CN1196792C - 新型的基于营养缺陷型互补的非抗生素筛选的大肠杆菌宿主/载体*** - Google Patents
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Abstract
不能与原核生物基因组同源重组的含有:e)一个复制起点,f)一个营养缺陷型标记基因,g)一个在原核生物中有功能活性的启动子以及h)一个在上述启动子控制下的要表达的外源基因的最小原核表达载体特别适用于非抗生素选择。
Description
技术领域
本发明涉及能进行非抗生素筛选的新型原核表达***以及将其用于生产重组蛋白质。
背景技术
除了一个或多个抗生素抗性基因外,已知的原核表达质粒还含有不必需的DNA序列,造成细胞代谢的负担。它们包括产生于克隆过程的DNA序列,来自多重目的载体诸如对体外合成mRNA特异的启动子和对单链DNA合成特异的噬菌体复制起点以及可能由不需要的质粒重组造成的不完全加倍的载体序列等的DNA片段残留物。
质粒特别是表达载体的存在对细胞造成附加的代谢负担。这就形成了选择压力,有利于大部分可由抗生素筛选阻止的不含质粒细胞的形成。
常常使用诸如氨苄青霉素,四环素,卡那霉素和氯霉素等抗生素进行筛选。特别是将诸如氨苄青霉素等β-内酰胺抗生素用于医疗产品的生产(发酵)是很成问题的。
由于以上所述的原因,在最近的方法中不再使用通过β-内酰胺抗生素进行的抗生素质粒筛选。在有些情况下,证实使用的宿主/载体***足够稳定,可在预培养和主发酵中忽略质粒筛选(Weir,A.N.C.and Mountain,A.,EP0651803)。然而,这样通常会伴有产量的降低。在抗生素选择不可缺少时,通常使用四环素代替氨苄青霉素(Carter,P.et al.,1992)。与β-内酰胺抗生素不同,四环素不是反应性化学物质,在发酵中不会被酶修饰失活。四环素抗性基因编码一种蛋白质,它可以修饰细菌细胞膜从而阻止抗生素进入细胞。
Struhl,K.和他的同事(Struhl,et al.,1976)使用咪唑甘油磷酸脱水酶(HIS3)作为例子,表明合适的大肠杆菌突变体(hisB)可通过质粒直接互补,该质粒含有酵母DNA并且由HIS3编码的酵母酶可在大肠杆菌中功能性表达。将基因的这种互补大肠杆菌突变的能力用作选择标准以克隆例如(互补克隆)其它酵母基因(LEU 2,URA 3,TRP 5和ARG 4)。
通过互补进行选择需要稳定突变的(回复突变率>10-10;优选地是不可恢复的缺失突变体)大肠杆菌宿主菌株。然而,已知突变的回复突变率大小在<10-10数量级(Schlegel,H.G,1981)。
在很多情况下由射线(X射线或紫外线),化学诱变剂(例如碱基类似物,亚硝酸和烷化剂)或生物学技术(例如Mu噬菌体和转座子诱变)(Bachman,B.J.,1986)等非定向诱变产生的各突变体基因型的不同使已知的大肠杆菌实验室菌株有差异。
发明内容
本发明的目的是开发一种可避免通过抗生素进行质粒筛选的稳定的原核(优选地是大肠杆菌)宿主/载体***(表达***)。筛选的原理基于充足的酵母基因与稳定的原核宿主细胞营养缺陷型的互补。
本发明涉及不能与原核生物基因组同源重组的最小的原核表达载体,它含有:
a)一个复制起点,
b)一个营养缺陷型标记基因
c)一个在原核生物中具功能活性的启动子以及
d)一个在上述启动子控制下可表达的外源基因(外源序列)。
在此方面,营养缺陷型标记基因的转录和要表达的外源基因的转录优选地处于相反方向。亦优选地,标记基因与用作宿主细胞的原核生物是异源的。更优选地,当宿主细胞中营养缺陷型互补时,在本发明所述宿主/载体***中,营养缺陷型标记基因的表达只占宿主细胞中表达总蛋白的1%或更少。
在一个优选实施例中,依据本发明的表达载体特征是营养缺陷型标记基因和要表达基因的阅读框方向相反,并且由相同的转录终止子或多个排在一起的转录终止子终止。
一个营养缺陷型标记基因理解为能够使营养缺陷型宿主菌株在选择性培养条件下进行细胞生长的基因。特别优选的标记基因是异源真核基因,优选地是酵母基因,它能够补偿宿主生物必需代谢途径的缺陷(突变)。大肠杆菌作为宿主生物时,优选地是在色氨酸,亮氨酸或尿嘧啶生物合成途径有缺陷的突变体,它可由标记基因互补。
本发明的进一个目的物是含有依据本发明的载体的原核营养缺陷型宿主细胞,宿主细胞在一个基因上含有能由表达载体的选择标记基因互补的突变(缺失),并且缺失或突变能造成上述宿主细胞基因不表达功能性产物。缺失优选地位于与表达载体的营养缺陷型标记基因对应的必需染色体基因上。本发明的进一个目的是产生一个原核表达***的方法,包括将依据本发明的表达载体引入具有对应于表达载体的营养缺陷标记的基因缺失的原核营养缺陷型细胞中,其中缺失或突变能够使上述宿主细胞基因不表达功能性产物。
本发明的进一个目的物是一种方法,通过使用依据本发明的宿主细胞中依据本发明的表达载体进行所需蛋白的异源表达来生产异源蛋白质,以及从基本培养基或合成完全培养基发酵产生的细胞或上清液中分离表达产物。
本发明的进一个目的物是一种产生原核表达***的方法,其特征是将一种依据本发明的表达载体引入在染色体基因有突变并能由表达载体的营养缺陷标记基因互补的原核宿主细胞中,并且染色体突变能够使上述染色体宿主细胞基因不表达功能性产物。
本发明开发了一种基于由质粒编码表达的适当的酵母基因(TRP1,URA3)对必需染色体的大肠杆菌营养缺陷型(trpC,pyrF)互补的而不是通常的用抗生素选择的新型大肠杆菌宿主/载体***。此外:
i)使用最少功能元件(选择标记,复制起点和表达盒)构建了在大小上最优化(最小化)的新型表达载体,
ii)通过所需染色体大肠杆菌基因(trpC,pyrF)的同源重组(缺失)分离非回复突变宿主菌株以及
iii)基于模式基因(干扰素-α-2b)表达检测了新型宿主/载体***(表达质粒和宿主菌株)元件的功能和表现。
为此:
i)构建了具有染色体基因trpC和pyrF的稳定突变(缺失)的大肠杆菌宿主菌株以及
ii)含有互补酵母基因TRP1(Tschumper,G.,1980)或URA3(Rose,M.,1984)的载体。
双突变体或缺失突变体优选地构建为稳定宿主菌株。
依据本发明的最小载体优选地非常小(小于2000碱基对)并且只含有表达质粒绝对必需的元件即一个复制起点,一个异源选择标记基因和一个异源表达盒并且它们都具有尽可能小的大小以避免与原核宿主细胞基因组同源重组。同源重组在本发明中理解为依据本发明的载体与宿主细胞基因组之间DNA序列的交换。当载体和基因组之间有相当的序列相容性时(至少50-1000碱基对)可发生同源重组。在本发明检测范围内更低的序列一致性(低于50碱基对)不会导致同源重组。
适当的宿主细胞的例子是特征性具有无活性N-(5′-磷酸-核糖)-邻氨苯甲酸异构酶(EC5.3.1.24)的大肠杆菌TrpC突变体和特征性具有无活性的乳清酸-5’-磷酸脱羧酶(EC 4.1.1.23)的大肠杆菌PyrF突变体。突变体不能合成色氨酸或尿嘧啶因而在缺乏这些组分的营养培养基上不能生长。与此相反,它们在有充足量色氨酸和尿嘧啶的完全培养基上显示正常生长。
营养缺陷型trpC和pyrF突变体由依据本发明的质粒互补,质粒含有未突变的相应生物合成的缺乏或缺陷基因。但是,互补基因不是来自大肠杆菌而是来自酿酒酵母。它们与相应的大肠杆菌基因编码相同的酶。由于酵母启动子的功能差,它们在大肠杆菌中的转录低于宿主内源类似物大肠杆菌基因的转录。例如质粒编码的URA 3酵母基因(pBR 322质粒衍生物)的表达只有类似的染色体pyrF基因表达的三分之一(Rose,M.,1984)。这样的优点在于尽管有基因剂量效应但标记基因并不过量表达从而不对细胞造成额外的代谢压力。
质粒是染色体外(游离型)环状双链DNA分子,长度为几千个核苷酸构件,在每个细胞中有几个到几百个拷贝。它们有一段叫作复制起点的DNA片段,使质粒不依赖于染色体DNA的复制进行自主质粒复制/扩增。
开发了一种避免了抗生素质粒筛选的稳定大肠杆菌宿主/载体***。选择原理基于充分的酵母基因对稳定大肠杆菌营养缺陷型的互补。
大肠杆菌宿主菌株优选地含有在染色体基因trpC和/或pyrF中的稳定的优选地不可回复突变(缺失)以及含有互补酵母基因TRP 1和/或URA 3的表达质粒。
基本的表达质粒特征是:
i)不含抗生素抗性基因以及
ii)非常小的大小(<2000碱基对)。
它们只含有在大肠杆菌中复制和表达所需基因绝对必需的元件:
i)一个复制起点,
ii)一个选择标记基因以及
iii)一个原核或真核表达盒(基因治疗),并且这些质粒元件的大小尽可能最小。
复制起点
细胞中质粒自主复制的复制起点来自原核质粒,优选地来自天然大肠杆菌质粒。目前使用的大多数大肠杆菌质粒来自克隆载体pBR 322(Boliver,F.et al.,1979),它的复制子(DNA复制起点)基于质粒pMB1(Sutcliffe,G.et al,1979),它只与质粒Col E1有很小差别。质粒pBR 322的复制亦称为Col E1型复制(Backman,K.et al.,1978)。使pBR322质粒自主复制的最小DNA序列是由Backman,K.等1978年缩减到580-650碱基对长度的DNA序列。每个细胞的质粒拷贝数是由复制起点的类型决定的。依据每细胞可达到的拷贝数,可称为低拷贝数(大约10个拷贝,PACY(质粒),中拷贝数(大约50个拷贝),pBR质粒)和高拷贝数(大约500个拷贝,pUC质粒)。pUC质粒的高拷贝数复制起点仅在pBR复制起点基础上进行了点突变(Chambers,S.P.et al.,1988)。一个基因的表达量通常与要表达基因的拷贝数相关。
表达盒
一个表达盒(异源转录单位)含有:
i)一个启动子,
ii)一个核糖体结合位点
iii)一个多克隆切割位点以及
iv)一个转录终止子(rho-不依赖的终止)。
多克隆切割位点用于***要表达的基因(结构基因),为此目的它由在载体上只出现一次的至少两个限制性内切核酸酶切割位点构成。切割位点优选地用于面向启动子的切割位点,启动子的识别序列诸如限制性酶NcoI,BspHI,SpHI和NdeI的识别序列中含有ATG起始密码子核苷酸序列。这样利于启动子和结构基因的精确连接。
启动子是一段DNA片段,它是在表达盒中具功能活性的对mRNA合成的起始和要形成的mRNA分子频率的控制信号。典型的大肠杆菌启动子有80-300碱基对的长度,含有通过序列比较确认在多种启动子中具有共性的多个特征性(同源性)区域(Rosenberg,M.and Court,D.,1979;Harley,C.B.and Reynolds,R.P.,1987)。高度保守区域是:
i)RNA聚合酶的识别位点,具有5′-TTGACG-3′基序,在mRNA合成起点前的35碱基对,
ii)Pribnow Schaller盒或叫作TATA盒,具有密码子原型(codonical prototype)序列5′-TATAAT-3′,位于mRNA合成起点前方10碱基对以及
iii)在强启动子中大约“-43”位置有一个富含AT区域。
依据读取启动子的频率称为弱和强启动子。亦可区分为组成型和可调节型(诱导型,脱阻抑型)启动子。对于工业生产蛋白质,好的启动子通常是强的,严格调节的启动子,在细胞增殖时无活性而在需要时例如发酵后期可特异地转换。需要非常高并且同时可严格控制的启动子活性导致了现在优选使用的杂合启动子的构建。在易于调节的tac杂合启动子中,强组成型trp启动子的“-35”区与可诱导的lac启动子的“-10”区融合(DeBoer,H.A.et al.,1983;Amann,E.et al.,1983)。进一个例子是T5-PN25/03/04杂合启动子(Stuber,D.et al.,1990),它以强组成型T5噬菌体启动子为基础,并通过组合/***两个lac操纵子(lacO)以形成易于调节的强启动子重新构建。tac以及T5-PN25/03/04杂合启动子由lacI阻遏物通过与lac操纵基因的相互作用阻止启动子的转录进行负调节。添加天然诱导物乳糖或特别有效的非代谢乳糖类似物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)可使lacI阻遏物分离从而形成所需mRNA和合成蛋白质。
转录终止子是长度50-100碱基对的DNA序列,传递给RNA聚合酶终止mRNA合成的信号。它们的结构特征是由互补碱基对(多为富含G/C)形成发夹环形二级结构。功能上它们的作用与方向无关。建议在表达盒3′末端有非常有效的(强)终止子以防止RNA聚合酶特别是使用强启动子时发生连读。低效转录终止子可导致类似操纵子mRNA的形成,它可能是不需要的质粒编码基因表达的原因。此外,终止子造成的mRNA 3′末端的二级结构阻碍了3′外切核酸酶的降解(Higgins,C.F.et al.,1993),能增加mRNA的半寿期从而亦增加了合成蛋白的量。常用的转录终止子的例子是λ噬菌体的TO终止子(Schwarz,E.et al.,1978),fd噬菌体终止子(Beck E.and Zink,B.,1981)以及大肠杆菌rrnB操纵子的终止子T1(Brosius,J.et al.,1981)。
对于有效的蛋白质生物合成的起始,亦需要核糖体结合位点(RBS)。它包括从ATG起始密码子至具有保守基序AGGA的称为Shine Dalgarno序列的序列。ATG起始密码子和SD序列之间的距离在5-15碱基对并且富含A/T。mRNA合成起始点和ATG翻译起始密码子之间的距离常规为15-80碱基对。
任何适于作为外源序列的序列均在本发明含义内。这些核酸序列优选地编码在人体内对代谢有作用的多肽。这些蛋白或多肽优选地是与医疗相关的多肽,诸如细胞因子,蛋白质或蛋白质激素。
现在有大量的技术可产生适于构建大肠杆菌宿主菌株的大肠杆菌突变体。它们从诱变全细胞随后利用所需表型筛选直到单个碱基或精确确认的基因或基因组片段的特定诱变。这些方法描述于Miler,J.H.(1972),Neidhardt,F.C.et al.(1987)和Winnacker,E.-L.(1985)。
通过依据Hamilton C.M.et al.,1989的同源重组方法定向删除完整基因或一大段基因片段将稳定的不可回复突变营养缺陷型标记引入到宿主菌株。在此技术中保存原始基因型即不再向大肠杆菌基因组引入突变。基因交换技术的原理在使用构建tryC缺失突变作为例子当中有更详细阐释。
为了举例从大肠杆菌色氨酸操纵子中删除了完整的trpC基因(1355碱基对)(Yanofsky,C.et al.,1981)。为此目的,使用合适的引物和染色体大肠杆菌DNA为模板利用PCR方法扩增了trpC基因的侧翼区(各700-800碱基对)。引物的突出端含有单一限制性酶切位点目的是将扩增的基因trpD和trpB的DNA片段直接融合(direct fusion)连接到载体pMAK 705。载体pMAK705特征是有在44℃无活性的温度敏感的复制起点(pSC 101的复制起点)和氯霉素抗性基因。为了删除染色体trpC基因,将pMAK 705-trp D/B质粒转化到所需的大肠杆菌菌株。质粒和大肠杆菌染色体同源重组的先决条件是能够重组的大肠杆菌菌株(recA+基因型)。具有recA-基因型的菌株不能进行同源重组因而不适用。转化的细胞在氯霉素存在下44℃培养。质粒由于其温度敏感的复制起始点(orits)在44℃不能复制,因此只有例如通过同源重组将载体整合到染色体的细胞生存下来。分离出共合体并在氯霉素选择下30℃培养数代。在染色体上定位的质粒pMAK 705-trpD/B复制起点在此温度下有活性导致共合体的生长速率显著降低。通过第二次重组从染色体除去质粒的细胞重新正常生长。它们含有从染色体脱离的在30℃氯霉素存在下复制的质粒。结果是在含有质粒的细胞比共合体过分生长并在培养数代后在培养物中占优势。如图1中说明,整合的质粒可通过A和B两种不同的方式从染色体脱离。依据同源重组事件,质粒含有要删除的基因trpC(B)或在细胞中重新采取原来的形式(A)。含有携带染色体trpC基因质粒的细胞最可能具有所需的trpC缺失。通过质粒的限制性分析确认它们并通过在缺乏氯霉素条件下44℃单次培养和33℃下多次培养消除质粒。随后通过将各克隆在含和不含色氨酸的培养基上铺平板(影印培养)检测克隆的trpC营养缺陷型。
特定大肠杆菌宿主/载体***和宿主菌株
特别开发了一种极端严紧调控的宿主/载体***用于表达对大肠杆菌有毒性的蛋白质,以预防仍造成干扰的基因的基本表达。Studier,F.et al.,1990的T7聚合酶***以来自对T7启动子有绝对选择性和特异性的噬菌体T7的特定RNA聚合酶为基础。由于宿主大肠杆菌RNA聚合酶不识别T7启动子,只有在下列诱导条件下时才有T7聚合酶。
i)用合适的噬菌体例如λ噬菌体衍生物CE 6感染培养物或
ii)将整合入染色体的T7聚合酶处于lac UV5/lacI启动子控制下诱导。
通过溶源性λ噬菌体衍生物DE3的染色体***构建了含有T7聚合酶基因的特定大肠杆菌宿主菌株BL 21(DE3)和HMS 174(DE3)。这一常用于科研实验室的***不太适用于工业目的因为:
i)只存在有限数量的宿主菌株(2)
ii)在发酵罐中DE3溶源菌并不绝对稳定以及
iii)诱导后细胞生长停滞,随后难以生长至高细胞密度。
下面的实施例,发表文献,测序方案和图形进一步阐释了本发明从专利要求书产生的保护范围。描述的方法应理解为实施例,其中亦描述了甚至经过修改后的本发明的主题。
附图说明
图1:通过基因交换技术构建大肠杆菌trpC缺失突变体。将要删除的trpC基因的侧翼序列整合到载体pMAK 705中。由于质粒不能在44℃下复制,在44℃下添加氯霉素培养时只有通过同源重组转化的并且将质粒整合到染色体的大肠杆菌菌株存活(共合物形成)。随后在30℃,氯霉素选择下的培养导致第二次同源重组,其中将质粒从染色体切除。共合物的分割可产生最初的pMAK 705-trp D/B质粒(A)或产生另外含有trpC基因的pMAK705-trp D/C/B质粒衍生物(B)。只有在B情况下才从大肠杆菌染色体缺失了trpC基因。
图2:构建基本载体OripBR-TRP1,OripBR-URA3和OripBR-TET:使用切割位点SfiI和XhoI,通过将从质粒pBR 322,yEP 24和yRP 7分离的标记基因TET,URA3和TRP1与含有pBR 322复制起点的DNA片段连接生成了质粒OripBR-TRP1(1497碱基对),OripBR-URA3(1697碱基对)和OripBR-TET(2012碱基对)。
图3:表达盒核苷酸序列,由T5-PN25/03/04杂合启动子,核糖体结合位点RBSII,多克隆切割位点(NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII)和λ-TO终止子构成。
具体实施方式
基本方法:
使用Sambrook,J,et al(1989)在分子克隆:实验室手册,冷泉港实验室出版社,冷泉港,纽约(Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York)中所述的标准方法进行DNA操作。依据制造商的建议使用分子生物学试剂。
使用载体pBR 322(中等拷贝数)和载体PUC 20(高拷贝数)的复制起点作为复制起点。这些质粒的自主复制的最小DNA序列在580-650碱基对(Backman,K.et al.,1978)。
选择酵母基因TRP1和URA3作为选择标记基因。使用四环素抗性基因构建同基因的标准参照质粒。
实施例1
构建基本载体(base vector)OripBP-TRP1,OripBR-URA3和OripBR-TET
1.1构建基本载体OripBR-TRP1
质粒OripBR-TRP1由两个DNA片段构成,它们是依据Mullis,K.B.和Faloona,F.A.,1987的方法利用聚合酶链式反应(PCR)获得的。在第一个PCR反应中,使用引物N1(序列1)和N2(序列2)以及pBR 322作为模板DNA扩增了依据Sutcliffe J.G,1979年发表文章从碱基对位置2517至3160的质粒pBR 322复制起点。
SfiI
N1:5′-AAAAAA
GGCCATATA
GGCCGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTC-3′
XhoI
N2:5′-AAAAAA
CTCGAGGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAG-3′
通过PCR引物N1的5′突出端引入单一的SfiI限制性内切核酸酶切割位点并通过PCR引物N2突出端引入单一的XhoI限制性内切核酸酶切割位点。
在第二个PCR反应中,使用引物N3(序列3)和N4(序列4)以及YRP7(Kopetzki,E.et al.,1989)作为模板DNA扩增了依据Tschumper,G.和Carbon,J.,1980年发表文章从碱基位置22至777的TRP1酵母基因(5′侧翼区和TRP 1结构基因)。
SfiI NotI
N3:5′-AAAAAA
GGCCATATA
GGCCATAT
GCGGCCGCGGAGAGGGCCAAGA
GGGAGGGC-3′
XhoI BamH1 fd-终止子
TTA
CTATTTCTTAGCATTTTTGACG
AAATTTGC-3′
End End
通过PCR引物N3的5′突出端和第二个翻译终止密码引入了单一的SfiI切割位点的和NotI切割位点,通过PCR引物N4的5′突出端将噬菌体fd从位置1522至1570的fd转录终止子(Beck,E.and Zink,B.,1981)和两个单一限制性内切核酸酶切割位点(MAKHI和XhoI)引入TRP1结构基因编码区的3′末端。
将SfiI和XhoI消化得到的两段PCR片段使用琼脂糖凝胶电泳纯化后连接。随后使用依据Hanahan,D.,1983的氯化钙法或依据Fiedler,S.和Wirth,R.,1988的电穿孔法转化大肠杆菌K12菌株JA 300(thr leuB6,thi,thyA,trpC1117,hsrK,Hsmk,StrR;DSMZ 4776)(来源:“Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。在琼脂平板上M9基本培养基(制备:参看Sambrook,J等1989)和0.5%(w/v)购自Difco公司的酪蛋白氨基酸(不含色氨酸的酸水解酪蛋白)中筛选转化体并随后在液体培养基中培养。通过限制性图谱确认所需的质粒OripBR-TRP1(1497碱基对)。
1.2构建基本载体OripBR-URA3
类似于质粒OripTRP1,质粒OripBR-URA3由两个PCR片段组成。但是,要用URA3酵母基因而不是TRP1选择标记基因。第一个PCR反应:参看实施例1.1。
在第二次PCR反应中扩增了依据Rose,M.1984的发表文章从碱基对位置75至1030的URA3酵母基因(5′侧翼区和URA3结构基因),使用引物N5(序列5)和N6(序列6),
sfiI NotI
N5:5′-AAAAAA
GGCCATATA
GGCCATAT
GCGGCCGCCGGTAATCTCCGAACAGAAGGAAGA
AC-3′
XhoI BamH1 fd-终止子
N6:5′-AAAAAA
CTCGAGACGA
GGATCC
EndEnd
使用YEp 24(Botstein,D.et al.,1979)作为模板DNA。通过PCR引物N5的5′突出末端和第二个翻译终止密码子引入单一的SfiI切割位点和NotI切割位点,通过PCR引物N6的5′突出末端在TRP1结构基因编码区3′末端引入从位置1522至1570(Beck,E.and Zink,B.,1981)的噬菌体fd的fd转录终止子(与天然方向相反)以及两个单一限制性内切核酸酶切割位点(BamHI和XhoI)。
用SfiI和XhoI消化的两个PCR片段在琼脂糖凝胶电泳纯化后连接。随后使用依据Hanahan,D.,1983的氯化钙法或依据Fieldler,S.和Wirth,R.1988的电穿孔法转化大肠杆菌K12菌株CSH 28(Δlacpro,supF,trp,pyrF,his,strA,thi)(来源:冷泉港实验室,纽约;M:ller,J.H.,1972)。在琼脂平板上含有0.5%(w/v)来自Difco公司的酪蛋白氨基酸和5毫克/毫升色氨酸的M9基本培养基(制备:参看Sambrook,J.et al.,1989)中筛选转化体并随后在液体培养基中培养。通过限制性图谱确定所需的质粒OripBR-URA3(1697碱基对)。
1.3构建具抗生素抗性的参照载体OripBR-TET
类似于质粒OripBR-TRP1和OripBRURA3,质粒OripBR-TET由两个PCR片段构成。但是使用来自质粒pBR 322的四环素抗性基因(TET)代替了TRP1或URA3选择标记基因。第一个PCR反应:参看实施例1.1。
在第二个PCR反应中扩增了依据Sutcliffe J.G.,1979的从碱基对位置3至1275的TET抗性基因(启动子和TET结构基因),使用的引物是N7(序列7)和N8(序列8),
sfiI NotI
N7:5′-AAAAAA
GGCCATATA
GGCCATAT
GCGGCCGCCTCATGTTTGACAGCTTATCATCGA
TAAG-3′
XhoI XbaI fd终止子
N8:5′-AAAAAA
CTCGAGATAT
TCTAGA
TCAGGTCGAGGTGGCCCGGCTCC-3′
使用pBR 322(Sutcliffe,J.G.,1979)作为模板DNA。通过PCR引物N7的5′突出末端引入了单一的SfiI切割位点和NotI切割位点,通过PCR引物N8的5′突出端引入了从位置1522至1570(Beck,E.and Zink,B.,1981)的噬菌体fd的fd转录终止子(与天然方向相反)以及两个单一限制性内切核酸酶切割位点(XhoI和XbaI)到TET结构基因的编码区的3’端。
使用SfiI和XhoI消化的两个PCR片段在琼脂糖凝胶电泳后连接。随后使用依据Hanahan,D.,1983的氯化钙法或依据Fiedler,S.和Wirth,R.,1988的电穿孔法转化大肠杆菌K12菌株JA300(thr,leuB6,thi,thyA,trpC1117,hsrk,Hsmk,strR;DSMZ 4776)(来源:“Deutsche Sammlung furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH)。在含有12.5微克/毫升四环素的LB完全培养基中(制备:参看Sambrook,J.et al.,1989)筛选(琼脂平板)转化体并随后在液体培养基中培养。通过限制性图谱确定所需的质粒Ori pBR-TET(2012碱基对)。
1.4从质粒OripBR-TRP1,OripBR-URA3和OripBR-TET中消除一个NdeI切割位点
在基本载体OripBR-TRP1,OripBR-URA3和OripBR-TET连接中由切割位点NotI和SfiI之间的两个PCR片段形成了不需要的NdeI切割位点,随后通过一个NotI/SfiI核苷酸衔接子消除。
为此目的使用NotI和SfiI消化质粒OripBR-TRP1,OripBR-UAR3和Orip-BR-TET,通过琼脂糖凝胶电泳纯化了载体片段并与NotI/SfiI衔接子连接。通过限制性图谱确定所需的质粒(失去了NdeI切割位点)。
从相互互补的寡核苷酸N9(序列9)和N10(序列10)的杂交制备NotI/SfiI衔接子。为此目的,将寡核苷酸N9和N10各10纳摩尔(nmol)混合于100微升pH7.0和12.5毫摩尔/升MgCl2的12.5毫摩尔/升Tris-HCl中,将混合液加热5分钟至95℃并随后缓慢降至室温。
N9:5′-AGGCCGGGGGGGGGC-3′
N10:5′-GGCCGCCCCCCCCCGGCCTATA-3′
NotI/SfI衔接子
5′---
AGGCCGGGGGGGG
GC-----3′
3-
ATATCCGGCCCCCCCC
CGCCGG-5′
SfiI NotI
实施例2
原核表达盒的构建
使用的表达盒(异源转录单位)由以下元件构成:
i)可调型T5-PN25/03/04杂合启动子(Bujard,H.et al.,1987;Stuber,D.et al.,1990),
ii)合成的核糖体结合位点RBSII(Stuber,D.et al.,1990),
iii)一个具有NdeI,SalI,XmaI,EcoRV和CelII单一切割位点的多克隆切割位点以及
iv)λ-T0噬菌体转录终止子(Schwarz,E.et al.,1978)。
通过一个EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelI接头将T5-PN25/03/04杂合启动子(图3:碱基对位置:1-87)连接到λ-T0终止子(图3:碱基对位置:146-241)。
通过重新构建pDS 56/RBSII质粒(Stuber,D.et al.,1990)获得了表达盒。为此目的使用EcoRI和CelII消化pDS 56/RBSII质粒的衍生物并将使用琼脂糖凝胶电泳纯化的EcoRI/CelII-pDS 56载体片段与一个EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/EcoRV/CelII接头连接。
通过相互互补的寡核苷酸N11(序列11)和N12(序列12)的杂交制备了EcoRI-RBSII-NdeI/SalI/XmaI/ECorV/CelII接头。将寡核苷酸N11和N12各10纳摩尔混合到pH7.0和12.5毫摩尔/升MgCl2的100微升12.5毫摩尔/升Tris-HCl中,将混合液加热5分钟至95℃并随后缓慢降至室温:
N11:5′-CATTAAAGAGGAGAAATTAACTATGGTATGGTCGACCCCGGGGATATCGC-3′
N12:5′-TCAGCGATATCCCCGGGGTCGACCATACCATAGTTAATTTCTCCTCTTTAATGAATT-3′
EcoRI-RB SII-NdeI/SalI/XmalI/EcoRV/CelII接头
NdeI SalI XmaI EcoRV
3′-
TTAAGTAATTTCTCCTCTTTAATTGATACCATACCAGCTGGGGCCCCTATAG
CGACT-5 ′
ECoRI CelII
通过限制性图谱确定所需的质粒p16074a并通过DNA测序检测表达盒。
实施例3
表达质粒OripBR-TRP1-EK,OripBR-URA3-EK和OripBR-TET-EK的构建
通过PCR扩增了质粒P16074a的由可调型T5-PN25/03/04杂合启动子,合成的核糖体结合位点RBSII,具有单一切割位点NdeI,SalI,XmaI,EcoRV和CelII的多克隆切割位点和λ-TO终止子组成的表达盒(图3)并将其***质粒OripBR-TRP1,OripBR-URA3和OripBR-TET。
3.1构建表达质粒OripBR-TRP1-EK
通过PCR方法扩增了表达盒(图3),使用引物是N13(序列13)和N14(序列14)
N13:5′-AAAAAAGTAAAGGGGCTTTTCACGG-3′
N14:5′-AAAAAA
GGATCCGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCG-3′
BamHI
使用模板DNA是质粒p16074a。通过PCR方法的引物N14在表达盒的3′末端(λ-T0终止子)引入了单一的BamHI切割位点。
用限制性内切核酸酶XhoI和BamHI消化PCR产物并在琼脂糖凝胶电泳纯化后将大约255碱基对长的XhoI/BamHI片段连接到大约1490碱基对长的XhoI/BamHI-OripBR-TRP1载体片段(实施例2)。通过限制性图谱确认了所需的质粒OripBR-TRP1-EK(1728碱基对)并通过DNA测序证实了PCR扩增的表达盒的序列。
3.2构建表达质粒OripBR-URA3-EK
类似于质粒OripBR-TRP1-EK制备了表达质粒OripBR-URA3-EK(1928碱基对)。只是使用基本载体OripBR-URA3代替基本载体OripBR-TRP1。
3.3构建参照质粒OripBR-TET-EK
通过PCR方法扩增了表达盒(图3),使用N13(序列13)和N14(序列15)作为引物
N15:5′-AAAAAA
TCTAGAGATTCTCACCAATAAAAAACGCCCG-3′
XbaI
使用质粒p16 074a作为模板DNA。通过PCR方法的引物N15在表达盒的3′末端(λ-T0终止子)引入单一的XbaI切割位点。
使用限制性内切核酸酶XhoI和XbaI消化PCR产物并在琼脂糖凝胶电泳纯化后将大约255碱基对长度的XhoI/XbaI片段连接到大约2000碱基对长度的XhoI/XbaI-OripBR-TET载体片段(实施例2)。通过限制性图谱确认所需的质粒OripBR-TET-EK(2243碱基对)并通过DNA测序证实PCR扩增的表达盒序列。
实施例4
构建表达质粒OripUC-TRP1-EK,OripUC-URA3-EK和OripUC-TET-EK
在质粒OripUC-TRP1-EK,OripUC-URA3-EK和OripUC-TET-EK中,用高拷贝数的PUC质粒复制起点代替了中等拷贝数的pBR 322的复制起点。
为此目的,以N1(序列1)和N2(序列2)为引物(实施例1),以质粒pUC 20为模板DNA,通过PCR方法扩增了pUC复制起点。用SfiI和NotI消化的大约650碱基对长的SfiI/NotI-pUC复制起点片段在琼脂糖凝胶电泳纯化后连接到相应的载体片段SfiI/NotI-OripBR-TRP1-EK,SfiI/NotI-OripBR-UIRA3-EK和SfiI/NotI-OripBR-TET-EK。基于它们增加的质粒拷贝数(标准制备后质粒产量增加3-5倍)确认了所需的质粒OripUC-TRP1-EK,OripUC-URA3-EK和OripUC-TET-EK。
实施例5
构建干扰素-α2b(IFN-α2b)表达质粒
5.1合成IFN-α2b模式基因
检测了表达载体的质粒稳定性和正N-α2b的合成,其中使用了必须异源表达的干扰素-α2b基因(不含信号序列的Met-IFN-α2b结构基因)作为模式基因。
化学合成的Met-IFN-α2b结构基因基于索引标称中(Index Nominum)(国际药物手册1992/1993)声明的成熟IFN-α2b氨基酸序列。此外Met-IFN-α2b结构基因含有一个ATG起始密码子。合成的核糖体RBSII结合位点和一个单一的EcoRI切割位点位于Met-IFN-α2b结构基因5′末端的上游(StuberD.et al.,1990)。在Met-IFN-α2b基因的基因设计中考虑了优选地用于大肠杆菌的密码子(大肠杆菌密码子习惯)。此外,为了构建变体基因和重新克隆Met-IFN-α2b DNA片段,在编码区和Met-IFN-α2b结构基因末端引入了合适的单一限制性内切核酸酶切割位点(EcoRI和HindIII)。
由Genosys公司(Genosys Biotechnologies Inc.Cambrige,England)通过化学合成从寡核苷酸制备了IFN-α2b基因(RBSII-Met-IFN-α2b基因)。通过寡核苷酸的模拟退火和连接组装了双链RBSII-Met-IFN-α2b基因并随后克隆到来自Stratagene公司(Stratagene GmbH,Heidelberg,Germany)的大肠杆菌标准载体pBluescriptSK(+)的EcoRI和HindIII切割位点。通过DNA测序证实了克隆的RBSII-Met-IFN-α2b结构基因的预定的DNA序列。随后将大约535碱基对长度的EcoRI/HindIII-RBSIII-Met-IFN-α2b片段重新克隆到用EcoRI和HindIII消化的(pDS-IFN)一个pDS 56/RBSII质粒中。这就使得以大约540碱基对长度EcoRI/CelII-RBSII-Met-IFN-α2b片段的形式转移了RBSII-Met-IFN-α2b基因。
5.2构建IFN-α2b表达质粒
以大约540碱基对长度的EcoRI/CelII-RBSII-Met-IFN-α2b片段的形式从质粒pDS-IFN分离到RBSII-Met-IFN-α2b基因并随后与使用EcoRI和CelII消化的各质粒OripBR-TRP1-EK,OripBR-URA3-EK,OripBR-TET-EK,OripUC-TRP1-EK,OripUC-URA3-EK和OripUC-TET-EK连接。通过限制性图谱确认了所需的质粒OripBR-TRP1-EK-IFN,OripBR-URA3-EK-IFN,OripBR-TET-EK-IFN,OripUC-TRP1-EK-IFN,OripUC-URA3-EK-IFN和OripUC-TET-EK-IFN。
实施例6
构建不可回复突变的trpC和pyrF大肠杆菌宿主菌株
通过依据Hamilton C.M.等1989的同源重组定向删除完整基因或更大的基因片段将所需的营养缺陷型标记trpC和pyrF引入到已获得的实验室菌株中。
6.1构建缺失质粒
6.1.1构建缺失质粒pMAK705-trp D/B
为了删除完整的染色体trpC基因(1355碱基对),通过PCR方法分别将700-800碱基对的5′侧翼区(trpD)和3′侧翼区(trpB)克隆并且通过由PCR引物引入的通用切割位点(NotI)以直接融合方式(trpD/B)将其连接到载体pMAK705(Hamilton C.M.et al.,1989)。大肠杆菌色氨酸操纵子的DNA序列由Yanofsky,C.et al.,1981提供。
使用引物N16(序列16)和N17(序列17)并以染色体大肠杆菌DNA为模板扩增了trpC基因的5′侧翼区(trpD)。
N16:5′-AAAAAA
GGATCCGGGCTGAAAGTGGCGAAACACGGC-3′
BamHI
N17:5′-AAAAAA
GCGGCCGCTTACCCTCGTGCCGCCAGTGCG-3′
NotI
通过引物N16在5′末端引入了单一的BamHI切割位点并通过引物N17在扩增的trpD片段3′末端引入单一的NotI切割位点。
使用引物N18(序列18)和N19(序列19)并以染色体大肠杆菌DNA为模板扩增了trpC基因的3′侧翼区(trpB)
N18:5′-AAAAAA
GCGGCCGCGGAAAGGAACAATGACAACATTACTTAAC-3′
NotI
N19:5′-AAAAAA
GCATGCCGGTGCGCCGTGCTCGCCAGTTTCG-3′
SpHI
通过引物N18在5′末端引入了单一的NotI切割位点并通过引物N19在扩增的trpB片段的3′末端引入单一的SpHI切割位点。
用BamHI和NotI消化trpD PCR片段(大约710碱基对)并用NotI和SpHI消化trpB PCR片段(大约820碱基对)。在琼脂糖凝胶电泳纯化后,利用通用NotI切割位点通过直接融合的三片段连接方法将DNA片段连接到大约5650碱基对长度的BamHI/SpHI-pMAK 705载体片段。通过限制性图谱确认了所需的质粒pMAK 705-trp D/B(7104碱基对)并通过DNA测序证实了PCR扩增的trpD/B序列。
6.1.2构建缺失载体pMAK 705-ΔpyrF
为了从染色体pyrF基因编码区删除大约260碱基对,通过PCR方法分别将700-800碱基对的pyrF侧翼区克隆并且通过由PCR引物引入的通用切割位点(XbaI)以直接融合方式(ΔpyrF)将其连接到载体pMAK 705。大肠杆菌pyrF操纵子的DNA序列由Turnbough,C.L.Jr.et al.,1987发表。使用引物N20(序列20)和N21(序列21)并以染色体大肠杆菌DNA为模板扩增了ΔpyrF基因的5′侧翼区。
N20:5′ AAAAAA
GGATCCGTACGTAGTAAGCCTCGTTATCGTTG-3′
BamHI
N21:5′-AAAAAA
TCTAGACACACGCCTAAGTCAGCTGCAGC-3′
XbaI
通过引物N20在5′末端引入了单一的BamHI切割位点并通过引入N21在扩增的DNA片段的3′末端引入单一的XbaI切割位点。
使用引物N22(序列22)和N23(序列23)并以染色体大肠杆菌DNA为模板扩增了ΔpyrF基因的3′侧翼区
N22:5′-AAAAAA
TCTAGAGGTCAGGAGTTCAAACTGGTTACG-3′
XbaI
N23:5′-AAAAAA
GCATGCCAGCTGTCGGAGGTGTTATTGGTC-3′
SpHI
通过引物N22在5′末端引入单一的XbaI切割位点并通过引物N23在扩增的DNA片段的3′末端引入单一的SpHI切割位点。
用BamHI和XbaI消化ΔpyrF片段5′侧翼区(大约600碱基对)并用XbaI和SpHI消化ΔpyrF片段3′侧翼区。在琼脂糖凝胶电泳纯化后,利用通用XbaI切割位点通过直接融合的三片段连接方法将DNA片段连接到大约5650碱基对长度的BamHI/SPHI-pMAK705载体片段。通过限制性图谱确认了所需的质粒pMAK 705-ΔpyrF(6788碱基对)并通过DNA测序证实了PCR扩增的pyrF序列。
6.2分离大肠杆菌缺失突变体
载体pMAK 705的特征是具有温度敏感的在44℃无活性的复制起点(来自pSC 101的复制起点)和氯霉素抗性基因。为了删除染色体基因,将合适的pMAK705质粒衍生物转化到所需的大肠杆菌菌株。质粒和大肠杆菌染色体之间同源重组的前提是能够重组的大肠杆菌菌株(recA+基因型)。基因型为recA-的菌株不能进行同源重组因此不合适。
用质粒pMAK 705-trpD/B和质粒pMAK 705-ΔpyrF转化了大肠杆菌K12菌株UT 5600(ara,proC-14,LeuB6,azi-6,lacY1,tsx-67,entA403,trpE38+,rpsL109,xyl-5,mtl-1,thi-1,ΔompT)(Grodberg,J.and Dunn,J.J.,1988)。加上质粒DNA后,将转化制备物冰浴30分钟,37℃5分钟(热休克),30℃30分钟培养。将转化制备物转移到含20微克/毫升氯霉素的3毫升LB培养基并培养细胞过夜。
为了筛选质粒共合体,即通过同源重组将质粒整合到染色体的细胞,将300微升10-5稀释的过夜培养物在含有20微克/毫升的氯霉素的LB琼脂平板上铺平板。将琼脂平板在培养箱中预热至50-60℃并在将细胞铺平板后立即在精确的44℃培养。由于在此温度下pMAK 705质粒不能复制,只有在染色体中整合了质粒的细胞长成克隆。随后将共合体候选物在含有20微克/毫升氯霉素的LB琼脂平板上44℃传代2至3次用以纯化(稀释涂片(dilutionsmear))。
为了断开共合体并消除从染色体分离的质粒,将纯化的共合体克隆在不含氯霉素的LB培养基上30℃培养数代(2至6)。随后在LB培养基上稀释分离细胞并检测所需的基因型。
6.2.1缺失突变体UT 5600(ΔtrpC)的特征
通过在含有色氨酸(50毫克/毫升)和不含色氨酸(影印平板)的培养基(含0.5%酪蛋白氨基酸的M9基本培养基)上铺平板检测了通过在LB培养基上稀释分离的细胞/克隆的所需要的trp营养缺陷型。此外,通过在含有氯霉素(20微克/毫升)和不含氯霉素的LB培养基上铺平板检测了克隆的氯霉素敏感性。另外,使用PCR引物N1和N4及相应的染色体DNA作为模板DNA通过原始菌株和缺失突变体的比较PCR测定证实了染色体trpC缺失。通过理论计算,原始菌株的PCR产物大约长2900碱基对而trpC缺失突变体的PCR产物大约长1430碱基对。
6.2.2缺失突变体UT 5600(ΔpyrF)的特征
通过在含有尿嘧啶(20毫克/毫升)和不含尿嘧啶的培养基(含0.5%酪蛋白氨基酸的M9基本培养基)上铺平板检测了通过在LB培养基上稀释分离的细胞/克隆的所需要的pyrF营养缺陷型。此外,通过在含有氯霉素(20微克/毫升)和不含氯霉素的LB培养基上铺平板检测了克隆的氯霉素敏感性。另外,使用PCR引物N5和N8及相应的染色体DNA作为模板DNA通过原始菌株和缺失突变体的比较PCR测定证实了染色体pyrF缺失。通过理论计算,原始菌株的PCR产物大约长1550碱基对而pyrF缺失突变体的PCR产物大约长1290碱基对。
实施例7
异源模式基因(INF-α2b)的表达
使用作为必须异源表达的干扰素-α2b评价了基于营养缺陷型互补的非抗生素筛选的新型宿主/载体***的功能和行为表现。
7.1通过trpC营养缺陷型互补的筛选
为了表达IFN-α2b基因,在每种情况下分别用实施例5中描述的表达质粒OripBR-TRP1-EK-INF,OripUC-TRP1-EK-IFN,OripBR-TET-EK-IFN和OripUC-TET-EK-IFN中的一个转化大肠杆菌K12菌株UT 5600(ΔtrpC)(实施例6)。将转化的UT 5600(ΔtrpC)/OripBR-TRP1-EK-INF和UT 5600(ΔtrpC)/UripUC-TRP1-EK-IFN细胞在含有0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中37℃摇瓶培养并将参照细胞UT 5600(Δtrpc)/OripBR-TET-EK-IFN和OripUC-TET-EK-IFN在含有0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)和50毫克/毫升色氨酸及12.5微克/毫升四环素的M9基本培养基中37℃培养至550nm下的光密度值(OD550)为0.6-0.9并随后用IPTG(终浓度1-5毫摩尔/升)诱导。在37℃诱导4-8小时(h)后,离心收获细胞(Sorvall RC-5B离心机,GS3转头,6000rpm,15分钟),用pH7.2的50毫摩尔/开Tris-HCl缓冲液冲洗并贮存于-20℃用于进一步处理。
7.2通过pyrF营养缺陷型互补进行筛选
为了表达IFN-α2b基因,在每种情况下分别用实施例5中描述的表达质粒OripBR-URA3-EK-FN,OripUC-URA3-EK-IFN,OripBR-TET-EK-FN和OripUC-TET-EK-FN中的一个转化大肠杆菌K12菌株UT 5600(ΔpyrF)(实施例6)。将转化的UT 5600(ΔtrpC)/OripBR-URA 3-EK-IFN和UT5600(ΔtrpC)/OripUC-URA3-EK-IFN细胞在含有0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)的M9基本培养基中37℃摇瓶培养并将参照细胞UT 5600(ΔtrpC)/OripBR-TET-EK-IFN和OripUC-TET-EK-IFN在含有0.5%酪蛋白氨基酸(Difco)和20毫克/毫升尿嘧啶及12.5微克/毫升四环素的M9基本培养基中37℃培养至550nm下的光密度值(OD550)为0.6-0.9并随后用2PTG(终浓度1-5毫摩尔/升)诱导。在37℃诱导4-8小时(h)后,离心收获细胞(Sorvall RC-5B离心机,GS3转头,6000rpm,15分钟),用pH7.2的50毫摩尔/升Tris-HCl缓冲液冲洗并贮存于-20℃用于进一步处理。
7.3标准***中的表达测定
在使用表达质粒OripBR-TRP1-EK-IFN,OripUC-TRP1-EK-FN,OripBR-URA3-EK-IFN,OripUC-URA3-EK-IFN,OripBR-TET-EK-IFN和OripUC-TET-EK-IFN转化的UT 5600(ΔtrpC)或UT 5600(ΔpyrF)细胞中测定了IFN-α2b的合成。为此目的将3OD550单位(1OD550=1毫升OP550值为1的细胞悬液)的离心培养物细胞沉淀重新悬浮于0.25毫升pH7.2的10毫摩尔/升Tris-HCl中并使用Branson公司(Heusenstamm,Germany)的Sonifier细胞破碎器B15(Sonifier Cell Disurptor B15)通过超声波处理(50%强度的30秒脉冲2次)裂解细胞。沉淀了不可溶的细胞组分(Eppendorf 5415离心机,14000rpm,5分钟)并将上清混合于1/5体积(VOL)5×SDS样品缓冲液(1×SDS样品缓冲液:50毫摩尔/升Tris-HCl,pH6.8,1%SDS,1%巯基乙醇,10%甘油,0.001%溴酚蓝)。将不可溶的细胞碎片部分(沉淀)重新悬浮于0.3毫升含6-8M脲的1×SDS样品缓冲液,将样品在95℃温育5分钟。随后通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)(Laemmli,U.K.,1970)分离蛋白并用考马斯亮蓝染色。
合成的IFN-α2b蛋白质是均质的并且仅以不可溶蛋白聚集体,即称为包涵体(IBs)的形式存在于不可溶的细胞碎片组分中。在测量精度范围内,所有克隆/细胞的表达产量为相对于总大肠杆菌蛋白量的30-50%。
实施例8
质粒稳定性的检测
在细胞诱导前取样(实施例7)并进行质粒稳定性测定。为此目的,使用含0.5%酪蛋白氨基酸的M9基本培养基直接稀释样品并在每一稀释步骤取300微升在非选择性琼脂平板(补充有0.5%酪蛋白氨基酸,50毫克/毫升色氨酸和20毫克/毫升尿嘧啶的M9基本培养基)上铺平板。随后将来自每一克隆的400个单独的克隆首先在合适的选择琼脂平板(含有0.5%酪蛋白氨基酸的M9基本培养基或补充有0.5%酪蛋白氨基酸,50毫克/升色氨酸,20毫克/毫升尿嘧啶和12.5微克/毫升四环素的M9基本培养基)然后在非选择性琼脂平板(补充有0.5%酪蛋白氨基酸,50毫克/升色氨酸和20毫克/升尿嘧啶的M9基本培养基)上用牙签涂层。
从在两种琼脂平板上均形成克隆的细胞数量确定含质粒的细胞数量。在选择性琼脂平板上不能生长的细胞失去了用于互补营养缺陷型的基因或形成了抗生素抗性(TET参照质粒)。在细胞诱导前,所有的培养物质粒稳定性为100%,与选择方法无关,与质粒类型无关。
参者文献表
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ttttttggag atcaggtcga ggtggcccgg ctcc 94
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aaaaaagcat gccagctgtc ggaggtgtta ttggtc 36
Claims (8)
1.不能与生物体基因组同源重组的最小原核表达载体,含有:
a)一个复制起点,
b)一个与宿主细胞所用的原核生物异源的营养缺陷型真核标记基因,
c)一个在原核生物中有功能活性的启动子以及
d)一个在上述启动子控制下的要表达的外源基因。
2.权利要求1所述的表达载体,其中营养缺陷型真核标记基因和要表达的外源基因方向相反并且由相同终止子终止。
3.权利要求1或2所述的表达载体,其中的营养缺陷型真核标记补偿色氨酸,亮氨酸或尿嘧啶缺陷。
4.权利要求1或2所述的表达载体,其中当能够互补上述宿主细胞中的营养缺陷型时,营养缺陷型真核标记基因的表达量只有宿主细胞总蛋白量的1%或更低但大于0。
5.权利要求3中所述的表达载体,其中当能够互补上述宿主细胞中的营养缺陷型时,营养缺陷型真核标记基因的表达量只有宿主细胞总蛋白量的1%或更低但大于0。
6.含有权利要求1至5中任一项所述载体的原核宿主细胞,其中宿主细胞在染色体基因上含有相应于表达载体营养缺陷型真核标记基因的突变,而突变的结果是上述宿主细胞染色体基因不表达功能性产物。
7.构建原核表达***的方法,其中将权利要求1至5中任一项所述的表达载体引入到在染色体基因上有突变的原核宿主细胞,该突变能由表达载体的营养缺陷型真核标记基因互补并且染色体突变的结果是上述宿主细胞染色体基因不能表达功能产物。
8.通过权利要求1至5中任一项所述的表达载体上的外源基因的异源表达产生异源蛋白质以及从宿主细胞或上清中分离表达产物的方法,其中权利要求1至5中任一项所述的表达载体包含在权利要求6中所述宿主细胞中,宿主细胞的发酵在基本培养基或合成的完全培养基中进行。
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