JP2009022298A

JP2009022298A - 多量のクラブラン酸を産生する微生物

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Publication number: JP2009022298A
Application number: JP2008256485A
Authority: JP
Inventors: Barry Barton; バリー・バートン; John Patrick Griffin; ジョン・パトリック・グリフィン; Roy Henry Mosher; ロイ・ヘンリー・モシャー; Ashish Sudhakar Paradkar; アシシュ・サドハカール・パラドカール; Susan Jensen; スーザン・ジェンセン; Cecilia Anders; セシリア・アンダース
Original assignee: University of Alberta; SmithKline Beecham Ltd
Current assignee: University of Alberta; SmithKline Beecham Ltd
Priority date: 1997-02-04
Filing date: 2008-10-01
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2018-02-02
Also published as: CN1696301A; CN1251612A; WO1998033896A3; DZ2413A1; JP2001511001A; AR011100A1; EP0970198B1; EA003773B1; US20030124690A1; AP1320A; EA199900718A1; CA2279207A1; US20030166175A1; EP1405913A3; KR100514964B1; BR9807144A; UY24874A1; WO1998033896A2; JP4227199B2; US6936458B1

Abstract

【課題】５Ｒクラバム、例えばクラブラン酸の製造を改善する方法を提供する。
【解決手段】５Ｓクラバムを少ししか産生しないか、または全く産生しない生物について予備スクリーニングしてなるクラブラン酸を多量に産生する生物の同定方法を改善することもできる。
【選択図】なし

Description

本発明は、クラバム（clavam）、例えばクラブラン酸の製造を改善する方法に関する。

微生物とりわけストレプトミセス（Streptomyces）種はクラブラン酸ならびに他のクラバム、セファロスポリン、ポリケチド、セファマイシン、ツニカマイシン、ホロマイシンおよびペニシリンを包含する多くの抗生物質を産生する。微生物が産生するこれらの抗生物質の絶対および相対量を操作できるというのは非常に興味深いことであり、従って生合成経路の代謝および遺伝メカニズムを調査するために非常に多くの研究が為されている［Domain,A.L.「Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics」、50years of Pensillin applications，history and trendsより]。代謝経路の種々の工程で作用する多くの酵素およびこれらの酵素をコードする遺伝子が知られている。

クラバムはその環の立体化学により任意に二つの群に分けられる（５Ｓおよび５Ｒクラバム）。５Ｒおよび５Ｓクラバムの生合成に関する生化学的経路は十分には解明されていないが、これらのクラバムが同一の出発ユニットに由来することが示唆されている（未だ同定されていない三炭素化合物[Townsend,C.A.およびHo,M.F.、J.Am.Chem.Soc.107(4):1066-1068（1985）並びにElson,S.W.およびOliver,R.S.、J.Antibiotics XXXI(6):568（1978）]およびアルギニン[Valentine,B.P.ら、J.Am.Chem.Soc.15:1210-1211（1993）]並びにいくつかの共通する中間物質[Iwata-Reuyl,D.およびC.A.Townsend、J.Am.Chem.Soc.114:2762-2763（1992）並びにJanc,J.W.ら、Bioorg.Med.Chem.Lett.3:2313-2316（1993）]を共有する）。

５Ｓクラバムの例としてはクラバム−２−カルボキシレート（Ｃ２Ｃ）、２−ヒドロキシメチルクラバム（２ＨＭＣ）、２−（３−アラニル）クラバム、バルクラバムおよびクラバミン酸（GB1585661、Rohl,F.ら、Arch. Microbiol. 147：315-320、US4202819）が挙げられる。しかしながら５Ｒクラバムにはあまり例がなく、最もよく知られているのはβ−ラクタマーゼインヒビターのクラブラン酸であり、これはストレプトミセス・クラブリゲルス（Sreptomyces clavuligerus）の醗酵により産生される。クラブラン酸はクラブラン酸のカリウム塩の形態で、抗生物質AUGMENTIN（商標SmithKline Beecham）ではβ−ラクタムアモキシシリンと組み合わせている。商業上、クラバムの生合成を理解するための研究は、エス・クラブリゲルス（S.clavuligerus）による５Ｒクラバム、クラブラン酸の生合成に集中している。クラブラン酸の生合成に関係する多くの酵素およびそれらの遺伝子が同定され、かつ公開されている。例えば、このような公開物としては、Hodgson,J.E.ら、Gene 166:49-55（1995）、Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46（1994）、Paradkar,A.S.ら、J.Bact.177(5):1307-1314（1995）が挙げられる。反対に、エス・クラブリゲルス（S.clavuligerus）のクラブラン酸生合成経路においてクラバミン酸シンターゼの作用により産生されるクラブラン酸前駆体であるクラバミン酸以外の５Ｓクラバムの生合成および遺伝学についてはなにも知られていない。

遺伝子クローニング実験により、エス・クラブリゲルスが２種のクラバミン酸シンターゼイソ酵素、cas１およびcas２[Marsh,E.N.ら、Biochemistry 31:12648-12657（1992）]を含有し、これらは共に特定の栄養条件下でクラブラン酸産生に寄与できる[Pardkar,A.S.ら、J.Bact.177(5):1307-1314（1995）]ことが証明されている。クラバミン酸シンターゼ活性はまた別のクラブラン酸産生微生物、すなわちエス・ジュモンジネンシス（S.jumonjinensis）[Vidal,C.M. ES550549（1987）]およびエス・カツラハマヌス（S.katurahamanus）[Kitano,K.ら、JP53-104796（1978）]並びに５Ｓクラバム、バルクラバムを産生するエス・アンチビオティコス（S.antibioticos）[Baldwin,J.E.ら、Tetrahedron Letts.35(17):2783-2786（1994）]においても検出されている。後者の文献ではエス・アンチビオティコスが、クラブラン酸生合成に関与することがわかっているもう一つ別の酵素であるプロカルバミン酸アミジノヒドロラーゼ活性を有することも報告されている。クラバム生合成に関与するとして同定されたエス・クラブリゲルスのその他の全ての遺伝子がクラブラン酸生合成に必要であると報告されている[Hodfson,J.E.ら、Gene 166:49-55（1995）、Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46（1994）]が、今のところ５Ｓクラバムの生合成に特異的な遺伝子は報告されていない。
Ｄｏｍａｉｎ，Ａ．Ｌ．「Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ」、５０ｙｅａｒｓｏｆＰｅｎｓｉｌｌｉｎａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｈｉｓｔｏｒｙａｎｄｔｒｅｎｄｓＴｏｗｎｓｅｎｄ，Ｃ．Ａ．およびＨｏ，Ｍ．Ｆ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７（４）：１０６６−１０６８（１９８５）Ｅｌｓｏｎ，Ｓ．Ｗ．およびＯｌｉｖｅｒ，Ｒ．Ｓ．、Ｊ．ＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓＸＸＸＩ（６）：５６８（１９７８）Ｖａｌｅｎｔｉｎｅ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１５：１２１０−１２１１（１９９３）Ｉｗａｔａ−Ｒｅｕｙｌ，Ｄ．およびＣ．Ａ．Ｔｏｗｎｓｅｎｄ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：２７６２−２７６３（１９９２）Ｊａｎｃ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．３：２３１３−２３１６（１９９３）Ｒｏｈｌ，Ｆ．ら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７：３１５−３２０Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ１６６：４９−５５（１９９５）Ａｉｄｏｏ，Ｋ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅ１４７：４１−４６（１９９４）Ｐａｒａｄｋａｒ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７７（５）：１３０７−１３１４（１９９５）Ｍａｒｓｈ，Ｅ．Ｎ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３１：１２６４８−１２６５７（１９９２）Ｐａｒｄｋａｒ，Ａ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｂａｃｔ．１７７（５）：１３０７−１３１４（１９９５）Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｊ．Ｅ．ら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔｓ．３５（１７）：２７８３−２７８６（１９９４）Ｈｏｄｆｓｏｎ，Ｊ．Ｅ．ら、Ｇｅｎｅ１６６：４９−５５（１９９５）Ａｉｄｏｏ，Ｋ．Ａ．ら、Ｇｅｎｅ１４７：４１−４６（１９９４）

この度、本発明者らは、エス・クラブリゲルスにおいて５Ｓクラバム、例えばＣ２Ｃおよび２ＨＭＣで例示される生合成に特異的な特定の遺伝子を同定した。従って、本発明はエス・クラブリゲルスの５Ｓクラバム生合成に特異的であるが５Ｒクラバム（例えばクラブラン酸）生合成には必須でない１個またはそれ以上の遺伝子を含んでなるＤＮＡを提供する。

本明細書で用いる「遺伝子」なる用語はまた、遺伝子機能または発現に必要ないずれの制御領域をも包含する。好ましい態様において、ＤＮＡは図１のように同定されたものである。好ましくはＤＮＡは図１においてorfup３、orfup２、orfup１、orfdwn１、orfdwn２およびorfdwn３と称されるヌクレオチド配列を含んでなる。本発明はまた該ＤＮＡによりコードされるタンパク質をも提供する。本発明はまた本発明のＤＮＡを含んでなるベクターおよびかかるベクターを含有する宿主をも提供する。

意外にも、本発明者らは、本発明による遺伝子の少なくとも一つに欠損がある場合、生物が産生するクラブラン酸の量が増加することを見出した。従って本発明はまた適当な微生物が産生するクラブラン酸の量を増加させる方法をも提供する。本発明の一つの態様において、同定された遺伝子を操作しては多量のクラバム、適当にはクラブラン酸の産生能を有する生物を作ることができる。この知見によりまた５Ｓクラバムを少ししか産生しないか、または全く産生しない生物について予備スクリーニングしてなるクラブラン酸を多量に産生する生物の同定方法を改善することもできる（例えば本明細書の実施例に記載するＨＰＬＣおよび／またはクラバムバイオアッセイによる）。

適当には本発明の５Ｓクラバム遺伝子は、本発明で得られる配列に基づいて慣用的なクローニング法（例えばＰＣＲ）により得ることができる。遺伝子の機能は、遺伝子破壊［Aidoo,K.A.ら、Gene 147:41-46（1994）]、ランダム変異誘発、位置指定変異誘発およびアンチセンスＲＮＡのごとき遺伝学的技術により妨げるかまたは排除／欠失させることができる。

本発明のさらなる態様において、1個またはそれ以上の欠損遺伝子を含有するプラスミド、好ましくは以下に記載するプラスミドｐＣＥＣ０６０、ｐＣＥＣ０６１、ｐＤＥＳ３、ｐＣＥＣ０５６およびｐＣＥＣ０５７を提供する。遺伝子は、
例えばその遺伝子の作用を完全に破壊する抗生物質抵抗性遺伝子をコードするＤＮＡフラグメントを挿入する、種々の方法で欠損させることができる。別法として、抗生物質抵抗性遺伝子をコードしないＤＮＡの挿入、遺伝子の一部の欠失、遺伝子全ての欠失または１またはそれ以上のヌクレオチドの付加および／または置換による遺伝子のヌクレオチド配列の変化を含む、別の方法を用いて欠損遺伝子を作ることができる。本発明による欠損遺伝子は種々の程度で欠損させたものであってもよい。遺伝子の活性を完全に破壊するかまたは原活性の一部を保持するように遺伝子を欠損させてもよい。

適当には、本発明のプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスのごとき生物、例えばＡＴＣＣ２７０６４株（これはエス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５に対応する）を形質転換することができる。適当な形質転換の方法は以下の関連文献に見出すことができる：Sambrook，J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T.、Molecular cloning：a laboratory manual第2編（1989）、ColdSpring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor，N.Y.；Hopwood，D.A.ら、Genetic Manipulation of Streptomyces．A Cloning Manual（1985）並びにParadkar，A.S.およびJensen,S.E.、J.Bacteriol.177(5):1307-1314（1995）。

エス・クラブリゲルス種の株を工業的に用いてクラブラン酸（クラブラン酸カリウム）を製造することができる。英国および米国薬局方ではクラブラン酸カリウムに関して（英国薬局方1993年、補遺14994年、1362-1363頁および米国薬局方 Official Monographs 1995年、USP23 NF18、384-385頁）、毒性のある５Ｓクラバム、クラバム−２−カルボキシレートの量を具体的に制限している。

従って本発明のさらなる態様において、多量のクラブラン酸を産生できるがＣ２Ｃを作ることができないか、または多量のクラブラン酸を産生できるがＣ２Ｃは少ししか産生しない生物を提供する。適当にはクラブラン酸産生生物は１個またはそれ以上の欠損クラバム遺伝子を含有し、好ましくは以下に記載するエス・クラブリゲルス株５６−１Ａ、５６−３Ａ、５７−２Ｂ、５７−１Ｃ、６０−１Ａ、６０−２Ａ、６０−３Ａ、６１−１Ａ、６１−２Ａ、６１−３Ａおよび６１−４Ａである。かかる生物は、５Ｓクラバム、クラバム−２−カルボキシレートを産生することなく、またはクラバム−２−カルボキシレートの産生が著しく少ない状態で、クラブラン酸を産生するのに適している。

実施例
実施例では特記する以外、全ての方法はSambrook，J.、Fritsch,E.F.およびManiatis，T.、Molecular Cloning A Laboratory Manual（第2編）（1989）、またはHopwood,D.A.ら、Genetic Manipulation of Streptomyces，A Cloning Manual（1985）並びにParadkar,A.S.およびJensen,S.E.、J.Bacteriol. 177(5):1307-1314（1995）に記載されるとおりである。

Ｉ.ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）染色体のクラバミネートシンターゼ遺伝子cas１の上流および下流のＤＮＡシークエンシング
Ａ.cas１の単離
ストレプトミセス・クラブリゲルス（Streptomyces clavuligerus）ＮＲＲＬ３５８５からクラバミネートシンターゼアイソザイム１（cas１）の遺伝子をコードする染色体ＤＮＡフラグメントを単離するために、予め配列決定したcas１遺伝子［Marsh,E.N.、Chang,M.D.T.およびTownsend,C.A.、Biochemistry 31：12648-12657（1992）]のヌクレオチド９−４４に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブＲＭＯ１を合成した。Applied Biosystems社製391 DNA Synthesiserを用いて常法でオリゴヌクレオチドを構築した。ＲＭＯ１（３６量体）の配列をMarshら（1992年、前掲）により公開された配列に対してアンチパラレルセンスにて合成し、ＲＭＯ１をＤＮＡオリゴヌクレオチド末端標識に関する常法で（Sambrookら、1989年、前掲）^３２Ｐで放射性標識し、これを用いてStahlおよびAmann（Nucleic acid techniques in bacterial systematics、E.StackebrandtおよびM.Goodfellow編、Tronto：John Wiley and Sons、205-248頁、1991年）に記載されるサザンハイブリダイゼーションによりストレプトミセス・クラブリゲルスゲノムＤＮＡのコスミドバンクをスクリーニングした。コスミドｐＬＡＦＲ３内に調製したエス・クラブリゲルス（S.clavuligerus）ＤＮＡのゲノムバンクに関してはDoran,J.L.ら、J.Bacteriol.172(9):4909-4918（1990）に記載されている。

エス・クラブリゲルス・コスミドバンクのコロニーブロットを５ｘＳＳＣ、５ｘDenhardt溶液、および０.５％ＳＤＳ（１ｘＳＤＳ：０.１５ＭＮａＣｌ＋０.０１５Ｍクエン酸三ナトリウム；１ｘDenhardt溶液：０.０２％ＢＳＡ、０.０２％ Ficollおよび０.０２％ＰＶＰ）からなる溶液中６０℃で一晩放射性標識したＲＭＯ１と共にインキュベートした。次いでブロットを０.５ｘＳＳＣ＋０.１％ＳＤＳ溶液中６８℃で３０分間洗浄した。ＲＭＯ１と強固にハイブリダイズし、制限エンドヌクレアーゼSacIおよびEcoRIで消化すると、エス・クラブリゲルスゲノムＤＮＡの消化物を用いる類似実験で検出されるハイブリダイゼーションシグナルと合致する、ハイブリダイゼーションシグナルを付与する、１個のコスミドクローン１０Ｄ７を単離した。

Ｂ．cas１を側面に付加するエス・クラブリゲルス染色体のＤＮＡシークエンシング
制限エンドヌクレアーゼSacI、NcoIおよびKpnIを用いてコスミド１０Ｄ７の部分制限地図を作成した。ＲＭＯ１および１０Ｄ７ＤＮＡの種々消化物とのサザンハイブリダイゼーション実験によりcas１はたいてい７キロベースのSacI−SacI ＤＮＡサブフラグメントの一方の末端に位置することが示された。このフラグメントはcas１オープン・リーディング・フレームおよび上流のＤＮＡ約６キロベースから成る。次いでファージミドベクターpBluescriptＩＩＳＫ＋（２.９６キロベース；Stratagene）中１０Ｄ７のSacI消化物から７キロベースのフラグメントをサブクローニングし、このように組み換えプラスミドｐＣＥＣ０００７を作った。

cas１の上流の染色体のシークエンシング方法を容易にするために、７キロベースのSacI−SacIフラグメントの３キロベースのNcoI−NcoIサブフラグメントを両方の配向でｐＵＣ１２０［３.２キロベース；VieirraおよびMessing、Methods Enzymol.153:3-11（1987）］にサブクローニングし、組み換えプラスミドｐＣＥＣ０２６およびｐＣＥＣ０２７を作った。３キロベースのサブフラグメントはcas１のアミノ末端コード化部分および上流のＤＮＡ約２.６キロベースからなる。

エクソヌクレアーゼＩＩＩおよびＳ１ヌクレアーゼ消化を用いてプラスミドｐＣＥＣ０２６およびｐＣＥＣ０２７の両方で重複する入れ子欠失部を創製し（Sambrookら、1989年、前掲）、Taq dye−deoxy^aターミネーターキットおよびApplied Biosystems社製373A Sequencerを用いてジデオキシ鎖終結法［Sanger, F.、Nicklen,S.およびCoulson,A.R.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:5463-5467（1977）］により３キロベースのNcoI−NcoIフラグメントのＤＮＡ配列を両方の鎖で決定した。

cas１のすぐ下流の染色体のＤＮＡ配列を決定するために、ｐBluescriptＩＩＳＫ＋中でコスミドクローン１０Ｄ７から４.３キロベースのKpnI−EcoRI ＤＮＡフラグメントをサブクローニングし、ｐＣＥＣ０１８を作った。ｐＳＬ１１８０（３.４２２キロベース、Pharmacia）中でｐＣＥＣ０１８から３.７キロベースのSacI−SacIサブフラグメントをクローニングした；このフラグメントのSacI末端の一つはcas１のＴＧＡ停止コドンと部分的に重複し、もう一つはコード化ベクターであった。サブクローニング中に両方向の３．７キロベースのフラグメントを得、得られた組み換えプラスミドをｐＣＥＣ０２３およびｐＣＥＣ０２４と称した。両方のプラスミドで重複する入れ子欠失部を創製し、３.７キロベースのフラグメントのＤＮＡ配列を両方の鎖で決定した。これらの実験で生じたエス・クラブリゲルス染色体のヌクレオチド配列およびcas１フランキング配列を図１に示す。

ＩＩ．cas１を側面に付加するオープン・リーディング・フレームの機能分析
cas１の上流にあるＤＮＡ配列をコンピューター分析に付し、２個の完全なorfおよび１個の不完全なorfの存在を予測した。３個のorfは全てcas１とは反対のＤＮＡ鎖上に位置し、従って逆方向に配向する。第１のオープン・リーディング・フレームであるorfup１はcas１の上流５７９塩基対に位置し、３４４個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。第２のオープン・リーディング・フレームであるorfup２はorfup１の３'末端を越えて４３７塩基対に位置し、１５１個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。orfup２の向こうがorfup３である。orfup３の出発コドンはorfup２の翻訳停止コドンと重複し、これは２個のorfが共役して翻訳されることを示唆している。orfup３の翻訳停止コドンは３キロベースのNcoI−NcoIフラグメントには存在しなかった。

cas１の下流にあるＤＮＡ配列を同様な分析に付し、２個の完全なorfおよび１個の不完全なorfの存在を予測した。２個のorfはcas１とは反対のＤＮＡ鎖上に位置し、従ってcas１には順方向にある。第3のorfはcas１と同じ鎖上に位置し、そこから離れて行くように配向する。第１の下流のオープン・リーディング・フレームであるorfdwn１はcas１の下流３７３塩基対に位置し、３２８個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。第２のオープン・リーディング・フレームであるorfdwn２はorfdwn１の上流５５塩基対に位置し、３９４個のアミノ酸のポリペプチドをコードする。orfdwn２の上流３１５塩基対の反対の鎖がorfdwn３である。３.７キロベースのフラグメントではorfdwn３の停止コドンが観察されなかったので、これは２１９個のアミノ酸の不完全なポリペプチドをコードする。

orfupおよびorfdwnオープン・リーディング・フレームの遺伝子破壊
クラブラン酸およびエス・クラブリゲルスにより産生されるその他のクラバムの生合成におけるcas１を側面に付加するオープン・リーディング・フレームの考え得る役割を評価するために、遺伝子置換により挿入不活化または欠失変異体を創製した。遺伝子破壊および置換に用いた方法は本質的にParadkar Jensenに記載されたもの（1995年、前掲）である。

Ａ．orfup１
アプラマイシン抵抗性遺伝子（apr^r）を担持する１.５キロベースのNcoI−NcoIフラグメントをParadkar Jensenに記載されるように（1995年、前掲）構築し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を作り（Sambrookら、1989年、前掲）、BasBIで消化しクレノウフラグメントで同様に処理したｐＣＥＣ０２６にライゲートした。ｐＣＥＣ０２６はorfup１内で翻訳開始コドンから６３６塩基対のところに位置するBasBI部位を有する。ライゲーション混合物を用いてイー・コリ（E.coli）ＧＭ２１６３のコンピテント細胞［New England Biolabsより入手可能、米国、Marinus,M.G.ら、ＭＧＧ122;:288-289（1983））］を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からプラスミドｐＣＥＣ０５４およびｐＣＥＣ０５５を含有する２個のクローンを単離した；制限分析によりｐＣＥＣ０５４はorfup１と同じ配向で挿入されたapr^r−フラグメントを有するが、ｐＣＥＣ０５５はこれを反対の配向で有することが認められた。

ｐＣＥＣ０５４をエス・クラブリゲルスに導入するために、プラスミドＤＮＡをBamHIおよびHindIIIで消化し、コピー数の多いストレプトミセスベクターｐＩＪ４８６［６．２キロベース；Wardら、Mol.Gen.Genet.203:468-478（1986）］にライゲートした。次いでライゲーション混合物を用いてイー・コリ（E.coli）ＧＭ２１６３のコンピテント細胞に形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からシャトルプラスミドｐＣＥＣ０６１有する１個のクローンを単離した。次いでプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５を形質転換した。得られた形質転換体を非選択性培地で胞子形成を連続して２ラウンド行い、次いでレプリカ平板法により抗生物質を含有する培地に移し、アプラマイシン抵抗性およびチオストレプトン感受性形質転換体を同定した。この方法により４個の推定変異体（６１−１Ａ、−２Ａ、−３Ａおよび−４Ａ）を選別し、さらなる分析に供した。

これらの推定変異体のorfup１が破壊されていることを確認するために、６１−１Ａおよび６１−２Ａ単離体からゲノムＤＮＡを調製し、SacIで消化し、サザンブロット分析に供した。サザンブロットの結果は二重交差が生じたことで合致し、これらの変異体がorfup１の真の破壊置換変異体であることを示している。

変異体６１−１Ａ、−２Ａ、−３Ａおよび−４ＡをSoya−Flour培地で成長ささせ、その培養上澄をクラブラン酸およびクラバム産生物に関してＨＰＬＣにより検定した。Soya−Flour培地の組成およびはＨＰＬＣによるクラバムの検定方法は、ＨＰＬＣアッセイのラニング緩衝液を０.１ＭＮａＨ_２ＰＯ_４＋６％メタノール、ｐＨ３．６８（氷酢酸で調整）で構成すること以外は予め報告した（ParadkarおよびJensen、1995年、前掲）とおりである。ＨＰＬＣ分析によれば、変異体はいずれも検出可能な濃度のクラバム−２−カルボキシレートまたは２−ヒドロキシメチルクラバムを産生しないことがわかった。さらに、PruessおよびKellettの方法［J.Antibiot.36:208-212(1983)］を用いて培養上澄をバシラス（Bacillus）種ＡＴＣＣ２７８６０に対してバイオアッセイを行った場合、変異体はいずれも検出可能な濃度のアラニルクラバムを産生しなかった。対照的に、野生型と比較した場合、変異体がより高濃度のクラブラン酸を産生するようであることが培養上澄のＨＰＬＣアッセイによりわかった（表１）。

orfup１欠失
クローニング実験を行い、orfup１のAatII部位間の６５４ヌクレオチドの遺伝子欠失を作った。以下に列記したオリゴヌクレオチドプライマーおよび鋳型として前記したｐＣＥＣ０６１を用いてＰＣＲ産生物を作った。PstIをオリゴ11に、SphI部位をオリゴ１４に組み込み元のヌクレオチド配列を変化させた。

オリゴヌクレオチド対１を用いてＰＣＲ産生物１を作る
プライマー１１ 5’ dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3’
プライマー１２ 5’ dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3’

オリゴヌクレオチド対２を用いてＰＣＲ産生物２を作る
プライマー１３ 5’ dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3’
プライマー１４ 5’ dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3’

ＧＲＩ（Felsted，Dunmow，Essex，ＣＭ６３ＬＤ）のＰＴＣ−２００Peltier thermal cyclerを用いて標準的なＰＣＲ反応を実施した。

プライマー１１および１２を用いてＰＣＲ産生物１を作った。この産生物は約１キロベースであり、第２のAatII部位からのorfup１のカルボキシ末端および下流領域を有する。

プライマー１３および１４を用いてＰＣＲ産生物２を作った。この産生物は約１.１キロベースであり、第１のAatII部位からのorfup１のアミノ末端および上流領域を有する。
使用説明書に従い、ＰＣＲ産生物２をSrfI消化ｐＣＲ−Script AmpＳＫ（＋）（Strategene Ltd、Cambridge Science Park、Milton Road、CambridgeＣＢ４４ＧＦ）にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてEpicurian イー・コリ（E.coli）ＸＬ１−BlueＭＲＦ’ Kanのスーパーコンピテント細胞（Strategeneより入手可能）を形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した（製造者の指示どおり）。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、ＤＮＡ制限分析により７個のクローンがＰＣＲ産生物２をライゲートしたプラスミドを含有することが示された。これらのプラスミドの一つをｐＤＥＳ１と称する。

ＰＣＲ産生物１をPstIおよびAatIIで消化し、得られたＤＮＡをアガロースゲル電気泳動によりフラクションに分けた。１キロベースのフラグメントを切り取り、Sephaglas band prepキット（Pharmacia，St Albans，Herts，ＡＬＩ３ＡＷ）を用いてゲルから溶出した。単離したフラグメントを次いでAtaIIおよびPstI消化したｐＤＥＳ１にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリＸＬ１−Blueのコンピテント細胞（Strategeneより入手可能）に形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した（製造者の指示どおり）。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により１個のクローンがＰＣＲ産生物１をライゲートしたプラスミドを含有することが示された。このプラスミドをｐＤＥＳ２と称する。

ｐＤＥＳ２をエス・クラブリゲルスに導入するために、プラスミドがストレプトミセス内で機能できる複製起点を含有するようにさらに修飾した。この修飾を達成するためにｐＤＥＳ２のプラスミドＤＮＡをEcoRIおよびHindIIIで消化し、またEcoRIおよびHindIIIで消化したコピー数の多いストレプトミセスベクターｐＩＪ４８６［６．２キロベース：Wardら、Mol.Gen.Genet.203:468-478（1986）］にライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリのコンピテント細胞（ＪＭ１０９）（Strategene Ltd.）に形質転換してアンピシリン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により６個のクローンがｐＩＪ４８６を含有するｐＤＥＳ２をを有することが示された。これらのプラスミドの一つをｐＤＥＳ３と称する。プラスミドｐＤＥＳ３を用いてorfup１遺伝子が既にアプラマイシン抵抗性遺伝子の挿入により破壊されているエス・クラブリゲルス株（前記のとおり）を形質転換した。チオストレプトン抵抗性形質転換体を選別して、次いでこれらの形質転換体を非選択性培地で胞子形成を３ラウンド行い、アプラマイシン抵抗性の損失に関してスクリーニングした。この方法によりアプラマイシン抵抗性を損失した変異体４５個が同定された。次いでこれらをＨＰＬＣにより分析し、これらの株が、通常クラバム２カルボキシレートおよび２−ヒドロキシメチルクラバムを産生する条件下で醗酵させた場合、orfup１破壊体６１−１Ａ、６１−２Ａ、６１−３Ａおよび６１−４Ａのようにこれらのクラバムを産生できないことを確認した。

Ｂ．orfdwn１およびorfdwn２
最初にｐＣＥＣ０１８（７．３キロベース）をNcoIで消化し、ほとんどのorfdwn１およびorfdwn２の一部を含有する１キロベースのサブフラグメントを遊離させて、orfdwn１およびorfdwn２における欠失／置換変異体を創製した。消化物をアガロース電気泳動によりフラクションに分け、６．３キロベースのフラグメントを切り取り、ゲルから溶出した。次いでこのフラグメントをapr^rを担持するNcoI-NcoIＤＮＡフラグメントにライゲートし、これを用いてイー・コリXL1-Blueを形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。この実験により１個のクローンを得たが、得られた組み換えプラスミドの制限分析によりアプラマイシン抵抗性フラグメントの２個のコピーが欠失プラスミドにライゲートしたことが明らかになった。apr^r-フラグメントの余分なコピーを排除するためにプラスミドをNcoIで消化し、自己ライゲートさせた。ライゲーション混合物を用いてイー・コリＧＭ２１６３を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与した。その形質転換体から、プラスミドｐＣＥＣ０５２およびｐＣＥＣ０５３を含有する２つのクローンを単離する；それらは共にapr^r-フラグメントのコピーを1個だけ有し、ｐＣＥＣ０５２はorfdwn１および２に関して逆方向のapr^r-フラグメントを有するが、ｐＣＥＣ０５３はorfdwn１および２と順方向に挿入されたapr^r-フラグメントを有する。

BamHI消化ｐＣＥＣ０５２を同様に消化したｐＩＪ４８６とライゲートし、イー・コリＧＭ２１６３を形質転換してアプラマイシン抵抗性を付与することによりｐＣＥＣ０５２のシャトルプラスミドを構築した。この実験によりシャトルプラスミドｐＣＥＣ０６０を含有する１個のクローンを単離した。このプラスミドを用いて野生型エス・クラブリゲルス３５８５を形質転換してアプラマイシンおよびチオストレプトン抵抗性を付与した。得られた形質転換体を非選択的条件下で胞子形成を２ラウンド行い、次いで平板プレート法により抗生物質含有培地に移してアプラマイシン抵抗性、チオストレプトン感受性コロニーを同定した。推定変異体３個（６０−１Ａ、−２Ａおよび−３Ａ）を選別して、さらなる分析に供した。

これらの推定変異体を同定するために、６０−１Ａおよび６０−２Ａ株からゲノムＤＮＡを単離し、SacIかまたはBstEIIのいずれかで消化し、サザンブロット分析に供した。この実験で得られたハイブリダイゼーションバンドは両方の株が二重交差事象を受けていることと合致し、それはこれらの変異体がorfdwn１／２内で真の破壊置換変異体であることを示す。

これらをSoya-Flour培地で培養し、培養物の上澄をＨＰＬＣで検定すると、変異体はいずれも検出可能な濃度のクラバム−２−カルボキレートまたは２−ヒドロキシメチルクラバムを産生しなかった。培養上澄をバイオアッセイに付し、その変異体はまた、検出可能な濃度のアラニルクラバムを産生しないことがわかった。orfup１変異体と同様、orfdwn１／２変異体は野生型よりも高濃度のクラブラン酸を産生することができる。

orfdwn３
orfdwn３を破壊するために、ｐＣＥＣ０２３（ｐＳＬ１１８０にサブクローニングしたcas１の下流のＤＮＡの３.７キロベースのフラグメントからなる）をNcoIで消化し、次いで自己ライゲートさせた。イー・コリをライゲーション混合物で形質転換した後に、プラスミドｐＣＥＣ０３１を有する１個のクローンを単離した。プラスミドはorfdwn２の一部および不完全なorfdwn３をコードする１.９キロベースのNcoI-EcoRIフラグメントのみを保持した。ＤＮＡ配列の試験により、ｐＣＥＣ０３１がorfdwn３の翻訳開始部位から１５８塩基対のところで独特のBstEII部位を有することがわかった。従って、ｐＣＥＣ０３１をBstEIIで消化し、クレノウフラグメントで処理して平滑末端を作り、平滑末端化したアプラマイシン抵抗性カセットにライゲートした。ライゲーション混合物を用いてイー・コリＧＭ２１６３を形質転換してアプラマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性を付与した。各々ｐＣＥＣ０５０およびｐＣＥＣ０５１を含有する２個の形質転換体を選別した。制限分析によりアプラマイシン抵抗性カセットがｐＣＥＣ０５０内ではorfdwn３と順方向に、ｐＣＥＣ０５１内では逆方向に配向していることがわかった。次いでこれらのプラスミドを共にHindIIIで消化し、同様に消化したｐＩＪ４８６にライゲートした。次いでライゲーション混合物を用いて別個にイー・コリＧＭ２１６３を形質転換してアプラマイシンおよびアンピシリン抵抗性を付与した。得られた形質転換体からシャトルプラスミドｐＣＥＣ０５６（ｐＣＥＣ０５０＋ｐＩＪ４８６）およびｐＣＥＣ０５７（ｐＣＥＣ０５１＋ｐＩＪ４８６）を単離した。次いで両方のプラスミドを用いてエス・クラブリゲルスＮＲＲＬ３５８５を形質転換した。

各々の形質転換体の実験から１個の形質転換体を選別し、非選択性培地上で胞子形成を連続して２ラウンド行い、次いでレプリカ平板法により抗生物質を含有する培地に移し、アプラマイシン抵抗性およびチオストレプトン感受性形質転換体を同定した。この方法により推定変異体２個を各々の１次形質転換体（ｐＣＥＣ０５６では５６−１Ａおよび５６−３Ａ、ｐＣＥＣ０５７では５７−１Ｃおよび５７−２Ｂ）の子孫から単離した。

これらの推定変異体を同定するためにこれらの株からゲノムＤＮＡを単離し、SacIまたはAcc65Iのいずれかで消化し、サザンブロット分析に供した。この実験から得られたハイブリダイゼーションバンドは、両方の株が二重交差事象を受けていることと合致し、それはこれらの変異体がorfdwn３内で真の破壊置換変異体であることを示す。

これらの株をSoya-Flour培地で培養し、培養物の上澄をＨＰＬＣで検定すると、変異体が産生するクラバム−２−カルボキレートまたは２−ヒドロキシメチルクラバムの濃度は非常に低かった。培養上澄をバイオアッセイに付し、変異体は検出可能な濃度のアラニルクラバムをも産生しないことがわかった。orfup１およびorfdwn１／２変異体と同様、orfdwn３変異体も野生型よりも高濃度のクラブラン酸を産生することができる（表３）。

本出願では以下のヌクレチド配列を開示する：
配列番号：１図１のＤＮＡ配列
配列番号：２ orfup３の配列
配列番号：３ orfup２の配列
配列番号：４ orfup１の配列
配列番号：５ orfdwn１の配列
配列番号：６ orfdwn２の配列
配列番号：７ orfdwn３の配列
配列番号：８オリゴヌクレオチドプライマー１１の配列
配列番号：９オリゴヌクレオチドプライマー１２の配列
配列番号：１０オリゴヌクレオチドプライマー１３の配列
配列番号：１１オリゴヌクレオチドプライマー１４の配列

cas１を有して側面に付加するエス・クラブリゲルス染色体のヌクレオチド配列を示す。

Claims

適当な微生物の５Ｒクラバム産生を改善する方法であって、
ａ）図１（配列番号：１）に示されるエス・クラブリゲルスにおける５Ｓクラバムの生合成に特異的であって、５Ｒクラバムの生合成には必須ではない１個または複数の遺伝子を有してなるＤＮＡ；
ｂ）図１にてｏｒｆｕｐ３、ｏｒｆｕｐ２、ｏｒｆｕｐ１、ｏｒｆｄｗｎ１、ｏｒｆｄｗｎ２またはｏｒｆｄｗｎ３（配列番号：２−７）で示される配列かまたは実質的にその配列を有するエス・クラブリゲルスにおける５Ｓクラバムの生合成に特異的であって、５Ｒクラバムの生合成には必須ではない１個または複数の遺伝子を有してなるＤＮＡ；
ｃ）図１にてｏｒｆｕｐ１で示される配列（配列番号：４）または実質的にその配列を有するエス・クラブリゲルスにおける５Ｓクラバムの生合成に特異的であって、５Ｒクラバムの生合成には必須ではない１個または複数の遺伝子を有してなるＤＮＡ；および
ｄ）高度にストリンジェントな条件下で上記（ａ）〜（ｃ）のいずれか一のＤＮＡとハイブリダイズし、かつ、エス・クラブリゲルスにおける５Ｓクラバムの生合成に特異的であって、５Ｒクラバムの生合成には必須ではない１個または複数の遺伝子を有してなるＤＮＡ；
からなる群より選択されるＤＮＡを操作し、それを微生物に封入することからなる方法。
適当な微生物がエス・クラブリゲルスである請求項１記載の方法。
各々配列番号：２−７であるオープン・リーディング・フレームｏｒｆｕｐ３、ｏｒｆｕｐ２、ｏｒｆｕｐ１、ｏｒｆｄｗｎ１、ｏｒｆｄｗｎ２またはｏｒｆｄｗｎ３から選択される、５Ｓクラバムの生合成に特異的であって、５Ｒクラバムの生合成には必須ではないオープン・リーディング・フレームに対応するＤＮＡを有し、ここで、オープン・リーディング・フレームが破壊されているかそうでなければ不完全であるところのエス・クラブリゲルスの５Ｒクラバム産生を改善する方法であって、ｃａｓ１を側面に付加するＤＮＡ領域を破壊するかそうでなければ不完全にすることからなる方法。
５Ｓクラバムがクラバム−２−カルボキシレートである、請求項３記載の方法。
５Ｓクラバムが２−ヒドロキシメチルクラバムである、請求項３記載の方法。
オープン・リーディング・フレームが、欠失とその後の遺伝子置換によって破壊されているかそうでなければ不完全である請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
オープン・リーディング・フレームが、遺伝子破壊とその後の遺伝子置換によって破壊されているかそうでなければ不完全である請求項３〜５のいずれか一項に記載の方法。
ＤＮＡが、オープン・リーディング・フレームｏｒｆｕｐ３、ｏｒｆｕｐ２、ｏｒｆｕｐ１、ｏｒｆｄｗｎ１、ｏｒｆｄｗｎ２またはｏｒｆｄｗｎ３に対応する請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５Ｒクラバムがクラブラン酸である請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。