CN1192107C - 从带小棒链霉菌分离的5s棒烷基因及其在棒酸生产中的应用 - Google Patents
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Abstract
用于提高5R棒烷生产的新细菌基因、微生物和方法,所述5R棒烷例如棒酸。
Description
本发明涉及新细菌基因和用于增进例如棒酸的棒烷生产的方法。本发明也提供能够产生增加量的棒酸的新生物。
微生物,具体地说是链霉菌属(Streptomyces sp.),产生一些抗生素,包括棒酸和其它棒烷、头孢菌素、聚酮化合物、头孢霉素、衣霉素、全霉素和青霉素。能够操作这些由所述微生物产生的绝对和相对量的抗生素具有可观的利益,并因此有大量的学者研究生物合成途径的代谢和遗传机制[Domain,A.L.(1990)“β-内酰胺抗生素的生物合成与调节”,在:青霉素50年的应用、历史和发展趋势]。现在已知许多在所述代谢途径中执行不同步骤的酶和编码这些酶的基因。
可以根据棒烷的环状立体化学结构,将其任意分为两组(5S和5R棒烷)。还没有完全解释明白生物合成5R和5S棒烷的生物化学途径,但有人认为它们由相同的起子单元(至今尚未鉴别出的3碳化合物)[Townsend,C.A.和Ho,M.F.(1985)J.Am.Chem.Soc.107(4),1066-1068和Elson,S.W.和Oliver,R.S.(1978)J.Antibiotics XXXI No.6,568]和精氨酸[Valentine,B.P.等(1993)J.Am Chem.Soc.15,1210-1211]衍生,并共有一些普通的中间体[Iwata-Reuyl,D.和C.A.Townsend(1992)J.Am.Chem.Soc.114:2762-63和Janc,J.W.等(1993)Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2313-16]。
5S棒烷的实施例包括棒烷-2-羧化物(C2C)、2-羟甲基棒烷(2HMC)、2-(3-丙氨酰)棒烷、Valclavam和棒酸[GB 1585661,Rohl,F.等Arch.Microbiol.147:315-320,US 4,202,819]。然而几乎没有5R棒烷的实施例,最广为人知的是由带小棒链霉菌(Streptomycesclavuligerus)发酵产生的β-内酰胺酶抑制剂棒酸。在抗生素AUGMENTIN(Trade Mark SmithKline Beecham)中,将棒酸钾形式的棒酸同β-内酰胺阿莫西林结合。由于这具有商业利益,所以了解棒烷生物合成的研究集中在带小棒链霉菌的生物合成5R棒烷、棒酸方面。已经鉴别和公开了一些与棒酸生物合成有关的酶及其基因。这些公开的实例包括Hodgson,J.E.等,Gene 166,49-55(1995),Aidoo,K.A.等,Gene 147,41-46(1994),Paradkar,A.S.等,J.Bact.177(5),1307-14(1995)。相反,除了霉棒酸,关于5S棒烷的生物合成和遗传是未知的,棒霉酸是带小棒链霉菌中的棒酸生物合成途径中通过棒酸合酶作用产生的棒酸前体。
基因克隆实验已经证实,带小棒链霉菌包含两个棒霉酸合酶同工酶,cas1和cas2[Marsh,E.N.等,Biochemistry 31,12648-657,(1992)],cas1和cas2都可以在一定营养条件下影响棒酸产量[Paradkar,A.S.等,J.Bact.177(5),1307-14(1995)]。在其它产生棒酸的微生物中也检测出棒霉酸合酶活性,所述微生物即S.jumonjinensis[Vidal,C.M.,ES 550549,(1987)]和桂滨链霉菌(S.Katsurahamanus)[Kitano,K.等JP53-104796,(1978)]以及5S棒烷valclavam的生产者抗生链霉菌(S.Antibioticos)[Baldwin,J.E.等,Tetrahedron Letts.35(17),2783-86,(1994)]。后一篇论文也报道了具有原棒霉酸(proclavaminic acid)脒基水解酶活性的抗生链霉菌,该酶为已知参与棒酸生物合成的另一个酶。有报导指在带小棒链霉菌中鉴别出的参与棒烷生物合成的所有其它基因,是棒酸生物合成所需要的[Hodgson,J.E.等,Gene,166,49-55(1995),Aidoo,K.A.等,Gene,147,41-46(1994)],而且至今尚未报导5S棒烷生物合成特有的基因。
我们现在已经鉴别出了一些5S棒烷生物合成特有的基因,如在带小棒链霉菌中由C2C和2HMC作为示例的基因。因此本发明提供了包含一种或多种基因的DNA,所述基因是带小棒链霉菌中5S棒烷的生物合成特有的,且对5R棒烷(例如棒酸)生物合成不是必需的。
我们在本文使用的“基因”也包括任何基因功能或表达所需的调节区。在一优选方面,所述DNA如图1鉴定的。所述DNA最好包含在图1中显示的、称为orfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2和orfdwn3的核苷酸序列。本发明也提供由所述DNA编码的蛋白。本发明也提供包含本发明所述DNA的载体和包含这种载体的宿主。
令人惊奇的是,我们发现当至少一种按照本发明的基因是缺陷型时,由所述生物产生的棒酸的量增加。因此本发明也提供用于增加由合适的微生物产生的棒酸产量的方法。在本发明的一个方面,可以操作鉴别的基因,以产生能够产生增加量的棒烷(更恰当的说是棒酸)的生物。本发明的研究结果也提供鉴别具有较高棒酸产量的生物的改进方法,所述方法包括初步筛选具有较低5S棒烷产量或不产5S棒烷的微生物(例如通过hplc和/或如在本文的实施例中所述的棒烷生物测定)。
合适的是,可以以本文提供的序列为基础,通过常规的克隆方法(诸如PCR),获得本发明的5S棒烷基因。可以通过遗传技术,诸如基因破坏[Aidoo,K.A.等,(1994),Gene,147,41-46]、随机诱变、定点诱变和反义RNA,干扰或去除/删除所述基因的功能。
在本发明的另一方面,提供包含一种或多种缺陷基因的质粒,优选为下文所述的质粒pCEC060、pCEC061、pDES3、pCEC056和pCEC057。可以用各种方法使所述基因产生缺陷。例如通过***编码抗生素抗性基因的DNA片段,所述DNA片段完全消除了那个基因的活性。另一方面,可以使用其它策略产生缺陷基因,包括***不编码抗生素抗性基因的DNA、消除部分所述基因、删除所有所述基因、或通过增加和/或置换一个或多个核苷酸改变所述基因的核苷酸序列。按照本发明的缺陷基因可以在不同程度上缺陷。它们可以是缺陷型,因为它们的活性完全消除,或可以保留一部分原始活性。
合适的是,将本发明所述质粒用于转化诸如带小棒链霉菌的生物,所述带小棒链霉菌例如菌株ATCC 27064(其相当于带小棒链霉菌NRRL 3585)。可以在有关资料中发现合适的转化方法,所述资料包括:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),分子克隆:实验室指引,第二版,冷泉港实验室,冷泉港,N.Y.;Hopwood,D.A.等(1985),链霉菌属遗传操作,克隆指引,和Paradkar,A.S.和Jensen,S.E.(1995),J.Bacteriol.177(5):1307-1314。
带小棒链霉菌菌株工业上用于生产棒酸(棒酸钾)。在的英国和美国药典(英国药典1993,附录1994,第1362-3页和美国药典政府专论1995,USP 23 NF18第384-5页)中,关于棒酸钾,具体控制了毒性5S棒烷棒烷-2-羧化物的量。
因此在本发明的另一方面,提供能够高产棒酸、但已使其不能产生C2C的生物,或者提供能够高产棒酸、但只能产生低水平C2C的生物。产生棒酸的生物合适地是包括一种或多种缺陷型棒烷基因,而优选是下文所述的带小棒链霉菌菌株56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、60-1A、60-2A、60-3A、61-1A、61-2A、61-3A和61-4A。这类生物适于生产棒酸而不生产5S棒烷棒烷-2-羧化物,或者明显降低了棒烷-2-羧化物的产量。
实施例
在所述实施例中,除非另有说明,否则所有方法都如以下文献所述:Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.(1989),分子克隆实验室指引(第二版),或Hopwood,D.A.等(1985),链霉菌属遗传操作,克隆指引,和Paradkar,A.S.和Jensen,S.E.(1995),J.Bacteriol.177(5):1307-1314。
I.
棒霉酸合酶基因cas1的带小棒链霉菌染色体上游和下游的 DNA序列
A.
cas1的分离
为了从带小棒链霉菌NRRL 3885中分离编码棒霉酸合酶同工酶1(cas1)的基因的染色体DNA片段,根据先前测序的cas1基因(Marsh,E.N.,Chang,M.D.T.和Townsend,C.A.(1992)Biochemistry31:12648-12657)的核苷酸9-44,合成寡核苷酸探针ROM1。使用标准方法,在应用生物***391 DNA合成仪上构建寡核苷酸。合成36-mer的ROM1序列,所述ROM1序列在方向上同Marsh等(1992,ibid)公开的序列反向平行,通过末端标记DNA寡核苷酸的标准技术(Sambrook等,1989出处同上),用32P放射性标记ROM1,并通过由Stahl和Amann所述的DNA杂交法(载于:Nucleic acid techniques inbacterial systematics.E.Stackebrandt和M.Goodfellow编辑,多伦多:John Wiley and Sons,第205-248页,1991),使用ROM1筛选带小棒链霉菌基因组DNA的粘粒库。Doran,J.L等(1990),J.Bacteriol.172(9),4909-4918中描述了在粘粒pLAFR3中制备的带小棒链霉菌DNA基因组库。
于60℃在溶液中同放射性标记的ROM1整夜温育带小棒链霉菌粘粒库的菌落印迹,所述溶液由5×SSC、5×Denhardt′s溶液和0.5%SDS(1×SDS:0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠;1×Denhardt′s溶液:0.02%BSA、0.02%Ficoll和0.02%PVP)组成。然后于68℃在0.5×SSC+0.1%SDS的溶液中洗涤所述印迹30分钟。分离一个粘粒克隆10D7,它同ROM1强烈杂交,并在用限制性核酸内切酶SacI和EcoRI消化时产生杂交信号,所述杂交信号和在使用带小棒链霉菌基因组DNA消化物的相似的实验中检定的杂交信号相一致。
B.
cas1侧翼的带小棒链霉菌染色体的DNA序列
用限制性核酸内切酶SacI、NcoI和KpnI产生粘粒10D7的部分限制性酶切图谱。在ROM1和10D7 DNA的各种消化物间的DNA杂交实验表明,cas1最可能位于7-kb SacI-SacI DNA亚片段的一个末端。这个片段由cas1开放读框和大约6kb的上游DNA组成。然后,在噬菌粒载体pBluescript II SK+(2.96kb;Stratagene)中,由10D7的SacI消化物亚克隆所述7-kb片段,因此产生重组质粒pCEC007。
为了易化对cas1染色体上游测序的方法,在pUC120(3.2kb;Vieirra和Messing,酶学方法,
153,3-11,1987)中以两个方向亚克隆所述7-kb SacI-SacI片段的3-kb NcoI-NcoI亚片段,产生重组质粒pCEC026和pCEC027。所述3-kb亚片段由cas1的氨基末端编码部分和大约2.6kb的上游DNA组成。
使用外切核酸酶III和S1核酸酶消化法(Sambrook等,1989出处同上),在pCEC026和pCEC027中产生嵌套重叠缺失,并通过双脱氧链终止法(Sanger,F.,Nicklen,S.和Coulson,A.R.(1977),Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.
74:5463-5467),使用Taq dye-deoxy2终止子试剂盒和应用生物***373A测序仪,在两个链上测定所述3-kb NcoI-NcoI片段的DNA序列。
为了测定紧接cas1染色体下游的DNA序列,在pBluescript IISK+中由粘粒克隆10D7亚克隆4.3kb的KpnI-EcoRI DNA片段,产生pCEC018。在pSL1180(3.422kb,Pharmacia)中由pCEC018克隆3.7-kb的SacI-SacI亚片段;这个片段的一个SacI末端同cas1的TGA终止密码子部分重叠,另一SacI末端是载体编码的。在亚克隆过程中得到两个方向的所述3.7-kb片段,所得的重组质粒称为pCEC023和pCEC024。在两种质粒中产生嵌套重叠缺失,并在两个链上测定所述3.7-kb片段的DNA序列。在图1中显示了在这些实验中产生的带小棒链霉菌染色体的核苷酸序列,包括cas1序列和cas1侧翼的序列。
II.
casl侧翼的开放读框的功能分析
casl上游DNA序列的计算机分析预示,存在两个完整的orf和一个不完整的orf。所有三个orf均位于casl的相反DNA链上,并因此以相反的方向定向。第一个开放读框orfup1位于casl上游579bp,并编码344个氨基酸(aa)的多肽。第二个开放读框orfup2位于orfup1的3′-末端以外437bp,并编码151个aa的多肽。orfup3在orfup2之外。orfup3的起始密码子与orfup2的翻译终止密码子重叠,这使人们猜测所述两个orf翻译上偶联。orfup3的翻译终止密码子没有位于所述3-kb的NcoI-NcoI片段上。
对casl下游DNA序列的相似分析预示,存在两个完整的orf和一个不完整的orf。其中两个所述orf位于casl的相反DNA链上,并因此以casl的方向定向。所述第三个orf位于同casl相同的链上,并因此以远离casl的方向定向。第一个下游开放读框orfdwn1位于casl下游373bp,并编码328个aa的多肽。第二个开放读框orfdwn2位于orfdwn1上游55bp,并编码394个aa的多肽。orfdwn3在orfdwn2上游315bp,并在相反的链上。因为在所述3.7-kb片段上没有发现orfdwn3的终止密码子,所以orfdwn3编码219 aa的不完整多肽。
orfup和orfdwn开放读框的基因破坏
为评价cas1侧翼的开放读框在由带小棒链霉菌产生的棒酸和其它棒烷的生物合成中可能起的作用,通过基因替换产生***失活或缺失突变体。Paradkar和Jensen(1995出处同上)大体描述了用于基因破坏和置换的方法。
A.
orfup1
按Paradkar和Jensen(1995出处同上)所述,构建带有阿泊拉霉素抗性基因(aprr)的1.5-kb NcoI-NcoI片段,对其用克列诺片段处理,以产生平端(Sambrook等,1989出处同上),并将其与pCEC026连接,所述pCEC026已用BsaBI消化,并也用克列诺片段处理。pCEC026具有一个位于orfup1中距翻译起始密码子636bp的BsaBI位点。连接混合物用于转化大肠杆菌GM 2163感受态细胞(得自New EnglandBiolabs,USA.,Marinus,M.G.等M G G(1983)第122卷,第288-9页)至阿泊拉霉素抗性。从产生的转化体中,分离两个包含质粒pCEC054和pCEC055的克隆;通过限制酶切分析,发现pCEC054具有以与orfup1相同的方向***的aprr-片段,而pCEC055具有以相反方向***的aprr-片段。
为将pCEC054引入到带小棒链霉菌中,用BamHI和HindIII消化质粒DNA,并连接到高拷贝数的链霉菌属载体pIJ486(6.2kb;Ward等,(1986)Mol.Gen.Genet.203:468-478)上。然后使用连接混合物转化大肠杆菌GM 2163感受态细胞至阿泊拉霉素抗性。从产生的转化体中,分离出一个具有穿梭质粒pCEC061的克隆。然后使用这个质粒转化带小棒链霉菌NRRL 3585。在非选择性培养基上将所得的转化体连续进行两轮孢子形成,然后复制平板接种至包含抗生素的培养基上,以鉴别阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌肽-敏感转化体。根据此方法,选择四个推断的突变体(61-1A、-2A、-3A和-4A),用于进一步的分析。
为证实这些推断的突变体在orfup1中被破坏,由分离的61-1A和61-2A制备基因组DNA,用SacI消化,并接受DNA印迹分析。DNA印迹分析的结果符合发生的双交换,并证明这些突变体在orfup1中是真正的破坏置换突变体。
在大豆粉(Soya-Flour)培养基中培养突变体61-1A、-2A、-3A和-4A,通过HPLC分析它们的培养物上清液的棒酸和棒烷产量。除了用于HPLC分析的电泳缓冲液由0.1M NaH2PO4+6%甲醇,pH3.68(用冰醋酸调节)组成,先前报导了大豆粉培养基的组成和通过HPLC分析棒烷的方法(Paradkar和Jensen,1995出处同上)。HPLC分析表明,所述突变体没有产生可检测水平的棒烷-2-羧化物或2-羟甲基棒烷。而且,当使用Pruess和Kellett法(1983,J.Antibiot.36:208-212)对芽孢杆菌属菌种(Bacillus sp.)ATCC 27860培养物上清液进行生物测定时,所述突变体没有产生可检测水平的丙氨酰棒烷。相反,当与野生型对比时,所述培养物上清液的HPLC分析显示,所述突变体似乎产生高水平的棒酸(表1)。
表1
在摇瓶实验中orfup1突变体的棒酸效价(CA)
菌株 | 70小时 | 70小时 | 93小时 | 93小时 |
CAμg/ml | CAμg/mg DNA | CAμg/ml | CAμg/mg DNA | |
NRRL 3585#1 | 87 | 915 | 166 | 1963 |
NRRL 3585#2 | 66 | 790 | 159 | 1842 |
61-1A | 272 | 2894 | 439 | 6113 |
61-2A | 199 | 2148 | 225 | 2928 |
61-3A | 54 | 692 | 221 | 2585 |
61-4A | 0 | 0 | 226 | 2422 |
orfup1缺失
进行克隆实验,以在orfup1的AatII位点之间产生654个核苷酸的基因缺失。使用列于下文的寡核苷酸引物和上述pCEC061作为模板,产生PCR产物。改变原始核苷酸序列,以将一个PstI掺入到oligo11中,和将一个SphI位点掺入到oligo 14中。
用于产生PCR产物1的寡核苷酸对1
引物11 5′dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3′
引物12 5′dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3′
用于产生PCR产物2的寡核苷酸对2
引物13 5′dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3′
引物14 5′dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3′
使用GRI(Felsted,Dunmow,Essex,CM63LD)的PTC-200 Peltier循环变温加热器进行标准PCR反应。
使用引物11和12产生PCR产物1。这个产物大约1Kb,并包含从第二AatII位点起的orfup1羧基末端和下游区域。
使用引物13和14产生PCR产物2。这个产物大约1.1Kb,并包含从第一个AatII位点起的orfUp1氨基末端和上游区域。
按照使用手册(Strategene Ltd,Cambridge Science Park,MiltonRoad,Cambridge CB44GF)连接PCR产物2和用SrfI消化的pCR-ScriptAmp SK(+)。使用所述连接混合物转化Epicurian大肠杆菌XL1-BlueMRF′Kan超感受态细胞(由Strategene获得)至氨苄青霉素抗性(按照生产商的说明)。由获得的转化体分离质粒DNA,DNA限制酶切分析显示,7个克隆包含已经连接了PCR产物2的质粒。这些质粒之一称为pDES1。
用PstI和AatII消化PCR产物1,并通过琼脂糖凝胶电泳分级分离所得的DNA。使用Sephaglas band prep试剂盒(Pharmacia,StAlbans,Herts,ALI 3AW),从凝胶上切下并洗脱出1Kb片段。然后将所分离的片段与AatII和PstI消化的pDES1相连接。所述连接混合物用于转化大肠杆菌XL1-Blue感受态细胞(由Strategene获得)至氨苄青霉素(按照生产商的说明)。从所得的转化体中分离质粒DNA,限制酶切分析显示,1个克隆包含连接了PCR产物1的质粒。这个质粒称为pDES2。
为将pDES2引入到带小棒链霉菌中,进一步修饰所述质粒,以包含可以在链霉菌中起作用的复制起点。为达到这个目的,用EcoRI和HindIII消化pDES2的质粒DNA,并将所述质粒DNA连接到高拷贝数的链霉菌属载体pIJ486(6.2Kb:Ward等,(1986)Mol.Gen.Genet.203:468-478)上,所述pIJ486也用EcoRI和HindIII消化。所述连接混合物用于转化大肠杆菌(JM109)感受态细胞(Strategene Ltd)至氨苄青霉素抗性。从所得的转化体中分离质粒DNA,限制酶切分析显示,6个克隆具有包含pDES2的pIJ486。这些质粒之一称为pDES3。质粒pDES3用于转化带小棒链霉菌菌株,其中通过***阿泊拉霉素抗性基因(如上所述),已经破坏了orfup1基因。选择硫链丝菌肽抗性转化体,然后将这些转化体在非选择性的培养基上完成3轮孢子形成,并筛选丢失阿泊拉霉素抗性的转化体。根据这个方法鉴别出45个丧失阿泊拉霉素抗性的突变体。然后通过HPLC分析这些突变体,证实了象orfup1破坏体(disruptant)61-1A、61-2A、61-3A和61-4A一样,当在正常生产这些棒烷的条件下发酵时,这些菌株不能产生棒烷-2-羧化物和2-羟甲基棒烷。
B.
orfdwn1和orfdwn2
通过先用NcoI消化pCEC018(7.3kb),并释放1-kb包含大部分orfdwn1和一部分orfdwn2的亚片段,在orfdwn1和orfdwn2中产生缺失/置换突变体。通过琼脂糖凝胶电泳分级分离所述消化物,从所述凝胶中切下并洗脱出6.3-kb片段。然后将这个片段和具有aprr的NcoI-NcoI DNA片段相连接,并用于转化大肠杆菌XL1-Blue至阿泊拉霉素抗性。由这个实验获得一个克隆,但所获重组质粒的限制酶切分析显示,两个拷贝的所述阿泊拉霉素抗性片段已经连接入所述缺失质粒。为消除多余拷贝的aprr-片段,用NcoI消化所述质粒,并自身连接所述质粒。所述连接混合物用于转化大肠杆菌GM2163至阿泊拉霉素抗性。由所述转化体分离两个包含质粒pCEC052和pCEC053的克隆,所述两个质粒都只具有一个拷贝的所述aprr-片段;pCEC052具有相对于orfdwn1和2反方向的所述aprr-片段,而pCEC053具有在与orfdwn1和2相同的方向***的所述aprr-片段。
通过将BamHI消化的pCEC052和相似消化的pIJ486相连接,并转化大肠杆菌GM2163至阿泊拉霉素抗性,构建pCEC052穿梭质粒。由这个实验分离一个包含穿梭质粒pCEC060的克隆。这个质粒用于转化野生型带小棒链霉菌3585至阿泊拉霉素和硫链丝菌肽抗性。所得转化体在非选择性条件下完成两轮孢子形成,然后平板复制到包含抗生素的培养基上,以鉴别阿泊拉霉素抗性、硫链丝菌肽敏感菌落。选择三个推断的突变体(60-1A、-2A和3A)用于进一步的分析。
为确立这些推断突变体的身份,从菌株60-1A和60-2A中分离基因组DNA,用或者SacI,或者BstEII消化基因组DNA,并接受DNA印迹分析。由这个实验产生的杂交带和经历双交换事件的两种菌株一致,这证明这些突变体是真正的orfdwn1/2破坏置换突变体。
当在大豆粉培养基中培养这些突变体,并通过HPLC测定它们的培养物上清液时,所述突变体没有产生可检测水平的棒烷-2-羧化物或2-羟甲基棒烷。培养物上清液的生物测定显示,所述突变体也没能产生可检测水平的丙氨酰棒烷。同orfup1突变体一样,orfdwn1/2突变体能够产生高于野生型水平的棒酸(表2)。
表2
在摇瓶实验中orfdwn1/2突变体的棒酸效价(CA)
菌株 | 70小时 | 70小时 | 93小时 | 93小时 |
CAμg/ml | CAμg/mg DNA | CAμg/ml | CAμg/mg DNA | |
NRRL 3585#1 | 87 | 915 | 166 | 1963 |
NRRL 3585#2 | 66 | 790 | 159 | 1842 |
60-1A | 164 | 1872 | 260 | 2911 |
60-2A | 187 | 2013 | 108 | 1320 |
60-3A | 79 | 994 | 214 | 2161 |
orfdwn3
为破坏orfdwn3,用NcoI消化pCEC023(包括亚克隆到pSL1180的cas1下游DNA的3.7-kb片段),然后自身连接pCEC023。用连接混合物转化大肠杆菌后,分离一个具有质粒pCEC031的克隆。这个质粒仅保留编码一部分orfdwn2和不完整的orfdwn3的1.9kb NcoI-EcoRI片段。DNA序列检查显示,pCEC031在距orfdwn3翻译起始位点158bp处具有唯一的BstEII位点。所以,用BstEII消化pCEC031,用克列诺片段处理pCEC031,以产生平端,然后连接到平头阿泊拉霉素抗性盒上。所述连接混合物用于转化大肠杆菌GM2163至阿泊拉霉素抗性和氨苄青霉素抗性。选择两个分别包含pCEC050和pCEC051的转化体。限制酶切分析显示,在pCEC050中,所述阿泊拉霉素抗性盒以与orfdwn3相同的方向定向,而在pCEC051中,所述阿泊拉霉素抗性盒以与orfdwn3相反的方向定向。然后都用HindIII消化这两种质粒,并连接到相似消化的pIJ486上。然后将所述连接混合物分别用于转化大肠杆菌GM2163至阿泊拉霉素和氨苄青霉素抗性。从所得的转化体中分离穿梭质粒pCEC056(pCEC050+pIJ486)和pCEC057(pCEC051+pIJ486)。然后两种质粒都用于转化带小棒链霉菌NRRL 3585。
从每个转化实验中选择一个转化体,并在非选择性培养基中完成两轮连续的孢子形成,然后平板复制到包含抗生素的培养基中,以鉴别阿泊拉霉素抗性和硫链丝菌肽敏感转化体。根据这个方法从每个原始转化体的后代中分离两个推断的突变体。(对于pCEC056为56-1A和56-3A,而对于pCEC057为57-1C和57-2B)。
为确立这些推断突变体的身份,从这些菌株中分离基因组DNA,用或者SacI,或者Acc65I消化基因组DNA,并接受DNA印迹分析。由这个实验产生的杂交带和经历双交换事件的两种菌株一致,这证明这些突变体是真正的orfdwn3破坏置换突变体。
当在大豆粉培养基中培养这些菌株,并通过HPLC测定它们的培养物上清液时,所述突变体产生大大降低水平的棒烷-2-羧化物或2-羟甲基棒烷。所述培养物上清液的生物测定显示,所述突变体也没能产生可检测水平的丙氨酰棒烷。同所述orfup1和orfdwn1/2突变体一样,所述orfdwn3突变体能够产生高于野生型水平的棒酸(表3)。
表3
在摇瓶实验中orfup3突变体的棒酸效价(CA)
菌株 | 71小时 | 71小时 | 93小时 | 93小时 |
CAμg/ml | CAμg/mg DNA | CAμg/ml | CAμg/mg DNA | |
NRRL 3585#1 | 180 | 1580 | 193 | 1790 |
NRRL 3585#2 | 179 | 1640 | 266 | 2310 |
56-1A | 34 | 110 | 235 | 2160 |
56-3A | 225 | 2140 | 274 | 2740 |
57-1C | 253 | 2910 | 277 | 2920 |
57-2B | 242 | 2240 | 193 | 1860 |
本申请公开了下列核苷酸序列:
SEQ ID No.1: 图1的DNA序列
SEQ ID No.2: orfup3序列
SEQ ID No.3: orfup2序列
SEQ ID No.4: orfup1序列
SEQ ID No.5: orfdwn1序列
SEQ ID No.6: orfdwn2序列
SEQ ID No.7: orfdwn3序列
SEQ ID No.8: 寡核苷酸引物11序列
SEQ ID No.9: 寡核苷酸引物12序列
SEQ ID No.10: 寡核苷酸引物13序列
SEQ ID No.11: 寡核苷酸引物14序列
图1:包括cas1和cas1侧翼的带小棒链霉菌染色体的核苷酸序列
NcoI . . . . . .
1 GGTACCGCCCGCCGCCGACGGGGCCTCGGAGCCGGCCTGGCCACTGGTCCTGGTGGGGCC 60
M A P P P Q G P A E A P G T V L V V G
. . . . . .
61 ACCCTATCACCGGGCGGTGGGCCGCGTCGTCTGAGGGCCTGTGCCTGGGCACCCACACGC 120
T P Y H G A V R R L L S G S V S G H T H
. . <orfup3 . . .
121 GCCTTTCCGGGCCTCCGGCCCAGTGTCGGTGCCCATTGCGCGCCACAGGAACGGGCGCAT 180
* L W P Y R A T D K G A Y
A S L G P P R T M
. . . . . .
181 TAGCCCCAGGTCTATCTGCTTCCGGGCCACCTGCTCCTTCAGGGCGTGGAGCATCTGGCA 240
D P D L Y V F A R H V L F D R V E Y V T
. . . . . .
241 CGTGGTCGCGGGCCGCCGGGTGAGCCCCAGTGGGCGGGCGGTGCCGGGCAGGGCCACGAG 300
C W R G A A W E P D G A R W P G D R H E
. . . . . .
301 TGGCACCCACCACGGGAGGCGCCGCTCCTCAAGCCAGGGCCAGTCTTAGGTCAACTGCCT 360
G H T T G E A A L L E T G T L I W N V S
. . . . . .
361 GGTGTCTACCACCCACTAGCTCGCCTACCACGGGGGCTCCAGCAGCTTCTCGGCCCGCTA 420
W L H H T I S R I T G G L D D F L R A I
. . . . . .
421 GAGCCTGAACGGGGCCCGGTCTGGGGTGAACCCCTTCTTCTTCTGGCGCAGGAGCCGCTT 480
E S K G R A L G W K P F F F V A D E A F
. . . . . .
481 CATCAGCTAGCGCCCCCACGGCAGCGACGGCTGCGGCGGCAACAGCTTGCGGAACTTCAT 540
Y D I A P T G D S G V G G N D F A K F Y
. . . . . <orfup2
541 GCGCCACTACTGGCGGAACGCGACGAGCAGGCAGTATGGCCGGCTACGGTGCCTGTACTT 600
A T I V A K R Q E D T M G A S A V S M
. . . . . .
601 TGCTGGAGGTCTCTAAGGCCCACCGACACGACCCCGACGCCTTCCCCACAGGGGGCGCTT 660
. . . . . .
661 CCTGCCGCCTGCGGCGCCTGCGGCGCCGGCAGAGGGGCCGCCTGCCCAGGGTCGCAGGAC 720
. . . . . .
721 CTCTCCCGAACCGCCGCCGAACTGCGGCACGACAGGGCGCCGAACGCCTTGCGCTTCATG 780
. . . . . .
781 GCCGGTCGCATGCCCGCAACGTGGCCTGCACATGCGGCCAGCCCTGGGGAGCATGGGGGC 840
. . . . . .
841 CTCGGCCGGCTGGGGCCGCCGAGGCCCCCATGCCTGCGCGGCCTGGCCGGGCTCGCTCGG 900
. . . . . .
901 CCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCTGGCCTGCC 960
. . . . . .
961 ACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCC 1020
. . . . . .
1021 GTGCGGCCTGCCCAGTCAACGGCTAGTACCGCTCGTTACGGCCCCACATGGCGAGGGGCC 1080
* N G I M A L L A P T Y R E G
. . . . . .
1081 TGTGGCCCACCCTCTAGCGCCGGCAGTGGAGGCGCTCCCTGGCCAGCAGGTCGGCCTAGC 1140
S V P H S I A A T V E A L S R D D L R I
. . . . . .
1141 TCCGCCGCCGCTCTAACAGGCGCTCTACCCGGCCCAAGCGCCACGGGCCCTAGCCCTGCT 1200
S A A A L N D A L H A P N A T G P I P V
. . . . . .
1201 GCAGGAGCGGGGCCACCACGTCGGTCCGCTCGCGCTCGACACGGTCCCAGTCGGGGTCTG 1260
V D E G R H H L W A L A L Q A L T L G L
. . . . . .
1261 GCAGGCGCTGGCCCGCGTCGGCCACGTCGTTGCTCGCCAACGCGCGCTCCCGGCCTCGCG 1320
G D A V P R L R H L L S R N R A L A P A
. . . . . .
1321 ACTTGGCCCCGACCGGGGCCGCCTTCAGGAGCAGGGGGTCTAGCAGCCACCACGCCTACC 1380
S F R P Q G R R F D E D G L D D T T R I
. . . . . .
1381 ACGGCCACTCTTTTGGGGCAGGGTCTCCCCGCATTCGCTGCTAGGGCTAGGGGTCGAGGG 1440
T G T L F G R G L P A Y A V I G I G L E
. . . . . .
1441 CCGTCTGCCCGTGGTGGAGCAGGAGCTAGGGCGCGCTGGTGTCCGAGGTGAGCGAGACGT 1500
R C V P V V E D E I G R S W L S W E S Q
. . . . . .
1501 GGCGGCAGTGGCCCACGTGGCGCAGGCGGGCCGCGTCGCACCGGCGCCTCCCGAGCCTCT 1560
V A T V P H V A D A R R L T A A S P E S
. . . . . .
1561 CTGGCTCGGACGCCTGGAACGGGAGCGCGTGGTCGAGCCGGTGGCGTGGGTGCCAGAGGA 1620
L G L R R V K G E R V L E A V A G V T E
. . . . . .
1621 GCTAGCCGTGGCGGCCCAGGCAGGTCACGACCATCATGTCCAGCTACGCCAGCCACGGCT 1680
E I P V A P D T W H Q Y Y L D I R D T G
. . . . . .
1681 CTGCTGCGTCCCTGGCAAGCGTCCGGCGCGCCTGCATCCTGCCGAGCGGCGTGTTCGGGA 1740
L R R L S R E C A A R V Y S P E G C L G
. . . . . .
1741 CCCTCCGCGGCAGCCTGCTCGCGTGGTACGGCTTGAACCACCGCTAGTCGTGGAGCAGGG 1800
Q S A G D S S R V M G F K T A I L V E D
. . . . . .
1801 CCGCCGGGCGCTGGCGGGCAGGCTCGTCGAGGAGTGGCCGCGGCTCGGGGACCTGCAGCC 1860
R R G A V A R G L L E E G A G L G Q V D
. . . . . .
1861 GCCACAGGTCGTCCCACTGGGGCCGCAGCTGCCGCCGCGCCTACCACCGGCAGCGGGCCC 1920
A T D L L T V G A D V A A R I T A T A R
. . . . . .
1921 GCGCCAGGCCCGCAGGCATCTTCAGCCACCAGCCGTCCGTCGGCTCGGGGACCCGTGACT 1980
A R D P R G Y F D T T P L C G L G Q A S
. . . . . .
1981 GGCCTTCCAGGGCGTCCCGCGCCTGGCCGCCTGCGCCTTGGCGCCGCCTGTGCCTTGGCC 2040
V P L D R L A R V P P R P V A A S V S G
. . <orfupI . . .
2041 CCGGGGACTCGGGCGGAGAGCGGGACATACGGAACCTCCACAGGCGGAGCCGGGAACGGG 2100
GGCCCCTGAGCCCGCCTCTCGCCCTGTATGCCTTGGAGGTGTCCGCCTCGGCCCTTGCCC
A P S E P P S R S M
. . . . . .
2101 ACGAGGGCGAGGACGGGACGGAACGAAGGAGAGGACGGGACGGACAGCACGGACGGGACG 2160
TGCTCCCGCTCCTGCCCTGCCTTGCTTCCTCTCCTGCCCTGCCTGTCGTGCCTGCCCTGC
. . . . . .
2161 GACGGAACGGAGTCGGGAACCGGGGGGGGTGACCGGAACCGGGCCGTCCTTGGCCCTCCC 2220
CTGCCTTGCCTCAGCCCTTGGCCCCCCCCACTGGCCTTGGCCCGGCAGGAACCGGGAGGG
. . . . . .
2221 CCGTCCTCCCCGCCATCCGCCGTTCTCCCCCGTTCCCTCTCCCGTCCTCCAGCCAACACC 2280
GGCAGGAGGGGCGGTAGGCGGCAAGAGGGGGCAAGGGAGAGGGCAGGAGGTCGGTTGTGG
. . . . . .
2281 GCCGCCCTTTCCAAGCGCTTGACACGGCACCGACAGCCGCCGCCGGGCGCCCGATGGGGA 2340
CGGCGGGAAAGGTTCGCGAACTGTGCCGTGGCTGTCGGCGGCGGCCCGCGGGCTACCCCT
. . . . . .
2341 CCCGTGCCCGCCGGTGAGCGGCGGTGAGCGCCGGTACGGGACCCCACGCGCCGCCGCCCG 2400
GGGCACGGGCGGCCACTCGCCGCCACTCGCGGCCATGCCCTGGGGTGCGCGGCGGCGGGC
. . . . . .
2401 GGCGCCCGCCAGGGCCCGCGCGGCCACCCCGGCCCGCCCCGGCCGGAGCGGCGATCCGGG 2460
CCGCGGGCGGTCCCGGGCGCGCCGGTGGGGCCGGGCGGGGCCGGCCTCGCCGCTAGGCCC
. . . . . .
2461 CCGCTCGCTGCAAGAGGAACATCCACAGCCGCACAAGGAGCGCTCCGCACAGTGGGCACC 2520
GGCGAGCGACGTTCTCCTTGTAGGTGTCGGCGTGTTCCTCGCGAGGCGTGTCACCCGTGG
. . . . . .
2521 ACGTCCGCCCCGTCCCCCACACCGTGGCCGGTCCCCACCGGACAGCACAGCACCGCACAG 2580
TGCAGGCGGGGCAGGGGGTGTGGCACCGGCCAGGGGTGGCCTGTCGTGTCGTGGCGTGTC
. . . . . .
2581 CACCACATCGCACGGCACAGCACAGCACCACCGGCACGAGGAACCAAGGAAAGGAACCAC 2640
GTGGTGTAGCGTGCCGTGTCGTGTCGTGGTGGCCGTGCTCCTTGGTTCCTTTCCTTGGTG
casl>
M T S V D C T A Y G P E L R A L A A
2641 ACCACCATGACCTCAGTGGACTGCACCGCGTACGGCCCCGAGCTGCGCGCGCTCGCCGCC 2700
TGGTGGTACTGGAGTCACCTGACGTGGCGCATGCCGGGGCTCGACGCGCGCGAGCGGCGG
. . . . . .
2701 CGGCTGCCCCGGACCCCCCGGGCCGACCTGTACGCCTTCCTGGACGCCGCGCACACAGCC 2760
R L P R T P R A D L Y A F L D A A H T A
. . . . . .
2761 GCCGCCTCGCTCCCCGGCGCCCTCGCCACCGCGCTGGACACCTTCAACGCCGAGGGCAGC 2820
A A S L P G A L A T A L D T F N A E G S
. . . . . .
2821 GAGGACGGCCATCTGCTGCTGCGCGGCCTCCCGGTGGAGGCCGACGCCGACCTCCCCACC 2880
E D G H L L L R G L P V E A D A D L P T
. . . . NcoI . .
2881 ACCCCGAGCAGCACCCCGGCGCCCGAGGACCGCTCCCTGCTGACCATGGAGGCCATGCTC 2940
T P S S T P A P E D R S L L T M E A M L
. . . KpnI. . .
2941 GGACTGGTGGGCCGCCGGCTCGGTCTGCACACGGGGTACCGGGAGCTGCGCTCGGGCACG 3000
G L V G R R L G L H T G Y R E L R S G T
. . . . . .
3001 GTCTACCACGACGTGTACCCGTCGCCCGGCGCGCACCACCTGTCCTCGGAGACCTCCGAG 3060
V Y H D V Y P S P G A H H L S S E T S E
. . . . . .
3061 ACGCTGCTGGAGTTCCACACGGAGATGGCCTACCACCGGCTCCAGCCGAACTACGTCATG 3120
T L L E F H T E M A Y H R L Q P N Y V M
. . . . . .
3121 CTGGCCTGCTCCCGGGCCGACCACGAGCGCACGGCGGCCACACTCGTCGCCTCGGTCCGC 3180
L A C S R A D H E R T A A T L V A S V R
. . . . . .
3181 AAGGCGCTGCCCCTGCTGGACGAGAGGACCCGGGCCCGGCTCCTCGACCGGAGGATGCCC 3240
K A L P L L D E R T R A R L L D R R M P
. . . . . .
3241 TGCTGCGTGGATGTGGCCTTCCGCGGCGGGGTGGACGACCCGGGCGCCATCGCCCAGGTC 3300
C C V D V A F R G G V D D P G A I A Q V
. . . . . .
3301 AAACCGCTCTACGGGGACGCGGACGATCCCTTCCTCGGGTACGACCGCGAGCTGCTGGCG 3360
K P L Y G D A D D P F L G Y D R E L L A
. . . . . .
3361 CCGGAGGACCCCGCGGACAAGGAGGCCGTCGCCGCCCTGTCCAAGGCGCTCGACGAGGTC 3420
P E D P A D K E A V A A L S K A L D E V
. . . . . .
3421 ACGGAGGCGGTGTATCTGGAGCCCGGCGATCTGCTGATCGTCGACAACTTCCGCACCACG 3480
T E A V Y L E P G D L L I V D N F R T T
. . . . . .
3481 CACGCGCGGACGCCGTTCTCGCCCCGCTGGGACGGGAAGGACCGCTGGCTGCACCGCGTC 3540
H A R T P F S P R W D G K D R W L H R V
. . . . . .
3541 TACATCCGCACCGACCGCAATGGACAGCTCTCCGGCGGCGAGCGCGCGGGCGACGTCGTC 3600
Y I R T D R N G Q L S G G E R A G D V V
A F T P R G * SacI . . . .
3601 GCCTTCACACCGCGCGGCTGAGCTCCCGGGTCCGACACCGCGCGGCTGAACCCACGGTCC 3660
CGGAAGTGTGGCGCGCCGACTCGAGGGCCCAGGCTGTGGCGCGCCGACTTGGGTGCCAGG
. . . . . .
3661 GGGGCCCACGGTCCGGCACCGCGCGGCTGAGCCCCCGGGTCCGGCAGCGGGCGGCTGAAC 3720
CCCCGGGTGCCAGGCCGTGGCGCGCCGACTCGGGGGCCCAGGCCGTCGCCCGCCGACTTG
. . . . . .
3721 CCCCGCCCCGGGCCACCGCCCGACCGCCCCCGCGCACCGGACGCGCCCGCCTGTACGGCG 3780
GGGGCGGGGCCCGGTGGCGGGCTGGCGGGGGCGCGTGGCCTGCGCGGGCGGACATGCCGC
. . . . . .
3781 GTCCCGCCCGGGCCCGTACACCTGAAGCGCCCGGCGGACCGCCGCCCCGCCGGGGGACGG 3840
CAGGGCGGGCCCGGGCATGTGGACTTCGCGGGCCGCCTGGCGGCGGGGCGGCCCCCTGCC
----------------> <---------------- . .
3841 ACAGAGCCGGGTGCGGGAGGACGTCCTCCCGCACCCGGCTCCCACCGTTCCGCACCGACC 3900
TGTCTCGGCCCACGCCCTCCTGCAGGAGGGCGTGGGCCGAGGGTGGCAAGGCGTGGCTGG
. . . . . .
3901 GCACCCGACCGTGCCGCAGGCGCCACCGGCACCGCACCGCCCGCGCCGGCAGCCACCACA 3960
CGTGGGCTGGCACGGCGTCCGCGGTGGCCGTGGCGTGGCGGGCGCGGCCGTCGGTGGTGT
. . . . . .
3961 GGCGCCACGCCGCCCGCACGGTGCCCGCGCTGCTCAGCCCCCGTCCACCGGGCTGTCCAG 4020
CCGCGGTGCGGCGGGCGTGCCACGGGCGCGACGAGTCGGGGGCAGGTGGCCCGACAGGTC
* G G D V P S D L
. . . . . .
4021 GTCGGCGGCGTCGCGCGGGGGCTACTTGAGGGCCAGCCGCCGGCTGGGGGGCCTGGGGCG 4080
L R R L A G G I F E R D A A S G G S G A
. . . . . .
4081 CTCTACGGGGGTGTGAGGGCCCTAGTGGAGGTCGCTCCGTATGCCGTCGTCTAGCCGGTG 4140
L H G W V G P I V E L S A Y P L L D A V
. . . . . .
4141 GGCGAAGAGCAGGAGCTGCCGCTTTGTGTGCAGGTCCCGCGGGCCGTCGTGGTGCCGGGC 4200
R K E D E V A F C V D L A G P L V V A R
. . . . . .
4201 GCGGCACTGCCTCCGGTCGCGGCGGAGCTGCGAGGGGGGCCGGGGCCCACAGCGGGGGTG 4260
A T V S A L A A E V S G G A G P T A G V
. . NcoI . . . .
4261 TAGGCACAAGAGGGTCCACGCGTGGTACCACTCGTCTAGGCGCCGCGGCCCGGGCCTCTC 4320
D T N E W T R V M T L L D A A G P G S L
. . . . . .
4321 CTTCTGGACGAGGGTCTTCGGCCACTCCATGAGGAGCGCCCACCGCTTTGGGTCGAGGGC 4380
F V Q E W F G T L Y E E R T A F G L E R
. . . . . .
4381 CACCCGTGCCGCCCGGGTCTTCCTTGCGCTCCAGGGGGTGGGCCGCTTGTGGGCCGGGCG 4440
H A R R A W F S R S T G W G A F V R G A
. . . . . .
4441 GCGGAAGGCGGGGGCGAGGGGCCGCAGCCGCGACTCGCGGCGCCGGTCTGGCCTGTCGTC 4500
A K R G R E G A D A S L A A A L G S L L
. . . . . .
4501 CTGGTCCGACACGCCCGACGAGTGGCCGCGGGGCGTCTAGCCCCGCTAGGCCGCGTGGTA 4560
V L S H P S S V P A G C I P A I R R V M
. . . . . .
4561 GGGGCCTACGCTGTGCCGGGTGACCATCCGCACCCGGCGCGGGTAGCTGGTCGGGCACTG 4620
G P H S V A W Q Y A H A A G M S W G T V
. . . . . .
4621 GTCCCGGTCAAGGGCATGGGGGTCGAGGAGCCACTCGTCGGCCACGACGCGGCGCTGTAA 4680
L A L E R V G L E E T L L R H Q A A V N
. . . . . .
4681 CAGGACGCCTCACTAGTCGCCTTTCGCCCTGGGGCTGCCCACCAACGGCCCGCTCGACCT 4740
D Q P T I L P F R S G S P H N G P S S S
. . . . . .
4741 CTGGGGCAACGGCTTCTCAGGCCGCCACTGCTGCGTCATGGCGGCCCACAGGTCGCCGTC 4800
V G N G F L G A T V V C Y R R T D L P L
. . . . . .
4801 GGGGCGTGGCTAGTCGGTCAGCATGGGCCACACCAGGGCCGGCTTCTTGCTGCCTGTCTC 4860
G A G I L W D Y G T H D R G F F S P C L
. . . . . .
4861 GTGGTGCAAGCAGGGCAGCCGCAAGCCGCACGGCATGTACCGCATTGGCTAGGCCCGCAG 4920
V V N T G D A N P T G Y M A Y G I R A D
. . . . . <orfdwn1
4921 GGCGTCCTGGAGGGGCAGGTCGTTGCCGTCAAGCAGCTAGAGCTTATACGCCGTAAGGTG 4980
R L V E G D L L P L E D I E F I R C E M
. . . . . .
4981 GCGACTGGAGGAACAAGCTAGGGGGGCCTGTTGTCCAGCCAGCACCGGCCTCTGAGTCTC 5040
* L
. . . . . .
5041 GGTCAACCCCCGCTAGAGCCACCGGGTGTCGAGGTCCGACGCGTCGACCTGTAGCACGCC 5100
W N P A I E T A W L E L S R L Q V D H P
. . . . . .
5101 CTAGTCGGGCCTCATGACCGTGACCTCGTCTATGAGGCCTAGCACGGCGAGGTGGTCGAA 5160
I L G S Y Q C Q L L Y E P D H R E V L K
. . . . . .
5161 GAGCTAGTACGCCAACTACAGCAGGCCCCACGGCTGGGTGAGGTCGGGGGCCAGCTGGTC 5220
E I M R N I D D P T G V W E L G R D V L
. . . . . .
5221 CCAGAACATCAGGCTCGGCTAGCCTGGGCAGAGCGGCCAGCGCGCGTCGCGGAGCCACTT 5280
T K Y D S G I P G T E G T A R L A E T F
NcoI . . . . . .
5281 CGGGTACCCCGGCTTGGTCAAGAGCTTCTACTTCGGCGGCGGCGCCCTGCGGGTCACCAC 5340
G M P G F W N E F I F G G G R S A W H H
. . . . . .
5341 CCGGAGCGGCCTCAGGGCCCTCTGGTCCTGCAGGAAGTAGTGGGGCTGGGCGAGCGGGGC 5400
A E G S D R S V L V D K M V G V R E G R
. . . . . .
5401 GGCGTCCCACGGCACCGGGCGGCGGAGCCGGAGGAGGGCCATCTACAGGTAGTCGGCCCG 5460
R L T G H G A A E A E E R Y I D M L R A
. . . . . .
5461 CTGCTAGACCAGCAGCCACAAGTAGTCCTAGCCGTGGTGCGGGAGGGCCCGTGTCTTGGC 5520
V I Q D D T N M L I P V V G E R A C F R
. . . . . .
5521 CTTGCACAGGAGTGACTTCGACTTGCCGACCTTCTGCCCGCCCACCCCCGCGACCATCCC 5580
F T D E S F S F P Q F V P P H P R Q Y P
. . . . . .
5581 GAACCCGCGCTACGGGTGGAGCGCCTACTGCGGCAAGAGCAGCTCCGGGGCCGGCATCGC 5640
K P A I G V E R I V G N E D L G R G Y R
. . . . . .
5641 CGCGTGGCGGAGCATCCCCTTGAGGTCCAGGCCGTGGCCCTAGCAGGTGACGAGGGGCCT 5700
R V A E Y P F E L D P V P I T W Q E G S
. . . . . .
5701 CACCCACTTGCAGAGCCAGCAGGTGCGGAAGAACTACTAGAGGGTCACGAGGAGCTTCTC 5760
H T F T E T T W A K K I I E W H E E F L
. . . . . .
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A R N R R D R E G A D S L T G G V G Y V
. . . . . .
5821 GACGGGGTACTACAGCCGGGTCGCGAAGACCTTGGGCGCGCGCTAGGGCTGCTTCCGCGC 5880
Q G M I D A W R K Q F G R A I G V F A R
. . . . . .
5881 CGGGGCCCAGTACACCAGCTCGTAGCGGTCTAGGAGCCGGTCGGCGTCGCCTAACACGTC 5940
G R T M H D L M A L D E A L R L P N H L
. . . . . .
5941 GCCGTCCTGCAACCGGTAGACCGGCTGGGCCTACACGGCCCAGACGTACGGCTCCATCTC 6000
P L V N A M Q G V R I H R T Q M G L Y L
. . . . . .
6001 GGGGTCGTACTAGCCCAACAACCTCTGGAGCTTTGGGAGCCACACCTTCACCACGAGCCA 6060
G L M I P N N S V E F G E T H F H H E T
. . . . . .
6061 CTTCCTGTCAGGGGTCATCGGCTCAAGCAGCCGGCGGACGCGGACGGCCCACTCGACGGC 6120
F S L G W Y G L E D A A Q A Q R T L Q R
. . . . . .
6121 CTCGTACAAGACCATCAAGACGCCTAACTGGGGGCGGTATGGGGCGACCTGGACGCGTAC 6180
L M N Q Y N Q P N V G A M G R Q V Q A H
. . . <orfdwn2 . .
6181 ACTGCCGACCGTTGGCAGATAGAAGAGAATGGACTTCACCCTGGCTCCTCCGGTTCGCGG 6240
TGACGGCTGGCAACCGTCTATCTTCTCTTACCTGAAGTGGGACCGAGGAGGCCAAGCGCC
S G V T P L Y F L I S K M
. . . . . .
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GCGGGAGGTAACTGCACGCGGCTTTCGCCGAGCTGGCAGGGTGAGGCGGGAACTCAAGGC
. . . . . .
6301 TCTGACGCCGCGCCAGTCGGCGGGCCGTCCGCCGGGGTGCCCGCCGGGGTCCGCACCCGC 6360
AGACTGCGGCGCGGTCAGCCGCCCGGCAGGCGGCCCCACGGGCGGCCCCAGGCGTGGGCG
. . . . . .
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GCCTGCCGTGCCGCGCGTGGCGCGCGCGCCGCGAAGCCCCGTGGCCCGAGCTGCCCCACG
. . . . . .
6421 TCAGCGGGACGTCCAACGGAAGGCAAGCCCCCGTACCCAGCCTGGTCAAGGCGCTCATCG 6480
AGTCGCCCTGCAGGTTGCCTTCCGTTCGGGGGCATGGGTCGGACCAGTTCCGCGAGTAGC
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. . . . . M P G
6481 CCATTCCCTGAGGAGGTCCCGCCTTGACCACAGCAATCTCCGCGCTCCCGACCGTGCCCG 6540
GGTAAGGGACTCCTCCAGGGCGGAACTGGTGTCGTTAGAGGCGCGAGGGCTGGCACGGGC
. . . . . .
6541 GCTCCGGACTCGAAGCACTGGACCGTGCCACCCTCATCCACCCCACCCTCTCCGGAAACA 6600
S G L E A L D R A T L I H P T L S G N T
. . . . . .
6601 CCGCGGAACGGATCGTGCTGACCTCGGGGTCCGGCAGCCGGGTCCGCGACACCGACGGCC 6660
A E R I V L T S G S G S R V R D T D G R
. . . . . .
6661 GGGAGTACCTGGACGCGAGCGCCGTCCTCGGGGTGACCCAGGTGGGCCACGGCCGGGCCG 6720
E Y L D A S A V L G V T Q V G H G R A E
. . . . . .
6721 AGCTGGCCCGGGTCGCGGCCGAGCAGATGGCCCGGCTGGAGTACTTCCACACCTGGGGGA 6780
L A R V A A E Q M A R L E Y F H T W G T
. . . . . .
6781 CGATCAGCAACGACCGGGCGGTGGAGCTGGCGGCACGGCTGGTGGGGCTGAGCCCGGAGC 6840
I S N D R A V E L A A R L V G L S P E P
. . . . . .
6841 CGCTGACCCGCGTCTACTTCACCAGCGGCGGGGCCGAGGGCAACGAGATCGCCCTGCGGA 6900
L T R V Y F T S G G A E G N E I A L R M
. . . . . .
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A R L Y H H R R G E S A R T W I L S R R
. . . . . .
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S A Y H G V G Y G S G G V T G F P A Y H
. . . . . .
7021 ACCAGGGCTTCGGCCCCTCCCTCCCGGACGTCGACTTCCTGACCCCGCCGCAGCCCTACC 7080
Q G F G P S L P D V D F L T P P Q P Y R
. . . . . .
7081 GCCGGGAGCTGTTCGCCGGTTCCGACGTCACCGACTTCTGCCTCGCCGAACTGCGCGAGA 7140
R E L F A G S D V T D F C L A E L R E T
. . . . Sau
7141 CCATCGACCGGATCGGCCCGGAGCGGATCGCGGCGATGATCGGCGAGCCGATC
I D R I G P E R I A A M I G E P I
Claims (9)
1.一种分离的DNA,其含有一个或多个特异于带小棒链霉菌的5S棒烷生物合成的基因,其中所述DNA不是生物合成棒酸所必需的以及其中所述基因包括一个选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6和SEQ ID No.7的开放读框。
2.选自以下的载体:
a)包含权利要求1的DNA的载体;
b)包含权利要求1的DNA的载体,其中一种或多种5S棒烷生物合成特异的基因已经被破坏或成为缺陷型;和
c)载体pCEC060、pCEC061、pCEC056、pCEC057或pDES3。
3.含有权利要求2的载体的宿主。
4.权利要求3的宿主,所述的宿主是带小棒链霉菌。
5.带小棒链霉菌,其含有对应5S棒烷生物合成所必需的一个或多个开放读框的DNA,所述开放读框选自orfup1(SEQ ID No.4)、orfdwn1(SEQ ID No.5)、orfdwn2(SEQ ID No.6)及orfdwn3(SEQ IDNo.7),其中一个或多个所述开放读框通过定点诱变被破坏、缺失或突变。
6.一个改善带小棒链霉菌的棒酸生产的方法,包括处理权利要求1的DNA,其中一个或多个选自SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQID No.6和SEQ ID No.7的开放读框通过定点诱变被破坏、缺失或突变,然后通过基因置换被***在带小棒链霉菌中。
7.选自以下的微生物:
(a)通过权利要求6的方法可获得的微生物,所述微生物能够产生5R棒烷、且低产或不产5S棒烷;
(b)所述微生物是菌株56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、60-1A、60-2A、60-3A、61-1A、61-2A、61-3A或61-4A。
8.权利要求7的微生物,其中(a)中所述微生物能够产生棒酸,但其低产或不产生棒烷-2-羧化物和/或2-羟甲基棒烷。
9.用于制备包含棒酸钾和阿莫西林的组合物的方法,所述方法包括由权利要求5的带小棒链霉菌产生棒酸,以及随后将所述棒酸转化成钾盐,并将所述钾盐和阿莫西林组合。
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