CN1863774B - 用作蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一类新的化合物、含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症，特别是与Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和SAPK2β异常激活有关的疾病或病症的方法。

Description

用作蛋白激酶抑制剂的化合物和组合物
相关申请的交叉参考
本申请要求于2003年10月8日提交的美国临时专利申请60/509,572的优先权。该申请中公开的所有内容在这里都被全部引入本文作为参考并用于所有的目的。
技术领域
本发明提供了一类新的化合物、含有这些化合物的药物组合物和使用这些化合物来治疗或预防与激酶活性异常或失调有关的疾病或病症，特别是与Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、Bmx、p70S6K、TGFβ、SRC、trkB、FGFR3、Fes、Lck、RAF、MKK4、MKK6和SAPK2α、SAPK2β激酶异常激活有关的疾病或病症的方法。
背景技术
蛋白激酶代表一大族蛋白质，它们在调节各种各样的细胞过程和保持对细胞功能的控制中起重要的作用。这些激酶的部分非限定性例子包括：受体酪氨酸激酶如得自血小板的生长因子受体激酶(PDGF-R)、干细胞因子的受体激酶、c-kit、神经生长因子受体、trkB和成纤维细胞生长因子受体、FGFR3；非-受体酪氨酸激酶如Abl和融合激酶BCR-Abl、Fes、Lck和Syk；和丝氨酸/苏氨酸激酶如b-RAF、MAP激酶(例如，MKK6)和SAPK2β。已经在许多疾病中观察到了异常的激酶活性，包括良性和恶性增殖性疾病以及由不合适的免疫和神经***激活所导致的疾病。
本发明的新化合物可以抑制一种或多种蛋白激酶活性，因此预期可用于治疗激酶相关性疾病。
发明概述
一方面，本发明提供了式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、单一的异构体及异构体混合物和这些化合物的可药用盐和溶剂化物(例如水合物)：
Figure S04829422620060418D000021
其中：
n是0、1或2；
Y选自-C(H)＝和-N＝；
Z选自-C(H)＝和-N＝；
R1选自氢、卤素和-R4；
R2选自氢和C1-6烷基；
R3选自卤素、硝基、C1-6烷基和C1-6烷氧基；
R4选自C3-8杂环烷基、-XNR5R6、-XNR5C(O)R6、-XC(O)NR5R6和-XNR5S(O)0-2R6；其中X是键或C1-4亚烷基；R5选自氢和C1-6烷基；R6选自C1-6烷基、C6-10芳基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基、C3-12环烷基-C0-4烷基和C3-8杂环烷基-C0-4烷基；其中R4的任何芳基、杂芳基、环烷基和杂环烷基任选地被1至3个独立地选自卤素、羟基、硝基、氰基、任选地被羟基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基、卤代-C1-6烷氧基、-XOXNR7R8、-XS(O)0-2R7、-XS(O)0-2NR7R8、-XOR7、-XC(O)NR7R8、-XNR7R8、-XNR7S(O)0-2R7和-XR9的基团所取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R7和R8独立地选自氢和C1-6烷基；R9选自C6-10芳基、C5-10杂芳基、C3-12环烷基和C3-8杂环烷基；其中R9的任何芳基、杂芳基、环烷基或杂环烷基任选地被1至3个C1-6烷基所取代；
R10选自氢、卤素和C1-6烷基。
第二方面，本发明提供了包含式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一的异构体及异构体混合物；或其可药用盐，和一种或多种合适的赋形剂的药物组合物。
第三方面，本发明提供了治疗动物疾病的方法，其中抑制激酶活性，特别是抑制Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和/或SAPK2β活性可预防、抑制或改善疾病的病理和/或症状，该方法包括给予动物治疗有效量的式I化合物或其N-氧化物衍生物、单一的异构体及异构体混合物或其可药用盐。
第四方面，本发明提供了式I化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的用途，其中在所述疾病中，激酶活性，特别是Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和/或SAPK2β活性对该疾病的病理和/或症状起作用。
第五方面，本发明提供了制备式I化合物及其N-氧化物衍生物、前药衍生物、保护的衍生物、单一的异构体及异构体混合物和可药用盐的方法。
发明详述
定义
作为基团或其它基团，例如卤素取代的烷基和烷氧基的结构元素的“烷基”可以是直链或支链的。C1-4-烷氧基包括甲氧基、乙氧基等。卤素取代的烷基包括三氟甲基、五氟乙基等。
“芳基”是指含有6-10个环碳原子的单环或稠合双环芳香环。例如，芳基可以是苯基或萘基，优选苯基。“亚芳基”是指由芳基衍生的二价基团。“杂芳基”如芳基所定义，并且其中有一个或多个环原子为杂原子。例如杂芳基包括吡啶基、吲哚基、吲唑基、喹喔啉基、喹啉基、苯并呋喃基、苯并吡喃基、苯并噻喃基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯、咪唑基、苯并咪唑基、嘧啶基、呋喃基、噁唑基、异噁唑基、***基、四唑基、吡唑基、噻吩基等。
“环烷基”是指含有指定环原子数的饱和或部分饱和的单环、稠合的双环或桥接的多环。例如，C3-10环烷基包括环丙基、环丁基、环戊基、环己基等。“杂环烷基”是指本申请中所定义的环烷基，条件是所述的一个或多个环碳由选自-O-、-N＝、-NR-、-C(O)-、-S-、-S(O)-或-S(O)2-的部分所代替，其中R为氢、C1-4烷基或氮保护基。例如，本申请中用于描述本发明化合物的C3-8杂环烷基包括吗啉基、吡咯烷基、哌嗪基、哌啶基、哌啶酮、1，4-二氧杂-8-氮杂-螺[4.5]癸-8-基等。
“卤素”优选表示氯或氟，但也可以是溴或碘。
“治疗”是指减轻或缓和疾病和/或其并发症的方法。
优选实施方案的描述
融合蛋白BCR-Abl是导致Abl原癌基因与Bcr基因融合的相互易位的结果。因此，BCR-Abl能够通过增加促有丝***活性改变B-细胞。该增加导致对细胞凋亡的敏感性降低，并改变CML祖细胞的粘着力和归巢。本发明提供治疗与激酶有关的疾病，特别是与Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和/或SAPK2β激酶有关的疾病的化合物、组合物和方法。例如，与BCR-Abl有关的白血病和其它增殖性疾病可通过抑制野生型和突变型BCR-Abl来进行治疗。
在一个实施方案中，涉及如下的式I化合物，其中n是0、1或2；
Y选自-C(H)＝和-N＝；
Z选自-C(H)＝和-N＝；
R1选自氢、卤素和-R4；
R2选自氢和C1-6烷基；
R3选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基；
R4选自C3-8杂环烷基、-XNR5R6、-XNR5C(O)R6和-XNR5S(O)0-2R6；其中X是键或C1-4亚烷基；R5选自氢和C1-6烷基；R6选自C1-6烷基、C6-10芳基-C0-4烷基、C3-8杂环烷基-C0-4烷基、C5-10杂芳基-C0-4烷基和C3-12环烷基-C0-4烷基；其中R4的任何芳基、杂芳基和环烷基任选地被1至3个独立地选自卤素、羟基、硝基、任选地被羟基取代的C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代-C1-6烷基、卤代-C1-6烷氧基、-XS(O)0-2R7、-XOXNR7R8、-XS(O)0-2NR7R8、-XOR7、-XC(O)NR7R8、-XNR7R8和-XR9的基团所取代；其中X是键或C1-4亚烷基；R7和R8独立地选自氢和C1-6烷基；R9选自C5-10杂芳基和C3-8杂环烷基；其中R9的任何杂芳基或杂环烷基任选地被1至3个C1-6烷基所取代；且
R10是氢。
在另一个实施方案中，R1选自氢、卤素、吡咯烷基和-NHR6；其中R6选自氢、甲基、乙基、二乙基-氨基-丙基、吗啉-4-基-乙基、羟基-乙基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基和苯基；其中所说的吡咯烷基、吡啶基、吡唑基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基或苯基任选地被1至2个独立地选自氨基、甲氧基、二甲基氨基、二甲基氨基-甲基、二甲基氨基-乙基、二甲基氨基-丙基、二甲基氨基-乙氧基、甲硫基、羟基、甲基磺酰基、羟基甲基、1-羟基-乙基、甲磺酰基-氨基、吗啉-4-基、吗啉-4-基-乙基、呋喃基-甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-甲基-哌嗪-1-基甲基、苄基、甲基-氨基羰基、甲基-羰基-氨基、甲基-吡唑基、氨基羰基和氨基-磺酰基的基团所取代。
在另一个实施方案中，R4选自-NHC(O)R6和-NHS(O)2R6；其中R6选自甲基、异丁基、叔丁基、环己基、呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吡唑基、四唑基-甲基和苄基；其中所说的R6的环己基、呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基、吡唑基、四唑基-甲基或苄基任选地被1至3个选自4-甲基-哌嗪-1-基甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-乙基-哌嗪-1-基甲基、4-乙基-哌嗪-1-基、苯基、乙基、三氟甲基、吗啉基、二甲基氨基、卤素、硝基、三氟甲氧基、1-甲基-吡咯-2-基、4-甲基-咪唑-1-基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-甲基-哌嗪-1-基甲基、异丁基和叔丁基的基团所取代。
在下面的实施例和表I中对优选的式I化合物进行了详述。
药理学和实用性
本发明的化合物调节蛋白质酪氨酸激酶活性并因此可用于治疗其中蛋白质酪氨酸激酶，特别是Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和/或SAPK2β激酶对疾病的病理和/或症状起作用的疾病或病症。
Abelson酪氨酸激酶(即Abl、c-Abl)参与细胞周期的调节、细胞对基因毒应激的应答和在细胞环境中通过整联蛋白信号转导传递信息。总的来说，Abl蛋白质似乎是作为细胞组件起复合的作用，其整合来自各种胞外和胞内的信号并影响细胞周期和细胞凋亡的结果。Abelson酪氨酸激酶包括亚型衍生物如嵌合融合(癌基因蛋白)BCR-Abl(具有失调的酪氨酸激酶活性)或v-Abl。BCR-Abl是95％慢性骨髓性白血病(CML)和10％急性淋巴细胞白血病的致病关键。STI-571(Gleevec)是致癌性BCR-Abl酪氨酸激酶的抑制剂并用于治疗慢性骨髓性白血病(CML)。然而，CML发病危险期的一些患者由于BCR-Abl激酶的突变而对STI-571耐受。目前已报道了超过22种突变，最常见的是G250E、E255V、T315I、F317L和M351T。
本发明化合物抑制abl激酶，特别是v-abl激酶。本发明化合物也抑制野生型BCR-Abl激酶和突变的BCR-Abl激酶并因此适于治疗Bcr-abl-阳性癌症和肿瘤疾病，如白血病(特别是慢性骨髓性白血病和急性淋巴细胞白血病，尤其是发现它们是以细胞凋亡为作用机制的)，并且还显示出对白血病干细胞亚组的影响，而且也可能用于取出所述细胞(例如，骨髓取出)后体外纯化这些细胞并在清除癌细胞后再将细胞植入(例如，再植入纯化的骨髓细胞)。
PDGF(得自血小板的生长因子)是非常常见的生长因子，它在正常生长和病理性细胞增殖中都起到重要作用，如在癌症和血管平滑肌细胞疾病，例如，在动脉粥样硬化和血栓症中所见到的那样。本发明化合物可抑制PDGF受体(PDGFR)活性并因此适用于***性疾病，如神经胶质瘤、肉瘤、***肿瘤和结肠、乳腺和卵巢肿瘤。
本发明化合物不仅可用作肿瘤抑制剂(例如在小细胞肺癌中)，而且可用作治疗非恶性增殖性疾病，如动脉粥样硬化、血栓症、牛皮癣、硬皮病和纤维化，以及保护干细胞(例如对抗化疗药如5-氟尿嘧啶的血液毒性作用)和治疗哮喘的药物。本发明化合物尤其可用于治疗对抑制PDGF受体激酶有反应的疾病。
本发明化合物显示可有效地用于治疗因移植，例如同种移植导致的疾病，特别是组织排斥反应，例如闭塞性细支气管炎(OB)，即同种肺移植物的慢性排斥反应。与没有患OB的病人相比，那些患有OB的病人经常显示支气管肺泡灌洗液中PDGF浓度升高。
本发明化合物对与血管平滑肌细胞迁移和增殖有关的疾病(其中PDGF和PDGF-R也经常起作用)如再狭窄和动脉粥样硬化也有效。这些作用及其对体内和体外血管平滑肌细胞增殖和迁移作用的结果可通过给予本发明化合物来证明，并且也可以通过研究其对体内机械性损伤后血管内膜增厚的作用来证明。
本发明化合物还可抑制涉及干细胞因子(SCF，也称作c-kit配体或青灰因子)的细胞过程，如抑制SCF受体(kit)自磷酸化和SCF-刺激的MAPK激酶(促细胞***剂-激活的蛋白激酶)活化。MO7e细胞是人幼巨核细胞性白血病细胞系，它依赖SCF来增殖。本发明化合物可抑制SCF受体的自磷酸化。
Trk族的神经营养受体(trkA、trkB、trkC)促进神经和非神经组织的存活、生长和分化。TrkB蛋白在小肠和结肠的神经内分泌型细胞、胰腺的α细胞、***和脾的单核细胞和巨噬细胞以及表皮的颗粒层中表达(Shibayama和Koizumi，1996)。TrkB蛋白的表达与Wilms肿瘤和成神经细胞瘤的有害进展有关。此外，TkrB在癌性***细胞中表达而不在正常细胞中表达。trk受体信号传递途径的下游包括通过Shc、激活的Ras、ERK-1和ERK-2基因激活MAPK的级联反应和PLC-γ传导途径(Sugimoto等人，2001)。
***素-激活的蛋白激酶(MAPK)是保守信号传导途径中的成员，其激活转录因子、翻译因子和其它对各种胞外信号进行应答的靶分子。MAPK通过***素-激活的蛋白激酶激酶(MKK)在序列Thr-X-Tyr的双重磷酸化基元处进行磷酸化来激活。在高等真核细胞中，MAPK信号传导的生理作用与细胞活动如增殖、瘤形成、发展和分化有关。因此，通过这些途径(特别是通过MKK4和MKK6)来调节信号传导的能力可导致开发出用于治疗和预防性治疗与MAPK信号传导相关的人类疾病如炎性疾病、自身免疫疾病和癌症的方法。
Syk是在肥大细胞脱粒和嗜曙红细胞活化中起关键作用的酪氨酸激酶。因此，在各种变应性病症，特别是哮喘中涉及Syk激酶。已经表明Syk通过N-末端SH2结构域与FcεR1受体磷酸化的γ链相结合并且对于下游信号很重要。
Ras-Raf-MEK-ERK信号途径调整细胞对生长信号的反应。在15％的人类癌症中，Ras突变为致癌形式。Raf族属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶并且包括三个成员，A-Raf、B-Raf和c-Raf(或Raf-1)。关于Raf作为药物靶点的研究主要集中在Raf是Ras的下游效应器的关系上。然而，近来的数据提示B-Raf可能在某些肿瘤的形成中起到非常突出的作用，并且不需要激活的Ras等位基因(Nature 417，949-954(2002年7月1日)。具体地讲，已在高百分比的恶性黑色素瘤中检测到了B-Raf突变。
黑色素瘤、特别是晚期黑色素瘤的现有医学治疗受到其有效性的限制。本发明化合物可抑制涉及B-Raf激酶的细胞过程，从而为人类癌症，特别是黑色素瘤的治疗提供新的治疗机会。
通过不同的基因编码的多种形式的p38MAPK(α、β、γ、δ)形成了部分在细胞对各种刺激(包括渗透性应激、紫外线和细胞因子介导的事件)的反应中所涉及的激酶链。这四种异构形式的p38被认为调节着细胞内信号过程的不同方面。它的激活是导致合成和产生前炎性细胞因子如TNFα的信号事件级联反应的一部分。P38通过将包括其他激酶和转录因子的下游底物磷酸化发挥作用。已证实，抑制p38激酶的物质可以阻断包括但不限于TNFα、IL-6、IL-8和IL-1β的细胞因子的产生。已证实当在体外用脂多糖(LPS)刺激时，外周血单核细胞(PBMC)会表达和分泌前炎性细胞因子。在用LPS刺激前用P38抑制剂预处理PBMC可以有效地阻断该作用。P38抑制剂在炎性疾病动物模型中是有效的。很多疾病的破坏作用是由过度产生前炎性细胞因子引起的。p38抑制剂调节这种过度产生的能力使得它们可用作减轻疾病的药物。
已证实，阻断p38功能的分子可有效地抑制骨再吸收、炎症和其它基于免疫和炎症的病理改变。因此，安全有效的p38抑制剂将提供一种治疗可以通过调节p38信号传递如RA来进行调节的衰弱退化性疾病的方法。因此，可以抑制p38活性的本发明化合物可用于治疗炎症、骨关节炎、类风湿性关节炎、癌症、自身免疫性疾病，并且可用于治疗其他细胞因子介导的疾病。
转化的生长因子-β(TGFβ)表示一大族蛋白质，例如包括TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3，它们是细胞生长和分化、胚胎和骨发育、细胞外基质形成、造血、免疫和炎性反应的多向调节剂。TGFβ族的成员启动细胞内信号传递途径，最终导致调节细胞循环、控制增殖反应或与介导细胞内外信号传递、细胞粘附、迁移和细胞间信息传递的细胞外基质蛋白相关的基因表达。因此，作为TGFβ细胞内信号传导途径抑制剂的本发明化合物可用于治疗成纤维细胞增殖性疾病，包括与TGFβ活性失调相关的肾脏疾病和过度纤维化，包括肾小球肾炎(GN)，如肾小球膜增殖性GN、免疫性GN和新月形GN。其它肾脏疾病包括糖尿病性肾病、肾间质纤维化、移植病人接受环孢菌素引起的肾纤维化和HIV相关性肾病。胶原血管疾病包括进行性***性硬化病、多肌炎、硬皮病、皮肌炎、嗜酸性细胞增多性肌膜炎、硬斑病或那些与Raynaud综合症发病相关的疾病。由TGFβ活性过强导致的肺纤维化包括成人呼吸窘迫综合征、COPD、先天性肺纤维化和常与自身免疫疾病如***性红斑狼疮和硬皮病、化学品接触或过敏相关的间质肺纤维化。另一种与纤维增殖特性相关的自身免疫疾病是类风湿性关节炎。纤维增殖性疾病可能与眼外科手术过程有关。这些过程包括伴有增殖性玻璃体视网膜病变的视网膜复置术、伴有眼内晶状体植入的白内障摘除术和青光眼引流术后。
成纤维细胞生长因子受体3显示对骨生长的下调作用并且抑制软骨细胞增殖。致死性发育不良是由成纤维细胞生长因子受体3的不同突变引起的，其中一种突变，TDII FGFR3，具有酪氨酸激酶结构活性，它激活转录因子Stat1，导致细胞周期抑制剂的表达、生长抑制和异常骨发育(Su等人，Nature，1997，386，288-292)。FGFR3也常常在多发性骨髓瘤类型的癌症中表达。
激酶c-Src传递许多受体的致癌信号。例如，肿瘤中EGFR或HER2/neu的过度表达导致c-src的结构活化，这是恶性细胞的特点，在正常细胞中没有。另一方面，c-src表达有缺陷的小鼠显示骨硬化病表型，表明了c-src在破骨细胞功能方面的关键作用和与相关疾病有关的可能性。
人核糖体S6蛋白激酶族由至少8个成员组成(RSK1、RSK2、RSK3、RSK4、MSK1、MSK2、p70S6K和p70S6Kb)。核糖体蛋白质S6蛋白激酶起重要的多向功能，尤其是在蛋白质生物合成过程中对mRNA翻译的调节起关键作用(Eur.J.Biochem 2000，11；267(21)：6321-30，Exp Cell Res.Nov.25，1999；253(1)：100-9，Mol Cell Endocrinol.May 25，1999；151(1-2)：65-77)。p70S6对S6核糖体蛋白质的磷酸化作用还参与细胞活动(Immunol.Cell Biol.2000，8；78(4)：447-51)和细胞生长(Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2000；65：101-27)的调节，因此，可能在肿瘤转移、免疫反应和组织修复以及其他疾病中是重要的。
SAPK(也被称为“jun N-末端激酶”或“JNK”)是一族在信号传导途径倒数第二步中体现的蛋白激酶，其导致c-jun转录因子的激活和c-jun调节的基因的表达。具体来说，c-jun与基因的转录有关，所述基因与编码因基因毒性而受损的DNA修复相关的蛋白质。所以，抑制细胞中SAPK活性的活性剂可以防止DNA修复和使细胞对通过诱导DNA损伤而起作用的癌症疗法敏感。
Lck在T-细胞信号传递中起作用。缺乏Lck基因的小鼠具有弱的胸腺细胞发育能力。Lck作为T-细胞信号传递的正性激活剂的功能启示Lck抑制剂有可能用于治疗自身免疫疾病如类风湿性关节炎。
Fes在骨髓造血细胞中大量表达并且在骨髓白细胞的分化和存活信号途径中都被涉及。在癌症，特别是直肠结肠癌和乳癌中涉及CSK。
如上文所述，本发明还提供一种在需要进行治疗的个体中预防或治疗上文所述的任何疾病或病症方法，该方法包括给予所述个体治疗有效量的(参见“给药和药物组合物”，下文)式I化合物或其可药用盐。对于任何上述用途，所需剂量会根据给药方式、被治疗的特定疾病和所需的效果来进行调整。
给药和药物组合物
通常，可通过本领域已知的任何常规和适宜的方式、单独或与一种或多种治疗剂一起给予治疗有效量的本发明化合物。治疗有效量可随着疾病的严重性、患者的年龄和相对健康状况、所用化合物的潜能和其它因素而改变。通常，以每日每公斤体重大约0.03-2.5mg的剂量***给药可获得满意的结果。大的哺乳动物，例如人的每日推荐剂量在大约0.5mg-100mg的范围内，通常以例如每日最多4次的分剂量给药或以缓释剂型给药。适宜的口服给药单位剂型包含大约1-50mg活性组分。
本发明化合物可以通过任何常规给药途径以药物组合物的形式给药，特别是肠道给药，例如，以片剂或胶囊剂的形式口服给药，或非肠道给药，例如，以注射溶液或悬浮液的形式给药，局部给药，例如，以洗剂、凝胶剂、软膏剂或霜剂的形式给药，或以鼻腔给药制剂或栓剂的形式给药。含有游离形式或可药用盐形式的本发明化合物和至少一种可药用载体或稀释剂的药物组合物可按照常规方法，通过混合、制粒或包衣方法制备。例如，口服组合物可以是片剂或明胶胶囊剂，它含有活性组分和a)稀释剂，例如，乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露糖醇、山梨糖醇、纤维素和/或甘氨酸；b)润滑剂，例如，二氧化硅、滑石粉、硬脂酸、其镁盐或钙盐和/或聚乙二醇；对于片剂来说还可以含有c)粘合剂，例如，硅酸镁铝、淀粉糊、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羧基甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮；如果需要还可以含有d)崩解剂，例如，淀粉、琼脂、藻酸或其钠盐，或泡腾剂混合物；和/或e)吸收剂、着色剂、矫味剂和甜味剂。注射组合物可以是等渗水溶液或悬浮液，并且栓剂可以由脂肪乳剂或悬浮液制备。组合物可以被灭菌和/或含有辅助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂或乳化剂、溶解促进剂、调节渗透压的盐和/或缓冲剂。另外，它们还可以含有其它有治疗价值的物质。适宜的透皮用制剂包含有效量的本发明化合物和载体。载体包括有助于通过宿主皮肤吸收的药理学上可接受的溶剂。例如，透皮吸收制剂是一种含有背衬膜、含有所述化合物并任选地含有载体和使所述化合物在较长的一段时间内以受控和预定速度释放到宿主皮肤的控速屏障的贮药库、以及确保所述透皮吸收制剂牢固地与皮肤接触的部件的绷带形式。也可以使用基质透皮制剂。合适的局部用，例如皮肤和眼睛用制剂优选为本领域公知的水溶液、软膏剂、霜剂或凝胶剂。所述制剂可包含增溶剂、稳定剂、张力增强剂、缓冲剂和防腐剂。
本发明化合物可以与一种或多种治疗剂一起以治疗有效量进行给药(联用药物产品)。例如，协同作用可与其它免疫调节剂或抗炎物质来产生，例如与环孢菌素、雷帕霉素或子囊霉素或其免疫抑制剂类似物，例如环孢菌素A(CsA)、环孢菌素G、FK-506、雷帕霉素或类似化合物、皮质类固醇、环磷酰胺、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、布喹那、来氟米特、咪唑立宾、麦考酚酸、吗替麦考酚酯、15-脱氧精胍菌素、免疫抑制剂抗体，特别是白细胞受体的单克隆抗体例如MHC、CD2、CD3、CD4、CD7、CD25、CD28、B7、CD45、CD58或其配体，或其它免疫调节化合物，如CTLA41g一起使用时产生。当本发明化合物与其它治疗剂一同给药时，共同给药的化合物的剂量当然将根据一起使用的药物类型、所使用的特定药物、被治疗的疾病等情况来进行调整。
本发明还提供了一种联用药物产品，例如药盒，其包含a)游离形式或可药用盐形式的第一种活性剂，它是本文公开的本发明化合物，和b)至少一种联用的活性剂。该药盒可包含用于给药的使用说明。
本文使用的术语“联合用药”或“合并给药”等意指包括将所选择的治疗剂给予同一病人，并且旨在包括治疗剂不以相同途径或相同时间给药的治疗方案。
本文所使用的术语“联用药物产品”是指由一种以上活性组分混合或组合所形成的产品并且包括活性成分的固定组合和不固定组合。术语“固定组合”是指活性组分例如式I化合物和联用治疗剂以单一实体或剂型同时给予患者。术语“不固定组合”是指活性组分例如式I化合物和联用治疗剂各自作为实体同时、一起或没有具体时间限制地依次给予患者，其中所述给药可在患者身体中提供治疗有效水平的两种化合物。后者也用于鸡尾酒疗法，例如给予三种或三种以上的活性组分。
制备本发明化合物的方法
本发明还包括制备本发明化合物的方法。在所描述的反应中，可能有必要保护在终产物中需要的反应性官能团，例如羟基、氨基、亚氨基、巯基或羧基，以避免它们不必要地参与反应。可按照标准实践使用常规的保护基，例如，参见T.W.Greene和P.G.M.Wuts“有机化学中的保护基”，John Wiley和Sons，1991。
在下面三个反应流程图的各流程图中，R10被表示为氢。其中R2是氢的式I的化合物可以通过下面反应流程图I中的过程来制备：
反应流程图I
Figure S04829422620060418D000141
其中R1、R3、R4、Y、Z和n的定义如发明概述中式I的定义所述。式I的化合物可以通过将式2的化合物与适宜的氧化剂(例如，NaNO2等)在存在适宜的酸(例如，TFA等)的情况下进行反应来制备。该反应是在20至40℃下进行的并且可进行最多4小时以使其反应完全。
其中R2是C1-6烷基的式I的化合物可以通过下面反应流程图II中的过程来进行制备：
反应流程图II
Figure S04829422620060418D000142
其中R1、R3、R4、Y、Z和n的定义如发明概述中式I的定义所述。
式I的化合物可以通过将其中R2是氢的式I的化合物与R2I或R2Br在存在适宜溶剂(例如，DMF等)和适宜的氧化剂(例如，NaH等)的情况下进行反应来制备。该反应是在0至25℃下进行的并且可进行最多4小时以使其反应完全。
反应流程图III
其中R2、R3、R4、R6、Y、Z和n的定义如发明概述中式I的定义所述。
式I的化合物可以通过将式I的化合物与R6NH2在存在适宜的溶剂(例如，二噁烷等)、适宜的碱(例如，磷酸钾、叔丁醇钾等)、适宜的配体(例如，Xantphos、咪唑鎓配体(见实施例8)等)和适宜的催化剂(例如，Pd2(dba)3、Pd(OAc)2等)的情况下进行反应来制备。该反应是在约80至约120℃下进行的并且可进行最多约24小时以使其反应完全。
在下面的实施例中对式I化合物的合成进行了详细描述。
制备本发明化合物的其它方法
本发明化合物的可药用酸加成盐可通过将游离碱形式的化合物与可药用无机或有机酸反应来制备。或者，本发明化合物的可药用碱加成盐可通过将游离酸形式的化合物与可药用无机或有机碱反应制备。或者，盐形式的本发明化合物可利用起始材料或中间体的盐制备。
游离酸或游离碱形式的本发明化合物可分别由相应的碱加成盐或酸加成盐制备，例如酸加成盐形式的本发明化合物可通过用适宜的碱(例如，氢氧化铵溶液、氢氧化钠等)处理转化为相应的游离碱。碱加成盐形式的本发明化合物可通过用适宜的酸(例如，盐酸等)处理转化为相应的游离酸。
非氧化形式的本发明化合物可通过在适宜的惰性有机溶剂(例如乙腈、乙醇、二噁烷水溶液等)中，在0-80℃下，用还原剂(例如，硫、二氧化硫、三苯基膦、硼氢化锂、硼氢化钠、三氯化磷、三溴化磷等)处理由本发明化合物的N-氧化物制备。
本发明化合物的前药衍生物可通过本领域普通技术人员已知的方法(例如，详情见Saulnier等人(1994)，Bioorganic and Medicinal ChemistryLetters，第4卷，第1985页)制备。例如，适宜的前药可通过将非衍生化的本发明化合物与适宜的氨基甲酰化试剂(例如，1，1-酰氧基烷基羰基氯(carbanochloridate)、对硝基苯基碳酸酯等)反应来制备。
本发明化合物的被保护衍生物可通过本领与普通技术人员已知的方法制备。用于产生保护基及其脱除的技术的详细描述可见于T.W.Greene，“有机化学中的保护基”，第3版，John Wiley和Sons，Inc.，1999。
在本发明化合物的制备过程中，可方便地制备或形成本发明化合物的溶剂化物(例如水合物)。本发明化合物的水合物可通过在水/有机溶剂混合物中重结晶，利用有机溶剂如二恶英、四氢呋喃或甲醇方便地制备。
本发明化合物单独的立体异构体可通过将化合物的外消旋混合物与旋光拆分剂反应形成一对非对映异构体化合物、分离非对映异构体并重新获得光学纯对映异构体来制备。尽管对映异构体的拆分可利用本发明化合物的共价非对映异构体衍生物来进行，但可解离的复合物(例如，非对映异构体盐晶体)是优选的。非对映异构体具有不同的物理性质(例如，熔点、沸点、溶解度、反应性等)并且可以很容易地利用这些差异进行分离。非对映异构体可以通过色谱法分离，或者优选通过建立在溶解度不同基础上的分离/拆分技术进行分离。然后通过任何不会导致消旋化的实用方法重新获得光学纯的对映异构体和拆分剂。用于通过外消旋混合物拆分化合物的立体异构体的技术的更详细描述可见于Jean Jacques，Andre Collet，SamuelH.Wilen，“对映异构体、外消旋体和拆分”，John Wiley和Sons，Inc.，1981。
总之，式I化合物可通过下述方法制备，该方法包括：
(a)反应方案I、II或III中的那些方法；和
(b)任选地将本发明化合物转化为可药用盐；
(c)任选地将盐形式的本发明化合物转化为非盐形式；
(d)任选地将非氧化形式的本发明化合物转化为可药用N-氧化物；
(e)任选地将N-氧化物形式的本发明化合物转化为其非氧化物形式；
(f)任选地将异构体混合物拆分为本发明化合物的单一的异构体；
(g)任选地将非衍化的本发明化合物转化为可药用前药衍生物；和
(h)任选地将本发明化合物的前药衍生物转化为其非衍化形式。
当本文中未对起始材料的制备进行具体描述时，则所述化合物是已知的或者可通过本领域已知的类似方法或如下文实施例所述进行制备。
本领域技术人员可以理解上述转化仅仅是制备本发明化合物方法的代表，并可类似地使用其他公知的方法。
实施例
用下面说明了本发明式I的化合物(实施例)和中间体(参考例)的制备的实施例对本发明进行进一步非限制性的举例说明。
实施例1
N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000171
步骤A：2，6-二氯-3-硝基苯基-乙腈的制备
Figure S04829422620060418D000172
在0℃下，向2，6-二氯-苯基-乙腈(15.0g，80.62mmol)在二氯甲烷(50mL)和H2SO4(40mL)中的溶液中缓慢加入H2SO4(14mL)和HNO3(5.5mL)的混合物。将该反应混合物在0℃下搅拌20分钟，在半小时内加温至室温，然后将其浓缩以除去有机溶剂。将该溶液倾倒到一个包含冰水(400mL)的烧杯中，得到一种结晶性沉淀，通过真空过滤对其进行收集，用水洗涤得到产物(20.44g，82.4％)。
步骤B：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-[1，6]萘啶-2-基胺的制备
Figure S04829422620060418D000181
将2，6-二氯-3-硝基苯基-乙腈(1.02g，4.42mmol)、4-氨基-吡啶-3-甲醛(0.4g，3.28mmol)和NaOH(52mg，1.31mmol)在EtOH(2.0mL)中的溶液加热至105℃加热24小时。将该反应混合物用EtOAc(50ml)稀释，并用饱和K2CO3和盐水对其进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物。通过快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(100/6)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(257mg，23.4％)。
步骤C：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮的制备
在0℃下，向3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-[1，6]萘啶-2-基胺(50mg，0.149mmol)在TFA(3.0mL)中的溶液中缓慢加入NaNO2。将该反应混合物在0℃下搅拌15分钟，加温至室温并将其搅拌三小时。将该溶液倾倒到一个包含冰水(50mL)和NaCO3的烧杯中，然后用EtOAc(3×50ml)对其进行萃取，并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到固体形式的标题中间体化合物(50mg，100％)。
另一种制备3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮的方法：
步骤A’：(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-乙酸的制备
将2，6-二氯-3-硝基苯基-乙腈(15.0g，64.94mmol)在水(100mL)和浓H2SO4(100mL)中的溶液加热至120℃加热三小时。将该反应混合物冷却至室温并将其倾倒到一个包含冰水(250mL)的烧杯中，得到一种结晶性沉淀，通过真空过滤对其进行收集，用水洗涤，得到产物(16.0g，98.6％)。
步骤B’：2-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-N-(3-甲酰基-吡啶-4-基)-乙酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000192
将(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-乙酸(15.0g，60.0mmol)在亚硫酰氯(60mL)中的溶液回流一小时。通过浓缩除去溶剂；向其中加入无水甲苯并将其浓缩以彻底除去亚硫酰氯。向酰氯在无水二氯甲烷(200mL)中的溶液中加入(滴加)4-氨基-吡啶-3-甲醛(6.6g，54mmol)在二氯甲烷(50mL)和DIEDA(10.7mL，60mmol)中的溶液。将该混合物在室温下放置2小时。将该反应混合物用EtOAc(300ml)稀释并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物。用二氯甲烷/己烷重结晶，得到固体形式的标题化合物(18.2g，95.2％)。
步骤C’：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮的制备
将2-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-N-(3-甲酰基-吡啶-4-基)-乙酰胺(5.0g，14.12mmol)和Na2CO3(2.5g)在MeOH(300mL)中的溶液在70℃下加热15分钟。将该反应混合物过滤后，通过浓缩除去溶剂，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(93/7％)梯度洗脱，得到固体形式的标题化合物(3.75g，77.7％)。
步骤D：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮的制备
在0℃下，向3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮(2.0g，5.95mmol)在DMF(50mL)中的溶液中加入HNa(286mg，60％，7.14mmol)和IMe(0.5mL，8.03mmol)。将该混合物在0℃下搅拌两小时，用EtOAc(300ml)稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(98.5/1.5)梯度洗脱，得到固体形式的标题化合物(1.67g，80.3％)。
步骤E：3-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮的制备
Figure S04829422620060418D000202
在75℃下，向3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(1.55g，4.427mmol)在EtOH(12mL)中的混悬液中加入Sn(II)Cl2(3.80g，19.92mmol)在浓HCl(16mL)中的溶液。在将其在75℃下搅拌30分钟后，将该混合物用EtOAc稀释并用K2CO3将其中和至pH 8。将有机层用饱和K2CO3、盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩，得到粗产物。通过用CH2Cl2/EtOAc/己烷重结晶来对粗产物进行纯化，得到固体形式的标题中间体化合物(1.32g，93.15％)。
步骤F：4-氯甲基-N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000211
向3-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]-萘啶-2-酮(30mg，0.0937mmol)在二氯甲烷(7mL)中的溶液中加入4-(氯甲基)苯甲酰氯(53.2mg，0.28mmol)。将该混合物在室温下搅拌24小时后，用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水对其进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(95/5％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(32.4mg，73.1％)。
步骤G：N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000212
向4-氯甲基-N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-苯甲酰胺(25mg，0.0529mmol)在DMF(2.5mL)中的溶液中加入CsCO3(51.7mg，0.1587mmol)和(53.2mg，0.28mmol)。将该混合物在室温下搅拌30分钟后，将其用EtOAc稀释并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(98/8)梯度洗脱，得到固体形式的N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-4-(4-甲基-哌嗪-1-基甲基)-苯甲酰胺(21mg，73.9％)：1H NMR 400MHz(CDCl3)δ8.86(s，1H)，8.69(s，1H)，8.63(d，1H)，8.44(s，1H)，7.84-7.86(m，2H)，7.77(s，1H)，7.46-7.52(m，3H)，7.29(d，1H)，3.78(s，3H)，3.58(s，2H)，2.50(m，8H)，2.30(s，3H)；MS m/z 537.2(M+1)。
实施例2
N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯磺酰胺
Figure S04829422620060418D000221
将3-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(35mg，0.1093mmol)溶解于无水THF(2mL)中。向其中加入4-三氟甲基苯磺酰氯(26.74mg，0.1093mmol)和吡啶(12.95mg，0.1640mmol)。将该反应回流2小时，用乙酸乙酯(150mL)稀释并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机相用MgSO4干燥并用硅胶柱色谱对粗品进行纯化，并用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到白色固体形式的N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯磺酰胺(20.6mg)：1H NMR(CD3OD)：δ3.70(s，3H)，7.44(d，1H)，7.53(d，1H)，7.63(t，1H)，7.82(m，3H)，7.91(s，1H)，7.98(s，1H)，8.62(d，1H)，9.03(s，1H)；MS m/z 528.1(M+1)。
实施例3
N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000222
步骤A：2-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-N-(2-甲酰基-苯基)-乙酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000231
将(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-乙酸(0.90g，3.35mmol)在亚硫酰氯(15mL)中的溶液回流一小时。通过浓缩除去溶剂并向其中加入无水甲苯以彻底除去亚硫酰氯。向酰氯在无水二氯甲烷(30mL)中的溶液中加入(滴加)2-氨基苯甲醛(0.365g，3.02mmol)在二氯甲烷(5.0mL)中的溶液。将该混合物在室温下搅拌2小时。将该反应混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物(0.94g，88.6％)。
步骤B：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-喹啉-2-酮的制备
Figure S04829422620060418D000232
将2-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-N-(2-甲酰基-苯基)-乙酰胺(0.7g，1.99mmol)和Na2CO3(1.0g)在MeOH(150mL)中的溶液在70℃下加热30分钟。将该反应混合物过滤后，通过浓缩除去溶剂，得到粗产物。将该粗产物用快速柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(97/3％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(0.288g，41.3％)。
步骤C：3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮的制备
Figure S04829422620060418D000233
在0℃下，向3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1H-喹啉-2-酮(0.21g，0.6266mmol)在DMF(5.0mL)中的溶液中加入HNa(30.1mg，60％，0.752mmol)和IMe(120.1mg，0.846mmol)。将该混合物在0℃下搅拌两小时后，将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(95/5)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(78mg，35.8％)。
步骤D：3-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮的制备
Figure S04829422620060418D000241
在75℃下，向3-(2，6-二氯-3-硝基-苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮(50mg，0.143mmol)在EtOH(3.0mL)中的混悬液中加入Sn(II)Cl2(122mg，0.644mmol)在浓HCl(2.0mL)中的溶液。将该混合物在75℃下搅拌30分钟后，将该混合物用EtOAc稀释并用K2CO3对其进行中和直至其pH达到8。将有机层用饱和K2CO3、盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩，得到粗产物(44.2mg，96.7％)。
步骤E：N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000242
向3-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-喹啉-2-酮(30mg，0.094mmol)在二氯甲烷(5.0mL)中的溶液中加入4-(氯甲基)苯甲酰氯(58.7mg，0.283mmol)。将该混合物在室温下搅拌24小时后，用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水对其进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(95/5)梯度洗脱，得到固体形式的N-[2，4-二氯-3-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-喹啉-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(34.5mg，75.0％)：1HNMR 400MHz(CDCl3)δ8.53(d，1H)，8.47(s，1H)，8.20(s，1H)，8.05(d，1H)，7.84(d，1H)，7.72(s，1H)，7.61-7.69(m，3H)，7.51(d，1H)，7.46(d，1H)，7.30(m，1H)，3.83(s，3H)；MS m/z 491.20(M+1)。
实施例4
N-[3，5-二氯-4-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000251
在0℃下，向3，5-二氯硝基苯(50.00g，260.6mmol)和甲基硫代乙腈(22.71g，260.6mmol)在DMSO(400mL)中的溶液中加入NaOH(20.84g，521.2mmol)。将该反应混合物加温至室温，将其在室温下在N2下搅拌24小时。将该反应用冰水稀释并用3N HCl酸化至pH为1。用乙酸乙酯对该混合物进行萃取(3×500mL)，用H2O洗涤，用MgSO4干燥并将其浓缩，得到一种黑色的油状物。将该油状物用硅胶柱色谱纯化，用0-10％乙酸乙酯/己烷梯度洗脱，得到黄色固体形式的2，6-二氯-4-硝基苄腈(11.00g)。
将进行着搅拌的2，6-二氯-4-硝基苄腈(10.86g，47.0mmol)在浓H2SO4(45mL)和H2O(50mL)中的混悬液在150℃下加热2.5小时。然后，将该反应混合物倾倒到水(300mL)中。通过过滤收集沉淀，得到白色固体形式的2，6-二氯-4-硝基苄基-甲酸(10.41g)。
将2，6-二氯-4-硝基苄基-甲酸(3.00g，11.98mmol)混悬于亚硫酰氯(12mL)中。将该混悬液加热至80℃并将其回流30分钟。通过加入无水甲苯来完全蒸发除去过量的亚硫酰氯。将残余物溶解于无水二氯甲烷(50mL)中，然后将其加入到4-氨基-3-吡啶基甲醛(1.76g，14.38mmol)在无水二氯甲烷(5mL)和三乙胺(2.91g，28.76mmol)中的溶液中。将其在室温下搅拌2小时后，将该反应混合物用乙酸乙酯(500mL)稀释，用饱和K2CO3溶液和盐水对其进行洗涤。将有机相用MgSO4干燥并用硅胶柱色谱对粗产物进行纯化，用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到白色固体形式的2-(2，6-二氯-4-硝基-苯基)-N-(3-甲酰基-吡啶-4-基)-乙酰胺(3.00g)。
将2-(2，6-二氯-4-硝基-苯基)-N-(3-甲酰基-吡啶-4-基)-乙酰胺(3.0g，8.47mmol)溶解于无水甲醇(240mL)中。向其中加入Na2CO3(1.80g，16.94mmol)。将该反应回流30分钟，用乙酸乙酯(210mL)稀释并将其过滤。蒸发掉溶剂，得到粗产物，将其用乙酸乙酯/己烷重结晶，得到淡黄色固体形式的3-(2，6-二氯-4-硝基-苯基)-1H-[1，6]萘啶-2-酮(3.07g)。
将3-(2，6-二氯-4-硝基-苯基)-1H-[1，6]-萘啶-2-酮(1.50g，4.46mmol)溶解于无水DMF(60mL)中并将其冷却至0℃。向其中加入NaH(0.20g，60％位于矿物油中的分散液，4.91mmol)和碘甲烷(0.76g，5.35mmol)并将其在0℃下搅拌1.5小时。通过蒸发除去溶剂，将残余物溶解于乙酸乙酯(300mL)中，用饱和K2CO3和盐水对其进行洗涤，用MgSO4干燥并将其浓缩，得到粗产物(1.30g)，其不经进一步纯化直接用于下一步。
将上一步的粗品(437mg)混悬于无水乙醇(45mL)中。向该混悬液中加入溶解于浓HCl(6mL)中的SnCl2(946mg，4.99mmol)。将该反应加热至75℃并将其回流30分钟。将该反应用乙酸乙酯(200mL)稀释并用饱和K2CO3和盐水洗涤。将有机相用MgSO4干燥并用硅胶柱色谱对粗产物进行纯化，用0-4％2.0N的甲醇氨溶液/二氯甲烷梯度洗脱，得到黄色固体形式的3-(4-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(265mg)。
向3-(4-氨基-2，6-二氯-苯基)-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(30mg，0.0937mmol)在无水二氯甲烷(12mL)中的溶液中加入3-三氟甲基苯甲酰氯(39.08mg，0.1874mmol)。将该反应在室温下搅拌2小时。将该反应用乙酸乙酯(100mL)稀释，用饱和K2CO3和盐水对其进行洗涤。将有机相用MgSO4干燥并将粗产物用硅胶柱色谱纯化，用0-4％甲醇/二氯甲烷梯度洗脱，得到白色固体形式的N-[3，5-二氯-4-(1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(42mg)。1H NMR 400MHz(CD3OD)：δ3.80(s，3H)，7.62(d，1H)，7.76(t，1H)，7.92(d，1H)，8.01(s，2H)，8.06(s，1H)，8.23(d，1H)，8.30(s，1H)，8.64(d，1H)，8.92(s，1H)。MS m/z 492.2(M+1)。
实施例5
N-[4-氯-3-(2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
向2-氯-5-硝基-苯乙酸(3.08g，14.28mmol)在二氯甲烷(150mL)中的溶液中加入草酰氯(6.2mL，71.00mmol)并将该混合物回流1小时。在冷却至室温后，将其浓缩并将残余物与无水甲苯(2×30mL)一起蒸发。然后，将残余物溶解于二氯甲烷(60mL)中并向其中加入4-氨基-吡啶-3-甲醛(1.744g，14.28mmol)在二氯甲烷(30mL)中的溶液。将该混合物搅拌20分钟，然后向其中加入N，N’-二异丙基乙胺(2.56mL，14.28mmol)。继续再搅拌两小时，然后用二氯甲烷(500mL)稀释。将该混合物用水(100mL)、盐水(100mL)洗涤，用MgSO4干燥，过滤，浓缩。粗产物不经进一步纯化直接使用。
将所述粗产物和碳酸钠(3.0g，28.3mmol)在甲醇(50mL)中回流30分钟。通过过滤除去固体并将滤液浓缩。将残余物溶解于EtOAc(500mL)中，用水(2×50mL)洗涤，将有机相分离出来并对其进行浓缩。在结晶后，得到终产物(2.78g)。
将3-(2-氯-5-硝基-苯基)-1H-[1，6]-萘啶-2-酮(0.96g，3.18mmol)混悬于乙醇(15mL)中。向其中加入SnCl2(2.71g，14.3mmol)和HCl(20mL)并将该混合物回流两小时，然后将其冷却至室温。向其中加入EtOAc(100mL)并通过加入碳酸钠来对该混合物进行中和。用EtOAc(3×100mL)萃取，将所合并的有机物用盐水(50mL)洗涤，用MgSO4干燥，得到淡黄色固体形式的终产物(0.62g，71.7％)。
向3-(5-氨基-2-氯-苯基)-1H-[1，6]-萘啶-2-酮(60mg，0.23mmol)和DIPEA(82μl，0.46mmol)在无水THF(2.5mL)中的溶液中加入3-三氟甲基-苯甲酰氯(44μl)溶液。将该混合物在室温下搅拌30分钟，用EtOAc(50mL)稀释，用水(10mL)和盐水(10mL)洗涤，用MgSO4干燥，浓缩并用制备HPLC对其进行纯化，得到N-[4-氯-3-(2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-苯基]-3-三氟-甲基-苯甲酰胺(18.3mg)。
实施例6
N-(2，4-二氯-3-{2-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基}-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000281
步骤A：4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛的制备
Figure S04829422620060418D000282
在0℃下，向4-氨基-2-(甲硫基)嘧啶-5-腈(3.0g，18.05mmol)在THF(100mL)中的溶液中加入氢化二异丁基铝(41.52mL，1.0M的CH2Cl2溶液，41.52mmol)。将该混合物在0℃下搅拌2.5小时后，向其中加入盐酸(2N，30mL)并将其继续搅拌20分钟。向该反应混合物中加入饱和Na2CO3直至其pH达到8。用硅藻土垫将混悬的物质滤出并用K2CO3溶液对其进行洗涤。将该溶液用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用快速硅胶柱色谱进行纯化，用己烷(100％)至己烷/***(60/40％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(1.62g，53.1％)。
步骤B：6-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺的制备
Figure S04829422620060418D000291
将4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(2.0g，11.82mmol)、(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-乙腈(2.85g，14.18mmol)和K2CO3(4.9g，35.49mmol)在DMF(20mL)中的混合物加热至110℃加热30小时。将该溶液冷却至室温并用滤纸除去固体，浓缩，得到粗产物。用硅胶快速柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(100/7％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(3.31g，80.0％)。
步骤C：N-[3-(7-氨基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-2，4-二氯-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000292
向6-(3-氨基-2，6-二氯-苯基)-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]-嘧啶-7-基胺(0.5g，1.42mmol)在CH2Cl2(40mL)中的溶液中加入3-(三氟甲基)苯甲酰氯(1.07mL，7.1mmol)。将该混合物在室温下搅拌24小时后，将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用硅胶快速柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(95/5％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(0.591g，79.4％)。
步骤D：N-[2，4-二氯-3-(2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000301
在0℃下，在搅拌的同时在20分钟内向N-[3-(7-氨基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-2，4-二氯-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(1.7g，3.24mmol)在TFA(15mL)中的溶液中缓慢加入NaNO2(783mg，11.35mmol)。蒸发掉溶剂，用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物。将该粗产物用硅胶快速柱色谱纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(93/7％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(1.64g，96.5％)。
步骤E：N-[2，4-二氯-3-(8-甲基-2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
在0℃下，在搅拌的同时在30分钟内向N-[2，4-二氯-3-(2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(1.14g，2.17mmol)在DMF(35mL)中的溶液中缓慢加入NaH(117.2mg，60％，2.93mmol)。向上面的溶液中加入碘甲烷(369mg，2.60mmol)并将其在0℃下搅拌40分钟。蒸发掉溶剂，用EtOAc对其进行稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，用快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(93/7)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(1.14g，98.0％)。
步骤F：N-[2，4-二氯-3-(2-甲磺酰基-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000311
将N-[2，4-二氯-3-(8-甲基-2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(1.1g，2.04mmol)和MCPBA(983mg，60％，4.38mmol)在CH2Cl2(50mL)中的溶液在室温下搅拌1小时。将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水对其进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，用快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用己烷(100％)至己烷/EtOAc(65/35)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(472mg，40.7％)。
步骤G：N-(2，4-二氯-3-{2-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基}-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000312
将N-[2，4-二氯-3-(2-甲磺酰基-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(20mg，0.035mmol)和3-(1-羟基乙基)-苯胺(50mg，0.364mmol)的混合物在120℃下加热10分钟。将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，将其用制备HPLC纯化，得到白色固体形式的N-(2，4-二氯-3-{2-[3-(1-羟基-乙基)-苯基氨基]-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基}-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺。(17.9mg，81.4％)。1H NMR(CD3OD)：δ10.50(s，1H)，8.57(d，1H)，8.52(s，1H)，8.41(s，1H)，8.19(s，1H)，8.06(d，1H)，7.92(s，1H)，7.86(d，1H)，7.68(t，1H)，7.59(d，1H)，7.56(s，1H)，7.52(d，1H)，7.41(t，1H)，7.21(s，1H)，7.20(d，1H)，4.98(q，1H)，3.83(s，3H)，1.54(d，2H)；MS m/z 629.10(M+1)。
实施例7
N-{3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]-4-氯-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000321
步骤A：(2-氯-5-硝基-苯基)-乙腈的制备
在0℃下，向2-氯-苯基-乙腈(15.0g，99.0mmol)在二氯甲烷(50mL)和H2SO4(40mL)中的溶液中缓慢加入H2SO4(14mL)和HNO3(5.5mL)的混合物。将该反应混合物在0℃下搅拌20分钟，将其在30分钟内加温至室温，然后将其浓缩以除去有机溶剂。将该溶液倾倒到一个包含冰水(400mL)的烧杯中，得到一种结晶性沉淀，通过真空过滤对其进行收集并用水对其进行洗涤，得到标题中间体化合物(13.4g，69.0％)。
步骤B：(5-氨基-2-氯-苯基)-乙腈的制备
在75℃下，向(2-氯-5-硝基-苯基)-乙腈(4.0g，20.0mmol)在EtOH(10mL)中的混悬液中加入Sn(II)Cl2(15.36g，81.0mmol)在浓HCl(14mL)中的溶液。将该混合物在75℃下搅拌30分钟后，将该混合物用EtOAc稀释并用K2CO3对其进行中和直至其pH达到8。将有机层用饱和K2CO3、盐水洗涤，干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，通过用CH2Cl2/EtOAc/己烷重结晶对其进行纯化，得到固体形式的标题中间体化合物(3.04g，89.7％)。
步骤C：6-(5-氨基-2-氯-苯基)-2-甲硫基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺的制备
Figure S04829422620060418D000331
将4-氨基-2-甲硫基-嘧啶-5-甲醛(1.8g，10.64mmol)、(5-氨基-2-氯-苯基)-乙腈(2.3g，13.83mmol)和K2CO3(4.41g，31.92mmol)在DMF(20mL)中的溶液加热至110℃加热36小时。将该溶液冷却至室温并用滤纸除去固体。然后，将该混合物浓缩，得到粗产物。用快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(2N NH3)(97/3％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(1.24g，36.7％)。
步骤D：N-[3-(7-氨基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-4-氯-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000332
向6-(5-氨基-2-氯-苯基)-2-甲硫基吡啶并[2，3-d]嘧啶-7-基胺(0.65g，2.046mmol)在CH2Cl2(80mL)中的溶液中加入3-(三氟甲基)苯甲酰氯(2.13g，10.23mmol)。将该混合物在室温下搅拌24小时后，将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到固体形式的粗产物(1.0g，～100％)。
步骤E：N-[4-氯-3-(2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000341
在0℃下，在搅拌下在20分钟内向N-[3-(7-氨基-2-甲硫基-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-4-氯-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(1.0g，2.04mmol)在TFA(10mL)中的溶液中缓慢加入NaNO2(423mg，6.12mmol)。蒸发掉溶剂，用EtOAc稀释，用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，用快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用CH2Cl2(100％)至CH2Cl2/MeOH(NH3，2N)(93/7％)梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(0.644g，64.4％)。
步骤F：N-[4-氯-3-(8-甲基-2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
Figure S04829422620060418D000342
在0℃下，在搅拌下在30分钟内向N-[4-氯-3-(2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(370mg，0.75mmol)在DMF(35mL)中的溶液中缓慢加入NaH(40.7mg，60％，1.02mmol)。向上面的溶液中加入碘甲烷(133.7mg，0.94mmol)，将其在0℃下搅拌40分钟。蒸发掉溶剂，用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，其不经进一步纯化直接用于下一步。
步骤G：N-[4-氯-3-(2-甲磺酰基-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
将N-[4-氯-3-(8-甲基-2-甲硫基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(380mg，0.75mmol)和MCPBA(386mg，60％，1.72mmol)在CH2Cl2(25mL)中的溶液在室温下搅拌1小时。将该混合物用EtOAc稀释并用饱和K2CO3、盐水和水进行洗涤。将有机层干燥，过滤，浓缩，得到粗产物，用快速硅胶柱色谱对其进行纯化，用己烷(100％)至己烷/EtOAc(65/35％)进行梯度洗脱，得到固体形式的标题中间体化合物(126mg，31.1％)。
步骤H：N-{3-[2-(3-氨基-苯基氨基)-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基]-4-氯-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺的制备
将3-氨基苯胺(121.1mg，1.12mmol)加热至110℃。当熔化时，向其中加入N-[4-氯-3-(2-甲磺酰基-8-甲基-7-氧代-7，8-二氢-吡啶并[2，3-d]嘧啶-6-基)-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺34(15mg，0.028mmol)。将该反应液在110℃下搅拌25分钟。将该反应液用MeOH(1mL)稀释并用制备-HPLC对其进行纯化，得到黄色固体形式的终产物：1H NMR(CDCl3)：δ3.64(s，3H)，6.66(d，1H)，7.17(t，1H)，7.28(d，1H)，7.42(m，2H)，7.48(t，1H)，7.50(dd，1H)，7.57(s，1H)，7.63(m，2H)，7.97(d，1H)，8.07(s，1H)，8.49(s，1H)；MS m/z 565.0(M+1)。
实施例8
N-{3-[7-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000351
Figure S04829422620060418D000361
对于上面的反应流程图来说，R6NH2是6-甲氧基-吡啶-3-基胺。将1，3-丙酮二甲酸二乙酯(10.11g，50mmol)与原甲酸三乙酯(8.14g，55mmol)和醋酸酐(10.20g，100mmol)在100mL的烧瓶中进行混合并将其加热至120℃加热1.5小时。在约90-100℃下将该粗产物真空(150-200mmHg)蒸馏，可在冷凝器中收集到淡黄色的油状溶液。将剩余的残余物在冰上冷却并将其与30％的氨水(4ml)混合。使该反应在冰浴上进行1小时，然后用2N HCl将其酸化至pH＜5。在真空下除去溶剂。用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(1∶1)进行洗脱。终产物化合物(2)4，6-二羟基-烟酸乙酯是澄清的油状物，2.85g。
将4，6-二羟基-烟酸乙酯(2.85g)与纯POCl3(25mL)在100mL的烧瓶中进行混合并将其加热至110℃加热2小时。在冷却后，在真空下除去大部分POCl3。将该深色的粗产物倒入少量冰水混合物中，用饱和碳酸钠溶液对其进行中和。用200mL乙酸乙酯对产物萃取两次。将所合并的有机层用饱和氯化钠溶液洗涤并用Na2SO4干燥。在除去溶剂后，用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(15％∶85％)进行洗脱。最终的化合物(3)4，6-二氯-烟酸乙酯是白色固体，3.05g。
将4，6-二氯-烟酸乙酯(2.19g，10mmol)溶解于30mL乙腈中并将其冷却至0℃，将其缓慢加入到4mL甲胺溶液(40％甲胺水溶液，50mmol)中。将该反应在0℃下搅拌30分钟并将其加温至室温再搅拌2小时。在真空下除去溶剂并用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(30％∶70％)进行洗脱。最终的化合物(4)6-氯-4-甲基氨基-烟酸乙酯是白色固体，2.03g。
将6-氯-4-甲基氨基-烟酸乙酯(2.03g，9.5mmol)溶解于30mL无水THF中并将其冷却至-78℃。缓慢向其中加入20mL LAH THF溶液(1M THF溶液，20mmol)并使其在-78℃下继续反应3小时。使该反应缓慢加温至室温并用TLC进行检查以确保没有剩余的原料。缓慢向其中加入少量MeOH/EA(1∶1)混合物以破坏过量的LAH。使该粗产物通过硅藻土塞，用EA将其洗涤两次。在真空下除去溶剂，然后用快速柱色谱对粗品进行纯化，用MeOH/DCM(5％∶95％)进行洗脱。最终的化合物(5)(6-氯-4-甲基氨基-吡啶-3-基)-甲醇是白色固体，1.40g。
将(6-氯-4-甲基氨基-吡啶-3-基)-甲醇(1.40g，8.1mmol)溶解于40mLDCM中并向其中加入7.0g MnO2(81mmol)。将该反应在室温下搅拌2小时。然后，使该反应溶液通过硅藻土塞并用EA对其进行洗涤。在真空下除去溶剂，用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(3∶7)进行洗脱。该最终的化合物(6)6-氯-4-甲基氨基-吡啶-3-甲醛是白色固体，1.30g。
Figure S04829422620060418D000371
将2-甲基-5-硝基苯甲酸(5.0g，27.5mmol)溶解于50mL无水THF中。
在加入41.3mL 1M硼烷的THF溶液(41.3mmol)后，将该反应在室温下搅拌18小时。用碳酸钾(4.5g)的100mL水溶液终止反应。在真空下除去THF，然后用DCM对该水溶液进行萃取并用盐水对所合并的有机层进行洗涤，用硫酸钠干燥。过滤，在真空下除去溶剂，终产物化合物(12)(2-甲基-5-硝基苯基)-甲醇是淡黄色固体，4.3g。
将(2-甲基-5-硝基苯基)-甲醇(4.3g，25.7mmol)溶解于100mL无水DCM中并将其冷却至0℃，用甲磺酰氯(3.22g，28.3mmol)和DIEA(5.36mL，30.8mmol)对其处理30分钟。使该反应加温至室温并将其再搅拌30分钟。通过加入30mL水终止反应。用盐水对有机层进行洗涤，用硫酸钠干燥，过滤。在真空下除去溶剂，终产物化合物(13)甲磺酸(2-甲基-5-硝基苯基)-甲酯是黄色油状物，6.2g。
将甲磺酸(2-甲基-5-硝基苯基)-甲酯(6.2g，25.3mmol)和***(5.0g，76mmol)在200mL乙腈中回流8小时并将其冷却至室温。在真空下除去溶剂，然后将粗产物溶解于DCM中并对其进行过滤。用盐水对滤液进行洗涤并用硫酸钠干燥。在真空下除去溶剂，然后用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(1∶1)进行洗脱。终产物化合物(14)2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙腈是黄色固体，3.1g。
将2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙腈(2.5g，14.2mmol)溶解于50mL甲醇中。向其中加入溶于50mL水的氢氧化钾(8.0g，142mmol)并将该反应加热回流14小时。在冷却和除去甲醇后，用DCM和***对水层进行洗涤。将所合并的有机层用盐水洗涤，用硫酸钠干燥并对其进行过滤。在真空下除去溶剂后，得到橙色固体形式的终产物化合物(15)2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙酸，1.9g。
将2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙酸(1.9g，9.7mmol)溶解于50mL甲醇中并向其中加入5mL 4M HCl的1，4-二噁烷溶液。将该反应液加热回流14小时。在冷却和除去溶剂后，将粗产物溶解于50mL水中并用2N氢氧化钠水溶液将其碱化至pH＞12。用乙酸乙酯对该溶液进行萃取，并用盐水对所合并的有机层进行洗涤，用硫酸钠干燥，过滤。在除去溶剂后，得到深黄色固体形式的终产物化合物(16)2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙酸甲酯，1.85g。
将2-(2-甲基-5-硝基苯基)-乙酸甲酯(1.85g，8.85mmol)溶解于40mL乙醇中。向其中加入180mg 10％钯碳并使用氢气囊。将该反应在RT下搅拌16小时。通过用硅藻土塞过滤除去钯碳并除去溶剂后，用快速色谱对粗产物进行纯化，用MeOH/DCM(7％∶93％)进行洗脱。终产物化合物(7)2-(5-氨基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯为黄色油状物，1.5g。
将6-氯-4-甲基氨基-吡啶-3-甲醛(850mg，5mmol)与2-(5-氨基-2-甲基-苯基)-乙酸甲酯(化合物7，1.35g，7.5mmol)和碳酸钾(2.07g，15mmol)在15mL DMF中进行混合，加热至100℃加热16小时。冷却并在真空下除去溶剂后，用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(6∶4)进行洗脱。最终的化合物(8)3-(4-氨基-2-甲基-苯基)-7-氯-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮为灰白色固体，1.30g。
将3-(4-氨基-2-甲基-苯基)-7-氯-1-甲基-1H-[1，6]萘啶-2-酮(600mg，2.0mmol)与3-三氟甲基-苯甲酰氯(440mg，2.1mmol)和520μL DIEA(3.0mmol)在20mL无水DCM中进行混合。将该反应在室温下搅拌4小时。在真空下除去溶剂，然后用快速色谱对粗产物进行纯化，用EA/己烷(1∶1)进行洗脱。最终的化合物(9)N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺为白色固体，900mg：1H NMR 400MHz(CDCl3)δ8.58(s，1H)，8.25(s，1H)，8.13(s，1H)，8.08(d，1H，J＝7.8Hz)，7.78(d，1H，J＝7.8Hz)，7.71(s，1H)，7.62(m，2H)，7.44(d，1H，J＝5.8Hz)，7.31(s，1H)，7.20(d，1H，J＝8.2Hz)，3.76(s，3H)，2.03(s，3H)；MS m/z 477.2(M+1)。
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(50mg，0.106mmol)与6-甲氧基-吡啶-3-基胺(20mg，0.16mmol)、Pd2(dba)2(2.4mg，2.5％)、氯化1，3-二(2，6-二异-丙基苯基)咪唑鎓(2.3mg，5％)和叔丁醇钾(17.8mg，0.159mmol)一起在氩气环境下进行混合。向其中加入6mL无水1，4-二噁烷并使该反应在100℃下继续14小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到灰白色固体形式的终产物：1H NMR 400MHz(CDCl3)δ11.61(s，1H)，8.26(d，1H，J＝2.6Hz)，8.16(s，1H)，8.10(s，1H)，8.05(d，1H，J＝7.9Hz)，7.95(s，1H)，7.80(d，1H，J＝7.7Hz)，7.69(d，1H，J＝2.1Hz)，7.61(m，2H)，7.51(s，1H)，7.42(dd，1H，J＝6.0Hz)，6.89(d，1H，J＝8.7Hz)，6.38(s，1H)，4.00(s，3H)，3.52(s，3H)，2.15(s，3H)；MS m/z 560.3(M+1)。
实施例9
N-[3-(7-乙基氨基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000401
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(50mg，0.106mmol)与乙胺(0.14mL 70％水溶液，2.2mmol)一起在密封的试管中进行混合。向其中加入1mL正-丁醇并将其在100℃下搅拌16小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到白色固体形式的终产物：1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ10.47(s，1H)，8.48(s，1H)，8.29(s，1H)，8.25(d，1H，J＝8.0Hz)，7.96(d，1H，J＝7.8Hz)，7.78(m，2H)，7.66(m，2H)，7.26(d，1H，J＝9.0Hz)，6.46(s，1H)，3.57(s，3H)，3.39(q，2H，J＝7.1Hz)，2.13(s，3H)，1.22(t，3H，J＝7.1Hz)；MS m/z 481.2(M+1)。
实施例10
N-(4-甲基-3-{1-甲基-2-氧代-7-[(吡啶-3-基甲基)-氨基]-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基}-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(50mg，0.106mmol)与3-(氨基甲基)-吡啶(18mg，0.16mmol)、Pd2(dba)2(2.4mg，2.5％)、氯化1，3-二(2，6-二-异-丙基苯基)-咪唑鎓(2.3mg，5％)和叔丁醇钾(17.8mg，0.159mmol)一起在氩气环境下进行混合。向其中加入6mL无水1，4-二噁烷并使该反应在100℃下继续进行14小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到灰白色固体形式的终产物：1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ10.46(s，1H)，8.79(s，1H)，8.68(d，1H，J＝4.6Hz)，8.44(s，1H)，8.29(s，1H)，8.24(t，2H，J＝7.5Hz)，7.96(d，2H，J＝7.8Hz)，7.76(m，3H)，7.65(m，2H)，7.24(d，1H，J＝8.3Hz)，6.46(s，1H)，4.74(s，2H)，3.52(s，3H)，2.11(s，3H)；MS m/z 544.3(M+1)。
实施例11
N-{3-[7-(3-二甲基氨基甲基-苯基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(50mg，0.106mmol)与3-二甲基-氨基甲基-苯基胺(24mg，0.16mmol)、Pd2(dba)2(2.4mg，2.5％)、氯化1，3-二(2，6-二-异-丙基苯基)咪唑鎓(2.3mg，5％)和叔丁醇钾(17.8mg，0.159mmol)一起在氩气环境下进行混合。向其中加入6mL无水1，4-二噁烷并使该反应在100℃下继续进行14小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到灰白色固体形式的终产物：1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ10.48(s，1H)，9.64(s，1H)，8.60(s，1H)，8.30(s，1H)，8.26(d，1H，J＝8.9Hz)，7.96(d，1H，J＝7.8Hz)，7.87(s，2H)，7.79(t，1H，J＝7.8Hz)，7.67(m，3H)，7.41(t，1H，J＝7.8Hz)，7.27(d，1H，J＝9.1Hz)，7.08(d，1H，J＝7.7Hz)，6.78(s，1H)，4.28(d，2H，J＝5.0Hz)，3.58(s，3H)，2.77(d，6H，J＝4.6Hz)，2.14(s，3H)；MS m/z 586.3(M+1)。
实施例12
N-(4-甲基-3-{1-甲基-7-[3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基氨基]-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基}-苯基)-3-三氟甲基-苯甲酰胺
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(50mg，0.106mmol)与3-(4-甲基-哌嗪-1-基)-苯基胺(31mg，0.16mmol)、Pd2(dba)2(2.4mg，2.5％)、氯化1，3-二(2，6-二-异-丙基苯基)咪唑鎓(2.3mg，5％)和叔丁醇钾(17.8mg，0.159mmol)一起在氩气环境下进行混合。向其中加入6mL无水1，4-二噁烷并使该反应在100℃下继续进行14小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到灰白色固体形式的终产物：1H NMR400MHz(DMSO-d6)δ10.47(s，1H)，9.43(s，1H)，8.58(s，1H)，8.30(s，1H)，8.26(d，1H，J＝8.1Hz)，7.97(d，1H，J＝7.9Hz)，7.83(s，1H)，7.79(t，1H，J＝7.8Hz)，7.69(m，2H)，7.37(s，1H)，7.21(m，3H)，6.74(s，1H)，6.65(d，1H，J＝6.5Hz)，3.80(d，2H，J＝13.9Hz)，3.56(s，3H)，3.54(d，2H，J＝13.9Hz)，3.18(m，2H)，2.98(m，2H)，2.88(d，3H，J＝3.8Hz)，2.14(s，3H)；MS m/z627.3(M+1)。
实施例13
N-[3-(7-氨基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺
Figure S04829422620060418D000431
将N-[3-(7-氯-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺(100mg，0.21mmol)与苄胺(35mg，0.32mmol)、Pd2(dba)2(4.8mg，2.5％)、氯化1，3-二(2，6-二-异-丙基苯基)咪唑鎓(4.6mg，5％)和叔丁醇钾(35.6mg，0.32mmol)一起在氩气环境下进行混合。向其中加入6mL无水1，4-二噁烷并使该反应在100℃下继续进行14小时。冷却并在真空下除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到灰白色固体形式的产物N-[3-(7-苄基氨基-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基)-4-甲基-苯基]-3-三氟甲基-苯甲酰胺。将这种产物溶解于10mL乙醇中并向其中加入8mg 10℃％钯碳粉末。将该反应在室温下在50psi氢环境下搅拌16小时。在用硅藻土塞过滤除去钯碳并除去溶剂后，将粗产物溶解于DMSO中并用反相制备HPLC对其进行纯化，得到白色固体形式的终产物：1H NMR 400MHz(DMSO-d6)δ10.42(s，1H)，8.35(s，1H)，8.31(s，1H)，8.26(d，1H，J＝7.8Hz)，7.96(d，1H，J＝7.7Hz)，7.78(t，1H，J＝7.8Hz)，7.69(m，2H)，7.61(s，1H)，7.24(d，1H，J＝8.1Hz)，6.53(s，2H)，6.29(s，1H)，3.49(s，3H)，2.12(s，3H)；MS m/z 453.2(M+1)。
通过重复上面实施例中所述的操作，用适宜的起始材料获得表1中确定的如下式I化合物。
表1
Figure S04829422620060418D000441
Figure S04829422620060418D000451
Figure S04829422620060418D000461
Figure S04829422620060418D000471
Figure S04829422620060418D000481
Figure S04829422620060418D000491
Figure S04829422620060418D000511
Figure S04829422620060418D000521
Figure S04829422620060418D000581
Figure S04829422620060418D000601
Figure S04829422620060418D000611
Figure S04829422620060418D000621
Figure S04829422620060418D000631
Figure S04829422620060418D000641
Figure S04829422620060418D000651
Figure S04829422620060418D000671
Figure S04829422620060418D000681
Figure S04829422620060418D000691
Figure S04829422620060418D000701
Figure S04829422620060418D000711
Figure S04829422620060418D000721
Figure S04829422620060418D000731
Figure S04829422620060418D000741
Figure S04829422620060418D000751
活性测定
测定了与母本32D细胞相比本发明化合物选择性抑制表达BCR-Abl的32D细胞(32D-p210)的细胞增殖的能力。测试选择性抑制这些BCR-Abl转化的细胞增殖的化合物对于表达野生型或突变型BCR-Abl的Ba/F3细胞的抗增殖活性。另外还测定了化合物抑制B-RAF的能力。
抑制细胞BCR-Abl依赖性增殖(高通量方法)
所使用的鼠科细胞系是用BCR-Abl eDNA转化的32D造血祖细胞系(32D-p210)。这些细胞保持在补充有青霉素50μg/mL、链霉素50μg/mL和L-谷氨酸200mM的RPMI/10％胎牛血清(RPMI/FCS)中。未转化的32D细胞保持在类似条件下并加有15％WEHI条件培养基作为IL3源。
将50μl 32D或32D-p210细胞悬浮液以每孔5000个细胞的密度涂覆到Greiner 384孔微孔板(黑色)中。在每个孔中加入50nL的试验化合物(1mM，在DMSO储备溶液中)(STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下将细胞培养72小时。在各孔中加入10μL 60％的Alamar Blue溶液(Tek诊断剂)并将细胞再培养24小时。使用AcquestTM***(Molecular Devices)测定荧光密度(530nm处激发，580nm处发射)。
抑制细胞BCR-Abl依赖性增殖
将32D-p210细胞以每孔15000个细胞的密度涂覆到96孔TC板中。向各孔中加入50μL试验化合物的两倍系列稀释液(Cmax为40μM)(STI571作为阳性对照)。将细胞在37℃、5％CO2下培养48小时后，向各孔中加入15μL的MTT(Promega)并将细胞再培养5小时。通过分光光度法测定570nm处的光密度并通过量效曲线确定50％抑制作用所需的化合物的浓度，即IC50值。
对细胞周期分布的影响
将32D和32D-p210细胞以每孔2.5×106个细胞并存在于5mL培养基中的形式加入6孔TC板中并以1或10μM的浓度加入试验化合物(STI571作为对照)。然后，在37℃、5％CO2下培养细胞24或48小时。用PBS洗涤2ml细胞悬浮液，在70％EtOH中固定1小时并用PBS/EDTA/RNase A处理30分钟。加入碘化丙锭(Propidium iodide Cf＝10μg/ml)并在FACScaliburTM***(BD Biosciences)上通过流式细胞仪测定荧光强度。本发明试验化合物显示对32D-p210细胞具有细胞凋亡作用但不诱导32D母本细胞凋亡。
对细胞BCR-Abl自磷酸化的影响
使用c-abl特异性捕获抗体和抗磷酸酪氨酸抗体用捕获Elisa测定BCR-Abl的自磷酸化作用。将32D-p210细胞以每孔2×105个细胞并存在于50μL培养基中的形式加入96孔TC板中。每孔加入50μL试验化合物的两倍系列稀释液(Cmax为10μM，STI571作为阳性对照)。在37℃、5％CO2下培养细胞90分钟。然后，细胞在冰上用150μL含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的溶胞缓冲液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl，5mM EDTA，1mM EGTA和1％NP-40)处理1小时。将50μL细胞溶解产物加到96孔光学板中，该板事先用抗-abl特异性抗体涂覆并封闭。在4℃下培养该板4小时。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入50μL碱性磷酸酶结合的抗-磷酸酪氨酸抗体并将该板在4℃下保温过夜。用TBS-吐温20缓冲液洗涤后，加入90μL发光底物并用AcquestTM***(Molecular Devices)定量测定发光情况。所测试的本发明化合物以剂量依赖性方式抑制表达BCR-Abl的细胞的增殖并抑制细胞BCR-Abl的自磷酸化。
对表达突变型BCR-Abl的细胞增殖的影响
测试本发明化合物对表达野生型或突变型BCR-Abl的Ba/F3细胞(G250E、E255V、T315I、F317L、M351T)的抗增殖作用，这些细胞对STI571耐受或对其敏感性降低。以10、3.3、1.1和0.37μM的浓度如上所述(培养基中不合IL3)测试这些化合物对表达突变型-BCR-Abl的细胞和未转化的细胞的抗增殖作用。由如上所述获得的量效曲线确定对未转化的细胞没有毒性的化合物的IC50值。
FGFR3(酶试验)
用纯化的FGFR3(Upstate)以10μL的终体积来进行激酶活性测定，所说的终体积中包含0.25μg/mL位于激酶缓冲液(30mM Tris-HCl pH7.5，15mM MgCl2，4.5mM MnCl2，15μM Na3VO4和50μg/mL BSA)中的酶和底物(5μg/mL生物素-聚-EY(Glu，Tyr)(CIS-US，Inc.)和3μM ATP)。制备两种溶液：第一种5μl的溶液在激酶缓冲液中包含FGFR3酶，首先将其分配到384-格式板(Perkin-Elmer)中，然后向各孔中加入50nL溶解于DMSO中的化合物，然后加入5μl在激酶缓冲液中包含底物(聚-EY)和ATP的第二种溶液。将该反应在室温下保温1小时，通过加入10μL HTRF检测混合物(其包含30mM Tris-HCl pH7.5，0.5M KF，50mM ETDA，0.2mg/mL BSA，15μg/mL链霉抗生物素蛋白-XL665(CIS-US，Inc.)和150ng/mL穴合物轭合的抗磷酸酪氨酸抗体(CIS-US，Inc.)来停止反应。将其在室温下保温一小时以使链霉抗生物素蛋白-生物素相互作用，然后在Analyst GT(Molecular Devices Corp.)上读取动态(time resolved)荧光信号。通过对各化合物在12种浓度(从50μM至0.28nM的1∶3稀释)下的抑制百分比进行线性回归分析来计算IC50值。在该试验中，本发明化合物的IC50范围为10nM至2μM。
FGFR3(细胞试验)
对本发明化合物抑制转化的Ba/F3-TEL-FGFR3细胞增殖(其取决于FGFR3细胞激酶活性)的能力进行分析。用补加了10％胎牛血清的RPMI1640作为培养基在混悬液中将Ba/F3-TEL-FGFR3培养至每毫升800,000个细胞。以5000个细胞/孔的数量将悬浮在50μL培养基中的细胞分配到384-孔格式板中。将本发明的化合物在二甲基亚砜(DMSO)中溶解并稀释。用DMSO进行十二次1∶3的系列稀释，从而产生一般从10mM至0.05μM的浓度梯度。向细胞中加入50nL稀释的化合物并将其在细胞培养恒温箱中保温48小时。以10％的终浓度向细胞中加入
Figure S04829422620060418D000791
(TREKDiagnostic Systems)，用其来监测正在增殖的细胞所产生的还原环境。将其在37℃下在细胞培养恒温箱中再保温4小时后，在Analyst GT(MolecularDevices Corp.)上对被还原的
Figure S04829422620060418D000792
所产生的荧光信号进行定量测量(在530nm下激发，在580nm下发射)。通过对各化合物在12种浓度下的抑制百分比进行线性回归分析来计算IC50值。
b-Raf
测试本发明化合物抑制B-RAF活性的能力。在黑色壁和透明底的384孔MaxiSorp板(NUNC)中进行测定。在DPBS中稀释底物IκBα(1∶750)并在各孔中加入15μL。在4℃下将板保温过夜并在EMBLA板洗涤器上用TBST(25mM Tris，pH8.0，150mM NaCl和0.05％吐温-20)洗涤3次。在室温下，将板用Superblock(15μL/孔)封闭3小时，用TBST洗涤3次并用纸蘸干(pat-dried)。将含有20μM ATP(10μL)的测定缓冲液加到各孔中，然后加入100nL或500nL化合物。将B-RAF在测定缓冲液中稀释(1μL稀释至25μl)中并将10μl稀释的B-RAF加到各孔中(0.4μg/孔)。在室温下将该板保温2.5小时。通过用TBST洗涤该板6次来终止激酶反应。在Superblock中稀释Phosph-IκBα(Ser32/36)抗体(1∶10,000)并将15μL加到各孔中。将板在4℃下保温过夜并用TBST洗涤6次。在Superblock中稀释AP-结合的山羊-抗-小鼠IgG(1∶1,500)并将15μL加到各孔中。在室温下培养该板1小时并用TBST洗涤6次。在各孔中加入15μL Attophos AP底物并在室温下培养15分钟。使用荧光强度Nanxin BBT阴离子(505二色性镜)在Acquest或Analyst GT上读板。
Upstate Kinase ProfilerTM-放射-酶学过滤器结合测定法
评价本发明化合物抑制各种激酶(激酶的部分非限定性例子包括：Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1、JNK2、PDGF-R、p38、p70S6K、TGFβ、SRC、EGFR、c-Kit、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、RAF、MKK4、MKK6和SAPK2β)的能力。按照该通用方法以10μM的最终浓度一式两份地测试化合物。需要注意的是激酶缓冲液组合物和底物随“Upstate KinaseProfilerTM”中激酶的不同而进行变化。在置于冰上的eppendorf中混合激酶缓冲液(2.5μL，10倍浓度，需要时含有MnCl2)、活性激酶(0.001-0.01单位；2.5μL)、存在于激酶缓冲液中的特异性或多聚(Glu4-Tyr)肽(5-500μM或0.01mg/ml)以及激酶缓冲液(50μM；5μl)。加入Mg/ATP混合物(10μL；67.5(或33.75)mM MgCl2、450(或225)μM ATP和1μCi/μl[γ-32P]-ATP(3000Ci/mmol))并在约30℃下将反应产物保温约10分钟。将反应混合物(20μl)点在2cm×2cm P81(磷酸纤维素，用于带正电的肽底物)或Whatman No.1(用于多聚(Glu4-Tyr)肽底物)方形纸上。用0.75％磷酸洗涤该方形纸4次，每次5分钟，然后用丙酮洗涤一次，洗涤5分钟。将该方形纸转移到闪烁管中，加入5ml闪烁混合液并用Beckman闪烁计数器测定掺入肽底物中的32P(cpm)。计算每个反应的抑制百分数。
游离形式或可药用盐形式的式I化合物显示出有价值的药理学特性，例如，如本申请所述的体外试验所示。例如，式I化合物对野生型BCR-Abl以及G250E、E255V、T315I、F317L和M351T BCR-Abl突变型优选显示范围为1×10-10到1×10-5M，优选小于50nM的IC50。例如：
a)N-{3-[7-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺(实施例8)对野生型、G250E、E255V、T315I、F317L和M351T Bcr-abl分别具有＜0.5nM、43nM、48nM、122nM、＜0.5nM和9nM的IC50；
b)N-{3-[7-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺(实施例8)在FGFR3酶和细胞试验中分别具有107nM和3nM的IC50，在b-Raf和c-Raf酶试验中分别具有500nM和17nM的IC50；
浓度为10μM的式I的化合物优选对Abl、Bcr-abl、Bmx、c-RAF、CSK、Fes、FGFR3、Flt3、GSK3β、IR、JNK1α1、JNK2α2、Lck、MKK4、MKK6、p70S6K、PDGFRα、Rsk1、SAPK2α、SAPK2β、Syk和TrkB激酶表现出高于50％，优选高于约70％的抑制百分比。例如：
c)N-{3-[7-(6-甲氧基-吡啶-3-基氨基)-1-甲基-2-氧代-1，2-二氢-[1，6]萘啶-3-基]-4-甲基-苯基}-3-三氟甲基-苯甲酰胺(实施例8)在10μM的浓度下以括号中所示的百分比抑制了下面的激酶(例如，100％意味着完全抑制，0％意味着没有抑制)：野生型Abl(100％)、Bmx(100％)、c-RAF(90％)、CSK(100％)、FGFR3(96％)、JNK1α1(89％)、JNK2α2(99％)、Lck(99％)、MKK4(91％)、MKK6(97％)、p70S6K(86％)、SAPK2α(95％)、SAPK2β(98％)和TrkB(97％)。
可以理解的是，本文所述的实施例和具体实施方式仅仅是出于举例说明的目的，本领域技术人员可以据此进行各种修饰或改变，并且这些修饰和改变均包括在本申请的精神和范围内以及所附权利要求的保护范围之内。本文中引证的所有公开出版物、专利和专利申请的全部内容均引入本文作为参考。

Claims (4)

1.式I的化合物或其可药用的盐：
Figure FSB00000162362600011
其中：
n是0、1或2；
Y选自-C(H)＝和-N＝；
Z选自-C(H)＝和-N＝；
R1是-NHR6；其中R6选自吗啉-4-基-乙基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基和苯基；其中所说的吡啶基、吡唑基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基或苯基任选地被1至2个独立地选自氨基、甲氧基、二甲基氨基、二甲基氨基-甲基、二甲基氨基-乙基、二甲基氨基-丙基、二甲基氨基-乙氧基、甲硫基、羟基、甲基磺酰基、羟基甲基、1-羟基-乙基、甲磺酰基-氨基、吗啉-4-基、吗啉-4-基-乙基、呋喃基-甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-甲基-哌嗪-1-基甲基、苄基、甲基-氨基羰基、甲基-羰基-氨基、甲基-吡唑基、氨基羰基和氨基-磺酰基的基团所取代；
R2选自氢和C1-6烷基；
R3选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基；
R4是-NHC(O)R6；其中R6选自呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基和吡唑基；其中所说的R6的呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基任选地被1至3个选自4-甲基-哌嗪-1-基甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-乙基-哌嗪-1-基甲基、4-乙基-哌嗪-1-基、苯基、乙基、三氟甲基、吗啉-4-基、二甲基氨基、卤素、硝基、三氟甲氧基、1-甲基-吡咯-2-基、4-甲基-咪唑-1-基、异丁基和叔丁基的基团所取代；且
R10选自氢、卤素和C1-6烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其中：
n是0、1或2；
Y选自-C(H)＝和-N＝；
Z选自-C(H)＝和-N＝；
R1是-NHR6；其中R6选自吗啉-4-基-乙基、苯并[1，3]二氧杂环戊烯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基和苯基；其中所说的吡啶基、吡唑基、吡嗪基、吡啶基-甲基、2-(2-氧代-吡咯烷-1-基)-乙基或苯基任选地被1至2个独立地选自氨基、甲氧基、二甲基氨基、二甲基氨基-甲基、二甲基氨基-乙基、二甲基氨基-丙基、二甲基氨基-乙氧基、甲硫基、羟基、甲基磺酰基、羟基甲基、1-羟基-乙基、甲磺酰基-氨基、吗啉-4-基、吗啉-4-基-乙基、呋喃基-甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-甲基-哌嗪-1-基甲基、苄基、甲基-氨基羰基、甲基-羰基-氨基、甲基-吡唑基、氨基羰基和氨基-磺酰基的基团所取代；
R2选自氢和C1-6烷基；
R3选自卤素、C1-6烷基和C1-6烷氧基；
R4是-NHC(O)R6；其中R6选自呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基和吡唑基；其中所说的R6的呋喃基、吡咯基、苯基、吡啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基任选地被1至3个选自4-甲基-哌嗪-1-基甲基、4-甲基-哌嗪-1-基、4-乙基-哌嗪-1-基甲基、4-乙基-哌嗪-1-基、苯基、乙基、三氟甲基、吗啉-4-基、二甲基氨基、卤素、硝基、三氟甲氧基、1-甲基-吡咯-2-基、4-甲基-咪唑-1-基、异丁基和叔丁基的基团所取代；且
R10是氢。
3.一种包含治疗有效量的权利要求1或2所述的化合物和可药用赋形剂的药物组合物。
4.权利要求1或2所述的化合物在制备用于治疗动物疾病的药物中的应用，其中所述疾病的病理和/或症状与Abl、BCR-Abl、CSK、JNK1α1、JNK2α2、PDGFRα、p70S6K、trkB、FGFR3、Fes、Lck、Syk、b-RAF、c-RAF、MKK4、MKK6和/或SAPK2β的激酶活性有关。
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