；
（ｉ）配列番号２３のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２３のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号２４のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号２４のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ；又は
（ｉ）配列番号３９のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３９のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＨ、及び／又は配列番号４０のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号４０のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％、特に少なくとも９５％又は少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含むＶＬ
を含む。
一態様では、ＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様において、ＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＨは、配列番号３１のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３１のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、ＶＬは、配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様において、ＶＬは、配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＬは、配列番号３２のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号３２のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様では、本発明は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供し、抗体は、上記に提供した態様のいずれかのＶＨ配列及び上記に提供した態様のいずれかのＶＬ配列を含む第１の抗原結合ドメインを含む。
一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む。一態様では、抗体は、ヒト定常領域を含む免疫グロブリン分子、特にヒトＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３及び／又はＣＬドメインを含むＩｇＧクラス免疫グロブリン分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号７９及び８０（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号８１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様では、抗体は、配列番号７９又は配列番号８０のアミノ酸配列、特に配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。一態様では、抗体は、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域は、本明細書に記載のＦｃドメインにおけるアミノ酸変異を含んでもよい。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様では、第１の抗原結合部分は、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。一態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号７９又は配列番号８０のアミノ酸配列、特に配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの態様では、第１の抗原結合ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。
一態様では、抗体は、モノクローナル抗体である。
一態様では、抗体は、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１抗体である。一態様では、抗体は、完全長抗体である。
別の態様では、抗体は、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片、特にＦａｂ分子である。別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。
一態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。好ましい態様では、第１の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。代替的な態様では、第１の抗原結合部分は、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の、可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが、互いによって置き換えられているＦａｂ分子である（即ち第１の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子である）。
さらなる態様では、上記態様のうちのいずれかによる抗体は、以下のセクションＩＩ．Ａ．１．－１０に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で又は組み合わせで組み込んでもよい。
好ましい態様では、抗体は、Ｆｃドメイン、特にＩｇＧ Ｆｃドメイン、さらに詳細にはＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。Ｆｃドメインは、第１及び第２のサブユニットから構成され、Ｆｃドメインバリアントに関連して本明細書の以下（セクションＩＩ．Ａ．１０．）に記載される特徴のうちのいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込んでもよい。
別の好ましい態様では、抗体は、第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む（即ち、抗体は、本明細書の以下（セクションＩＩ．Ａ．９．）にさらに記載される多重特異性抗体である）。
１．抗体断片
一部の態様では、本明細書に提供される抗体は、抗体断片である。
一態様では、抗体断片は、Ｆａｂ分子、Ｆａｂ’分子、Ｆａｂ’－ＳＨ分子、又はＦ（ａｂ’）２分子であり、特に本明細書に記載のＦａｂ分子である。「Ｆａｂ’分子」は、抗体ヒンジ領域から１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端における残基の付加だけ、Ｆａｂ分子とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を保持するＦａｂ’分子である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ分子）と、Ｆｃ領域の一部とを有するＦ（ａｂ’）２分子が得られる。
別の態様では、抗体断片は、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。ダイアボディは、二価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、ＥＰ ４０４，０９７；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）；及びＨｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６４４４－６４４８（１９９３）を参照されたい。トリアボディ及びテトラボディはまた、Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ９：１２９－１３４（２００３）にも記載がある。
さらなる態様では、抗体断片は、一本鎖Ｆａｂ分子である。「一本鎖Ｆａｂ分子」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向において、以下の順序：ａ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬ、ｂ）ＶＬ－ＣＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＨ１、ｃ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ－ＣＨ１－リンカー－ＶＨ－ＣＬのうちの１つを有する。特に、前記リンカーは、少なくとも３０個のアミノ酸、好ましくは３２～５０個のアミノ酸のポリペプチドである。一本鎖Ｆａｂ分子は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。加えて、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位及び可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
別の態様では、抗体断片は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変断片」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは、１０～２５個のアミノ酸の短いポリペプチドであり、通常、柔軟性のためにグリシンが、かつ、溶解性のためにセリン又はトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、又はこの逆に、接続することができる。このタンパク質は、定常領域が取り除かれ、リンカーが導入されているにもかかわらず、元の抗体の特異性を保持する。ｓｃＦｖ断片の総説としては、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ． １１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．，（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ），ｐｐ． ２６９－３１５（１９９４）を参照；国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号も参照されたい。
別の態様では、抗体断片は単一ドメイン抗体である。「単一ドメイン抗体」は、抗体の重鎖可変ドメインの全部若しくは一部、又は軽鎖可変ドメインの全部若しくは一部を含む抗体断片である。一部の態様において、単一ドメイン抗体は、ヒト単一ドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ；例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照のこと）。
抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載される、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、及び組み換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組み換え産生を含む種々の技術によって作製することができる。
２．ヒト化抗体
一部の実施形態では、本明細書に提供される抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減させる一方で、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持するようにヒト化される。通常、ヒト化抗体は、ＣＤＲ（又はその一部）が非ヒト抗体に由来する１つ又は複数の可変ドメインを含み、ＦＲ（又はその一部）はヒト抗体配列に由来する。ヒト化抗体はまた、任意選択的に、ヒト定常領域の少なくとも一部を含む。いくつかの態様では、ヒト化抗体中のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性又は親和性を回復又は改善するために、非ヒト抗体（例えば、ＣＤＲ残基が由来する抗体）からの対応する残基で置換される。
ヒト化された抗体及びその作製方法については、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）に総説があり、さらに例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３－３２９（１９８８）；Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：１００２９－１００３３（１９８９）；米国特許第５、８２１，３３７号、同第７，５２７，７９１号、同第６，９８２，３２１号、及び同第７，０８７，４０９号；Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４（２００５）（特異性決定領域（ＳＤＲ）グラフトについて記載）；Ｐａｄｌａｎ，Ｍｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２８：４８９－４９８（１９９１）（「リサーフェシング」について記載）；Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：４３－６０（２００５）（「ＦＲシャッフル」について記載）；並びにＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８（２００５）及びＫｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ，８３：２５２－２６０（２０００）（ＦＲシャッフルの「ガイド付き選択」アプローチについて記載）に記載がある。
ヒト化のために使用されうるヒトフレームワーク領域としては、限定されないが、「ベストフィット」法を使用して選択されたフレームワーク領域（例えば、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １５１：２２９６（１９９３）を参照）、軽鎖又は重鎖可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域（例えば、Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８９：４２８５（１９９２）；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照）、ヒト成熟（体細胞性変異）フレームワーク領域又はヒト生殖細胞フレームワーク領域（例えば、Ａｌｍａｇｒｏ ａｎｄ Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ． Ｂｉｏｓｃｉ． １３：１６１９－１６３３（２００８）を参照）、並びにＦＲライブラリーのスクリーニングに由来するフレームワーク領域（例えば、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２：１０６７８－１０６８４（１９９７）ａｎｄ Ｒｏｓｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７１：２２６１１－２２６１８（１９９６）を参照）が挙げられる。
３．ヒト抗体
一部の態様では、本明細書に提供される抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体は、当技術分野で既知の様々な技術を使用して生成することができる。ヒト抗体は、一般に、ｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｐｈａｒｍａｃｏｌ． ５：３６８－７４（２００１）及びＬｏｎｂｅｒｇ，Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０：４５０－４５９（２００８）に記載されている。
ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答して、インタクトなヒト抗体又はヒト可変領域を有するインタクトな抗体を産生するように修飾されたトランスジェニック動物に免疫原を投与することによって調製することができる。このような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置き換えるか、又は染色体外に存在するか若しくは動物の染色体にランダムに統合されるヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、通常不活性化されている。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の概説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ、Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ２３：１１１７－１１２５（２００５）を参照のこと。また、例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥＴＭ技術を記載する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号；ＨＵＭＡＢ（登録商標）技術を記載する米国特許第５，７７０，４２９号；Ｋ－Ｍ ＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許第７，０４１，８７０号；及び、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）技術を記載する米国特許出願公開第２００７／００６１９００号も参照されたい。このような動物によって生成されたインタクトな抗体からのヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることによって、さらに修飾されてもよい。
また、ヒト抗体は、ハイブリドーマを用いた方法で作製することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒト異種骨髄腫細胞株が記載されている。（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ． ５１－６３（Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：８６（１９９１）を参照。）ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されるヒト抗体は、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ，１０３：３５５７－３５６２（２００６）にも記載されている。さらなる方法としては、例えば、米国特許第７，１８９，８２６号（ハイブリドーマ細胞株からのモノクローナルヒトＩｇＭ抗体の生成について記載）及びＮｉ，Ｘｉａｎｄａｉ Ｍｉａｎｙｉｘｕｅ，２６（４）：２６５－２６８（２００６）（ヒト－ヒトハイブリドーマについて記載）に記載されるものが挙げられる。ヒトハイブリドーマ技術（トリオーマ技術）は、Ｖｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ，２０（３）：９２７－９３７（２００５）及びＶｏｌｌｍｅｒｓ ａｎｄ Ｂｒａｎｄｌｅｉｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｆｉｎｄｉｎｇｓ ｉｎ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２７（３）：１８５－９１（２００５）にも記載されている。
ヒト抗体はまた、ヒト由来のファージディスプレイライブラリーから選択される可変ドメイン配列を単離することによって生成することができる。次いで、そのような可変ドメイン配列は、所望のヒト定常ドメインと組み合わせることができる。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術を、以下に記載する。
４．ライブラリー由来の抗体
一部の態様では、本明細書に提供される抗体はライブラリーから得られる。本発明の抗体は、１つ又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離されうる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための方法は、例えば、Ｌｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １６：４９８－５０８（２０１６）に総説がある。例えば、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてそのようなライブラリーをスクリーニングするための様々な方法が当技術分野で知られている。このような方法は、例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ ｅｔ ａｌ． ｉｎ ｍＡｂｓ ８：１１７７－１１９４（２０１６）；Ｂａｚａｎ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ８：１８１７－１８２８（２０１２）及びＺｈａｏ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ３６：２７６－２８９（２０１６）、並びにＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １７８：１－３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，２００１）及びＭａｒｋｓ ａｎｄ Ｂｒａｄｂｕｒｙ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２４８：１６１－１７５（Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ、２００３）に総説がある。
一部のファージディスプレイ法において、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子のレパートリーは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって個別にクローニングされ、ファージライブラリーにおいて無作為に組み換えられ、次いで、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２：４３３－４５５（１９９４）に記載のように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片又はＦａｂ断片としてディスプレイする。免疫源からのライブラリーは、ハイブリドーマを構築する必要なしに、免疫原に対する高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ． ｉｎ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １２：７２５－７３４（１９９３）によって記載されるように、ナイーブなレパートリーをクローン化し（例えば、ヒトから）、免疫化することなく、非自己及びさらには自己抗原の広範囲に対する単一の抗体源を得ることができる。最終的に、ナイーブライブラリーはまた、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ ｉｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２２７：３８１－３８８（１９９２）により記載されるように、再整列していないＶ遺伝子セグメントを幹細胞からクローニングすること、およびランダム配列を含有するＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロで再整列を達成することによって、合成により作製することができる。ヒト抗体ファージライブラリーについて記載する特許公報としては、例えば：米国特許第５，７５０，３７３号、同第７，９８５，８４０号、同第７，７８５，９０３号及び同第８，６７９，４９０号、並びに米国特許出願公開第２００５／００７９５７４号、同第２００７／０１１７１２６号、同第２００７／０２３７７６４号及び同第２００７／０２９２９３６号が挙げられる。
１つ又は複数の所望の活性を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングするための当技術分野で知られている方法のさらなる例には、リボソーム及びｍＲＮＡディスプレイ、並びに細菌、哺乳動物細胞、昆虫細胞又は酵母細胞における抗体ディスプレイ及び選択のための方法が含まれる。酵母表面ディスプレイのための方法は、例えば、Ｓｃｈｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５０３：１３５－５６（２０１２）及びＣｈｅｒｆ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ １３１９：１５５－１７５（２０１５）並びにＺｈａｏ ｅｔ ａｌ． ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８８９：７３－８４（２０１２）に概説がある。リボソームディスプレイのための方法は、例えば、Ｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２５：５１３２－５１３４（１９９７）ａｎｄ ｉｎ Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ、ＰＮＡＳ９４：４９３７－４９４２（１９９７）に記載される。
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体又は抗体断片は、本明細書ではヒト抗体又はヒト抗体断片とみなされる。
５．グリコシル化バリアント
一部の態様において、本明細書に提供される抗体は、抗体のグリコシル化の程度を増減させるために変更される。抗体に対するグリコシル化部位の付加又は欠失は、１つ又は複数のグリコシル化部位が生成又は除去されるようにアミノ酸配列を変更することにより簡便に達成されうる。
抗体がＦｃ領域を含む場合、抗体に付着しているオリゴ糖を変更してもよい。哺乳動物細胞によって産生されるネイティブ抗体は、典型的には、通常Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７へのＮ－連結によって結合された分岐した二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ ｅｔ ａｌ． ＴＩＢＴＥＣＨ １５：２６－３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖には、様々な炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐型オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースが含まれうる。いくつかの態様では、本発明の抗体中のオリゴ糖の修飾が、特定の改良された特性を有する抗体バリアントを生成するために行われてもよい。
一態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ちＦｃ領域へのフコース結合（直接又は間接）を欠くオリゴ糖構造を有する抗体バリアントが提供される。このような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖とも呼ばれる）は特に、二分枝オリゴ糖構造の幹に第１のＧｌｃＮＡｃが結合したフコース残基を欠く、Ｎ結合オリゴ糖である。一態様では、内在性又は親抗体と比較して、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の比率が増加した抗体バリアントを提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約６０％、少なくとも約８０％、又は場合によっては約１００％（即ち、フコシル化オリゴ糖が存在しない）であってもよい。非フコシル化オリゴ糖の割合は、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号に記載のＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析法により測定した、Ａｓｎ２９７に結合したすべてのオリゴ糖の合計（例えば、複合体、ハイブリッド、及びハイマンノース構造）に対する、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域の約２９７位に位置するアスパラギン残基を指す（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）；しかしながら、Ａｓｎ２９７は、抗体のマイナーな配列変化のために、位置２９７の上流又は下流、即ち位置２９４と３００の間の約±３個のアミノ酸に位置していてもよい。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の割合が増加したこのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合、及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有することができる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；同第２００４／００９３６２１号を参照されたい。
フコシル化が低下した抗体を産生可能な細胞株の例としては、タンパク質フコシル化が不足しているＬｅｃ１３ＣＨＯ細胞（Ｒｉｐｋａ ｅｔ ａｌ． Ａｒｃｈ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｉｏｐｈｙｓ． ２４９：５３３－５４５（１９８６）；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ－１，６－フコシルトランスフェラーゼ遺伝子のＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞（例えば、Ｙａｍａｎｅ－Ｏｈｎｕｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． Ｂｉｏｅｎｇ． ８７：６１４－６２２（２００４）；Ｋａｎｄａ，Ｙ． ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． Ｂｉｏｅｎｇ．，９４（４）：６８０－６８８（２００６）；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照されたい）、又はＧＤＰ－フコース合成若しくはトランスポータータンパク質の活性が低下若しくは消滅した細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４２５９１５０号、同第２００５０３１６１３号、同第２００４１３２１４０号、同第２００４１１０２８２号を参照されたい）が挙げられる。
さらなる態様では、抗体バリアントは、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃにより二分されている二分されたオリゴ糖と共に提供される。そのような抗体バリアントは、上述のように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有してもよい。そのような抗体バリアントの例は、例えば、Ｕｍａｎａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ １７，１７６－１８０（１９９９）；Ｆｅｒｒａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎ Ｂｉｏｅｎｇ ９３，８５１－８６１（２００６）；国際公開第９９／５４３４２号；同第２００４／０６５５４０号、同第２００３／０１１８７８号に記載されている。
Ｆｃ領域に付着したオリゴ糖に少なくとも１つのガラクトース残基を有する抗体バリアントも提供される。このような抗体バリアントは、改善したＣＤＣの機能を有しうる。このような抗体バリアントは、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号、同第１９９８／５８９６４号、及び同第１９９９／２２７６４号に記載されている。
６．システイン操作抗体バリアント
一部の態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基で置換されているシステイン操作抗体、例えば、ＴＨＩＯＭＡＢＴＭを生成することが望ましい場合がある。好ましい態様では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で生じる。これらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書にさらに記載されるように、抗体を薬物部位又はリンカー－薬物部位といった他の部位にコンジュゲートしてイムノコンジュゲートを生成するために使用することができる。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号、同第８，３０，９３０号、同第７，８５５，２７５号、同第９，０００，１３０号、又は国際公開第２０１６０４０８５６号に記載のように生成することができる。
７．抗体誘導体
一部の態様では、本明細書で提供される抗体は、技術分野で既知であり、容易に入手可能な、さらなる非タンパク質性部分を含むようにさらに修飾されてもよい。抗体の誘導体化に適した部位としては、水溶性ポリマーが挙げられるが、これらに限定されるものではない。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、これらに限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ－１，３－ジオキソラン、ポリ－１，３，６－トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（ホモポリマー又はランダムコポリマー）、及びデキストラン又はポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロプロピレングリコールホモポリマー、プロリプロピレンオキサイド／エチレンオキサイドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール、及びこれらの混合物が挙げられる。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、水中での安定性のため、製造上の利点を有しうる。ポリマーは、任意の分子量であってよく、分岐していても、分岐していなくてもよい。抗体に付着しているポリマーの数は様々であってよくｊ、複数のポリマーが付着している場合、それらは同じ分子であっても、異なる分子であってもよい。一般に、誘導体化のために使用されるポリマーの数及び／又は種類は、限定するものではないが、改善される抗体の特定の特性又は機能、抗体誘導体が規定の条件下で治療に使用されるかどうかなどの考慮事項に基づいて決定することができる。
８．イムノコンジュゲート
本発明はまた、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、薬物、成長阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、若しくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらの断片）、又は放射性同位体などの１つ又は複数の治療剤にコンジュゲート（化学的に結合）した本明細書の抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を含む、イムノコンジュゲートを提供する。
一態様において、イムノコンジュゲートは、抗体が、前述の治療剤の１つ又は複数にコンジュゲートしている、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを使用して、治療薬の１つ又は複数に接続される。治療剤及び治療薬及びリンカーの例を含む、ＡＤＣ技術の概説は、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｒｅｖｉｅｗ ６８：３－１９（２０１６）に記載されている。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、酵素活性毒素又はその断片にコンジュゲートした本発明の抗体を含み、これには、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、エキソトキシンＡ鎖（緑膿菌からのもの）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ－サルシン、シナアブラギリのタンパク質、ジアンチンタンパク質、ヨウシュヤマゴボウのタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ－Ｓ）、ツルレイシ阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ阻害剤、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、並びにトリコテセンが含まれるが、これらに限定されない。
別の態様では、イムノコンジュゲートは、放射性原子にコンジュゲートして放射性抱合体を形成する、本発明の抗体を含む。様々な放射性同位体が放射性抱合体の製造のために利用可能である。例としては、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が挙げられる。放射性抱合体が検出のために使用されるとき、その例には、シンチグラフィー研究のための放射性原子、例えば、Ｔｃ９９ｍ若しくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）画像法（別名、磁気共鳴画像法、ＭＲＩ）のための、Ｉ１２３、Ｉ１３１、Ｉｎ１１１、Ｆ１９、Ｃ１３、Ｎ１５、Ｏ１７、ガドリニウム、マンガン、若しくは鉄などのスピン標識が含まれうる。
抗体と細胞毒性剤とのコンジュゲートは、例えば、Ｎ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル－４－（Ｎ－マレイミドメチル）シクロヘキサン－１－カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチルアジピミデートＨＣｌなど）、活性エステル（スベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（グルタルアルデヒドなど）、ビスアジド化合物（ビス（ｐ－アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス－ジアゾニウム誘導体（ビス－（ｐ－ジアゾニウムベンゾイル）－エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（トルエン２，６－ジイソシアネートなど）、及び二活性フッ素化合物（１，５－ジフルオロ－２，４－ジニトロベンゼンなど）といった様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。例えば、Ｖｉｔｅｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３８：１０９８（１９８７）に記載されているように、リシン免疫トキシンを調製することができる。炭素１４標識１－イソチオシアナトベンジル－３－メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ－ＤＴＰＡ）は、抗体へのラジヌクレオチドのコンジュゲートのための例示的なキレート剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞内での細胞傷害性薬物の放出を促進する「開裂性リンカー」であってもよい。例えば、酸－ラビリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、フォトラビリンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー（Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：１２７－１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
本明細書のイムノコンジュゲート又はＡＤＣは、市販されている（例えば、Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ．，Ｕ．Ｓ．Ａから）ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、及びスルホ－ＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）を含むがこれらに限定されない架橋試薬を用いて調製されたコンジュゲートを明示的に想起するが、それに限定されない。
９．多重特異性抗体
一部の態様では、本明細書に提供される抗体は多重特異性抗体、特に、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原決定基（例えば、２つの異なるタンパク質、又は同じタンパク質上の２つの異なるエピトープ）に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。一部の態様では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。一部の態様では、結合特異性のうちの一方はＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対するものであり、他方は任意の他の抗原に対するものである。一部の態様では、多重特異性抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４の２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合しうる。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体は、細胞傷害性薬剤又は細胞を、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する細胞に局在化するために使用することもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片として調製することができる。
多重特異性抗体を作製するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対の組み換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ ３０５：５３７（１９８３）参照）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号及びＡｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７０：２６（１９９７）参照）が含まれるが、これらに限定されない。多重特異性抗体は、また、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果の操作（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号参照）；２つ以上の抗体若しくは断片の架橋（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）；ロイシンジッパーを使用した二重特異性抗体の生成（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７－１５５３（１９９２）及び国際公開第２０１１／０３４６０５号参照）；軽鎖の誤対合問題を回避するための一般的な軽鎖技術の使用（例えば、国際公開第９８／５０４３１号参照）；二重特異性抗体断片を作製するための「ダイアボディ」技術の使用（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、９０：６４４４－６４４８（１９９３）参照）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）参照）；並びに例えばＴｕｔｔ ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １４７：６０（１９９１）に記載されている三重特異性抗体の調製によって作製することができる。
例えば、「オクトパス（Ｏｃｔｏｐｕｓ）抗体」を含む３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、又はＤＶＤ－Ｉｇも本明細書に含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照されたい）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号及び国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出すことができる。多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３に、同様に別の異なる抗原に、又はＣＤ３の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」又は「ＤＡＦ」も含む（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号及び国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照されたい）。
多重特異性抗体は、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにドメインクロスオーバーを有する非対称形態（いわゆる「クロスマブ（ＣｒｏｓｓＭａｂ）」技術）で、即ちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号参照）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、同第２０１６／０１６２９９号参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７－１１９１、及びＫｌｅｉｎ ａｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ ８（２０１６）１０１０－２０）も参照）を交換することによっても提供されうる。非対称Ｆａｂアームは、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
多重特異性抗体の様々なさらなる分子フォーマットが当技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ６７（２０１５）９５－１０６参照）。
本明細書に同様に含まれる特定の種類の多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原、及びＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化インバリアント構成成分、例えばＴ細胞を再標的化して標的細胞を死滅させるためのＣＤ３に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。したがって、好ましい態様では、本明細書に提供される抗体は、結合特異性のうちの１つがＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対するものであり、他がＴ細胞活性化抗原、特にＣＤ３に対するものである、多重特異性抗体、特に二重特異性抗体である。
この目的のために有用でありうる二重特異性抗体フォーマットの例には、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ｅｎｇａｇｅｒ））分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、同第２００５／０６１５４７号、同第２００７／０４２２６１号及び同第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ ａｎｄ Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ３１７，１２５５－１２６０（２０１１）参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９，２９９－３０５（１９９６））及びその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２９３、４１－５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、安定化付加のためのＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする「ＤＡＲＴ」（二重親和性再標的化）分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３９９，４３６－４４９（２０１０））、並びに全ハイブリッドマウス／ラットＩｇＧ分子であるいわゆるトリオマブ（ｔｒｉｏｍａｂ）（Ｓｅｉｍｅｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ ３６、４５８－４６７（２０１０）に概説）が含まれるが、これらに限定されない。本明細書に含まれる具体的なＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、同第２０１３／０２６８３９号、同第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
本発明の多重特異性抗体の好ましい態様を以下に記載する。
一態様において、本発明は、本明細書に記載の、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメインを含み、第２の抗原 に結合する第２の抗原結合ドメイン（及び任意選択的に、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第３の抗原結合ドメイン）を含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を提供する。
本発明の好ましい態様によれば、抗体に含まれる抗原結合ドメインはＦａｂ分子である（即ち、各々が可変ドメイン及び定常ドメインを含む、重鎖及び軽鎖から構成される抗原結合ドメインである）。一態様において、第１、第２及び／又は存在する場合は第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。一態様において、前記Ｆａｂ分子は、ヒトのものである。別の態様では、前記Ｆａｂ分子はヒト化のものである。また別の態様では、前記Ｆａｂ分子は、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインを含む。
好ましくは、抗原結合ドメインの少なくとも１つは、クロスオーバーＦａｂ分子である。このような修飾は、異なるＦａｂ分子の重鎖と軽鎖の誤対合を低減し、それによって、組み換え生成における本発明の（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善する。本発明の（多重特異性）抗体に有用な好ましいクロスオーバーＦａｂ分子では、Ｆａｂ軽鎖及びＦａｂ重鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＬ及びＶＨ）が交換されている。しかしながら、このドメイン交換によっても、（多重特異性）抗体の調製は、誤対合重鎖及び軽鎖の間の、いわゆる、ベンス・ジョーンズ型相互作用に起因して、特定の副生成物を含むことがある（Ｓｃｈａｅｆｅｒ ｅｔ ａｌ，ＰＮＡＳ、１０８（２０１１）１１１８７－１１１９１を参照されたい）。本明細書にさらに記載されるように、異なるＦａｂ分子の重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに減少させ、これにより望ましい（多重特異性）抗体の純度及び収率を上昇させるため、反対の電荷を有する荷電アミノ酸を、第１の抗原（ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４）に結合するＦａｂ分子又は第２の抗原（例えばＣＤ３）に結合するＦａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメインにおける特定のアミノ酸位置に導入することができる。電荷修飾は、（多重特異性）抗体に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）（例えば、図１Ａ～Ｃ、Ｇ～Ｊに示される）、又は（多重特異性）抗体に含まれるＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子（例えば、図１Ｄ～Ｆ、Ｋ～Ｎに示される）において行われる（但し両方で行われることはない）。好ましい態様では、電荷修飾は、（多重特異性）抗体（好ましい態様では第１の抗原、即ちＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する）に含まれる従来のＦａｂ分子（複数可）で行われる。
本発明による好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、第１の抗原（即ちＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４）と、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）とに同時結合することができる。一態様において、（多重特異性）抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）とＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４への同時結合により、Ｔ細胞と標的細胞を架橋することができる。より好ましい態様では、そのような同時結合は、標的細胞、特に標的細胞抗原（例えばＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４）発現腫瘍細胞の溶解を生じる。一態様では、そのような同時結合はＴ細胞の活性化を生じる。別の態様では、そのような同時結合は、増殖、分化、サイトカイン分泌、細胞傷害性エフェクター分子の放出、細胞傷害活性及び活性化マーカーの発現の群から選択されるＴリンパ球、特に細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞応答を生じる。一態様において、標的細胞抗原（即ちＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４）への同時結合を伴わない（多重特異性）抗体の第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）への結合は、Ｔ細胞活性化を生じない。
一態様において、（多重特異性）抗体は、Ｔ細胞の細胞傷害活性を標的細胞に向け直すことができる。好ましい態様において、前記向け直しは、標的細胞によるＭＨＣ媒介ペプチド抗原提示及び／又はＴ細胞の特異性と無関係である。
好ましくは、本発明のいずれかの態様によるＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞、特にＣＤ８＋Ｔ細胞である。
ａ）第１（及び第３）の抗原結合ドメイン
本発明の（多重特異性）抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン（第１の抗原結合ドメイン）を含む。好ましい態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４は、ヒトＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４である。特定の態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９である。
第１の抗原結合ドメインは、（多重特異性）抗体を標的部位へ、例えばＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現する特定の種類の腫瘍細胞へ向かわせることができる。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する２つの抗原結合ドメインを含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対する二価の結合を提供する。
一態様において、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子、及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。
一部の態様において、（多重特異性）抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。特定の態様では、これらの抗原結合ドメインのすべては同一であり、即ち同じ分子フォーマット（例えば、従来又はクロスオーバーＦａｂ分子）を有し、（存在する場合）本明細書に記載されるＣＨ１及びＣＬドメインに同じアミノ酸置換を含む同じアミノ酸配列を含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する最大２つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。
好ましい態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。このような態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。
代替的な態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。このような態様では、第２の抗原に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域を含む。一態様において、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、ヒト定常領域、特にヒトＣＨ１及び／又はＣＬドメインを含むＦａｂ分子である。ヒト定常ドメインの例示的な配列は、配列番号７９及び８０（それぞれ、ヒトカッパ及びラムダＣＬドメイン）、並びに配列番号８１（ヒトＩｇＧ１重鎖定常ドメインＣＨ１－ＣＨ２－ＣＨ３）で与えられる。一態様において、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号７９又は配列番号８０のアミノ酸配列、特に配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域を含む。特に、軽鎖定常領域は、「電荷修飾」の状態で本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい、及び／又は、クロスオーバーＦａｂ分子での場合、１つ又は複数の（特に２つの）Ｎ末端アミノ酸の欠失又は置換を含んでいてもよい。いくつかの態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列に含まれるＣＨ１ドメイン配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を含む。特に、重鎖定常領域（具体的にはＣＨ１ドメイン）は、「電荷修飾」状態において本明細書に記載のアミノ酸変異を含んでいてもよい。
ｂ）第２の抗原結合ドメイン
一部の態様では、本発明の（多重特異性）抗体は、第２の抗原に結合する少なくとも１つの抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子を含む。第２の抗原は、好ましくはＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４でなく、即ちＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４と異なる。一態様において、第２の抗原は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４とは異なる細胞に発現される（例えば腫瘍細胞といった標的細胞以外の細胞に発現される）抗原である。一態様において、第２の抗原は、Ｔ細胞抗原、特にＴ細胞活性化抗原である。具体的な態様では、第２の抗原はＣＤ３である。好ましい態様では、ＣＤ３はヒトＣＤ３（配列番号７６）又はカニクイザルＣＤ３（配列番号７７）、さらに詳細にはヒトＣＤ３である。一態様において、第２の抗原結合ドメインは、ヒト及びカニクイザルＣＤ３と交差反応性である（即ちそれらに特異的に結合する）。いくつかの態様では、ＣＤ３のサブユニット（ＣＤ３イプシロン）である。
好ましい態様では、（多重特異性）抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する１つを超えない抗原結合ドメインを含む。一態様において、（多重特異性）抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に対する一価の結合を提供する。
一態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、Ｆｖ分子、ｓｃＦｖ分子、Ｆａｂ分子及びＦ（ａｂ’）２分子の群から選択される抗体断片である。好ましい態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
好ましい態様では、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインのＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えらえているＦａｂ分子である。このような態様において、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、好ましくは従来のＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する１つを超える抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様において、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
代替的な態様では、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。このような態様では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメイン（複数可）は、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＨ１とＣＬが交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。（多重特異性）抗体に含まれる第２の抗原に結合する１を超える抗原結合ドメイン、特にＦａｂ分子が存在する態様において、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗原結合ドメインは、好ましくはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原に結合する抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
好ましい態様では、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１、特に可変ドメインＶＬとＶＨが、互いによって置き換えられているＦａｂ分子である（即ち、そのような態様によれば、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変又は定常ドメインが交換されているクロスオーバーＦａｂ分子である）。１つのそのような態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインは、従来のＦａｂ分子である。
好ましい態様では、第２の抗原は、本明細書で上述したように、ＣＤ３である。
一態様において、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、列番号６３のＬＣＤＲ２、及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）；又は
（ｉｉ）配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５５のＬＣＤＲ２、及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）
を含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗体である（ヒト化抗体に由来する）。一態様では、第２の抗原結合ドメインは、ヒト化抗原結合ドメイン（即ち、ヒト化抗体の抗原結合ドメイン）である。一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、ヒト化可変領域である。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨ及び／又はＶＬは、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを含む。
いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５９の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号６２の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号６３のＬＣＤＲ２、及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号６５の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号６５のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、これにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号６６の１つ又は複数の系さフレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号６６のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、これにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは配列番号６５のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号６６のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番６５の配列を含むＶＨと、配列番号６６の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号６５のＶＨ配列と、配列番号６６のＶＬ配列とを含む。
別の態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号６５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号６６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号６５のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号６６のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号６５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６５のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様において、ＶＨは、配列番号６５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６５のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＨは、配列番号６５のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６５のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号６６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６６のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様において、ＶＬは、配列番号６６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６６のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＬは、配列番号６６のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号６６のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
いくつかの態様では、第２の抗原結合ドメインは、
（ｉ）配列番号５１の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号５４の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号５５のＬＣＤＲ２、及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号５７の１つ又は複数の重鎖フレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＨ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号５７のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列を含み、これにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５８の１つ又は複数の系さフレームワーク配列（即ち、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及び／又はＦＲ４配列）を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％又は約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９８％同一であるアミノ酸配列を含む。一部の態様では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するＶＬ配列は、基準配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含有するが、その配列を含む抗体は、第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する能力を保持する。一部の態様では、合計で１～１０個のアミノ酸が、配列番号５８のアミノ酸配列において置換されている、挿入されている及び／又は欠失している。一部の態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域で（即ち、ＦＲで）生じる。一態様において、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列を含む。任意選択的に、ＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列を含み、これにはその配列の翻訳後修飾が含まれる。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含み、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様において、ＶＨは配列番号５７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号５８のアミノ酸配列を含む。
さらなる態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番５７の配列を含むＶＨと、配列番号５８の配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５７のＶＨ配列と、配列番号５８のＶＬ配列とを含む。
別の態様において、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列を含むＶＨと、配列番号５８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列を含むＶＬとを含む。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインは、配列番号５７のＶＨのＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３アミノ酸配列と、配列番号５８のＶＬのＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２及びＬＣＤＲ３アミノ酸配列とを含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＨは、配列番号５７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークとを含む。一態様において、ＶＨは、配列番号５７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＨは、配列番号５７のＶＨの重鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５７のＶＨのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
一態様において、第２の抗原結合ドメインのＶＬは、配列番号５８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性のフレームワークを含む。一態様において、ＶＬは、配列番号５８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９５％の配列同一性のフレームワークとを含む。別の態様において、ＶＬは、配列番号５８のＶＬの軽鎖ＣＤＲ配列と、配列番号５８のＶＬのフレームワーク配列と少なくとも９８％の配列同一性のフレームワークとを含む。
ｃ）電荷修飾
本発明の（多重特異性）抗体は、それに含まれるＦａｂ分子に、１つ（又は２つより多い抗原結合Ｆａｂ分子を含む分子の場合には、さらに多くの）結合アーム中にＶＨ／ＶＬ交換を有するＦａｂベース多重特異性抗体の生成において生じうる、軽鎖と適合しない重鎖との誤対合（ベンス・ジョーンズ型副生成物）を低減するうえで特に効率的であるアミノ酸置換を含みうる（全体が本明細書に参照により組み込まれる国際公開第２０１５／１５０４４７号、特にその中の実施例も参照されたい）。望ましくない副生成物、特に、結合アームの１つにＶＨ／ＶＬドメイン交換を有する多重特異性抗体に生じるベンス・ジョーンズ型副生成物と比較した、所望の（多重特異性）抗体の比を、ＣＨ１及びＣＬドメインの特定のアミノ酸位置と反対の電荷を有する荷電アミノ酸を導入することによって改善することができる（本明細書で「電荷修飾」と呼ぶことがある）。
したがって、（多重特異性）抗体の第１及び第２の（及び存在する場合、第３の）抗原結合ドメインが両方ともＦａｂ分子であり、それら抗原結合ドメインの１つ（特に、第２の抗原結合ドメイン）において、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いにより置き換えられているいくつかの態様では、
ｉ）第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）か、或いは
ｉｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、正に帯電したアミノ酸で置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、負に帯電したアミノ酸で置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
（多重特異性）抗体は、ｉ）及びｉｉ）に記述されている修飾を両方とも含むことはない。ＶＨ／ＶＬ交換を有する抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及びＣＨ１は、互いによって置き換えられていない（即ち、交換されていないままである）。
より具体的な態様では、
ｉ）第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）か、或いは
ｉｉ）第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
１つのこのような態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
より好ましい態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらにより好ましい態様では、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様において、上記の態様によるアミノ酸置換が、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１に行われる場合、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
代替的に、上記の態様によるアミノ酸置換は、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１の代わりに、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよい。好ましいこのような態様において、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプである。
したがって、一態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸又は位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
なお別の態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様では、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸がアルギニン（Ｒ）により置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）により置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の及び任意選択的に第３の抗原結合ドメインであって；
第１（及び、存在する場合第３）の抗原結合ドメインが、従来のＦａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
を含み；
第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）により独立して（好ましい態様では、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）により独立して）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、第２（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）により独立して置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の及び任意選択的に第３の抗原結合ドメイン：
並びに
（Ｂ）第２の抗原、好ましくはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメイン
を含む。
ｄ）多重特異性抗体フォーマット
本発明による（多重特異性）抗体は、様々な構造を有することができる。例示的な構造が図１に描写されている。
好ましい態様において、（多重特異性）抗体に含まれる抗原結合ドメインは、Ｆａｂ分子である。このような態様において、第１、第２、第３などの抗原結合ドメインは、それぞれ本明細書において第１、第２、第３などのＦａｂ分子と呼ばれることがある。
一態様において、（多重特異性）抗体の第１及び第２の抗原結合ドメインは、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。好ましい態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子である。１つのそのような態様において、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。別のそのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。（ｉ）第１の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインがＦａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している態様において、追加的に、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖及び第２の抗原結合ドメインのＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に特異的に結合することのできる単一の抗原結合ドメイン（例えばＦａｂ分子）を有する（多重特異性）抗体、（図１Ａ、Ｄ、Ｇ、Ｈ、Ｋ、Ｌに示される実施例）は、特に抗原の内部移行が高親和性抗原結合ドメインの結合の後で予測される場合に有用である。そのような場合、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に特異的な１つを超える抗原結合ドメインの存在は、抗原の内部移行を増強し、それによってその利用能を低減しうる。
しかしながら、他の場合では、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に特異的な２つ以上の抗原結合ドメイン（例えば、Ｆａｂ分子）を、例えば、標的部位への標的化を最適化するため又は標的細胞抗原の架橋を可能にするために含む（多重特異性）抗体（例えば、図１Ｂ、１Ｃ、１Ｅ、１Ｆ、１Ｉ、１Ｊ，１Ｍ又は１Ｎに示されている実施例を参照されたい）を有することが有利であろう。
したがって、好ましい態様では、本発明による（多重特異性）抗体は第３の抗原結合ドメインを含む。
一態様において、第３の抗原結合ドメインは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する。一態様において、第３の抗原結合ドメインはＦａｂ分子である。
一態様において、第３の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと同一である。
いくつかの態様において、第３及び第１の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第３の抗原結合ドメインは、第１の抗原結合ドメインと同一である。したがって、これらの態様では、第１及び第３の抗原結合ドメインは、同じ重鎖及び軽鎖アミノ酸配列を含み、同じドメイン配置（即ち、従来の又はクロスオーバーの）を有する。さらに、これらの態様において、第３の抗原結合ドメインは、存在する場合、第１の抗原結合ドメインと同じアミノ酸置換を含む。例えば、本明細書において「電荷修飾」と記載されるアミノ酸置換は、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの各々の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われる。代替的に、前記アミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン（好ましい態様ではＦａｂ分子でもある）の定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１において行われてもよく、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬ及び定常ドメインＣＨ１では行われない。
第１の抗原結合ドメインと同様に、第３の抗原結合ドメインは、好ましくは従来のＦａｂ分子である。しかしながら、第１及び第３の抗原結合ドメインがクロスオーバーＦａｂ分子である（且つ第２の抗原結合ドメインが従来のＦａｂ分子である）態様も考慮される。したがって、好ましい態様では、第１及び第３の抗原結合ドメインは、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他の態様では、第１及び第３の抗原結合ドメインは、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
第３の抗原結合ドメインが存在する場合、好ましい態様では、第１の及び第３の抗原結合ドメインはＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合し、第２の抗原ドメインは第２の抗原（例えばＣＤ３などのＴ細胞活性化抗原）に結合する。
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットは、安定な会合が可能である。
本発明による（多重特異性）抗体は、異なる構造を有することができ、即ち、第１、第２（及び任意選択的に第３）の抗原結合ドメインは、互いに、異なる様式でＦｃドメインに融合していてもよい。構成要素は、直接的に、又は好ましくは１つ又は複数の適切なペプチドリンカーを介して、互いに融合していてもよい。Ｆａｂ分子の融合が、ＦｃドメインのサブユニットのＮ末端へのものである場合、それは典型的には免疫グロブリンヒンジ領域を介するものである。
いくつかの態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様では、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又はＦｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様では、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、第１の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｇ及び１Ｋに概略的に描写されている（これらの実施例における第２の抗原結合ドメインは、ＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから実質的になり、第１及び第２のＦａｂ分子は、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ａ及び１Ｄに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。第１及び第２のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第２のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、それぞれＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
一部の態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、それぞれＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような態様において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端又は（上記に記載されたように）Ｆｃドメインの他方のサブユニットのＮ末端に融合していてもよい。好ましいそのような態様において、前記第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載されるクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第１の抗原結合ドメインはクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
一態様において、第１及び第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。このような構造は、図１Ｈ及び１Ｌに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
いくつかの態様において、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１又は第２のサブユニットのＮ末端に融合している。好ましいそのような態様において、前記第１及び第３の抗原結合ドメインは、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いにより置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第１及び第３の抗原結合ドメインは、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
好ましいそのような態様において、第２及び第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーとから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｂ及び１Ｅ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）と、図１Ｊ及び１Ｎ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第２及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様では、第２及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、各々がＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
別のそのような態様において、第１及び第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。具体的な態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子と、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと、任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｃ及び１Ｆ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）、並びに図１Ｉ及び１Ｍ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。第１及び第３のＦａｂ分子は、Ｆｃドメインに直接的に又はペプチドリンカーを介して融合していてもよい。好ましい態様において、第１及び第３のＦａｂ分子は、免疫グロブリンヒンジ領域を介して、各々がＦｃドメインに融合している。具体的な態様において、特にＦｃドメインがＩｇＧ１ Ｆｃドメインである場合に、免疫グロブリンヒンジ領域はヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。任意選択的に、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、追加的に互いに融合していてもよい。
Ｆａｂ分子が、免疫グロブリンヒンジ領域を介してＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの各々のＮ末端に融合している（多重特異性）抗体の構造において、２つのＦａｂ分子、ヒンジ領域及びＦｃドメインは、免疫グロブリン分子を本質的に形成する。好ましい態様において、免疫グロブリン分子は、ＩｇＧクラス免疫グロブリンである。さらにより好ましい態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ１サブクラス免疫グロブリンである。別の態様において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ４サブクラス免疫グロブリンである。さらに好ましい態様において、免疫グロブリンは、ヒト免疫グロブリンである。他の態様において、免疫グロブリンは、キメラ免疫グロブリン又はヒト化免疫グロブリンである。一態様において、免疫グロブリンは、ヒト定常領域、特にヒトＦｃ領域を含む。
本発明の（多重特異性）抗体のいくつかにおいて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、任意選択的にペプチドリンカーを介して互いに融合している。第１及び第２のＦａｂ分子の構造に応じて、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよく、又は第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖は、そのＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖のＮ末端に融合していてもよい。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖の融合は、適合しないＦａｂ重鎖及び軽鎖の誤対合をさらに低減し、本発明の（多重特異性）抗体の一部の発現に必要なプラスミドの数も低減する。
抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインに又は互いに、直接的に又は１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合していてもよい。ペプチドリンカーは、当技術分野で既知であり、本明細書に記載される。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれる。「ｎ」は、通常、１～１０、典型的には２～４の整数である。一態様において、前記ペプチドリンカーは、少なくとも５個のアミノ酸長さ、一態様において５～１００個、さらなる態様において１０～５０個のアミノ酸長さを有する。一態様において、前記ペプチドリンカーは、（ＧｘＳ）ｎ又は（ＧｘＳ）ｎＧｍであり、ここでＧ＝グリシン、Ｓ＝セリン及び（ｘ＝３、ｎ＝３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３）又は（ｘ＝４、ｎ＝２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３）であり、一態様において、ｘ＝４及びｎ＝２又は３であり、さらなる態様において、ｘ＝４及びｎ＝２である。一態様において、前記ペプチドリンカーは（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖を互いに融合するために特に適したペプチドリンカーは、（Ｇ４Ｓ）２である。第１及び第２のＦａｂ断片のＦａｂ重鎖を接続するために適した例示的なペプチドリンカーは、配列（Ｄ）－（Ｇ４Ｓ）２（配列番号８２及び８３）を含む。別の適切なそのようなリンカーは、配列（Ｇ４Ｓ）４を含む。加えて、リンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域（の一部）を含んでいてもよい。特に、Ｆａｂ分子が、ＦｃドメインサブユニットのＮ末端に融合する場合、免疫グロブリンヒンジ領域又はその一部を介して、さらなるペプチドリンカーを用いて又は用いずに融合してもよい。
一部の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、並びに第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、並びに第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有する（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有する（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））ポリペプチドを含む。これらの態様のいくつかにおいて、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの態様の他のいくつかにおいて、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有する（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））ポリペプチド、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））ポリペプチドをさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。他の態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域により置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、Ｆｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））を含む。これらの態様のいくつかにおいて、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する第２のＦａｂ分子のクロスオーバーＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）、及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。これらの態様の他のいくつかにおいて、適切であれば、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドと共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＬ（１））、又は第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチドが、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。これらの態様による（多重特異性）抗体は、（ｉ）Ｆｃドメインサブユニットポリペプチド（ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））、又は（ｉｉ）第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖がカルボキシ末端ペプチド結合をＦｃドメインサブユニットと共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＣＨ２－ＣＨ３（－ＣＨ４））及び第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含むことができる。一部の態様において、ポリペプチドは、例えばジスルフィド結合によって共有結合的に連結している。
一部の態様において、（多重特異性）抗体はＦｃドメインを含まない。好ましいそのような態様において、前記第１の、及び存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、各々が従来のＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、本明細書に記載のクロスオーバーＦａｂ分子、即ち、Ｆａｂ重鎖と軽鎖の可変ドメインＶＨとＶＬ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が交換されている／互いによって置き換えられているＦａｂ分子である。他のそのような態様において、前記第１の、及び存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、各々がクロスオーバーＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である。
１つのそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｏ及び１Ｓに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
別のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１及び第２の抗原結合ドメイン、並びに任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１及び第２の抗原結合ドメインは、両方ともＦａｂ分子であり、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。このような構造は、図１Ｐ及び１Ｔに概略的に描写されている（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子である）。
いくつかの態様において、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。一部のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第１のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｑ及び１Ｕ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｘ及び１Ｚ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
いくつかの態様において、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、（多重特異性）抗体は、第３の抗原結合ドメイン、特に第３のＦａｂ分子をさらに含み、前記第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。一部のそのような態様において、（多重特異性）抗体は、第１、第２及び第３のＦａｂ分子、並びに任意選択的に１つ又は複数のペプチドリンカーから本質的になり、第２のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＮ末端に融合しており、第３のＦａｂ分子は、Ｆａｂ重鎖のＮ末端で第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖のＣ末端に融合している。そのような構造は、図１Ｒ及び１Ｖ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインはＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは各々が従来のＦａｂ分子である）、又は図１Ｗ及び１Ｙ（これらの実施例において、第２の抗原結合ドメインは従来のＦａｂ分子であり、第１及び第３の抗原結合ドメインは各々がＶＨ／ＶＬクロスオーバーＦａｂ分子である）に概略的に描写されている。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチ（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））ドを含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（即ち、第２のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＬ（２））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第２のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＬ（２）－ＶＨ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＨ１（２））及び第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＬ（１））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有する（即ち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第１のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽定常領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有する（即ち、第３のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）ポリペプチド（ＶＨ（２）－ＣＨ１（２）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（３）－ＣＬ（３））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が、軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有し（即ち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖可変領域が軽鎖可変領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３）－ＶＬ（１）－ＣＨ１（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（１）－ＣＬ（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３））をさらに含む。
一部の態様において、本発明による（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第３のＦａｂ分子が、クロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が、軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域と共有し、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域と共有し（即ち、第１のＦａｂ分子がクロスオーバーＦａｂ重鎖を含み、重鎖定常領域が軽鎖定常領域によって置き換えられている）、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖定常領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第２のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖と共有するポリペプチド（ＶＨ（３）－ＣＬ（３）－ＶＨ（１）－ＣＬ（１）－ＶＨ（２）－ＣＨ１（２））を含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第１のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第１のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（１）－ＣＨ１（１））及び第２のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖ポリペプチド（ＶＬ（２）－ＣＬ（２））をさらに含む。いくつかの態様において、（多重特異性）抗体は、第３のＦａｂ分子のＦａｂ軽鎖可変領域が、カルボキシ末端ペプチド結合を、第３のＦａｂ分子のＦａｂ重鎖定常領域と共有するポリペプチド（ＶＬ（３）－ＣＨ１（３））をさらに含む。
一態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、
（ｉ）（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
好ましい態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１及び第３の抗原結合ドメインであって、第１及び第３の抗原結合ドメインの各々が、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１及び第３の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、
（ｉ）（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、
（ｉ）（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
本発明による（多重特異性）抗体の異なる構造のすべてにおいて、本明細書に記載されるアミノ酸置換（「電荷修飾」）は、存在する場合、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１及びＣＬドメイン、又は第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１又はＣＬドメインにおけるものでありうる。好ましくは、それらは、第１及び（存在する場合）第３の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子のＣＨ１ドメイン及びＣＬドメインにおけるものである。本発明の概念によれば、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。逆に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、このようなアミノ酸置換は、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われない。アミノ酸置換は、好ましくは、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ１が互いによって置き換えらえているＦａｂ分子を含む（多重特異性）抗体において行われる。
本発明による（多重特異性）抗体の好ましい態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第１（及び存在する場合、第３）のＦａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。本発明による（多重特異性）抗体の他の態様において、特に、本明細書に記載されるアミノ酸置換が、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子において行われる場合、第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。いくつかの態様において、第１（及び存在する場合、第３）の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬ、並びに第２の抗原結合ドメイン／Ｆａｂ分子の定常ドメインＣＬは、カッパアイソタイプのものである。
一態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、（Ａ）の第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸がリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（Ａ）の第２の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸がグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ここで、
（ｉ）（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
好ましい態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１及び第３の抗原結合ドメインであって、第１及び第３の抗原結合ドメインの各々が、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
ここで、
（ｉ）（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しているか、又は
（ｉｉ）（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ａ）の第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
別の態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメインであって、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、（Ａ）の第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸は、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（Ａ）の第１の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
（Ａ）の第１の抗原結合ドメイン及び（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
上記の態様のいずれかによると、（多重特異性）抗体の構成要素（例えば、Ｆａｂ分子、Ｆｃドメイン）は、直接的に又は様々なリンカーを介して、特に本明細書に記載される又は当技術分野において知られている、１個又は複数個のアミノ酸、典型的には約２～２０個のアミノ酸を含むペプチドリンカーを介して融合されていてもよい。適切な非免疫原性ペプチドリンカーには、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎ、（Ｇ４Ｓ）ｎ又はＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーが含まれ、「ｎ」は通常１～１０、典型的には２～４の整数である。
さらに、上記の態様のいずれかによれば、第２の抗原結合ドメインは、（ｉ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５４のＬＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ（特に配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）；及び／又は（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬ、又は（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ（特に配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６アミノ酸配列を含むＶＬ）を含みうる。
好ましい態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１及び第３の抗原結合ドメインであって、第１及び第３の抗原結合ドメインの各々が、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉ）配列番号１のＨＣＤＲ１、配列番号２のＨＣＤＲ２、及び配列番号３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４のＬＣＤＲ１、配列番号５のＬＣＤＲ２及び配列番号６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｉｉ）配列番号４１のＨＣＤＲ１、配列番号４２のＨＣＤＲ２、及び配列番号４３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号４４のＬＣＤＲ１、配列番号４５のＬＣＤＲ２及び配列番号４６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｉｖ）配列番号９のＨＣＤＲ１、配列番号１０のＨＣＤＲ２、及び配列番号１１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号１２のＬＣＤＲ１、配列番号１３のＬＣＤＲ２及び配列番号１４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（ｖ）配列番号１７のＨＣＤＲ１、配列番号１８のＨＣＤＲ２、及び配列番号１９のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２０のＬＣＤＲ１、配列番号２１のＬＣＤＲ２及び配列番号２２のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｖｉ）配列番号３３のＨＣＤＲ１、配列番号３４のＨＣＤＲ２、及び配列番号３５のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号３６のＬＣＤＲ１、配列番号３７のＬＣＤＲ２及び配列番号３８のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号２５のＨＣＤＲ１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８のＬＣＤＲ１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第１の抗原結合ドメインと；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
（ｉｉ）配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５４のＬＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；
（特に、配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ）
を含む第２の抗原結合ドメインと；
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインと
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、
（Ａ）の第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（Ａ）の第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
さらに、
（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
さらに好ましい態様において、本発明は、
（Ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１及び第３の抗原結合ドメインであって、第１及び第３の抗原結合ドメインの各々が、（従来の）Ｆａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉ）配列番号７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉ）配列番号４７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉ）配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号１６のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（ｉ）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（特に配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬ）
を含む第１及び第３の抗原結合ドメイン；
（Ｂ）第２の抗原、特にＴ細胞活性化抗原、より詳細にはＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、且つ
（ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
（ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ；
（特に配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬ）
を含む第２の抗原結合ドメイン；並びに
（Ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメイン
を含む（多重特異性）抗体を提供し、
ここで、
（Ａ）の第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸はリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）によって（最も好ましくはアルギニン（Ｒ）によって）置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、（Ａ）の第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、
さらに、
（Ａ）の第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で（Ｂ）の第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、（Ｂ）の第２の抗原結合ドメイン及び（Ａ）の第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端で（Ｃ）のＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合している。
本発明のこれらの態様による一態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられており（Ｙ４０７Ｖ）、任意選択的に位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｓ３５４Ｃ）か又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３４９のチロシン残基がシステイン残基と置により置き換えられて（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、位置２３４のロイシン残基がアラニン残基（Ｌ２３４Ａ）と置き換わっており、位置２３５のロイシン残基がアラニン残基と置き換わっており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基がグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本発明のこれらの態様によるさらなる態様では、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。
具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３に結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号６８のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３に結合する（多重特異性）抗体を提供する。
さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号６７の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７１の配列に少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらなる具体的な態様では、（多重特異性）抗体は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。
一態様において、本発明は、配列番号６７の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７１の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３に結合する（多重特異性）抗体を提供する。一態様において、本発明は、配列番号６７のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９のアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０のアミノ酸配列を含むポリペプチド（特に、２つのポリペプチド）、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４及びＣＤ３に結合する（多重特異性）抗体を提供する。
１０．Ｆｃドメインバリアント
好ましい態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、第１及び第２のサブユニットから構成されるＦｃドメインを含む。
（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、免疫グロブリン分子の重鎖ドメインを含む一対のポリペプチド鎖からなる。例えば、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）分子のＦｃドメインは、ダイマーであり、その各サブユニットは、ＣＨ２及びＣＨ３ ＩｇＧ重鎖定常ドメインを含む。Ｆｃドメインの２つのサブユニットは、互いに安定な会合が可能である。一態様において、本発明の（多重特異性）抗体は１つを超えるＦｃドメインを含まない。
一態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ Ｆｃドメインである。好ましい態様において、ＦｃドメインはＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。別の態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換、特にアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含むＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）。このアミノ酸置換は、インビボでのＩｇＧ４抗体のＦａｂアーム交換を低減する（Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ａｎｄ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ ３８，８４－９１（２０１０）を参照されたい）。さらなる好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。より好ましい態様において、Ｆｃドメインは、ヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域の例示的な配列は、配列番号７８で与えられる。
ａ）ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメイン修飾
本発明による（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方又は他方に融合し得る異なる抗原結合ドメインを含み、したがってＦｃドメインの２つのサブユニットは、典型的には２つの非同一ポリペプチド鎖に含まれる。これらのポリペプチドの組み換え共発現及びその後の二量体化によって、２つのポリペプチドのいくつかの可能な組み合わせが生じる。組み換え産生における（多重特異性）抗体の収率及び純度を改善するため、（多重特異性）抗体のＦｃドメインに、所望のポリペプチドの会合を促進する修飾を導入することが有利である。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間の最も広範なタンパク質－タンパク質相互作用の部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、一態様では、上記修飾は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメインの中にある。
ヘテロ二量体化を強化するために、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン中の修飾に複数の手法が存在し、それらは例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、欧州特許第１８７０４５９号、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２０５８７６８号、国際公開第２０１３１５７９５４号、国際公開第２０１３０９６２９１号に十分に記載されている。典型的には、すべてのこのような手法において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインは、両方とも、各ＣＨ３ドメイン（又はそれを含む重鎖）がもはやそれ自体とホモ二量体化することができず、相補的に操作された他のＣＨ３ドメインとヘテロ二量体化させるような（第１及び第２のＣＨ３ドメインがヘテロ二量体化し、２つの第１又は２つの第２のＣＨ３ドメインの間にホモ二量体が形成されないような）、相補的な様式で操作される。改善された重鎖ヘテロ二量体化のためのこれらの異なる手法は、重鎖／軽鎖の誤対合及びベンス・ジョーンズ型副生成物を低減する、（多重特異性）抗体における重鎖－軽鎖修飾との組み合わせでの異なる代替例として考慮される（例えば、１つの結合アームにおけるＶＨ及びＶＬの交換／置き換え、並びにＣＨ１／ＣＬ界面における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の置換の導入）。
具体的な態様において、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する前記修飾は、いわゆる「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ－ｉｎｔｏ－ｈｏｌｅ）」修飾であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方に「ノブ（ｋｎｏｂ）」修飾及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方に「ホール（ｈｏｌｅ）」修飾を含む。
ノブ・イントゥ・ホール技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号、米国特許第７，６９５，９３６号、Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔ Ｅｎｇ ９、６１７－６２１（１９９６）及びＣａｒｔｅｒ、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈ ２４８、７－１５（２００１）に記載される。通常、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、これにより、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように、突起を空洞内に位置させることができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）で置き換えることによって構築される。突起と同一又は同様の大きさの相補性空洞は、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）で置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に生成される。
したがって、好ましい態様では、（多重特異性）抗体のＦｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置することが可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に空洞を生成し、その中に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能である。
好ましくは、より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）及びトリプトファン（Ｗ）からなる群から選択される。
好ましくは、より小さな側鎖体積を有する前記アミノ酸残基は、アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）及びバリン（Ｖ）からなる群から選択される。
突起及び空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変更することによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、又はペプチド合成によって作製することができる。
具体的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニット（「ホール」サブユニット）（のＣＨ３ドメイン）において、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）。一態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）（特に、位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋の形成が生じ、二量体がさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４８，７－１５（２００１））。
好ましい態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
好ましい態様では、好ましくはＴ細胞活性化抗原、例えばＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインは、Ｆｃドメインの第１のサブユニット（「ノブ」修飾を含む）に融合する（任意選択的に、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメイン、及び／又はペプチドリンカーを介して）。理論に束縛されるものではないが、第２の抗原（例えばＣＤ３）に結合する抗原結合ドメインの、Ｆｃドメインのノブ含有サブユニットへの融合は、第２の抗原に結合する２つの抗原結合ドメインを含む抗体の生成（２つのノブ含有ポリペプチドの立体的衝突（ｓｔｅｒｉｃ ｃｌａｓｈ））を（さらに）最小化する。
ヘテロ二量体化を強化するＣＨ３修飾のための他の技術が本発明による代替例として考慮され、例えば、国際公開第９６／２７０１１号、国際公開第９８／０５０４３１号、ＥＰ１８７０４５９、国際公開第２００７／１１０２０５号、国際公開第２００７／１４７９０１号、国際公開第２００９／０８９００４号、国際公開第２０１０／１２９３０４号、国際公開第２０１１／９０７５４号、国際公開第２０１１／１４３５４５号、国際公開第２０１２／０５８７６８号、国際公開第２０１３／１５７９５４号、国際公開第２０１３／０９６２９１号に記載されている。
一態様では、ＥＰ１８７０４５９に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。この手法は、Ｆｃドメインの２つのサブユニット間のＣＨ３／ＣＨ３ドメイン界面における特定のアミノ酸位置における反対の電荷を有する荷電アミノ酸の導入に基づく。本発明の（多重特異性）抗体の特定の態様は、（Ｆｃドメインの）２つのＣＨ３ドメインの一方におけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインのＣＨ３ドメインの他方におけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
別の態様において、本発明の（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおけるアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含むか、又は前記（多重特異性）抗体は、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖを含み、追加的に、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｒ４０９Ｄ、Ｋ３７０Ｅ及びＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のアミノ酸変異Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋを含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、国際公開第２０１３／１５７９５３号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｋを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、さらなるアミノ酸変異Ｌ３５１Ｋを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｄ及びＬ３６８Ｅから選択されるアミノ酸変異（特に、Ｌ３６８Ｅ）をさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、国際公開第２０１２／０５８７６８号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、位置Ｔ４１１、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｆ４０５、Ｎ３９０又はＫ３９２に、例えば、ａ）Ｔ４１１Ｎ、Ｔ４１１Ｒ、Ｔ４１１Ｑ、Ｔ４１１Ｋ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ又はＴ４１１Ｗ、ｂ）Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｗ、Ｄ３９９Ｙ又はＤ３９９Ｋ、ｃ）Ｓ４００Ｅ、Ｓ４００Ｄ、Ｓ４００Ｒ又はＳ４００Ｋ、ｄ）Ｆ４０５Ｉ、Ｆ４０５Ｍ、Ｆ４０５Ｔ、Ｆ４０５Ｓ、Ｆ４０５Ｖ又はＦ４０５Ｗ、ｅ）Ｎ３９０Ｒ、Ｎ３９０Ｋ又はＮ３９０Ｄ、ｆ）Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｒ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｆ又はＫ３９２Ｅから選択されるさらなるアミノ酸変異を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｌ３５１Ｙ、Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｖ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ａ、Ｋ４０９Ｆを含む。さらなる態様において、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ３９２Ｅ、Ｔ４１１Ｅ、Ｄ３９９Ｒ及びＳ４００Ｒをさらに含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、国際公開第２０１１／１４３５４５号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用され、例えば、３６８及び４０９からなる群から選択される位置にアミノ酸修飾を有する（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様では、上記に記載されたノブ・イントゥ・ホール技術も使用する、国際公開第２０１１／０９０７６２号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｗを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ａを含む。一態様において、第１のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｔ３６６Ｙを含み、第２のＣＨ３ドメインはアミノ酸変異Ｙ４０７Ｔを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一態様において、（多重特異性）抗体又はそのＦｃドメインは、ＩｇＧ２サブクラスのものであり、国際公開第２０１０／１２９３０４号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。
代替的な態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニット及び第２のサブユニットの会合を促進する修飾は、例えば、国際公開第２００９／０８９００４号に記載されるように、静電ステアリング効果を媒介する修飾を含む。通常、この方法は、２つのＦｃドメインサブユニットの界面に、ホモ二量体形成が静電的に望ましくないが、ヘテロ二量体化が静電的に望ましくなるように、帯電したアミノ酸残基による１つ又は複数のアミノ酸残基の置き換えを含む。１つのこのような態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ３９２又はＮ３９２のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ３９２Ｄ又はＮ３９２Ｄ）を含み、第２のＣＨ３ドメインは、正に帯電したアミノ酸によるＤ３９９、Ｅ３５６、Ｄ３５６又はＥ３５７のアミノ酸置換（例えば、リジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）による、特にＤ３９９Ｋ、Ｅ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｋ又はＥ３５７Ｋ、より詳細にはＤ３９９Ｋ及びＥ３５６Ｋ）を含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸によるＫ４０９又はＲ４０９のアミノ酸置換（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）による、特にＫ４０９Ｄ又はＲ４０９Ｄ）をさらに含む。さらなる態様において、第１のＣＨ３ドメインは、負に帯電したアミノ酸（例えば、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ））によるＫ４３９及び／又はＫ３７０のアミノ酸置換を追加的に又は代替的に含む（すべてＫａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
さらなる態様では、国際公開第２００７／１４７９０１号に記載されているヘテロ二量体化手法が代替的に使用される。一態様において、第１のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｋ２５３Ｅ、Ｄ２８２Ｋ及びＫ３２２Ｄを含み、第２のＣＨ３ドメインは、アミノ酸変異Ｄ２３９Ｋ、Ｅ２４０Ｋ及びＫ２９２Ｄを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
また別の態様では、国際公開第２００７／１１０２０５号に記載されているヘテロ二量体化手法を代替的に使用することができる。
一態様において、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｋ３９２Ｄ及びＫ４０９Ｄを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｄ３５６Ｋ及びＤ３９９Ｋを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
ｂ）Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能を低下させるＦｃドメイン修飾
Ｆｃドメインは、（多重特異性）抗体に、標的組織における良好な蓄積に寄与する長い血清半減期を含む好ましい薬物動態特性及び好ましい組織血液分布比を付与する。しかしながら、それは同時に、好ましい抗原担持細胞ではなく、Ｆｃ受容体を発現する細胞への（多重特異性）抗体の望ましくない標的化をもたらすことがある。さらに、Ｆｃ受容体シグナル伝達経路の同時活性化はサイトカイン放出をもたらすことがあり、これはＴ細胞活性化特性及び（多重特異性）抗体の長い半減期と組み合わさって、全身投与するとサイトカイン受容体の過剰な活性化及び重篤な副作用を生じる。Ｔ細胞以外の（Ｆｃ受容体担持）免疫細胞の活性化は、例えば、ＮＫ細胞によるＴ細胞の破壊の可能性によって、（多重特異性）抗体の有効性さえも低減しうる。
したがって、好ましい態様において、本発明による（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈する。１つのこのような態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する、及び／又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）と比較して、５０％未満、特に２０％未満、さらに詳細には１０％未満、最も詳細には５％未満のエフェクター機能を呈する。一態様において、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）は、Ｆｃ受容体に実質的に結合しない及び／又はエフェクター機能を誘導しない。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃ受容体である。一態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに具体的には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も詳細には、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである。一態様において、エフェクター機能は、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びサイトカイン分泌の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、エフェクター機能はＡＤＣＣである。一態様において、Ｆｃドメインは、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に実質的に同様の結合親和性を呈する。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（又はネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）の約７０％超、特に約８０％超、さらに詳細には約９０％超の結合親和性をＦｃＲｎに対して呈するとき、達成される。
一部の態様において、Ｆｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性が低減される及び／又はエフェクター機能が低減されるように操作される。好ましい態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減する１つ又は複数のアミノ酸変異を含む。典型的には、Ｆｃドメインの２つのサブユニットそれぞれに、同じ１つ以上のアミノ酸変異が存在する。一態様では、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体に対するＦｃドメインの結合親和性を下げる。一態様において、アミノ酸変異は、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を、少なくとも２分の１、少なくとも５分の１又は少なくとも１０分の１に低減する。Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を低減する１つを超えるアミノ酸変異が存在する態様において、これらのアミノ酸変異の組み合わせは、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性を少なくとも１０分の１、少なくとも２０分の１又はさらには少なくとも５０分の１にまで低減し得る。一態様において、操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体は、非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体と比較して、２０％未満、特に１０％未満、さらに詳細には５％未満の結合親和性をＦｃ受容体に対して呈する。好ましい態様において、Ｆｃ受容体はＦｃγ受容体である。一部の態様において、Ｆｃ受容体はヒトＦｃ受容体である。いくつかの態様では、Ｆｃ受容体は、活性化Ｆｃ受容体である。具体的な態様では、Ｆｃ受容体は、活性化ヒトＦｃγ受容体であり、さらに具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩ又はＦｃγＲＩＩａであり、最も具体的にはヒトＦｃγＲＩＩＩａである。好ましくは、これらの受容体の各々に対する結合が低減される。いくつかの態様では、補体成分に対する結合親和性、具体的にはＣ１ｑに対する結合親和性も低下する。一態様では、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対する結合親和性は低減されない。ＦｃＲｎへの実質的に同様の結合、即ち、前記受容体へのＦｃドメインの結合親和性の保存は、Ｆｃドメイン（又は前記Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）が、Ｆｃドメインの非操作形態（又は前記Ｆｃドメインの非操作形態を含む（多重特異性）抗体）の結合親和性の約７０％超をＦｃＲｎ対して呈するとき、達成される。Ｆｃドメイン又は前記Ｆｃドメインを含む本発明の（多重特異性）抗体は、そのような親和性の約８０％超、さらには約９０％超を呈しうる。一部の態様において、（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、非操作Ｆｃドメインと比較して、エフェクター機能が低減されるように操作される。エフェクター機能の低減として、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）の低減、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の低減、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）の低減、サイトカイン分泌の低減、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込みの低減、ＮＫ細胞への結合の低減、マクロファージへの結合の低減、単球への結合の低減、多形核細胞への結合の低減、直接的なシグナル伝達誘導性アポトーシスの低減、標的結合抗体の架橋の低減、樹状細胞成熟の低減、又はＴ細胞プライミングの低減のうちの１つ又は複数を挙げることができるが、これらに限定されない。一態様において、エフェクター機能の低減は、ＣＤＣの低減、ＡＤＣＣの低減、ＡＤＣＰの低減及びサイトカイン分泌の低減の群から選択される１つ又は複数である。好ましい態様では、エフェクター機能の低減は、ＡＤＣＣの低減である。一態様において、ＡＤＣＣの低減は、非操作Ｆｃドメイン（又は非操作Ｆｃドメインを含む（多重特異性）抗体）により誘導されるＡＤＣＣの２０％未満である。
一態様において、Ｆｃ受容体へのＦｃドメインの結合親和性及び／又はエフェクター機能を低減するアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。一態様において、Ｆｃドメインは、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な態様において、Ｆｃドメインは、Ｌ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される位置にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。いくつかの態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。一態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９位にアミノ酸置換を含む。より具体的な態様において、アミノ酸置換は、Ｐ３２９Ａ又はＰ３２９Ｇ、特にＰ３２９Ｇである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。一態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９にアミノ酸置換を含み、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７及びＰ３３１から選択される位置にさらなるアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より具体的な態様において、さらなるアミノ酸置換は、Ｅ２３３Ｐ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｌ２３５Ｅ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｄ又はＰ３３１Ｓである。好ましい態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９、Ｌ２３４及びＬ２３５にアミノ酸置換を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。より好ましい態様において、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇ（「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」、「ＰＧＬＡＬＡ」又は「ＬＡＬＡＰＧ」）を含む。具体的には、好ましい態様において、Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含み（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、即ち、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの各々において、位置２３４のロイシン残基はアラニン残基と置き換えられており（Ｌ２３４Ａ）、位置２３５のロイシン残基はアラニン残基で置き換えられており（Ｌ２３５Ａ）、位置３２９のプロリン残基はグリシン残基により置き換えられている（Ｐ３２９Ｇ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインである。アミノ酸置換の「Ｐ３２９Ｇ ＬＡＬＡ」の組み合わせは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているように、ヒトＩｇＧ１ ＦｃドメインのＦｃγ受容体（同様に補体）結合をほとんど完全に消滅させる。国際公開第２０１２／１３０８３１号は、このような変異Ｆｃドメインの調製方法及びその特性、例えばＦｃ受容体結合又はエフェクター機能を決定するための方法も記載する。
ＩｇＧ４抗体は、ＩｇＧ１抗体と比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及びエフェクター機能の低減を呈する。したがって、いくつかの態様において、本発明の（多重特異性）抗体のＦｃドメインは、ＩｇＧ４ Ｆｃドメイン、特にヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである。一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８にアミノ酸置換を含み、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。Ｆｃ受容体への結合親和性及び／又はエフェクター機能をさらに低減させるため、一態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｌ２３５におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｌ２３５Ｅを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。別の態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｐ３２９におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｐ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。好ましい態様において、ＩｇＧ４ Ｆｃドメインは、位置Ｓ２２８、Ｌ２３５及びＰ３２９におけるアミノ酸置換、具体的にはアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。このようなＩｇＧ４ Ｆｃドメイン変異体及びこれらのＦｃγ受容体結合特性は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されている。
好ましい態様において、ネイティブＩｇＧ１ Ｆｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体への結合親和性の低減及び／又はエフェクター機能の低減を呈するＦｃドメインは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン、又はアミノ酸置換Ｓ２２８Ｐ、Ｌ２３５Ｅ及び任意選択的にＰ３２９Ｇを含むヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインである（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
一部の態様では、ＦｃドメインのＮ－グリコシル化が排除された。１つのこのような態様において、Ｆｃドメインは、位置Ｎ２９７におけるアミノ酸変異、特にアスパラギンをアラニンにより置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ａ）又はアスパラギン酸に置き換えるアミノ酸置換（Ｎ２９７Ｄ）を含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。
本明細書に上述され、且つ国際公開第２０１２／１３０８３１号に記載されているＦｃドメインに加え、Ｆｃ受容体結合及び／又はエフェクター機能が低減されたＦｃドメインには、Ｆｃドメイン残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７及び３２９のうちの１つ又は複数の置換を有するものも含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）。そのようなＦｃ変異体には、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７のうちの２つ以上に置換を有するＦｃ変異体が含まれ、残基２６５及び２９７がアラニンに置換されている、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体が含まれる（米国特許第７，３３２，５８１号）。
変異体Ｆｃドメインは、本技術分野で周知の遺伝的方法又は化学的方法を使用する、アミノ酸の欠失、置換、挿入又は修飾によって調製することができる。遺伝的方法は、コードＤＮＡ配列の部位特異的変異導入法、ＰＣＲ、遺伝子合成などを含みうる。正しいヌクレオチド変化は、例えば配列決定によって確認することができる。
Ｆｃ受容体に対する結合は、例えばＥＬＩＳＡによって、又はＢＩＡｃｏｒｅ装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な装置と組み換え発現によって取得されうるＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって、容易に決定することができる。代替的に、Ｆｃ受容体に関するＦｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが知られている細胞株、例えば、ＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するヒトＮＫ細胞を使用して評価してもよい。
Ｆｃドメイン又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体のエフェクター機能は、当技術分野に既知の方法によって測定することができる。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの例は、米国特許第５，５００，３６２号；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８３、７０５９－７０６３（１９８６）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８２、１４９９－１５０２（１９８５）；米国特許第５，８２１，３３７号；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １６６，１３５１－１３６１（１９８７）に記載されている。代替的に、非放射性アッセイを用いてもよい（例えば、ＡＣＴＩＴＭフローサイトメトリー用非放射性細胞傷害アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）及びＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞傷害アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。このようなアッセイに有用なエフェクター細胞としては、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が挙げられる。代替的に、又は追加的に、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、インビボで、例えばＣｌｙｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，６５２－６５６（１９９８）に開示されるような動物モデルにおいて評価されてもよい。
いくつかの態様では、相補性構成要素、具体的にはＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合が低減される。したがって、エフェクター機能が低減されるようにＦｃドメインが操作されるいくつかの態様では、前記エフェクター機能の低減はＣＤＣの低減を含む。Ｃ１ｑ結合アッセイを実行し、Ｆｃドメイン、又はＦｃドメインを含む（多重特異性）抗体がＣ１ｑに結合することができ、したがってＣＤＣ活性を有するかどうかを決定してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び同第２００５／１００４０２号のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行ってもよい（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ－Ｓａｎｔｏｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２，１６３（１９９６）；Ｃｒａｇｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １０１，１０４５－１０５２（２００３）；及びＣｒａｇｇ ａｎｄ Ｇｌｅｎｎｉｅ，Ｂｌｏｏｄ １０３，２７３８－２７４３（２００４）を参照されたい）。
ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定は、当技術分野で既知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ、Ｓ．Ｂ． ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８（１２）：１７５９－１７６９（２００６）；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照されたい）。
Ｂ．ポリヌクレオチド
本発明は、本発明の抗体をコードする単離ポリヌクレオチドをさらに提供する。前記単離ポリヌクレオチドは、単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチドであってよい。
本発明の（多重特異性）抗体をコードするポリヌクレオチドは、完全な抗体をコードする単一のポリヌクレオチドとして発現されてもよく、又は共発現される複数の（例えば、２つ以上の）ポリヌクレオチドとして発現されてもよい。共発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドは、例えば、ジスルフィド結合又は他の手段を介して会合し、機能的な抗体を形成しうる。例えば、抗体の軽鎖部分は、抗体の重鎖を含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現すると、重鎖ポリペプチドは、軽鎖ポリペプチドと会合し、抗体を形成する。別の例では、２つのＦｃドメインサブユニットのうち一方と、任意選択的に１つ又は複数のＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分は、２つのＦｃドメインサブユニットの他方と、任意選択的にＦａｂ分子（の一部）とを含む抗体の一部分に由来する別個のポリヌクレオチドによってコードされてもよい。共発現すると、Ｆｃドメインサブユニットは会合してＦｃドメインを形成する。
いくつかの態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体分子全体をコードする。他の態様では、単離ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように本発明による抗体に含まれるポリペプチドをコードする。
一部の態様では、ポリヌクレオチド又は核酸はＤＮＡである。他の態様では、本発明のポリヌクレオチドはＲＮＡであり、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態である。本発明のＲＮＡは、一本鎖又は二本鎖であってよい。
Ｃ．組み換え方法
本発明の抗体は、例えば、固体状態ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）又は組み換え産生によって得られてもよい。組み換え産生について、抗体をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチド、例えば、上述のものは、さらなるクローニング及び／又は宿主細胞での発現のために、単離され、１つ又は複数のベクターに挿入される。このようなポリヌクレオチドは、従来の手順を使用して容易に単離され、配列決定されうる。一態様では、本発明のポリヌクレオチド（とりわけ単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含むベクター、特に発現ベクターが提供される。当業者に周知の方法を使用し、適切な転写／翻訳制御シグナルと共に、抗体のコード配列を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、インビトロ組み換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ組み換え／遺伝子組み換えが挙げられる。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）；及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ（１９８９）に記載される技術を参照されたい。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスの一部とすることができるか、又は核酸断片であってもよい。発現ベクターは、抗体をコードするポリヌクレオチド（即ちコード領域）が、プロモーター及び／又は他の転写又は翻訳制御要素と共に操作可能に会合してクローン化される発現カセットを含む。本明細書で使用される場合、「コード領域」は、アミノ酸に翻訳されるコドンからなる核酸の一部である。「停止コドン」（ＴＡＧ、ＴＧＡ又はＴＡＡ）は、アミノ酸に翻訳されないが、存在する場合はコード領域の一部であると考えることができる。但し、あらゆるフランキング配列、例えばプロモーター、リボソーム結合部位、転写ターミネーター、イントロン、５’及び３’未翻訳領域などは、コード領域の一部ではない。２つ以上のコード領域が、単一のポリヌクレオチドコンストラクト中の、例えば単一のベクター上に、又は別個のポリヌクレオチドコンストラクト中の、例えば別個の（異なる）ベクター上に、存在していてもよい。さらに、任意のベクターは、単一のコード領域を含んでいてもよく、又は２つ以上のコード領域を含んでいてもよく、例えば本発明のベクターは、１種以上のポリペプチドをコードしてもよく、翻訳後又は翻訳と同時に、タンパク質分解による開裂によって、最終的なタンパク質へと分離される。これに加え、本発明のベクター、ポリヌクレオチド又は核酸は、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチド、又はそのバリアント若しくは誘導体に融合するか、又は融合しない、異種コード領域をコードしうる。異種コード領域としては、限定されないが、特殊な要素又はモチーフ、例えば分泌シグナルペプチド又は異種機能性ドメインが挙げられる。作動可能な会合は、遺伝子産物、例えばポリペプチドのコード領域が、制御配列（複数可）の影響下又は制御下で、遺伝子産物の発現を行うような様式で、１つ以上の制御配列と会合する。２つのＤＮＡ断片（例えば、ポリペプチドコード領域及びこれに関連するプロモーター）は、プロモーター機能の導入によって、所望の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡの転写が起こる場合、及び２つのＤＮＡ断片間の結合の性質が、遺伝子産物の発現を指向する発現制御配列の能力を妨害しないか、又はＤＮＡテンプレートを転写する能力を妨害しない場合、「作動可能に会合する」。したがって、プロモーター領域は、プロモーターが核酸の転写を行うことができる場合、ポリペプチドをコードする核酸と作動可能に会合しうる。プロモーターは、所定の細胞内でのＤＮＡの実質的な転写のみを指向する細胞特異的なプロモーターであってもよい。プロモーター以外の他の転写制御要素、例えばエンハンサー、オペレーター、レプレッサー、及び転写停止シグナルは、細胞特異的な転写を指向するために、ポリヌクレオチドに作動可能に会合することができる。適切なプロモーター及び他の転写制御領域は、本明細書に開示される。種々の転写制御領域が当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、脊椎動物細胞内で機能する転写制御領域、例えば、限定されないが、サイトメガロウイルス由来のプロモーター及びエンハンサーセグメント（例えば最初期プロモーター、イントロン－Ａとの組み合わせで）、シミアンウイルス４０（例えば初期プロモーター）及びレトロウイルス（例えばラウス肉腫ウイルス）が挙げられる。他の転写制御領域としては、脊椎動物遺伝子から誘導されるもの、例えば、アクチン、ヒートショックタンパク質、ウシ成長ホルモン及びウサギβ－グロビン、並びに真核細胞において遺伝子発現を制御することのできる他の配列が挙げられる。さらなる適切な転写制御領域としては、組織特異的なプロモーター及びエンハンサー、並びに誘導性プロモーター（例えばテトラサイクリン誘導性プロモーター）が挙げられる。同様に、種々の翻訳制御要素は当業者に知られている。これらとしては、限定されないが、リボソーム結合部位、翻訳開始及び停止コドン、及びウイルス系から誘導される要素（特に、内部リボソーム侵入部位、即ちＩＲＥＳ、ＣＩＴＥ配列とも呼ばれる）が挙げられる。発現カセットは、例えば、複製の起源及び／又は染色体組み込み要素、例えば、レトロウイルスの長い末端反復（ＬＴＲ）、又はアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）末端逆位配列（ＩＴＲ）などの他の特徴も含んでいてもよい。
本発明のポリヌクレオチド及び核酸コード領域は、分泌又はシグナルペプチドをコードする追加のコード領域と会合してもよく、本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの分泌を指向する。例えば、抗体の分泌が望ましい場合、シグナル配列をコードするＤＮＡは、本発明の抗体又はその断片をコードする核酸の上流に置かれていてもよい。シグナル仮説によれば、哺乳動物細胞によって分泌されるタンパク質は、粗い小胞体全体に成長したタンパク質鎖が外に出始めると成熟タンパク質から切断される、シグナルペプチド又は分泌リーダー配列を有している。当業者は、脊椎動物細胞によって分泌されるポリペプチドが、通常ポリペプチドのＮ末端に融合するシグナルペプチドを有しており、これが翻訳されたポリペプチドから切断されてポリペプチドの分泌した形態又は「成熟」形態を生成することを知っている。一部の態様では、ネイティブシグナルペプチド、例えば免疫グロブリン重鎖又は軽鎖シグナルペプチドが使用されるか、又は作動可能に会合するポリペプチドの分泌を指示する能力を保持する配列の機能性誘導体が使用される。代替的に、異種哺乳動物シグナルペプチド、又はその機能性誘導体が使用されてもよい。例えば、野生型リーダー配列は、ヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ＴＰＡ）又はマウスβ－グルクロニダーゼのリーダー配列で置換されてもよい。
後の精製を容易にするため又は抗体を標識するのに役立てるために使用可能な短いタンパク質配列（例えば、ヒスチジンタグ）をコードするＤＮＡが、ポリヌクレオチドをコードする抗体（断片）の中に、又はその末端に含まれていてもよい。
さらなる態様では、本発明のポリヌクレオチド（即ち単一のポリヌクレオチド又は複数のポリヌクレオチド）を含む宿主細胞が提供される。特定の態様において本発明のベクターを含む宿主細胞が提供される。ポリヌクレオチド及びベクターは、それぞれポリヌクレオチド及びベクターに関連して本明細書に記載する特徴のいずれかを、単独で又は組み合わせて組み込まれてもよい。１つのこのような態様では、宿主細胞は、本発明の抗体（の一部）をコードする１つ又は複数のポリヌクレオチドを含む１つ又は複数のベクターを含む（例えば、それらで形質転換又はトランスフェクトされている）。本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本発明の抗体又はその断片を生成するように操作することが可能な任意の種類の細胞系を指す。抗体の複製及び発現補助に適した宿主細胞は、当技術分野で周知である。このような細胞は、適切な場合、特定の発現ベクターを用いてトランスフェクト又は形質導入されてよく、大規模発酵機に接種するために大量のベクターを含む細胞を成長させ、臨床用途に十分な量の抗体を得ることができる。適切な宿主細胞としては、原核微生物（例えば大腸菌）又は種々の真核生物細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などが挙げられる。例えば、ポリペプチドは、特にグリコシル化が必要でないとき、細菌内で生成されうる。発現後、ポリペプチドは、適切なフラクション中の細菌細胞ペーストから単離されてもよく、さらに精製することができる。原核生物に加え、真核生物の微生物、例えば、糸状菌又は酵母は、ポリペプチドをコードするベクターに適切なクローニング又は発現の宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」された真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全にヒトグリコシル化されたパターンを有するポリペプチドを生成する。Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２２，１４０９－１４１４（２００４）、及びＬｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２４，２１０－２１５（２００６）を参照されたい。（グリコシル化）ポリペプチドの発現に適した宿主細胞も、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、植物細胞及び昆虫細胞が挙げられる。昆虫細胞と組み合わせて、特にヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために使用することができる、多数のバキュロウイルス株が同定されている。植物細胞培養物も、宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号、同第６，０４０，４９８号、同第６，４２０，５４８号、同第７，１２５，９７８号、及び同第６，４１７，４２９号（トランスジェニック植物で抗体を生成するためのＰＬＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳＴＭ技術を記載している）を参照されたい。脊椎動物細胞も、宿主として使用することができる。例えば、懸濁物中で成長するように適合した哺乳動物細胞株が有用な場合がある。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０（ＣＯＳ－７）によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（例えばＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ３６，５９（１９７７）に記載される２９３細胞又は２９３Ｔ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、マウスセルトリ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ ２３，２４３－２５１（１９８０）に記載されるＴＭ４細胞）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリサル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、マウス***腫瘍細胞（ＭＭＴ ０６０５６２）、ＴＲＩ細胞（例えばＭａｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ Ｎ．Ｙ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ３８３、４４－６８（１９８２）に記載されるもの）、ＭＲＣ ５細胞、及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株としては、ｄｈｆｒ－ＣＨＯ細胞を含む、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ７７，４２１６（１９８０））、骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３及びＳｐ２／０が挙げられる。タンパク質生成に適した特定の哺乳動物宿主細胞の総説としては、例えば、Ｙａｚａｋｉ ａｎｄ Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ． ２４８（Ｂ．Ｋ．Ｃ． Ｌｏ，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ）、ｐｐ． ２５５－２６８（２００３）を参照されたい。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、数例を挙げると、哺乳動物培養細胞、酵母細胞、昆虫細胞、細菌細胞及び植物細胞が挙げられるが、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物又は培養植物又は動物組織に含まれる細胞も含まれる。一態様では、宿主細胞は、真核細胞、特にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）細胞又はリンパ球細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）といった哺乳動物細胞である。一態様では、宿主細胞は、ヒト身体中の細胞ではない。
これらの系において外来遺伝子を発現させる標準的な技術は、当技術分野で既知である。抗体などの抗原結合ドメインの重鎖又は軽鎖を含むポリペプチドを発現する細胞を操作して他方の抗体鎖も発現させ、発現した生成物が、重鎖及び軽鎖の両方を有する抗体となるようにすることができる。
一態様では、本発明による抗体を生成する方法が提供され、この方法は、抗体の発現に適した条件下で、本明細書に提供される抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養すること、及び任意選択的に、宿主細胞（又は宿主細胞培地）から抗体を回収することを含む。
本発明の（多重特異性）抗体の成分は、互いに遺伝子的に融合していてよい。（多重特異性）抗体は、その構成要素が、互いに直接的に又はリンカー配列を通して間接的に融合されるように設計することができる。リンカーの組成及び長さは、当技術分野で周知の方法に従って決定されてもよく、有効性について試験されてもよい。（多重特異性）抗体の異なる構成要素の間のリンカー配列の例が、本明細書で提供される。必要に応じて、開裂部位を組み込んで融合の個々の構成要素を分離するために、追加の配列が含まれていてもよい（例えば、エンドペプチダーゼ認識配列）。
本明細書で記載するように調製される抗体は、例えば、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの当技術分野で既知の技術によって精製されてもよい。特定のタンパク質を精製するために使用される実際の条件は、部分的には、正味の電荷、疎水性、親水性などの因子に依存するであろうし、当業者には明らかであろう。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、抗体が結合する抗体、リガンド、受容体又は抗原を使用することができる。例えば、本発明の抗体のアフィニティークロマトグラフィー精製のために、プロテインＡ又はプロテインＧを含むマトリックスを使用することができる。連続したプロテインＡ又はＧのアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、実施例に本質的に記載されるように抗体を単離することができる。抗体の純度は、ゲル電気泳動、高圧液体クロマトグラフィーを含む種々の周知の分析方法のいずれかによって決定することができる。
Ｄ．アッセイ
本明細書に提供される抗体は、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物活性について、当技術分野で既知の様々なアッセイによって、同定、スクリーニング、又は特性評価されうる。
１．結合アッセイ
Ｆｃ受容体又は標的抗原に対する抗体の結合（親和性）は、例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの標準的な器具類、及び例えば組み換え発現により入手可能な受容体又は標的抗原を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定することができる。代替的に、異なる受容体又は標的抗原に対する抗体の結合が、特定の受容体又は標的抗原を発現する細胞株を使用して、例えばフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）により、評価されてもよい。ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対する結合活性を測定するための特定の説明的且つ例示的な態様が以下に記載される。
一態様において、本発明の（多重特異性）抗体のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対する結合親和性は、ＳＰＲにより以下のように決定される：
ＳＰＲを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）において、２５℃で、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ７．４、０．００５％界面活性剤Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ－１００６－６９））を用いて実施する。抗ヒトＦｃ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ－１００８－３９）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にアミンカップリングにより直接固定化する。ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を、６０秒間２．５ｎＭで捕捉する。ＨＢＳ－ＥＰ（６．１７～１５００ｎＭ）中のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９複合体の３倍希釈系列を、２４０秒間３０μｌ／分でリガンド上を通過させ、会合相を記録する。解離相を２４０秒間監視し、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へのスイッチングによってトリガーする。チップ表面を、３ＭのＭｇＣｌ２注入を１０μｌ／分で３０秒間使用する各サイクルの後で再生する。バルク屈折率差を、抗ヒトＦｃ抗体を含むが捕捉されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を有さない基準フローセルに得られた応答を差し引くことにより、訂正する。親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出する。
２．活性アッセイ
本発明の（多重特異性）抗体の生物活性は、実施例に記載されるように、様々なアッセイによって測定することができる。生物活性には、例えばＴ細胞の増殖の誘導、Ｔ細胞内のシグナル伝達の誘導、Ｔ細胞内の活性化マーカーの発現の誘導、Ｔ細胞によるサイトカイン分泌の誘導、腫瘍細胞などの標的細胞の溶解の誘導、並びに腫瘍退縮及び／又は生存の向上の誘導が含まれうる。
Ｅ．組成物、製剤、及び投与経路
さらなる態様において、本発明は、例えば以下の治療方法のいずれかにおいて使用するための、本明細書に提供される抗体のうちのいずれかを含む医薬組成物を提供する。一態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、薬学的に許容される担体とを含む。別の態様では、医薬組成物は、本発明による抗体と、少なくとも１つの追加の治療剤、例えば、以下に記載するものとを含む。
さらには、インビボでの与に適した形態で本発明の抗体を生成する方法が提供され、この方法は、（ａ）本発明による抗体を得ること、及び（ｂ）抗体と、少なくとも１つの薬学的に許容される担体とを配合し、それによって、抗体の製剤を、インビボでの投与のために配合することとを含む。
本発明の医薬組成物は、薬学的に許容される担体に溶解又は分散した有効量の抗体を含む。「医薬的に許容される」との表現は、通常、使用する投薬量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、即ち、適切な、例えばヒトといった動物に投与したときに、有害な反応、アレルギー反応又は他の不都合な反応を生まない分子要素及び組成物を指す。抗体と、任意選択的にさらなる有効成分とを含む医薬組成物の調製は、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０に例示される本開示の観点から、当業者に既知である。さらに、動物（例えば、ヒト）投与の場合、製剤が、ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ又は他の国の対応する機関によって要求される滅菌性、発熱原性、一般的安全性及び純度基準を満たすべきであることが理解されるであろう。好ましい組成物は、凍結乾燥製剤又は水溶液である。本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」は、当業者に知られているように（例えば、参照により本明細書に組み込まれるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０，ｐｐ． １２８９－１３２９を参照されたい）、任意及びすべての溶媒、緩衝液、分散媒体、コーティング、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（例えば抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、酸化防止剤、タンパク質、薬物、薬物安定化剤、ポリマー、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、染料、このような類似の材料及びこれらの組み合わせを含む。いずれかの従来の担体が有効成分と適合しない場合を除き、医薬組成物中にそれを使用することが企図されている。
本発明の抗体（及び任意の追加の治療剤）は、非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに局所治療のために望まれる場合、病変内投与を含む、任意の適切な手段によって投与することができる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。投薬は、任意の適切な経路により、例えば、投与が一時的であるか慢性的であるかに部分的に依存して、注射、例えば静脈内注射又は皮下注射により行うことができる。
非経口組成物としては、注射、例えば皮下、皮内、病巣内、静脈内、動脈内、筋肉内、髄腔内、又は腹腔内注射による投与のために設計されているものが挙げられる。注射のために、本発明の抗体は、水溶液、特にハンクス溶液、リンゲル液、又は生理食塩水緩衝液といった生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化することができる。溶液は、配合剤、例えば懸濁剤、安定化剤及び分散剤を含有していてもよい。代替的に、抗体は、適切なビヒクル、例えば、滅菌した発熱性物質除去水と共に使用前に構成するための粉末形態であってもよい。滅菌した注射可能な溶液は、必要に応じて以下に列挙する種々の他の成分と共に、本発明の抗体を必要な量で適切な溶媒に組み込むことによって調製される。滅菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成されうる。一般的に、分散物は、種々の滅菌した有効成分を、塩基性分散媒体及び／又は他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌した注射可能な溶液、懸濁物又は乳化物を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、以前に滅菌濾過した液体媒体から有効成分と任意の追加の所望の成分との粉末が得られる減圧乾燥又は凍結乾燥技術である。液体媒体は、必要に応じて適切に緩衝化されているべきであり、注射する前に、十分な食塩水又はグルコースで液体希釈剤をまず等張性にする。組成物は、製造条件及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の混入作用から保護されなければならない。エンドトキシン汚染を安全なレベルに最小限に、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に維持すべきであることが認識されるだろう。適切な薬学的に許容される担体としては、限定されないが、緩衝液、例えば、ホスフェート、シトレート及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド；ベンゼトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３－ペンタノール；及びｍ－クレゾール）；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン；単糖類、二糖類及び他の炭水化物（グルコース、マンノース又はデキストリンを含む）；キレート化剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖類、例えば、ショ糖、マンニトール、トレハロース又はソルビトール；塩を形成する対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）；及び／又は非イオン性界面活性剤、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。注射懸濁液は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、デキストランなどといった懸濁物の粘度を上げる化合物を含んでいてもよい。任意選択的に、懸濁物は、適切な安定化剤、又は高度に濃縮した溶液の調製を可能にするために化合物の溶解度を高める薬剤を含んでいてもよい。加えて、活性化合物の懸濁物は、適切な油注射懸濁物として調製されてもよい。適切な親油性溶媒又はビヒクルとしては、ゴマ油、又は合成脂肪酸エステル、例えば、エチルクリート（ｅｔｈｙｌ ｃｌｅａｔ）又はトリグリセリド、若しくはリポソームといった脂肪族油が挙げられる。
有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、又は界面重合、例えば、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）又はマクロエマルジョンにおいて、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン－マイクロカプセル及びポリ－（メチルメタシレート）マイクロカプセルによって調製されたマイクロカプセル内に封入することができる。このような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ Ｅｄ． Ｍａｃｋ Ｐｒｉｎｔｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）に開示されている。持続放出性製剤を調製してもよい。徐放性製剤の適切な例としては、ポリペプチドを含有する固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、成型物品の形態、例えばフィルム又はマイクロカプセルである。特定の態様では、注射可能組成物の持続性吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、又はこれらの組み合わせの組成物での使用によってもたらすことができる。
前述の組成物に加え、抗体は、デポ剤として配合されてもよい。このような長く作用する製剤は、埋め込みによって（例えば、皮下又は筋肉内）、又は筋肉内注射によって投与されてもよい。したがって、例えば、抗体は、適切なポリマー若しくは疎水性材料（例えば、許容される油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂を用いて、又は難溶性の誘導体として、例えば難溶性の塩として配合されてもよい。
本発明の抗体を含む医薬組成物は、従来の混合、溶解、乳化、カプセル化、封入又は凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。医薬組成物は、１つ又は複数の生理学的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤又はタンパク質を薬学的に使用可能な製剤へと加工するのを容易にする補助剤を使用して、従来の様式で配合されてもよい。適切な製剤は、選択する投与経路によって変わる。
抗体は、遊離酸若しくは遊離塩基、中性又は塩形態で組成物に配合されてもよい。薬学的に許容可能な塩は、遊離酸又は遊離塩基の生物活性を実質的に保持する塩である。薬学的に許容可能な塩としては、酸付加塩、例えば、タンパク質性組成物の遊離アミノ基と形成される酸付加塩、又は例えば塩酸若しくはリン酸といった無機酸と形成されるか、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸若しくはマンデル酸のような有機酸と形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基と形成される塩も、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄といった無機塩基から誘導されてもよく、又はイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン又はプロカインといった有機塩基から誘導されてもよい。医薬塩は、対応する遊離塩基形態よりも、水性及び他のプロトン性溶媒に溶けやすい傾向がある。
Ｆ．治療方法及び組成物
本明細書で提供される抗体のいずれも、治療方法に使用することができる。本発明の抗体は、例えばがんの治療において、免疫治療剤として使用されうる。
治療方法における使用のために、本発明の抗体は、医学行動規範と一致した様式で配合され、用量決定され、投与される。これに関連して考慮すべき要因としては、治療される特定の疾患、治療される特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、疾患の原因、薬剤の送達部位、投与方法、投与スケジュール、及び医療従事者に既知である他の要因が挙げられる。
一態様では、医薬としての使用のための本発明の抗体が提供される。さらなる態様では、疾患の治療における使用のための本発明の抗体が提供される。一部の態様では、治療方法における使用のための本発明の抗体が提供される。一態様では、本発明は、疾患の治療を必要とする個体の疾患の治療における使用のための本発明の抗体を提供する。一部の態様では、本発明は、個体に有効量の抗体を投与することを含む、疾患を有する個体を治療する方法における使用のための抗体を提供する。一部の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。一部の態様では、この方法は、さらに、個体に対し、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）を投与することを含む。さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導することに使用するための本発明の抗体を提供する。一部の態様では、本発明は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に有効量の抗体を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のための本発明の抗体を提供する。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様では、本発明は、医薬の製造又は調製における本発明の抗体の使用を提供する。一態様では、医薬は、疾患の治療を必要とする個体における疾患の治療のためのものである。さらなる態様では、医薬は、疾患を有する個体に対し、有効量の医薬を投与することを含む、疾患を治療する方法における使用のためのものである。一部の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。一態様では、この方法は、個体に対し、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）の有効量を投与することをさらに含む。さらなる態様では、医薬は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するためのものである。またさらなる態様では、医薬は、標的細胞の溶解を誘導するために個体に対して有効量の医薬を投与することを含む、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導する方法における使用のためのものである。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様において、本発明は、疾患を治療するための方法を提供する。一態様では、この方法は、このような疾患を有する個体に対し、本発明の抗体の有効量を投与することを含む。一態様では、組成物は、前記個体に投与され、本発明の抗体を薬学的に許容される形態で含んでいる。一部の態様では、治療される疾患は、増殖性障害である。好ましい態様では、疾患は、がんである。一部の態様では、この方法は、さらに、個体に対し、少なくとも１つの追加の治療剤の有効量（例えば、治療される疾患ががんである場合は抗がん剤）を投与することを含む。上記のいずれかの態様による「個体」は、哺乳動物、好ましくはヒトであってよい。
さらなる態様では、本発明は、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法を提供する。一態様では、この方法は、Ｔ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞の存在下において、標的細胞を本発明の抗体と接触させることを含む。さらなる態様では、個体において、標的細胞、特に腫瘍細胞の溶解を誘導するための方法が提供される。１つのこのような態様では、方法は、個体に対し、標的細胞の溶解を誘導するために、有効量の本発明の抗体を投与することを含む。一態様では、「個体」は、ヒトである。
一部の態様では、治療される疾患は、増殖性障害、特にがんである。がんの非限定的な例としては、膀胱がん、脳がん、頭頸部がん、膵臓がん、肺がん、乳がん、卵巣がん、子宮がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、食道がん、結腸がん、結腸直腸がん、直腸がん、胃がん、前立腺がん、血液がん、皮膚がん、扁平上皮癌、骨がん及び腎臓がんが挙げられる。本発明の抗体を用いて治療されうる他の細胞増殖障害としては、限定されないが、腹部、骨、***、消化器系、肝臓、膵臓、腹膜、内分泌腺（副腎、副甲状腺、脳下垂体、睾丸、卵巣、胸腺、甲状腺）、眼、頭頸部、神経系（中枢及び末梢）、リンパ系、骨盤、皮膚、軟組織、脾臓、胸部領域及び泌尿生殖器系に位置する新生物が挙げられる。前がん状態又は病変及びがん転移も含まれる。一部の態様では、がんは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんである。一部の態様では、がんは、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、皮膚がん、胃がん及び卵巣がんからなる群から選択されるがんである。当業者であれば、多くの場合に、抗体は治癒を提供せずに部分的な恩恵のみを提供する場合があることを容易に認識する。いくつかの態様では、いくらかの恩恵を有する生理学的変化も治療上有益であるとみなされる。したがって、いくつかの態様では、生理学的変化を与える抗体の量は、「有効量」と考えられる。治療が必要な対象、患者又は個体は、典型的には哺乳動物であり、具体的にはヒトである。
いくつかの態様では、有効量の本発明の抗体が、疾患を治療するために個体に投与される。
疾患の予防又は治療のために、本発明の抗体の適切な投薬量（単独で又は１つ又は複数の他の追加の治療剤と組み合わせて使用される場合）は、治療される疾患の種類、投与経路、患者の体重、抗体の種類、疾患の重篤度及び経過、抗体が予防目的で投与されるか又は治療目的で投与されるか、以前又は現在の治療介入、患者の病歴及び抗体に対する応答、並びに主治医の裁量に依存するであろう。投与に責任を持つ施術者はいずれにせよ、組成物中の有効成分（複数可）の濃度、及び個々の対象のための適切な用量（複数可）を決定することになる。単回又は様々な時点にわたる複数回投与、ボーラス投与、及びパルス輸注を含むが、これらに限定されない様々な投薬スケジュールが本明細書で企図される。
抗体は、適切には、患者に一度に又は一連の治療にわたって投与される。疾患の種類及び重篤度に応じて、約１μｇ／ｋｇ～１５ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体を、例えば、１回の又は複数回の別個の投与によるか、又は連続的な注入によるかに関わらず、患者に投与するための初期の候補投薬量とすることができる。典型的な１日投薬量は、上述の因子に依存して、約１μｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲となりうる。数日間又はそれ以上にわたる反復投与において、状態に応じ、治療は通常、疾患症状の所望の抑制が生じるまで続けられる。抗体の１つの例示的投与量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲であろう。他の非限定的な例では、用量は、１回の投与当たり、約１μｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重、約１０μｇ／ｋｇ体重、約５０μｇ／ｋｇ体重、約１００μｇ／ｋｇ体重、約２００μｇ／ｋｇ体重、約３５０μｇ／ｋｇ体重、約５００μｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、約５ｍｇ／ｋｇ体重、約１０ｍｇ／ｋｇ体重、約５０ｍｇ／ｋｇ体重、約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約２００ｍｇ／ｋｇ体重、約３５０ｍｇ／ｋｇ体重、約５００ｍｇ／ｋｇ体重から、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、又はそれよりも多く、及びこれらから誘導される任意の範囲を含んでもよい。本明細書に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ体重～約１００ｍｇ／ｋｇ体重、約５μｇ／ｋｇ体重～約５００ｍｇ／ｋｇ体重などの範囲を、上述の数に基づいて投与することができる。したがって、約０．５ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇ（又はこれらの任意の組み合わせ）のうちの１つ又は複数の用量が、患者に投与されうる。このような用量は、断続的に、例えば毎週又は３週間毎（例えば、患者が約２～約２０回、又は例えば約６回の用量の抗体を受容するように）投与されてもよい。より高い初回負荷用量を投与し、続いて１回又は複数回のより低い用量を投与してもよい。しかしながら、他の投薬レジメンも有用でありうる。この療法の進行は、従来の技術及びアッセイによって容易に監視される。
本発明の抗体は、通常、意図した目的を達成するために有効な量で使用される。疾患状態を治療又は予防するための使用のために、本発明の抗体、又はその医薬組成物が、有効量で投与又は塗布される。
全身投与の場合、有効な用量は、インビトロアッセイ、例えば細胞培養アッセイから最初に概算することができる。次いで、細胞培養物中で決定されるＩＣ５０を含む血中濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで配合してもよい。このような情報を使用し、ヒトにおける有用な用量をさらに正確に決定することができる。
初期用量も、インビボデータから、例えば、動物モデルから、当技術分野で周知の技術を使用して概算することができる。
治療効果を維持するために十分な抗体の血漿濃度を与えるように、投薬量及び投薬間隔は個々に調節されてもよい。注射による投与のための通常の患者用量は、約０．１～５０ｍｇ／ｋｇ／日、典型的には約０．５～１ｍｇ／ｋｇ／日の範囲である。治療に有効な血漿レベルは、各日に複数回の用量を投与することによって達成されてもよい。血漿中のレベルは、例えば、ＨＰＬＣによって測定することができる。
本発明の抗体の有効な用量は、通常、実質的な毒性を引き起こすことなく治療効果を提供する。抗体の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な医薬手順によって決定することができる。細胞培養アッセイ及び動物実験を使用し、ＬＤ５０（集団の５０％が死に至る用量）及びＥＤ５０（集団の５０％において治療が有効である用量）を決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きい治療指数を呈する抗体が好ましい。一態様では、本発明による抗体は、高い治療指数を呈する。細胞培養アッセイ及び動物実験から得られるデータを、ヒトでの使用に適した投薬範囲を配合する際に使用することができる。投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど又はまったくないＥＤ５０を含む血中濃度の範囲内にある。投薬量は、例えば、用いられる投薬量、利用される投与経路、対象の状態などの種々の因子に依存して、この範囲内で変動しうる。正確な製剤、投与経路及び投薬量は、患者の状態という観点から個々の医師によって選択されうる（例えば、その全体が本明細書に参考として組み込まれる、Ｆｉｎｇｌ ｅｔ ａｌ．，１９７５、ｉｎ：Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｃｈ． １、ｐ． １参照）。
本発明の抗体で治療される患者の主治医は、毒性、臓器不全などに起因して、どのように、いつ、投与を中止、中断、又は調整するかを知っているであろう。逆に、主治医は、臨床応答が十分でない場合（毒性を生じずに）、治療をもっと高レベルにするように調整することも知っている。目的の疾患の管理において投与される用量の大きさは、治療される状態の重篤度、投与経路などにより変わるであろう。状態の重篤度は、例えば、部分的には、標準的な診断評価方法によって評価されてもよい。さらに、用量と、おそらく投与頻度は、個々の患者の年齢、体重及び応答によっても変わるであろう。
本発明の抗体は、治療において、１つ又は複数の他の薬剤と組み合わせて投与されてもよい。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療剤と共投与されてもよい。用語「治療剤」は、このような治療が必要な個体において、症状又は疾患を治療するために投与される任意の薬剤を包含する。このような追加の治療剤は、治療される特定の疾患に適した任意の有効成分、好ましくは、互いに有害な影響を与えない相補的な活性を有するものを含むことができる。一部の態様では、追加の治療剤は、免疫制御剤、細胞増殖抑制剤、細胞接着の阻害剤、細胞傷害性薬剤、細胞アポトーシスの活性化剤、又はアポトーシス誘導因子に対する細胞の感受性を高める薬剤である。好ましい態様では、追加の治療剤は、抗がん剤、例えば、微小管破壊剤、代謝拮抗物質、トポイソメラーゼ阻害剤、ＤＮＡインターカレーター、アルキル化剤、ホルモン治療、キナーゼ阻害剤、受容体アンタゴニスト、腫瘍細胞アポトーシスの活性化剤、又は抗血管形成剤である。
このような他の薬剤は、適切には、意図する目的にとって有効な量の組み合わせで存在する。このような他の薬剤の有効量は、使用される抗体の量、障害又は治療の種類、及び上述の他の因子に依存する。抗体は、通常、同じ投薬量で、本明細書に記載の投与経路で使用されるか、又は約１～９９％の本明細書に記載の投薬量で、又は経験的／臨床的に適切であると決定される任意の投薬量及び任意の経路で使用される。
上述のこのような併用療法は、組み合わせた投与（２つ以上の治療剤が、同じ又は別個の組成物に含まれる）、及び別個の投与を包含し、この場合、本発明の抗体の投与は、追加の治療剤及び／又はアジュバントの投与前、投与と同時及び／又は投与後に行うことができる。本発明の抗体は、放射線療法と組み合わせて使用されてもよい。
Ｇ．製造物品
本発明の別の態様では、上述の障害の処置、予防、及び／又は診断に有用な材料を含有する製造物品が提供される。製造物品は、容器と、容器上の又は容器に付随するラベル又は添付文書とを備えている。適切な容器としては、例えば、瓶、バイアル、シリンジ、ＩＶ溶液バッグなどが挙げられる。容器は、ガラス又はプラスチックなどの種々の材料から形成することができる。容器は、状態を治療、予防、及び／又は診断するために、単独で又は有効な別の組成物と組み合わせて使用される組成物を保持し、無菌アクセスポートを有することができる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針によって穿孔可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。組成物中の少なくとも１つの活性剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選択される状態を治療するために使用されることを示す。さらに、製造物品は、（ａ）本発明の抗体を含む組成物が入った第１の容器、及び（ｂ）細胞障害性剤又は他の治療剤をさらに含む組成物が入った第２の容器を備えることができる。本発明のこの態様における製造物品は、組成物が特定の状態を治療するために使用されうることを示す添付文書をさらに含んでいてもよい。代替的に又は追加的に、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液などの薬剤学的に許容される緩衝剤を含む第２の（又は第３の）容器をさらに備えることができる。製造物品は、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器を含む、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでいてもよい。
Ｈ．診断及び検出のための方法及び組成物
一部の態様において、本明細書に提供される抗体はいずれも、生体試料中のその標的（例えば、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４）の存在を検出するために有用である。本明細書で使用される「検出」という用語は、定量的又は定性的な検出を包含する。一部の態様において、生体試料は、細胞又は組織、例えば前立腺組織を含む。
一態様において、診断又は検出の方法における使用のための、本発明による抗体が提供される。さらなる態様において、生体試料中のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４の存在を検出する方法が提供される。一部の態様において、方法は、生体試料と、本発明の抗体とを、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に対する抗体の結合を許容する条件下で接触させることと、複合体が、抗体とＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４との間で形成されるかどうかを検出することとを含む。このような方法は、インビトロ法でも又はインビボ法でもよい。一態様において、本発明の抗体は、例えばＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４が患者の選択のためのバイオマーカーである場合、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を用いた治療法に的確な対象を選択するために使用される。
本発明の抗体を使用して診断されうる例示的な障害としては、がん、特に皮膚がん又は脳がんが挙げられる。
一部の態様において、標識された、本発明による抗体が提供される。標識には、直接検出される標識又は部分（例えば、蛍光標識、発色性標識、電子密度標識、化学発光標識、及び放射性標識）、並びに酵素反応又は分子間相互作用を介して間接的に検出される部分、例えば、酵素又はリガンドが含まれるが、これらに限定されない。例示的な標識には、限定されないが、放射性同位元素３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ、希土類キレート又はフルオレセイン及びその誘導体といったフルオロフォア、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェラーゼ、例えばホタルルシフェラーゼ及び細菌性ルシフェラーゼ（米国特許第４，７３７，４５６号）、ルシフェリン、２，３－ジヒドロフタラジンジオン、ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ、β－ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リゾチーム、サッカライドオキシダーゼ、例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース－６－リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＲＰ、ラクトペルオキシダーゼ、又はマイクロペルオキシダーゼといった色素前駆体を酸化するために過酸化水素を用いる酵素、ビオチン／アビジン、スピンラベル、バクテリオファージラベル、及び安定したフリーラジカルなどと結合した、ウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼといった複素環オキシダーゼが含まれる。
ＩＩＩ．配列
Figure 0007296467000001
Figure 0007296467000002
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Figure 0007296467000027
ＩＶ．実施例
以下は、本発明の方法及び組成物の実施例である。上述の一般的な説明を考慮すると、種々の他の態様が実施されうることが理解される。
実施例１．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーの生成
抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ Ｆａｂの選択とスクリーニング
抗ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ Ｆａｂが、異なるＶ－ドメインファミリーから得られたＶＬとＶＨの対合からなる合成Ｆａｂライブラリーからファージディスプレイにより選択した。これらのライブラリーは、ＶＬ及びＶＨドメインのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３に配列多様性を有するヒトフレームワーク全体に基づくものである。
以下のプロトコルに従って、溶液中で選択操作（バイオパニング）を実施した：１．５００ｎＭの無関係のビオチン化ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ複合体でコーティングされたニュートラアビジン被覆９６ウェルプレート上でのライブラリープール当たり～１０１２個のファージミド粒子のプレクリアリング（ＷＴＲＭＦペプチドについては配列番号８４を参照）、２．総容積８００μｌでの０．５時間にわたる、１００ｎＭのビオチン化ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥＡ４ｐ２３０－２３９複合体を用いた非ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ結合ファージミド粒子のインキュベーション、３．シェーカーに８０μｌのストレプトアビジン被覆磁性粒子を２０分間加えることによるビオチン化ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９及び特異的結合ファージの捕捉、４．磁性粒子セパレーターを使用した、それぞれ１ｍｌのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０で５～１０ｘ及び１ｍｌのＰＢＳで５－１０ｘの磁性粒子の洗浄、５．１００ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）ｌｍｌを５～１０分間加えることによるファージ粒子の溶出、及び１ＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．４）の１／２容積の付加による中和、６． 溶出されたファージ粒子を用いた対数期大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、３７℃で０．５時間のシェーカーでのインキュベーション、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、３０℃で一晩のシェーカーでのインキュベーション、及びその後の、次の選択操作に使用されるファージミド粒子のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
選択は、それぞれ１００ｎＭ、５０ｎＭ、５０ｎＭ及び１０ｎｍの漸減抗原濃度を使用して３～４回にわたり実行した。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４結合アッセイ：ファージディスプレイによって得られたＦａｂの特性評価のためのサンドイッチＥＬＩＳＡ法
個々のクローンを、９６ウェルフォーマットにおいて１ｍｌの培養物として細菌により発現させ、上清（ＦＬＡＧ又はＴ７配列でタグ付けした、可溶型Ｆａｂフォーマットのバインダーを有する）をＥＬＩＳＡによるスクリーニングに供した。特異的なバインダーは、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥｐ２３０－２３９については５ｘ背景を上回るシグナルを、ＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦ（無関係のＨＬＡ－Ａ２／ペプチド複合体）については３ｘ背景を下回るシグナルを有するものとして定義された。さらに詳細には、ニュートラアビジン９６ウェルストリッププレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を、１０ｎＭのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥｐ２３０－２３９又は５０ｎＭのＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦで３７℃で３０分間コーティングし、続いてプレートを、２％（ｗ／ｖ）のｍｉｌｋ－リン酸緩衝生理食塩水（ＭＰＢＳ）（２００μｌ／ウェル）で１～２時間室温でブロックした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、次いでＦａｂ含有細菌上清を加え、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでのさらに３回の洗浄工程の後、抗ＦＬＡＧ－ＨＲＰ二次抗体（１：４０００）又は抗Ｔ７－ＨＲＰ二次抗体（１：１００００）を加え、プレートを１時間室温でインキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、１００μｌ／ウェルのＢＭ Ｂｌｕｅ ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ）を加えることにより発展させた。酵素反応を、５０μｌ／ウェルの１Ｍ Ｈ２ＳＯ４を加えることにより停止させた。ＯＤ４５０－９００の最終読み出しのために、ＯＤを４５０ｎｍで読み取った（９００ｎｍでの参照）。ＥＬＩＳＡ陽性クローンを、後述の動態スクリーニング実験に供した。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４結合アッセイ：ファージディスプレイによって得られたＦａｂの速度論的特性評価のための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
特異的バインダーは、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサー（ＢｉｏＲａｄ）を使用したＦａｂ含有細菌培養上清の表面プラズモン共鳴－スクリーニングにより同定した。簡単には、溶出されたファージ粒子による対数期大腸菌ＴＧ１細胞の感染後、単一コロニー形成単位（ｃｆｕ）を蒔き、９６ディープウェルプレートに１ｍｌの発現培養物の播種のために採取した。
すべての実験は、ランニングバッファーとしてＰＢＳＴを使用し（１０ｍＭ ＰＢＳ、ｐＨ７．４、及び０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０）、２５℃で実施した。ＧＬＭセンサーチップを備えたＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６バイオセンサー及びカップリング試薬（１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ４．５、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド［スルホ－ＮＨＳ］、１－エチル－３－（３－ジメチルアミンプロピル）－カルボジイミド塩酸塩［ＥＤＣ］及びエタノールアミン）を使用した（すべてＢｉｏＲａｄ）。
ＧＬＭチップ上で３０μｌ／分で固定化を実施した。ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異性抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を、標準的なアミンカップリング手順を使用して垂直方向にカップリングした：６個すべてのリガンドチャネルを５分間ＥＤＣ（２００ｍＭ）とスルホ－ＮＨＳ（５０ｍＭ）の混合物で活性化した。表面が活性化された直後に、ｐＡｂ（ヤギ）抗ヒトＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）２特異性抗体（５０μｇ／ｍｌ、１０ｍＭの酢酸ナトリウム、ｐＨ５）を６個すべてのチャネルに５分間注入した。最後に、チャネルを、１Ｍのエタノールアミン－ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の５分の注入によりブロックした。最終的な固定化レベルはすべてのチャネルで同様であり、１００００～１１５００ＲＵの範囲であった。Ｆａｂ抗体を、個別の水平チャネル（３０μｌ／ｍｉｎ）のうちの５つに沿った５分間の同時注入により大腸菌上清から捕捉し、それは上清中のＦａｂの濃度に応じて２００～９００ＲＵの範囲のレベルであった。調整された培地を６つ目のチャネルに沿って注入し、二重参照目的のための「インライン」ブランクを提供した。ワンショット反応速度測定を、垂直チャネルに沿った２分間のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥｐ２３０－２３９又はＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦの希釈系列（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ、５０μｌ／分）の注入により実施した。解離を３分間監視した。反応速度データをＰｒｏｔｅＯｎ Ｍａｎａｇｅｒ ｖ． ２．１で分析した。反応スポットデータの処理には、インラインバッファーブランクを使用するスポット間参照及び二重参照工程の適用が含まれた（Ｍｙｓｚｋａ，Ｊ Ｍｏｌ Ｒｅｃｏｇｎｉｔ（１９９９）１２，２７９－２８４）。複製ワンショット注入からの処理データを、物質輸送なしで試料の１：１ラングミュア結合モデルにフィッティングした（Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９９３）２１２，４５７－４６８）。
４８ウェルフォーマットにおけるＨＥＫ生成物の上清由来のＩｇＧの測定のために、分離した別個の水平チャネル全体のうちの５つに沿った５分間の同時注入（３０μｌ／分）によりＩｇＧバリアントがＨＥＫ２９３上清から捕捉され、それは２００～４００ＲＵの範囲のレベルであった。調整された培地を６つ目のチャネルに沿って注入し、二重参照目的のための「インライン」ブランクを提供した。ワンショット反応速度測定を、垂直チャネルに沿った３分間のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥｐ２３０－２３９又はＨＬＡ－Ａ２／ＷＴ１ＲＭＦの希釈系列（１００、５０、２５、１２．５、６．２５、０ｎＭ、５０μｌ／分）の注入により実施した。解離を５分間監視した。反応速度データを上述のように分析した。
結合プロファイル及び測定された抗原に対する結合の特異性に基づいて、バインダーを最終候補に入れ、機能アッセイにおいて測定した。
選択されたすべてのバインダー（００７Ａ０９、００７Ｄ１０、０５７Ｂ０４、０５７Ｄ０３、０３２Ｇ０９、０３４Ｆ０５）の配列を、本明細書に含まれる配列表に提供し、以下の表１にまとめる。
表１．選択されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーのアミノ酸配列
Figure 0007296467000028
実施例２．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧ及びＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体の調製
ＣＤ３二重特異性抗体は、本明細書では「Ｔ細胞二重特異性抗体」、「ＴＣＢ抗体」、又は「ＴＣＢ」も指す。この実施例で調製される二重特異性抗体の概略図が図２に例示されている。
ＣＤ３バインダーとして、抗体ＣＨ２５２７又は抗体Ｖ９を使用した。これらのバインダーの配列は、本明細書に含まれる配列表に提供されており、以下の表２にまとめられている。
表２．ＣＤ３バインダーのアミノ酸配列
Figure 0007296467000029
ＴＣＢ抗体の例示的配列は、配列番号６７、６９、７０及び７１（分子Ｄ）と、配列番号６８、６９、７０及び７２（分子Ｒ）に与えられている。他のＴＣＢ抗体を、対応するＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーのＶＨ及びＶＬ配列を使用して同様に構築した。
対照として、国際公開第２０１６／１９９１４１号に記載されている、バインダー「Ｃ１０６Ｂ９」に基づくＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧ抗体及びＴＣＢ抗体を調製した。このバインダーのＶＨ及びＶＬ領域配列は、それぞれ配列番号４９及び５０に示される。
以下の表３は、生成されたＩｇＧ及びＴＣＢ抗体分子と、これらの分子について本明細書で使用される名称を示している。
表３．生成されたＩｇＧ及びＴＣＢ抗体分子と本明細書で使用されるそれらの名称
Figure 0007296467000030
一般的な方法及びツール
組み換えＤＮＡ技術標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ． ｅｔ ａｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるように、ＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造元の説明書に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖及び重鎖のヌクレオチド配列に関する一般的な情報は、以下に与えられる：Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ９１－３２４２。
ＤＮＡ配列決定ＤＮＡ配列は、二本鎖配列決定によって決定した。
遺伝子の合成必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、又はＧｅｎｅａｒｔ ＡＧ（Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ生成物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ開裂部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクター内へとクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、濃度をＵＶ分光法によって決定した。サブクローニングした遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクター内へのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。すべてのコンストラクトは、真核細胞における分泌のためのタンパク質を標的とするリーダー配列についてコードする５’末端ＤＮＡ配列を用いて設計した。
ＩｇＧ及びＴＣＢ抗体の生成
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダー（及び、必要に応じて、ＣＤ３バインダー）の可変重鎖及び軽鎖領域をコードするＤＮＡ配列を、従来のクローニング技術を使用して哺乳動物の発現ベクター内へとクローニングした。
ＨＥＫ２９３ ＥＢＮＡ細胞又はＣＨＯ ＥＢＮＡ細胞の一過性トランスフェクションにより、ＩｇＧ及びＴＣＢ抗体を生成した。細胞を遠心分離し、予め温めたＣＤ ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、＃１０７４３０２９）により培地を置き換えた。ＣＤ ＣＨＯ培地中で発現ベクターを混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ，＃２３９６６－１）を加え、溶液をボルテックスして室温で１０分間インキュベートした。その後、細胞（２ｍｉｏ／ｍＬ）をベクター／ＰＥＩ溶液と混合し、フラスコに移し、５％ＣＯ２雰囲気の振盪インキュベーター内で、３時間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、補充液（全体積の８０％）を含むＥｘｃｅｌｌ培地を付加した（Ｗ． Ｚｈｏｕ ａｎｄ Ａ． Ｋａｎｔａｒｄｊｉｅｆｆ，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ＤＯＩ：１０．１００７／９７８－３－６４２－５４０５０－９；２０１４）。トランスフェクションの１日後に、補充液（Ｆｅｅｄ、全体積の１２％）を付加した。７日後に、遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により細胞上清を回収し、後述の標準的な方法により、回収した上清を精製した。
或いは、従来の（非ＰＣＲベースの）クローニング技術を用いる専有のベクターシステムを使用し、懸濁適応性ＣＨＯ Ｋ１細胞を使用して（元はＡＴＣＣより受託し、Ｅｖｉｔｒｉａでの懸濁培養液中無血清増殖に適合した）、Ｅｖｉｔｒｉａ（Ｓｃｈｌｉｅｒｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）により、本明細書に記載のＩｇＧ及びＴＣＢ抗体を調製した。生成のために、Ｅｖｉｔｒｉａは、専有の動物構成成分非含有無血清培地（ｅｖｉＧｒｏｗ及びｅｖｉＭａｋｅ２）、並びに専有のトランスフェクション試薬（ｅｖｉＦｅｃｔ）を用いた。遠心分離、及びその後の濾過（０．２μｍフィルター）により上清を回収し、標準的な方法により、回収した上清からタンパク質を精製した。
ＩｇＧ及びＴＣＢ抗体の精製
タンパク質を、標準プロトコルを参照し、濾過した細胞培養物上清から精製した。簡単には、Ｆｃ含有タンパク質を細胞培養上清からプロテインＡ－アフィニティークロマトグラフィーにより精製した（平衡バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム，２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５；溶出バッファー：２０ｍＭのクエン酸ナトリウム、ｐＨ３．０）。溶出はｐＨ３．０で達成され、続いて試料をすぐにｐＨ中和した。遠心分離（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ａｍｉｃｏｎ（登録商標）ＵＬＴＲＡ－１５、＃ＵＦＣ９０３０９６）によりタンパク質を濃縮し、凝集したタンパク質を、２０ｍＭヒスチジン、１４０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０のサイズ排除クロマトグラフィーにより、単量体タンパク質から分離した。
ＩｇＧ及びＴＣＢ抗体の分析
Ｐａｃｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５，４，２４１１－１４２３によるアミノ酸配列に基づいて計算した質量減衰係数を使用して、２８０ｎｍにおける吸収を測定することにより、精製したタンパク質の濃度を決定した。ＬａｂＣｈｉｐＧＸＩＩ又はＬａｂＣｈｉｐ ＧＸ Ｔｏｕｃｈ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、還元剤の存在下及び非存在下で、ＣＥ－ＳＤＳによりタンパク質の純度及び分子量を分析した。凝集物含有量の決定を、ランニングバッファー（２００ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、２５０ｍＭ ＫＣｌ ｐＨ６．２、０．０２％ＮａＮ３）中で平衡化した分析用サイズ排除カラム（ＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ ＳＷ ＸＬ又はＵＰ－ＳＷ３０００，Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して、２５℃でＨＰＬＣクロマトグラフィーにより実施した。
ＣＥ－ＳＤＳでほぼ１００％の単量体含有量と１００％の純度を有するすべての分子について、最終的な品質は極めて良好であった。
実施例３．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の親和性分析
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９に対するＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体の親和性を決定するために、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）実験を、ランニングバッファーとしてＨＢＳ－ＥＰ＋を用いる（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．００５％ Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ－１００６－６９））Ｂｉａｃｏｒｅ Ｔ２００で２５℃で実施した。抗ヒトＦｃ特異性抗体（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，＃ＢＲ－１００８－３９）を、アミンカップリングによりＣＭ５チップ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に直接固定化した。ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を、２．５ｎＭで６０秒間捕捉した。ＨＢＳ－ＥＰ（６．１７～１５００ｎＭ）中のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９複合体の３倍希釈系列を、２４０秒間３０μｌ／分でリガンド上を通過させ、会合相を記録した。解離相を２４０秒間監視し、試料溶液からＨＢＳ－ＥＰ＋へのスイッチングによってトリガーした。チップ表面を、３ＭのＭｇＣｌ２注入を１０μｌ／分で３０秒間使用する各サイクルの後で再生した。バルク屈折率差を、抗ヒトＦｃ抗体を含むが捕捉されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体を有さない基準フローセルに得られた応答を差し引くことにより、訂正した。親和性定数を、ＢＩＡｅｖａｌソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、１：１ラングミュア結合へのフィッティングにより、動態速度定数から導出した。測定は、独立した希釈系列を用いて３連で実施した。
試験したすべての分子（分子Ｈ、Ｉ、Ｊ、Ｋ、Ｌ及びＭ（すべてＩｇＧ抗体）と分子Ｒ（ＴＣＢ抗体））について、１：１ラングミュア結合の速度定数を表４にまとめる。
試験したすべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４抗体は、２桁のナノモル（一価の）親和性でＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９に結合し、ＩｇＧから二重特異性フォーマットに変換すると同じ親和性を保つ（分子Ｋ及びＲについて示されるように）。
表４．選択されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧ及びＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体についてＳＰＲにより決定したＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９に対する親和性データのまとめ
Figure 0007296467000031
実施例４．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３Ｔ細胞二重特異性（ＴＣＢ）抗体により誘導されたペプチド－パルスＴ２細胞のＴ細胞媒介性の溶解
異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により媒介されるＴ細胞殺傷を、ペプチド－パルスＴ２細胞で評価した。ヒトＰＢＭＣがエフェクターとして称され、二重特異性抗体を用いたインキュベーションを２４時間行ったところで殺傷を検出した。
Ｔ２細胞を回収し、洗浄し、及び０．８μＭのＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ、配列番号７３）又は無関係なペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ１ｐ１５７－１６５：ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ、配列番号８５）を用いて３７℃で２時間パルスした。ＰＢＳでの１回の洗浄工程の後、ペプチド－パルス標的細胞を、平底９６ウェルプレートを使用して３００００細胞／ウェルの密度で蒔いた。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、健康なヒトドナーから得られたヘパリン添加血液の濃縮リンパ球調製物のＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度遠心分離により調製した。新鮮血を、滅菌ＰＢＳで希釈し、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配（Ｓｉｇｍａ，＃Ｈ８８８９）に積層した。遠心分離（４５０ｘｇ、３０分、室温）後、ＰＢＭＣ含有界面相より上方の血漿を廃棄し、ＰＢＭＣを新しいｆａｌｃｏｎチューブに移し、続いてＰＢＳ ５０ｍｌで満たした。混合物を遠心分離（４００ｘｇ，１０分，室温）し、上清を廃棄し、ＰＢＭＣペレットを滅菌ＰＢＳで２回洗浄した（遠心分離工程３５０ｘｇ，１０分）。結果として得られたＰＢＭＣ集団を、自動的にカウントし（ＶｉＣｅｌｌ）、１０％ＦＣＳ及び１％Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ＃Ｋ０３０２）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地に３７℃、５％ＣＯ２で、さらなる使用まで細胞インキュベーター内に保存した（２４時間以内）。
殺傷アッセイのために、抗体を指定の濃度まで加えた（３連で０．０２ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。ＰＢＭＣを標的細胞に加え、最終Ｅ：ｔ比１０：１を得た。標的細胞殺傷を、３７℃、５％ＣＯ２での２４時間のインキュベーション後に、アポトーシス／ネクローシス細胞によって細胞上清内に放出されたＬＤＨの定量化により評価した（ＬＤＨ検出キット，Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，＃１１ ６４４ ７９３ ００１）。標的細胞の最大溶解（＝１００％）は、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００での標的細胞のインキュベーションによって達成された。最小溶解（＝０％）は、二重特異性構築物を有しないエフェクター細胞と共インキュベートした標的細胞を基準とする。
図３に示すように、評価したすべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体は、２４時間のインキュベーション後にＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド－パルスＴ２細胞の殺傷を誘導する。ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のランク付けは以下の通りである：分子Ｄ＞分子Ａ＝分子Ｆ＞分子Ｅ≧分子Ｃ＝分子Ｂ。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算した腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を表５に示す。
表５．示されるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により誘導されたＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドパルスＴ２細胞のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
Figure 0007296467000032
実施例５．ペプチド－パルスＴ２細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ活性化アッセイ）でのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体－誘導Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化
細胞上のＣＤ３とＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体への同時結合時に、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴエフェクター細胞のＣＤ３－媒介活性化を誘導するＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体の能力を、ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又は無関係なペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ１ｐ１５７－１６５：（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ））及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを含むＣＤ３－発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）でパルスしたＴ２細胞の共培養物を使用して評価した。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドパルスＴ２細胞上のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４とＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現）にＴＣＢ抗体が同時結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
アッセイのために、Ｔ２細胞を回収し、洗浄し、及び０．８μＭの（ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ））又は無関係なペプチド（ＮＹ－ＥＳＯ１ｐ１５７－１６５：（ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ）でパルスした。８０００細胞／ウェルを平底、白色３８４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３９６３）に蒔き、希釈した抗体又は培地（対照用）を加えた（０．１ｐＭ～１００ｎＭの範囲）。
続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を細胞培地に再懸濁し、腫瘍細胞に加え、指示通り２．５：１の最終Ｅ：Ｔ、及び採集容積３０μｌ／ウェルを得た。細胞を、加湿したインキュベーター内において３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１０μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ；１ウェル当たり１：４のＯＮＥ－Ｇｌｏとアッセイ培地容積）をウェルに加え、暗所で１０分間室温でインキュベートした。発光を、ＷＡＬＬＡＣ Ｖｉｃｔｏｒ３ ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を使用して、検出時間１秒／ウェルで検出した。
図４に示すように、評価したすべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体は、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドでパルスしたＴ２細胞と共にインキュベートすると、ＣＤ３を介してＴ細胞架橋を、その後Ｔ細胞活性化を引き起こす。ＥＣ５０及び誘導される活性化の全体のレベル両方を考慮すると、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のランク付けは以下の通りである：分子Ｄ＞分子Ａ＝分子Ｆ＞分子Ｃ＞分子Ｅ＞分子Ｂ。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算したＪｕｒｋａｔ活性化の対応するＥＣ５０値を表６に示す。
表６．６時間のインキュベーション後に、発光により測定したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体－媒介活性化のＥＣ５０値（ｐＭ）
Figure 0007296467000033
実施例６．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により誘導されるＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４発現腫瘍細胞株のパネルのＴ細胞媒介性の溶解
異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により媒介されるＴ細胞殺傷を、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４発現腫瘍細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１７５５、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＩＭ－９、Ｕ２６６Ｂ１、Ａ－３７５、ＵＭＵＣ－３、Ｃ－３３Ａ）のパネルにおいて評価した。ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を、陰性対照として含めた。アッセイは実施例４に記載の通り行った。
殺傷アッセイのために、抗体を指定の濃度まで加えた（３連で０．０２ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。
２４時間後の結果（図５）は、すべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体が、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４発現腫瘍細胞株の殺傷を誘導できることを示している。殺傷の度合は、異なるＴＣＢ抗体及び異なる腫瘍細胞株間で変わる。ＮＣＩ－Ｈ１７５５及びＩＭ－９細胞が最も多く殺傷される。ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体分子Ａ、Ｄ及びＦは、試験した６つのＴＣＢ抗体の中で最も強力である。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算した腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を表７に示す。
表７．示されるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により誘導された、種々のＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
Figure 0007296467000034
実施例７．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により誘導されるＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４陰性腫瘍細胞株のパネルのＴ細胞媒介性腫瘍溶解
異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により媒介されるＴ細胞殺傷を、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４陰性腫瘍細胞株（ＭＤＡ－ＭＡ－２３１、ＳＫＭ－１、ＳＷ－４８０、Ｃｏｌｏ－２０５、ＨＣＴ－１１６、ＳＷ－６２０、Ｓａｏｓ－２、Ｌ３６３）のパネルにおいて評価した。ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４陽性細胞株ＮＣＩ－Ｈ１７５５を、陽性対照として含めた。アッセイは実施例４に記載の通り行った。
殺傷アッセイのために、抗体を指定の濃度まで加えた（３連で０．０２ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。
２４時間後の結果（図６）は、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体のうち、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４陰性腫瘍細胞の殺傷を引き起こすものがないことを示している。試験したすべてのＴＣＢは、ＨＬＡ－Ａ２のみに対する選択性を示し、ＭＡＧＥ－Ａ４発現の非存在下で標的細胞殺傷を誘導しない。
実施例８．アラニンスキャンアッセイによる、選択されたＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢの結合残基の定義
本発明者らのＴＣＢ抗体によるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドの有望な結合モチーフの特性評価のため、本発明者らは、各アミノ酸をアラニンで個々に置き換えることにより、天然配列に由来するペプチドを使用するアラニンスキャンアッセイを設定し、これらのペプチドでパルスしたＴ２細胞によりＮＦＡＴ－レポーターシグナルを測定した。
アッセイのために、Ｔ２細胞を回収し、洗浄し、０．８μＭのＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又はアラニンで置き換えられたペプチドでパルスした。２００００細胞／ウェルを平底白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ、＃６５５０９８）に蒔き、希釈した抗体又は培地（対照用）を加えた。続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を細胞培地に再懸濁し、腫瘍細胞に加え、指示通り５：１の最終Ｅ：Ｔ、及び採集容積１００μｌ／ウェルを得た。細胞を、加湿したインキュベーター内において３７℃で６時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１００μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ；１ウェル当たり１：１のＯＮＥ－Ｇｌｏとアッセイ培地容積）をウェルに加え、暗所で１０分間室温でインキュベートした。発光を、ＷＡＬＬＡＣ Ｖｉｃｔｏｒ３ ＥＬＩＳＡリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ２０３０）を使用して、検出時間５秒／ウェルで検出した。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算したＮＦＡＴ－レポーターシグナルのＥＣ５０値を図７Ａに示す。さらに、陰性ペプチドのＥＣ５０に対するＥＣ５０の倍率変化を計算し、≧５の倍率変化を有意であると考慮した（図７Ｂ）。
アラニンスキャンの結果は、ＴＣＢ抗体によるＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドの異なる結合モチーフを示している。
実施例９．ペプチド－パルスＴ２細胞（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ活性化アッセイ）上での異なるＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体に対する予測標的外ペプチド（ＰＯＴＰ）評価
細胞上のＣＤ３とＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体への同時結合時に、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ細胞のＣＤ３－媒介活性化を誘導するＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体の能力を、ＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又は３３の予測される標的外ペプチド（図８）、及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞（ＮＦＡＴプロモーターを含むＣＤ３－発現ヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株、ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ－ＲＥ－ｌｕｃ２Ｐ、Ｐｒｏｍｅｇａ ＃ＣＳ１７６５０１）でパルスした、Ｔ２細胞の共培養物を使用して評価した。ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドパルスＴ２細胞上のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４複合体とＣＤ３抗原（Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上に発現）にＴＣＢ抗体が同時結合すると、ＮＦＡＴプロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。（ルシフェラーゼ基質の付加時に得られる）発光シグナルの強度は、ＣＤ３活性化及びシグナル伝達の強度に比例する。
アッセイのために、Ｔ２細胞を回収し、洗浄し、９６ウェルプレートを使用し、１０μＭのＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又はＰＯＴＰを用いて、１ｍｉｏ細胞／ｍｌで２時間３７℃でパルスした。パルスしたＴ２細胞を洗浄し、２％ＦＣＳ、１％Ｌ－アラニル－Ｌ－グルタミン（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ、＃Ｋ０３０２）及び１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、＃Ｐ４３３３）（Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ培地）を含有するＲＰＭＩ１６４０培地中濃度０．４ｍｉｏ細胞／ｍｌで９６ディープウェルプレートに移した。
続いて、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を、Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ培地に濃度１ｍｉｏ／ｍｌで再懸濁し、最終アッセイプレートにＥ：Ｔ比２．５：１を得た。
ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体をＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ培地に希釈し、最終アッセイ濃度１０ｎＭを得て、使用まで４℃で貯蔵した。
以下の工程は、ＴＥＣＡＮ ＥＶＯ ２００プラットフォームを使用して自動で実行された：
ペプチド－パルスＴ２細胞、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞及びＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体を、平底白色３８４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３９６３）に加え、加湿したインキュベーター内で１６時間３７℃でインキュベートした。インキュベーション時間の最後に、２０μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ；アッセイ培地で１：２に希釈）を加え、混合物を暗所で１０分間室温でインキュベートした。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋリーダーを使用して、検出時間０．５秒／ウェルで検出した。
その結果得られたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞活性化シグナルを、１秒当たりのカウントとして定量化された相対光単位として測定した（ＣＰＳシグナル）。ＰＯＴＰシグナルとＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルのパーセントでの比を以下のように計算した：（ＣＰＳ［ＰＯＴＰ］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）／（ＣＰＳ［ＭＡＧＥ－Ａ４］－ＣＰＳ［非パルス細胞］）＊１００ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドでパルスしたＴ２細胞により誘導された１００％と比較して２％を上回るシグナルを誘導したＰＯＴＰは、関連性があるとして定義され、さらなる評価のために考慮された。
図８に示すように、分子Ｃを除き、評価したすべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体は、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞上のＣＤ３と、示されたＰＯＴＰでパルスしたＴ２細胞上のｐＭＨＣとへの同時結合時に、Ｔ細胞活性化を誘導した。分子ＣはＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞活性化を誘導したが、それはＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドでパルスしたＴ２細胞の存在下においてのみであり、示されたＰＯＴＰのいずれかでパルしたＴ２細胞の存在下では誘導せず、高レベルの特異性を示した。しかしながら、以前の腫瘍細胞溶解実験で明らかとなったインビトロでの抗腫瘍効果はかなり低いものであった（図５参照）。
したがって、分子Ｄは、好ましい力価（図５参照）と安全性プロファイルとの対比に基づいて、さらなる評価のために選択され、肺及び心臓といった高リスク器官に広く発現しないペプチドでパルスしたＴ２細胞の存在下においてのみＪｕｒｋａｔ活性化Ｊｕｒｋａｔ活性化を示す。
次に、ＰＯＴＰのパネルを５０３個のペプチド（配列番号８６～５８９）に拡大し、分子Ｄを、上述のようにパルスしたＴ２細胞の存在下で同様のＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおいて評価した。図９は、結果として得られたＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞活性化シグナルを、２％を上回るシグナルを誘導したＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルに対するＰＯＴＰシグナルのパーセントでの比としてまとめたものである。
２％を上回るシグナルを誘導したＰＯＴＰを、それぞれのペプチドでパルスしたＴ２を使用したＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴアッセイにおいて検証した。アッセイは実施例４に記載の通り行った。以前に同定されたペプチドを標的外として確認することができた（図１０）。それでも、ＭＡＧＥ－Ａ４標的ペプチドと試験したＰＯＴＰとの間には明らかな治療濃度域が存在している。ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体－媒介活性化の対応するＥＣ５０値を表８に示す。
表８．発光によって測定したＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体－媒介活性化のＥＣ５０値（ｎＭ）
Figure 0007296467000035
ＭＡＧＥ－Ａ８誘導ペプチドは、１０ｘの治療濃度域を示すのみであり、これはＭＡＧＥ－Ａ８－誘導ペプチド（ＧＬＹＤＧＲＥＨＳＶ）とＭＡＧＥ－Ａ４標的ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）との強い相同性により説明することができる。しかしながら、同定されたＰＯＴＰの中に、高リスク器官に広く発現されるものはない。これは、分子Ｄの好ましい安全性プロファイルが維持されていることを明らかに実証する。
上述と同様のアッセイ設計を使用して、分子Ｇの特異性を分析した。５０３個のＰＯＴＰの拡大されたパネルを、１０μＭのＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）又は示されたＰＯＴＰでパルスしたＴ２細胞の存在下で、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴレポーター細胞アッセイにおいて評価した。図１１は、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドでパルスしたＴ２細胞により誘導される１００％と比較して２％を上回るシグナルを誘導したＰＯＴＰシグナルとＭＡＧＥ－Ａ４誘導シグナルのパーセントでの比を示している。検証したＰＯＴＰのうちのいくつか（ＴＰＣ、ＲＢＢＰ５及びＲＥＮＴ１）はかなり広い発現プロファイルを示し、潜在的な関連安全リスクを判断するためのより詳細なリスク評価の必要性を示唆している。したがって、分子Ｄに含まれるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーを含む分子が、分子Ｇに含まれるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーを含む同様の分子よりはるかに良好な治療濃度域／安全性プロファイルを有するであろうことが期待される。
実施例１０．ペプチド－パルスＴ２細胞上でのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧ－誘導Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化（ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ活性化アッセイ）
ＩｇＧフォーマットのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーのＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞活性化能を、以下に記載のように評価した。Ｔ２細胞をＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）でパルスし、ＩｇＧ分子のＦｃ部分内にあってＮＦＡＴプロモーターを含む、抗ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊエフェクター細胞（ＰＧＬＡＬＡ（Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（ＥＵ番号付け））に対して指向された（キメラ 抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴヒト急性リンパ性白血病レポーター細胞株）変異で共培養した。国際公開第２０１９／１２２０４６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。ＩｇＧ分子がＭＡＧＥ－Ａ４ペプチド－パルスＴ２細胞上のＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４複合体とＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞に同時結合すると、ＮＦＡＴ プロモーターが活性化され、活性ホタルルシフェラーゼの発現を引き起こす。
アッセイのために、Ｔ２細胞を回収し、洗浄し、１０μＭのＭＡＧＥ－Ａ４ｐ２３０－２３９ペプチド（ＧＶＹＤＧＲＥＨＴＶ）でパルスした。同時に、ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４－ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を回収し、播種した。８０００細胞／ウェルを平底白色３８４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ、＃３５３９６３）に蒔き、希釈した抗体又は培地（対照用）を加えた（０．０１ｐＭ～１０ｎＭの範囲）。
続いて、ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊレポーター細胞を回収し、ＶｉＣｅｌｌを使用して生存度を評価した。細胞を細胞培地に再懸濁し、腫瘍細胞に加え、指示通り２．５：１の最終Ｅ：Ｔ、及び採集容積３０μｌ／ウェルを得た。細胞を、加湿したインキュベーター内において３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション時間の最後に、１０μｌ／ウェルのＯＮＥ－Ｇｌｏ溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ；１ウェル当たり１：４のＯＮＥ－Ｇｌｏとアッセイ培地容積）をウェルに加え、暗所で１０分間室温でインキュベートした。発光を、Ｔｅｃａｎ Ｓｐａｒｋ機器を使用して、検出時間０．５秒／ウェルで検出した。
図１２に示すように、評価したすべてのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＩｇＧは、ＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－ＪとＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドでパルスしたＴ２細胞とに同時結合すると、ＣＡＲ－Ｊ活性化を誘導する。ＭＡＧＥ－Ａ４陰性ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞にはＣＡＲ－Ｊ活性化を観察することができず、このことは、ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドの非存在下では、試験したＩｇＧはＨＬＡ－Ａ２に対する交差反応性を有さないことを示唆している。力価の観点から、ＥＣ５０値（表９）、並びにシグナルの最大振幅の両方によって決定した場合、試験したＩｇＧの中で分子Ｈ及び分子Ｋが最も強力である。
表９．ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドパルスＴ２細胞の存在下において、示されたＩｇＧにより誘導されたＰＧＬＡＬＡ－ＣＡＲ－Ｊ細胞の活性化のＥＣ５０値（ｐＭ）
Figure 0007296467000036
実施例１１．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体によって誘導されるＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株のパネルのＴ細胞媒介性腫瘍溶解
異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダー及び異なるＣＤ３バインダーを含むＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により媒介されるＴ細胞殺傷を、ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株（ＵＭ－ＵＣ３、Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ２０１３）のパネルにおいて評価した。アッセイは実施例４に記載の通り行った。
殺傷アッセイのために、抗体を指定の濃度まで加えた（３連で１ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。
４８時間後の結果（図１３）は、異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４バインダーを含む２つのＴＣＢ抗体間の（分子Ｄ対Ｇ及び分子Ｒ対Ｕ）ＴＣＢ誘導標的細胞溶解に差がないことを示している。
標的細胞の溶解は、ＣＨ２５２７（分子Ｄ及びＧ）を含むＴＣＢと比べ、ＣＤ３バインダーとしてＶ９を含む２つのＴＣＢ抗体（分子Ｒ及びＵ）で増大する。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算した腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を表１０に示す。
表１０．示されるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体により誘導された、種々のＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｎＭ）
Figure 0007296467000037
実施例１２．ＨＬＡ－Ａ２＋ ＭＡＧＥ－Ａ４発現Ａ３７５細胞、ＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように操作したＡ３７５細胞及びＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウトを含むＡ３７５細胞上でＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（分子Ｒ）により誘導されるＴ細胞媒介性腫瘍溶解及びサイトカイン放出
分子Ｒによって媒介されたＴ細胞殺傷を、異なるレベルのＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ペプチドＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体を発現するＡ３７５細胞（Ａ３７５細胞、ＨＬＡ－Ａ２を過剰発現するように遺伝子操作された（レンチウイルスで）Ａ３７５細胞、及びＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウトを含むＡ３７５細胞（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９により生成））で評価した。
異なるＡ３７５細胞のＭＨＣ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（ＭＡＰＰＳ）により検出されたＭＡＧＥ－Ａ４／ＨＬＡ－Ａ２ ｐＭＨＣコピー数を表１１に示す。
表１１．ＭＨＣ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ（ＭＡＰＰＳ）により検出されたＭＡＧＥ－Ａ４／ＨＬＡ－Ａ２ ｐＭＨＣコピー数．
Figure 0007296467000038
アッセイは実施例４に記載の通り行った。殺傷アッセイのために、分子Ｒを指定の濃度で加えた（３連で１ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。
２４時間後の結果（図１４）は、分子ＲはＡ３７５細胞の殺傷を誘導することができるが、ＨＬＡ－Ａ２過剰発現を有するＡ３７５細胞の場合により強い度合までそれが可能であることを示している。ＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウトを有するＡ３７５細胞は、ＭＡＧＥ－Ａ４発現の不足に起因して標的ｐＭＨＣ複合体を提示しないため、殺傷されなかった。
ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ６を使用して計算した腫瘍細胞溶解の対応するＥＣ５０値を表１２に示す。
表１２．分子Ｒによって誘導されたＡ３７５及びＡ３７５過剰発現ＨＬＡ－Ａ２のＴ細胞媒介性溶解のＥＣ５０値（ｐＭ）
Figure 0007296467000039
２４時間後と４８時間後、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイ（Ｈｕｍａｎ Ｃｕｓｔｏｍ ＰｒｏｃａｒｔａＰｌｅｘ ７－ｐｌｅｘ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；＃ＰＰＸ－０７－ＭＸＦＶＫ４Ｙ）によるサイトカインＴＮＦα及びＩＦＮγのその後の分析のために上清を収集した。アッセイは製造元の説明書に従って実施した。
１．４ｎＭの分子Ｒを用いた２４時間のインキュベーション後のＩＦＮγ放出と４８時間のインキュベーション後のＴＮＦα放出を図１５に示す。分子Ｒ媒介性殺傷時の両サイトカインの放出は、Ａ３７５ ＨＬＡ－Ａ２過剰発現細胞で強力に増加しており、これはＩＦＮγ及びＴＮＦα放出がＭＡＧＥ－Ａ４／ＨＬＡ－Ａ２ ｐＭＨＣ複合体の発現レベルと相関していることを示している。Ａ３７５ ＭＡＧＥ－Ａ４ノックアウト細胞にサイトカイン放出を観察することはできない。
実施例１３．ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（分子Ｒ）による治療時の腫瘍細胞増殖
異なる濃度の分子Ｒによる治療時の腫瘍細胞増殖を監視するために、異なるＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋細胞株（Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５、ＳｃａＢｅｒ、ＵＭ－ＵＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）を、Ｅｓｓｅｎ ＣｅｌｌＰｌａｙｅｒ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、＃４４７６；ＥＦ１α、ピューロマイシン）で形質導入し、核に制限されたＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ蛍光性タンパク質を安定して発現させた。１ウェル当たりの経時的定量化により、腫瘍細胞溶解又は増殖のこのようなリアルタイム評価が可能である。
エフェクター細胞（ＰＢＭＣ）を、実施例４に記載の健康なボランティアの血液から単離した。
ＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋ ＮｕｃＬｉｇｈｔ赤血球（Ａ３７５、ＮＣＩ－Ｈ１７５５、ＳｃａＢｅｒ、ＵＭ－ＵＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）を、細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃１３１５１－０１４）を使用して回収し、インキュベーター内において、滅菌９６ウェル平底接着組織培養物プレート（ＴＰＰ、＃９２０９６）中の細胞培養培地に１ウェル当たり１５×１０３細胞（Ａ３７５、ＵＭ－ＵＣ３、ＮＣＩ－Ｈ２０２３、ＮＣＩ－Ｈ１７０３）、５×１０３細胞／ウェル（ＳｃａＢｅｒ）又は２５×１０３細胞／ウェル（ＮＣＩ－Ｈ１７５５）の密度で、一晩３７℃及び５％ＣＯ２で蒔いた。分子Ｒを、指定の濃度で加えた（３連で１ｐＭ～５０ｎＭの範囲）。ＰＢＭＣを、エフェクター細胞として各ウェルにＥ：ｔ比５：１で加えた。
プレートを、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（登録商標）Ｚｏｏｍ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、ＨＤ 相コントラスト、赤色蛍光、１０×の対物レンズ）を使用して、蛍光顕微鏡検査ハイコンテントライフイメージングにより、３時間間隔で９６時間３７℃及び５％ＣＯ２で監視した。腫瘍細胞増殖を監視するために、健康な腫瘍細胞（Ｃｏｕｎｔ（Ｐｅｒ Ｉｍａｇｅ））の量を、ＩｎｃｕｃｙｔｅＺｏｏｍ Ｓｏｆｔｗａｒｅを使用して定量化した。それぞれの時点及び使用したＴＣＢ濃度に対する条件について値をプロットし、Ｔ細胞の細胞傷害能に対する効果を分析した。
図１６は、分子ＲがＨＬＡ－Ａ２＋／ＭＡＧＥ－Ａ４＋腫瘍細胞株の腫瘍増殖を阻害できることを示している。腫瘍増殖阻害の度合及び有効濃度は、異なる細胞株間で変化し、このことは、異なるＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ｐＭＨＣ複合体の発現レベル及びがん細胞株の異なる起源によって説明することができる。
実施例１４．ヒト化マウスのＩＭ－９異種移植片にＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４ ＣＤ３ ＴＣＢ抗体（分子Ｒ）を用いた用量設定有効性試験
この実施例に記載される有効性試験の目的は、完全ヒト化ＮＳＧマウスにおける腫瘍退縮及びＩｍｍｕｎｏ－ＰＤの観点から分子Ｒの用量依存性の有効性を理解することであった。
ヒトＩＭ－９細胞（ヒト多発性骨髄腫）は、ＤＭＳＺから最初に得られ、増殖後、Ｒｏｃｈｅ Ｇｌｙｃａｒｔ内部細胞バンクに寄託された。細胞をＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＣＳ＋１％Ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ＋１ｍＭピルビン酸ナトリウム中において３７℃で５％ＣＯ２の水飽和雰囲気で培養した。インビトロ継代１２を９８％の生存率で皮下注射に使用した。
５０マイクロリットルのマトリゲルと混合した５０マイクロリットルの腫瘍細胞懸濁液を、２２Ｇ～３０Ｇの針を用いて、麻酔したマウスの脇腹に皮下注射した。
実験開始時に４～５週齢の雌ＮＳＧマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を、特定の病原体のいない条件に維持し、１日のサイクルは、関連するガイドライン（ＧＶ－Ｓｏｌａｓ；Ｆｅｌａｓａ；ＴｉｅｒｓｃｈＧ）に従って、１２時間明状態／１２時間暗状態であった。この実験研究プロトコルは、地方自治体によって検閲及び承認された（Ｐ ２０１１／１２８）。到着後、動物を、新しい環境に慣れさせ、観察するために、１週間維持した。連続的な健康モニタリングを、定期的に行った。
雌ＮＳＧマウスに対し、１５ｍｇ／ｋｇのブスルファンを腹腔内注射し、１日後、臍帯血から単離した１ｘ１０５個のヒト造血幹細胞を静脈注射した。幹細胞注入から１４～１６週後、マウスを舌下で出血させ、ヒト化を成功させるために、血液をフローサイトメトリーによって分析した。効率的に移植されたマウスは、そのヒトＴ細胞の頻度に従って、異なる処置群に無作為に分けられた。この時、マウスに上述の腫瘍細胞を注射し、腫瘍サイズが概ね２００ｍｍ３（７日目）に到達したら、週に１回異なる用量のＲ又はビヒクルで処置した（図１７）。適用は、２００μｌの注入容積で静脈内に行われた。ノギスを用いて腫瘍増殖を週２回測定し、腫瘍体積を以下のように計算した：
Ｔｖ：（Ｗ２／２）×Ｌ（Ｗ：幅、Ｌ：長さ）
試験１５日目に、１つの群につき４匹のスカウトマウスを屠殺し、腫瘍を除去し、計量し、ＰＦＡで一晩固定し、組織学的評価のためにパラフィンに包埋した。腫瘍のスライドを抗マウスＣＤ３抗体で染色し、すべての群の腫瘍内Ｔ細胞頻度を評価した。試験２８日目に試験を終了した。
図１８は、すべての群における腫瘍増殖動態（平均、＋／－ＳＥＭ）と、マウス１匹当たりの個体腫瘍増殖を示している。すべての用量の単剤としての分子Ｒが、腫瘍増殖の阻害を誘導した。試験した最低用量（０．１ｍｇ／ｋｇ）は、比較的不均一な阻害を示し、２匹のマウスが低用量処置から離脱した。スカウト動物の腫瘍におけるヒトＴ細胞浸潤の分析（図１９）は、ビヒクルと比較して、すべての群において腫瘍中のＴ細胞頻度が良好に上昇していることを明らかにしたが、用量間で差は見られなかった。
上述の発明は、理解を明確にする目的で、説明及び実施例によって、ある程度詳細に記載されたが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本明細書に引用されるすべての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に組み込まれる。

Claims (61)

  1. ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体であって、第１の抗原結合ドメインを含み、第１の抗原結合ドメインが、配列番号２５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２６のＨＣＤＲ２、及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含む重鎖可変領域（ＶＨ）と、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、抗体。
  2. 第１の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１に記載の抗体。
  3. ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体であって、第１の抗原結合ドメインを含み、第１の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、抗体。
  4. 多重特異性抗体である、請求項１～３のいずれか一項に記載の抗体。
  5. 二重特異性抗体である、請求項４に記載の抗体。
  6. 第２の抗原に結合する第２の抗原結合ドメインを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の抗体。
  7. 第２の抗原が、Ｔ細胞活性化抗原である、請求項６に記載の抗体。
  8. Ｔ細胞活性化抗原が、ＣＤ３である、請求項７に記載の抗体。
  9. Ｔ細胞活性化抗原が、ＣＤ３εである、請求項７に記載の抗体。
  10. 第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号５９のＨＣＤＲ１、配列番号６０のＨＣＤＲ２、及び配列番号６１のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号６２のＬＣＤＲ１、配列番号６３のＬＣＤＲ２及び配列番号６４のＬＣＤＲ３を含むＶＬ；又は
    （ｉｉ）配列番号５１のＨＣＤＲ１、配列番号５２のＨＣＤＲ２、及び配列番号５３のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号５４のＬＣＤＲ１、配列番号５５のＬＣＤＲ２及び配列番号５６のＬＣＤＲ３を含むＶＬ
    を含む、請求項６又は７に記載の抗体。
  11. 第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号６６のアミノ酸配列少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
    （ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含む、請求項１０に記載の抗体。
  12. 第２の抗原結合ドメインが、
    （ｉ）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号６６のアミノ酸配列を含むＶＬ；又は
    （ｉｉ）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号５８のアミノ酸配列を含むＶＬ
    を含む、請求項６～１１のいずれか一項に記載の抗体。
  13. 第３の抗原結合ドメインを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の抗体。
  14. 第３の抗原結合ドメインがＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する、請求項１３に記載の抗体。
  15. 第３の抗原結合ドメインが、配列番号２５の重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、配列番号２６のＨＣＤＲ２及び配列番号２７のＨＣＤＲ３を含むＶＨと、配列番号２８の軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、配列番号２９のＬＣＤＲ２及び配列番号３０のＬＣＤＲ３を含むＶＬとを含む、請求項１４に記載の抗体。
  16. 第３の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨ、及び／又は配列番号３２のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１５に記載の抗体。
  17. 第３の抗原結合ドメインが、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の抗体。
  18. 第３の抗原ドメインが第１の抗原結合ドメインと同一である、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の抗体。
  19. 第１、第２及び／又は第３の抗原結合ドメインがＦａｂ分子である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の抗体。
  20. 第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨ又は定常ドメインＣＬとＣＨ１が、互いによって置き換えられているＦａｂ分子である、請求項６～１９のいずれか一項に記載の抗体。
  21. Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが、互いによって置き換えられている、請求項２０に記載の抗体。
  22. 第１の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、従来のＦａｂ分子である、請求項１～２１のいずれか一項に記載の抗体。
  23. 第１の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ分子であり、定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸が、独立して、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）又はヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）又はアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１～２２のいずれか一項に記載の抗体。
  24. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインが、互いに融合されている、請求項６～２３のいずれか一項に記載の抗体。
  25. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインが、ペプチドリンカーを介して互いに融合されている、請求項２４に記載の抗体。
  26. 第１の抗原結合ドメイン及び第２の抗原結合ドメインは各々がＦａｂ分子であり、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されている、請求項６～２５のいずれか一項に記載の抗体。
  27. 第１のサブユニットと第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含む、請求項１～２６のいずれか一項に記載の抗体。
  28. 第１の抗原結合ドメイン、第２の抗原結合ドメイン及び、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは各々がＦａｂ分子であり、前記抗体が、第１のサブユニットと第２のサブユニットで構成されるＦｃドメインを含み、（ｉ）第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されているか、又は（ｉｉ）第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、第１の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合されており、且つ第１の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＮ末端に融合されており、存在する場合、第３の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＮ末端に融合されている、請求項６～２７のいずれか一項に記載の抗体。
  29. Ｆｃドメインが、ＩｇＧ Ｆｃドメインである、請求項２７又は２８に記載の抗体。
  30. Ｆｃドメインが、ＩｇＧ １ Ｆｃドメインである、請求項２９に記載の抗体。
  31. ＦｃドメインがヒトＦｃドメインである、請求項２７～３０のいずれか一項に記載の抗体。
  32. Ｆｃドメインが、ヒトＩｇＧ １ Ｆｃドメインである、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の抗体。
  33. Ｆｃドメインが、Ｆｃドメインの第１のサブユニットと第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の抗体。
  34. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の空洞に位置することが可能な突起を生成し、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基で置き換えられ、それによって、第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に、第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が位置することが可能な空洞を生成する、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の抗体。
  35. Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置３６６のトレオニン残基がトリプトファン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｗ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、位置４０７のチロシン残基がバリン残基で置き換えられている（Ｙ４０７Ｖ）、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の抗体。
  36. Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に、位置３６６のトレオニン残基がセリン残基で置き換えられており（Ｔ３６６Ｓ）、位置３６８のロイシン残基がアラニン残基で置き換えられている（Ｌ３６８Ａ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３５に記載の抗体。
  37. Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、追加的に位置３５４のセリン残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｓ３５４Ｃ）又は位置３５６のグルタミン酸残基がシステイン残基で置き換えられており（Ｅ３５６Ｃ）、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、追加的に位置３４９のチロシン残基がシステイン残基で置き換えられている（Ｙ３４９Ｃ）（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３５又は３６に記載の抗体。
  38. Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体への結合及び／又はエフェクター機能を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項２７～３７のいずれか一項に記載の抗体。
  39. １つ又は複数のアミノ酸置換が、Ｅ２３３、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｎ２９７、Ｐ３３１及びＰ３２９の群から選択される位置にあり、特に、位置がＬ２３４、Ｌ２３５及びＰ３２９の群から選択される（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項３８に記載の抗体。
  40. Ｆｃドメインの各サブユニットは、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）、請求項２７～３９のいずれか一項に記載の抗体。
  41. ａ）ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインであって、前記第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインのそれぞれが、配列番号３１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号３２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む（従来の）Ｆａｂ分子である、第１の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメイン；
    ｂ）ＣＤ３に結合する第２の抗原結合ドメインであって、前記第２の抗原結合ドメインが、Ｆａｂ軽鎖とＦａｂ重鎖の可変ドメインＶＬとＶＨが互いによって置き換えられているＦａｂ分子であり、配列番号６５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号６６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、第２の抗原結合ドメイン；並びに
    ｃ）第１及び第２のサブユニットから構成されるヒトＩｇＧ １ Ｆｃドメイン：
    ここで、
    （ｉ）第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＬにおいて、位置１２４のアミノ酸はリジン（Ｋ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、位置１２３のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）によって置換されており（Ｋａｂａｔによる番号付け）、且つ第１及び第３の抗原結合ドメインの定常ドメインＣＨ１において、位置１４７のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）、位置２１３のアミノ酸はグルタミン酸（Ｅ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックスによる番号付け）；
    （ｉｉ）第１の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ重鎖のＣ末端で第２の抗原結合ドメインのＦａｂ重鎖のＮ末端に融合し、第２の抗原結合ドメイン及び第３の抗原結合ドメインは、各々がＦａｂ重鎖のＣ末端でＦｃドメインのサブユニットの１つのＮ末端に融合しており；且つ
    （ｉｉｉ）Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃ及びＴ３６６Ｗを含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ及びＹ４０７Ｖを含み、Ｆｃドメインのサブユニットの各々が、アミノ酸置換Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ及びＰ３２９Ｇを含む（Ｋａｂａｔ ＥＵインデックス番号付け）
    を含む、請求項１～４０のいずれか一項に記載の抗体。
  42. 配列番号６８の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号６９の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、配列番号７０の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む２つのポリペプチド、及び配列番号７２の配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、を含む、請求項１～４１のいずれか一項に記載の抗体。
  43. 請求項１～４２のいずれか一項に記載の抗体をコードする単離ポリヌクレオチド。
  44. 請求項４３に記載の単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
  45. ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体を生成する方法であって、（ａ）抗体の発現に適した条件下で請求項４４に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、方法。
  46. （ｂ）抗体を回収する工程をさらに含む、請求項４５に記載の方法。
  47. 請求項４５又は４６に記載の方法によって生成された、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４に結合する抗体。
  48. 請求項１～４２のいずれか一項又は請求項４７に記載の抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
  49. 医薬としての使用のための、請求項１～４２のいずれか一項若しくは請求項４７に記載の抗体、又は請求項４８に記載の医薬組成物。
  50. 疾患の治療における使用のための、請求項１～４２のいずれか一項若しくは請求項４７に記載の抗体、又は請求項４８に記載の医薬組成物。
  51. 疾患ががんである、請求項５０に記載の使用のための抗体又は医薬組成物。
  52. がんが、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんである、請求項５１に記載の使用のための抗体又は医薬組成物。
  53. がんが、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、皮膚がん、胃がん及び卵巣がんからなる群から選択されるがんである、請求項５１又は５２に記載の使用のための抗体又は医薬組成物。
  54. 医薬の製造における、請求項１～４２のいずれか一項若しくは請求項４７に記載の抗体、又は請求項４８に記載の医薬組成物の使用。
  55. がんの治療のための医薬の製造における、請求項１～４２のいずれか一項若しくは請求項４７に記載の抗体、又は請求項４８に記載の医薬組成物の使用。
  56. がんが、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんである、請求項５５に記載の使用。
  57. がんが、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、皮膚がん、胃がん及び卵巣がんからなる群から選択されるがんである、請求項５５又は５６に記載の使用。
  58. 個体において疾患を治療するための医薬であって、請求項１～４２のいずれか一項若しくは請求項４７に記載の抗体又は請求項４８に記載の医薬組成物の有効量を含む医薬。
  59. 疾患ががんである、請求項５８に記載の医薬。
  60. がんが、ＨＬＡ－Ａ２／ＭＡＧＥ－Ａ４を発現するがんである、請求項５９に記載の医薬。
  61. がんが、肺がん、頭頸部がん、膀胱がん、食道がん、皮膚がん、胃がん及び卵巣がんからなる群から選択されるがんである、請求項５９又は６０に記載の医薬。
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