ES2255149T3 - Microorganismos con produccion incrementada de acido clavulanico. - Google Patents
Microorganismos con produccion incrementada de acido clavulanico.Info
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Abstract
Nuevos genes bacterianos, microorganismos y procedimientos para la mejora de la fabricación de 5R clavamas, por ejemplo, ácido clavulánico.
Description
Microorganismos con producción incrementada de
ácido clavulánico.
La presente invención se refiere a nuevos genes
bacterianos y procedimientos para mejorar la fabricación de
clavams, por ejemplo, ácido clavulánico. La presente invención
también proporciona nuevos organismos capaces de producir cantidades
incrementadas de ácido clavulánico.
Ciertos microorganismos, en particular
Streptomyces sp. producen algunos antibióticos incluyendo el
ácido clavulánico y otros clavams, cefalosporinas, poliquétidos,
cefamicinas, tunicamicina, holomicina y penicilinas. Hay
considerable interés en poder manipular las cantidades absolutas y
relativas de estos antibióticos producidos por el microorganismo y,
por consiguiente, ha habido una gran cantidad de estudios que
investigan los mecanismos metabólicos y genéticos de las rutas
biosintéticas [Domain, A.L. (1990) "Biosynthesis and regulation of
beta-lactam antibiotics". En: 50 years of
Penicillin applications, history and trends]. Se conocen muchas de
las enzimas que llevan a cabo las diversas etapas en las rutas
metabólicas y los genes que codifican estas enzimas.
Los clavams se pueden dividir arbitrariamente en
dos grupos, dependiendo de su estereoquímica anular (5S- y
5R-clavams). Las rutas bioquímicas para la
biosíntesis de 5R- y 5S-clavams todavía no se han
elucidado completamente pero se ha sugerido que se obtienen a
partir de las mismas unidades iniciadoras (un compuesto de 3
carbonos no identificado todavía [Townsend, C.A. y Ho, M.F. (1985)
J. Am. Chem. Soc. 107 (4), 1066-1068 y Elson, S.W.
y Oliver, R.S. (1978) J. Antibiotics XXXI núm. 6, 568] y arginina
[Valentine, B.P. et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 15,
1210-1211] y que tienen en común algunos compuestos
intermedios [Iwata-Reuyl, D. y C.A. Townsend (1992)
J. Am. Chem. Soc. 114: 2762-63, y Janc, J.W. et
al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett.
3:2313-16].
Ejemplos de 5S-clavams incluyen
el clavam-2-carboxilato (C2C),
2-hidroximetilclavam (2HMC),
2-(3-alanil)clavam, valclavam y ácido
clavamínico [GB 1585661, Rohl, F. et al., Arch. Microbiol.
147:315-320, US 4.202.819]. Sin embargo, hay pocos
ejemplos de 5R-clavams y el más conocido, con mucho,
es el inhibidor de beta-lactamasa ácido
clavulánico, que se produce por la fermentación de Streptomyces
clavuligerus. El ácido clavulánico, en forma de clavulanato de
potasio, está combinafo con la beta-lactama
amoxicilina en el antibiótico AUGMENTINE (nombre comercial de
SmithKline Beecham). Debido a este interés comercial, las
investigaciones acerca del entendimiento de la biosíntesis de
clavam se han concentrado en la biosíntesis del
5R-clavam, ácido clavulánico, por S.
clavuligerus. Se han identificado y publicado cierto número de
enzimas y sus genes asociados con la biosíntesis del ácido
clavulánico. Ejemplos de tales publicaciones incluyen Hodgson, J.E.
et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K.A.
et al., Gene 147, 41-46 (1994), Paradkar,
A.S. et al., J. Bact. 177(5), 1307-14
(1995) y la solicitud de patente canadiense CA2108113. Los
resultados de Ward y Hodgson (1993) FEMS Microbiol. Lett.
110, p. 239-242 sugieren que al menos algunos
de los genes implicados en la biosíntesis del ácido clavulánico
están agrupados y caen cerca del grupo de genes de la cefamicina en
el genoma de S. clavuligerus. En cambio, no se sabe nada
acerca de la biosíntesis y la genética de los
5S-clavams, exceptuando el ácido clavamínico, que
es un precursor del ácido clavulánico producido por la acción de la
ácido clavamínico-sintasa en la ruta biosintética
en S. clavuligerus.
Experimentos de clonación génica han identificado
que S. clavuligerus contiene dos isoenzimas ácido
clavamínico-sintasas, cas1 y cas2 [Marsh, E.N.
et al., Biochemistry 31, 12648-657, (1992)],
ambas de las cuales pueden contribuir a la producción de ácido
clavulánico en ciertas condiciones nutritivas [Paradkar, A.S. et
al., J. Bact. 177(5), 1307-14 (1995)].
El gen cas2 reside dentro del grupo de genes del ácido clavulánico
(CA2108113 supra). Se desconoce la ubicación del gen cas1
pero Janc et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 p.
5399-04 especulan con la posibilidad de que resida
en una región dedicada a la producción de clavams. También se ha
detectado actividad de ácido clavamínico-sintasa en
otros microorganismos que producen ácido clavulánico, es decir,
S. jumonjinensis [Vidal, C.M., ES 550549, (1987)] y S.
karsurahamanus [Kitano, K., et al., JP
53-104796 (1978)] así como S. antibioticos,
un productor del 5S-clavam, valclavam [Baldwin, J.E.
et al., Tetrahedron Letts., 35(7),
2783-86 (1994)]. Este último artículo también dio a
conocer que S. antibioticos tiene actividad de ácido
proclavamínico-amidino-hidrolasa,
otra enzima conocida que está implicada en la biosíntesis del ácido
clavulánico. Se ha dado a conocer que todos los demás genes
identificados en S. clavuligerus como implicados en la
biosíntesis de clavams son requeridos para la biosíntesis del ácido
clavulánico [Hodgson J.E. et al., Gene 166,
49-55 (1995), Aidoo, K.A. et al., Gene 147,
41-46 (1994)] y todavía no se ha dado a conocer
ninguno que sea específico para la biosíntesis de
5S-clavams.
5S-clavams.
Ahora se han identificado ciertos genes que son
específicos para la biosíntesis de 5S-clavams, que
se ejemplifican por C2C y 2HMC en S. clavuligerus, y que no
son esenciales para la biosíntesis de 5R-clavam (por
ejemplo, ácido clavulánico).
Por "gen", como se utiliza aquí, también se
entiende cualquier región reguladora requerida para la función o
expresión de un gen. Los marcos de lectura abiertos de los genes que
son específicos la secuencia de nucleótidos del gen por adición y/o
sustitución de uno o más nucleótidos. Los genes defectuosos de
acuerdo con la invención pueden ser defectuosos en diferentes
medidas. Pueden ser defectuosos en el sentido de que su actividad
está completamente abolida o de que se conserve una proporción de
la actividad original.
Adecuadamente, se utilizan plásmidos que
contienen uno o más genes defectuosos para transformar un organismo
tal como S. clavuligerus, p.ej. la cepa ATCC 27064 (que
corresponde a S. clavuligerus NRRL 3585). Se pueden
encontrar métodos de transformación adecuados en fuentes relevantes
La presente invención también proporciona vectores que comprenden
los genes de la invención y hospedantes que contienen tales
vectores.
Sorprendentemente, la solicitante ha encontrado
que cuando es defectuoso al menos uno de los genes de acuerdo con
la invención, aumenta la cantidad de ácido clavulánico producida por
el organismo. Por consiguiente, la presente invención proporciona
procedimientos para aumentar la cantidad de ácido clavulánico
producida por un microorganismo adecuado. La invención proporciona
un procedimiento para mejorar la producción de ácido clavulánico en
una cepa de S. clavuligerus, en el que ADN que comprende un
marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S
clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam,
seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1,
orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms. 4-7) ha sido
alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado
dentro de la cepa de S. clavuligerus. La invención también
proporciona un procedimiento para producir ácido clavulánico con
poco o nada de 5S clavam en una cepa de S. clavuligerus en
el que ADN que comprende un marco de lectura abierto específico para
la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la
biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura
abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms.
4-7) ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de
otro modo y se ha transformado dentro de dicha cepa de
S. clavuligerus.
S. clavuligerus.
En un aspecto de la invención los genes
identificados pueden ser manipulados para producir un organismo
capaz de producir cantidades incrementadas de clavam, adecuadamente
ácido clavulánico. Por lo tanto, la invención también proporciona
un S. clavuligerus que comprende ADN que corresponde a un
marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S
clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam,
seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1,
orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms. 4-7) en donde dicho
marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso
de otro modo.
Adecuadamente, los genes de 5S clavam de la
presente invención se pueden obtener por métodos de clonación
convencionales (tales como PCR) basados en la secuencias
proporcionadas aquí. La función del gen puede ser interferida o
eliminada/suprimida por técnicas genéticas tales como alteración
génica [Aidoo, K.A. et al., (1994), Gene, 147,
41-46]., mutagénesis al azar, mutagénesis dirigida
al sitio y ARN antisentido.
Los genes de pueden hacer defectuosos de diversas
maneras. Por ejemplo, por inserción de un fragmento de ADN que
codifica un gen de resistencia a un antibiótico, que abole
completamente la actividad de ese gen. Alternativamente, se pueden
emplear otras estrategias para producir genes defectuosos,
incluyendo la inserción de ADN que no codifica el gen de
resistencia a un antibiótico, la deleción de parte del gen, la
deleción de todo el gen o la alteración de la secuencia de
nucleótidos del gen por adición y/o sustitución de uno o más
nucleótidos. Los genes defectuosos de acuerdo con la invención
pueden ser defectuosos en diferentes medidas. Pueden ser
defectuosos en una medida tal que su actividad esté completamente
abolida o tal que se conserve una proporción de la actividad
original.
original.
Adecuadamente, se utilizan plásmidos que
contienen uno o más genes defectuosos para transformar un organismo
tal como S. clavuligerus, por ejemplo la cepa ATCC 27064 (que
corresponde a S. clavuligerus NRRL 3585). Se pueden
encontrar métodos adecuados de transformación en fuentes relevantes,
incluyendo: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989),
Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring
Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Hopwood, D.A. et
al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning
Manual y Paradkar, A.S. y Jensen, S.E. (1995), J. Bacteriol.
177(5): 1307-1314.
Las cepas de la especie S. clavuligerus se
utilizan industrialmente para producir ácido clavulánico
(clavulanato de potasio). Dentro de las Farmacopeas Británica y de
los Estados Unidos, se controlan específicamente las cantidades del
5S-clavam tóxico,
clavam-2-carboxilato, para el
clavulanato de potasio (Farmacopea Británica 1993, Addendum 1994,
pág. 1362-3 y Monografías Oficiales de la Farmacopea
de los EE.UU. 1995, USP23NF18, págs. 384-5).
Por lo tanto, en un aspecto adicional de la
invención, se proporciona un organismo capaz de producir altas
cantidades de ácido clavulánico pero que se le ha hecho incapaz de
elaborar C2C, o capaz de producir altas cantidades de ácido
clavulánico pero que se le ha hecho capaz de elaborar sólo bajos
niveles de C2C. Adecuadamente, el organismo que produce ácido
clavulánico contiene uno o más genes de clavam defectuosos, y
preferiblemente es alguna de las cepas 56-1A,
56-3A, 57-2B, 57-1C,
60-1A, 60-2A, 60-3A,
61-1A, 61-2A, 61-3A
y 61-4A de S. clavuligerus, descritas más
adelante. Tales organismos son adecuados para la producción de ácido
clavulánico sin la producción del 5S-clavam, el
clavam-2-carboxilato o con
producción significativamente reducida de
clavam-2-car-
boxilato.
boxilato.
\vskip1.000000\baselineskip
En los ejemplos, todos los métodos son como los
de Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular
Cloning A Laboratory Manual (2ª edición), o Hopwood, D.A., et
al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning
Manual, y Paradkar, A.S. y Jensen, S.E. (1995) J. Bacteriol.
177(5): 1307-1314, salvo indicación en
con-
trario.
trario.
Para aislar los fragmentos de ADN cromosómico a
partir de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, que codifican
el gen de la isoenzima 1 clavaminato-sintasa
(cas1), se sintetizó una sonda oligonucleotídica RMO1, basada
en los nucleótidos 9-44 del gen de cas1,
previamente secuenciado (Marsh, E.N., Chang, M.D.T. y Townsend, C.A.
(1992) Biochemistry 31: 12648-12657). Se
construyeron oligonucleótidos utilizando métodos estándar, en un
instrumento "Applied Biosystems 391 DNA Synthesiser". La
secuencia de RMO1, un 36-mero, se sintetizó en el
sentido antiparalelo al publicado por Marsh et al. (1992,
íbid.). Se radiomarcó RMO1 con ^{32}P utilizando técnicas estándar
para marcar en los extremos oligonucleótidos de ADN (Sambrook et
al., 1989 íbid) y se utilizó para rastrear un banco cosmídico de
ADN genómico de Streptomyces clavuligerus por hibridación
Southern, como describen Stahl y Amann (en: Nucleic acid techniques
in bacterial systematics. Ed. E. Stackebrandt y M. Goodfellow.
Toronto; John Wiley and Sons, págs. 205-248, 1991).
El banco genómico de ADN de S. clavuligerus, preparado en
pLAFR3 cosmídico, era como el descrito por Doran, J.L. et
al. (1990), J. Bacteriol. 172 (9),
4909-4918.
Se incubaron manchas de colonias del banco
cosmídico de S. clavuligerus durante una noche con RMO1
radiomarcada, a 60ºC, en una solución consistente en 5 x SSC, 5 x
solución de Denhardt y 0,5% de SDS (1 x SDS: NaCl 0,15 M + Na_{3}
citrato 0,015 M; 1 x solución de Denhardt: 0,02% de BSA, 0,02% de
Ficoll y 0,02% de PVP). Después, las manchas se lavaron a 68ºC
durante 30 minutos en una solución de 0,5 x SSC + 0,1% de SDS. Se
aisló un clon cosmídico, 10D7, que se hibridó fuertemente a RMO1 y
dio señales de hibridación tras la digestión con las endonucleasas
de restricción SacI y EcoRI que eran consecuentes con
las señales de hibridación detectadas en experimentos similares con
digeridos de ADN genómico de S. clavuligerus.
Se generó un mapa de restricción parcial del
cósmido 10D7 utilizando las endonucleasas de restricción
SacI, NcoI y KpnI. Los experimentos de
hibridación Southern entre RMO1 y diversos digeridos de ADN de 10D7
indicaron que cas1 estaba localizado lo más probablemente en
un extremo de un subfragmento de ADN SacI-SacI de
7-kb. Este fragmento consistía en el marco de
lectura abierto de cas1 y aproximadamente 6 kb de ADN curso
arriba. Luego, el fragmento de 7-kb se subclonó a
partir de un digerido con SacI de 10D7 en el vector
fagomídico pBluescriptII SK+ (2,96 kb; Stratagene), generando así el
plásmido recombinante pCEC007.
Para facilitar el proceso de secuenciación, el
cromosoma curso arriba de cas1, un subfragmento
NcoI-NcoI de
3-kb del fragmento SacI-SacI de 7-kb se subclonó en pUC120 (3,2 kb; Vieirra y Messing, Methods Enzymol. 153, 3-11, 1987)) en ambas orientaciones, generando los plásmidos recombinantes pCEC026 y pCEC027. El subfragmento de 3-kb consistía en la porción que codifica el extremo amino-terminal de casI y aproximadamente 2,6 kb de ADN curso arriba.
3-kb del fragmento SacI-SacI de 7-kb se subclonó en pUC120 (3,2 kb; Vieirra y Messing, Methods Enzymol. 153, 3-11, 1987)) en ambas orientaciones, generando los plásmidos recombinantes pCEC026 y pCEC027. El subfragmento de 3-kb consistía en la porción que codifica el extremo amino-terminal de casI y aproximadamente 2,6 kb de ADN curso arriba.
Se crearon deleciones encajadas, solapantes,
tanto en pCEC026 como en pCEC027, utilizando digestión con
exonucleasa III y S1-nucleasa (Sambrook et
al., 1989 íbid) y se determinó la secuencia de ADN del fragmento
NcoI-NcoI de 3-kb en ambas hebras por
el método de terminación de la cadena didesoxi (Sanger, F., Nicklen,
S y Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:
5463-5467) utilizando un kit de terminador Taq
Dye-deoxy^{a} y un secuenciador Applied Biosystems
373A.
Para determinar la secuencia de ADN del cromosoma
inmediatamente curso abajo de cas1, se subclonó un fragmento
de ADN KpnI-EcoRI de 4,3-kb a partir
del clon cosmídico 10D7 en pBluescriptII SK+, generando pCEC018. A
partir de pCEC018, se clonó un subfragmento SacI-SacI
de 3,7-kb en pSL1180 (3,422 kb, Pharmacia); uno de
los extremos SacI de este fragmento solapaba parcialmente
con el codon de parada TGA de cas1 y el otro estaba
codificado por el vector. Se obtuvieron ambas orientaciones del
fragmento de 3,7-kb durante la subclonación y los
plásmidos recombinantes resultantes se designaron pCEC023 y
pCEC024. Se crearon deleciones encajadas, solapantes, en ambos
plásmidos y se determinó la secuencia de ADN del fragmento de
3,7-kb en ambas hebras. La secuencia nucleotídica
del cromosoma de S. clavuligerus generada en estos
experimentos, que incluye y flanquea a la secuencia de cas1, se
muestra en la Fig. 1.
\vskip1.000000\baselineskip
El análisis por ordenador de la secuencia de ADN
curso arriba de cas1 predijo la presencia de dos orfs
completos y un orf incompleto. El total de los tres orfs estaba
localizado en la hebra de ADN opuesta a cas1, así que se
orientaron en la dirección opuesta. El primer marco de lectura
abierto, orfup1, estaba localizado 579 pb curso arriba de
cas1 y codificaba un polipéptido de 344 aminoácidos (aa). El
segundo marco de lectura abierto, orfup2, estaba localizado
437 pb más allá del extremo 3' de orfup1 y codificaba un
polipéptido de 151 aa. Más allá de orfup2 está orfup3. El
codon de iniciación de orfup3 solapa con el codon de parada
de la traducción de orfup2, lo que sugiere que los dos orfs
están traduccionalmente acoplados. En el fragmento
NcoI-NcoI de 3-kb, no estaba
localizado ningún codon de parada de la traducción para
orfup3.
Un análisis similar de la secuencia de ADN curso
abajo de cas1 predijo la presencia de dos orfs completos y
un orf incompleto. Dos de los orfs estaban localizados en la hebra
de ADN opuesta a cas1, así que estaban orientados hacia
cas1. El tercer orf estaba localizado en la misma hebra que
cas1, así que estaba orientado en sentido opuesto a
cas1. El primer marco de lectura abierto curso abajo,
orfdwn1, estaba localizado 373 pb curso abajo de cas1
y codificaba un polipéptido de 328 aa. El segundo marco de lectura
abierto, orfdwn2, estaba localizado 55 pb curso arriba de
orfdwn1 y codificaba un polipéptido de 394 aa. A 315 pb curso
arriba de orfdwn2 y en la hebra opuesta estaba
orfdwn3. Como no se observó ningún codon de parada para
orfdwn3 en el fragmento de 3,7-kb, ése
codificaba un polipéptido incompleto de 219 aa.
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar los posibles papeles de los marcos
de lectura abiertos que flanquean a cas1 en la biosíntesis
del ácido clavulánico y los otros clavams producidos por S.
clavuligerus, se crearon por recolocación génica mutantes por
deleción o inactivación insercional. El método utilizado para la
rotura y la recolocación génica fue esencialmente como el descrito
por Paradkar y Jensen (1995 íbid).
Un fragmento NcoI-NcoI de 1,5 kb,
que lleva el gen de resistencia a apramicina (apr^{r}),
construido como describen Paradkar y Jensen (1995 íbid), se trató
con fragmento Klenow para generar extremos romos (Sambrook et
al., 1989 íbid) y se ligó a pCEC026 que se había digerido con
BsaBI y tratado igualmente con fragmento Klenow. pCEC026 posee un
sitio BsaBI localizado dentro de orfup1 a 636 pb del
codon de iniciación de la traducción. La mezcla de ligación se
utilizó para transformar células competentes de E. coli
GM2163 (disponible a partir de New England Biolabs, USA, Marinus,
M.G. et al. M.G.G. (1983) vol. 122, pág.
288-9) y conferirles resistencia a apramicina. A
partir de los transformantes resultantes, se aislaron dos clones
que contenían los plásmidos pCEC054 y pCEC055; por análisis de
restricción, se encontró que pCEC054 poseía el fragmento
apr^{r} insertado en la misma orientación que
orfup1, mientras que pCEC055 lo poseía en la orientación
opuesta.
Para introducir pCEC054 en S.
clavuligerus, se digirió ADN plasmídico con BamHI y
HindIII y se ligó al vector pIJ486 de Streptomyces de
alto número de copia (6,2 kb; Ward et al. (1986) Mol. Gen.
Genet. 203: 468-478). Luego se utilizó la mezcla de
ligación para transformar células competentes de E. coli
GM2163 con el fin de conferirles resistencia a apramicina. A partir
de los transformantes resultantes, se aisló un clon, que poseía el
plásmido transportador pCEC061. Luego se utilizó este plásmido para
transformar S. clavuligerus NRRL 3585. Los
transformantes resultantes se sometieron a de dos cursos sucesivos
de esporulación en medios no selectivos y después las réplicas se
cultivaron en placas en medios que contenían antibióticos, para
identificar transformantes resistentes a apramicina y sensibles a
tiostreptona. A partir de este método, se eligieron cuatro presuntos
mutantes (61-1A, -2A, -3A y -4A) para un análisis
adicional.
Para confirmar que estos presuntos mutantes
estaban rotos orfup1, se preparó ADN genómico a partir de aislados
61-1A y 61-2A, se digirieron con
SacI y se sometieron a análisis de transferencia Southern. Los
resultados de la transferencia Southern fueron consecuentes con la
ocurrencia de un sobrecruzamiento doble y demostraron que estos
mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y recolocación en
orfup1.
Los mutantes 61-1A, -2A, -3A y
-4A se cultivaron en medio Soya-Flour y sus líquidos
sobrenadantes de los cultivos se ensayaron por HPLC para determinar
la producción de ácido clavulánico y clavam. La composición del
medio Soya-Flour y el método para ensayar clavams
por HPLC fueron los que se han dado a conocer previamente (Paradkar
y Jensen, 1995 íbid) excepto que el tampón de pasada para el ensayo
HPLC consistía en NaH_{2}PO_{4} 0,1 M + metanol al 6%, pH 3,68
(ajustado con ácido acético glacial). El análisis HPLC indicó que
ninguno de los mutantes producía niveles detectables de
clavam-2-carboxilato o
2-hidroximetilclavam. Más aún, cuando los líquidos
sobrenadantes de los cultivos se bioensayaron contra Bacillus
sp. ATCC 27860, utilizando el método de Pruess y Kellett (1983,
J. Antibiot. 36: 208-212), ninguno de los
mutantes produjo niveles detectables de alanilclavam. En cambio,
los ensayos HPLC de los líquidos sobrenadantes de los cultivos
mostraron que los mutantes parecían producir niveles superiores de
ácido clavulánico cuando se comparaban con el tipo salvaje (Tabla
1).
Cepa | 70 Horas | 70 Horas | 93 Horas | 93 Horas |
CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | |
NRRL 3585 nº 1 | 87 | 915 | 166 | 1963 |
NRRL 3585 nº 2 | 66 | 790 | 159 | 1842 |
Cepa | 70 Horas | 70 Horas | 93 Horas | 93 Horas |
CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | |
61-1A | 272 | 2894 | 439 | 6113 |
61-2A | 199 | 2148 | 225 | 2928 |
61-3A | 54 | 692 | 221 | 2585 |
61-4A | 0 | 0 | 226 | 2422 |
Se emprendió un experimento de clonación para
crear una deleción génica de 654 nucleótidos entre los sitios
AatII de orfup1. Se generaron productos PCR utilizando
los cebadores oligonucleotídicos listados más adelante y el pCEC061
descrito anteriormente como molde. Se alteró la secuencia
nucleotídica original para incorporar un PstI en oligo 11 y
un sitio SphI en oligo 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Par oligonucleotídico 1 utilizado para generar
el producto 1 de la PCR
- Cebador 11
- 5'dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3'
- Cebador 12
- 5'dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Par oligonucleotídico 2 utilizado para generar
el producto 2 de la PCR
- Cebador 13
- 5'dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3'
- Cebador 14
- 5'dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo reacciones PCR estándar
utilizando el instrumento de ciclo térmico PTC-200
Peltier, de GRI (Felsted, Dunmow, Essex, CM6 3LD).
El producto 1 de la PCR se generó utilizando los
cebadores 11 y 12. Este producto mide aproximadamente 1 kb y
contiene el extremo carboxi de orfup1 a partir del segundo
sitio AatII y regiones curso abajo.
El producto 2 de la PCR se generó utilizando los
cebadores 13 y 14. Este producto mide aproximadamente 1,1 kb y
contiene el extremo amino de orfup1 a partir del primer sitio
AatII y regiones curso arriba.
El producto 2 de la PCR se ligó a
pCR-Script Amp SK(+) digerido con SrfI
siguiendo el manual de instrucciones (Stratagene Ltd., Cambridge
Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 4GF). La mezcla de ligación
se utilizó para transformar células supercompetentes Epicurian
E. coli XL1-Blue MRF' Kan (disponibles a
partir de Stratagene) confiriéndoles resistencia a ampicilina
(siguiendo las instrucciones del fabricante). Se aisló ADN
plasmídico a partir de los transformantes resultantes y el análisis
de restricción del ADN reveló que 7 clones contenían plásmido en el
que se había ligado el producto 2 de la PCR. Uno de estos plásmidos
se designó pDES1.
El producto 1 de PCR se digirió con PstI y
AatII y el ADN resultante se fraccionó por electroforesis en
gel de agarosa. El fragmento de 1 kb se escindió y eluyó del gel
utilizando el kit "Sephaglas band prep" (Pharmacia, St.
Albans, Herts, ALI3AW). Después, el fragmento aislado se ligó a
pDES1 digerido con AatII y PstI. La mezcla de
ligación se utilizó para transformar células competentes de E.
coli XL-1-Blue (disponibles a
partir de Stratagene) confiriéndoles resistencia a ampicilina
(siguiendo las instrucciones del fabricante). Se aisló ADN
plasmídico a partir de los transformantes resultantes y el análisis
de restricción reveló que 1 clon contenía plásmido en el que se
había ligado el producto 1 de la PCR. Este plásmido se designó
pDES2.
Para introducir pDES2 en S. clavuligerus,
el plásmido se modificó adicionalmente para que contuviera un origen
de replicación que pudiera funcionar en estrepomicetos. Para
conseguir esto, se digirió ADN plasmídico de pDES2 con EcoRI
y HindIII y se ligó en el vector pIJ486 de
Streptomyces de alto número de copia (6,2 kb; Ward et
al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468-478),
también digerido con EcoRI y HindIII. La mezcla de
ligación se utilizó para transformar células competentes de E.
coli (JM109) (Stratagene Ltd) confiriéndoles resistencia a
ampicilina. Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes
resultantes y el análisis de restricción reveló 6 clones que
poseían pDES2 que contenía pIJ486. Uno de estos plásmidos se designó
pDES3. El plásmido pDES3 se utilizó para transformar una cepa de
S. clavuligerus en la que ya se había roto el gen de
orfup1 por inserción del gen de resistencia a apramicina
(como se ha descrito antes). Se seleccionaron transformantes
resistentes a tiostreptona y después estos transformantes se
sometieron a 3 cursos de esporulación en medios no selectivos y se
rastrearon para determinar la pérdida de resistencia a apramicina. A
partir de este procedimiento, se identificaron 45 mutantes que
habían perdido la resistencia a apramicina. Después, éstos se
analizaron por HPLC, que confirmó que estas cepas, al igual que las
cepas 61-1A, 61-2A,
61-3A y 61-4A que rompen
orfup1, eran incapaces de producir
clavam-2-carboxilato y
2-hidroximetil-clavam cuando
fermentaban en las condiciones en las que normalmente se producían
estos clavams.
Se creó un mutante por deleción/recolocación en
orfdwn1 y orfdwn2 digiriendo primero pCEC018 (7,3 kb)
con NcoI y liberando un subfragmento de 1-kb
que contenía la mayor parte de orfdwn1 y una porción de
orfdwn2. El digerido se fraccionó por electroforesis en gel
de agarosa, y se escindió y eluyó del gel el fragmento de 6,3 kb.
Después, este fragmento se ligó a un fragmento de ADN
NcoI-NcoI que llevaba apr^{r} y se utilizó
para transformar E. coli XL1-Blue
confiriéndole resistencia a apramicina. Se obtuvo un clon a partir
de este experimento pero el análisis de restricción del plásmido
recombinante resultante reveló que se habían ligado dos copias del
fragmento con resistencia a ampicilina en el plásmido con la
deleción. Para eliminar la copia extra del
fragmento-apr^{r}, el plásmido se digirió con NcoI y
se autoligó. La mezcla de ligación se utilizó para transformar
E. coli GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina. A
partir de los transformantes, se aislaron dos clones que contenían
los plásmidos pCEC052 y pCEC053, ambos de los cuales poseían sólo
una copia del fragmento apr^{r} orientada inversamente con
respecto a orfdwn1 y 2, mientras que pCEC053 poseía
el fragmento-apr^{r} insertado en la misma orientación que
orfdwn1 y 2.
Se construyó un plásmido transportador de pCEC052
ligando pCEC052 digerido con BamHI con pIJ486 igualmente
digerido, y transformando E. coli GM2163, confiriéndole
resistencia a apramicina. A partir de este experimento, se aisló un
clon que contenía el plásmido transportador pCEC060. Este plásmido
se utilizó para transformar S. clavuligerus 3585 de tipo
salvaje, confiriéndole resistencia a apramicina y tiostreptona. Los
transformantes resultantes se sometieron a dos cursos de
esporulación en condiciones no selectivas, y después las réplicas
se cultivaron en medios que contenían antibióticos para identificar
colonias resistentes a apramicina y sensibles a tiostreptona. Se
eligieron tres presuntos mutantes (60-1A, -2A y -3A)
para un análisis adicional.
Para establecer la identidad de estos presuntos
mutantes, se aisló ADN genómico a partir de las cepas
60-1A y 60-2A y se digirió o bien
con SacI, o con BstEII, y se sometió a un análisis de transferencia
southern. Las bandas de hibridación generadas a partir de este
experimento eran consecuentes con que ambas cepas hubieran
experimentado un episodio de doble sobrecruzamiento, demostrando que
estos mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y recolocación en
orfdwn1/2.
Cuando estos se cultivaron en medio
Soya-Flour y sus líquidos sobrenadantes del cultivo
se ensayaron por HPLC, ninguno de los mutantes produjo niveles
detectables de clavam-2-carboxilato
o 2-hidroximetilclavam. Un bioensayo de los
líquidos sobrenadantes del cultivo indicó que los mutantes tampoco
lograban producir niveles detectables de alanilclavam. Al igual que
con los mutantes de orfup1, los mutantes de orfdwn1/2
son capaces de producir niveles de ácido clavulánico superiores a
los obtenidos con el tipo salvaje (Tabla 2).
Cepa | 70 Horas | 70 Horas | 93 Horas | 93 Horas |
CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | |
NRRL 3585 nº 1 | 87 | 915 | 166 | 1963 |
NRRL 3585 nº 2 | 66 | 790 | 159 | 1842 |
60-1A | 164 | 1872 | 260 | 2911 |
60-2A | 187 | 2013 | 108 | 1320 |
60-3A | 79 | 994 | 214 | 2161 |
Para romper orfdwn3, se digirió pCEC023
(consistente en un fragmento de 3,7-kb de ADN curso
abajo de cas1, subclonado en pSL1180) con NcoI y después se
autoligó. Después de transformar E. coli con la mezcla de
ligación, se aisló un clon que poseía el plásmido pCEC031. Este
plásmido retenía sólo el fragmento NcoI-EcoRI de 1,9
kb que codifica una porción de orfdwn2 y el orfdwn3 incompleto. Un
examen de la secuencia de ADN reveló que pCEC031 poseía un único
sitio BstEII en 158pb a partir del sitio de iniciación de la
traducción de orfdwn3. Por lo tanto, se digirió pCEC031 con BstII,
se trató con fragmento Klenow para crear extremos romos y después
se ligó a una caja de resistencia a apramicina con extremos romos.
La mezcla de ligación se utilizó para transformar E. coli
GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina y resistencia a
ampicilina. Se seleccionaron dos transformantes que contenían,
respectivamente, pCEC050 y pCEC051. El análisis de restricción
reveló que la caja de resistencia a apramicina estaba orientada en
la misma orientación que orfdwn3 en pCEC050 y en la orientación
opuesta en pCEC051. Después, ambos de estos plásmidos se ligaron
con HindIII y se ligaron a pIJ486 igualmente digerido. Luego, las
mezclas de ligación se utilizaron separadamente para transformar
E. coli GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina y
ampicilina. Se aislaron los plásmidos transportadores pCEC056
(pCEC050 + pIJ486) y pCEC057 (pCEC051 + pIJ486) a partir de los
transformantes resultantes. Después, se utilizaron ambos plásmidos
para transformar S. clavuligerus NRRL 3585.
Se seleccionó un transformante a partir de cada
experimento con transformantes y se sometió a dos cursos sucesivos
de esporulación en medios no selectivos y después las réplicas se
cultivaron en medios que contenían antibióticos para identificar
transformantes resistentes a apramicina y sensibles a tiostreptona.
Por este procedimiento, se aislaron dos presuntos mutantes a partir
de la progenie de cada transformante principal.
(56-1A y 56-3A para pCEC056, y
57-1C y 57-2B para pCEC057).
Para establecer la identidad de estos presuntos
mutantes, se aisló ADN genómico a partir de estas cepas y se
digirió con SacI o Acc65I y se sometió a análisis de transferencia
Southern. Las bandas de hibridación generadas a partir de este
experimento fueron consecuentes con que ambas cepas hubieran
experimentado un episodio de doble sobrecruzamiento, demostrando
que estos mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y
recolocación en orfdwn3.
Cuando se cultivaron estas cepas en medio
Soya-Flour y se ensayaron sus líquidos sobrenadantes
del cultivo por HPLC, los mutantes producidos reducían claramente
los niveles de clavam-2-carboxilato
o 2-hidroximetilclavam. Un bioensayo de los
líquidos sobrenadantes del cultivo indicó que los mutantes tampoco
lograban producir niveles detectables de alanilclavam. Al igual que
los mutantes de orfup1 y orfdwn1/2, los mutantes de orfdwn3 fueron
capaces de producir niveles de ácido clavulánico superiores a los
obtenidos con el tipo salvaje (Tabla 3).
Cepa | 71 Horas | 71 Horas | 93 Horas | 93 Horas |
CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | CA \mug/ml | CA \mug/mg de ADN | |
NRRL 3585 nº 1A | 180 | 1580 | 193 | 1790 |
NRRL 3585 nº 1B | 179 | 1640 | 266 | 2310 |
56-1A | 34 | 110 | 235 | 2160 |
56-3A | 225 | 2140 | 274 | 2740 |
57-1C | 253 | 2910 | 277 | 2920 |
57-2B | 242 | 2240 | 193 | 1860 |
\vskip1.000000\baselineskip
Este documento de solicitud describe las
siguientes secuencias nucleotídicas:
SEQ ID nº 1: | secuencia de ADN de la Figura 1 |
SEQ ID nº 2: | secuencia de orfup3 |
SEQ ID nº 3: | secuencia de orfup2 |
SEQ ID nº 4: | secuencia de orfup1 |
SEQ ID nº 5: | secuencia de orfdwn1 |
SEQ ID nº 6: | secuencia de orfdwn2 |
SEQ ID nº 7: | secuencia de orfdwn3 |
SEQ ID nº 8: | secuencia del cebador oligonucleotídico 11 |
SEQ ID nº 9: | secuencia del cebador oligonucleotídico 12 |
SEQ ID nº 10: | secuencia del cebador oligonucleotídico 13 |
SEQ ID nº 11: | secuencia del cebador oligonucleotídico 14 |
Figura
1
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SmithKline Beecham plc et al
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos compuestos
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: SmithKline Beecham
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Two, New Horizons Court, Great West Road
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Brentford
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: R.U.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): TW8 9EP
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SISTEMA LÓGICO (SOFTWARE): FastSEQ para Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Valentin, Jill B
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: P31731
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 0181-9752000
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 0181-9756294
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 7193 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 145 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 453 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1032 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 984 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1182 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 660 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGACGCTGC AGGAGGAAGT CCCGC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGGGGCGAGG ACGTCGTCCC GATCC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGCCCCTGG ACGTCGGCGG TGTCC
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGGTGCAT GCTCAGCAGG GAGCG
\hfill25
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 972 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 344 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 328 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 394 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 220 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 324 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (12)
1. S. clavuligerus que comprende ADN que
corresponde a un marco de lectura abierto específico para la
biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis
de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos
orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con SEQ ID núms.
4-7 respectivamente, donde dicho marco de lectura
abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo.
2. S. clavuligerus según la reivindicación
1, donde el 5S clavam es
clavam-2-carboxilato.
3. S. clavuligerus según la reivindicación
1, donde el 5S clavam es 2-hidroximetilclavam.
4. S. clavuligerus según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho marco de lectura abierto ha
sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por deleción y
posterior reeemplazamiento de algún gen.
5. S. clavuligerus según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho marco de lectura abierto ha
sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por alteración
de algún gen y posterior reemplazamiento de algún gen.
6. Un procedimiento para mejorar la producción de
ácido clavulánico en una cepa de S. clavuligerus, donde ADN
que comprende un marco de lectura abierto específico para la
biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis
de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1,
orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con SEQ ID núms. 4-7
respectivamente, ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro
modo y se ha transformado dentro de dicha cepa de S.
clavuligerus.
7. Un procedimiento para mejorar la producción de
ácido clavulánico con poco o nada de 5S clavam en una cepa de S.
clavuligerus, donde ADN que comprende un marco de lectura
abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es
esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los
marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con
SEQ ID núms. 4-7 respectivamente, ha sido alterado o
se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado dentro de
dicha cepa de S. clavuligerus.
8. Un procedimiento según la reivindicación 6 o
7, donde el 5S clavam es
clavam-2-carboxilato.
9. Un procedimiento según la reivindicación 6 o
7, donde el 5S clavam es 2-hidroximetilclavam.
10. Un procedimiento según la reivindicación 6 o
7, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha
hecho defectuoso de otro modo por deleción y posterior
reemplazamiento de algún gen.
11. Un procedimiento según la reivindicación 6 o
7, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha
hecho defectuoso de otro modo por alteración y posterior
reemplazamiento de algún gen.
12. Un procedimiento para la preparación de una
composición que comprende clavulanato de potasio y amoxicilina,
cuyo procedimiento comprende producir ácido clavulánico a partir de
una cepa de S. clavuligerus según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5 y seguidamente convertirlo en la sal de
potasio y combinar la sal de potasio con amoxicilina.
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2008
- 2008-10-01 JP JP2008256485A patent/JP5042186B2/ja not_active Expired - Lifetime
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