CN1323716C

CN1323716C - Sarp－1在治疗和/或预防硬皮病中的应用

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Publication number: CN1323716C
Application number: CNB018223389A
Authority: CN
Inventors: C·普拉特尔－齐贝克; C·鲍尔; J·克林格
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Serono Lab
Priority date: 2000-12-06
Filing date: 2001-11-30
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2021-11-30
Also published as: NO20032597D0; ATE359808T1; NO20032597L; KR100804885B1; CN1553806A; KR20030076585A; DE60128009T2; HRP20030426A2; US20050113291A1; NZ525774A; EA200300639A1; WO2002046225A2; SK8472003A3; EP1411970A2; HUP0302738A3; EP1411970B1; EA005973B1; BR0115983A; DK1411970T3; PT1411970E

Abstract

本发明涉及SARP-1在制备治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症，的药物中的应用。

Description

SARP-1在治疗和/或预防硬皮病中的应用

技术领域

本发明涉及硬皮病领域。更具体地说，本发明涉及SARP-1在治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症，中的应用。

发明背景

硬皮病是一种以皮肤和内脏器官纤维化为特征的***疾病，导致器官衰竭和死亡(Black等人，1998；Clements和Furst，1996)。硬皮病有多种表现，在治疗上有各种含义。它包括局限性硬皮病(localized scleroderma)、***性硬化症(systemic sclerosis)、类似硬皮病的疾病及无硬皮病(Sinescleroderma)(Smith 2000)。局限性硬皮病是一种比较罕见的皮肤病，只限于皮肤的纤维化和表现；***性硬化症是一种累及内脏器官的多***疾病，而且皮肤病的程度更深。***性硬化症可以是弥漫型或局限型。局限型***性硬化症也称CREST综合症(钙质沉积、雷诺现象、食道功能障碍、指端硬化、毛细血管扩张)。据认为，类似硬皮病的疾病与暴露于工业环境有关。无硬皮病只涉及内脏器官，而皮肤无改变。

硬皮病特别是***性硬化症的主要表现是不恰当的过度胶原合成和沉积、内皮功能障碍、痉挛、由纤维化引起的萎陷和闭塞。

硬皮病是一种比较罕见的疾病，每百万人中大约有19人发病。硬皮病的发病原因还不清楚。然而，遗传易感性是非常重要的。异常情况包括自身免疫与内皮细胞和成纤维细胞功能的改变。事实上，***性硬化症可能是最严重的自身免疫疾病，诊断后5年内死亡率为50％(Silman，1991)。

在诊断上，一个重要的临床参数是近端掌指关节皮肤增厚。雷诺现象是硬皮病的常见症状，几乎所有病人均有雷诺现象。皮肤遇冷后会有色素变化，由此可作出诊断。雷诺疾病的症状是缺血和皮肤增厚。

疾病初期、加重和进展都有一些基本的生物过程，包括血管功能障碍、内皮细胞活化和损害、白细胞积聚、自身抗体的产生，以及严重时有失控的纤维化反应，可导致死亡(Clements和Furst，1996)。成纤维细胞在该疾病的发病机制中起到中心作用。从患有硬皮病的病人身上抽取原代成纤维细胞，其具有体内看到的许多疾病特性，主要为细胞外基质合成和沉积增加，特别是胶原和纤维连接蛋白(fibronectin)，以及改变生长因子和细胞因子的产生，如TGFβ和CTGF(Strehlow和Korn，1998；LeRoy，1974)。

目前没有有效的方法治愈硬皮病。有人提出一种新颖但风险很高的疗法是自体干细胞移植(Martini等人，1999)。具体地说，迄今为止还没有一种硬皮病的治疗方法是针对纤维化过程(Wigley和Boling，2000)。

识别与疾病风险和硬皮病进展相关的基因可能导致有效策略的发展，在疾病的不同阶段作出干预。

分泌型细胞凋亡相关蛋白质1(Secreted apoptosis related protein 1，缩写为SARP-1)是分泌蛋白族系的成员，基于它们与7跨膜受体的卷曲(frizzled)家族中找到的富含半胱氨酸的结构域(CRD结构域)同源，又称为分泌型卷曲相关蛋白质(Rattner等人，1997)。卷曲基因最初是在果蝇和控制组织极化中被识别到的(Adler等人，1987)。卷曲蛋白是高度保守性Wnt家族的受体，Wnt家族具有至少16个在胚胎发育过程中调节细胞与细胞相互作用的分泌信号分子(Smalley和Dale，1999)。从以下几个***可了解Wnt的作用机制：果蝇和线虫的遗传学、细胞培养的生化学、以及爪蟾胚胎的异位基因表达。小鼠的许多Wnt基因已发生突变，导致极为具体的发展缺陷。Wnt信号通路由Wnt与卷曲蛋白相互作用而触发，它通过一些胞质中间元件介导，具有抑制多蛋白β-连环蛋白转换复合物的活性的功能，以致胞质β-连环素积聚起来，随后胞质β-连环蛋白进入胞核，与TCF形成复合物激活Wnt靶基因的转录(Miller等人，1999；Kühl等人，2000)。

通过不同的Wnt结合蛋白和分泌型卷曲相关蛋白质(sFRP)的限制性表达可调节Wnt卷曲的相互作用。SFRPs通过N-末端CRD结构域能够与Wnt结合。所以它们能够使Wnt与其受体分离，从而对它具有拮抗作用(Bafico等人，1999)。

SARP-1的其它一些名称已为人所知，如SDF-5、PRO697、ATG-1622、HLHDY31、SFRP-2。小鼠或人SARP-1的部分或全长蛋白质和/或核酸序列在一些专利申请中已有叙述，例如WO 98/35043、WO 98/13493、EP 0879887、WO 99/46281。

分泌型卷曲相关蛋白质(SFRPs)与膜结合的卷曲受体竞争而与分泌型Wnt配体结合，其功能似乎是用作Wnt信号可溶性调节剂。与SARP-1不同，此家族的人蛋白质到现在为止已知包括SARP-2(SFRP-1)和SARP-3(SFRP-5)。已有记载，小鼠SARP-1和人SARP-2及入SARP-3能够敏化细胞直至细胞凋亡，或者能够抑制细胞凋亡反应(Melkonyan等人，1997)。当在乳腺癌细胞系中表达时，小鼠SARP-1和人SARP-2对细胞对于细胞凋亡前刺激的敏化性有相反的作用。含SARP-1的细胞具有更高抗性，表达SARP-2的细胞可被敏化至由肿瘤坏死因子和神经酰胺诱导的细胞凋亡。SARP-1或SARP-2的表达修改了Wnt介导的信号转导的指示剂即β-连环蛋白的细胞外水平，提示SARPs干涉Wnt卷曲信号通路(Melkonyan等人，1997)。

RNA印迹分析揭示了SARP基因具有不同表达型式(Leimeister，1998)。SARP-1以2.2kb和1.3kb转录物存在于某些人组织中，在克隆和小肠中的水平最高。Chang等人(1999)报导了SARP-1或SFRP-2高度优先表达在牛视网膜的整个内核层中。视网膜内的SARP-3或SFRP-5特异性表达在视网膜色素上皮中。

Melkonyan等人(1997)通过分析体细胞杂交绘制了人染色体4的SARP-1基因图谱。Chang等人(1999)用放射性杂交分析把图谱位置修正为4q31.3。

还有一些确实证据显示SARP-1表达的改变与癌症有关(WO 98/13493)。

发明内容

本发明发现SARP-1在确立的硬皮病动物模型中具有益效果。

所以，本发明的第一个目的是SARP-1在制备治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症的药物中的应用。本发明的第二个目的是细胞表达SARP-1或含有SARP-1编码序列的表达载体在制备治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症的药物中的应用。含有SARP-1的药物组合物和包括给人体施加SARP-1的治疗方法也在本发明的范围之中。

附图说明

图1所示为经基因滤膜分析(gene filter analysis)确定了7例硬化症病人的正常和患病成纤维细胞中SARP-1 mRNA的表达。每种样本(正常或异常)的平均表达水平见(A)部分，中值表达水平见(B)部分。

图2所示为用实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)确定8例硬化症病人的患病/正常成纤维细胞(传代次数少，少于5次传代)中SARP-1mRNA表达之比率。

图3所示为实时PCR分析正常人的真皮成纤维细胞(NHDF)中相对于GAPDH mRNA表达的SARP-1 mRNA表达。

图4所示为实时PCR分析临床上人的正常皮肤活检(n＝6)与硬化症病人的异常皮肤活检(n＝2)中相对于GAPDH的SARP-1 mRNA表达。

图5A和图5B是连接的，其所示为SARP-1 cDNA核苷酸序列和推导的氨基酸序列。箭头所指为预测的信号肽切割位点。

图6所示为人和小鼠SARP-1氨基酸序列的对比。突出表示了两个序列之间的不同残基(灰色部分)。

图7所示为在SARP-1转染、模拟物转染细胞和对照细胞中的细胞凋亡水平。***表示下降显著。

图8所示为SARP-1治疗对由人真皮成纤维细胞培养基收获的条件培养液中总MMP-1活性的影响。成纤维细胞取自患病组织(A、D、F)或健康个体(B、C)，或者取自硬皮病病人的非患病部位(E)。

图9所示为SARP-1共转染对无受刺激和由TGFβ刺激的NIH3T3细胞中胶原启动子活性的影响。(A)部分是在报导基因分析中所测到的发光单位，(B)部分是相对对照组的发光百分比。

图10所示为在博来霉素诱导的肺纤维化模型中各个肺的纤维化计分。图中标出在具有接纳载体的小鼠、具有SARP-1转染细胞的小鼠、具有模拟物转染细胞的小鼠或者具有用抗TGF治疗的小鼠中所测量的计分。***表示下降显著。

具体实施方式

本发明业已发现，分泌型蛋白SARP-1在硬皮病病人的患病成纤维细胞中的表达比在对照组细胞中低得多。用DNA基因滤膜微阵列技术(gene filtermicroarray technology)已经鉴定了与硬皮病病人纤维化病变分离的皮肤成纤维细胞以及与同一个病人临床上无受感染的皮肤部位分离的成纤维细胞中差异表达的基因。7例测试病人中有5例的SARP-1表达在病变成纤维细胞中是下调的。除此以外，对与硬皮病病人的异常皮肤的整个活检标本分离的总RNA进行实时RT-PCR分析表明，其SARP-1 mRNA水平比临床上正常状况、年龄、性别和解剖部位相当的对照组的活检低。

一种比较基因滤膜微阵列所含有的全部基因的表达水平的方法支持上述结果，这种方法表明SARP-1的下调有95％的可能性与病人的纤维性病变有关，提示SARP-1与疾病临床进展的关联性。

在广泛确定的小鼠硬皮病模型即博来霉素诱导的肺纤维化模型中证实了SARP-1对硬皮病的有益效果。在此模型中，施加表达SARP-1的细胞显著减低肺纤维化的比例。

所以，本发明涉及□□物质在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，该物质结合和启动人SARP-1受体信号或者刺激释放或增强内源性SARP-1活性。所述物质可以是成熟的SARP-1自身或者通过SARP-1受体结合和启动信号的任何一个SARP-1片段，以及SARP-1受体的任何一种其它激动剂，如抗SARP-1受体的主动抗体或其特异性化学激动剂。

有人提出SARP-1的受体是推定地与富含半胱氨酸的SARP-1卷曲结构域结合的Wnt蛋白质(Lin等人，1997)。所以本发明的物质也可以是含有它富含半胱氨酸的卷曲结构域的SARP-1片段。

治疗和/或预防硬皮病所用的物质最好选自由以下物质组成的组：

(a)成熟的SARP-1；

(b)含SEQ ID NO：2的多肽；

(c)含SEQ ID NO：2的氨基酸21至295的多肽；

(d)含SEQ ID NO：2的氨基酸24至295的多肽；

(e)含SEQ ID NO：2的氨基酸25至295的多肽；

(f)含SEQ ID NO：2的氨基酸26至295的多肽；

(g)含SEQ ID NO：2的氨基酸27至295的多肽；

(h)含SEQ ID NO：2的氨基酸28至295的多肽；

(i)含SEQ ID NO：2的氨基酸37至295的多肽；

(j)(a)至(i)中任一之突变蛋白，其中氨基酸序列与(a)至(i)中至少一个序列至少有40％或50％或60％或70％或80％或90％同一性。

(k)(a)至(i)中任一之突变蛋白，该蛋白由DNA序列编码，所述DNA序列与在中等严格条件或高度严格条件下与编码(a)至(i)中任一个多肽的天然DNA序列补体杂交。

(l)(a)至(i)任一之突变蛋白，其中氨基酸序列的任何改变是(a)至(i)的氨基酸序列的保守性氨基酸取代。

(m)(a)至(l)任一之盐、同种型、融合蛋白、功能性衍生物、活性片段或循环变换衍生物。

已经克隆了人SARP-1全长cDNA，并示于图5和所附序列表的SEQ IDNO：1。图5和所附序列表的SEQ ID NO：2还给出了相应的氨基酸序列。如以下实施例所示，已发现SARP-1的N末端具有高度异源性。预测的SARP-1信号肽从SEQ ID NO：2的氨基酸25延伸至295或者从氨基酸21至295。在HEK 293细胞中表达的纯化的重组人SARP-1的N-末端序列揭示了成熟的SARP-1的其它N-末端前导序列，它们始于SEQ ID NO：2的氨基酸24、25、26、27、28或37。

本文所用的术语“SARP-1”指上述(a)至(m)中所考虑的任何一种或全部物质。

本文所用的术语“治疗和/或预防”包括任何消除、减弱、或部分、基本上或完全预防或者阻断疾病形成、演化、进展或疾病的任何一种症状或某些症状或全部症状的形成、演化或进展。

本文所用的术语“硬皮病”包括背景技术中详细描述的任何类型和定义的硬皮病及硬皮病的一种或多种症状。术语“硬皮病”也指已知的与硬皮病相关的疾病，例如本文引用的参考文献Smith(2000)所叙述的疾病。

本文所用的术语“硬皮病”还包括纤维化疾病，例如肝硬化、肺间纤维病变、迪皮特朗挛缩(Dupuytren’s contracture)、瘢痕疙瘩和其它瘢痕/伤口的不正常愈合、手术后缝合和反应性纤维化、以及慢性心脏衰竭，特别是心肌梗塞之后。本发明涉及SARP-1在制备治疗和/或预防纤维化疾病，如以上所列出的疾病的药物中的应用。

采用SARP-1可治疗的其它疾病或病症包括伤口愈合疾病，特别是肺的伤口愈合，这些疾病包括肺的慢性炎症与肺表面最后纤维化或出现瘢痕。涉及肺部发炎的病症包括例如特发性肺纤维化、结节病、肺及支气管发育不良症、纤维性增生性急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、以及肺的表征或***性疾病，如类风湿关节炎(Krein等人，2001)。

术语“硬皮病”优选指局限性硬皮病、***性硬皮病、局限型和弥漫型硬皮病及重叠综合征。

局限性硬皮病主要影响皮肤，但也会影响下面的肌肉和骨胳。然而，它不会累及内脏器官。局限性硬皮病是病情相对较轻的硬皮病，可与***性硬皮病的表面症状相似，例如显微镜下皮肤活检的表现。

***性硬皮病包括多种症状和多组症状，如CREST综合征、局限型与弥漫型。***性硬皮病也称***性硬化症。它又称进行性***硬化症或家族性进行性***硬化症。***性硬皮病可以影响例如皮肤、血管和/或内脏器官。当它累及皮肤时，它可导致皮肤增厚，大多数常见于手和脸。当它累及血管时，它可引起雷诺疾病。***性硬化症的最严重情况是累及内脏器官，可导致残废甚至死亡。除此之外，***性硬化症包括：硬皮病肺病、硬皮病肾危象、心脏表征、包括疲劳或局限型CREST在内的肌肉无力、胃肠蠕动异常和痉挛以及中枢、周边和自主神经***异常。对于神经***异常，最常见的是先有腕管综合征，继而三叉神经痛。

局限型硬皮病可以限于手指，虽然也可累及脸和颈。

弥漫型硬皮病包括皮肤绷紧，也可发生在手腕以上的位置(或肘)。弥漫型硬皮病有多种亚型，例如内脏器官纤维化但皮肤无绷紧的“硬皮病无硬皮病(scleroderma sine scleroderma)”和发生在家族中较少见的家族性进展性***硬化症。

重叠综合症指硬皮病病人还有其它自身免疫疾病(如狼疮、类风湿关节炎等)，例如弥漫型硬皮病与狼疮重叠。硬皮病病症也可以是混合型***疾病(MCTD)或者未分化型***疾病(VCTD)的一部分。

本文所用的术语“SARP-1”指一种蛋白质，其包括所附序列表中SEQ IDN：2(人)或SEQ ID NO：5(小鼠)的全部或部分序列，与该蛋白质的名称无关，包括但不限于其它已知的名称：SDF-5、PRO697、ATG-1622、HLHDY31、SFRP-2或FRP-2及其盐、同种型、突变蛋白、活性片段、功能性衍生物和循环变换衍生物。

术语“SARP-1”优选指一种缺少信号肽的成熟蛋白。该预测的信号肽含有SEQ ID NO：2所限定的SARP-1的头20个或头23、24、25、26、27或36个氨基酸，这意味着成熟的蛋白质或者含有SEQ ID NO：2的氨基酸21至295，或者含有SEQ ID NO：2的氨基酸24、25、26、27、28或37至295。

如图6所示，人SARP-1的氨基酸序列与小鼠序列(SEQ ID NO：5)享有高度同源性。因此，小鼠SARP-1与衍生自其它物种的蛋白质可用于本发明，只要蛋白质之间的同一性足够高，使得蛋白质具有生物活性，而且不会在人体身上诱发基本免疫反应。

术语“SARP-1”还指对硬皮病具有所希望的活性的SEQ ID NO：2或5的任一片段、部分、结构域或亚域。蛋白质片段或者蛋白质的一个或多个结构域可用于本发明，只要它们对硬皮病具有有益的效果，最好具有至少可比拟全长蛋白的效果。有益的效果可在下列实施例所述的其中一个体内或体外测试中，或者在任何其它一个充分证明对硬皮病的效果的分析中测定。例如，SARP-1包括一富含半胱氨酸的卷曲结构域和一营养因子状结构域，□也称NTRmodule，NTR module享有金属蛋白酶组织抑制剂(TIMPs)的同源性(Banyai和Patthy，1999)。所以，含有SARP-1卷曲结构域的片段，或者含有NTR module的片段都是本发明的优选片段。

根据本发明，SARP-1可以是天然存在的，即天然蛋白，或者是重组蛋白。重组生产可在诸如酵母菌细胞或中国仓鼠卵巢(CHO)细胞等真核细胞、人成纤维细胞或细胞系中进行。它还可以在原核细胞中生产，如大肠杆菌。

SARP-1的一个或多个位点最好被糖基化。它也可以是非糖基化的，取决于特定的需要和产生和分离蛋白质的来源。

本文的术语“盐”既指羧基盐，又指SARP-1分子或其同类物的氨基的酸加成盐。羧基盐可通过本领域已知的方法形成，包括无机盐，如钠、钙、铵、铁或锌盐等等，那些形成具有有机碱，例如三乙醇胺、精氨酸或赖氨酸、哌啶、普鲁卡因等胺的盐。酸加成盐包括例如具有诸如盐酸或硫酸等无机酸的盐，以及具有诸如乙酸或草酸等有机酸的盐。当然，任何这样一些盐必须保留与本发明有关的SARP-1生物活性，即对硬皮病具有有益的效果。

SARP-1同种型或剪接变体也可用在本发明中，只要它们能够抑制硬皮病的进展和/或硬皮病症状。例如，被发现在人组织中差异表达的1.3kb和2.2kb两种转录物可表示不同的SARP-1同种型，它们都可用于本发明。

本文所用的术语“突变蛋白”指SARP-1的同类物，其中天然SARP-1的一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基所取代，或缺失，或SARP-1的天然序列中加入了一个或多个氨基酸残基，但其活性最好至少与野生型SARP-1相同，甚至更高。这些突变型蛋白由已知的合成和/或定位点诱变技术，或任何适合的其它已知技术制备。

任何这样一种蛋白质最好具有一SARP-1充分复制的氨基酸序列，如SEQID NO：2所述，从而具有与SARP-1基本上相似的活性。用本领域已知的分析，特别是用下列实施例所解释的试验可测定SARP-1突变蛋白的活性。例如，测量成纤维细胞中胶原合成的含量(实施例7)是评估SARP-1突变蛋白的活性的一个恰当试验。

本发明的突变蛋白包括由一核酸编码的蛋白，该核酸例如是在严格条件下与DNA或RNA杂交且编码本发明的SARP-1的DNA或RNA。术语“严格条件”指杂交和后来的洗涤条件，本领域技术人员通常把它们称为“严格的”。见Ausubel等人的分子生物学的现有方案，Supra，Interscience，纽约，§§6.3和6.4节(1987，1992)，和Sambrook等人(Sambrook，J.C.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)，分子克隆：实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，纽约)。

作为没有限制作用的举例说明，严格条件包括以下洗涤条件，低于研究杂交所计算的温度2-20℃，例如用2xSSC和0.5％SDS洗5分钟，及用2xSSC和0.1％SDS洗15分钟；37℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟，然后68℃用0.1xSSC和0.5％SDS洗30-60分钟。本领域技术人员知道严格条件还取决于DNA序列长度、寡核苷酸探针(如10-40个碱基)或混合型寡核苷酸探针。如果采用混合型探针，最好用四甲基氯化铵(TMAC)代替SSC。见Ausubel，supra。

任何这样一个突变蛋白最好具有一SARP-1充分复制的氨基酸序列，从而具有与SARP-1基本上相似于或者甚至更高的活性。

人们较易测定SARP-1的活性，是由于SARP-1能够降低胶原的合成。一种测定此活性的试验在以下实施例6中有详细叙述。只要该突变蛋白具有基本上降低胶原的活性，就可以认为它的活性基本上与SARP-1相似。故通过常规实验可以确定任何一种给定突变蛋白的活性是否与SARP-1至少基本上相同，这些实验包括使这样一个突变蛋白例如进行实施例7所述的简单试验。

在一优选实施例中，任何这样一个突变蛋白与所附序列表的SEQ ID NO：2的序列具有至少40％的同一性或同源性。更优选的是，它具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％的同一性或同源性，最好的是具有至少90％的同一性或同源性。

同一性反映两个或多个多肽序列或者两个或多个多核苷酸序列之间的关系，通过比较这些序列而确定。通常，同一性指两个多核苷酸或两个多肽序列在各自要比较的序列长度中，它们的核苷酸与核苷酸或者氨基酸与氨基酸之间的对应是完全一样的。

对于其对应不是完全一样的序列，可以确定“序列百分比”。通常把待比较的两个序列进行序列对比，得出这两个序列之间的最大相关性。这可包括在其中一个或两个序列中***“缺口(gap)”以增加对比度。比较每一个序列的整个长度(所谓的全域性对比(global alignment))，或者比较它们的较短的限定长度(所谓的区域性对比(local alignment))可确定序列百分比，前者特别适合长度相等或长度差不多的序列，后者更适合长度不相等的序列。

两个或多个序列同一性和同源性的比较方法已为本领域技术人员所熟知。例如，Wisconsin序列分析软件包9.1版(Devereux J等人，1984)所提供的程序，又例如程序BESTFIT和GAP均可用于确定两个多核苷酸之间的同一性百分比与两个多肽序列之间的同一性百分比及同源性百分比。BESTFIT采用Smith和Waterman的“区域性同源性”算法(1981)，找出两个序列间最佳的一相似区域。其它确定两个序列间同一性和/或相似性的程序也已为本领域所知，例如各个程序的BLAST家族(Altschul S F等人，1990，Altschul S F等人，1997，登入NCBI主页 www.ncbi.nlm.nih.gov可查询得到)与FASTA(Pearson WR，1990，Pearson 1988)。

可用于本发明的SARP-1突变蛋白或编码它们的核酸包括一组有限的基本上相应的序列作为取代多肽或多核苷酸，本领域普通技术人员可根据本文所述的教导和指引用常规方法获得，而无须进行过多实验。。

本发明突变蛋白中的优选变化被称为“保守性”取代。SARP-1多肽或蛋白质的保守性氨基酸取代可包括一组内同义氨基酸，其具有足够相似的生理化学特性，该组原子之间的取代将保留该分子的生物功能(Grantham，1974)。很明显，在上述序列中不改变其功能还可进行氨基酸的***和缺失，特别是如果这种***或缺失只涉及少数氨基酸时，如30个以下，最好为10个以下，而且不会移去或取代对功能性构造起关键作用的氨基酸，如半胱氨酸残基。这类缺失和/或***所产生的蛋白质和突变蛋白属于本发明的范围。

优选同义氨基酸组是表1列出的那些组；更好的同义氨基酸组是表2列出的那些组；最好的同义氨基酸组是表3列出的那些组。

表1优选同义氨基酸组

氨基酸	同义组
氨基酸	同义组	SerArgLeuProThrAlaValGlyIlePheTyrCysHisGlnAsnLysAspGluMetTrp	Ser，Thr，Gly，AsnArg，Gln，Lys，Glu，HisIle，Phe，Tyr，Met，Val，LeuGly，Ala，Thr，ProPro，Ser，Ala，Gly，His，Gln，ThrGly，Thr，Pro，AlaMet，Tyr，Phe，Ile，Leu，ValAla，Thr，Pro，Ser，GlyMet，Tyr，Phe，Val，Leu，IleTrp，Met，Tyr，Ile，Val，Leu，PheTrp，Met，Phe，Ile，Val，Leu，TyrSer，Thr，CysGlu，Lys，Gln，Thr，Arg，HisGlu，Lys，Asn，His，Thr，Arg，GlnGln，Asp，Ser，AsnGlu，Gln，His，Arg，LysGlu，Asn，AspAsp，Lys，Asn，Gln，His，Arg，GluPhe，Ile，Val，Leu，MetTrp

表2更好的同义氨基酸组

氨基酸	同义组
氨基酸	同义组	SerArgLeuProThrAlaValGlyIlePheTyrCysHisGlnAsnLysAspGluMetTrp	SerHis，Lys，ArgLeu，Ile，Phe，MetAla，ProThrPro，AlaVal，Met，IleGlyIle，Met，Phe，Val，LeuMet，Tyr，Ile，Leu，PhePhe，TyrCys，SerHis，Gln，ArgGlu，Gln，HisAsp，AsnLys，ArgAsp，AsnGlu，GlnMet，Phe，Ile，Val，LeuTrp

表3最好的同义氨基酸组

氨基酸	同义组
氨基酸	同义组	SerArgLeuPro	SerArgLeu，Ile，MetPro

ThrAlaValGlyIlePheTyrCysHisGlnAsnLysAspGluMetTrp

ThrAlaValGlyIle，Met，LeuPheTyrCys，SerHisGlnAsnLysAspGluMet，Ile，LeuMet

在蛋白质中产生氨基酸取代的实施例可用来获得本发明中所用的SARP-1多肽或蛋白质的突变蛋白，其包括任何已知的方法步骤，如Mark等人的美国专利4,959,314、4,588,585和4,737,462；Koths等人的美国专利5,116,943；Namen等人的美国专利4,965,195；Chong等人的美国专利4,879,111和Lee等人的美国专利5,017,691中提出的方法，以及美国专利4,904,584(Shaw等人)中提出的赖氨酸取代蛋白质。

术语“融合蛋白”指一多肽，其包含与另一蛋白质，如在体液中停留时间延长的蛋白质融合的SARP-1或其突变蛋白。本发明优选的融合蛋白包含与能够改善分子的生物活性□如在人体内的半衰期的蛋白质全部或功能部分融合□SARP-1全部或功能部分。一优选实施例的融合蛋白包括免疫球蛋白(Ig)融合。包含与免疫球蛋白(Ig)全部或一部分融合的SARP-1全部或一部分的融合蛋白是高度优选的。它们可以是单体或多聚体，异源或同源多聚体。融合蛋白最好含有免疫球蛋白恒定区，特别是免疫球蛋白的Fc部分。免疫球蛋白是IgGl或IgG2同种型的实施例是本发明更优选的。

所以SARP-1可以与另一蛋白质、多肽等融合，例如免疫球蛋白或其片段。融合可以是直接的，或者通过短的连接肽，该肽长度可以短到1至3个氨基酸残基或稍长，例如长13个氨基酸残基。例如，所述连接肽可以是序列E-F-M(Glu-Phe-Met)的三肽，或是含有引入于SARP-1序列和免疫球蛋白序列之间的Glu-Phe-Gly-Ala-Gly-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met的13个氨基酸连接序列。

本文使用的“功能性衍生物”，包括SARP-1衍生物及其突变蛋白和融合蛋白，它们可用本领域已知方法从残基或N末端或C末端基团侧链存在的官能团制备，只要它们仍然在药学上可接受，即它们没有破坏与SARP-1活性至少基本上相似的蛋白质活性，并且不会使含它的组合物具有毒性，均包括在本发明中。所以，一优选实施例的功能性衍生物包括至少一连接于一个或多个官能团的部分，所述官能团是氨基酸残基上一个或多个侧链。

本发明高度优选的部分是聚乙二醇(PEG)侧链。PEG侧链可遮蔽抗原位并延长与它们连接的物质在体液中的停留。其它衍生物包括羧基脂肪酯、羧基与氨或伯胺或仲胺反应产生的酰胺、氨基酸残基的游离氨基与酰基分子(如烷酰基或碳环芳酰基)形成的N-酰基衍生物、或游离羟基(如丝氨酰或苏氨酰残基的游离羟基)与酰基分子形成的O-酰基衍生物。

SARP-1及其突变蛋白和融合蛋白的“活性部分”包括单独蛋白分子多肽链的任何片段或前体，或蛋白分子与相关分子或与其相连的残基，如糖或磷酸根残基一起，或蛋白分子或糖残基自身的聚集物，只要所述活性部分具有与SARP-1至少基本上相似的活性。

本发明还涉及核酸分子在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，其中该核酸分子含有编码一多肽的核酸序列，所述多肽含有一选自由下列各组的氨基酸序列：

(a)成熟的SARP-1；

(b)含SEQ ID NO：2的多肽；

(c)含SEQ ID NO：2的氨基酸21至295的多肽；

(d)含SEQ ID NO：2的氨基酸24至295的多肽；

(e)含SEQ ID NO：2的氨基酸25至295的多肽；

(f)含SEQ ID NO：2的氨基酸26至295的多肽；

(g)含SEQ ID NO：2的氨基酸27至295的多肽；

(h)含SEQ ID NO：2的氨基酸28至295的多肽；

(i)含SEQ ID NO：2的氨基酸37至295的多肽；

用于制备治疗和/或预防硬皮病的药物。本发明还涉及所述核酸分子在治疗和/或预防硬皮病中的应用。

根据本发明，SARP-1也可以以含有所述核酸分子的载体形式施加给人体。所以，本发明还涉及含有所述核酸分子的载体在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用。载体最好是表达载体，含有操作性连接于SARP-1编码序列全部或一部分的启动子。另一优选实施例的载体是基因治疗载体。基因治疗载体为本领域所公知，大多数是病毒衍生而成的载体，例如腺病毒载体或慢病毒载体。

根据本发明，SARP-1也可以以产生和/或分泌SARP-1的细胞形式施加给人体。所以，本发明还涉及表达SARP-1的细胞在制备治疗和/或预防硬皮病的药物中的应用，即涉及治疗和/或预防硬皮病的细胞治疗。此细胞可以是产生天然SARP-1的细胞和/或产生重组SARP-1的转染细胞。最好是表达和分泌高含量蛋白的细胞，例如过度表达的细胞，其携带高拷贝数目的表达载体，而该载体含有一编码SARP-1的核酸分子。

由于成纤维细胞表示纤维化机制，所以它们是抗纤维化和治疗硬皮病的最合适的细胞。因此，本发明最好采用SARP-1表达的成纤维细胞。

本发明还涉及一种制备治疗和/或预防硬皮病药物的细胞，其含有一载体，所述载体包括编码SARP-1全部或一部分的核酸分子。经过基因修饰产生本发明的多肽的细胞也在本发明的范围之中。

本发明还考虑，以抑制剂正常不表达或表达的量不足够，使用能诱导和/或增强SARP-1在一细胞中内源性产生的表达载体。所以本发明利用称为内源性基因激活(EGA)的技术产生所需要的蛋白质。

***性硬化症是硬皮病中最严重的一种疾病，往往导致残废和死亡。所以，本发明的另一优选实施例涉及***性硬化症，如上所述，它是硬皮病的指标，主要特点是累及内脏器官。

本发明优选使用一些组合治疗。故本发明的药物最好还包括：

·干扰素，特别是干扰素β

·肿瘤坏死因子(TNF)拮抗剂，特别是TBPI和/或TBPII

·选自以下物质的抗硬皮病药物：ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂(proton pump inhibitors)、非类固醇抗炎药(NSAIDs)、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明(bucillamine)、香叶基香叶基转移酶抑制剂(geranylgeranyl transferase inhibitors)、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素(relaxin)、氢溴酸常山酮(halofuginone)、***素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂和抗氧化剂。

所有治疗可以同时、先后或分开使用。

虽然目前还没有治愈硬皮病的方法，但现正使用一些药物治疗来治疗硬皮病的病症。可用作本发明组合治疗的这样一些抗硬皮病药物，见本文引用的参考文献Leighton(2001)或Wigley和Sule(2001)。

干扰素主要因其对病毒复制和细胞增殖有抑制作用而为人所认知。例如，干扰素-γ在促进免疫和炎症反应中起重要作用。据说干扰素β(IFN-β，I型干扰素)有抗炎症作用。

在本发明另一实施例中，SARP-1与TNF拮抗剂结合使用。TNF拮抗剂以几种方式发挥其活性。首先，拮抗剂能以足够的亲和力和特异性结合或封蔽TNF分子本身，以致部分或基本上中和了TNF表位或负责与TNF受体结合的表位(下文称为“遮蔽性拮抗剂”)。例如，一种遮蔽性拮抗剂可以是抗TNF的抗体。

另一方面，TNF拮抗剂可抑制TNF结合后由细胞表面受体激活的TNF信号通道(下文称为“信号拮抗剂”)。TNF拮抗剂易于识别并通过常规方法筛选评价，即在体外敏感细胞系，如TNF能引起其增殖和分泌免疫球蛋白的人B细胞中用候选拮抗剂对天然TNF活性的影响来评价。该试验包含不同稀释度，例如，试验所用TNF摩尔量的0.1倍至100倍，的候选拮抗剂的TNF制剂，以及无TNF或只有拮抗剂的对照(Tucci等人，1992)。

封蔽拮抗剂是本发明优选使用的TNF拮抗剂。在封蔽拮抗剂中，优选使用那些以高亲和力结合TNF并具有低免疫原性的多肽。特别优选使用可溶性TNF受体分子和抗TNF的中和抗体。例如，可溶性TNF-RI(p55)和TNF-RII(p75)可用于本发明。这些截短型受体是本发明更优选的拮抗剂，其包括受体的细胞外结构域或其功能部分，例如，EP914431叙述了截短的可溶性TNF-I型和TNF-II型受体。

截短型的TNF受体是可溶的，在尿和血清中检测到30kDa或40kDa的TNF抑制性结合蛋白，这两种TNF抑制性结合蛋白分别称为TBPI和TBPII(Engelmann等人，1990)。根据本发明，SARP-1与TNF拮抗剂和/或干扰素可同时、先后或分开使用。

根据本发明，优选TNF拮抗剂是TBPI和TBPII，与SARP-1结合使用。该受体分子的衍生物、片段、区段和生物活性部分，按功能装配成本发明用的受体分子。受体分子的这种生物活性等价物或衍生物，指多肽部分或编码该受体分子的序列部分，其大小足够并能以亲和力结合TNF，以致抑制或阻断与膜结合的TNF受体的相互作用。

本发明另一优选实施例中，可溶性人TNF-RI(TBPI)是本发明用的TNF拮抗剂。欧洲专利EP308378、EP398327和EP433900叙述了天然和重组的可溶性TNF受体分子及其制备方法。

虽然在疾病早期可能有利于阻断TNF-α，在晚期也作过讨论，但TNF自身对硬皮病具有有益的效果(Abraham等人，2000)。所以，本发明还涉及SARP-1和TNF-α结合使用来治疗或预防硬皮病，特别是进展期疾病。

COX抑制剂在本领域已公知。例如，WO01/00229叙述了一些具体的COX-2抑制剂。

本发明还涉及用于治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症的药物组合物，其包括SARP-1，可任选地与一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂一起施用。该药物组合物也包括任一上述其它组分，特别是干扰素、TBP或COX抑制剂。

本发明的药物组合物还包括含有本发明核酸分子的载体或表达SARP-1的细胞。

药物组合物的活性成分，即本发明的多肽、核酸或细胞、或其组合以及以上提到的物质组合，可以以各种方法给个体施用。施药途径包括皮内、透皮(如缓释制剂)、肌肉内、腹膜内、静脉内、皮下、口服、硬膜外、局部和鼻内等途径。也可采用其它有效治疗途径施药，例如通过上皮或内皮组织吸收或通过基因治疗将编码活性药物的DNA分子施加给病人(如通过载体)，导致该活性药物在体内表达和分泌。此外，可将本发明的蛋白质与生物活性药物的其它组分，如药学上可接受的表面活性剂、赋形剂、载体、稀释剂和载体剂等，一起施用。

定义“药学上可接受的”指包含不会干扰活性成分的生物活性效果，并对施药的宿主无毒性的任何载体。例如，为了在外肠胃道施药，可将这些活性蛋白以注射用剂量单位形式配制在载体中，如盐水，葡萄糖液，血清白蛋白和林格(Ringer)液。

对于肠胃道外(如静脉内、皮下、肌肉内)施药，可将活性蛋白质配制成溶液、悬浮液、乳液或与药学上可接受的肠胃道外载体(如水、盐水、葡萄糖液)以及能维持等渗性(如甘露糖醇)或化学稳定性(如防腐剂和缓冲液)的添加剂一起制成冻干粉末。以常规技术给制剂灭菌。

本发明的活性蛋白质也可用共轭方法增加分子在人体内的半衰期而改善其生物利用性。例如，如PCT专利申请WO 92/13095所述那样，使分子与聚乙二醇交联。

活性蛋白的有效治疗量是很多变量的函数，包括受体类型、本发明的物质与其受体的亲和力、受体显示的残留毒性、施药途径、病人的临床状态。

“有效治疗量”是施用时本发明的物质使SARP-1受体激活、或使体内刺激受体的配体失活。给个体施加单剂或多剂的剂量取决于各种因素，包括SARP-1药物动力学性能、施药途径、病人的病情和特征(性别、年龄、体重、健康状况和身型大小)、症状程度、并行治疗、治疗频度和所要求的效果。本领域技术人员都掌握了调整和操作已确定的剂量范围。

按照本发明，多肽的剂量约为0.0001-100mg/kg，或约0.01-10mg/kg，或约0.1-5mg/kg，或约1-3mg/kg，虽然如此，主要还是取决于治疗的需要。

每日药量通常分成几剂或以缓释形式施用，以有效获得所需结果。第二次或随后施药可以与首次或原先施加给该个体的相同剂量、少于或多于此剂量进行。可在疾病发作时或发作前进行第二次或随后施药。

本发明还涉及用于治疗和/或预防硬皮病，特别是***性硬化症的方法，其包括给有需要的病人施加一有效抑制量的本发明多肽，可任选地与药学可接受的载体一起施用。另外，按照本发明也可施加产生本发明SARP-1或核酸分子的细胞，其可任选地包含在一表达载体中。

表达载体可***地施加。表达载体优选为通过肌肉内注射施加。另一优选施药途径是吸入途径，特别当疾病涉及肺纤维化时。

本发明还涉及一种药物组合物的制备方法，其包括使有效治疗量SARP-1与药学可接受的载体混合，以及涉及一种关节炎的治疗和/或预防方法，其包括给有需要的宿主施加一有效抑制量的SARP-1。

本文所引用的全部文献，包括期刊文章或摘要、公开或未公开的美国或外国专利申请、已授权的美国或外国专利或任何其它文献，均纳入其整体内容作为参考。它们包括引用文献所提供的全部数据、表格、图形及文字。此外，本文引用文献内所引用的文献也纳入其整体内容作为参考。

总之，参考已知的方法步骤、常规的方法步骤、已知方法或常规方法并不是承认本发明的任何方面、叙述或实施例均已在相关技术领域中得以揭示、启发或者暗示。

上述对具体实施例的叙述将完整地揭示本发明的总体特征，其他人运用本领域的一般技术常识(包括本文引用的参考文献的内容)在无需过多的实验和不脱离本发明一般概念的条件下可容易地对这些具体实施例的各种应用作出改变和/或调整。所以，基于本文的教导和指引，这样一些改变和/或调整在意义上是所揭示的实施例相当的范围。需要知道的是，本文的用语或术语是为了说明而不具有限制性，因此这些术语或用语可由本领域技术人员根据本文所提供的教导和指引，并结合本领域技术人员所知道的常识作出解释。

以上为对本发明进行的叙述，参照以下提供的实施例将会更容易理解本发明的内容，但以下实施例是用于阐述而不意味着对本发明的限制。

实施例1：SARP-1在硬皮病病人的皮肤成纤维细胞中差异表达

方法

病人样本

从9例年龄和性别相当的弥漫型皮肤***性硬化症病人的病变或非病变皮肤(通常是前臂皮肤)钻取2立方毫米，进行活组织检查。所有病人都符合美国内风湿学会关于***性硬化症诊断的标准。

成纤维细胞培养

如前所述(Abraham等人，1991)，通过体外培养，自活检获得成纤维细胞。简言之，将活检组织切成小片，置于消毒塑料盘或塑料瓶中。室温干燥15分钟后，活检切片附在组织培养塑料上，再在由DMEM组成的成纤维生长培养基(FGM)中培养，DMEM含有10％胎牛血清(FCS)、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、100单位/ml盘尼西林、100μg/ml链霉素、50μg/ml艮他霉素和2.5μg/ml两性霉素B。在湿空气和5％二氧化碳的环境中培养2-3星期后，经胰蛋白酶简单处理使成纤维细胞生长晕脱离出来，再次在不含艮他霉素和两性霉素B的成纤维生长培养基中培养。实验采用第2和5代之间的成纤维细胞。成纤维细胞表型通过他们在单层和三维胶原凝胶培养基中的一般形态而得到证实。

RNA的分离

按照制造商的方案，用Trizol(Life Technologies)从早期传代连片生长的成纤维细胞或者正常人真皮(***)成纤维细胞(购自Promocell)的原代培养基中提取总RNA。最终的RNA沉淀重悬于经消毒DEPC处理过的水中，浓度为1μg/μl，储存于-80℃。

cDNA探针合成

取2μg总RNA与1.3μl细胞因子特异性引物(R&D Systems，cat.no.GAC11)混合，70℃下在0.5毫升微量离心管(eppendorf tube)内培育2分钟。再把离心管冷却至50℃，保持2分钟，然后，加入反应混合物，该混合物含有2μl 5X反应缓冲液(250mM Tris-HCl pH8.3、375mM氯化钾和15mM氯化镁)、1μl 10XdNTP混合物(5mM dGTP、5mM dCTP和5mM dTTP)、3.5μlα32P-dATP(3000Ci/mmol，Amersham，cat.no.PB10204)、0.5μl DTT(100mM)和1μl SuperscriptII逆转录酶(Life Technologies)。反应混合物用吸管头(pipetting)混匀一下，50℃培养25分钟。加入含1mg/ml糖原的1μl 0.1M EDTA pH8.0终止反应。再按照制造商的使用说明，用Chromaspin-200 DEPC-H2O层析柱从无掺入的脱氧核苷酸纯化标记cDNA。采用Czerenkov计数鉴定含有cDNA的馏分。70℃下峰值馏分(通常为收集的全部6个馏分中第2个馏分)用含1mM EDTA的0.1体积1M氢氧化钠处理20分钟，使RNA水解，70℃下再以等体积含2.5μg人Col-1 DNA(Life Technologies)的1M磷酸二氢钠中和20分钟。加热处理中和后的cDNA探针，再直接加入到杂交混合物中。

与基因滤膜微阵列杂交

将含0.5μg/ml鲑鱼精DNA(Life Technologies)的5ml表达杂交液(ExpressHybridization solution)(Clontech)装在转动瓶中，转动瓶置于Hybaid杂交烘箱(MWG Biotech)，68℃使基因滤膜微阵列(人细胞因子表达阵列，R&D Systems，cat.no.GA001)在此表达杂交液中预杂交2小时。之后，预杂交液被新鲜杂交液所置换，所述新鲜杂交液含有特异性活性为0.25至1×10⁶cpm/ml的cDNA探针制剂。68℃杂交16-20小时。杂交后，68℃滤膜用2X SSC/1％SDS洗4次，每次20分钟，用0.1X SSC/0.5％SDS洗2次，每次15分钟。然后，将滤膜密封在Saran wrapTM中，室温下暴露于K型成像磷屏(Biorad)不同的时间(4小时到4天)。

影像分析

成像磷屏用Biorad的个人FX磷光影像分析仪扫描，分辨率为50μm。将所得的16位数字文件转为可用Arrayvision软件(Imaging Research Inc.)分析的TIF格式和影像。我们测量每个标本滴在滤膜上两点的384基因的像素密度。减去背景信号，得到阵列中每对斑点的平均像素密度(相等于表达水平)。

通过RT-PCR技术确定选择基因的微阵列结果

每个病人样本各取1μg总RNA，用寡脱氧胸苷酸(oligo dT)引物(Promega)使总RNA在20μl反应体积中逆转录，该反应体积含5mM氯化镁、10mMTris-HCl、50mM氯化钾、0.1％Trition X-100、dATP、dGTP、dCTP和dTTP各1mM、0.5单位重组的RNasin核糖核酸酶抑制剂(Promega)及15单位AMV逆转录酶(Promega)。42℃反应混合物培养60分钟，95℃加热5分钟，再用无菌水稀释至200μl。用特异性引物对使逆转录酶反应稀释液在Taqman(PEApplied Biosystem 7700)进行实时PCR分析，特异性引物对是根据基因滤膜制造商提供的数据库查询号用Primer Express软件(PE Applied Biosystems)为每个基因而设计的。将所得结果标准化为每个样本中管家基因甘油醛3-磷酸脱氢酶的表达，并以折叠变化来表示，由病人异常标本的表达值除以病人相应的正常标本的表达值而确定。

预测硬皮病相关基因的统计方法

用邻近分析(neighbor analysis)和类别预测器(class predictor)进行预测硬皮病相关基因的统计方法，本文引用的参考文献(Golub等人，1999)有详细叙述。

结果

对7例硬皮病病人正常和异常成纤维细胞样本进行基因滤膜微阵列分析。每个病人样本的SARP-1 cDNA的平均表达水平见图1A，中值表达水平见图1B。正常和异常细胞间平均值和中值差异显著，SARP-1的正常表达水平比异常表达水平高。处理病人样本时通常使用中值，因为它们使组内变化较大的个体的影响减至最小。此处，7例测试病人中有5例的异常成纤维细胞表达SARP-1 mRNA的水平比正常成纤维细胞低得多。

用SARP-1特异性PCR引物对病人样本进行实时PCR分析，进一步证实了微阵列所得的结果。这些结果显示在图2中，以折叠变化(异常除以正常)来表示表达水平。8例测试病人中有6例同一个病人的SARP-1在患病成纤维细胞比在正常成纤维细胞下调至少2倍。其余两例病人在正常和异常成纤维细胞中的表达水平差不多。

在同一个病人的正常和异常成纤维细胞所观察到的表达差异并不是由于两组细胞的不同培养条件造成的，因为SARP-1 mRNA在正常人真皮成纤维细胞的原代培养基中表达不会显著改变细胞的传代(图3)。另外，提取硬皮病病人异常皮肤的整个活检样本的总RNA进行实时RT-PCR分析，结果显示SARP-1 mRNA的水平比临床上正常状况、年龄、性别和解剖部位相当的对照活检低。(图4)。

除此之外，统计方法显示SARP-1下调有95％的可能性与硬皮病的进展有关。

结论

上述结果显示硬皮病病人的患病组织与健康组织相比缺少SARP-1，这表明恢复SARP-1的正常水平可有助治愈该疾病。所以SARP-1可提供一种新药，用于部分或完全抑制硬皮病或硬皮病的至少一个或多个症状，或者用于抑制疾病进展。

实施例2：人SARP-1全cDNA编码序列的克隆

材料和方法

用SARP-1部分编码序列(EMBL查询号：AF017986)开始在人dbEST(公共EST数据库)上进行连续的BLAST搜索，用ENTREZ在http://www.ncbi.nlm.gov/Web/Search/index.html检索到相关的ESTs。下列ESTs与AF017986序列一起装配，产生SARP-1共有全编码序列：AW580647、AW608301、AA976403和W92531。

在上述所得到的共有序列基础上用下列引物通过逆转录酶PCR在含0.3mM dNTPs、1mM硫酸镁、5μl正常人的真皮(***)成纤维细胞cDNA模板(用上述方法制备)、5μl 10X Pfx扩增缓冲液(Life Technologies)和1μl铂Pfx DNA聚合酶(Life Technologies)的50μl反应混合物中克隆SARP-1的全长cDNA编码序列：SARP-1正向5’GCC AAG CTT CCC ACG ATG CTG CAG GGCCCT(SEQ ID NO：3)和SARP-1反向5’GCG CTC GAG CTA GCA CTG CAGCTT GCG GAT(SEQ ID NO：4)各50pmole。94℃反应混合物加热2分钟，再按下列条件进行35次PCR：94℃15秒，55℃30秒和68℃2分钟。用1×TAE缓冲液中的1％琼脂糖凝胶(Life Technologies)对扩增产物作分析。用WizardPCR纯化试剂盒(Promega)从凝胶纯化PCR产物，其以预测的分子量(906bp)迁移。

取100ng凝胶纯化的DNA，按照制造商的条件以限制酶HindIII和Xhol(Pharmacia)消化，再次按上述方法进行纯化，并按照标准分子生物技术用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)与用HindIII/Xhol消化的质粒pcDNA3.1(+)(Invitrogen)连接。用Biorad的基因脉冲仪(Biorad Gene Pulser)通过电穿孔使连接产物转到大肠杆菌菌株TOP 10F’(Invitrogen)中。从所得克隆生长而成的5ml培养基分离质粒DNA，并用T7和pcDNA3.1AS引物(Invitrogen)在Applied Biosystems 3700测序仪中进行自动测序分析以确定SARP-1的序列。

结果

为了鉴定SARP-1的体内外活性，克隆了人的全cDNA编码序列。采用BLAST程序用人SARP-1的部分cDNA序列(EMBL查询号为AF017986)鉴定dbEST公共数据库内的重叠ESTs。由下列序列查询号装配全cDNA编码序列：AF017986、AW580647、AW608301、AA976403和W92531。图5A和5B所示为SARP-1的全长DNA序列和推导的氨基酸序列(A和B应连续读取)。采用位于预测的启动和终止密码子旁侧的引物通过逆转录酶PCR克隆SARP-1的cDNA编码序列。对所得的SARP-1 cDNA克隆进行序列分析，发现在核苷酸水平上其与所公开的小鼠SARP-1序列的同一性为91％(Melkonyan等人，1997)，在氨基酸水平上与小鼠序列的同一性为95％。人和小鼠SARP-1的氨基酸序列对比见图6。分别用SIGNALASE(Von Heijne，1986)或SIGNALP程序预测蛋白序列是295氨基酸，其具有20或24个氨基酸预测信号肽，见图5A的箭头所示。人和小鼠序列的氨基差异已在图6突出显示，这种差异出现在N-末端信号肽(4个氨基酸)和成熟蛋白序列(2个氨基酸)中。

所附序列表的SEQ ID NO：1含有人SARP-1 cDNA编码链，SEQ ID NO：2含有人SARP-1氨基酸序列。所附序列表的SEQ ID NO：5所示为小鼠氨基酸序列。

实施例3：人SARP-1的N-末端序列

预测的SARP-1信号肽长20或24个氨基酸(见图5A)。为了证实成熟的SARP-1的N-末端是正确的，使含6个残留组氨酸的尾的重组SARP-1在HEK-293细胞中表达，并用镍-螯合柱纯化。纯化的蛋白作为32kDa带在SDS-PAGE上迁移，对应质谱所测到的质量34313Da。

采用配有Maundrell等人(1997)的148C型号在线乙内酰硫脲氨基酸分析仪的Applied Biosystems 494型号脉冲液相蛋白测序仪获得纯化的重组蛋白质的N-末端序列。简言之，37℃下纯化的SARP-1在90μl 100mM Tris-HClpH8.5(Boehringer Mannheim，测序级)中培养过夜而消化，该Tris-HCl含1M尿素、20mM甲胺、1mM二硫苏糖醇和5μg胰岛素。用反相高效液相层析法(HPLC)把肽分离出来，层析柱为Brownlee C18(220×2.1mm)。这些肽用0至55％的乙腈梯度洗脱60分钟，再用55-70％的乙腈洗脱5分钟。收集洗脱馏分，采用配有148C型号在线乙内酰硫脲氨基酸分析仪的Applied Biosystems 494型号脉冲液相蛋白测序仪以爱德曼降解法(Edman degradation)测定闪烁光谱测定法鉴定的带放射性³³P标记的磷酸肽的序列。

应用串联质谱通过胰蛋白酶消化还原和烷基化的蛋白质，得到序列GLFLFGQPDFSYK。基本上按Cavalli等人(2001)所述的方法，采用装有纳米级喷雾离子源的Q-TOF质谱仪(Micromass UK Limited，英国曼彻斯特)进行分析。简言之，用10％SDS-PAGE分离1微克纯化的蛋白质。从银染凝胶切除蛋白质谱带，并用胰蛋白酶(Shevchenko等人，1996)凝胶内消化。提取肽混合物，采用装有纳米级喷雾离子源的Q-TOF质谱仪(Micromass UK Limited，英国曼彻斯特)用串联质谱测序法(Wilm等人，1996)对其进行分析。

结果

未成熟的SARP-1的理论N-末端序列如下：

1 10 20 30

40 ...

MLQGPGSLLL LFLASHCCLG SARGLFLFGQ PDFSYKRSNC KPIPANLQLC...

预测的第二信号切割位点的位置在残基24和25(G和L)之间。

在所进行的测序实验中发现SARP-1的N-末端有着非常高的异质性。

在一个实验发现了两个主要序列，其中一个始于FGQPD，即始于SEQ IDNO：2的氨基酸28，另一个始于LFGQPD，即始于SEQ ID NO：2的氨基酸27。

然而，在一批纯化料中另外还发现4个序列：

LFLFGQPDFS 始于氨基酸25

FLFGQPDFS 始于氨基酸26

LFGQPD 始于氨基酸27

FGQPD 始于氨基酸28

另一个序列始于氨基酸37，它是RSNCKPIPAN。该序列是由于在赖氨酸残基后进行切割(类似胰蛋白酶切割)而产生的。

此外，在一个实验中发现了一个始于位置24的序列：GLFLFGQPDFSYK。

所以，N末端似乎是非常不均一的，它也可因为SARP-1固有的内肽酶或蛋白酶活性而产生。成熟的SARP-1可存在于一些具有不同N-末端的不同变异体中。

实施例4：SARP-1转染诱导体内细胞凋亡

方法

按照制造商的建议，采用Geneporter 2(Gene Therapy Systems，圣地亚哥)或Fugene 6(Life technologies)转染剂用含SARP-1 cDNA编码序列的质粒pcDNA3.1或者单独pcDNA3.1转染成纤维细胞系(小鼠NIH3T3细胞和人AG1518细胞)和成纤细胞原代培养基。转染24小时后用购自R&D Systems的TiterTacs 96孔细胞凋亡试剂盒测量细胞凋亡，并按制造商的使用说明用CyQuant染料(Molecular Probes)计算细胞的数目。

结果

为了评估SARP-1对成纤维细胞的影响，用SARP-1 cDNA转染成纤维细胞系，并评估细胞凋亡的程度。结果见图7。SARP-1转染的细胞中细胞凋亡与模拟物(pcDNA3.1)转染的细胞相比有显著下降，表示人SARP-1具有与其小鼠相应物相似的活性。确定非转染细胞中细胞凋亡的基础水平。经核酸酶处理过的NIH3T3细胞作阳性对照。“无标记的”柱显示背景染色水平，核酸酶处理(“经核酸酶处理过的”)作阳性对照。

实施例5：SARP-1对TGFβ1的产生的影响

TGFβ1是一种在硬皮病中上调的前纤维化细胞因子，已发现其与硬皮病的发病有关(Kawakami等人，1998)。为了评估SARP-1是否通过成纤维细胞使TGFβ1的产生或分泌下调或受到抑制，以纯化的蛋白质形式将SARP-1加入到成纤维细胞培养基中。另一种可选择的方法是可使含有SARP-1 cDNA的表达载体转染到细胞中，以致细胞培养基中含有足够含量的SARP-1。还有一种可能性是向成纤维细胞培养基加入由SARP表达细胞构成的介质，可将此介质浓缩得到足够含量的SARP-1。本实验可使用由健康或患病个体或者由硬皮病病人皮肤的正常或患病部位产生的成纤维细胞系或原代成纤维细胞。

TGFβ1的含量可采用购自R&D Systems的测定TGFβ1的Quantikine酶联免疫吸附试验(ELISA)***(cat no.DB100)在培养细胞的条件培养基中测定。

实施例6：SARP-1的施加对体外人成纤维细胞中MMP-1活性的影响

方法

将3’端含6XHis尾的编码序列的人SARP-1 cDNA亚克隆到杆状病毒转移载体pDEST Fastbac中。在重组杆状病毒转染的Sf5昆虫细胞中产生C-末端带6XHis尾的SARP-1，并用Ni-NTA亲和层析法纯化。

取硬皮病病人或健康受试者的病变或非病变皮肤传代次数少(2-5)的人成纤维细胞，用0、100、或1000ng/ml重组的SARP-1处理24小时。收获条件培养基，4℃以1200rpm转速离心10分钟除去细胞碎片。按照制造商的方案用MMP-1萤光因子(fluorokine)试剂盒(购自R&D Systems)测定未稀释的培养基中MMP-1的活性。还测定了同一些样本中MMP-9的活性。

结论

MMP-1负责I型胶原的降解，这表示MMP-1活性下降是其中一种硬皮病潜在症状包括过度胶原沉积的促进因素。

硬皮病病人的真皮成纤维细胞的MMP-1与同一个病人分离出来的正常和非病变真皮成纤维细胞相比，无论在mRNA水平还是在蛋白质水平上的表达都有所下降。虽然不同病人之间可检测的总活性MMP-1差别非常大，但是硬皮病病人的异常成纤维细胞(图8A、D、F)以及硬皮病病人无受感染和健康皮肤产生的成纤维细胞(图8E)、临床上正常对照个体的成纤维细胞(图8B和C)中经SARP-1处理过的成纤维细胞具有比未经处理的成纤维细胞更高的活性。所显示的结果是三个测定值的平均值。与MMP-1不同，观察到SARP-1并不影响MMP-9的活性(数据未示出)。

实施例7：SARP-1 cDNA的转染使NIH3T3成纤维细胞中胶原1α2型启动子的活性降低

材料和方法

将保持在含2mM谷氨酰胺、100单位/ml盘尼西林/链霉素和10％胎牛血清的DMEM中的NIH3T3细胞按50％融合接种在透明底层组织培养级白色壁的96孔板(Wallac)上。第二天，按照制造商的使用说明，用Geneporter转染剂使细胞与含3.5kb胶原启动子和萤光素酶报导基因(Royal Free Hospital医院的David Abraham医生赠送)的pcDNA3.1 SARP-1和pGL3载体(Promega)共转染。转染后30小时加入TGFβ(R&D Sytems，5ng/ml)。24至36小时后，采用购自Promega的Bright-Glo分析***直接测定每个孔中萤光素酶的活性。

结果

为了评估SARP-1过度表达与胶原合成是否有关系，检验了SARP-1 cDNA转染对与Col1α2启动子/萤光素酶报导基因构造体共转染的NIH3T3成纤维细胞中胶原启动子的活性的影响。

SARP-1 cDNA与胶原启动子/萤光素酶报导质粒共转染显示SARP-1不仅能够抑制胶原启动子的基本活性，而且能够抑制TGFβ诱导增强胶原启动子的活性(图9)。这些结果表明SARP-1基因产物通过SARP-1介导的信号活动可直接或间接参与调节胶原启动子体外的活性。

另一种方法测试SARP-1对成纤维细胞中胶原沉积和/或合成和/或分泌的影响是将纯化的SARP-1加入到成纤维细胞培养基中。另一种可选择的方法是可将含SARP-1 cDNA的表达载体转染到成纤维细胞中，以便在细胞培养中获得足够浓度的SARP-1。

还有一种可能性是向成纤维细胞培养基中加入由SARP表达细胞构成的介质，可将此介质浓缩得到足够含量的SARP-1。本实验可使用由健康或患病个体或者由硬皮病病人皮肤的正常或患病部位产生的成纤维细胞系或原代成纤维细胞。

如Shi-wen等人(1997)所述的方法，用捕获ELISA***(抗体购自SouthernBiotechnology Associates Inc)可体外测定培养的人成纤维细胞中胶原的合成。

实施例8：过度表达SARP-1或以重组的人SARP-1处理的人真皮成纤维细胞显示与硬皮病病理相关的基因的mRNA表达改变

材料和方法

正常人真皮(***)成纤维细胞保持在成纤维细胞培养基(Promocell)中。成纤维细胞在TGFβ1存在和不存在的情况下用重组的人SARP-1(100ng/ml)处理4或24小时。处理后收获细胞，并按制造商的使用说明用TrizolTM试剂(LifeTechnologies)提取总RNA。如上所述由RNA制备32P-dATP标记的cDNA探针，并如上所述与R&D Systems的人细胞因子基因滤膜阵列杂交和处理。

结果

虽然SARP-1最初被认为是一种细胞凋亡相关基因，但它的确切功能还不知道。为了了解SARP-1在硬皮病中所起的作用，测量经TGFβ预处理，即模拟硬皮病表型并含有SARP-1的人真皮成纤维细胞的处理对成纤维细胞基因表达的影响。

表4所示为受到用TGFα预刺激4小时后并具有重组的SARP-1的成纤维细胞处理影响的mRNAs，TGFα预刺激是用来模拟硬皮病表型。细胞用SARP-1处理24小时。在这样的条件下，TGFα和FGF5是下调的。此时观察到一种TGFβ1结合蛋白endoglin的表达减弱，而一种与基质金属蛋白酶活化相关的蛋白酶弗林蛋白酶(furin)的表达增强。另一种下调的mRNA是TARC。该趋化因子与皮肤归巢(homing)T细胞在发炎部位的募集有关。所以施加SARP-1可具有抗炎效果是可能的。此外，还观察到TNFR1亚基mRNA上调。这一发现的意义目前还不清楚，因为科技文献关于TNF在硬皮病中是有致病作用还是有保护作用的看法似乎相差很大。

在一独立实验中(未示出)，分析比较了硬皮病病人的成纤维细胞与健康对照的成纤维细胞的基因调节。令人感兴趣的是，我们发现表4所示出的调节基因在硬皮病样本中受到调节。那些在硬皮病成纤维细胞中被发现上调的基因在上述模型中表达SARP-1后变为下调，那些被发现下调的基因在上述模型中表达SARP-1后变为上调，这进一步表示SARP-1在硬皮病治疗中具有有益的效果。

表4

比率^*	用TGFβ处理	用TGFβ+SARP-1处理	基因
比率^*	用TGFβ处理	用TGFβ+SARP-1处理	基因	-1.6	1346	830	FGF-5
-2.7	788	297	endoglin	-1.6	1346	830	FGF-5
-2.7	788	297	endoglin	3.3	157	515	TNFR1

3.3	128	428	furin
3.3	128	428	furin	-4.6	275	60	TGFα
-4.7	164	34	TARC	-4.6	275	60	TGFα

^*比率SARP-1/模拟物表示用TGFβ+SARP-1处理/仅用TGFα处理的比率所示结果基于两个独立的实验

实施例9：小鼠疾病模型中SARP-1体内作用的评估

博来霉素诱导的肺损害是公认的硬皮病模型。此疾病由气管内施加博来霉素而引起(Hattori等人，2000)。诱导后大约第14日纤维化达到最大，处理后的小鼠的肺继而会出现炎症反应(最快大约在第7日)。此模型用来评估施加SARP-1对体内肺纤维化发展的影响。采用一种细胞输送***(用全长SARP-1cDNA转染的NIH3T3细胞)体内产生SARP-1。

方法

动物的处理

第1日气管内施加在生理盐水中的博来霉素(0.075IU)来诱导小鼠的肺纤维化。将小鼠分为不同的4组，每组10只动物。第1组腹膜内注射10⁶用SARP-1/pcDNA3.1转染的NIH3T3细胞。第2组注射10⁶用模拟物(pcDNA3.1载体)转染的NIH3T3细胞。第3组注射250μg抗TGFβ抗体(抗Pan TGFβ：Sigmacat.no.T9429)，最后1组注射生理盐水。第14日处死全部小鼠，肺经***固定，以石蜡包埋，用于组织学研究。肺解剖面的胶原上三色或苦天狼星红(picro Sirius red)(Bancroft J.D.和Stevens A.，Theory and Practice ofHistological Techniques)，纤维化/肺程度计分。

NIH3T3细胞的转染

如前述方法，采用Geneporter 2试剂以SARP-1/pcDNA3.1转染NIH3T3细胞。转染后24小时，弃掉培养基，37℃下细胞用含1mM EDTA的磷酸盐缓冲盐水(PBS)处理5分钟。用细胞刮棒(Costar)轻轻地使细胞分离，4℃离心5分钟沉淀细胞，重悬于注射级盐水中，浓度为10⁷细胞/ml。

结果

SARP-1防止博来霉素诱导的肺纤维化

单独用博来霉素或者用模拟物转染的NIH3T3细胞处理的动物会出现明显的肺纤维化(未示出)。TGFβ1被认为是负责引致纤维化致病变化的其中一种关键性试剂。当预防性地施加抗TGFβ1多克隆抗体，发现它能防止肺纤维化继续发展(Yamamoto等人，1999)，而且还能减少GvHD硬皮病模型的皮肤纤维化(McCormick等人，1999)。所以，这些实验采用此抗体作为阳性对照。抗TGFβ处理的小鼠肺部没有出现广泛纤维化。然而，用SARP-1转染细胞处理的小鼠与仅用博来霉素或者用模拟物转染细胞处理的动物相比，肺纤维化病变的数目显著减少。其效果可比得上用抗TGFβ1处理所见的效果，甚至还要好(未示出)。

对肺进行组织学分析显示，SARP-1处理的动物具有与无炎性浸润液而且大部分肺泡结构是正常的肺近似的正常形态。这种形态与抗TGFβ1处理的动物相似，其形状与在用模拟物处理和未处理的动物的肺所看到的异常形态截然相反。后2组动物的肺泡空间充满了细胞浸润液和胶质沉积(未示出)。

不同实验组的肺部纤维化病变的数量见图10。SARP-1处理的小鼠所含有的纤维化病变与用生理盐水或抗TGFβ处理的小鼠相比少得多。

施加博来霉素可引致死亡率上升。此外，还注意到施加SARP-1除了有防止纤维化的作用外，而且经过治疗生存下来的小鼠数量(10只小鼠中有8只)比生理盐水处理的小鼠(10只小鼠中有6只)、抗TGFβ处理的小鼠(10只小鼠中有4只)和模拟物处理的小鼠(10只小鼠中有3只)的数量都多。所以，用SARP-1处理甚至能防止肺纤维化模型死亡，提示在此实验设定中SARP-1治疗明显优于抗TGFβ处理。

概括地说，该建立的硬皮病体内模型证实了SARP-1具有有益的效果。

另外，体内模型还可用来测试施加SARP-1的效果，如用于硬皮病的小鼠硬皮病移植物抗宿主病(graft-vs-host disease)(Scl GVHD)模型。该模型再现了硬皮病的重要症状，包括皮肤增厚、肺纤维化和皮肤胶原mRNA上调，在此之前会先有单核细胞浸润和皮肤TGF-β1 mRNA上调。McCormick等人(1999)对这一模型有详细叙述。

实施例10：通过肌肉内注射表达质粒DNA***性输送SARP-1

要证明SARP-1在硬皮病中起到保护因素的作用，用编码小鼠SARP-1cDNA的质粒体内转染小鼠，作为对照，与用空质粒转染的小鼠进行比较。

如前所述方法(Dimmeler等人，1997；Mir等人，1999)，在痳痹小鼠的两块胫头颅肌肉内注射质粒。简言之，在腿两侧设置相距4.2至5.3mm的两块不锈钢电极板，经PS-15电脉冲仪发出经皮电脉冲(200V/cm的8方波电脉冲，在2Hz持续20毫秒)。

博来霉素诱导的肺纤维化如上一个实施例所解释，在SARP-1转染和模拟物转染的动物都观察到疾病的发展。

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序列表

<110>应用研究***ARS股份公司(Applied Research Systems ARS Holding N.V.)

<120>SARP-1在治疗和/或预防硬皮病中的应用

<130>EP 469 Y

<160>5

<170>PatentIn 3.0版本

<210>1

<211>912

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>1

gccaagcttc ccacgatgct gcagggccct ggctcgctgc tgctgctctt cctcgcctcg 60

cactgctgcc tgggctcggc gcgcgggctc ttcctctttg gccagcccga cttctcctac 120

aagcgcagca attgcaagcc catcccggcc aacctgcagc tgtgccacgg catcgaatac 180

cagaacatgc ggctgcccaa cctgctgggc cacgagacca tgaaggaggt gctggagcag 240

gccggcgctt ggatcccgct ggtcatgaag cagtgccacc cggacaccaa gaagttcctg 300

tgctcgctct tcgcccccgt ctgcctcgat gacctagacg agaccatcca gccatgccac 360

tcgctctgcg tgcaggtgaa ggaccgctgc gccccggtca tgtccgcctt cggcttcccc 420

tggcccgaca tgcttgagtg cgaccgtttc ccccaggaca acgacctttg catccccctc 480

gctagcagcg accacctcct gccagccacc gaggaagctc caaaggtatg tgaagcctgc 540

aaaaataaaa atgatgatga caacgacata atggaaacgc tttgtaaaaa tgattttgca 600

ctgaaaataa aagtgaagga gataacctac atcaaccgag ataccaaaat catcctggag 660

accaagagca agaccattta caagctgaac ggtgtgtccg aaagggacct gaagaaatcg 720

gtgctgtggc tcaaagacag cttgcagtgc acctgtgagg agatgaacga catcaacgcg 780

ccctatctgg tcatgggaca gaaacagggt ggggagctgg tgatcacctc ggtgaagcgg 840

tggcagaagg ggcagagaga gttcaagcgc atctcccgca gcatccgcaa gctgcagtgc 900

tagctcgagc gc 912

<210>2

<211>295

<212>PRT

<213>智人(Homo sapiens)

<400>2

Met Leu Gln Gly Pro Gly Ser Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ala Ser His

1 5 10 15

Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp

20 25 30

Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln

35 40 45

Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu

50 55 60

Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile

65 70 75 80

Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys

85 90 95

Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln

100 105 110

Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val

115 120 125

Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg

130 135 140

Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His

145 150 155 160

Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys

165 170 175

Asn Lys Asn Asp Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn

180 185 190

Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg

195 200 205

Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu

210 215 220

Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys

225 230 235 240

Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro

245 250 255

Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser

260 265 270

Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg

275 280 285

Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys

290 295

<210>3

<211>30

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>3

gccaagcttc ccacgatgct gcagggccct 30

<210>4

<211>30

<212>DNA

<213>智人(Homo sapiens)

<400>4

gcgctcgagc tagcactgca gcttgcggat 30

<210>5

<211>295

<212>PRT

<213>小家鼠(Mus musculus)

<400>5

Met Pro Arg Gly Pro Ala Ser Leu Leu Leu Leu Val Leu Ala Ser His

1 5 10 15

Cys Cys Leu Gly Ser Ala Arg Gly Leu Phe Leu Phe Gly Gln Pro Asp

20 25 30

Phe Ser Tyr Lys Arg Ser Asn Cys Lys Pro Ile Pro Ala Asn Leu Gln

35 40 45

Leu Cys His Gly Ile Glu Tyr Gln Asn Met Arg Leu Pro Asn Leu Leu

50 55 60

Gly His Glu Thr Met Lys Glu Val Leu Glu Gln Ala Gly Ala Trp Ile

65 70 75 80

Pro Leu Val Met Lys Gln Cys His Pro Asp Thr Lys Lys Phe Leu Cys

85 90 95

Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Asp Leu Asp Glu Thr Ile Gln

100 105 110

Pro Cys His Ser Leu Cys Val Gln Val Lys Asp Arg Cys Ala Pro Val

115 120 125

Met Ser Ala Phe Gly Phe Pro Trp Pro Asp Met Leu Glu Cys Asp Arg

130 135 140

Phe Pro Gln Asp Asn Asp Leu Cys Ile Pro Leu Ala Ser Ser Asp His

145 150 155 160

Leu Leu Pro Ala Thr Glu Glu Ala Pro Lys Val Cys Glu Ala Cys Lys

165 170 175

Thr Lys Asn Glu Asp Asp Asn Asp Ile Met Glu Thr Leu Cys Lys Asn

180 185 190

Asp Phe Ala Leu Lys Ile Lys Val Lys Glu Ile Thr Tyr Ile Asn Arg

195 200 205

Asp Thr Lys Ile Ile Leu Glu Thr Lys Ser Lys Thr Ile Tyr Lys Leu

210 215 220

Asn Gly Val Ser Glu Arg Asp Leu Lys Lys Ser Val Leu Trp Leu Lys

225 230 235 240

Asp Ser Leu Gln Cys Thr Cys Glu Glu Met Asn Asp Ile Asn Ala Pro

245 250 255

Tyr Leu Val Met Gly Gln Lys Gln Gly Gly Glu Leu Val Ile Thr Ser

260 265 270

Val Lys Arg Trp Gln Lys Gly Gln Arg Glu Phe Lys Arg Ile Ser Arg

275 280 285

Ser Ile Arg Lys Leu Gln Cys

290 295

Claims

1.一种物质的应用，其特征在于：所述物质选自由下列组成的组，用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物，

(a)成熟的SARP-1；

(b)包含其富含半胱氨酸的卷曲结构域的SARP-1片段；

(c)含SEQ ID NO：2的多肽；

(d)含SEQ ID NO：2的氨基酸21至295的多肽；

(e)含SEQ ID NO：2的氨基酸24至295的多肽；

(f)含SEQ ID NO：2的氨基酸25至295的多肽；

(g)含SEQ ID NO：2的氨基酸26至295的多肽；

(h)含SEQ ID NO：2的氨基酸27至295的多肽；

(i)含SEQ ID NO：2的氨基酸28至295的多肽；

(j)含SEQ ID NO：2的氨基酸37至295的多肽；和

(k)(a)至(j)任一之融合蛋白。

2.如权利要求1所述的物质的应用，其特征在于：所述物质的一个或多个位点被糖基化。

3.如权利要求1或2所述的物质的应用，其特征在于：所述的物质是融合蛋白，它包括免疫球蛋白(Ig)融合。

4.如权利要求1所述的物质的应用，其特征在于：其中所述的物质包括至少一连接于一个或多个官能团的聚乙烯部分，所述官能团是氨基酸残基上一个或多个侧链。

5.一种核酸分子的应用，其特征在于：该核酸分子含有编码一多肽的核酸序列，所述该多肽含有一选自由下列组成的组的氨基酸序列，用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物，

(a)成熟的SARP-1；

(b)包含其富含半胱氨酸的卷曲结构域的SARP-1片段；

(c)含SEQ ID NO：2的多肽；

(d)含SEQ ID NO：2的氨基酸21至295的多肽；

(e)含SEQ ID NO：2的氨基酸24至295的多肽；

(f)含SEQ ID NO：2的氨基酸25至295的多肽；

(g)含SEQ ID NO：2的氨基酸26至295的多肽；

(h)含SEQ ID NO：2的氨基酸27至295的多肽；

(i)含SEQ ID NO：2的氨基酸28至295的多肽；

(j)含SEQ ID NO：2的氨基酸37至295的多肽；和

(k)(a)至(j)任一之融合蛋白。

6.一种含有权利要求5所述核酸分子的载体的应用，其特征在于：所述载体用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物。

7.如权利要求6所述的载体的应用，其特征在于：所述载体是表达载体。

8.如权利要求6或7所述的载体的应用，其特征在于：所述载体是基因治疗载体。

9.一种能在细胞中诱导和/或增强内源性产生权利要求1所述多肽的载体的应用，其特征在于：所述载体用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物

10.一种含有由权利要求6至9中任何一项所限定的载体的细胞的应用，其特征在于：所述细胞用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物。

11.一种表达由权利要求1至3中任何一项所限定的物质的细胞的应用，其特征在于：所述细胞用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物。

12.一种经过基因修饰产生由权利要求1至3任一所限定的多肽的细胞的应用，其特征在于：所述细胞用于制备治疗和/或预防纤维化疾病的药物。

13.如权利要求1、5、6或9所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：纤维化疾病是肝硬化。

14.如权利要求1、5、6或9所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：纤维化疾病是硬皮病。

15.如权利要求14所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物还包括干扰素。

16.如权利要求15所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述干扰素是干扰素β。

17.如权利要求14所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物还包括肿瘤坏死因子拮抗剂。

18.如权利要求17所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述肿瘤坏死因子拮抗剂是TBP-I和/或TBP-II。

19.如权利要求14至18中任何一项所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述药物还包括抗硬皮病药物。

20.如权利要求19所述的物质、核酸分子、载体或细胞在制备和/或预防纤维化疾病的药物中的应用，其特征在于：所述抗硬皮病药物选自由下列组成的组：ACE抑制剂、钙离子通道阻断剂、质子泵抑制剂、非类固醇抗炎药、COX抑制剂、皮质类固醇、四环素、己酮可可碱、布西拉明、香叶基香叶基转移酶抑制剂、rotterlin、脯氨基-4-羟化酶抑制剂、c-蛋白酶抑制剂、赖氨基-氧化酶抑制剂、松弛素、卤夫酮、***素、前列环素、内皮素-1、氧化氮、血管紧张素II抑制剂和抗氧化剂。