ES2255149T3 - Microorganismos con produccion incrementada de acido clavulanico. - Google Patents

Microorganismos con produccion incrementada de acido clavulanico.

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ES2255149T3 ES98906924T ES98906924T ES2255149T3 ES 2255149 T3 ES2255149 T3 ES 2255149T3 ES 98906924 T ES98906924 T ES 98906924T ES 98906924 T ES98906924 T ES 98906924T ES 2255149 T3 ES2255149 T3 ES 2255149T3
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Ashish Sudhakar Uni. of Alberta PARADKAR
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Abstract

Nuevos genes bacterianos, microorganismos y procedimientos para la mejora de la fabricación de 5R clavamas, por ejemplo, ácido clavulánico.

Description

Microorganismos con producción incrementada de ácido clavulánico.
La presente invención se refiere a nuevos genes bacterianos y procedimientos para mejorar la fabricación de clavams, por ejemplo, ácido clavulánico. La presente invención también proporciona nuevos organismos capaces de producir cantidades incrementadas de ácido clavulánico.
Ciertos microorganismos, en particular Streptomyces sp. producen algunos antibióticos incluyendo el ácido clavulánico y otros clavams, cefalosporinas, poliquétidos, cefamicinas, tunicamicina, holomicina y penicilinas. Hay considerable interés en poder manipular las cantidades absolutas y relativas de estos antibióticos producidos por el microorganismo y, por consiguiente, ha habido una gran cantidad de estudios que investigan los mecanismos metabólicos y genéticos de las rutas biosintéticas [Domain, A.L. (1990) "Biosynthesis and regulation of beta-lactam antibiotics". En: 50 years of Penicillin applications, history and trends]. Se conocen muchas de las enzimas que llevan a cabo las diversas etapas en las rutas metabólicas y los genes que codifican estas enzimas.
Los clavams se pueden dividir arbitrariamente en dos grupos, dependiendo de su estereoquímica anular (5S- y 5R-clavams). Las rutas bioquímicas para la biosíntesis de 5R- y 5S-clavams todavía no se han elucidado completamente pero se ha sugerido que se obtienen a partir de las mismas unidades iniciadoras (un compuesto de 3 carbonos no identificado todavía [Townsend, C.A. y Ho, M.F. (1985) J. Am. Chem. Soc. 107 (4), 1066-1068 y Elson, S.W. y Oliver, R.S. (1978) J. Antibiotics XXXI núm. 6, 568] y arginina [Valentine, B.P. et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 15, 1210-1211] y que tienen en común algunos compuestos intermedios [Iwata-Reuyl, D. y C.A. Townsend (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 2762-63, y Janc, J.W. et al. (1993) Bioorg. Med. Chem. Lett. 3:2313-16].
Ejemplos de 5S-clavams incluyen el clavam-2-carboxilato (C2C), 2-hidroximetilclavam (2HMC), 2-(3-alanil)clavam, valclavam y ácido clavamínico [GB 1585661, Rohl, F. et al., Arch. Microbiol. 147:315-320, US 4.202.819]. Sin embargo, hay pocos ejemplos de 5R-clavams y el más conocido, con mucho, es el inhibidor de beta-lactamasa ácido clavulánico, que se produce por la fermentación de Streptomyces clavuligerus. El ácido clavulánico, en forma de clavulanato de potasio, está combinafo con la beta-lactama amoxicilina en el antibiótico AUGMENTINE (nombre comercial de SmithKline Beecham). Debido a este interés comercial, las investigaciones acerca del entendimiento de la biosíntesis de clavam se han concentrado en la biosíntesis del 5R-clavam, ácido clavulánico, por S. clavuligerus. Se han identificado y publicado cierto número de enzimas y sus genes asociados con la biosíntesis del ácido clavulánico. Ejemplos de tales publicaciones incluyen Hodgson, J.E. et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K.A. et al., Gene 147, 41-46 (1994), Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5), 1307-14 (1995) y la solicitud de patente canadiense CA2108113. Los resultados de Ward y Hodgson (1993) FEMS Microbiol. Lett. 110, p. 239-242 sugieren que al menos algunos de los genes implicados en la biosíntesis del ácido clavulánico están agrupados y caen cerca del grupo de genes de la cefamicina en el genoma de S. clavuligerus. En cambio, no se sabe nada acerca de la biosíntesis y la genética de los 5S-clavams, exceptuando el ácido clavamínico, que es un precursor del ácido clavulánico producido por la acción de la ácido clavamínico-sintasa en la ruta biosintética en S. clavuligerus.
Experimentos de clonación génica han identificado que S. clavuligerus contiene dos isoenzimas ácido clavamínico-sintasas, cas1 y cas2 [Marsh, E.N. et al., Biochemistry 31, 12648-657, (1992)], ambas de las cuales pueden contribuir a la producción de ácido clavulánico en ciertas condiciones nutritivas [Paradkar, A.S. et al., J. Bact. 177(5), 1307-14 (1995)]. El gen cas2 reside dentro del grupo de genes del ácido clavulánico (CA2108113 supra). Se desconoce la ubicación del gen cas1 pero Janc et al. (1995) J. Biol. Chem. 270 p. 5399-04 especulan con la posibilidad de que resida en una región dedicada a la producción de clavams. También se ha detectado actividad de ácido clavamínico-sintasa en otros microorganismos que producen ácido clavulánico, es decir, S. jumonjinensis [Vidal, C.M., ES 550549, (1987)] y S. karsurahamanus [Kitano, K., et al., JP 53-104796 (1978)] así como S. antibioticos, un productor del 5S-clavam, valclavam [Baldwin, J.E. et al., Tetrahedron Letts., 35(7), 2783-86 (1994)]. Este último artículo también dio a conocer que S. antibioticos tiene actividad de ácido proclavamínico-amidino-hidrolasa, otra enzima conocida que está implicada en la biosíntesis del ácido clavulánico. Se ha dado a conocer que todos los demás genes identificados en S. clavuligerus como implicados en la biosíntesis de clavams son requeridos para la biosíntesis del ácido clavulánico [Hodgson J.E. et al., Gene 166, 49-55 (1995), Aidoo, K.A. et al., Gene 147, 41-46 (1994)] y todavía no se ha dado a conocer ninguno que sea específico para la biosíntesis de
5S-clavams.
Ahora se han identificado ciertos genes que son específicos para la biosíntesis de 5S-clavams, que se ejemplifican por C2C y 2HMC en S. clavuligerus, y que no son esenciales para la biosíntesis de 5R-clavam (por ejemplo, ácido clavulánico).
Por "gen", como se utiliza aquí, también se entiende cualquier región reguladora requerida para la función o expresión de un gen. Los marcos de lectura abiertos de los genes que son específicos la secuencia de nucleótidos del gen por adición y/o sustitución de uno o más nucleótidos. Los genes defectuosos de acuerdo con la invención pueden ser defectuosos en diferentes medidas. Pueden ser defectuosos en el sentido de que su actividad está completamente abolida o de que se conserve una proporción de la actividad original.
Adecuadamente, se utilizan plásmidos que contienen uno o más genes defectuosos para transformar un organismo tal como S. clavuligerus, p.ej. la cepa ATCC 27064 (que corresponde a S. clavuligerus NRRL 3585). Se pueden encontrar métodos de transformación adecuados en fuentes relevantes La presente invención también proporciona vectores que comprenden los genes de la invención y hospedantes que contienen tales vectores.
Sorprendentemente, la solicitante ha encontrado que cuando es defectuoso al menos uno de los genes de acuerdo con la invención, aumenta la cantidad de ácido clavulánico producida por el organismo. Por consiguiente, la presente invención proporciona procedimientos para aumentar la cantidad de ácido clavulánico producida por un microorganismo adecuado. La invención proporciona un procedimiento para mejorar la producción de ácido clavulánico en una cepa de S. clavuligerus, en el que ADN que comprende un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms. 4-7) ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado dentro de la cepa de S. clavuligerus. La invención también proporciona un procedimiento para producir ácido clavulánico con poco o nada de 5S clavam en una cepa de S. clavuligerus en el que ADN que comprende un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms. 4-7) ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado dentro de dicha cepa de
S. clavuligerus.
En un aspecto de la invención los genes identificados pueden ser manipulados para producir un organismo capaz de producir cantidades incrementadas de clavam, adecuadamente ácido clavulánico. Por lo tanto, la invención también proporciona un S. clavuligerus que comprende ADN que corresponde a un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 (SEQ ID núms. 4-7) en donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo.
Adecuadamente, los genes de 5S clavam de la presente invención se pueden obtener por métodos de clonación convencionales (tales como PCR) basados en la secuencias proporcionadas aquí. La función del gen puede ser interferida o eliminada/suprimida por técnicas genéticas tales como alteración génica [Aidoo, K.A. et al., (1994), Gene, 147, 41-46]., mutagénesis al azar, mutagénesis dirigida al sitio y ARN antisentido.
Los genes de pueden hacer defectuosos de diversas maneras. Por ejemplo, por inserción de un fragmento de ADN que codifica un gen de resistencia a un antibiótico, que abole completamente la actividad de ese gen. Alternativamente, se pueden emplear otras estrategias para producir genes defectuosos, incluyendo la inserción de ADN que no codifica el gen de resistencia a un antibiótico, la deleción de parte del gen, la deleción de todo el gen o la alteración de la secuencia de nucleótidos del gen por adición y/o sustitución de uno o más nucleótidos. Los genes defectuosos de acuerdo con la invención pueden ser defectuosos en diferentes medidas. Pueden ser defectuosos en una medida tal que su actividad esté completamente abolida o tal que se conserve una proporción de la actividad
original.
Adecuadamente, se utilizan plásmidos que contienen uno o más genes defectuosos para transformar un organismo tal como S. clavuligerus, por ejemplo la cepa ATCC 27064 (que corresponde a S. clavuligerus NRRL 3585). Se pueden encontrar métodos adecuados de transformación en fuentes relevantes, incluyendo: Sambrook, J., Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory manual, 2ª ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.; Hopwood, D.A. et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual y Paradkar, A.S. y Jensen, S.E. (1995), J. Bacteriol. 177(5): 1307-1314.
Las cepas de la especie S. clavuligerus se utilizan industrialmente para producir ácido clavulánico (clavulanato de potasio). Dentro de las Farmacopeas Británica y de los Estados Unidos, se controlan específicamente las cantidades del 5S-clavam tóxico, clavam-2-carboxilato, para el clavulanato de potasio (Farmacopea Británica 1993, Addendum 1994, pág. 1362-3 y Monografías Oficiales de la Farmacopea de los EE.UU. 1995, USP23NF18, págs. 384-5).
Por lo tanto, en un aspecto adicional de la invención, se proporciona un organismo capaz de producir altas cantidades de ácido clavulánico pero que se le ha hecho incapaz de elaborar C2C, o capaz de producir altas cantidades de ácido clavulánico pero que se le ha hecho capaz de elaborar sólo bajos niveles de C2C. Adecuadamente, el organismo que produce ácido clavulánico contiene uno o más genes de clavam defectuosos, y preferiblemente es alguna de las cepas 56-1A, 56-3A, 57-2B, 57-1C, 60-1A, 60-2A, 60-3A, 61-1A, 61-2A, 61-3A y 61-4A de S. clavuligerus, descritas más adelante. Tales organismos son adecuados para la producción de ácido clavulánico sin la producción del 5S-clavam, el clavam-2-carboxilato o con producción significativamente reducida de clavam-2-car-
boxilato.
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Ejemplos
En los ejemplos, todos los métodos son como los de Sambrook, J. Fritsch, E.F. y Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning A Laboratory Manual (2ª edición), o Hopwood, D.A., et al. (1985), Genetic Manipulation of Streptomyces. A Cloning Manual, y Paradkar, A.S. y Jensen, S.E. (1995) J. Bacteriol. 177(5): 1307-1314, salvo indicación en con-
trario.
I. Secuenciación del ADN del cromosoma de Streptomyces clavuligerus curso arriba y curso abajo del gen de la clavaminato-sintasa, casI A. Aislamiento de casI
Para aislar los fragmentos de ADN cromosómico a partir de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585, que codifican el gen de la isoenzima 1 clavaminato-sintasa (cas1), se sintetizó una sonda oligonucleotídica RMO1, basada en los nucleótidos 9-44 del gen de cas1, previamente secuenciado (Marsh, E.N., Chang, M.D.T. y Townsend, C.A. (1992) Biochemistry 31: 12648-12657). Se construyeron oligonucleótidos utilizando métodos estándar, en un instrumento "Applied Biosystems 391 DNA Synthesiser". La secuencia de RMO1, un 36-mero, se sintetizó en el sentido antiparalelo al publicado por Marsh et al. (1992, íbid.). Se radiomarcó RMO1 con ^{32}P utilizando técnicas estándar para marcar en los extremos oligonucleótidos de ADN (Sambrook et al., 1989 íbid) y se utilizó para rastrear un banco cosmídico de ADN genómico de Streptomyces clavuligerus por hibridación Southern, como describen Stahl y Amann (en: Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Ed. E. Stackebrandt y M. Goodfellow. Toronto; John Wiley and Sons, págs. 205-248, 1991). El banco genómico de ADN de S. clavuligerus, preparado en pLAFR3 cosmídico, era como el descrito por Doran, J.L. et al. (1990), J. Bacteriol. 172 (9), 4909-4918.
Se incubaron manchas de colonias del banco cosmídico de S. clavuligerus durante una noche con RMO1 radiomarcada, a 60ºC, en una solución consistente en 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt y 0,5% de SDS (1 x SDS: NaCl 0,15 M + Na_{3} citrato 0,015 M; 1 x solución de Denhardt: 0,02% de BSA, 0,02% de Ficoll y 0,02% de PVP). Después, las manchas se lavaron a 68ºC durante 30 minutos en una solución de 0,5 x SSC + 0,1% de SDS. Se aisló un clon cosmídico, 10D7, que se hibridó fuertemente a RMO1 y dio señales de hibridación tras la digestión con las endonucleasas de restricción SacI y EcoRI que eran consecuentes con las señales de hibridación detectadas en experimentos similares con digeridos de ADN genómico de S. clavuligerus.
B. Secuenciación del ADN del cromosoma de S. clavuligerus que flanquea a cas1
Se generó un mapa de restricción parcial del cósmido 10D7 utilizando las endonucleasas de restricción SacI, NcoI y KpnI. Los experimentos de hibridación Southern entre RMO1 y diversos digeridos de ADN de 10D7 indicaron que cas1 estaba localizado lo más probablemente en un extremo de un subfragmento de ADN SacI-SacI de 7-kb. Este fragmento consistía en el marco de lectura abierto de cas1 y aproximadamente 6 kb de ADN curso arriba. Luego, el fragmento de 7-kb se subclonó a partir de un digerido con SacI de 10D7 en el vector fagomídico pBluescriptII SK+ (2,96 kb; Stratagene), generando así el plásmido recombinante pCEC007.
Para facilitar el proceso de secuenciación, el cromosoma curso arriba de cas1, un subfragmento NcoI-NcoI de
3-kb del fragmento SacI-SacI de 7-kb se subclonó en pUC120 (3,2 kb; Vieirra y Messing, Methods Enzymol. 153, 3-11, 1987)) en ambas orientaciones, generando los plásmidos recombinantes pCEC026 y pCEC027. El subfragmento de 3-kb consistía en la porción que codifica el extremo amino-terminal de casI y aproximadamente 2,6 kb de ADN curso arriba.
Se crearon deleciones encajadas, solapantes, tanto en pCEC026 como en pCEC027, utilizando digestión con exonucleasa III y S1-nucleasa (Sambrook et al., 1989 íbid) y se determinó la secuencia de ADN del fragmento NcoI-NcoI de 3-kb en ambas hebras por el método de terminación de la cadena didesoxi (Sanger, F., Nicklen, S y Coulson, A.R. (1977), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74: 5463-5467) utilizando un kit de terminador Taq Dye-deoxy^{a} y un secuenciador Applied Biosystems 373A.
Para determinar la secuencia de ADN del cromosoma inmediatamente curso abajo de cas1, se subclonó un fragmento de ADN KpnI-EcoRI de 4,3-kb a partir del clon cosmídico 10D7 en pBluescriptII SK+, generando pCEC018. A partir de pCEC018, se clonó un subfragmento SacI-SacI de 3,7-kb en pSL1180 (3,422 kb, Pharmacia); uno de los extremos SacI de este fragmento solapaba parcialmente con el codon de parada TGA de cas1 y el otro estaba codificado por el vector. Se obtuvieron ambas orientaciones del fragmento de 3,7-kb durante la subclonación y los plásmidos recombinantes resultantes se designaron pCEC023 y pCEC024. Se crearon deleciones encajadas, solapantes, en ambos plásmidos y se determinó la secuencia de ADN del fragmento de 3,7-kb en ambas hebras. La secuencia nucleotídica del cromosoma de S. clavuligerus generada en estos experimentos, que incluye y flanquea a la secuencia de cas1, se muestra en la Fig. 1.
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II. Análisis funcional de los marcos de lectura abiertos que flanquean a cas1
El análisis por ordenador de la secuencia de ADN curso arriba de cas1 predijo la presencia de dos orfs completos y un orf incompleto. El total de los tres orfs estaba localizado en la hebra de ADN opuesta a cas1, así que se orientaron en la dirección opuesta. El primer marco de lectura abierto, orfup1, estaba localizado 579 pb curso arriba de cas1 y codificaba un polipéptido de 344 aminoácidos (aa). El segundo marco de lectura abierto, orfup2, estaba localizado 437 pb más allá del extremo 3' de orfup1 y codificaba un polipéptido de 151 aa. Más allá de orfup2 está orfup3. El codon de iniciación de orfup3 solapa con el codon de parada de la traducción de orfup2, lo que sugiere que los dos orfs están traduccionalmente acoplados. En el fragmento NcoI-NcoI de 3-kb, no estaba localizado ningún codon de parada de la traducción para orfup3.
Un análisis similar de la secuencia de ADN curso abajo de cas1 predijo la presencia de dos orfs completos y un orf incompleto. Dos de los orfs estaban localizados en la hebra de ADN opuesta a cas1, así que estaban orientados hacia cas1. El tercer orf estaba localizado en la misma hebra que cas1, así que estaba orientado en sentido opuesto a cas1. El primer marco de lectura abierto curso abajo, orfdwn1, estaba localizado 373 pb curso abajo de cas1 y codificaba un polipéptido de 328 aa. El segundo marco de lectura abierto, orfdwn2, estaba localizado 55 pb curso arriba de orfdwn1 y codificaba un polipéptido de 394 aa. A 315 pb curso arriba de orfdwn2 y en la hebra opuesta estaba orfdwn3. Como no se observó ningún codon de parada para orfdwn3 en el fragmento de 3,7-kb, ése codificaba un polipéptido incompleto de 219 aa.
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Rotura génica de los marcos de lectura abiertos orfup y orfdwn
Para evaluar los posibles papeles de los marcos de lectura abiertos que flanquean a cas1 en la biosíntesis del ácido clavulánico y los otros clavams producidos por S. clavuligerus, se crearon por recolocación génica mutantes por deleción o inactivación insercional. El método utilizado para la rotura y la recolocación génica fue esencialmente como el descrito por Paradkar y Jensen (1995 íbid).
A.orfup1
Un fragmento NcoI-NcoI de 1,5 kb, que lleva el gen de resistencia a apramicina (apr^{r}), construido como describen Paradkar y Jensen (1995 íbid), se trató con fragmento Klenow para generar extremos romos (Sambrook et al., 1989 íbid) y se ligó a pCEC026 que se había digerido con BsaBI y tratado igualmente con fragmento Klenow. pCEC026 posee un sitio BsaBI localizado dentro de orfup1 a 636 pb del codon de iniciación de la traducción. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli GM2163 (disponible a partir de New England Biolabs, USA, Marinus, M.G. et al. M.G.G. (1983) vol. 122, pág. 288-9) y conferirles resistencia a apramicina. A partir de los transformantes resultantes, se aislaron dos clones que contenían los plásmidos pCEC054 y pCEC055; por análisis de restricción, se encontró que pCEC054 poseía el fragmento apr^{r} insertado en la misma orientación que orfup1, mientras que pCEC055 lo poseía en la orientación opuesta.
Para introducir pCEC054 en S. clavuligerus, se digirió ADN plasmídico con BamHI y HindIII y se ligó al vector pIJ486 de Streptomyces de alto número de copia (6,2 kb; Ward et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468-478). Luego se utilizó la mezcla de ligación para transformar células competentes de E. coli GM2163 con el fin de conferirles resistencia a apramicina. A partir de los transformantes resultantes, se aisló un clon, que poseía el plásmido transportador pCEC061. Luego se utilizó este plásmido para transformar S. clavuligerus NRRL 3585. Los transformantes resultantes se sometieron a de dos cursos sucesivos de esporulación en medios no selectivos y después las réplicas se cultivaron en placas en medios que contenían antibióticos, para identificar transformantes resistentes a apramicina y sensibles a tiostreptona. A partir de este método, se eligieron cuatro presuntos mutantes (61-1A, -2A, -3A y -4A) para un análisis adicional.
Para confirmar que estos presuntos mutantes estaban rotos orfup1, se preparó ADN genómico a partir de aislados 61-1A y 61-2A, se digirieron con SacI y se sometieron a análisis de transferencia Southern. Los resultados de la transferencia Southern fueron consecuentes con la ocurrencia de un sobrecruzamiento doble y demostraron que estos mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y recolocación en orfup1.
Los mutantes 61-1A, -2A, -3A y -4A se cultivaron en medio Soya-Flour y sus líquidos sobrenadantes de los cultivos se ensayaron por HPLC para determinar la producción de ácido clavulánico y clavam. La composición del medio Soya-Flour y el método para ensayar clavams por HPLC fueron los que se han dado a conocer previamente (Paradkar y Jensen, 1995 íbid) excepto que el tampón de pasada para el ensayo HPLC consistía en NaH_{2}PO_{4} 0,1 M + metanol al 6%, pH 3,68 (ajustado con ácido acético glacial). El análisis HPLC indicó que ninguno de los mutantes producía niveles detectables de clavam-2-carboxilato o 2-hidroximetilclavam. Más aún, cuando los líquidos sobrenadantes de los cultivos se bioensayaron contra Bacillus sp. ATCC 27860, utilizando el método de Pruess y Kellett (1983, J. Antibiot. 36: 208-212), ninguno de los mutantes produjo niveles detectables de alanilclavam. En cambio, los ensayos HPLC de los líquidos sobrenadantes de los cultivos mostraron que los mutantes parecían producir niveles superiores de ácido clavulánico cuando se comparaban con el tipo salvaje (Tabla 1).
TABLA 1 Título de ácido clavulánico (CA) de mutantes de orfup1 en ensayos en matraces con sacudimiento
Cepa 70 Horas 70 Horas 93 Horas 93 Horas
CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN
NRRL 3585 nº 1 87 915 166 1963
NRRL 3585 nº 2 66 790 159 1842
TABLA 1 (continuación)
Cepa 70 Horas 70 Horas 93 Horas 93 Horas
CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN
61-1A 272 2894 439 6113
61-2A 199 2148 225 2928
61-3A 54 692 221 2585
61-4A 0 0 226 2422
Deleción en orfup1
Se emprendió un experimento de clonación para crear una deleción génica de 654 nucleótidos entre los sitios AatII de orfup1. Se generaron productos PCR utilizando los cebadores oligonucleotídicos listados más adelante y el pCEC061 descrito anteriormente como molde. Se alteró la secuencia nucleotídica original para incorporar un PstI en oligo 11 y un sitio SphI en oligo 14.
\vskip1.000000\baselineskip
Par oligonucleotídico 1 utilizado para generar el producto 1 de la PCR
Cebador 11
5'dCTGACGCTGCAGGAGGAAGTCCCGC 3'
Cebador 12
5'dCGGGGCGAGGACGTCGTCCCGATCC 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Par oligonucleotídico 2 utilizado para generar el producto 2 de la PCR
Cebador 13
5'dGAGCCCCTGGACGTCGGCGGTGTCC 3'
Cebador 14
5'dGACGGTGCATGCTCAGCAGGGAGCG 3'
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo reacciones PCR estándar utilizando el instrumento de ciclo térmico PTC-200 Peltier, de GRI (Felsted, Dunmow, Essex, CM6 3LD).
El producto 1 de la PCR se generó utilizando los cebadores 11 y 12. Este producto mide aproximadamente 1 kb y contiene el extremo carboxi de orfup1 a partir del segundo sitio AatII y regiones curso abajo.
El producto 2 de la PCR se generó utilizando los cebadores 13 y 14. Este producto mide aproximadamente 1,1 kb y contiene el extremo amino de orfup1 a partir del primer sitio AatII y regiones curso arriba.
El producto 2 de la PCR se ligó a pCR-Script Amp SK(+) digerido con SrfI siguiendo el manual de instrucciones (Stratagene Ltd., Cambridge Science Park, Milton Road, Cambridge CB4 4GF). La mezcla de ligación se utilizó para transformar células supercompetentes Epicurian E. coli XL1-Blue MRF' Kan (disponibles a partir de Stratagene) confiriéndoles resistencia a ampicilina (siguiendo las instrucciones del fabricante). Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes resultantes y el análisis de restricción del ADN reveló que 7 clones contenían plásmido en el que se había ligado el producto 2 de la PCR. Uno de estos plásmidos se designó pDES1.
El producto 1 de PCR se digirió con PstI y AatII y el ADN resultante se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa. El fragmento de 1 kb se escindió y eluyó del gel utilizando el kit "Sephaglas band prep" (Pharmacia, St. Albans, Herts, ALI3AW). Después, el fragmento aislado se ligó a pDES1 digerido con AatII y PstI. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli XL-1-Blue (disponibles a partir de Stratagene) confiriéndoles resistencia a ampicilina (siguiendo las instrucciones del fabricante). Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes resultantes y el análisis de restricción reveló que 1 clon contenía plásmido en el que se había ligado el producto 1 de la PCR. Este plásmido se designó pDES2.
Para introducir pDES2 en S. clavuligerus, el plásmido se modificó adicionalmente para que contuviera un origen de replicación que pudiera funcionar en estrepomicetos. Para conseguir esto, se digirió ADN plasmídico de pDES2 con EcoRI y HindIII y se ligó en el vector pIJ486 de Streptomyces de alto número de copia (6,2 kb; Ward et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 203: 468-478), también digerido con EcoRI y HindIII. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células competentes de E. coli (JM109) (Stratagene Ltd) confiriéndoles resistencia a ampicilina. Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes resultantes y el análisis de restricción reveló 6 clones que poseían pDES2 que contenía pIJ486. Uno de estos plásmidos se designó pDES3. El plásmido pDES3 se utilizó para transformar una cepa de S. clavuligerus en la que ya se había roto el gen de orfup1 por inserción del gen de resistencia a apramicina (como se ha descrito antes). Se seleccionaron transformantes resistentes a tiostreptona y después estos transformantes se sometieron a 3 cursos de esporulación en medios no selectivos y se rastrearon para determinar la pérdida de resistencia a apramicina. A partir de este procedimiento, se identificaron 45 mutantes que habían perdido la resistencia a apramicina. Después, éstos se analizaron por HPLC, que confirmó que estas cepas, al igual que las cepas 61-1A, 61-2A, 61-3A y 61-4A que rompen orfup1, eran incapaces de producir clavam-2-carboxilato y 2-hidroximetil-clavam cuando fermentaban en las condiciones en las que normalmente se producían estos clavams.
B.orfdwn1 y orfdwn2
Se creó un mutante por deleción/recolocación en orfdwn1 y orfdwn2 digiriendo primero pCEC018 (7,3 kb) con NcoI y liberando un subfragmento de 1-kb que contenía la mayor parte de orfdwn1 y una porción de orfdwn2. El digerido se fraccionó por electroforesis en gel de agarosa, y se escindió y eluyó del gel el fragmento de 6,3 kb. Después, este fragmento se ligó a un fragmento de ADN NcoI-NcoI que llevaba apr^{r} y se utilizó para transformar E. coli XL1-Blue confiriéndole resistencia a apramicina. Se obtuvo un clon a partir de este experimento pero el análisis de restricción del plásmido recombinante resultante reveló que se habían ligado dos copias del fragmento con resistencia a ampicilina en el plásmido con la deleción. Para eliminar la copia extra del fragmento-apr^{r}, el plásmido se digirió con NcoI y se autoligó. La mezcla de ligación se utilizó para transformar E. coli GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina. A partir de los transformantes, se aislaron dos clones que contenían los plásmidos pCEC052 y pCEC053, ambos de los cuales poseían sólo una copia del fragmento apr^{r} orientada inversamente con respecto a orfdwn1 y 2, mientras que pCEC053 poseía el fragmento-apr^{r} insertado en la misma orientación que orfdwn1 y 2.
Se construyó un plásmido transportador de pCEC052 ligando pCEC052 digerido con BamHI con pIJ486 igualmente digerido, y transformando E. coli GM2163, confiriéndole resistencia a apramicina. A partir de este experimento, se aisló un clon que contenía el plásmido transportador pCEC060. Este plásmido se utilizó para transformar S. clavuligerus 3585 de tipo salvaje, confiriéndole resistencia a apramicina y tiostreptona. Los transformantes resultantes se sometieron a dos cursos de esporulación en condiciones no selectivas, y después las réplicas se cultivaron en medios que contenían antibióticos para identificar colonias resistentes a apramicina y sensibles a tiostreptona. Se eligieron tres presuntos mutantes (60-1A, -2A y -3A) para un análisis adicional.
Para establecer la identidad de estos presuntos mutantes, se aisló ADN genómico a partir de las cepas 60-1A y 60-2A y se digirió o bien con SacI, o con BstEII, y se sometió a un análisis de transferencia southern. Las bandas de hibridación generadas a partir de este experimento eran consecuentes con que ambas cepas hubieran experimentado un episodio de doble sobrecruzamiento, demostrando que estos mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y recolocación en orfdwn1/2.
Cuando estos se cultivaron en medio Soya-Flour y sus líquidos sobrenadantes del cultivo se ensayaron por HPLC, ninguno de los mutantes produjo niveles detectables de clavam-2-carboxilato o 2-hidroximetilclavam. Un bioensayo de los líquidos sobrenadantes del cultivo indicó que los mutantes tampoco lograban producir niveles detectables de alanilclavam. Al igual que con los mutantes de orfup1, los mutantes de orfdwn1/2 son capaces de producir niveles de ácido clavulánico superiores a los obtenidos con el tipo salvaje (Tabla 2).
TABLA 2 Título de ácido clavulánico (CA) de mutantes de orfdwn1/2 en ensayos en matraces con sacudimiento
Cepa 70 Horas 70 Horas 93 Horas 93 Horas
CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN
NRRL 3585 nº 1 87 915 166 1963
NRRL 3585 nº 2 66 790 159 1842
60-1A 164 1872 260 2911
60-2A 187 2013 108 1320
60-3A 79 994 214 2161
orfdwn3
Para romper orfdwn3, se digirió pCEC023 (consistente en un fragmento de 3,7-kb de ADN curso abajo de cas1, subclonado en pSL1180) con NcoI y después se autoligó. Después de transformar E. coli con la mezcla de ligación, se aisló un clon que poseía el plásmido pCEC031. Este plásmido retenía sólo el fragmento NcoI-EcoRI de 1,9 kb que codifica una porción de orfdwn2 y el orfdwn3 incompleto. Un examen de la secuencia de ADN reveló que pCEC031 poseía un único sitio BstEII en 158pb a partir del sitio de iniciación de la traducción de orfdwn3. Por lo tanto, se digirió pCEC031 con BstII, se trató con fragmento Klenow para crear extremos romos y después se ligó a una caja de resistencia a apramicina con extremos romos. La mezcla de ligación se utilizó para transformar E. coli GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina y resistencia a ampicilina. Se seleccionaron dos transformantes que contenían, respectivamente, pCEC050 y pCEC051. El análisis de restricción reveló que la caja de resistencia a apramicina estaba orientada en la misma orientación que orfdwn3 en pCEC050 y en la orientación opuesta en pCEC051. Después, ambos de estos plásmidos se ligaron con HindIII y se ligaron a pIJ486 igualmente digerido. Luego, las mezclas de ligación se utilizaron separadamente para transformar E. coli GM2163 confiriéndole resistencia a apramicina y ampicilina. Se aislaron los plásmidos transportadores pCEC056 (pCEC050 + pIJ486) y pCEC057 (pCEC051 + pIJ486) a partir de los transformantes resultantes. Después, se utilizaron ambos plásmidos para transformar S. clavuligerus NRRL 3585.
Se seleccionó un transformante a partir de cada experimento con transformantes y se sometió a dos cursos sucesivos de esporulación en medios no selectivos y después las réplicas se cultivaron en medios que contenían antibióticos para identificar transformantes resistentes a apramicina y sensibles a tiostreptona. Por este procedimiento, se aislaron dos presuntos mutantes a partir de la progenie de cada transformante principal. (56-1A y 56-3A para pCEC056, y 57-1C y 57-2B para pCEC057).
Para establecer la identidad de estos presuntos mutantes, se aisló ADN genómico a partir de estas cepas y se digirió con SacI o Acc65I y se sometió a análisis de transferencia Southern. Las bandas de hibridación generadas a partir de este experimento fueron consecuentes con que ambas cepas hubieran experimentado un episodio de doble sobrecruzamiento, demostrando que estos mutantes eran mutantes verdaderos por rotura y recolocación en orfdwn3.
Cuando se cultivaron estas cepas en medio Soya-Flour y se ensayaron sus líquidos sobrenadantes del cultivo por HPLC, los mutantes producidos reducían claramente los niveles de clavam-2-carboxilato o 2-hidroximetilclavam. Un bioensayo de los líquidos sobrenadantes del cultivo indicó que los mutantes tampoco lograban producir niveles detectables de alanilclavam. Al igual que los mutantes de orfup1 y orfdwn1/2, los mutantes de orfdwn3 fueron capaces de producir niveles de ácido clavulánico superiores a los obtenidos con el tipo salvaje (Tabla 3).
TABLA 3 Título de ácido clavulánico (CA) de mutantes de orfdwn3 en ensayos en matraces con sacudimiento
Cepa 71 Horas 71 Horas 93 Horas 93 Horas
CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN CA \mug/ml CA \mug/mg de ADN
NRRL 3585 nº 1A 180 1580 193 1790
NRRL 3585 nº 1B 179 1640 266 2310
56-1A 34 110 235 2160
56-3A 225 2140 274 2740
57-1C 253 2910 277 2920
57-2B 242 2240 193 1860 
\vskip1.000000\baselineskip
Este documento de solicitud describe las siguientes secuencias nucleotídicas:
SEQ ID nº 1: secuencia de ADN de la Figura 1
SEQ ID nº 2: secuencia de orfup3
SEQ ID nº 3: secuencia de orfup2
SEQ ID nº 4: secuencia de orfup1
SEQ ID nº 5: secuencia de orfdwn1
SEQ ID nº 6: secuencia de orfdwn2
SEQ ID nº 7: secuencia de orfdwn3
SEQ ID nº 8: secuencia del cebador oligonucleotídico 11
SEQ ID nº 9: secuencia del cebador oligonucleotídico 12
SEQ ID nº 10: secuencia del cebador oligonucleotídico 13
SEQ ID nº 11: secuencia del cebador oligonucleotídico 14
Figura 1
Secuencia nucleotídica del cromo S. clavuligerus que incluye y flanquea cas1
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: SmithKline Beecham plc et al 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos compuestos
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 19
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: SmithKline Beecham
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Two, New Horizons Court, Great West Road
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Brentford
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: R.U.
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL (ZIP): TW8 9EP
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SISTEMA LÓGICO (SOFTWARE): FastSEQ para Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Valentin, Jill B
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: P31731
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 0181-9752000
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TELEFAX: 0181-9756294
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 7193 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:
11
12
13
14 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 145 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
15 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 453 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:
16 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1032 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 984 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1182 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:
20 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 660 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CTGACGCTGC AGGAGGAAGT CCCGC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CGGGGCGAGG ACGTCGTCCC GATCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GAGCCCCTGG ACGTCGGCGG TGTCC 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACGGTGCAT GCTCAGCAGG GAGCG 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 972 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: Otro
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 48 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 151 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
25 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 344 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:
26
27 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 328 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
28
29 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 394 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:
31
32 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:18:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 220 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
33
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN ACERCA DE SEQ ID NO:19:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 324 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CATENARIEDAD: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
35
36

Claims (12)

1. S. clavuligerus que comprende ADN que corresponde a un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con SEQ ID núms. 4-7 respectivamente, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo.
2. S. clavuligerus según la reivindicación 1, donde el 5S clavam es clavam-2-carboxilato.
3. S. clavuligerus según la reivindicación 1, donde el 5S clavam es 2-hidroximetilclavam.
4. S. clavuligerus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por deleción y posterior reeemplazamiento de algún gen.
5. S. clavuligerus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por alteración de algún gen y posterior reemplazamiento de algún gen.
6. Un procedimiento para mejorar la producción de ácido clavulánico en una cepa de S. clavuligerus, donde ADN que comprende un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con SEQ ID núms. 4-7 respectivamente, ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado dentro de dicha cepa de S. clavuligerus.
7. Un procedimiento para mejorar la producción de ácido clavulánico con poco o nada de 5S clavam en una cepa de S. clavuligerus, donde ADN que comprende un marco de lectura abierto específico para la biosíntesis de 5S clavam, y que no es esencial para la biosíntesis de 5R clavam, seleccionado de los marcos de lectura abiertos orfup1, orfdwn1, orfdwn2 y orfdwn3 con SEQ ID núms. 4-7 respectivamente, ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo y se ha transformado dentro de dicha cepa de S. clavuligerus.
8. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, donde el 5S clavam es clavam-2-carboxilato.
9. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, donde el 5S clavam es 2-hidroximetilclavam.
10. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por deleción y posterior reemplazamiento de algún gen.
11. Un procedimiento según la reivindicación 6 o 7, donde dicho marco de lectura abierto ha sido alterado o se ha hecho defectuoso de otro modo por alteración y posterior reemplazamiento de algún gen.
12. Un procedimiento para la preparación de una composición que comprende clavulanato de potasio y amoxicilina, cuyo procedimiento comprende producir ácido clavulánico a partir de una cepa de S. clavuligerus según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y seguidamente convertirlo en la sal de potasio y combinar la sal de potasio con amoxicilina.
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