TW589377B - Cloning of DNA for 5S clavams biosynthesis and the use thereof - Google Patents

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經漓部中央標準局員_τ消費合作社印繁 589377 A7 B7_ 五、發明説明（1 ) ' ^~~ 本發明係有關新穎細菌基因及製造克拉凡素 (clavams) ’例如·克拉弗酸(davuianic⑽丨幻之改良方法。 本發明亦提供可提高克拉弗酸產量之新穎生物體。 微生物，特定言之鏈黴菌屬，可產生許多種抗生素， 包括：克拉弗酸及其他克拉凡素、頭孢素、聚乙醯 (polyketides)、頭黴素、衣徽素、全徵素、及青黴素。由 微生物生產此等抗生素之絕對量及相對量之處理上有相 當大利益’因此有許多研究探討其生合成途徑之代謝與 遺傳機制〔A丄·道明（D〇main)(1990)，、、泠-内醯胺抗生 素之生合成與調節 7/ (Biosynthesis and regulation 〇f beta-lactam antibiotics·)，述於、、五十年來青黴素之應用、 歷史及趨勢”（50 years of Penicillin applications，history and trends)〕。已知許多種在代謝途徑中進行各種步驟之 酵素’及編碼此等酵素之基因。 克拉凡素依其環之立體化學，大致可分成兩類（5S 及5R克拉凡素）。5R與5S克拉凡素生合成之生化途徑 尚未完全了解，但有人認為其係衍生自相同起始單位（係 尚未鑑定出之3個碳之化合物〔C.A.湯森(Townsend)與 M.F.何（Ho)(1985)，J· Am. Chem. Soc· 107(4)，1066-1068 及 S.W.艾森（Elson)及 R.S·奥利佛（01iver)(1978) J· Antibiotics XXXI Νο·6,568〕及精胺酸〔B_P.華倫坦 (Valentine)等人（1993) J. Am. Chem. Soc. 15, 1210〜1211〕且共同出現一些中間物〔D·伊華特(Iwacta)· 洛伊（Reuyl)及 C.A_ 湯森（T〇wnsend)(l"2) J· Am· Chem· >紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（21〇X297公f ) --------裝------訂------- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 589377

經漓部中央標準局員Η消費合作社印S A7 __ B7五、發明説明（2 ) Soc· 114:2762-63 及 J.W.詹克（Jane)等人（1993)，6丨〇〇巧· Med· Chem. Lett. 3:2313-16〕0 5S克拉凡素實例包括··克拉凡素-2-羧酸酯（C2C)、2-羥甲基克拉凡素(2HMC)、2-(3-丙胺醯基）克拉凡素、瓦 克拉凡素(valcalavam)及克拉凡酸(clavaminic acid)〔GB 1585661，F_ 洛爾（R〇hl)等人，入^11.]^(^〇131〇1.147:315-320，US 4,202,819〕。然而有少數幾種5R克拉凡素實例， 且目前最熟知者為石-内醯胺酶抑制劑克拉弗酸，其係由 克拉弗鏈黴菌（Streptomyces clavuligerus)醱酵產生。克拉 弗酸，係呈克拉弗酸鉀之形式與万-内醯胺經胺苄青黴素 組合成抗生素奥美丁 (AUGMENTIN)〔史密克萊畢強藥廠 (SmithKleinBeecham)之商標名〕。由於此商業利益，克 拉凡素生合成方面之研究則著重於克拉弗鏈黴菌之5r 克拉凡素（克拉弗酸）之生合成。現已鑑定出許多種與 克拉弗酸有關之酵素及其基因，且已公開。此等文獻實 例包括· J.E·赫德森（Hodgson)等人，Gene 166，49-55(1995)，Κ·Α·艾都（Aidoo)等人，Gene 147，41· 46(1994)，A.S.帕拉卡（Paradkar)等人，J. Bact. 177(5)， 1307-14(1995)。反之’對克拉凡酸(ciavaininicacid)以外 之5S克拉凡素之生合成及遺傳學則完全未知，克拉凡酸 為克拉弗鏈黴菌之克拉弗酸生合成途徑中，克拉凡酸合 成酶作用產生之克拉弗酸前體。 基因選殖實驗已鑑別出克拉弗鏈黴菌含有二種克拉 凡酸合成酶之同功異構酶，casl及cas2〔 E.N.馬希(Marsh) -4- 本紙張尺度適用中國國家標準（ CNS ) A4規格（210x^7^餐) ' (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) -裝·

、1T i0 經滴部中决標举局員工消費合作沿印« 589377 A7 B7 五、發明説明（3 ) 等人，Biochemistry 31，12648-657(1992)，此二者均可在 某些營養條件下產生克拉弗酸(A.S.帕拉卡(Paradkar)， J_ Bact· 177(5)，1307-14(1995)〕。在其他生產克拉弗酸 之微生物中，亦即尤木琴鏈黴菌（S.jumonjinensis)〔C.M. 韋達（Vidal)，ES 550549,（1987)〕與卡蘇漢鏈黴菌（S. katsurahamanus) [ K.奇塔諾（Kitano)等人，JP53-104796(1978)〕及抗生鏈黴菌（S· antibiotics)(係 5S 克拉 凡素，瓦克拉凡素之生產菌）〔J.E·巴德温（Baldwin)，

Tetrahedron Letts· 35(17)，2783-86(1994)〕，亦檢測到克 拉凡酸合成酶活性。後項文獻亦報告了抗生鏈黴菌具有 原克拉凡酸脒基水解酶活性，其係另一種已知涉及克拉 凡酸生合成之酵素。已有文獻指出克拉弗鏈黴菌中所鑑 別出之所有涉及克拉凡素生合成之其他基因為克拉弗酸 生合成所必要.者〔J.E_赫格森(Hodgson)等人 ，Gene 166, 49-55(1995)，Κ·Α·艾都（Aidoo)等 人，Gene 147，41-46(1994)〕’但尚無文獻指出專門用於5s克拉凡素生合 成之基因。 吾等現已鑑別出專用於5S克拉凡素生合成之某些基 因’其實例為克拉弗鏈黴菌之C2C與2HMC。因此本發 明提供包含克拉弗鏈黴菌專用於5S克拉凡素生合成但 不疋為5汉克拉凡素（例如：克拉弗酸）生合成所必需 之一種或多種基因之DNA。 、兩本文所採用、、基因〃亦包括任何基因功能或表現所 必而之任何調節區。較佳方面，DNA之鑑定結果示於圖 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

、1T 589377 A7 B7 五、發明説明（ 經漓部中央標準局貝_!消費合作社印餐 1。較佳者，DNA包括圖1中以orfup 3、〇 f 1、orfdwiu、orfdwn 2 與❶池驟 3 代表0二冲 2、orfup 本發明亦提供由該職編碼之蛋白質。林=序列。 含本發明舰之載體及含料傾之宿主亦提供包 吾等已驚人地發現，當至少一種根。 缺陷時，生物體之克拉弗酸產量增加。因此基因有 供利用合適之微生物提高克拉弗酸產量之方法 :方面’可操作所㈣之基因產生可提高克拉凡素x 克拉弗酸較合適）之生物體。本研究之發現結果亦可改 良鑑別較高克拉弗酸產量之生物體之方法，其包括初步 筛選5S克拉凡素產量低或無之生物體（例如本 例所述進行hplc與/或克拉凡素生物分析法）。 本發明5S克拉凡素基因宜由一般選殖法（如： PCR)，根據本文提供之序列製得。可採用基因技術， 如：基因瓦解〔K.A.艾都等人（1994)，Gene，147,41-46〕、 隨機誘變法、定位誘變法及反義RNA，來干擾或消除/ 刪除基因功能。 本發明另一方面係提供含有一個或多個缺陷基因之 質體，較佳質體為如下述之pCEC 060、pCEC 06卜pDES 3、pCEC 056與pCEC 057。該等基因可依多種方式製成 缺陷。例如：嵌插一段完全廢除該基因活性之編碼抗生 素抗性基因之DNA片段。或者，可採用其它方法生產缺 陷基因，包括篏插不編碼抗生素抗性基因之DNA，刪除 部份基因，刪除所有基因或經由增加與/或取代一個或 ---------1T---------0 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 6- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21〇Χ297公釐） 589377 A7 B7 五、發明説明（5 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 多個核苷酸來改變基因之核苷酸序列。根據本發明之缺 陷基因之缺陷程度可能各異。其缺陷處可能在於活性完 全廢除或保留一部份原有活性。 本發明之質體宜用於轉化如：克拉弗鏈黴菌之生物 體，例如：菌株ATCC 27064 (其相當於克拉弗鏈黴菌 NRRL 3585 )。合適之轉化法可參見相關文獻，包括：J. 山布魯克（Sambrook)、E.F.弗立奇(Fritsch)與T.馬尼狄 斯（Maniatis)(1989)，、、分子選殖法：實驗室手冊 (Molecular cloning:a laboratory manual)，第 2 版，紐約冷 泉港冷泉港實驗室（Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor，N.Y.) ; D.A.哈普伍德（Hopwood)等人 (1985)，a鏈黴菌之基因操作法。選殖手冊〃（Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual)及 A.S. 帕拉克（Paradkar)與 S.E·傑森（Jensen)(1995)，J· Bacteriol. 177(5):1307-1314。 經满部中央標率局員_!:消費合作社印f 工業上使用克拉弗鏈黴菌菌株來生產克拉弗酸（克 拉弗酸钟）。在英國與美國藥典(British and United States Pharmacopoeias)中有關克拉弗酸鉀部份（英國藥典 1993,附冊1994，P.1362-3及美國藥典官方專題論文⑴乂 Pharmacopeia Official Monographs) 1995, USP 23 NF 18 P.384-5 )，明確控制毒性5S-克拉凡素，克拉凡素-2-羧 酸醋之含量。 因此本發明另一方面係提供可生產高量克拉弗酸， 但無法製造C2C或可生產高量克拉弗酸但僅可製造低量 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經漓部中央標枣局員工消費合竹社印f 589377 " ^ ^ *--—--______ B7 五、發明説明（6 ) ^ C2C之生物體。生產克拉弗酸之合適生物體含有一個或 夕個缺陷克拉凡素基因，較佳者為如下說明之克拉弗鏈 徽菌菌株 56-1A、56-3A、57-2B、57-1C、60-1A、60-2A、 60-3A、61_1A、61_2A、61_3A、及 61-4A。此等生物體 適合生產克拉弗酸’不會生產克拉凡素、克拉凡素· 2-羧酸酯，或顯著降低克拉凡素_2_羧酸酯產量。 實例 實例中，所有方法均如J.山布魯克，E.F·弗立奇與T. 馬尼狄斯（1989)之、、分子選殖法：實驗室手冊，，（第2 版）或D.A·哈普伍德等人（1985)之、、鏈黴菌之基因操作 法。選殖手冊”，及A.S.帕拉卡與S.E·傑森（1995)之J.

Bacteriol，177(5):1307-1314，除非另有說明。 L立拉弗鏈黴菌染色體克拉凡酸酯合成酶基因casl上 游及下游之DNA戽列分析 A. casl之分離

為了自克拉弗鏈黴菌NRRL 3585分離編碼克拉凡酸 酯合成酶同功異構型l(casl)之染色體DNA片段，根據 已先分析序列之casl基因（E.N.馬希(Marsh))、M.D·T· 張（Chang) 及 C.A. 湯森 （Townsend)(1992) Biochemistry 仏:12648-12657)之核苷酸9-44，合成募核苷酸探針 RM01。寡核苷酸係於應用生物系統公司（Applied Biosystems) 391 DNA合成儀上，採用標準方法構築。所 合成之RM01 (36聚體）之序列與上述馬希所公開之序 列（1992,上述文獻）呈反向平行意義。RMOl係採用DNA -8 - 尺度適用中國國CNS ) A4規格—（210X297公釐) (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· -訂 589377 Α7 Β7 五、發明説明（7 ) 寡核苷酸末端標識標準技術（上述山布魯克等人， 1989)，以32P進行放射性標識，並用於依史塔爾（Stall) 與阿曼（Amann)所述之南方雜交法〔'細菌分類學之核酸 技術(Nucleic acid techniques in bacterial systematics〕， E·史塔克布蘭特(Stackbrandt)與M.古菲洛(Goodfellow) 編輯，多倫多市強威利父子公司（John Wiley & Sons)， P.205-248, 1991)，篩選克拉弗鏈黴菌基因組DNA粘接質 體庫。於粘接質體PLAFR3中製備之克拉弗鏈黴菌DNA 之基因組庫說明於J.L.杜倫（Doran)等人（1990)，J. Bacterial· 172(9)，4909-4918 〇 經滴部中央標率局員JT-消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 由克拉弗鏈黴菌粘接質體庫之菌落點與標識放射性 之RMOl於60°C下，於含5XSSC，5χ登哈特氏溶液 (Denhardt’s solution)與 0.5% SDS (lxSDS : 0·15Μ NaCl + 0.015M擰檬酸三鈉；ΐχ登哈特氏溶液：〇 〇2〇/c) BSA， 0.02%Ficol卜及〇·〇2%ρνΡ)溶液中培養一夜。吸墨點於 68°C下，於〇.5xSSC + 0_l% SDS溶液中洗滌30分鐘。 分離一株粘接質體純系1〇D7,其會與RMOl強力雜交， 當接受限制内切核酸酶Sac I與EcoRI分解時，產生之雜 父5孔號與克拉弗鏈黴菌基因組DNA之類似分解實驗時 檢測之雜交訊號一致。 B.息奥黴菌側接casl之DNA序列分析 採用限制内切核酸酶SacI、NcoI及ΚρηΙ產生粘接質 體10D7之部份限制圖譜。由rmOI與l〇D7 DNA之各 種不同分解物之間之南方雜交實驗顯示，casi最可能位 _ -9- 本紙張尺度適用中^—家;^) M規格（2ΐ〇χ_297公襲） 589377 經滴部中央標準局員工消費合作社印繁 A7 B7______五、發明説明（8 ) 於7 kb SacI-SacI DNA次片段之一端，此片段由casl開 、 放讀碼框及約6 kb上游DNA組成。再自噬菌質體載體 pBluescriptll SK+(2.96 kb;史塔金公司（Stratagene))中 10D7之SacI分解物次選殖出7-kb片段，因而產生重組 質體 pCEC007。 為了有利於分析casl之染色體上游之序列，在pUC 120(3.2 kb ;菲拉（Vieirre)與梅辛（Messing)，Methods Enzymol· 153, 3-11，1987)中，依兩個方向，次選殖出7 kb SacI-SacI片段之3 kb Ncol-Ncol次片段，產生重組質體 PCEC026與pCEC027。該3 kb次片段係由casl之編碼 胺基末端部份與上游DNA約2.6 kb組成。 採用外切核酸酶ΠΙ與S1核酸酶分解法（上述山布魯 克等人，1989 )，在pCEC026與pCEC027中產生集中 重疊刪除，並.利用Tag染料-去氧a終結子套組及應用生 物系統373 A序列分析儀進行二去氧鏈終結法(F.山格 (Sauger) ，S.尼克倫（Nicklen)與 A.R.庫森 (Coulson)(1977)? Proc. Natl. Acad. Sci. USA? 74:5463-5467)，在兩股上決定3 kbNcoI-NcoI片段之DNA序列。 為了決定緊接casl下游染色體之DNA序列，自 pBluescritpn SK+中粘接質體純系10D7次選殖出4.3 kb KpnI-Eco RI DNA 片段，產生 pCEC018。自 pcEC018 中，選殖 3·7 kb SacI-SacI 次片段至 pSL1180 中（3,422 kb， 法馬藥廢(Pharmacia));此片段SacI末端之一與casl之 TGA停止字碼子部份重疊，其他部份則編竭載體。次選 -10- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝_ 訂 i0 經漓部中央標率局貝工消費合作社印f 589377 A7 _____________B7 五、發明説明（9 ) 殖期間則得到兩個方向之3_7 kb片段，所得重組質體分 別稱為pCEC023及pCEC024。在兩個質體中進行隼中重 疊删除，並於兩股上決定3.7 kb片段之DNA序列。此等 實驗產生之克拉弗鏈黴菌染色體之核苷酸序列（包括測 接casl序列）示於圖1。 Π開放讀碼框側接casl之功能分析法 casl上游之DNA序列之電腦分析法預測到兩個完整 之orfs及一個不完整之orf之存在。所有三個沉f均位在 c a s 1之相反DN A股上，因此呈反向排列。第一個開放讀 碼框orfupl位於casl上游之579 bp，且編碼3料個胺基 酉夂（aa)之多狀’第一個開放讀碼框〇rfUp2，位於〇rfUpi 之3末端上方437 bp ’且編碼151 j aa之多肽。〇rfUp2 上方為orfup3。〇rfup3之起始字碼子與orfup2之轉譯停 止字碼子重疊，表示這二個orfs在轉譯上偶合。3 kb Ncol-Ncol片段上沒有orfup3之轉譯停止字碼子。 casl下游之DNA序列之類似分析法預測到二個完整 orfs及一個不完整orf之存在。這二個〇rf均位在casl 之反向DNA股上，因此其方向係向著casi。第三個〇rf 位於casl之相同股上，因此其方向係遠離casl。第一個 下游開放讀碼樞orfdwnl位於casl下游373 bp，且編碼 328個aa之多肽。第二個開放讀碼框orfdwn2位於 orfdwnl上游55 bp，且編碼394個aa之多肽。orfdwn3 則位於〇rfdwn2上游315 bp，且在反向股上。由於3.7 kb 片段上未發現orfdwn3之停止字碼子，因此其編碼219 -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589377 A7 _________ B7 五、發明説明（10 ) 個aa之不完整多肽。 orfup與orfdwn開放讀碼框之基因瓦解曼 為了分析開放讀碼框侧接casl於克拉弗鏈黴菌生產 克拉弗酸及其他克拉凡素之生合成作用中之可能角色， 利用基因置換法，產生嵌插之不活化或刪除突變株。用 於基因瓦解及置換之方法基本上已說明於帕拉卡 (Paradkar)與傑森（Jensen)之上述文獻（1995)中。 A. orfupl 依帕拉克與傑森（上述文獻1995)所述構築帶有阿 伯拉黴素（apramycin)抗性基因（aprr)之 1·5 kb NcoI_NcoI-片段’以克倫片段(Klenow fragment)處理，產生純端（山 布魯克等人，1989上述文獻），粘接至經BsaBI分解之 PCEC026，同樣以克倫片段處理。pCEC026擁有一個 BsaBI位置’位於離轉譯起始字碼子636 bp之orfupl内。 採用枯接混合物轉化大腸桿菌GM 2163可勝任之細胞 (得自美國新英格蘭生物實驗室（New England Biolabs， USA)，M.G.馬里諾斯(Marinus)等人，MGG(1983)，vol. 122，Ρ·288-9)，使之具有阿伯拉黴素抗性。自所形成之 轉化體中分離出二株含有質體pCEC054及pCEC055之 純系；經限制酶分析，發現pCEC〇54擁有aprr-片段嵌在 與orfupl之相同方向上，而pCEC055則呈相反方向。 為了將PCEC054引入克拉弗鏈黴菌中，以BamHI 及Hindm分解質體DNA，並粘接高套數鏈黴菌載體 pIJ486 (6·2 kb ;華德（Ward)等人，（1986) Mol· Gen· Genet· -12- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )六4規格（2i〇x297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝·

、1T 589377 A7 B7 五、發明説明（1 1 ) 203:468-478)。然後採用枯接混合物來轉化大腸桿菌gm 2163可勝任之細胞，使之具有阿伯拉黴素抗性。由所得 之轉化體中分離一株擁有往返質體PCEC061之純系。此 質體再用於轉化克拉弗鏈黴菌NRRL 3585。所得轉化體 則於非選擇性培養基上連續進行兩回芽胞形成作用，然 後重覆塗佈在含抗生素之培養基上，以鑑別具阿伯拉黴 素抗性及硫鏈絲菌肽敏感性之轉化體。由此方法再選拔 四株推斷可能之突變株（61-1八、-2八、-3人與-4八），進一 步分析。 為了證實此等推斷之突變株會在orfUp 1中瓦解，因 此自分離株61-1A及61-2A中製備基因組DNA，以SacI 分解，並進行南方墨點分析。南方墨點分析結果與所出 現之雙重交叉現象一致，證明此等突變株為orfupl中之 真正瓦解置換.突變株。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)

由突變株61-1A、-2A、_3A與-4A於大豆粉培養基中 生長’以HPLC分析其培養物上澄液之克拉弗酸與克拉 凡素產量。大豆粉培養基之組成份及HPLC分析克拉凡 素之方法均如先前技藝之說明（帕拉克與傑森，1995上 述文獻），但HPLC分析法之流動緩衝液則改由〇.1 μ NaH2P04+6%曱醇，pH 3.68組成（以冰醋酸調pH)。 HPLC分析法顯示，突變株均未產生可檢測量之克拉凡 素-2-羧酸酯或2-羥甲基克拉凡素。此外，當培養物上澄 液採用普魯士（Pruess)與克里特（Kellett)之方法（1983，J. Antibiot·巧·· 208-212)，針對桿菌屬（Bacillus sp·) ATCC -13- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589377 A7 .. ____ B7 五、發明説明（12 ) 27860進行生物分析時，突變株均未產生可檢測量之丙 -胺醯基克拉凡素。反之，培養物上澄液之HpLC〜分析法 則顯示突變株之克拉弗酸產量似乎優於野生型（表1)。 奉1 突變换拉莖_盪燒瓶^拉弗酸效價(CA) 菌 種 70小時 70小時 93小時 93小時 CA微毫升 CA微克/毫克DNA CA微統升 CA微克/毫克DNA NRRL 3585 #] 87 "9Ϊ?~ ~~ 166 1963 NRRL 3585 #2 66 *790~'-- 159 1842 61-1 A 272 2894 _ 439 6113 6I-2A 199 2148 _ ' 225 2928 6J-3A 54 692 221 2585 61-4A 0 226 2422 orfupl刪除法 經濟、部中央標準局員Η消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 進行選殖實驗，在orfupl之Aatn位置之間刪除654 個核苷酸。採用下列寡核苷酸引子並以上述pCEC061為 模板，產生PCR產物。改變原有之核苷酸序列，使PstI 納入寡核苷酸11中，及使SphI位置納入寡核苷酸14 中。 用於產生PCR產物1之寡核苷酸對1 引子 11 5’ dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3’ 5J dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC3, "5丨于12 -14- _ 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印繁 589377 A7 _______B7__;___ 五、發明説明（13 ) 用於產生PCR產物2之寡核苷酸對2 2 1 α 5, dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3， -引子13 ^ 5, dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3， 引子14 採用來自 GRI(Felsted，Dunmow，Essex，CM6 3LD)之 PTC-200普利特(Peltier)熱循環機進行標準PCR反應。 採用引子11及12產生PCR產物1。此產物約1 kb， 且包含由第二個Aat Π位置開始之orfup 1之敌基末端及 下游區。 PCR產物係採用引子13與14產生。此產物約1.1 kb，且包含由第一個Aatn位置開始之orfupl之胺基末 端及上游區。

依指導手冊（史塔金公司（Strategene Ltd，Cambridge Science Park，Milton Road，Cambridge CB4 4GF)，由 PCR 產物2與SrfI分解之PCR-Script Amp SK(+)枯接。採用 此粘接混合物轉化Epicurian大腸桿菌XL 1-Blue MRF’Kan具超勝任能力之細胞（來自史塔金公司），使 之具胺苄青黴素抗性（依製造商指導手冊進行）。自所 得轉化體中分離質體DNA，由DNA之限制酶分析結果 顯示，有7株含有已粘接PCR產物2之質體之純系。其 中一個質體稱為pDESl。 以PstI及Aatn分解PCR產物，所得DNA經琼脂糖 破膠電泳分離。切下1 kb片段’採用Sephaglas條帶製 備套組(band prep kit)(法馬公司（Pharmacia，St Albans

Herts，ALI3AW)，自凝膠上溶離出。分離之片段再枯接 -15- 本紙張又度適ϋ國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） ' - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· 、1Τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 589377 A7 -__ B7 五、發明説明（14 )

Aatn與PstI分解之pDESl。採用此粘接混合物來轉化大 腸桿菌XLl-Blue可勝任之細胞（來自史塔金公司），使 之具胺苄青黴抗性（依製造商之指示）。自所得之轉化 體中分離質體DNA，由限制酶分析結果顯示有丨株含有 已粘接PCR產物之質體純系。此質體稱為pdeS2。 為了將pDES2引入克拉弗鏈黴菌中，進一步修飾質 體，使之含有可於鏈黴菌中運轉之複製起點。為了達成 此目的，以EcoRI與HindlE分解pDES2之質體DNA， 並粘接至亦經EcoRI及HindlE分解之高套數鏈黴菌載體 pIJ486(6.2 kb :華特等人（1986) Mol. Gen. Genet. 203:468-478)中。採用粘接混合物來轉化大腸桿菌（jmi〇9) 可勝任之細胞（史塔金公司），使之具胺苄青黴抗性。 自所得轉化體中分離質體DNA，由限制酶分析結果顯示 6株具有含pIJ486之pDES2之純系。其中一個質體稱為 pDES3。採用質體pDES3轉化一株克拉弗鏈黴素菌菌 株，其中orfupl基因已因嵌插阿伯拉黴素抗性基因而瓦 解（如上述）。選拔硫鏈絲菌肽抗性轉化體，此等轉化 體再於非選擇性培養基上進行三回芽胞形成作用，並篩 選阿伯拉黴素抗性之喪失。由此方法鑑別出45株已喪失 阿作拉黴素抗性之突變株。然後利用HPLC分析證實此 等菌株，例如：orfupl瓦解株61-1A、61-2A、61_3A及 61-4A當於通常生產克拉凡素之條件下醱酵時，無法生 產克拉凡素-2-竣酸S旨及2-經甲基克拉凡素。 B· orfdwnl 及 orfdwn2 -16- 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（21^1^公羡) '' _~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 、1Τ 589377 經濟部中央標率局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（15 ) 先以Ncol分解PCEC018(7.3 kb)，並釋出含大多數 orfdwnl及一部份〇rfdwn2之1 kb次片段，製成在 orfdwnl及orfdwn2中删除/置換之突變株。分解物經琼 脂糖凝膠電泳分離，切下6·3 kb片段，自凝膠上溶離。 此片段再粘接帶有aprr之Ncol-Ncol DNA片段，用來轉 化大腸桿菌XLl-Blue，使之具阿伯拉徽素抗性。由此實 驗得到一株純系，但所得到重組質體之限制酶分析結果 顯示，已有二套阿伯拉黴素抗性片粘接至刪除質體中。 為了消去apr1*片段之多餘套數，以Ncol分解質體，並自 體粘接。採用粘接混合物來轉化大腸桿菌GM2163，使 之具阿伯拉黴素抗性。自此等轉化體中分離二株含有質 體PCEC052與pCEC053之純系，此二質體均僅具有一 套apr -片段，pCEC052具有aprr_片段與〇rfdwnl及2呈 相反方向，而.PCEC053具有之aprr-片段則依與 2之相同方向嵌插。 pCEC052之往返質體之構築法為粘接BamHI-分解之 PCEC052與依類似方法分解之PIJ486，並轉化大腸桿菌 GM2163 ’使之具阿伯拉徽素抗性。由此實驗中分離出一 株含有往返質體pCEC060之純系。此質體用來轉化野生 型克拉弗鏈黴菌3585，使之具阿伯拉黴素與硫鏈絲菌狀 抗性。所得轉化體於非選擇條件下進行兩回芽胞形成作 用，然後重覆塗佈在含抗生素之培養基中，以鑑別阿伯 拉黴素抗性，硫鏈絲菌肽敏感性菌落。選拔三株推斷可 能之突變株(60_1A、-2A及-3A)作進一步分析。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 、-u -17- 589377 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（16 為了鑑別此等推斷之突 中分離基因組DNA，並二㈣’自菌株論及㈣A 方墨點分析。Φ此實驗產生或BStE11分解進行南 象之兩個菌株結果—:產=雜二與出現雙重交叉現 中之真正瓦解置換突變株。*等突變株為。rfdwnl/2 當=等突變株於大豆粉培養 析其培養物上料時 φ 且以HPLC刀 t 變株均無法產生可檢測量 經甲基克拉凡素。培養物上澄 液之生物刀析法顯示該等突變株亦無法產生可檢測量 丙胺醯基克拉凡素。如同〇rfupl突變株，〇rfdwni/2突 株之克拉弗酸產量亦優於野生型（表 表2 之變 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝. -訂· ύ 種 70小時 70小時 93小時 93小時 CA微％毫升 CA微克/毫克]^^ CA微力毫升 CA微克/毫克DNA NRRL 3585 #1 87 915 ~ " 166 1963 NRRL 3585 #2 66 790 — 159 1842 60-JA 164 —1872 ' 260 2911 60-2Α 187 2013 ， 108 1320 60-3Α 79 994 214 2161 orfdwn3 -18 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4规格（210X 297公襲） 589377 A7 B7 五、發明説明（17 ) 經滴部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 為 了瓦解 〇rfdwn3，由 pCEC3023(由 casl 下游 DNA 3.7-kb片段次選殖至pSL 1180中組成）經 Ncol分解，然後自體粘接。經此粘接混合物轉化 大腸桿菌後，分離一株具有質體PCEC03 1之純 系。此質體僅保留編碼一部份〇rfdwn2及不完整 orfdwn3 之 1.9kb NcoI-EcoRI 片段。檢視 DNA 序 列顯示pCEC03 1具有一個獨特之BstE Π位置位於 orf*dwn3轉譯起始位置之1 58bp處。因此，以BstE Π分解pCEC03 1，經克倫片段處理，形成鈍端， 然後與已呈鈍端之阿伯拉黴素抗性匣粘接。採用此 粘接混合物來轉化大腸桿菌GM2 163，使之具有阿 伯拉黴素抗性及胺苄青黴素抗性。選拔二株分別含 有PCEC050及pCEC05 1之轉4匕體，由限制酶分析 結果顯示，阿伯拉黴素抗性匣之方向亦與PCEC050 中之orfdwn3之方向相同，但與pCEC051之方向 相反。這二個質體再經HindlE分解，並與依類似 方式分解之PIJ486粘接。該粘接混合物再分別用 於轉化大腸桿菌GM2 163，使之具阿伯拉黴素及胺 苄青黴素抗性。自所得之轉化體中分離往返質體 pCEC05 6(pCEC05 0+pIJ486)與 pCEC05 7(pCEC051 + pIJ486)。這二個質體再用於轉化克拉弗鏈黴菌 NRRL 3585。 自轉化實驗中選拔一株轉化體，並於非選擇性 培養基上連續進行兩回芽胞形成作用，然後重覆塗 -19 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 589377 A7 B7 五、發明説明（l8 ) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 佈在含抗生素之培養基上，以鑑別阿伯拉黴素抗性 及硫鏈絲菌肽敏感性轉化體。由此方法，自各初級 轉化體之後代分離出兩株推斷可能之突變株 (PCEC056 之 56-1A 與 56-3A，及 pCEC057 之 57-1C 與 57-2B)。 為了鑑別此等推斷之突變株，自此等菌株中分 離出基因組DNA，以SacI或Acc65I分解，進行南 方墨點分析。由此實驗產生之雜交帶與這兩株菌株 之雙重交叉現象一致，證實此等突變株為orWwn3 中真正瓦解置換突變株。 當此等菌株於大豆粉培養基中培養並以HPLC 分析其培養物上澄液時，所產生之突變株大幅降低 克拉凡素-2-叛酸酯或2-羥甲基克拉凡素之產量。 培養物上澄液之生物分析顯示，該等突變株亦無法 生產可檢測量之丙胺醯基克拉凡素。如同〇rfupl 及orfdwnl/2突變株，orfdwn3突變株之克拉弗酸 產量優於野生型（表3)。 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -20- 本紙張尺度適用中酬家辟（CNS ) A4規格（210x297公釐） 589377 A7 B7 五、發明説明（19·) 表3 orftiwn3突變株於振盪燒瓶試驗中之克拉弗酸效價(CA) 菌 種 70小時 70小時 93小時 93小時 CA微克/毫升 CA微克/毫克DNA CA微t毫升 CA微克/毫克DNA NRRL 3585 U1A 180 1580 193 1790 NRRL 3585 #JB 179 1640 266 2310 56-1A 34 110 235 2160 56-3A 225 2140 274 2740 57-1C 253 2910 277 2920 57-2B 242 2240 193 1860 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁 本申請案揭示下列核苷酸序列： 裝— 訂 满 部 中 k 標 率 局 Μ 工 消 費 合 作 社 印 製 SEQ ID No. 1 : SEQIDNo. 2 : SEQ ID No. 3 : SEQ ID No. 4 : SEQ ID No. 5 : SEQ ED No. 6 : SEQ ED No. 7 : SEQ ID No. 8 : SEQ ID No. 9 : SEQ ID No. 10: SEQ ID No. 11: 圖1之DNA序列 orfbp3 序歹，J oribp2序列 orfUpl序列 orfdwnl 序列 orfdwn2 序列 orfdwn3 序列 募核苷酸引子11序列 寡核苷酸引子12序列 寡核苷酸引子13序列 寡核苷酸引子14序列 _ 21· # 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 589377 A7 — B7______ 五、發明説明（如） 圖1克拉弗鏈黴菌染色體（包括側接casl )之核苷酸序列 NCOI丨 .

1 GGTACCGCCCGCCGCCGACGGGGCCTCGGAGCCGGCCTGGCCACTGGTCCTGGTGGGGCC 60 'MAPPPQQPAEAPGTVLVVG * · · · * ·

61 ACCCTATCACCGGGCGGTGGGCCGCGTCGTCTGAGGGCCTGTGCCTGGGCACCCACACGC 120 TPYHGAVRRLLSGSVSGHTH • . <〇rfup3 . . . 121 GCCTTTCCGGGCCTCCGGCCCAGTGTCGGTGCCCATTGCGCGCCACAGGAACGGGCGCAT 180

♦LWPYRATDKGAY

ASLGPPRTM

181 TAGCCCCAGGTCTATCTGCTTCCGGGCCACCTGCTCCTTCAGGGCGTGGAGCATCTGGCA 240 DPDLYVFARHVLFDRVEYVT

241 CGTGGTCGCGGGCCGCCGGGTGAGCCCCAGTGGGCGGGCGGTGCCGGGCAGGGCCACGAG 300 CWRGAAWEPDGARWPGDRHE

301 TGGCACCCACCACGGGAGGCGCCGCTCCTCAAGCCAGGGCCAGTCTTAGGTCAACTGCCT 360 GHTTGEAALLETGTLIWNVS

361 GGTGTCTACCACCCACTAGCTCGCCTACCACGGGGGCTCCAGCAGCTTCTCGGCCCGCTA 420 WLHHTISRITGGLDDFLRAI

421 GAGCCTGAACGGGGCCCGGTCTGGGGTGAACCCCTTCTTCTTCTGGCGCAGGAGCCGCTT 480 ESKGRALGWKPFFFVADEAF 經滅部中次標導1局貝J-消費合作衫印粼

481 CATCAGCTAGCGCCCCCACGGCAGCGACGGCTGCGGCGGCAACAGCTTGCGGAACTTCAT 540 YDIAPTGDSGVGGNDF AKFY Λ . . . <orfup2

541 GCGCCACTACTGGCGGAACGCGACGAGCAGGCAGTATGGCCGGCTACGGTGCCTGTACTT 600 ATIVAKRQEDTMGASA VSM 601 TGCTGGAGGTCTCTAAGGCCCACCGACACGACCCCGACGCCTTCCCCACAGGGGGCGCTT 660 -22.- 娜（210x 297公釐) 經淆部中决標準局舄工消费合作社印袈 589377 ΑΊ ___ Β7 五、發明説明（>丨） 661 CCTGCCGCCTGCGGCGCCTGCGGCGCCGGCAGAGGGGCCGCCTGCCCAGGGTCGCAGGAC 720 721 CTCTCCCGAACCGCCGCCGAACTGCGGCACGACAGGGCGCCGAACGCCTTGCGCTTCATG 780 781 GCCGGTCGCATGCCCGCAACGTGGCCTGCACATGCGGCCAGCCCTGGGGAGCATGGGGGC 840 841 CTCGGCCGGCTGGGGCCGCCGAGGCCCCCATGCCTGCGCGGCCTGGCCGGGCTCGCTCGG 900 901 CCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCTGGCCTGCC 960 961 ACGCGCACCAAGGCCACACAGCCTGTCGAGCCTGCCCAGCCTGCCACGCGCACCAAGGCC 1020 1021 GTGCGGCCTGCCCAGTCAACGGCTAGTACCGCTCGTTACGGCCCCACATGGCGAGGGGCC 1080.

*NGIMALLAPTYREG 1081 TGTGGCCCACCCTCTAGCGCCGGCAGTGGAGGCGCTCCCTGGCCAGCAGGTCGGCCTAGC 1140

SVPHS IAATVEALSRDDLRI 1141 TCCGCCGCCGCTCTAACAGGCGCTCTACCCGGCCCAAGCGCCACGGGCCCTAGCCCTGCT 1200

SAAALNDALHAPNATGPIPV 1201 GCAGGAGCGGGGCCACCACGTCGGTCCGCTCGCGCTCGACACGGTCCCAGTCGGGGTCTG 1260

VDEGRHHLWALALQALTLGL 1261 GCAGGCGCTGGCCCGCGTCGGCCACGTCGTTGCTCGCCAACGCGCGCTCCCGGCCTCGCG 1320

GDAVPRLRHLLSRNRALAPA 1321 ACTTGGCCCCGACCGGGGCCGCCTTCAGGAGCAGGGGGTCTAGCAGCCACCACGCCTACC 1380 SFRPQGRRFDEDGLDDTTR 工 1381 ACGGCCACTCTTTTGGGGCAGGGTCTCCCCGCATTCGCTGCTAGGGCTAGGGGTCGAGGG 1440

TGTLFGRGLPAYAVIGIGLE 1441 CCGTCTGCCC^TGGTGGAGCAGGAGCTAGGGCGCGCTGGTGTCCGAGGTGAGCGAGACGT 1500-

RCVPVVEDEIGRSWLSWESQ 1501 GGCGGCAGTGGCCCACGTGGCGCAGGCGGGCCGCGTCGCACCGGCGCCTCCCGAGCCTCT 1560

VATVPHVADARRLTAASPES -23.- 本紙張尺度適用中國殴家標碑（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝· 訂 經濟部中次標卑局员X消贽合作社印f 589377 A7 ______ _ B7 五、發明説明（>> ) 1561 CTGGCTCGGACGCCTGGAACGGGAGCGCGTGGTCGAGCCGGTGGCGTGGGTGCCAGAGGA 1620

LGLRRVKGERVLEAVAGVTE 1621 GCTAGCCGTGGCGGCCCAGGCAGGTCACGACCATCATGTCCAGCTACGCCAGCCACGGCT 1680

EIPVAPDTWHQYYLDIRDTG 16 81 CTGCTGCGTCCCTGGCAAGCGTCCGGCGCGCCTGCATCCTGCCGAGCGGCGTGTTCGGGA 1740

LRRLSRECAARVYSPEGCLG 1741 CCCTCCGCGGCAGCCTGCTCGCGTGGTACGGCTTGAACCACCGCTAGTCGTGGAGCAGGG 1800

QSAGDSSRVMGFKTAILVED 1801 CCGCCGGGCGCTGGCGGGCAGGCTCGTCGAGGAGTGGCCGCGGCTCGGGGACCTGCAGCC 1860.

RRGAVARGLLEEGAGLGQVD 1861 GCCACAGGTCGTCCCACTGGGGCCGCAGCTGCCGCCGCGCCTACCACCGGCAGCGGGCCC 1920

ATDLLTVGADVAARITATAR 1921 GCGCCAGGCCCGCAGGCATCTTCAGCCACCAGCCGTCCGTCGGCTCGGGGACCCGTGACT 1980

ARDPRGYFDTTPLCGLGQAS 1981 GGCCTTCCAGGGCGTCCCGCGCCTGGCCGCCTGCGCCTTGGCGCCGCCTGTGCCTTGGCC 2040

VPLDRLARVPPRPVAASVSG . . <orfupl . . . 2041 CCGGGGACTCGGGCGGAGAGCGGGACATACGGAACCTCCACAGGCGGAGCCGGGAACGGG 2100

GGCCCCTGAGCCCGCCTCTCGCCCTGTATGCCTTGGAGGTGTCCGCCTCGGCCCTTGCCC APSEPPSRSM 2101 ACGAGGGCGAGGACGGGACGGAACGAAGGAGAGGACGGGACGGACAGCACGGACGGGACG 2160

TGCTCCCGCTCCTGCCCTGCCTTGCTTCCTCTCCTGCCCTGCCTGTCGTGCCTGCCCTGC 2161 GACGGAACGGftGTCGGGAACCGGGGGGGGTGACCGGAACCGGGCCGTCCTTGGCCCTCCC 222 0一 \

CTGCCTTGCCTCAGCCCTTGGCCCCCCCCACTGGCCTTGGCCCGGCAGGAACCGGGAGGG 2221 CCGTCCTCCCCGCCATCCGCCGTTCTCCCCCGTTCCCTCTCCCGTCCTCCAGCCAACACC 2280

GGCAGGAGGGGCGGTAGGCGGCAAGAGGGGGCAAGGGAGAGGGCAGGAGGTCGGTTGTGG -24.- 本紙張尺度適中國1¾家標缚（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝_ 、訂 589377 A7 B7 五、發明説明U3 ) 2281 GCCGCCCTTTCCAAGCGCTTGACACGGCACCGACAGCCGCCGCCGGGCGCCCGATGGGGA 2340

CGGCGGGAAAGGTTCGCGAACTGTGCCGTGGCTGTCGGCGGCGGCCCGCGGGCTACCCCT 2341 CCCGTGCCCGCCGGTGAGCGGCGGTGAGCGCCGGTACGGGACCCCACGCGCCGCCGCCCG 2400

GGGCACGGGCGGCCACTCGCCGCCACTCGCGGCCATGCCCTGGGGTGCGCGGCGGCGGGC 2401 GGCGCCCGCCAGGGCCCGCGCGGCCACCCCGGCCCGCCCCGGCCGGAGCGGCGATCCGGG 2460

CCGCGGGCGGTCCCGGGCGCGCCGGTGGGGCCGGGCGGGGCCGGCCTCGCCGCTAGGCCC 2461 CCGCTCGCTGCAAGAGGAACATCCACAGCCGCACAAGGAGCGCTCCGCACAGTGGGCACC 2520

GGCGAGCGACGTTCTCCTTGTAGGTGTCGGCGTGTTCCTCGCGAGGCGTGTCACCCGTGG 2521 ACGTCCGCCCCGTCCCCCACACCGTGGCCGGTCCCCACCGGACAGCACAGCACCGCACAG 2 58 0.

TGCAGGCGGGGCAGGGGGTGTGGCACCGGCCAGGGGTGGCCTGTCGTGTCGTGGCGTGTC 2581 CACCACATCGCACGGCACAGCACAGCACCACCGGCACGAGGAACCAAGGAAAGGAACCAC 2640

GTGGTGTAGCGTGCCGTGTCGTGTCGTGGTGGCCGTGCTCCTTGGTTCCTTTCCTTGGTG casl>

MTSVDCTAYGPELRALAA 2641 ACCACCATGACCTCAGTGGACTGCACCGCGTACGGCCCCGAGCTGCGCGCGCTCGCCGCC 2700

TGGTGGTACTGGAGTCACCTGACGTGGCGCATGCCGGGGCTCGACGCGCGCGAGCGGCGG 2 7 01 CGGCTGCCCCGGACCCCCCGGGCCGACCTGTACGCCTTCCTGGACGCCGCGCACACAGCC 2 760

RLPRTPRADLYAFLDAAHTA • * · · . . 2 761 GCCGCCTCGCTCCCCGGCGCCCTCGCCACCGCGCTGGACACCTTCAACGCCGAGGGCAGC 2820

A A S LPGALATALDTFNAEGS • * 套 . · . 2 821 GAGGACGGCCATCTGCTGCTGCGCGGCCTCCCGGTGGAGGCCGACGCCGACCTCCCCACC 2880

EDGHLLLRGLPVEADADLPT • · · . Ncol . . 2 881 ACCCCGAGCAGCACCCCGGCGCCCGAGGACCGCTCCCTGCTGACCATGGAGGCCATGCTC 2940 -

TPSSTPAPEDRSLLTME AML • · · JCpnl, . . 2 941 GGACTGGTGGGCCGCCGGCTCGGTCTGCACACGGGGTACCGGGAGCTGCGCTCGGGCACG 3000 -25.- 不ΪΡ4:家摞缚（（、NS ) Gk格（210; 297公釐） ^ (請先閱讀背面之注意事 1· ▼項再填· 装— :寫本頁) 經濟部中次標導扃貝,τ消费合竹社印製 經Μ部+决標準局炅X消资合作社印繁 589377 A7 _B7_____ 五、發明説明（>斗）

GLVGRRLGLHTGYRELRSGT 3001 GTCTACCACGACGTGTACCCGTCGCCCGGCGCGCACCACCTGTCCTCGGAGACCTCCGAG 3060

VYHDVYPSPGAHHLSSETSE 3061 ACGCTGCTGGAGTTCCACACGGAGATGGCCTACCACCGGCTCCAGCCGAACTACGTCATG 3120

T-LLEFHTEMAYHRLQPNYVM 3121 CTGGCCTGCTCCCGGGCCGACCACGAGCGCACGGCGGCCACACTCGTCGCCTCGGTCCGC 3180

LACSRADHERTAATLVASVR 3181 AAGGCGCTGCCCCTGCTGGACGAGAGGACCCGGGCCCGGCTCCTCGACCGGAGGATGCCC 3240

KALPLLDERTRARLLDRRMP 3241 TGCTGCGTGGATGTGGCCTTCCGCGGCGGGGTGGACGACCCGGGCGCCATCGCCCAGGTC 3300

CCVDVAFRGGVDDPGAIAQV 3301 AAACCGCTCTACGGGGACGCGGACGATCCCTTCCTCGGGTACGACCGCGAGCTGCTGGCG 3360

KPLYGDADDPFLGYDRELLA 3361 CCGGAGGACCCCGCGGACAAGGAGGCCGTCGCCGCCCTGTCCAAGGCGCTCGACGAGGTC 3420

PEDPADKEAVAALSKALDEV 3421 ACGGAGGCGGTGTATCTGGAGCCCGGCGATCTGCTGATCGTCGACAACTTCCGCACCACG 3480

TEAVYLEPGDLLIVDNFRTT 3481 CACGCGCGGACGCCGTTCTCGCCCCGCTGGGACGGGAAGGACCGCTGGCTGCACCGCGTC 3540

HARTPFSPRWDGKDRWLHRV 3541 TACATCCGCACCGACCGCAATGGACAGCTCTCCGGCGGCGAGCGCGCGGGCGACGTCGTC 3600

YIRTDRNGQLSGGERAGDVV A F T P R G * Sad .... 3601 GCCTTCACACCGCGCGGCTGAGCTCCCGGGTCCGACACCGCGCGGCTGAACCCACGGTCC 3660

CGGAAGTGTGGCGCGCCGACTCGAGGGCCCAGGCTGTGGCGCGCCGACTTGGGTGCCAGG 3661 GGGGCCCACGGTCCGGCACCGCGCGGCTGAGCCCCCGGGTCCGGCAGCGGGCGGCTGAAC 3720

CCCCGGGTGCCAGGCCGTGGCGCGCCGACTCGGGGGCCCAGGCCGTCGCCCGCCGACTTG -26.- ik張尺函( rNS ) Λ4規桔（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 一裝_ 訂 589377 A7 B7 經Μ部屮少«卑局員,τ消贽合作社印來 五、發明説明（）5 ) 3721 CCCCGCCCCGGGCCACCGCCCGACCGCCCCCGCGCACCGGACGCGCCCGCCTGTACGGCG 3780

GGGGCGGGGCCCGGTGGCGGGCTGGCGGGGGCGCGTGGCCTGCGCGGGCGGACATGCCGC ! 3781 GTCCCGCCCGGGCCCGTACACCTGAAGCGCCCGGCGGACCGCCGCCCCGCCGGGGGACGG 3840

CAGGGCGGGCCCGGGCATGTGGACTTCGCGGGCCGCCTGGCGGCGGGGCGGCCCCCTGCC "----------------> <---------------- . . 3841 ACAGAGCCGGGTGCGGGAGGACGTCCTCCCGCACGCGGCTCCCACCGTTCCGCACCGACC 3900

TGTCTCGGCCCACGCCCTCCTGCAGGAGGGCGTGGGCCGAGGGTGGCAAGGCGTGGCTGG 3901 GCACCCGACCGTGCCGCAGGCGCCACCGGCACCGCACCGCCCGCGCCGGCAGCCACCACA 3960

CGTGGGCTGGCACGGCGTCCGCGGTGGCCGTGGCGTGGCGGGCGCGGCCGTCGGTGGTGT 3961 GGCGCCACGCCGCCCGCACGGTGCCCGCGCTGCTCAGCCCCCGTCCACCGGGCTGTCCAG 4 02 0:

CCGCGGTGCGGCGGGCGTGCCACGGGCGCGACGAGTCGGGGGCAGGTGGCCCGACAGGTC

♦GGDVPSDL 4021 GTCGGCGGCGTCGCGCGGGGGCTACTTGAGGGCCAGCCGCCGGCTGGGGGGCCTGGGGCG 4080

LRRLAGGIFERDAASGGSGA 4081 CTCTACGGGGGTGTGAGGGCCCTAGTGGAGGTCGCTCCGTATGCCGTCGTCTAGCCGGTG 4140

LHGWVGPIVELSAYPLLDAV 4141 GGCGAAGAGCAGGAGCTGCCGCTTTGTGTGCAGGTCCCGCGGGCCGTCGTGGTGCCGGGC 4200

RKEDEVAFCVDLAGPLVVAR 4201 GCGGCACTGCCTCCGGTCGCGGCGGAGCTGCGAGGGGGGCCGGGGCCCACAGCGGGGGTG 4260

ATVSALAAEVSGGAGPTAGV ， . Ncol . 4261 TAGGCACAAGAGGGTCCACGCGTGGTACCACTCGTCTAGGCGCCGCGGCCCGGGCCTCTC 4320

DTNEWTRVMTLLDAAGPGSL 4321 CTTCTGGACGAGGGTCTTCGGCCACTCCATGAGGAGCGCCCACCGCTTTGGGTCGAGGGC 4380

FVQf；WFGTLYEERTA'FGLER 4381 CACCCGTGCCGCCCGGGTCTTCCTTGCGCTCCAGGGGGTGGGCCGCTTGTGGGCCGGGCG 4440

HARRAWFSRSTGWGAFVRGA * 27.- 本紙張尺度過川中國國家摞_ ( rNS ) Λ4規格（210X 297公釐） ^批农-- (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 589377 A7 __ B7五、發明説明UG ) 4441 GCGGAAGGCGGGGGCGAGGGGCCGCAGCCGCGACTCGCGGCGCCGGTCTGGCCTGTCGTC 4500

-AKRGREGADASLAAALGSLL 4501 CTGGTCCGACACGCCCGACGAGTGGCCGCGGGGCGTCTAGCCCCGCTAGGCCGCGTGGTA 4560

VLSHPSSVPAGCIPAIRRVM 4561 GGGGCCTACGCTGTGCCGGGTGACCATCCGCACCCGGCGCGGGTAGCTGGTCGGGCACTG 4620

GPHSVAWQYAHAAGMSWGTV 4621 GTCCCGGTCAAGGGCATGGGGGTCGAGGAGCCACTCGTCGGCCACGACGCGGCGCTGTAA 4680

LALERVGLEETLLRHQAAVN 4681 CAGGACGCCTCACTAGTCGCCTTTCGCCCTGGGGCTGCCCACCAACGGCCCGCTCGACCT 4740

DQPTILPFRSGSPHNGPSSS 4741 CTGGGGCAACGGCTTCTCAGGCCGCCACTGCTGCGTCATGGCGGCCCACAGGTCGCCGTC 4800

VGNGFLGATVVCYRRTDLPL 4801 GGGGCGTGGCTAGTCGGTCAGCATGGGCCACACCAGGGCCGGCTTCTTGCTGCCTGTCTC 4860

GAGILWDYGTHDRGFFSPCL 4861 GTGGTGCAAGCAGGGCAGCCGCAAGCCGCACGGCATGTACCGCATTGGCTAGGCCCGCAG 4920

VVNTGDANPTGYMAYGIRAD , . . . . <orfdwnl 4921 GGCGTCCTGGAGGGGCAGGTCGTTGCCGTCAAGCAGCTAGAGCTTATACGCCGTAAGGTG 4980

RLVEGDLLPLEDIEFIRCEM 4981 GCGACTGGAGGAACAAGCTAGGGGGGCCTGTTGTCCAGCCAGCACCGGCCTCTGAGTCTC 5040

★ L 5041 GGTCAACCCCCGCTAGAGCCACCGGGTGTCGAGGTCCGACGCGTCGACCTGTAGCACGCC 5100

WNPAIETAWLELSRLQVDHP 5101 CTAGTCGGGCGTCATGACCGTGACCTCGTCTATGAGGCCTAGCACGGCGAGGTGGTCGAA 5160

ILGSYQCQLLYEPDHREVLK 5161 GAGCTAGTACGCCAACTACAGCAGGCCCCACGGCTGGGTGAGGTCGGGGGCCAGCTGGTC 5220

EIMRNIDDPTGVWELGRDVL -28·- 度ϋ中國國家標碑（（、NS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中次標準局員J.消费合作社印繁

經潢部中次桴準局負,τ消費合作社印來 A7 ___ B7 五、發明説明（>7 ) 5221 CCAGAACATCAGGCTCGGCTAGCCTGGGCAGAGCGGCCAGCGCGCGTCGCGGAGCCACTT 5280

TKYDSGIPGTEGTARLAETF

Ncol ...... 5281 CGGGTACCCCGGCTTGGTCAAGAGCTTCTACTTCGGCGGCGGCGCCCTGCGGGTCACCAC 5340

GMP GFWNEFI FGGGRSAWHH 5341 CCGGAGCGGCCTCAGGGCCCTCTGGTCCTGCAGGAAGTAGTGGGGCTGGGCGAGCGGGGC 5400

AEGSDRSVLVDKMVGVREGR 5401 GGCGTCCCACGGCACCGGGCGGCGGAGCCGGAGGAGGGCCATCTACAGGTAGTCGGCCCG 5460

RLTGHGAAEAEERYIDMLRA 5461 CTGCTAGACCAGCAGCCACAAGTAGTCCTAGCCGTGGTGCGGGAGGGCCCGTGTCTTGGC 5520

VIQDDTNMLIPVVGERACFR 5521 CTTGCACAGGAGTGACTTCGACTTGCCGACCTTCTGCCCGCCCACCCCCGCGACCATCCC 5580

FTDESFSFPQFVPPHPRQYP 5581 GAACCCGCGCTACGGGTGGAGCGCCTACTGCGGCAAGAGCAGCTCCGGGGCCGGCATCGC 5640

KPAIGVERIVGNEDLGRGYR 5641 CGCGTGGCGGAGCATCCCCTTGAGGTCCAGGCCGTGGCCCTAGCAGGTGACGAGGGGCCT 5700

RVAEYPFELDPVPITWQEGS 5701 CACCCACTTGCAGAGCCAGCAGGTGCGGAAGAACTACTAGAGGGTCACGAGGAGCTTCTC 5760

HTFTETTWAKKIIEWHEEFL 5761 CCGTGCTAACGCGGCCAGGGCGAGGGGCCGCAGCCTGTCCCACGGCGGCTGGGGCATGTG 5820

ARNRRDREGADSLTGGVGYV 5821 GACGGGGTACTACAGCCGGGTCGCGAAGACCTTGGGCGCGCGCTAGGGCTGCTTCCGCGC 5880

QGMIDAWRKQFGRAIGVFAR 5881 CGGGGCCCAGTACACCAGCTCGTAGCGGTCTAGGAGCCGGTCGGCGTCGC0TAACACGTC 5940

GRTMHDLMALDEALRLPNHL 5941 GCCGTCCTGCAACCGGTAGACCGGCTGGGCCTACACGGCCCAGACGTACGGCTCCATCTC 6000 -29.- 本紙張尺度適用中國玛家標埤（（、NS ) Λ4規格（2I0X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 擎裝- 589377 A7 B7 五、發明説明（β 經潢部中决標準局吳J-消贽合作社印製

PLVNAMQGVRIHRTQMGLYL 6001 GGGGTCGTACTAGCCCAACAACCTCTGGAGCTTTGGGAGCCACACCTTCACCACGAGCCA 6060 GLMIPNNSVEFGETHFHHET 6061 CTTCCTGTCAGGGGTCATCGGCTCAAGCAGCCGGCGGACGCGGACGGCCCACTCGACGGC 6120 i'SLGWYGLEDAAQAQRTLQR 6121 CTCGTACAAGACCATCAAGACGCCTAACTGGGGGCGGTATGGGGCGACCTGGACGCGTAC 6180 LMNQYNQPNVGAMGRQVQAH . . . <orfdwn2 . . 6181 ACTGCCGACCGTTGGCAGATAGAAGAGAATGGACTTCACCCTGGCTCCTCCGGTTCGCGG 6240 TGACGGCTGGCAACCGTCTATCTTCTCTTACCTGAAGTGGGACCGAGGAGGCCAAGCGCC SGVTPLYFLISKM 6241 CGCCCTCCATTGACGTGCGCCGAAAGCGGCTCGACCGTCCCACTCCGCCCTTGAGTTCCG 6300 GCGGGAGGTAACTGCACGCGGCTTTCGCCGAGCTGGCAGGGTGAGGCGGGAACTCAAGGC 6301 TCTGACGCCGCGCCAGTCGGCGGGCCGTCCGCCGGGGTGCCCGCCGGGGTCCGCACCCGC 6360 AGACTGCGGCGCGGTCAGCCGCCCGGCAGGCGGCCCCACGGGCGGCCCCAGGCGTGGGCG 6361 CGGACGGCACGGCGCGCACCGCGCGCGCGGCGCTTCGGGGCACCGGGCTCGACGGGGTGC 6420 GCCTGCCGTGCCGCGCGTGGCGCGCGCGCCGCGAAGCCCCGTGGCCCGAGCTGCCCCACG 6421 TCAGCGGGACGTCCAACGGAAGGCAAGCCCCCGTACCCAGCCTGGTCAAGGCGCTCATCG 6480 AGTCGCCCTGCAGGTTGCCTTCCGTTCGGGGGCATGGGTCGGACCAGTTCCGCGAGTAGC orfdwn3> . . . . . Μ P G 6481 CCATTCCCTGAGGAGGTCCCGCCTTGACCACAGCAATCTCCGCGCTCCCGACCGTGCCCG 6540 GGTAAGGGACTCCTCCAGGGCGGAACTGGTGTCGTTAGAGGCGCGAGGGCTGGCACGGGC 6541 GCTCCGGACTCGAAGCACTGGACCGTGCCACCCTCATCCACCCCACCCTCTCCGGAAACA 6600 SGL*EALDRATLIHPTLSGNT - 6601 CCGCGGAACGGATCGTGCTGACCTCGGGG.TCCGGCAGCCGGGTCCGCGACACCGACGGCC 6660 AERIVLTSGSGSRVRDTDGR -30. 本紙張尺度適用+國國家摞埤（CNS ) Λ4規枱（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 「裝· 、11 589377 A7 B7 五、發明説明（β ) 6661 GGGAGTACCTGGACGCGAGCGCCGTCCTCGGGGTGACCCAGGTGGGCCACGGCCGGGCCG 6720

^EYLDASAVLGVTQVGHGRAE 6721 AGCTGGCCCGGGTCGCGGCCGAGCAGATGGCCCGGCTGGAGTACTTCCACACCTGGGGGA 6780

LARVAAEQMARLEYFHTWGT 6781 CGATCAGCAACGACCGGGCGGTGGAGCTGGCGGCACGGCTGGTGGGGCTGAGCCCGGAGC 6840

ISNDRAVELAARLVGLSPEP 6841 CGCTGACCCGCGTCTACTTCACCAGCGGCGGGGCCGAGGGCAACGAGATCGCCCTGCGGA 6900

LTRVYFTSGGAEGNEIALRM 6901 TGGCCCGGCTCTACCACCACCGGCGCGGGGAGTCCGCCCGTACCTGGATACTCTCCCGCC 6960

ARLYHHRRGESARTWILSRR 6961 GGTCGGCCTACCACGGCGTCGGATACGGCAGCGGCGGCGTCACCGGCTTCCCCGCCTACC 7020

SAYHGVGYGSGGVTGFPAYH 7021 ACCAGGGCTTCGGCCCCTCCCTCCCGGACGTCGACTTCCTGACCCCGCCGCAGCCCTACC 7080

QGFGPSLPDVDFLTPPQPYR 7 081 GCCGGGAGCTGTTCGCCGGTTCCGACGTCACCGACTTCTGCCTCGCCGAACTGCGCGAGA 7140

RELFAGSDVTDFCLAELRET • . . . Sau

7141 CCATCGACCGGATCGGCCCGGAGCGGATCGCGGCGATGATCGGCGAGCCGATC

IDRIGPERIAAMIGEPI (請先閱讀背面之注意事項再填寫本貢) •裝·

、1T 經滴部中-Φ(標率局吳X消費合作社印聚 -31. 本紙張尺度適用中國S家標碑（rNS ) Μ規桔（210X 297公釐） / 修ii: 補充 公告本 申請曰期 中 ^ ^ ^ Amended Pagei 案 號 類 別 以上各欄由本局填註） 專利申請案第87107252號 ROC Patent Appln. No.87107252 " 修正第1、2頁及補充第2-1頁一附件(五） LAand Supplemental Page 2-1 of the Chinese SDecification - Encl.(V) * (民國90年8月修正並送呈）-(Amended & Submitte(t4n August 27, 2001) 钃 專利説明書 589377 經濟部晳Μ时邊均資工消#合作社印製 -、=名稱 中 文 5S克拉瓦素(clavams)生合成作用DNA選殖及其利用 新型 英 文 Cloning of DNA for 5S clavams biosynthesis and the use thereof 姓 名 1. 白巴瑞 Barry Barton 2. 季強派 John Patrick Griffin 3. 莫若依 Roy Henry Mosher 國 籍 1.-2.為英國籍，3.為加拿大籍 一發明2 -、創作人 住、居所 1. 英—西塞斯沃辛市克來登路 SmithKline Beehcam Pharmaceuticals, Clarendon Road, Worthing, West Sussex, BN14 8QH, U.K. 2. 英國西塞斯沃辛市克來登路 SmithKline Beehcam Pharmaceuticals, Clarendon Road, Worthing, West Sussex, BN14 8QH? U.K. 1 3. 加拿大艾伯塔市坎帕‘二二二號 The Governors of the University of Alberta, 222 Campus Tower, 8625-112 Street, Alberta Canada T6G 2E1 姓 名 (名稱） 工蓍商ft笼斯克萊美占公司 SmithKline Beecham p.l.c. 2·艾伯塔大學理事 P The Governors of the University of Alberta 國籍 1·英國籍，2.加拿大籍 三、申請人 住、居所 (事務所） 1. 英國米德塞白福德城新水平院 New Horizons Court, Brentford, Middlesex TW8 9EP5 England 2. 力了 $岑艾伯峰市坎帕路二二二號萊森工業辦公室 c/o Industry Liaison Office, 222 Campus Tower, 8625-112 Street, Edmonton, Alberta, Canada T6G 2J9 fc 復尺度適用中 代表人 姓名 f 圃 1¾]女 ^ 1. 羅大為(David Roberts) 2. 葛迪克(Derek Gratz) 訂 線w 989768HFM(9SMIALB) 裝 5893T7 ή 0 —tl 申請曰期 案 號 類 別 (以上各欄由本局填註） 磬明 7 "新型專利説明書 中 文 發明 新型 名稱 英 文 姓 名 國 籍 發明 創作> 住、居所 4 帕客許 Ashish Sudhakar Paradkar 5·金蘇珊 Susan Jensen 6.安希亞 Cecilia Anders 4為印度籍，5.-6.為加拿大籍 4加拿大艾伯塔市坎帕路二二二號 The Governors of the University of Alberta，222 Campus Tower, 8625-112 Street, Alberta Canada T6G 2E1 5. 加拿大艾伯塔市坎帕4二二二號 The Governors of the University of Alberta, 222 Campus Tower, 8625-112 Street, Alberta Canada T6G 2E1 * 6. 加拿大艾伯塔市坎帕4二二二號 The Governors of the University of Alberta, 222 Campus Tower, 8625-112 Street, Alberta Canada T6G 2E1 裝 訂 姓 名 (名稱） 經濟部智慈4^工消t合作社印製 國 申請人 住、居所 (事務所） 代表人 姓 名 本紙張尺度^格(210X297公釐] 989768HFM(9SMIALB)

Claims (1)

1. 3 9 8 5 修Ji: ,ΜΆ 公告本 六、申請專利範圍 Α8 Β8 C8 D8 專利申請案第87107252號 ROC Patent Appln. No. 87107252 修正之申請專利範圍中文本-附件（一） Amended Claims in Chinese - EncL (D (民國93年2月 >7日送呈） (Submitted on February ”，2004 ) 1· 一種DNA’其專一於克拉弗鍵黴菌（s 10 中5S克拉凡素（ciavam)生合成作用，但並非5R克 拉凡素生合成所必要，具有orfup 1 (SEQ ID No· 4) 之序列： SEQ ID NO:4： ATGTCCCGCT CTCCGCCCGA GTCCCCGCCC GGTTCCGTGT CCGCCGCGGT TCCGCGTCCG 〇0 CCGGTCCGCG CCCTGCGGGA CCTTCCGGTC AGTGCCCAGG GGCTCGGCTG CCTGCCGACC 120 ACCGACTTCT ACGGACGCCC GGACCGCGCC CGGGCGACGG CCACCATCCG CGCCGCCGTC ieo GACGCCGGGG TCACCCTGCT G<SACACCGCC GACGXCCAGG GGCTCGGCGC CGGTGAGGAG 2^0 CTGCTCGGAC GGGCGGTCGC GGGCCGCCGG GACGAGGTGC TGAXCGCCAC CAAGTTCGGC 300 ATGGTGCGCT CGTCCGACGC- CGCCTCCCAG GGCTTGrGCG CCGAGCCG7C CTACGTCCGC 3 60 GCGGCCTGCG AACGGTCCCT GCGTCGXCTC GGCACCGACC GCATCGACCT GTACTACCAG 420 CACTG<SACGC ACCCGCCGGT GCCGATCGAG GAGACCGTGG GTGCGGTGGC CGAGCTGGTG 4S0 CGCGAGGGCA AGCTCCGCAG GCTCGGXCTC TCCGAGCCCT CCGCGGCCAC GCTGCGCCGG 540 GCGGACGCGG TGCACCCGGT GACGGCGGTG CAGAGCGAGT GGAGCCTGTG GTCGCGCGGG 600 ATCGAGGACG AGGTGGTGCC CGTCTGCCGG GAGCTGGGGA TCGGGATCGT CGCTTACGCC 660 CC 丁 C 丁 (5GGAC GGGGTTTTCT CACCGGCACC ATCCGCACCA CCGAC^ATC丁 GGGGGACGAG 720 GACTTCCGCC GGGGCCAGCC CCGGTTCAGC GCTCCGGCCC TCGCGCGCAA CCGCTCGTTG 780 CTGCACCGGC TGCGCCCGGT CGCCCACGGT CTGGGGCTGA CCCTGGCACA GCXCGCGCTC 840 GCCTGGCTGC ACCACCGGCG CGAGGACGTC GTCCCGATCC CGGGCACCGC r - --. GkACCCGGCC 900 CATCTCGCGG ACAATCTCGC CGCCGCCTCG ATCCGGCTGG ACGACCGGTC CCTCGCGGAG 960 (3TGACGGCCG CGATCTCCCA CCCGGTGXCC G3GGAGCGOT ACACCCCGGC ATTGCTCGCC 1020 ATGAJCGGCA AC 1032 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 25 2· —種DNA，其專一於克拉弗鏈黴菌中5S克拉凡素生 合成作用，但並非5R克拉凡素生合成所必要，具有 orfdwn 1 ( SEQ ID No. 5 )之序列： 32 87042B-接 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 589377 A8 B8 C8 D8 六、申請專利範圍 5EQ ID NO: 5: GTGGAATGCC GACGCCCGGA CXCTGTCCGT CTGCCGCTGG TCCAGCTCGC AATGTCGCGG GTCACGGGCT ATGGTGCGCC CTGCTGTCCG GCGOSCCGGG CGGGAGCTGG CTCTCCGGGC GTGGGGGCGA CGGGCCGTGG GTGGCCGATC GCGGGGTCCG CTGGACAGCC GC AT ATTCGA TCGGXT AC GC CGTTCTTCGG ACACCCGGCG CCGGCAACCA CGCAGCACCG GGTCGATGGG GGATCGCCCC GTCTGGCCGC TGTTCGCCGG GTTTCGCCAC CCGGCGCCGC CACCCGGO<SC TGCXGCCGGG tgctgccgta GGGGGTCGGC CGGTGGACGG GATCGACGAA CATGTACGGC CCGGGACCAC GXACTGCGTC CCCGTCGGGG GCTGCTCACC CGCGGCCCAC GATCTGCGC-G GGCGCTCAGC GTGC-CGCACC CCGCGAGGAG GGATCTGCTC CGGGGGGAGC CGCCCTGGAC TGCCTCGCTG CGCCGACCGG GGGC .'· CTGCCGTTGC ACGCCGAACG ACCGGGTACG GTCACCGCCG TCCCGCTTTC GAGGAGCTGG GC CTACCAGT GCGCCGGTGA GCCGACGCCG TCGCGTTCCT TACCTCACCG ACCATQSTGC GTCGAjGCCGG gtgtgtttcg GAGGTGATCC GAGTTCAJCG TGGACGGGGA CCGACGGGAC ACTGGCTGAX GACTCTTCGG CGCTGATCAC GGGTACGGGA GGGCCGTGTC GCAGCCCGCA GGGAGCGGGG TCTGGGCCCG GCTTCTGGGA GCACCTGGGA CGCTGGCCTC CCGTCGAGGA CGGGAGTGTG GGGGCGCGCT GGTCCTGCGG GAACGTGGTG COGTGCGGGG CAACGGOGTC TCCGCAGGAC ACTGGCCCTG GCATCCGGGG CAGCCTGGTC · GCGGAAGGCG CCGTGCCCAC GCAGGTCTTC GAACACGGAT CGTCACGGCG CGAGAAGCGC GC<3GCATCTC GCGGCGGCTG 60 120 190 210 300 360 420 480 540 600 660 720 780 Θ40 900 960 984 訂 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 3. —種DNA，其專一於克拉弗鏈黴菌中5S克拉凡素生 合成作用，但並非5R克拉凡素生合成所必要，具有 15 orfdwn 2 ( SEQ ID No· 6 )之序列： ♦ SZQ ID NO:6: GTGAAGTCCA TTCTCTTCTA TCXGCCAACG GTCGGCA^TC ATGCGCAGGT CCAGCGGGGT 60 ATG<X：GGGGG TCAATCCGCA GAACTACCAG A^CATGCXCC GGCAGCTCAC CCGGCAGGCG- 120 CAGGCGGCCG ACGA^.CTCGG CTACTGGGGA CTGTCCTTCA CCGAGCACCA CTTCCACACC 180 GAGGG丁丁TCG AjSGTCTCCAA CAACCCGATC ATGCTG<K^?C TCTACCTCGG CATGCAGACC 240 CG<5CAC\TCC GGGTCGGCCA GATGGCCAAC GTCCTGCCGC TGCACAATCC GCTGCGGCTG 300 GCCGAGGATC TGGCGATGCT CGACCidCATG ACCCGGCGCC GCGCCTTCGT CGGGATCGCG 260 CGCGGGTTCC AGAAGCGCTG GGCCGACATC ATGGGGCAGG TGTACGGGGT CGGCGGCACC 420 CTGTCCGACG CCGGGGAGCG GGACCGGCGC AATCGTGCCC TCTTCGAGGA GCACTGGGAG 4S0 ATCATCAAGA AGGCGTGGAC GACCGAGACG TTCACCCACT CCGGGGAGCA CTGGACGATC 540 -33 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210x297公釐） 589377 A8 B8 C8 D8 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製

   六、申請專利範圍 CCGGTGCCGG GAGAACGGCG CCCGTCTTCC GTGGTGCCGA CGGGAGGAGG ATGAAGGACG GGCGGCTTCA ACCGGCGAGA* TGGGTCGGCA CCGGA.GTAXC AGCC 丁 GGAGC ACCTGGAiSTT TCAXCCGCGA AGCCGTTCAG TCCTGATGAA CCGAGGCGGC TCCTGGTCTC TCTTCGAGAA CGGGTCCGAT CCCCGGACGA TGCTCCAGTG TGTGGGCCAC CCCCTACGAG GGTGGGCA1C CTTOvGTCAG CACCGACGAC CCGCGACTCC CTGGTTCGCC CGGCTCGGAC CATCAACCGC：· CCAGTACTCC CGAGATCGCC GCGGTGCGCC GCGCCCAAGC GACACGTTCC CAGATCCTCG ACCCTGCGGC GGCGAGGCCC CCCATG<^T TACAAGACCC ATGATCGAGA- GGGCTGATCC CCCAACTGGC GCTACGGCCG CCTACCAGCG GGTTCTGTGC CCCGGCTGAT GGGGCGAGCG ACCACTGGGC TCACCGAGGC TGGTCGACCG AGCTGGTGGA CGCACGATGT TC GGGCCTCGAC CCCCCACCCG CCGGGAGGGC GGACATCTAC GGTCGGGGTG GTCCCGCGGC GCTGCGCGCG GGGGCTGGAG GCGGCACGAT CCAGCTGCGC 600 GSQ 720 78 0 3^0 900 960 1020 1080 1140 1162 10 4· 一種DNA，其專一於克拉弗鏈徵菌中5:§克拉凡素生 合成作用，但並非5R克拉凡素生合成所必要，具有 orfdwn 3 ( SEQ ID No· 7 )之序列： SEQ ID NO;7; GTGCCCGGCT CCGGACTCGA AGCACTGGAC CGIGCCACCC GCAAACACCG. CGGAACGGAT CGTGCTGACC GACGGCCGGG AGTACCTGGA CGCGAjGCGCC COC^SCCGAGC TGGCCCGCGT CGCGGCCGAG TGGGGGACGA TCAGCAACGA CCGGGCGGXG CCGGAGCCGC TGACCCCCGT CTACTTCACC CTGCGGATGG CCCGGCTCTA CCACCACCGG TCCCGCCGGT CGGCCTACCA CGGCGTCGGA GCCTACCACC AGGGCTTCGG CCCCTCCCTC CCCTACCGCC GGGAGCTGTT CGCCGGTTCC CGCGAGACCA TCGACCGGAT CGCCCCGGAG TCGGGGTCCG CTCCTCGGGG CAGATGGCCC GAGCTGGCGG AGCGGCGGGG CGCGGGGAGT TACGGCAGCG CCGGACGTCC GACGTCACCG CGCATCGCGG TCATCCACCC GCAGC6GGGT TGACCCAGGT GGCTGGAGTA CACGGCTGGT CCGAGGGCAA CCGCCCGTAC GCGGCGTCAC ACTTCCTGAC ACTTCTGCCT CG^.TGATCGG CACCCTCTCC CCGCGACACC GGCCCACGGC CTTCCACACC GCCGCTGAGC CGAGATCGCC- CTGGATACTC CGOCTTCCCC CCCGCCGCAG CGCCGAACTG CGAGCCGATC *60 120 180 240 300 360 •J20 4Θ0 5-10 60C 660 -34 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐） 589377 A8 B8 C8 _D8_ 六、申請專利範圍 5. —種於合適之微生物中改良克拉弗酸產量之方法，其 包含刪去或破壞根據申請專利範圍第1至4項中任一 項之DNA並將之納入該微生物中，其中該微生物為 克拉弗鏈黴菌。 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 5 3 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格（210 X 297公釐）