SK105499A3 - Dna comprising one or more genes specific for biosythesis of 5s clavam in s. clavuligerus, a vector containing dna, a host containing such vectors, process for improving the manufacture of 5r clavam and method for identification of microorganisms - Google Patents

Dna comprising one or more genes specific for biosythesis of 5s clavam in s. clavuligerus, a vector containing dna, a host containing such vectors, process for improving the manufacture of 5r clavam and method for identification of microorganisms Download PDF

Info

Publication number
SK105499A3
SK105499A3 SK1054-99A SK105499A SK105499A3 SK 105499 A3 SK105499 A3 SK 105499A3 SK 105499 A SK105499 A SK 105499A SK 105499 A3 SK105499 A3 SK 105499A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
clavam
dna
clavuligerus
clavulanic acid
orfup
Prior art date
Application number
SK1054-99A
Other languages
English (en)
Inventor
Barry Barton
John Patrick Griffin
Cecilia Anders
Susan Jensen
Roy Henry Mosher
Ashish Sudhakar Paradkar
Original Assignee
Smithkline Beecham Plc
Univ Alberta
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Smithkline Beecham Plc, Univ Alberta filed Critical Smithkline Beecham Plc
Publication of SK105499A3 publication Critical patent/SK105499A3/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/36—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Actinomyces; from Streptomyces (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/188—Heterocyclic compound containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen atoms and oxygen atoms as the only ring heteroatoms

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

Oblasť techniky
Vynález sa týka nových bakteriálnych génov a spôsobu zlepšenia produkcie ; klavamov, napríklad kyseliny klavulanovej. Tento vynález tiež poskytuje nové organizmy schopné produkovať zvýšené množstvá kyseliny klavulanovej.
Doterajší stav techniky
Mikroorganizmy, predovšetkým Streptomyces sp. produkujú množstvo antibiotík zahŕňajúc kyselinu klavulanovú a iné klavamy, cefalosporíny, polyketidy, cefamycíny, tunikamycíny, holomycín a penicilíny. Je značný záujem v schopnosti manipulovať absolútne a relatívne množstvá týchto antibiotík produkovaných mikroorganizmami a preto sa veľké množstvo štúdií zaoberá skúmaním metabolických a genetických mechanizmov biosyntetických dráh (Domain, A. L. f (1990) „Biosynthesis and regulation of beta - lactam antibiotics“ In: 50 years of
Penicillin applications, history and trends). Mnoho enzýmov, ktoré uskutočňujú ’ rôzne kroky v metabolických dráhach a gény ktoré ich kódujú sú známe.
Klavamy môžu byť rozdelené do dvoch skupín v závislosti od stereochémie ich cyklu (5S a 5R klavamy). Biochemické dráhy biosyntézy 5R a 5S klavamov neboli doteraz úplne objasnené. Predpokladá sa, že sú derivované z rovnakých východzích jednotiek (až doposiaľ neidentifikované 3 karbónové zlúčeniny (Townsend, C. A. and Ho, M. F. (1985) J. Am. Chem. Soc. 107 (4), 1066 - 1068 and Elson, S. W. and Oliver, R. S. (1978) J. Antibiotics XXXI No. 6, 568) a arginínu (Valentíne, B. P. et. al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 15, 1210 - 1211) a zdieľajú niektoré bežné medziprodukty (Iwata - Reuyl, D. and C. A. Townsend (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 2762 - 63, and Jane, J. W. et. al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett. 3: 2313-16).
-2Príklady 5S klavamov zahŕňajú klavam-2-karboxylát (C2C), 2-hydroxymetylklavam (2HMC), 2-(3-alanyl)klavam, valklavam a kyselinu klavamínovú (GB 1585661, Rohí, F. et. al. Árch. Microbiol. 147:315 - 320, US 4, 202, 819). Je však len málo príkladov 5R klavamov a nepochybne najznámejším je beta laktamázový inhibítor kyseliny klavulanovej, ktorý je produkovaný fermentáciou Streptomyces clavuligerus. Kyselina klavulanová vo forme klavulanátu draselného je kombinovaná sbeta-laktam amoxycilínom v antibiotiku AUGMENTIN (Trade Mark SmithKline Beecham). V dôsledku komerčného záujmu sa výskumy biosyntézy klavamov sústredili na biosyntézu 5R klavamov, kyseliny klavulanovej pomocou S. clavuligerus. Mnoho enzýmov a ich génov asociovaných s biosyntézou kyseliny klavulanovej bolo identifikovaných a publikovaných. Príklady takýchto publikácií zahŕňajú Hodgsona, J. E. et. al., Gene 166,49 - 55 (1995), Aidoo, K. A. et. al., Gene 147, 41 - 46 (1994), Paradkara, A. S. et. al., J. Bact. 177 (5), 1307 - 4 (1995). Naopak nič nie je známe o biosyntéze a genetike 5S klavamov okrem kyseliny klavamínovej, ktorá je prekurzorom kyseliny klavulanovej produkovaným pôsobením syntázy kyseliny klavamínovej v biosyntetickej dráhe kyseliny klavulanovej v S. clavuligerus.
Pokusmi s klonovaním génu sa identifikovalo, že S. clavuligerus obsahuje dva izoenzýmy syntázy kyseliny klavamínovej, cas1 a cas2 (Marsh, E. N. et. al. Biochemistry 31, 12648 - 657, (1992)), pričom obidva môžu prispievať k produkcii kyseliny klavulanovej pri určitých nutričných podmienkach (Paradkar, A. S. et. al., J. Bact. 177 (5), 1307 - 14 (1995)). Aktivita syntázy kyseliny klavamínovej bola tiež zistená v iných mikroorganizmoch produkujúcich kyselinu klavulanovú, ako sú S. jumonjinensis (Vidal, C. M., ES 550549, (1987)) a S. katsurahamanus (Kitano, K. et. al., JP 53-104796, (1978)) ako aj S. antibioticos, producent 5S klavamu, valklavamu (Baldwin, J. E. et. al., Tetrahedron Letts. 35(17), 2783 - 86, (1994)). Posledná publikácia tiež opisuje amidino-hydrolázovú aktivitu kyseliny proklavamínovej u S. antibioticos, teda ďalší enzým o ktorom sa vie že je zahrnutý do biosyntézy kyseliny klavulanovej. Všetky ďalšie gény identifikované u S. clavuligerus ktoré sú zahrnuté do biosyntézy klavamov, boli opísané ako potrebné pre biosyntézu kyseliny klavulanovej (Hodgson, J. E. et. al., Gene 166, 49 - 55 (1995), Aidoo, K. A. et. al.,
-3Gene 147, 41 - 46 (1994)) a ako doteraz nikto nepublikoval, ktoré sú špecifické pre biosyntézu 5S klavamov.
Podstata vynálezu
I
Identifikovali sa určité gény, ktoré sú špecifické pre biosyntézu 5S klavamov ako je doložené príkladom C2C a 2HMC u S. clavuligerus. Podstatou vynálezu je preto DNA kódujúca jeden alebo viac génov, ktoré sú špecifické pre biosyntézu 5S klavamov v S. clavuligerus a ktoré nie sú esenciálne pre biosyntézu 5R klavamov (napr. kyselina klavulanová).
Označenie „gén v tomto texte tiež zahŕňa regulačné oblasti potrebné na fungovanie alebo expresiu génu. Predovšetkým je to DNA uvedená na obrázku 1. Výhodne zahrnuje DNA nukleotidové sekvencie z obrázku 1 označené ako orfup 3, orfup 2, orfup 1, orfdwn 1, orfdwn 2, a orfdwn 3. Tento vynález tiež zahŕňa proteíny kódované uvedenou DNA. Ďalej tento vynález tiež zahŕňa vektory obsahujúce DNA podľa vynálezu a hostiteľov obsahujúcich takéto vektory.
Prekvapujúco sa zistilo, že ak je aspoň jeden gén podľa tohto vynálezu porušený, tak množstvo kyseliny klavulanovej produkovanej organizmom narastá. Preto tento vynález tiež zahŕňa spôsoby na zvýšenie množstva kyseliny klavulanovej produkovanej vhodným mikroorganizmom. Podľa jedného uskutočnenia vynálezu môžu byť identifikované gény manipulované za účelom vytvorenia organizmu schopného produkovať zvýšené množstvá klavamu, vhodne kyseliny klavulanovej.
Výsledky tohto vynálezu tiež poskytujú vylepšené postupy na identifikáciu organizmov s vyššou produkciou kyseliny klavulanovej, ktoré zahŕňajú úvodný skríning na organizmy s nízkou alebo žiadnou produkciou 5S klavamu (napríklad pomocou hplc a/alebo analýzy klavamov, ktorá je opísaná v príkladoch).
Vhodne sa 5S klavamové gény tohto vynálezu dajú získať konvenčnými metódami klonovania (ako je PCR), ktoré sú založené na sekvenciách stanovených v tomto vynáleze. Funkcia génu môže byť porušená alebo eliminovaná/deletovaná pomocou genetických techník akými sú génová disrupcia (Aiodoo, K. A. et. al.,
-4(1994), Gene, 147, 41 - 46), náhodná mutagenéza, cielená mutagenéza a antisens RNA.
Podľa ďalšieho uskutočnenia vynálezu sú stanovené plazmidy obsahujúce jeden alebo viac defektných génov. Vhodné plazmidy sú pCEC060, pCEC061, pDES3, pCEC056 a pCEC057 opísané nižšie v texte. Vytvorenie defektných génov je možné uskutočniť rôznymi spôsobmi. Napríklad inzerciou fragmentu DNA kódujúceho gén pre antibiotikovú rezistenciu, ktorý úplne zruší aktivitu génu do ktorého sa fragment inzertuje. Na vytvorenie defektných génov môžu byť použité aj iné stratégie zahŕňajúce inzerciu DNA, ktorá nekóduje gén pre antibiotikovú rezistenciu, deléciu časti génu, deléciu celého génu alebo úpravu nukleotidovej sekvencie génu pomocou adície a/alebo substitúcie jedného alebo viacerých nukleotidov. Podľa tohto vynálezu môžu byť gény defektné v rozdielnom rozsahu. Gény môžu byť defektné tým spôsobom, že ich aktivita je úplne zrušená, alebo časť ich pôvodnej aktivity je zachovaná.
Vhodne sú plazmidy podľa vynálezu používané na transformáciu organizmu S. clavuligerus, napr. kmeň ATCC 27064 (ktorý korešponduje s S. clavuligerus NRRL 3585). Vhodné transformačné metódy sa dajú nájsť v relevantných zdrojoch, ktoré zahŕňajú: Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd Ed., ColdSpring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y, Hopwood, D. A. et. al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, and Paradkar, A. S. and Jensen, S. E. (1995), J. Bacteriol. 177 (5):1307-1314.
Kmene druhu S. clavuligerus sa priemyselne využívajú na produkciu kyseliny klavuianovej (klavulanátu draselného). V britských a USA farmakopeách z klavulanátu draselného (British Pharmacopoeia 1993, Addendum 1994, p1362 - 3 a U.S. Pharmacopoeia Official Monographs 1995, USP 23 NF18 p384 - 5) je množstvo toxického 5S klavamu, klavam-2-karboxylátu špecificky kontrolované.
Preto v ďalšom uskutočnení vynálezu bol vytvorený organizmus produkujúci vysoké množstvá kyseliny klavuianovej ale žiadne množstvá C2C, alebo produkujúci vysoké množstvá kyseliny klavuianovej ale len nízke množstvá C2C. Vhodne obsahuje organizmus produkujúci kyselinu klavulanovú jeden alebo viac defektných klavamových génov a sú ním výhodne S. clavuligerus kmene 56 - 1A,
-556 - 3Α, 57 - 2Β, 57 - 1C, 60 - 1Α, 60 - 2Α, 60 - 3Α, 61 - 1 A. 61 - 2A, 61 - 3A a 61 - 4A opísané nižšie v texte. Takéto organizmy sú vhodné na produkciu kyseliny klavulanovej bez produkcie 5S klavamu, klavam-2-karboxylátu alebo s výrazne redukovanou produkciou klavam-2-karboxylátu.
Prehraď obrázkov na výkresoch
Na obrázku je znázornená nukleotidová sekvencia chromozómu S. clavuligerus a ohraničujúce oblasti cas1.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Všetky metódy v príkladoch sa nachádzajú v Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning A Laboratory Manual (2nd Edition) alebo Hopwood, D. A. et. al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, and Paradkar, A. S. and Jensen, S. E. (1995), J. Bacteriol. 177 (5):13071314.
Príklad 1
DNA sekvenovanie chromozómu Streptomyces clavuligerus nad a pod klavaminát syntázovým génom cas1
A) Izolácia cas1
Na izoláciu chromozomálneho DNA fragmentu Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 kódujúceho gén pre klavaminát syntázu izozým 1 (cas1) bola syntetizovaná oligonukleotidová sonda RMO1 na základe nukleotidov 9 až 44 už predtým sekvenovaného cas1 génu (Marsh, E. N., Chang, M. D. T. a Townsend, C. A. (1992) Biochemistry 31: 12648 - 12657). Oligonukleotidy boli skonštruované pomocou štandardných metód na Applied Biosystems 391 syntetizéry. Sekvencia RMO1, 36-mér, bola syntetizovaná v antiparalelnom zmysle k sekvencii publikovanej Marshom a kol. (1992, ibid). RMO1 bola rádioaktívne označená s 32P pomocou
-6štandardných techník na koncové značenie DNA oligonukleotidov (Sambrook et. al., 1989 ibid) a bola použitá na skríning kozmidovej banky genomickej DNA Streptomyces clavuligerus pomocou Southernovej hybridizácie ako ju opísali Stahl a Amann (v: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Ed. E. Stackebrandt and M. Goodfellow. Toronto: John Wiley and Sons, p. 205 - 248, 1991). Genomická DNA banka S. clavuligerus bola zostrojená v kozmide pl_AFR3, spôsobom ktorý opísal Doran, J. L. a kol., (1990), J. Bacteriol. 172 (9), 4909 - 4918. Kolónové bloty kozmidovej banky S. clavuligerus boli cez noc inkubované s rádioaktívne označeným RMO1 pri 60 °C v roztoku obsahujúcom 5 x SSC, 5 x Denhardtov roztok a 0,5 % SDS (1 x SDS: 0,15 M NaCl + 0,015 M Na3citrát; 1 x Denhardtov roztok: 0,02 % BSA, 0,02 % Ficoll a 0,02 %PVP). Bloty boli potom premyté pri 68 °C počas 30 minút v roztoku 0,5 x SSC + 0,1 .% SDS. Bol izolovaný jeden kozmidový kloň, 10D7, ktorý silne hybridizoval s RMO1 a dával po štiepení s reštrikčnými endonukleázami Sací a EcoR1 hybridizačné signály, ktoré boli zhodné s hybridizačnými signálmi identifikovanými v rovnakých pokusoch pri štiepení genomickej DNA S. clavuligerus.
B) DNA sekvenovanie chromozómu S. clavuligerus ohraničujúceho cas1
Čiastočná reštrikčná mapa kozmidu 10D7 bola vytvorená použitím reštrikčných endonukleáz Sací, Nco1 a Kpn1. Southemova hybridizácia medzi RMO1 a rôznymi produktmi štiepenia 10D7 DNA naznačila, že cas1 bola najpravdepodobnejšie lokalizovaná na jednom konci 7kb Sad - Sad DNA subfragmentu. Tento fragment pozostával zcasl otvoreného čítacieho rámca a približne 6kb úseku DNA nad cas1. 7kb fragment bol potom subklonovaný zo Sad štiepenia 10D7 do fagmidového vektora pBluescriptII SK + (2,96 kb; Stratagene) čím sa vytvoril rekombinantný plazmid pCEC007.
Na uľahčenie sekvenovania chromozómu nad cas1 bol 3kb Nco1 - Nco1 subfragment 7kb Sad - Sad fragmentu subklonovaný do pUC120 (3,2kb; Vieirra and Messing, Methods Enzymol. 153, 3 - 11, 1987) v obidvoch orientáciách, čím boli zostrojené rekombinantné plazmidy pCEC026 a pCEC027. 3kb subfragment pozostával z amino - terminálnej časti cas1 a približne 2,6kb úseku DNA nad cas1.
-7Do seba zapadajúce, prekrývajúce sa delécie boli vytvorené v oboch pCEC026 a pCEC027 pomocou exonukleázy III a S1 nukleázového štiepenia (Sambrook et. al., 1989 ibid) a DNA sekvencia 3kb Nco1 - Nco1 fragmentu bola určená na oboch vláknach pomocou dideoxy - reťazovej terminačnej metódy (Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A. R. (1977), Prac. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463 - 5467) pomocou Taq dye - deoxy3 terminačného kitu a Applied Biosystems 373A sekvensera.
Na určenie DNA sekvencie chromozómu bezprostredne za cas1 bol 4,3 kb Kpn1 - EcoR1 DNA fragment kozmidového klonu 10D7 subklonovaný do pBluescriptII SK + a bol vytvorený pCEC018. ZpCEC018 bol 3,7kb Sací - Sací subfragment klonovaný do pSL1180 (3,422kb, Pharmacia); jeden Sad koniec tohto fragmentu čiastočne prekrýval TGA stop kodón cas1, druhý bol kódovaný vektorom. Obidve orientácie 3,7kb fragmentu boli získané počas subklonovania a výsledné rekombinantné plazmidy boli označené pCEC023 a pCEC024. Do seba zapadajúce, prekrývajúce sa delécie boli vytvorené v obidvoch plazmidoch a DNA sekvencia 3,7kb fragmentu bola určená na oboch vláknach. Nukleotidová sekvencia chromozómu S. clavuligerus zistená v týchto experimentoch zahŕňajúca ohraničujúcu cas1 sekvenciu je zobrazená na obrázkul.
Príklad 2
Funkčná analýza otvorených čítacích rámcov (orf) ohraničujúcich cas1
Počítačová analýza DNA sekvencie nad cas1 predpokladala prítomnosť dvoch kompletných orf a jedného nekompletného orf. Všetky tri orf boli lokalizované na opozitnom DNA vlákne ku cas1 a boli preto orientované v opačnom smere. Prvý otvorený čítací rámec, orfupl, bol lokalizovaný 579 bp nad cas1 a kódoval polypeptid pozostávajúci z 344 aminokyselín (aa). Druhý otvorený čítací rámec, orfup2, bol lokalizovaný 437 bp za 3'- koncom orfupl a kódoval polypeptid so 151 aa. Za orfup2 bol orfup3. Štartovací kodón orfup3 prekrýval translačný stop kodón orfup2, čím sa predpokladalo že dva orf sú translačne spojené. Na 3 - kb Ncol Ncol fragmente nebol zistený žiadny translačný stop kodón pre orfup3.
-8Podobná analýza DNA sekvencie pod cas1 predpokladala prítomnosť dvoch kompletných orf a jedného nekompletného orf. Dva orf boli lokalizované na opozitnom DNA vlákne ku cas1 a boli preto orientované smerom ku cas1. Tretí orf bol lokalizovaný na rovnakom vlákne ako cas1 a preto bol orientovaný smerom od cas1. Prvý otvorený čítací rámec pod časí, orfdwnl, bol lokalizovaný 373 bp pod cas1 a kódoval 328 aa polypeptid. Druhý otvorený čítací rámec, orfdwn2, bol lokalizovaný 55 bp nad orfdwnl a kódoval 394 aa polypeptid. 315 bp nad orfdwn2 a na opozitnom vlákne bol orfdwn3. Pretože pre orfdwn3 nebol na 3,7 kb - fragmente zistený žiadny stop kodón, kódoval nekompletný polypeptid s 219 aa.
Génová disrupcia otvorených čítacích rámcov orfup a orfdwn
Na určenie pravdepodobnej funkcie otvorených čítacích rámcov ohraničujúcich cas1 v biosyntéze kyseliny klavulanovej a iných klavamov produkovaných S. clavuligerus boli génovým preusporiadaním pomocou inzerčnej inaktivácie alebo delécie vytvorené mutanty. Na génovú disrupciu a preusporiadanie bola použitá základná metóda opísaná Paradkarom a Jensenom (1995 ibid).
A - orfupl
1,5 kb Ncol - Ncol fragment nesúci gén pre apramycínovú rezistenciu (apŕ), konštruovaný postupom opísaným Paradkarom a Jensenom (1995 ibid) bol opracovaný Klenowým fragmentom za účelom vytvorenia tupých koncov (Sambrook et. al., 1989 ibid) a bol ligovaný do pCEC026, ktorý bol štiepený BsaBI a tiež opracovaný Klenowým fragmentom. pCEC026 má BsaBI štiepne miesto lokalizované v orfupl, 636 bp od translačného štartovacieho kodónu. Na transformáciu kompetentných buniek E. coli GM 2163, (prístupné z New England Biolabs, USA., Marinus, M. G. Et. al. MGG (1983) vol 122, p288 - 9) aby získali apramycínovú rezistenciu, bola použitá ligačná zmes. Z výsledných transformantov boli izolované dva klony obsahujúce plazmidy pCEC054 a pCEC055. Reštrikčnou analýzou sa zistilo, že pCEC054 mal apŕ - fragment inzertovaný v rovnakej orientácii ako orfupl zatiaľ čo pCEC055 ho mal v opačnej orientácii.
-9Na zavedenie pCEC054 do S. clavuligerus bola ptazmidová DNA štiepená s BamHI a Hindlll a ligovaná do Streptomyces vektora s vysokým počtom kópií plJ486 (6,2 kb; Ward et. al., (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468 - 478). Na transformáciu kompetentných buniek E. coli GM 2163, aby získali apramycínovú rezistenciu, bola potom použitá ligačná zmes. Z výsledných transformantov bol izolovaný jeden kloň, ktorý obsahoval kyvadlový plazmid pCEC061. Tento plazmid bol potom použitý na transformáciu S. clavuligerus NRRL 3585. Výsledné transformanty boli podrobené dvom následným sériám sporulácie na neselektívnom médiu a potom boli repiikačnou pečiatkou prenesené do média obsahujúceho antibiotikum za účelom identifikácie apramycín - rezistentných a thiostrepton senzitívnych transformantov. Pre ďalšie analýzy boli vybrané štyri predpokladané mutanty (61 - 1 A, - 2A, - 3A a - 4A).
Na potvrdenie, že tieto predpokladané mutanty mali narušenie v orfupl bola izolovaná genomická DNA z izolátov 61 - 1A a 61 - 2A, ktorá bola potom štiepená Saci a podrobená Southern blot analýze. Výsledky Southern blot analýzy boli zhodné s dvojitým prekrížením, ktoré sa vyskytlo a demonštrovali, že tieto mutanty sú skutočnými mutantmi nesúcimi narušenie v orfupl.
Mutanty 61 - 1A, - 2A, - 3A a - 4A rástli v médiu so sójovou múkou a ich supernatanty boli analyzované pomocou HPLC na produkciu kyseliny klavulanovej a klavamov. Zloženie média so sójovou múkou a metóda analýzy klavamov pomocou HPLC boli už opísané (Paradkar and Jensen, 1995 ibid) s výnimkou bežiaceho pufru pre HPLC analýzu, ktorý obsahoval 0,1 M NaH2PO4 + 6% metanol, pH 3,68 (upravené ľadovou kyselinou octovou). HPLC analýza indikovala, že žiadny z mutantov neprodukoval detekovateľné množstvá klavam-2-karboxylátu alebo 2- hydroxymetylklavamu. Okrem toho, keď boli supernatanty kultúr bioanalyzované proti Bacillus sp. ATCC 27860 použitím metódy Pruessa a Kelletta (1983, J. Antibiot. 36: 208 - 212), žiadny z mutantov neprodukoval detekovateľné množstvá alanylklavamu. Naopak HPLC analýza supernatantov kultúr ukázala, že mutanty zjavne produkovali zvýšené množstvá kyseliny klavulanovej v porovnaní s divým typom (tabuľka 1).
-10Tabuľka 1
Titrát kyseliny klavulanovej (CA) orfupl mutantov v trepacích bankových testoch
Kmeň 70 hodín 70 hodín 93 hodín 93 hodín
CA ug/ml CA ug/mg DNA CA ug/ml CA ug/mg DNA
NRRL 3585 # 1 87 915 166 1963
NRRL 3585 # 2 66 790 159 1842
61 -1A 272 2894 439 6113
61 -2A 199 2148 225 2928
61 -3A 54 692 221 2585
61 -4A 0 0 226 2422
Orfupl delécia
S cieľom vytvoriť génovú deléciu o veľkosti 654 nukleotidov medzi Aatll miestami orfupl boli uskutočnené klonovacie experimenty. Boli vytvorené PCR produkty pomocou oligonukleotidových primérov opísaných nižšie a vyššie opísaného pCEC061 ako templátu. Pôvodná nukleotidová sekvencia bola upravená inkorporáciou Pstl do oligo 11 a Sphl miesta do oligo 14.
Oligonukleotidový pár 1 použitý na vytvorenie PCR produktu 1:
Primér 11 5 dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3'
Primér 12 5'dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3'
Oligonukleotidový pár 2 použitý na vytvorenie PCR produktu 2:
Primér 13 5'dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3'
Primér 14 5'dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3'
Štandardná PCR reakcia bola uskutočnená použitím PTC - 200 Peltier termálneho cykléru od GRI (Felsted, Dunmow, Essex, CM6 3LD).
-11 PCR produkt 1 bol vytvorený s použitím primérov 11 a 12. Tento produkt mal približne 1 Kb a obsahoval karboxy-zakončenie orfup 1 od druhého Aatll miesta a oblasti pod zakončením.
PCR produkt 2 bol vytvorený použitím primérov 13 a 14. Tento PCR produkt mal približne 1,1 Kb a obsahoval amino-zakončenie orfup 1 od prvého Aatll miesta a oblasti nad zakončením.
PCR produkt 2 bol ligovaný do pCR - Script Amp SK (+) štiepeného Srfl podľa inštrukcií manuálu (Stratagene Ltd, Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 4GF). Ligačná zmes bola použitá na transformáciu superkompetentných buniek Epicurian E. coli XL1 - Blue MRF'Kan (prístupné od Stratagene) aby získali ampicilínovú rezistenciu (podľa inštrukcií výrobcu). Z výsledných transformantov bola izolovaná plazmidová DNA a reštrikčná analýza DNA odhalila 7 klonov obsahujúcich plazmid v ktorom bol PCR produkt 2 ligovaný. Jeden z týchto plazmidov bol označený pDES1.
PCR produkt 1 bol štiepený Pstl a Aatll a výsledná DNA bola frakcionalizovaná agarózovou gélovou elektroforézou. 1Kb fragment bol vyrezaný a eluovaný z gélu použitím Sephaglas bánd prep kit (Pharmacia, St Albans, Herts, ALI 3AW). Izolovaný fragment bol potom ligovaný do pDES1 štiepeného Aatll a Pstl. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu kompetentných buniek E. coli XL1 - Blue (prístupné od Stratagene) aby získali ampicilínovú rezistenciu (podľa inštrukcií výrobcu). Z výsledných transformantov bola izolovaná plazmidová DNA a reštrikčná analýza odhalila 1 kloň, ktorý obsahoval plazmid sligovaným PCR produktom 1. Tento plazmid bol označený pDES2.
Pred zavedením pDES2 do S. clavuligerus bol plazmid ďalej modifikovaný tak aby obsahoval počiatok replikácie ktorý by mohol fungovať u streptomyces. Na získanie takého plazmidu bola plazmidová DNA pDES2 štiepená EcoRI a Hindlll a ligovaná do Streptomyces vektora s vysokým počtom kópií plJ486 (6,2 Kb: Ward et. al., (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468 - 478) tiež štiepeného EcoRI a Hindlll. Ligačná zmes bola použitá na transformovanie kompetentných buniek E. coli (JM109) (Stratagene Ltd) aby získali ampicilínovú rezistenciu.
Plazmidová DNA bola izolovaná z výsledných transformantov a reštrikčná analýza odhalila 6 klonov nesúcich pDES2, ktoré obsahovali plJ486. Jeden z týchto
-12plazmidov bol označený pDES3. Plazmid pDES3 bol použitý na transformáciu kmeňa S. clavuligerus v ktorom bol orfup 1 gén už rozrušený inzerciou génu pre apramycínovú rezistenciu (ako polo popísané vyššie). Thiostrepton rezistentné transformanty boli selektované a potom podrobené 3 sériám sporulácie na neselektívnom médiu a skrínované na stratu apramycínovej rezistencie. Bolo identifikovaných 45 mutantov, ktorý stratili apramycínovú rezistenciu. Títo boli potom analyzovaný pomocou HPLC, ktorá potvrdila, že tieto kmene, podobne ako orfup 1 disruptanti 61 - 1 A, 61 - 2A, 61 - 3A a 61 - 4A, neboli schopné produkovať klavam2-karboxylát a 2-hydroxymetylklavam keď boli fermentované v podmienkach pri ktorých sú tieto klavamy normálne produkované.
B - orfdwn 1 a orfdwn 2
Delečný mutant/mutant nesúci narušenie v orfdwn 1 a orfdwn 2 bol vytvorený najprv štiepením pCEC018 (7,3 kb) Ncol a uvolnením 1-kb subfragmentu obsahujúceho väčšinu z orfdwn 1 a časť orfdwn 2. Produkty štiepenia boli frakcionalizované pomocou elektroforézy na agarózovom géli a 6,3-kb fragment bol vyrezaný a eluovaný z gélu. Tento fragment bol potom ligovaný do Ncol - Ncol DNA fragmentu nesúceho apŕ a použitý na transformáciu buniek E. coli XL - Blue aby získali apramycínovú rezistenciu. Týmto experimentom sa získal jeden kloň, ale reštrikčná analýza výsledného rekombinantného plazmidu odhalila prítomnosť dvoch kópií fragmentu apramycínovej rezistencie, ktoré boli ligované do deletovaného plazmidu. Za účelom eliminovania extra kópie aprr-fragmentu bol plazmid štiepený Ncol a samoligovaný. Na transformáciu buniek E. coli GM 2163, aby získali apramycínovú rezistenciu, bola použitá ligačná zmes. Z transformantov boli izolované dva klony, ktoré obsahovali plazmidy pCEC052 a pCEC053 len s jednou kópiou apŕ-fragmentu; pCEC052 mal apť-fragment inverzne orientovaný vzhľadom k orfdwn 1 a 2, kým pCEC053 mal apr-fragment inzertovaný v rovnakej orientácii ako orfdwn 1 a 2.
Kyvadlový plazmid pCEC052 bol konštruovaný ligáciou BamHI štiepeného pCEC052 s rovnako štiepeným plJ486 a transformáciou buniek E. coli GM 2163 aby získali apramycínovú rezistenciu. Z tohto experimentu bol izolovaný jeden kloň,
-13ktorý obsahoval kyvadlový plazmid pCEC060. Tento plazmid bol použitý na transformáciu divého typu S. clavuligerus 3585 za účelom získania apramycínovej a thiostreptonovej rezistencie. Výsledné transformanty boli podrobené dvom sériám sporulácie za neselektívnych podmienok a potom replikačnou pečiatkou prenesení na médium s antibiotikom aby sa mohli identifikovať apramycín rezistentné, thiostrepton senzitívne kolónie. Na ďalšie analýzy boli vybrané tri predpokladané mutanty (60 -1 A, - 2A a - 3A).
Na dokázanie identity predpokladaných mutantov bola izolovaná genomická DNA z kmeňov 60 - 1A a 60 - 2A, ktorá bola štiepená buď Sací alebo BstEII a podrobená Southern blot analýze. Vytvorené hybridizačné pruhy boli zhodné pre oba kmene prekonajúce dvojité prekríženie čo dokázalo, že tieto mutanty sú pravé mutanty nesúci narušenie v orfdwn 1/2.
Keď boli kultivovaní v médiu so sójovou múkou a supernatanty z kultúr boli analyzované pomocou HPLC, žiadny z mutantov neprodukoval detekovateľné množstvo klavam-2-karboxylátu alebo 2-hydroxymetylklavamu. Bioanalýza supernatantov kultúr ukázala, že mutanty tiež neprodukovali detekovateľné množstvo alanylklavamu. Tak ako orfup 1 mutanty aj orfdwn 1/2 mutanty sú schopné produkovať vyššie množstvá kyseliny klavulanovej než produkuje divý typ (tabuľka 2).
Tabuľka 2
Titrát kyseliny klavulanovej (CA) orfdwn 1/2 mutantov v trepacích bankových testoch
Kmeň 70 hodín 70 hodín 93 hodín 93 hodín
CA ug/ml CA ug/mg CA ug/ml CA ug/mg
NRRL 3585 # 1 87 915 166 1963
NRRL 3585 # 2 66 790 159 1842
60-1A 164 1872 260 2911
60-2A 187 2013 108 1320
60-3A 79 994 214 2161
-14orfdwn 3
Na rozrušenie orfdwn 3 bol pCEC023 ( pozostávajúci z 3,7 - kb DNA fragmentu pod casl.subklonovaného do pSL1180) štiepený Ncol a potom samoligovaný. Po transformácii E. coli ligačnou zmesou bol izolovaný kloň, ktorý obsahoval plazmid pCEC031. Tento plazmid si zachoval len 1,9 kb Ncol - EcoRI fragment kódujúci časť orfdwn 2 a nekompletný orfdwn 3. Preskúmanie DNA sekvencie odhalilo, že pCEC031 má špecifické BstEII štiepne miesto 158 bp od translačného štartovacieho miesta orfdwn 3. Preto bol pCEC031 štiepený BstEII, opracovaný Klenowým fragmentom za účelom vytvorenia tupých koncov a potom ligovaný do apramycín rezistentnej kazety s tupými koncami. Ligačná zmes bola použitá na transformáciu buniek E. coli GM2163 aby získali apramycínovú rezistenciu a ampicilínovú rezistenciu. Boli selektované dva transformanty, ktorí obsahovali pCEC050 a pCEC051. Reštrikčná analýza odhalila, že apramycínová rezistenčná kazeta bola orientovaná v rovnakej orientácii ako orfdwn 3 v pCEC050 a v opačnej orientácii vpCEC051. Obidva plazmidy boli potom štiepené Hindlll a ligované s rovnako štiepeným plJ486. Ligačná zmes bola potom oddelene použitá na transformáciu buniek E. coli GM2163 aby získali apramycínovú a ampicilínovú rezistenciu. Kyvadlové plazmidy pCEC056 (pCEC050 + plJ486) a pCEC057 (pCEC051 + plJ486) boli izolované z výsledných transformantov. Obidva plazmidy boli potom použité na transformáciu S. clavuligerus NRRL 3585.
Jeden transformant bol selektovaný z každého experimentu a bol podrobený dvom následným sériám sporulácie na neselektívnom médiu a potom replikačnou pečiatkou prenesený do média obsahujúceho antibiotikum za účelom identifikovania apramycín-rezistentných a thiostrepton-senzitívnych transformantov. Z tohto kroku boli izolované dva predpokladané mutanty z potomstva každého primárneho transformantu (56 - 1A a 56 - 3A pre pCEC056 a 57 -1C a 57 - 2B pre pCEC057).
Na určenie identity predpokladaných mutantov bola z týchto kmeňov izolovaná genomická DNA, ktorá bola potom štiepená buď Sací alebo Acc65l a podrobená Southern blot analýze. Vytvorené hybridizačné pruhy boli zhodné pre oba kmene prekonajúce dvojité prekríženie, čo dokázalo, že tieto mutanty sú mutanty nesúce narušenie v orfdwn 3.
-15Keď boli tieto kmene kultivované v médiu so sójovou múkou a supernatanty kultúr boli analyzované pomocou HPLC, mutanty produkovali značne redukované množstvá klavam-2-karboxylátu alebo 2-hydroxymetylklavamu. Bioanalýza supernatantov kultúr ukázala, že mutanty tiež neboli schopné produkovať detekovateľné množstvá alanylklavamu. Tak ako orfup 1 a orfdwn 1/2 mutanty aj orfdwn 3 mutanty boli schopné produkovať vyššie množstvá kyseliny klavulanovej v porovnaní s divým typom (tabuľka 3).
Tabuľka 3
Titrát kyseliny klavulanovej (CA) orfdwn 3 mutantov v trepacích bankových testoch
Kmeň 71 hodín 71 hodín 93 hodín 93 hodín
CA ug/ml CA ug/mg CA ug/ml CA ug/mg
NRRL 3585 #1A 180 1580 193 1790
NRRL 3585 #1B 179 1640 266 2310
56-1A 34 110 235 2160
56-3A 225 2140 274 2740
57-1C 253 2910 277 2920
57-2B 242 2240 193 1860
Patent zahŕňa nasledujúce nukleotidové sekvencie:
SEQ ID No. 1: SEQ ID No. 2: SEQ ID No. 3: SEQ ID No. 4; SEQ ID No. 5: SEQ ID No. 6 SEQ ID No. 7 SEQ ID No. 8 SEQ ID No. 9
DNA sekvencia z obrázku 1 orfup 3 sekvencia orfup 2 sekvencia orfup 1 sekvencia orfdwn 1 sekvencia orfdwn 2 sekvencia orfdwn 3 sekvencia sekvencia oligonukleotidového priméru 11 sekvencia oligonukleotidového priméru 12
-16SEQ ID No. 10: sekvencia oligonukleotidového priméru 13 SEQ ID No. 11: sekvencia oligonukleotidového priméru 14

Claims (22)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. DNA zahrnujúca jeden alebo viac génov špecifických pre biosyntézu 5S klavamu v S. clavuligerus a ktorá nie je esenciálna pre biosyntézu 5R klavamu.
    I
  2. 2. DNA vybraná zo skupiny pozostávajúcej z:
    a) DNA podľa nároku 1 ako je zobrazená na obrázku (SEQ ID No. 1);
    b) DNA podľa nároku 1, ktorá má sekvenciu alebo v podstate sa zhodujúcu sekvenciu so sekvenciou zobrazenou na obrázku ako orfup 3, orfup 2, orfup 1, orfdwn 1, orfdwn 2 alebo orfdwn 3 (SEQ ID No. 2 až 7); a
    c) DNA podľa nároku 1, ktorá má sekvenciu alebo v podstate sa zhodujúcu sekvenciu so sekvenciou zobrazenou na obrázku ako orfup 1 (SEQ ID No. 4); a
    d) DNA, ktorá hybridizuje za prísnych podmienok s DNA z (a) až (c) uvedenou vyššie, alebo s DNA podľa nároku 1.
  3. 3. Vektor vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:
    a) vektor obsahujúci DNA podľa nároku 1 alebo 2;
    b) vektor obsahujúci DNA podľa nároku 1 alebo 2, v ktorom bol jeden alebo viac génov špecifických pre biosyntézu 5S klavamu narušený alebo iným spôsobom pozmenený; a
    c) vektor pCEC060, pCEC061, pCEC056, pCEC057 alebo pDES3.
  4. 4. Hostiteľ vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:
    a) hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 3;
    b) hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 3, ktorý je schopný produkovať zvýšené množstvá kyseliny klavulanovej;
    c) hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 3, ktorý je schopný produkovať nízke alebo žiadne množstvá
  5. 5S klavamu;
    d) hostiteľ obsahujúci vektor podľa nároku 3, ktorým je S. clavuligerus.
    -185. S. clavuligerus obsahujúci DNA, ktorá korešponduje s otvoreným čítacím rámcom ohraničujúcim cas1, pričom táto DNA bola rozrušená alebo iným spôsobom pozmenená.
  6. 6. S. clavuligerus podľa nároku 5, v ktorom otvorený čítací rámec znamená orfup 3, orfup 2, orfup 1, orfdwn 1, orfdwn 2 alebo orfdwn 3.
  7. 7. Spôsob zlepšenia produkcie 5R klavamu vo vhodnom mikroorganizme, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje manipuláciu DNA podľa nároku 1 alebo 2 a jej zavedenie do mikroorganizmu.
  8. 8. Spôsob podľa nároku 7, vyznačujúci sa tým, že vhodným mikroorganizmom je S. clavuligerus.
  9. 9. Spôsob zlepšenia produkcie 5R klavamu u S. clavuligerus, vyznačujúci sa t ý m, že zahŕňa rozrušenie alebo iným spôsobom pozmenenie DNA oblastí ohraničujúcich cas1.
  10. 10. Spôsob podľa ktoréhokoľvek nároku 7 až 9, vyznačujúci sa t ý m, že DNA korešponduje s otvorenými čítacími rámcami orfup 3, orfup 2, orfup 1, orfdwn 1, orfdwn 2 alebo orfdwn3.
  11. 11. Spôsob podľa ktoréhokoľvek nároku 7 až 10, vyznačujúci sa t ý m, že 5R klavamom je kyselina klavulanová.
  12. 12. Spôsob identifikácie mikroorganizmov vhodných na produkciu vysokých množstiev 5R klavamu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa počiatočný skríning mikroorganizmov na produkciu nízkych alebo žiadnych množstiev 5S klavamu.
  13. 13. Spôsob podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že mikroorganizmom je S. clavuligerus.
    -1914. Spôsob podľa nároku 12 alebo 13, vyznačujúci sa tým, že 5R klavamom je kyselina klavulanová.
  14. 15. Spôsob podľa ktoréhokoľvek nároku 12 až 14, vyznačujúci sa t ý m, že jeden alebo viac génov špecifických pre produkciu 5S klavamov je defektných.
  15. 16. Mikroorganizmus vybraný zo skupiny pozostávajúcej z:
    a) mikroorganizmus, ktorý je schopný produkovať 5R klavam a nízke alebo žiadne množstvá 5S klavamu a ktorý sa dá získať spôsobom podľa ktoréhokoľvek nároku 7 až 15;
    b) mikroorganizmus, ktorý je schopný produkovať 5R klavam a nízke alebo žiadne množstvá 5S klavamu a ktorý sa dá získať spôsobom podľa nároku 12 a ktorý je schopný produkovať kyselinu klavulanovú pričom neprodukuje klavam-2-karboxylát a/alebo 2-hydroxymetylklavam; a
    c) mikroorganizmus, ktorý sa dá získať spôsobom podľa nároku 12 a ktorým je kmeň 56-1A, 56-3A, 57 - 2B, 57 - 1C, 60 - 1A, 60 - 2A, 60 - 3A, 61 - 1A, 61 - 2A, 61 - 3A alebo 61 - 4A.
  16. 17. Kyselina klavulanová, ktorá sa dá získať fermentáciou mikroorganizmu podľa nároku 16.
  17. 18. Kyselina klavulanová podľa nároku 17, ktorá je bez alebo s výrazne redukovaným množstvom klavam-2-karboxylátu.
  18. 19. Kyselina klavulanová podľa nároku 18 vo forme jej draselnej soli.
  19. 20. Kyselina klavulanová, ktorá je bez alebo s výrazne redukovaným množstvom 5S klavamu.
  20. 21. Kyselina klavulanová, ktorá je bez alebo s výrazne redukovaným množstvom klavam-2-karboxylátu.
    -2022. Farmaceutický prostriedok, vyznačujúci sa tým, že zahrnuje klavulanát draselný podľa nároku 19 v kombinácii s beta-laktamovým antibiotikom.
  21. 23. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa t ý m, že beta-laktámovým antibiotikom je amoxycilín.
  22. 24. Spôsob prípravy farmaceutického prostriedku zahŕňajúceho klavulanát draselný a amoxycilín, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa produkciu kyseliny klavulanovej z mikroorganizmu podľa nároku 12, jej konverziu na draselnú soľ a potom kombinovanie draselnej soli s amoxycilínom.
SK1054-99A 1997-02-04 1998-02-02 Dna comprising one or more genes specific for biosythesis of 5s clavam in s. clavuligerus, a vector containing dna, a host containing such vectors, process for improving the manufacture of 5r clavam and method for identification of microorganisms SK105499A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB9702218.0A GB9702218D0 (en) 1997-02-04 1997-02-04 Novel product
PCT/EP1998/000644 WO1998033896A2 (en) 1997-02-04 1998-02-02 Microorganisms with increased production of clavulanic acid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
SK105499A3 true SK105499A3 (en) 2000-05-16

Family

ID=10807030

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1054-99A SK105499A3 (en) 1997-02-04 1998-02-02 Dna comprising one or more genes specific for biosythesis of 5s clavam in s. clavuligerus, a vector containing dna, a host containing such vectors, process for improving the manufacture of 5r clavam and method for identification of microorganisms

Country Status (32)

Country Link
US (5) US6936458B1 (sk)
EP (2) EP0970198B1 (sk)
JP (2) JP4227199B2 (sk)
KR (2) KR100514964B1 (sk)
CN (2) CN1192107C (sk)
AP (1) AP1320A (sk)
AR (2) AR011100A1 (sk)
AT (1) ATE312926T1 (sk)
AU (1) AU735782B2 (sk)
BG (1) BG103704A (sk)
BR (1) BR9807144A (sk)
CA (1) CA2279207A1 (sk)
DE (1) DE69832783T2 (sk)
DZ (1) DZ2413A1 (sk)
EA (1) EA003773B1 (sk)
ES (1) ES2255149T3 (sk)
GB (1) GB9702218D0 (sk)
HU (1) HUP0001048A3 (sk)
ID (1) ID22144A (sk)
IL (1) IL131043A0 (sk)
MA (1) MA24464A1 (sk)
MY (1) MY140928A (sk)
NO (1) NO993758D0 (sk)
NZ (1) NZ336894A (sk)
OA (1) OA11082A (sk)
PL (1) PL334961A1 (sk)
SK (1) SK105499A3 (sk)
TR (1) TR199901862T2 (sk)
TW (2) TW589377B (sk)
UY (2) UY24874A1 (sk)
WO (1) WO1998033896A2 (sk)
ZA (1) ZA98868B (sk)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7983400A (en) * 1999-09-16 2001-04-17 Johns Hopkins University, The Improvement of clavulanic acid production
JP2003512832A (ja) * 1999-10-22 2003-04-08 スミスクライン ビーチャム パブリック リミテッド カンパニー Ｌａｔおよびｃｖｍ遺伝子の欠失した５ｒクラバム産生微生物
GB0308696D0 (en) 2003-04-15 2003-05-21 Glaxo Group Ltd New process
EP2589663A1 (en) 2011-11-04 2013-05-08 LEK Pharmaceuticals d.d. Process for production of clavulanic acid
CN107964522B (zh) * 2018-01-04 2020-12-08 上海交通大学 海洋链霉菌dut11及其抗补体活性应用
EP3994154A1 (en) 2019-07-05 2022-05-11 GlaxoSmithKline Intellectual Property (No.2) Limited Streptomyces clavuligerus

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4110165A (en) * 1974-04-20 1978-08-29 Beecham Group Limited Process for the production of clavulanic acid
YU40452B (en) * 1975-02-07 1986-02-28 Beecham Group Plc Process for the elimination of contaminating impurities from clavulinic acid
GB1585661A (en) 1976-06-08 1981-03-11 Glaxo Lab Ltd Clavam derivatives
JPS589679B2 (ja) 1977-02-24 1983-02-22 武田薬品工業株式会社 抗生物質の製造法
US4202819A (en) 1979-05-04 1980-05-13 Hoffman-La Roche Inc. 2-(3-Alanyl)clavam antibiotic
GB8521516D0 (en) * 1985-08-29 1985-10-02 Beecham Group Plc Compounds
GB9020683D0 (en) 1990-09-22 1990-11-07 Univ Strathclyde Isolation of dna
CA2108113C (en) * 1993-10-08 2006-12-05 Susan E. Jensen Dna sequence encoding enzymes of clavulanic acid biosynthesis

Also Published As

Publication number Publication date
CN1696301A (zh) 2005-11-16
CN1251612A (zh) 2000-04-26
WO1998033896A3 (en) 1998-11-19
DZ2413A1 (fr) 2003-01-04
JP2001511001A (ja) 2001-08-07
AR011100A1 (es) 2000-08-02
EP0970198B1 (en) 2005-12-14
EA003773B1 (ru) 2003-08-28
US20030124690A1 (en) 2003-07-03
AP1320A (en) 2004-10-29
EA199900718A1 (ru) 2000-02-28
CA2279207A1 (en) 1998-08-06
US20030166175A1 (en) 2003-09-04
EP1405913A3 (en) 2004-08-04
KR100514964B1 (ko) 2005-09-15
BR9807144A (pt) 2000-01-25
UY24874A1 (es) 2001-07-31
WO1998033896A2 (en) 1998-08-06
JP4227199B2 (ja) 2009-02-18
US6936458B1 (en) 2005-08-30
CN1192107C (zh) 2005-03-09
MA24464A1 (fr) 1998-10-01
ATE312926T1 (de) 2005-12-15
TR199901862T2 (xx) 2000-12-21
TW200307041A (en) 2003-12-01
JP5042186B2 (ja) 2012-10-03
KR20000070723A (ko) 2000-11-25
KR20050053794A (ko) 2005-06-08
ZA98868B (en) 1999-08-03
HUP0001048A3 (en) 2001-09-28
BG103704A (en) 2000-05-31
HUP0001048A2 (hu) 2000-08-28
NO993758L (no) 1999-08-03
AU735782B2 (en) 2001-07-12
EP1405913A2 (en) 2004-04-07
US20030022321A1 (en) 2003-01-30
US7344869B2 (en) 2008-03-18
ES2255149T3 (es) 2006-06-16
GB9702218D0 (en) 1997-03-26
US20070298470A1 (en) 2007-12-27
AP9901614A0 (en) 1999-09-30
IL131043A0 (en) 2001-01-28
PL334961A1 (en) 2000-03-27
JP2009022298A (ja) 2009-02-05
NZ336894A (en) 2001-08-31
MY140928A (en) 2010-02-12
EP0970198A2 (en) 2000-01-12
AU6295398A (en) 1998-08-25
ID22144A (id) 1999-09-09
DE69832783T2 (de) 2006-07-20
AR018304A2 (es) 2001-11-14
DE69832783D1 (de) 2006-01-19
UY25197A1 (es) 1998-11-27
NO993758D0 (no) 1999-08-03
OA11082A (en) 2003-03-13
TW589377B (en) 2004-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH09107981A (ja) ホスフィノトリシン耐性遺伝子の使用
CA2767491C (en) Process for preparation of tacrolimus
JP5042186B2 (ja) 多量のクラブラン酸を産生する微生物
Hung et al. Enhancement of clavulanic acid by replicative and integrative expression of ccaR and cas2 in Streptomyces clavuligerus NRRL3585
WO2002059322A9 (en) Compositions and methods relating to the daptomycin biosynthetic gene cluster
KR102159415B1 (ko) Uk-2 생합성 유전자 및 그것을 사용한 uk-2 생산성을 향상시키기 위한 방법
JP2007289193A6 (ja) クラバム抗生物質の産生を強化する方法
JP2007289193A (ja) クラバム抗生物質の産生を強化する方法
CZ277599A3 (cs) Mikroorganismy se zvýšenou produkcí kyseliny klavulanové
US7622302B1 (en) Process for improving the manufacture of clavams e.g. clavulanic acid
US6410293B1 (en) DNA fragments containing biotin biosynthetase gene and use of the same
US20030109694A1 (en) Novel process
JPH06105682A (ja) β−ラクタム抗生物質産生促進法および大量のＡＣＶシンテターゼ単離法
Jensen Genetic Engineering To Regulate Production of Secondary Metabolites in Streptomyces clavuligerus
KR19990074514A (ko) 아미노글라이코사이드계 항생제에 대해 다제내성을지정하는유전자
WO2013064687A2 (en) Process for production of clavulanic acid