JP4227199B2 - 多量のクラブラン酸を産生する微生物 - Google Patents
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Description
微生物とりわけストレプトミセス(Streptomyces)種はクラブラン酸ならびに他のクラバム、セファロスポリン、ポリケチド、セファマイシン、ツニカマイシン、ホロマイシンおよびペニシリンを包含する多くの抗生物質を産生する。微生物が産生するこれらの抗生物質の絶対および相対量を操作できるというのは非常に興味深いことであり、従って生合成経路の代謝および遺伝メカニズムを調査するために非常に多くの研究が為されている[Domain,A.L.「Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics」、50years of Pensillin applications,history and trendsより]。代謝経路の種々の工程で作用する多くの酵素およびこれらの酵素をコードする遺伝子が知られている。
クラバムはその環の立体化学により任意に二つの群に分けられる(5Sおよび5Rクラバム)。5Rおよび5Sクラバムの生合成に関する生化学的経路は十分には解明されていないが、これらのクラバムが同一の出発ユニットに由来することが示唆されている(未だ同定されていない三炭素化合物[Townsend,C.A.およびHo,M.F.、J.Am.Chem.Soc.107(4):1066-1068(1985)並びにElson,S.W.およびOliver,R.S.、J.Antibiotics XXXI(6):568(1978)]およびアルギニン[Valentine,B.P.ら、J.Am.Chem.Soc.15:1210-1211(1993)]並びにいくつかの共通する中間物質[Iwata-Reuyl,D.およびC.A.Townsend、J.Am.Chem.Soc.114:2762-2763(1992)並びにJanc,J.W.ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2313-2316(1993)]を共有する)。
5Sクラバムの例としてはクラバム−2−カルボキシレート(C2C)、2−ヒドロキシメチルクラバム(2HMC)、2−(3−アラニル)クラバム、バルクラバムおよびクラバミン酸(GB1585661、Rohl,F.ら、Arch.Microbiol.147:315-320、US4202819)が挙げられる。しかしながら5Rクラバムにはあまり例がなく、最もよく知られているのはβ−ラクタマーゼインヒビターのクラブラン酸であり、これはストレプトミセス・クラブリゲルス(Sreptomyces clavuligerus)の醗酵により産生される。クラブラン酸はクラブラン酸のカリウム塩の形態で、抗生物質AUGMENTIN(商標SmithKline Beecham)ではβ−ラクタムアモキシシリンと組み合わせている。商業上、クラバムの生合成を理解するための研究は、エス・クラブリゲルス(S.clavuligerus)による5Rクラバム、クラブラン酸の生合成に集中している。クラブラン酸の生合成に関係する多くの酵素およびそれらの遺伝子が同定され、かつ公開されている。例えば、このような公開物としては、Hodgson,J.E.ら、Gene 166:49-55(1995)、Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46(1994)、Paradkar,A.S.ら、J.Bact.177(5):1307-1314(1995)が挙げられる。反対に、エス・クラブリゲルス(S.clavuligerus)のクラブラン酸生合成経路においてクラバミン酸シンターゼの作用により産生されるクラブラン酸前駆体であるクラバミン酸以外の5Sクラバムの生合成および遺伝学についてはなにも知られていない。
遺伝子クローニング実験により、エス・クラブリゲルスが2種のクラバミン酸シンターゼイソ酵素、cas1およびcas2[Marsh,E.N.ら、Biochemistry 31:12648-12657(1992)]を含有し、これらは共に特定の栄養条件下でクラブラン酸産生に寄与できる[Pardkar,A.S.ら、J.Bact.177(5):1307-1314(1995)]ことが証明されている。クラバミン酸シンターゼ活性はまた別のクラブラン酸産生微生物、すなわちエス・ジュモンジネンシス(S.jumonjinensis)[Vidal,C.M.ES550549(1987)]およびエス・カツラハマヌス(S.katurahamanus)[Kitano,K.ら、JP53-104796(1978)]並びに5Sクラバム、バルクラバムを産生するエス・アンチビオティコス(S.antibioticos)[Baldwin,J.E.ら、Tetrahedron Letts.35(17):2783-2786(1994)]においても検出されている。後者の文献ではエス・アンチビオティコスが、クラブラン酸生合成に関与することがわかっているもう一つ別の酵素であるプロカルバミン酸アミジノヒドロラーゼ活性を有することも報告されている。クラバム生合成に関与するとして同定されたエス・クラブリゲルスのその他の全ての遺伝子がクラブラン酸生合成に必要であると報告されている[Hodfson,J.E.ら、Gene 166:49-55(1995)、Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46(1994)]が、今のところ5Sクラバムの生合成に特異的な遺伝子は報告されていない。
この度、本発明者らは、エス・クラブリゲルスにおいて5Sクラバム、例えばC2Cおよび2HMCで例示される生合成に特異的な特定の遺伝子を同定した。従って、本発明はエス・クラブリゲルスの5Sクラバム生合成に特異的であるが5Rクラバム(例えばクラブラン酸)生合成には必須でない1個またはそれ以上の遺伝子を含んでなるDNAを提供する。
本明細書で用いる「遺伝子」なる用語はまた、遺伝子機能または発現に必要ないずれの制御領域をも包含する。好ましい態様において、DNAは図1のように同定されたものである。好ましくはDNAは図1においてorfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2およびorfdwn3と称されるヌクレオチド配列を含んでなる。本発明はまた該DNAによりコードされるタンパク質をも提供する。本発明はまた本発明のDNAを含んでなるベクターおよびかかるベクターを含有する宿主をも提供する。
意外にも、本発明者らは、本発明による遺伝子の少なくとも一つに欠損がある場合、生物が産生するクラブラン酸の量が増加することを見出した。従って本発明はまた適当な微生物が産生するクラブラン酸の量を増加させる方法をも提供する。本発明の一つの態様において、同定された遺伝子を操作しては多量のクラバム、適当にはクラブラン酸の産生能を有する生物を作ることができる。この知見によりまた5Sクラバムを少ししか産生しないか、または全く産生しない生物について予備スクリーニングしてなるクラブラン酸を多量に産生する生物の同定方法を改善することもできる(例えば本明細書の実施例に記載するHPLCおよび/またはクラバムバイオアッセイによる)。
適当には本発明の5Sクラバム遺伝子は、本発明で得られる配列に基づいて慣用的なクローニング法(例えばPCR)により得ることができる。遺伝子の機能は、遺伝子破壊[Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46(1994)]、ランダム変異誘発、位置指定変異誘発およびアンチセンスRNAのごとき遺伝学的技術により妨げるかまたは排除/欠失させることができる。
本発明のさらなる態様において、1個またはそれ以上の欠損遺伝子を含有するプラスミド、好ましくは以下に記載するプラスミドpCEC060、pCEC061、pDES3、pCEC056およびpCEC057を提供する。遺伝子は、例えばその遺伝子の作用を完全に破壊する抗生物質抵抗性遺伝子をコードするDNAフラグメントを挿入する、種々の方法で欠損させることができる。別法として、抗生物質抵抗性遺伝子をコードしないDNAの挿入、遺伝子の一部の欠失、遺伝子全ての欠失または1またはそれ以上のヌクレオチドの付加および/または置換による遺伝子のヌクレオチド配列の変化を含む、別の方法を用いて欠損遺伝子を作ることができる。本発明による欠損遺伝子は種々の程度で欠損させたものであってもよい。遺伝子の活性を完全に破壊するかまたは原活性の一部を保持するように遺伝子を欠損させてもよい。
適当には、本発明のプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスのごとき生物、例えばATCC27064株(これはエス・クラブリゲルスNRRL3585に対応する)を形質転換することができる。適当な形質転換の方法は以下の関連文献に見出すことができる:Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular cloning:a laboratory manual第2編(1989)、ColdSpring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor,N.Y.;Hopwood,D.A.ら、Genetic Manipulation of Streptomyces.A Cloning Manual(1985)並びにParadkar,A.S.およびJensen,S.E.、J.Bacteriol.177(5):1307-1314(1995)。
エス・クラブリゲルス種の株を工業的に用いてクラブラン酸(クラブラン酸カリウム)を製造することができる。英国および米国薬局方ではクラブラン酸カリウムに関して(英国薬局方1993年、補遺14994年、1362-1363頁および米国薬局方Official Monographs 1995年、USP23 NF18、384-385頁)、毒性のある5Sクラバム、クラバム−2−カルボキシレートの量を具体的に制限している。
従って本発明のさらなる態様において、多量のクラブラン酸を産生できるがC2Cを作ることができないか、または多量のクラブラン酸を産生できるがC2Cは少ししか産生しない生物を提供する。適当にはクラブラン酸産生生物は1個またはそれ以上の欠損クラバム遺伝子を含有し、好ましくは以下に記載するエス・クラブリゲルス株56−1A、56−3A、57−2B、57−1C、60−1A、60−2A、60−3A、61−1A、61−2A、61−3Aおよび61−4Aである。かかる生物は、5Sクラバム、クラバム−2−カルボキシレートを産生することなく、またはクラバム−2−カルボキシレートの産生が著しく少ない状態で、クラブラン酸を産生するのに適している。
実施例
実施例では特記する以外、全ての方法はSambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular Cloning A Laboratory Manual(第2編)(1989)、またはHopwood,D.A.ら、Genetic Manipulation of Streptomyces,A Cloning Manual(1985)並びにParadkar,A.S.およびJensen,S.E.、J.Bacteriol.177(5):1307-1314(1995)に記載されるとおりである。
I.ストレプトミセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)染色体のクラバミネートシンターゼ遺伝子cas1の上流および下流のDNAシークエンシング
A.cas1の単離
ストレプトミセス・クラブリゲルス(Streptomyces clavuligerus)NRRL3585からクラバミネートシンターゼアイソザイム1(cas1)の遺伝子をコードする染色体DNAフラグメントを単離するために、予め配列決定したcas1遺伝子[Marsh,E.N.、Chang,M.D.T.およびTownsend,C.A.、Biochemistry 31:12648-12657(1992)]のヌクレオチド9−44に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブRMO1を合成した。Applied Biosystems社製391 DNA Synthesiserを用いて常法でオリゴヌクレオチドを構築した。RMO1(36量体)の配列をMarshら(1992年、前掲)により公開された配列に対してアンチパラレルセンスにて合成し、RMO1をDNAオリゴヌクレオチド末端標識に関する常法で(Sambrookら、1989年、前掲)32Pで放射性標識し、これを用いてStahlおよびAmann(Nucleic acid techniques in bacterial systematics、E.StackebrandtおよびM.Goodfellow編、Tronto:John Wiley and Sons、205-248頁、1991年)に記載されるサザンハイブリダイゼーションによりストレプトミセス・クラブリゲルス ゲノムDNAのコスミドバンクをスクリーニングした。コスミドpLAFR3内に調製したエス・クラブリゲルス(S.clavuligerus)DNAのゲノムバンクに関してはDoran,J.L.ら、J.Bacteriol.172(9):4909-4918(1990)に記載されている。
エス・クラブリゲルス・コスミドバンクのコロニーブロットを5xSSC、5xDenhardt溶液、および0.5% SDS(1xSDS:0.15M NaCl+0.015M クエン酸三ナトリウム;1xDenhardt溶液:0.02% BSA、0.02%Ficollおよび0.02% PVP)からなる溶液中60℃で一晩放射性標識したRMO1と共にインキュベートした。次いでブロットを0.5xSSC+0.1% SDS溶液中68℃で30分間洗浄した。RMO1と強固にハイブリダイズし、制限エンドヌクレアーゼSacIおよびEcoRIで消化すると、エス・クラブリゲルスゲノムDNAの消化物を用いる類似実験で検出されるハイブリダイゼーションシグナルと合致する、ハイブリダイゼーションシグナルを付与する、1個のコスミドクローン10D7を単離した。
B.cas1を側面に付加するエス・クラブリゲルス染色体のDNAシークエンシング
制限エンドヌクレアーゼSacI、NcoIおよびKpnIを用いてコスミド10D7の部分制限地図を作成した。RMO1および10D7 DNAの種々消化物とのサザンハイブリダイゼーション実験によりcas1はたいてい7キロベースのSacI−SacI DNAサブフラグメントの一方の末端に位置することが示された。このフラグメントはcas1オープン・リーディング・フレームおよび上流のDNA約6キロベースから成る。次いでファージミドベクターpBluescriptII SK+(2.96キロベース;Stratagene)中10D7のSacI消化物から7キロベースのフラグメントをサブクローニングし、このように組み換えプラスミドpCEC0007を作った。
cas1の上流の染色体のシークエンシング方法を容易にするために、7キロベースのSacI−SacIフラグメントの3キロベースのNcoI−NcoIサブフラグメントを両方の配向でpUC120[3.2キロベース;VieirraおよびMessing、Methods Enzymol.153:3-11(1987)]にサブクローニングし、組み換えプラスミドpCEC026およびpCEC027を作った。3キロベースのサブフラグメントはcas1のアミノ末端コード化部分および上流のDNA約2.6キロベースからなる。
エクソヌクレアーゼIIIおよびS1ヌクレアーゼ消化を用いてプラスミドpCEC026およびpCEC027の両方で重複する入れ子欠失部を創製し(Sambrookら、1989年、前掲)、Taq dye−deoxyaターミネーターキットおよびApplied Biosystems社製373A Sequencerを用いてジデオキシ鎖終結法[Sanger,F.、Nicklen,S.およびCoulson,A.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467(1977)]により3キロベースのNcoI−NcoIフラグメントのDNA配列を両方の鎖で決定した。
cas1のすぐ下流の染色体のDNA配列を決定するために、p BluescriptII SK+中でコスミドクローン10D7から4.3キロベースのKpnI−EcoRI DNAフラグメントをサブクローニングし、pCEC018を作った。pSL1180(3.422キロベース、Pharmacia)中でpCEC018から3.7キロベースのSacI−SacIサブフラグメントをクローニングした;このフラグメントのSacI末端の一つはcas1のTGA停止コドンと部分的に重複し、もう一つはコード化ベクターであった。サブクローニング中に両方向の3.7キロベースのフラグメントを得、得られた組み換えプラスミドをpCEC023およびpCEC024と称した。両方のプラスミドで重複する入れ子欠失部を創製し、3.7キロベースのフラグメントのDNA配列を両方の鎖で決定した。これらの実験で生じたエス・クラブリゲルス染色体のヌクレオチド配列およびcas1フランキング配列を図1に示す。
II.cas1を側面に付加するオープン・リーディング・フレームの機能分析
cas1の上流にあるDNA配列をコンピューター分析に付し、2個の完全なorfおよび1個の不完全なorfの存在を予測した。3個のorfは全てcas1とは反対のDNA鎖上に位置し、従って逆方向に配向する。第1のオープン・リーディング・フレームであるorfup1はcas1の上流579塩基対に位置し、344個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。第2のオープン・リーディング・フレームであるorfup2はorfup1の3’末端を越えて437塩基対に位置し、151個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。orfup2の向こうがorfup3である。orfup3の出発コドンはorfup2の翻訳停止コドンと重複し、これは2個のorfが共役して翻訳されることを示唆している。orfup3の翻訳停止コドンは3キロベースのNcoI−NcoIフラグメントには存在しなかった。
cas1の下流にあるDNA配列を同様な分析に付し、2個の完全なorfおよび1個の不完全なorfの存在を予測した。2個のorfはcas1とは反対のDNA鎖上に位置し、従ってcas1には順方向にある。第3のorfはcas1と同じ鎖上に位置し、そこから離れて行くように配向する。第1の下流のオープン・リーディング・フレームであるorfdwn1はcas1の下流373塩基対に位置し、328個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。第2のオープン・リーディング・フレームであるorfdwn2はorfdwn1の上流55塩基対に位置し、394個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。orfdwn2の上流315塩基対の反対の鎖がorfdwn3である。3.7キロベースのフラグメントではorfdwn3の停止コドンが観察されなかったので、これは219個のアミノ酸の不完全なポリペプチドをコードする。
orfupおよびorfdwnオープン・リーディング・フレームの遺伝子破壊
クラブラン酸およびエス・クラブリゲルスにより産生されるその他のクラバムの生合成におけるcas1を側面に付加するオープン・リーディング・フレームの考え得る役割を評価するために、遺伝子置換により挿入不活化または欠失変異体を創製した。遺伝子破壊および置換に用いた方法は本質的にParadkar Jensenに記載されたもの(1995年、前掲)である。
A.orfup1
アプラマイシン抵抗性遺伝子(aprr)を担持する1.5キロベースのNcoI−NcoIフラグメントをParadkar Jensenに記載されるように(1995年、前掲)構築し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を作り(Sambrookら、1989年、前掲)、BasBIで消化しクレノウフラグメントで同様に処理したpCEC026にライゲートした。pCEC026はorfup1内で翻訳開始コドンから636塩基対のところに位置するBasBI部位を有する。ライゲーション混合物を用いてイー・コリ(E.coli)GM2163のコンピテント細胞[New England Biolabsより入手可能、米国、Marinus,M.G.ら、M G G122;:288-289(1983))]を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からプラスミドpCEC054およびpCEC055を含有する2個のクローンを単離した;制限分析によりpCEC054はorfup1と同じ配向で挿入されたaprr−フラグメントを有するが、pCEC055はこれを反対の配向で有することが認められた。
pCEC054をエス・クラブリゲルスに導入するために、プラスミドDNAをBamHIおよびHindIIIで消化し、コピー数の多いストレプトミセスベクターpIJ486[6.2キロベース;Wardら、Mol.Gen.Genet.203:468-478(1986)]にライゲートした。次いでライゲーション混合物を用いてイー・コリ(E.coli)GM 2163のコンピテント細胞に形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からシャトルプラスミドpCEC061有する1個のクローンを単離した。次いでプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスNRRL 3585を形質転換した。得られた形質転換体を非選択性培地で胞子形成を連続して2ラウンド行い、次いでレプリカ平板法により抗生物質を含有する培地に移し、アプラマイシン抵抗性およびチオストレプトン感受性形質転換体を同定した。この方法により4個の推定変異体(61−1A、−2A、−3Aおよび−4A)を選別し、さらなる分析に供した。
これらの推定変異体のorfup1が破壊されていることを確認するために、61−1Aおよび61−2A単離体からゲノムDNAを調製し、SacIで消化し、サザンブロット分析に供した。サザンブロットの結果は二重交差が生じたことで合致し、これらの変異体がorfup1の真の破壊置換変異体であることを示している。
変異体61−1A、−2A、−3Aおよび−4AをSoya−Flour培地で成長ささせ、その培養上澄をクラブラン酸およびクラバム産生物に関してHPLCにより検定した。Soya−Flour培地の組成およびはHPLCによるクラバムの検定方法は、HPLCアッセイのラニング緩衝液を0.1M NaH2PO4+6%メタノール、pH3.68(氷酢酸で調整)で構成すること以外は予め報告した(ParadkarおよびJensen、1995年、前掲)とおりである。HPLC分析によれば、変異体はいずれも検出可能な濃度のクラバム−2−カルボキシレートまたは2−ヒドロキシメチルクラバムを産生しないことがわかった。さらに、PruessおよびKellettの方法[J.Antibiot.36:208-212(1983)]を用いて培養上澄をバシラス(Bacillus)種ATCC 27860に対してバイオアッセイを行った場合、変異体はいずれも検出可能な濃度のアラニルクラバムを産生しなかった。対照的に、野生型と比較した場合、変異体がより高濃度のクラブラン酸を産生するようであることが培養上澄のHPLCアッセイによりわかった(表1)。
orfup1欠失
クローニング実験を行い、orfup1のAatII部位間の654ヌクレオチドの遺伝子欠失を作った。以下に列記したオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型として前記したpCEC061を用いてPCR産生物を作った。PstIをオリゴ11に、SphI部位をオリゴ14に組み込み元のヌクレオチド配列を変化させた。
GRI(Felsted,Dunmow,Essex,CM6 3LD)のPTC−200Peltier thermal cyclerを用いて標準的なPCR反応を実施した。
プライマー11および12を用いてPCR産生物1を作った。この産生物は約1キロベースであり、第2のAatII部位からのorfup1のカルボキシ末端および下流領域を有する。
プライマー13および14を用いてPCR産生物2を作った。この産生物は約1.1キロベースであり、第1のAatII部位からのorfup1のアミノ末端および上流領域を有する。
使用説明書に従い、PCR産生物2をSrfI消化pCR−Script Amp SK(+)(Strategene Ltd、Cambridge Science Park、Milton Road、CambridgeCB4 4GF)にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてEpicurianイー・コリ(E.coli)XL1−BlueMRF’Kanのスーパーコンピテント細胞(Strategeneより入手可能)を形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した(製造者の指示どおり)。得られた形質転換体からプラスミドDNAを単離し、DNA制限分析により7個のクローンがPCR産生物2をライゲートしたプラスミドを含有することが示された。これらのプラスミドの一つをpDES1と称する。
PCR産生物1をPstIおよびAatIIで消化し、得られたDNAをアガロースゲル電気泳動によりフラクションに分けた。1キロベースのフラグメントを切り取り、Sephaglas band prepキット(Pharmacia,St Albans,Herts,ALI3AW)を用いてゲルから溶出した。単離したフラグメントを次いでAtaIIおよびPstI消化したpDES1にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリXL1−Blueのコンピテント細胞(Strategeneより入手可能)に形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した(製造者の指示どおり)。得られた形質転換体からプラスミドDNAを単離し、制限分析により1個のクローンがPCR産生物1をライゲートしたプラスミドを含有することが示された。このプラスミドをpDES2と称する。
pDES2をエス・クラブリゲルスに導入するために、プラスミドがストレプトミセス内で機能できる複製起点を含有するようにさらに修飾した。この修飾を達成するためにpDES2のプラスミドDNAをEcoRIおよびHindIIIで消化し、またEcoRIおよびHindIIIで消化したコピー数の多いストレプトミセスベクターpIJ486[6.2キロベース:Wardら、Mol.Gen.Genet.203:468-478(1986)]にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリのコンピテント細胞(JM109)(Strategene Ltd.)に形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からプラスミドDNAを単離し、制限分析により6個のクローンがpIJ486を含有するpDES2をを有することが示された。これらのプラスミドの一つをpDES3と称する。プラスミドpDES3を用いてorfup1遺伝子が既にアプラマイシン抵抗性遺伝子の挿入により破壊されているエス・クラブリゲルス株(前記のとおり)を形質転換した。チオストレプトン抵抗性形質転換体を選別して、次いでこれらの形質転換体を非選択性培地で胞子形成を3ラウンド行い、アプラマイシン抵抗性の損失に関してスクリーニングした。この方法によりアプラマイシン抵抗性を損失した変異体45個が同定された。次いでこれらをHPLCにより分析し、これらの株が、通常クラバム2カルボキシレートおよび2−ヒドロキシメチルクラバムを産生する条件下で醗酵させた場合、orfup1破壊体61−1A、61−2A、61−3Aおよび61−4Aのようにこれらのクラバムを産生できないことを確認した。
B.orfdwn1およびorfdwn2
最初にpCEC018(7.3キロベース)をNcoIで消化し、ほとんどのorfdwn1およびorfdwn2の一部を含有する1キロベースのサブフラグメントを遊離させて、orfdwn1およびorfdwn2における欠失/置換変異体を創製した。消化物をアガロース電気泳動によりフラクションに分け、6.3キロベースのフラグメントを切り取り、ゲルから溶出した。次いでこのフラグメントをaprrを担持するNcoI-NcoIDNAフラグメントにライゲートし、これを用いてイー・コリXL1-Blueを形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。この実験により1個のクローンを得たが、得られた組み換えプラスミドの制限分析によりアプラマイシン抵抗性フラグメントの2個のコピーが欠失プラスミドにライゲートしたことが明らかになった。aprr-フラグメントの余分なコピーを排除するためにプラスミドをNcoIで消化し、自己ライゲートさせた。ライゲーション混合物を用いてイー・コリGM2163を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。その形質転換体から、プラスミドpCEC052およびpCEC053を含有する2つのクローンを単離する;それらは共にaprr-フラグメントのコピーを1個だけ有し、pCEC052はorfdwn1および2に関して逆方向のaprr-フラグメントを有するが、pCEC053はorfdwn1および2と順方向に挿入されたaprr-フラグメントを有する。
BamHI消化pCEC052を同様に消化したpIJ486とライゲートし、イー・コリGM2163を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与することによりpCEC052のシャトルプラスミドを構築した。この実験によりシャトルプラスミドpCEC060を含有する1個のクローンを単離した。このプラスミドを用いて野生型エス・クラブリゲルス3585を形質転換してアプラマイシンおよびチオストレプトン抵抗性を付与した。得られた形質転換体を非選択的条件下で胞子形成を2ラウンド行い、次いで平板プレート法により抗生物質含有培地に移してアプラマイシン抵抗性、チオストレプトン感受性コロニーを同定した。推定変異体3個(60−1A、−2Aおよび−3A)を選別して、さらなる分析に供した。
これらの推定変異体を同定するために、60−1Aおよび60−2A株からゲノムDNAを単離し、SacIかまたはBstEIIのいずれかで消化し、サザンブロット分析に供した。この実験で得られたハイブリダイゼーションバンドは両方の株が二重交差事象を受けていることと合致し、それはこれらの変異体がorfdwn1/2内で真の破壊置換変異体であることを示す。
これらをSoya-Flour培地で培養し、培養物の上澄をHPLCで検定すると、変異体はいずれも検出可能な濃度のクラバム−2−カルボキレートまたは2−ヒドロキシメチルクラバムを産生しなかった。培養上澄をバイオアッセイに付し、その変異体はまた、検出可能な濃度のアラニルクラバムを産生しないことがわかった。orfup1変異体と同様、orfdwn1/2変異体は野生型よりも高濃度のクラブラン酸を産生することができる。
orfdwn3
orfdwn3を破壊するために、pCEC023(pSL1180にサブクローニングしたcas1の下流のDNAの3.7キロベースのフラグメントからなる)をNcoIで消化し、次いで自己ライゲートさせた。イー・コリをライゲーション混合物で形質転換した後に、プラスミドpCEC031を有する1個のクローンを単離した。プラスミドはorfdwn2の一部および不完全なorfdwn3をコードする1.9キロベースのNcoI-EcoRIフラグメントのみを保持した。DNA配列の試験により、pCEC031がorfdwn3の翻訳開始部位から158塩基対のところで独特のBstEII部位を有することがわかった。従って、pCEC031をBstEIIで消化し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を作り、平滑末端化したアプラマイシン抵抗性カセットにライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリGM2163を形質転換してアプラマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性を付与した。各々pCEC050およびpCEC051を含有する2個の形質転換体を選別した。制限分析によりアプラマイシン抵抗性カセットがpCEC050内ではorfdwn3と順方向に、pCEC051内では逆方向に配向していることがわかった。次いでこれらのプラスミドを共にHindIIIで消化し、同様に消化したpIJ486にライゲートした。次いでライゲーション混合物を用いて別個にイー・コリGM2163を形質転換してアプラマイシンおよびアンピシリン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からシャトルプラスミドpCEC056(pCEC050+pIJ486)およびpCEC057(pCEC051+pIJ486)を単離した。次いで両方のプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスNRRL3585を形質転換した。
各々の形質転換体の実験から1個の形質転換体を選別し、非選択性培地上で胞子形成を連続して2ラウンド行い、次いでレプリカ平板法により抗生物質を含有する培地に移し、アプラマイシン抵抗性およびチオストレプトン感受性形質転換体を同定した。この方法により推定変異体2個を各々の1次形質転換体(pCEC056では56−1Aおよび56−3A、pCEC057では57−1Cおよび57−2B)の子孫から単離した。
これらの推定変異体を同定するためにこれらの株からゲノムDNAを単離し、SacIまたはAcc65Iのいずれかで消化し、サザンブロット分析に供した。この実験から得られたハイブリダイゼーションバンドは、両方の株が二重交差事象を受けていることと合致し、それはこれらの変異体がorfdwn3内で真の破壊置換変異体であることを示す。
これらの株をSoya-Flour培地で培養し、培養物の上澄をHPLCで検定すると、変異体が産生するクラバム−2−カルボキレートまたは2−ヒドロキシメチルクラバムの濃度は非常に低かった。培養上澄をバイオアッセイに付し、変異体は検出可能な濃度のアラニルクラバムをも産生しないことがわかった。orfup1およびorfdwn1/2変異体と同様、orfdwn3変異体も野生型よりも高濃度のクラブラン酸を産生することができる(表3)。
本出願では以下のヌクレチド配列を開示する:
配列番号:1 図1のDNA配列
配列番号:2 orfup3の配列
配列番号:3 orfup2の配列
配列番号:4 orfup1の配列
配列番号:5 orfdwn1の配列
配列番号:6 orfdwn2の配列
配列番号:7 orfdwn3の配列
配列番号:8 オリゴヌクレオチドプライマー11の配列
配列番号:9 オリゴヌクレオチドプライマー12の配列
配列番号:10 オリゴヌクレオチドプライマー13の配列
配列番号:11 オリゴヌクレオチドプライマー14の配列
図1:cas1を有して側面に付加するエス・クラブリゲルス染色体のヌクレオチド配列
Claims (8)
- a)図1(配列番号:1)に示されるエス・クラブリゲルスにおける5Sクラバムの生合成に特異的であって、5Rクラバムの生合成には必須ではない1個または複数の遺伝子を有してなるDNA;
b)図1にてorfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2またはorfdwn3(配列番号:2−7)で示される配列かまたは実質的にその配列を有するエス・クラブリゲルスにおける5Sクラバムの生合成に特異的であって、5Rクラバムの生合成には必須ではない1個または複数の遺伝子を有してなるDNA;
c)図1にてorfup1で示される配列(配列番号:4)または実質的にその配列を有するエス・クラブリゲルスにおける5Sクラバムの生合成に特異的であって、5Rクラバムの生合成には必須ではない1個または複数の遺伝子を有してなるDNA;および
d)高度にストリンジェントな条件下で上記(a)〜(c)のいずれか一のDNAとハイブリダイズし、かつ、エス・クラブリゲルスにおける5Sクラバムの生合成に特異的であって、5Rクラバムの生合成には必須ではない1個または複数の遺伝子を有してなるDNA;
からなる群より選択されるDNA。 - a)請求項1記載のDNAを含むベクター;
b)5Sクラバムの生合成に特異的な1個または複数の遺伝子が破壊されているかそうでなければ不完全である請求項1記載のDNAを有してなるベクター;および
c)ベクターpCEC060、pCEC061、pCEC056、pCEC057またはpDES3;
からなる群より選択されるベクター。 - a)請求項2記載のベクターを含有する宿主;および
b)エス・クラブリゲルスである請求項2記載のベクターを含有する宿主;
からなる群より選択される宿主。 - 各々配列番号:2−7であるオープン・リーディング・フレームorfup3、orfup2、orfup1、orfdwn1、orfdwn2またはorfdwn3から選択される、5Sクラバムの生合成に特異的であって、5Rクラバムの生合成には必須ではないオープン・リーディング・フレームに対応するDNAを有し、ここで、オープン・リーディング・フレームが破壊されているかそうでなければ不完全であるところのエス・クラブリゲルス。
- 5Sクラバムがクラバム−2−カルボキシレートである、請求項4記載のエス・クラブリゲルス。
- 5Sクラバムが2−ヒドロキシメチルクラバムである、請求項4記載のエス・クラブリゲルス。
- オープン・リーディング・フレームが、欠失とその後の遺伝子置換によって破壊されているかそうでなければ不完全である請求項4〜6のいずれか一項に記載のエス・クラブリゲルス。
- オープン・リーディング・フレームが、遺伝子破壊とその後の遺伝子置換によって破壊されているかそうでなければ不完全である請求項4〜6のいずれか一項に記載のエス・クラブリゲルス。
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