CN104114697A - 多重免疫筛选分析 - Google Patents
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Abstract
本发明提供用于病原体的早期检测、病原体的准确鉴定并改进疾病监测的试剂盒和分析方法。更具体地,本发明公开了免疫分析,其引导在受感染患者的生物液体中针对广泛范围的传染性病原体的抗体快速和同时检测。这种免疫分析涉及含有AGT酶与病毒抗原的融合蛋白在可鉴定的固体支持物(例如,荧光微球)上的共价和定向偶联,所述支持物预先用AGT底物包被。这种偶联由AGT酶在其底物上不可逆的反应所介导。因此,与通过标准胺偶联程序产生的抗原偶联的微球相比,所获得的抗原偶联微球显示特异性抗体的增强捕获。与经典ELISA或放射免疫沉淀分析相比,本发明的方法具有多重化、最小化生物样本量的能力,并具有针对靶抗体的增强的灵敏度和特异性。
Description
背景技术
由于疾病的严重程度、高致死性、某些介质(agent)的人类间接触传染性以及对其中的大多数缺乏有效治疗,传染病和病毒性出血热(VHF)构成显著的公共卫生问题。
其中一些是由高传染性的RNA病毒导致,所述RNA病毒来自几个科,其包括包括黄病毒科(Flaviviridae)(登革热、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(Togaviridae)(基孔肯雅(Chikungunya)、罗斯河、马雅罗、西方马型脑炎、东方马型脑炎、委内瑞拉马型脑炎病毒)、本雅病毒科(Bunyaviridae)(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(Caliciviridae)(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(拉沙热)和丝状病毒(Filoviridae)(埃博拉、马尔堡)。通常通过与感染的动物贮主或节肢动物载体接触发生传播。虽然大多数的这些病毒在热带和亚热带有更高的发生率,但其天然贮主和载体地域扩张、以及增加的国际旅行已经使这些介质在非流行地区极有可能出现。疫情控制关键取决于快速检测以及介质的准确鉴定,以定义和及时实现并适当行动。在这种情况下,必须产生和验证用于暴发的早期检测、精确鉴定病原体并改进疾病监测的工具。
在这方面,在体液中检测抗体构成了病毒引起的疾病、自身免疫性疾病的诊断以及癌症检测的重要组成部分。事实上,因为已知某些抗体存在与病原体的暴发有关,因此这些抗体可作为诊断标记物并可引导预后和治疗。对于专门靶向病毒抗原的抗体的情况尤其如此。
目前用于检测抗体存在的方法包括多种技术,诸如免疫荧光显微镜、化学发光分析、Western印迹、放射免疫沉淀法(RIP)和ELISA。例如,Kim H-J等人的团队最近开发出一种竞争ELISA用于检测针对在山羊和牛中的裂谷热病毒的抗体(The Journal of Veterinay Medical Science,2011)。然而,这种技术需要分开测量每种抗体,因而不适用于在单个生物液体样本中进行多个抗体的平行、快速和高通量分析。因为校准品和所述抗体在相同的条件下进行分析,通过减少个别分析(如ELISA)之间存在的基质效应,同时平行检测几种抗体可特别地有用;因此,对在相同样本中存在的多个抗体的测量,其将产生可比较的结果。
然而,使病原相关抗体的直接鉴定复杂化的是正常血清含有大量在复杂染色模式中表现其自身的天然抗体(Avrameas S.Immunol.Today 1991)。这些天然抗体的存在可使得疾病相关抗体与“自身免疫噪声”(即天然存在的自身抗体)的复杂背景的差异复杂化。这就是为什么大多数之前研究评估一个或几个特异性疾病相关抗体,并通过ELISA或RIA的方法仅筛选出有限数量的纯化的同源或异源的蛋白作为抗原。不可能建立基于这些抗体的诊断。在另一方面,因为Western印迹法允许同时筛选不同抗原的广泛谱,Western印迹法已经发展成为检测抗体的最重要工具。最近能够同时分析Western印迹这些复杂的染色模式的新技术,是基于数字图像分析。这种技术已成功应用于研究重症肌无力、格雷夫斯病和实验性葡萄膜炎(Zimmerman CW,Electrophoresis 1995)。还可使用表面增强激光解吸/电离(SELDI)或基质辅助激光解吸/电离质谱技术,优选SELDI质谱技术(US2006/166268)在蛋白芯片阵列上检测和测量抗体。然而,这些技术使用大型笨重设备,其是复杂的和维护昂贵,并且需要大量的生物样本来实现低量抗体的检测。
鉴于上述情况,需要可寻址***和方法,其可对产生抗体的疾病的分子诊断提供高通量、成本效益和精确性的进一步改善。本发明满足了这些和其它需要。
附图说明
图1表示嵌合AGT-抗原蛋白定向偶联至底物包被的微球上。偶联的第一步由通过氨基偶联将AGT底物BG-PEG-NH2偶联至活化的微球所组成。第二步由使底物包被的微球与含AGT的融合蛋白(例如,SNAP突变体)相接触所组成,所述酶意欲共价附至其BG-PEG-NH2底物,即至微球上。
图2显示嵌合SNAP-病毒抗原蛋白的偶联效率(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-ZIKA),接着是抗-SNAP抗体。
图3比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV2抗体对嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的免疫分析实验的灵敏度,所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通过hAGT蛋白的底物(本发明的偶联)缀合至微球、或者通过标准胺偶联方法,例如Bio-Plex胺偶联试剂盒BIORAD进行偶联。
图4比较用于检测纯化的单克隆抗-DV1抗体对嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白的免疫分析实验的灵敏度,所述嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白以单重格式缀合至微球,或者与其它嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)以多重格式偶联至微球。
图5显示用于检测纯化的单克隆抗-WNV抗体的稀释液对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)的多重免疫分析实验的反应性和特异性。
图6显示以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-ROCIO、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA)进行的在小鼠多克隆血清中针对DV3的抗-DV3 IgG检测(A)以及在小鼠多克隆血清中针对YF的抗-YF IgG检测(B)的反应性和特异性。
图7显示在DV1感染的人类患者血清中以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-ROCIO、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA、SNAP-TBE)进行的抗-DV1 IgM检测(A)和抗-DV1 IgG检测(B)的反应性和特异性。
图8公开pDeSNAPuniv盒(cassette)的结构。
图9公开pDeSNAPuniv/SBV.N盒的结构。
图10显示(A)使用Cd2+诱导10天(+)或未诱导的(-)的S2/SNAP-SBV.N细胞上清中进行的免疫印迹分析。使用抗-His标签抗体检测分泌的嵌合蛋白SNAP-SBV.N(理论MW 50kDa),与限定量的高纯度嵌合蛋白SNAP-TOS.N(理论MW 49kDa)进行比较。(B)在尺寸排阻层析柱的馏分(fraction)上进行的免疫印迹(PAGE-SDS的考马斯蓝染色)对应于来自诱导10天的S2/SNAP+SBV.N细胞的分泌SNAP+SBV.N蛋白的最后纯化步骤。
图11显示含有本发明的抗原包被微球的装置的实例。
具体实施方式
6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT,也被称为ATase或MGMT,以下称为“AGT”)在IUBMB酶命名法中编号为EC 2.1.1.63。它是207个氨基酸残基的6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶的DNA修复酶,其在细胞内的功能是修复烷基化DNA。更精确地,AGT通过将SN2反应中的甲基不可逆地转移至反应性半胱氨酸残基(Cys 145)对DNA中的O6-甲基化鸟嘌呤发挥作用。目前,已经证明一些O6-苄基鸟嘌呤衍生物通过将其苄基转移至AGT酶的活性位点半胱氨酸上来与所述酶进行不可逆反应(参见Damoiseaux等人,ChemBiochem.,2001,WO2004/031404和WO 2005/085470)。
本发明人已经开发和验证了这样的免疫分析,其导向由广泛疾病,特别是虫媒病毒疾病和VHF产生的几种抗体在生物液体中的快速和同时检测。
为实现对低量抗体检测最佳灵敏度和特异性两者,已经开发出定向抗原偶联方法。这个定向抗原偶联方法基于AGT酶和其底物(O6-苄基鸟嘌呤衍生物)之间的共价相互作用,所述底物通过将其苄基转移至酶的活性位点半胱氨酸上与AGT酶不可逆反应。相应地,一些靶抗原可融合至AGT酶的部分,从而导致不同的嵌合融合蛋白(以下称为[AGT-抗原]的融合蛋白),即可以用作对存在于生物样本中的抗体的捕获试剂。本发明人已证明,得益于特异性AGT-底物相互作用,当这些融合蛋白结合到固体支持物上时这种抗体捕获得以增强。因此,使用AGT-底物包被所述固体支持物是本发明免疫分析的必要步骤。
更确切地说,在本发明的上下文中,用于将抗原偶联至固体支持物的方法包括以下两个步骤:i)用AGT底物(例如,BG-PEG-氨基)包被固体表面,以及ii)使用AGT底物作为锚点来共价固定嵌合[AGT-抗原]融合蛋白(参见图1)。固体表面使用所述AGT底物包被之前,所述固体表面有利地是官能化的,优选通过使用优化的两步碳二亚胺处理(Kufer SK,Eur.Biophys.J,2005),从而使AGT底物共价附着到固体表面。一旦这些步骤已经完成,所述固体表面携带AGT底物被不可逆地连接到嵌合[AGT-抗原]融合蛋白上。由于这种反应的高特异性,所述融合蛋白专门通过含有半胱氨酸的AGT酶结构域偶联,因此使抗原因其与抗体的相互作用而可被接近。
这种偶联过程是非常有利的,因为其允许抗原在固体支持物上以定向的方式结合。此外,这种抗原偶联方法有利地使得能够获得在固体表面上的多聚体抗原结构,从而增强免疫球蛋白G、以及可能的免疫球蛋白M的捕获效率。因此,与通过标准的非定向胺偶联程序产生的抗原偶联微球相比,在本申请实验部分中开发的抗原偶联的微球已显示出增强的特异性抗体捕获(参见以下实验部分和图3)。最后,这种抗原偶联方法使得能够获得抗原缀合微球的高偶联效率与长期稳定性(在4℃,>6个月)。
重要的是,在本发明的免疫分析中使用的固体支持物应是本质上可区分的,因此有可能准确地确定何种固体支持物上携带何种抗原。然后,抗原偶联的和可区分的固体支持物用作特异性人免疫球蛋白的捕获试剂,并因此接触患者的生物样本。
本发明的方法的最后一步涉及检测有效地结合到免疫球蛋白的固体支持物。免疫球蛋白包被的固体支持物的鉴定能够诊断哪种病原体在感染患者(因为每种固体支持物与限定的致病抗原相匹配)。这个最后检测步骤通过任何常规方法进行,例如通过使用标记的检测抗体以及通过鉴定固体支持物的性质。
有利地,本发明的方法仅涉及在患病患者中检测抗体的存在,而不需要关于那些抗体身份的知识。
如在本申请的实验部分所示,本发明人用本发明的抗原偶联方法来生成一些不同抗原包被的荧光微球。目前,16组不同的微球已与16种纯化嵌合[AGT-抗原]融合蛋白相偶联,从而允许滴定对以下不同蛋白特异的16种血清抗体:登革血清型1至4、西尼罗、黄热病、日本脑炎、蜱传脑炎、圣路易脑炎、墨累谷脑炎(MurrayValley encephalitis)、威塞尔布朗(Wesselsbron)、寨卡(Zika)、罗西奥(Rocio)、乌苏图(Usutu)、裂谷热和基孔肯雅病毒。这16组不同微球已被混合在单一样本中而不影响检测的灵敏度和特异性(参见图5)。这种***的生产是高度时间效益和成本效益好的,因为只需极少量的重组抗原(<50μg)来产生一组抗原偶联的微球(~1.25×106微球),这样的组足以进行500个个体分析。
在第一方面,本发明涉及用于在生物样本中检测至少两个靶抗体的方法,其包括:
(a)使第一固体支持物与生物样本相接触,所述第一固体支持物包含共价偶联至第一融合蛋白的AGT底物,所述第一融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表位;
(b)使第二固体支持物与生物样本相接触,所述第二固体支持物包含共价偶联至第二融合蛋白的AGT底物,所述第二融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗体识别的第二表位;以及
(c)检测两个靶抗体的存在与否。
更确切地说,本发明涉及用于在来自受试者的生物样本中检测至少两种不同靶抗体存在的体外分析方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供第一融合蛋白,其包括:
-含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物;
(d)提供第二融合蛋白,其包括
-含有第二表位的多肽,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(f)获得第二固体支持物,其与由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位共价偶联,
其中所述第一和第二固体支持物可彼此被特异性地鉴定出;
(g)使所述生物样本与获自步骤(c)和(f)的第一和第二固体支持物相接触;
(h)检测所述至少两种靶抗体的存在。
如下文所用,术语“抗体”、“融合蛋白”、“表位”、“抗原”、“AGT多肽”、“固体支持物”等明显理解为本领域通常的,即以广义方式所理解的。特别是,它们不仅包括具体的单一分子还包括一些所述分子。例如,术语“固体支持物”包括许多相同固体支持物的子集,术语“微粒”包括许多相同的微粒的子集,以及术语“融合蛋白”包括一些相同的单一蛋白分子。在本发明的上下文中,值得注意的是固体支持物携带一些相同的融合蛋白,所述融合蛋白除AGT多肽以外还含有相同的抗原,并因此具有相同表位,以便在固体支持物上待检测的抗体可以被毫无疑义地鉴定。
如本文所用,术语“融合蛋白”指含有通过人工连接两个或更多多肽而产生的蛋白或多肽的多肽。在本发明的免疫分析中,所述融合蛋白包含AGT多肽和含有至少一个表位的抗原。融合蛋白可通过融合基因的遗传工程而获得。这通常涉及从编码的第一个蛋白的cDNA序列中去除终止密码子,然后通过连接或重叠延伸PCR符合阅读框地加上第二蛋白的cDNA序列。然后,所述DNA序列将作为单一蛋白由细胞表达。所述蛋白可被工程化以包括原始蛋白两者的完整序列,或仅其中一部分。如果这两个实体是蛋白,可以加入接头(或“间隔区”)肽,这使得蛋白独立地折叠和如预期地行为更有可能。特别地,通过提供含有与表位或抗原的编码序列在阅读框中的AGT编码序列的载体,可以获得本发明的融合蛋白,所述表位或抗原的编码序列可附着至AGT DNA序列的N末端或至C末端侧。这些载体可引入到原核宿主,其包括如大肠杆菌细菌的真细菌,或真核宿主,例如酵母、昆虫细胞或哺乳动物细胞,以及重组融合蛋白可以在适当条件下产生。典型的结构存在于本申请的实验部分。
如本文所用,术语“抗体”意在包括单克隆抗体、多克隆抗体和嵌合抗体。优选地,待用本发明的免疫分析来检测的抗体是多克隆抗体,其存在于患病患者的生物样本中,并且因此由不同B细胞来源产生。因此,其识别由致病抗原展示的不同表位(在另一方面,单克隆抗体源自单一细胞系并识别相同表位)。
抗体(或“免疫球蛋白”)由糖蛋白组成,所述糖蛋白包含由二硫键相连的至少两条重(H)链和两条轻链(L)。每条重链包含重链可变区(或结构域)(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域,CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为高变区,称为“互补决定区”(CDR)或“高变区”,其主要负责结合抗原表位并且其散布在更加保守称为骨架区(FR)的区中。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成,所述CDR和FR从氨基端到羧基端按以下顺序排列:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白结合至宿主组织或因子,包括免疫***的各种细胞(例如,效应细胞)和经典补体***的第一成分(Clq)。
抗体可以是不同的同种型(即IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)的。IgG和IgM型抗体两者可通过本发明的方法进行检测。值得注意的是,这些同种型的组成是由二硫键连接的两条相同重链和两条相同的轻链。重要的是,IgM抗体形成聚合物,其中多个免疫球蛋白通过二硫键共价连接在一起,主要是作为五聚体也可作为六聚体以使其具有约900kDa的分子量(以其五聚体形式)。因为每个单体具有两个抗原结合位点,五聚体IgM有10个结合位点。然而,通常IgM抗体不能在同一时间结合10个抗原,因为大多数抗原的大尺寸阻碍结合至附近的位点。由于IgM的聚合物性质,其具有高亲和力。
由于本发明的方法也可以检测到抗体片段。此术语意在包括Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、dsFv、ds-scFv、二聚体、微体、双体及其多聚体以及双特异性抗体片段。
单克隆抗体可以在本免疫分析中使用;例如,用于检测结合至固体支持物的免疫球蛋白。如本文中所用,“单克隆抗体”定义了从同源抗体群中所产生的抗体。更具体而言,除了可以以最小比例发现的几个可能天然存在的突变以外,群体的单个抗体是相同的。换言之,单克隆抗体由源自单一细胞克隆(例如杂交瘤、由编码均质性抗体的DNA分子转染的真核宿主细胞、由编码均质性抗体的DNA分子所转染的原核宿主细胞等)生长的均质性抗体所组成,并且通常表征为一种且仅一类和亚类的重链,以及仅一种类型的轻链。单克隆抗体是高度特异性的并且针对单一抗原。另外,与通常包括针对各种决定簇或表位的各种抗体的多克隆抗体的制备相反,每种单克隆抗体针对抗原的单一表位。
术语“抗原”在本文中意为任何物质,其引发免疫***产生针对所述物质的抗体。“免疫原性的”抗原是抗原的特定类型,其在自身被注入时能够刺激适应性免疫应答。因此,在分子水平上,抗原表征为其“结合”到抗体的抗原结合位点的能力。
在本发明的上下文中,如果抗体对所述抗原(或表位)具有高于105M-1,优选高于106M-1,更优选高于107M-1的亲和常数Ka(其为解离常数的倒数,即1/Kd),则说所述抗体“结合”限定的抗原(或表位)或“识别”所述抗原(或表位)。这种亲和性可以通过例如平衡透析或荧光淬灭来测量,这两种技术在本领域中是常规使用的。
在本发明的上下文中,抗原或表位包括:蛋白、脂蛋白、多糖以及糖蛋白。所述蛋白包括病毒、细菌、寄生虫、动物和真菌蛋白如白蛋白、破伤风类毒素、白喉类毒素、百日咳类毒素、细菌外膜蛋白(包括脑膜炎球菌外膜蛋白)、RSV-F蛋白、疟疾衍生肽、B-乳球蛋白B、抑肽酶、卵白蛋白、溶菌酶、线性肽、寡肽等。所述抗原也可以是肿瘤相关抗原如癌胚抗原(CEA)、CA15-3、CA125、CA19-9、***特异性抗原(PSA)、TAA复合物、SSX2或NERCMSL。所述抗原还可以是半抗原以及其它含有低分子量分子的部分,如糖、寡糖、多糖、肽、粘蛋白、毒素和变应原(花粉、蛋清)。传染性毒素是本领域公知的。可以列举,例如肉毒杆菌神经毒素、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的ε毒素、蓖麻毒素、蛤蚌毒素(saxitoxin)、志贺毒素(shigatoxin)、河豚毒素、葡萄球菌肠毒素等。粘蛋白也是本领域中公知的。MUC5AC、MUC5B和MUC2是其实例。特别地,其可以是天然存在的多糖,例如B组链球菌(steptococcal)和肺炎球菌荚膜多糖(包括III型)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)mucoexo多糖和荚膜多糖(包括费希尔I型)、以及流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)多糖。
在另一优选的实施方案中,所述抗原或表位通过选自以下的病毒表达:流感病毒、甲型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、庚型肝炎病毒、HIV病毒、黄热病毒、登革热病毒、日本脑炎病毒、蜱传脑炎病毒、乌苏图或西尼罗病毒、裂谷热或托斯卡纳病毒、基孔肯雅病毒、呼吸道合胞(synticial)病毒、罗西奥病毒、麻疹病毒、穆雷脑炎病毒、威塞尔布朗(Wesselbron)病毒、寨卡(Zika)病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎(choreomeningitis)病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、拉沙(Lassa)病毒、胡宁(Junin)病毒、马丘波(Machupo)病毒、萨比亚(Sabia)病毒、瓜纳里多(Guanarito)病毒、腮腺炎病毒、狂犬病病毒、风疹病毒、水痘带状疱疹病毒、单纯疱疹1和2型,更通常的α病毒、腺病毒、艾柯病毒、轮状病毒、黄病毒、鼻病毒、正本雅(orthobunya)病毒、脊髓灰质炎病毒、人细小病毒、肠病毒、冠状病毒、人***状瘤病毒、人巨细胞病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、来自1、2和3型的副流感病毒、或任何鉴定的病毒。
在另一优选的实施方案中,所述抗原或表位由属于这样科的病毒来表达,所述科选自:黄病毒科(登革热、黄热、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(拉沙)和丝状病毒科(埃博拉、马尔堡)。
在另一优选的实施方案中,所述抗原或表位通过以下表达:寄生原虫(例如那些来自于利什曼虫属或刚地弓形虫(Toxoplasma Gondii)、痢疾阿米巴(Entamoeba histolytica)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、肺囊虫(Pneumocystis carinii)、或贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、蠕虫(例如,线虫、绦虫、或吸虫)、或节肢动物(例如,甲壳类、昆虫、蛛形纲)。
在另一优选的实施方案中,所述抗原或表位通过传染性细菌表达,例如沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、支原体属(Mycoplasma)、白喉(Diphteriae)、钩端螺旋体属(Leptospirosa)、立克次氏体(Rickettsia)或埃希氏菌属(Escherichia)中。在另一优选的实施方案中,所述细菌属于选自以下种之一:流感嗜血杆菌(H.influenzae)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、百日咳杆菌(Bordetella pertussis)、破伤风杆菌(Clostridium tetani)、表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、脑膜炎双球菌(N.meningiditis)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、伯纳特氏立克次体(Coxiella burnetii)、问号钩端螺旋体(Leptospirosa interrogans)和大肠杆菌(E.coli)。
在另一优选的实施方案,所述抗原或表位由真菌或酵母(例如,来自物种念珠菌属(Candida)、曲霉属(Aspergillus)、隐球菌属(Cryptococcus)、组织胞浆菌属(Histoplasma)、肺孢子虫属(Pneumocystis)、或葡萄穗霉属(Stachybotrys))表达。
抗原通常存在几个表面特征,其可作为对特异性抗体相互作用的点。任何这样独特的分子特征组成表位。如本文所用,术语“表位”因此指定抗原的特定分子表面特征,例如抗原的片段,其能够结合至少一种抗体。因此,在分子水平上,表位对应于抗原的特定分子表面特征(例如,抗原的片段),其能被特定抗体识别和结合。在本发明的上下文中,“融合蛋白”包含被靶抗体识别的至少一个表位。优选地,所述融合蛋白包括包含几个表位的整个抗原。这些表位可以是线性或构象表位。如本文所用,线性的(或顺序的)表位是通过其线性氨基酸序列或一级结构被抗体所识别的抗原。与之相反,构象表位是通过其特定的三维形状被识别。优选地,本发明的融合蛋白含有构象表位,因为大多数多克隆抗体识别相同的。
然而,重要的是这种抗原不存在交叉反应表位,即由其所结合的非特异性抗体识别的表位。如果是的话,本发明方法的特异性将降低。
在一个更优选的实施方案中,所述表位存在于病毒蛋白中,所述病毒蛋白选自:由SEQ ID NO:3编码的登革病毒1的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:4编码的登革病毒2的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:5编码的登革病毒3的EDIII蛋白、由SEQID NO:6编码的登革病毒4的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:7编码的西尼罗病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:8编码的黄热病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:9编码的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:10编码的寨卡病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:11编码的威塞尔布朗(Wesselbron)病毒的EDIII蛋白、由SEQ IDNO:12编码的罗西奥病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:13编码的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:14编码的圣路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ IDNO:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:56编码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:57编码的基因型5的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、以及由SEQ ID NO:58编码的拉本斯堡(Rabensburg)病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒、以及致癌HPV株例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
在优选的实施方案中,在本发明方法中使用的与hAGT酶融合在融合蛋白中的第一和第二表位(或抗原)属于同一分类级别,即其属于相同科(例如,黄病毒科家族、本雅病毒科、沙粒病毒科或丝状病毒科)或属或种,但具有不同的血清型。换言之,所述第一和第二表位可通过密切相关的病毒来表达,例如属于相同科、属或种但具有不同血清型,如登革病毒1、2、3、或4。
或者,在另一优选实施方案中,所述第一和第二表位(或抗原)属于不相关生物的科或属或种。
重要的是,本发明的免疫分析依赖于检测大量已知或未知的抗体。“大量”在本文中理解为至少5种,更优选至少15种,更优选至少50种以及甚至更优选至少100种抗体。因此,在优选的实施方案中,本发明的分析方法用于从受试者的生物样本中检测至少5种,更优选至少15种,和优选至少50种以及甚至更优选至少100种靶抗体。对于本发明的方法而言,无所谓具体抗体是否被适当表征,因为所述方法仅依赖于检测所述抗体的存在而不是其性质。
在本发明优选的实施方案中,与所述第一和第二固体支持物偶联的所述第一和第二融合蛋白选自以下:
-SEQ ID NO:21(对应于融合蛋白[SNAP-DEN1.EDIII])
-SEQ ID NO:42(对应于融合蛋白[SNAP-SBV.N])
-SEQ ID NO:49(对应于融合蛋白[SNAP-EV71.VP1])
-SEQ ID NO:51(对应于融合蛋白[SNAP-JE.sE])
-SEQ ID NO:53(对应于融合蛋白[SNAP-JE-1.EDIII])
-SEQ ID NO:60(对应于融合蛋白[SNAP-JE-2.EDIII])
-SEQ ID NO:62(对应于融合蛋白[SNAP-JE-4.EDIII])
-SEQ ID NO:64(对应于融合蛋白[SNAP-JE-5.EDIII])
-SEQ ID NO:66(对应于融合蛋白[SNAP-RabV.EDIII])
-SEQ ID NO:68(对应于融合蛋白[SNAP-黄病毒.EDIII])
-SEQ ID NO:70(对应于融合蛋白[SNAP-RR.sE2])
-SEQ ID NO:72(对应于融合蛋白[SNAP-MAY.sE2])
-SEQ ID NO:74(对应于融合蛋白[SNAP-WEE.sE2])
-SEQ ID NO:76(对应于融合蛋白[SNAP-EEE.sE2])
-SEQ ID NO:78(对应于融合蛋白[SNAP-VEE.sE2])
-SEQ ID NO:80(对应于融合蛋白[SNAP-AKA.N])
-SEQ ID NO:82(对应于融合蛋白[SNAP-AIN.N])
-SEQ ID NO:84(对应于融合蛋白[SNAP-SHA.N])
-SEQ ID NO:86(对应于融合蛋白[SNAP-huCOV.N])
-SEQ ID NO:88(对应于融合蛋白[SNAP-huCOV.S])
-SEQ ID NO:90(对应于融合蛋白[SNAP-HCV.C])
-SEQ ID NO:92(对应于融合蛋白[SNAP-MSP+AMA])
-SEQ ID NO:94(对应于融合蛋白[SNAP-HbpA1])
-SEQ ID NO:96(对应于融合蛋白[SNAP-MUB40])
-SEQ ID NO:98(对应于融合蛋白[SNAP-moCLEC5A])
-SEQ ID NO:100(对应于融合蛋白[SNAP-huCLEC5A])
-SEQ ID NO:102(对应于融合蛋白[SNAP-cxVAGO])
-SEQ ID NO:104(对应于融合蛋白[SNAP-aaVAGO])
-SEQ ID NO:109(对应于融合蛋白[SNAP-CCHF.N])
-SEQ ID NO:111(对应于融合蛋白[SNAP-EBO.N])
-SEQ ID NO:113(对应于融合蛋白[SNAP-MAR.N])
-SEQ ID NO:115(对应于融合蛋白[SNAP-LAS.N])
-SEQ ID NO:117(对应于融合蛋白[SNAP-JUN.N])
-SEQ ID NO:119(对应于融合蛋白[SNAP-MAC.N])
-SEQ ID NO:121(对应于融合蛋白[SNAP-GUA.N])
-SEQ ID NO:123(对应于融合蛋白[SNAP-SAB.N])
-SEQ ID NO:125(对应于融合蛋白[SNAP-OMSK.EDIII])
-SEQ ID NO:127(对应于融合蛋白[SNAP-KYA.EDIII])
-SEQ ID NO:129(对应于融合蛋白[SNAP-ALK.EDIII])
-SEQ ID NO:131(对应于融合蛋白[SNAP-LAS.ectoGP1])
-SEQ ID NO:133(对应于融合蛋白[SNAP-JUN.ectoGP1])
-SEQ ID NO:135(对应于融合蛋白[SNAP-MAC.ectoGP1])
-SEQ ID NO:137(对应于融合蛋白[SNAP-GUA.ectoGP1])
-SEQ ID NO:139(对应于融合蛋白[SNAP-SAB.ectoGP1])
-SEQ ID NO:141(对应于融合蛋白[SNAP-LAS.ectoGP2])
-SEQ ID NO:143(对应于融合蛋白[SNAP-JUN.ectoGP2])
-SEQ ID NO:145(对应于融合蛋白[SNAP-MAC.ectoGP2])
-SEQ ID NO:147(对应于融合蛋白[SNAP-GUA.ectoGP2])
-SEQ ID NO:149(对应于融合蛋白[SNAP-SAB.ectoGP2]),以及
-SEQ ID NO:151(对应于融合蛋白[SNAP-HEV.C])。
因此,本发明的体外方法能够检测为病毒、细菌、酵母或真菌介导感染的靶疾病。优选地,所述病毒感染是由以下导致:***瘤病毒或来自黄病毒科(登革、黄热、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)的RNA病毒、披膜病毒科(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(拉沙)和丝状病毒科(埃博拉、马尔堡)。优选地,所述细菌感染是由问号钩端螺旋体(Leptospirosa Interrogans)导致的。优选地,所述感染是由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)导致的。
如本文所用,术语“生物样本”是指从患者已经获得的并可能含有抗体的任何样本。优选地,所述生物样本是生物液体,例如未经过滤的生物液体如尿液、脑脊液、胸膜液、滑膜液、腹膜液、羊水、胃液、血液、血清、血浆、淋巴液、组织液、唾液、生理分泌物、眼泪、粘液、汗液、乳汁、***、***、***分泌物、来自溃疡和其它表面皮疹、水泡、以及脓肿的液体。其也指组织提取物,包括正常、恶性以及可疑组织的活检、或可含有抗体的身体的任何其它成分。在所述生物样本可以在使用前预先处理,例如从血液制备血浆、稀释粘性流体等;治疗方法可以包括过滤、蒸馏、浓缩、干扰化合物的失活、以及加入试剂。在优选的实施方案中,所述生物样本选自全血、血清、血浆、尿液、***、脑脊髓液和唾液。
在本发明方法中可以使用任何具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的多肽。出于本发明的目的,这些多肽将称为“AGT多肽”。
AGT从其底物O6-烷基鸟嘌呤-DNA上将烷基不可逆地转移至其半胱氨酸残基之一。迅速与AGT反应的底物类似物是O6-苄基鸟嘌呤,其二级速率常数为约103秒-1M-1。
在本发明的上下文中,如果多肽能够从含有O6-烷基鸟嘌呤的分子上将烷基不可逆地转移至其自己的半胱氨酸残基之一上,则认为多肽具有“O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性”(或“AGT活性”)。例如,通过接触已知标记的O6-苄基鸟嘌呤衍生物并监测所述标记转移至测试多肽,可证明所述多肽的“O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶的活性”。如果在细胞(in cellulo)或在细胞提取物中进行分析,宿主细胞的内源性AGT反应应加以控制以使内源性AGT不干扰所述多肽。因此,优选使用已知的AGT-缺陷细胞系。现在,鉴定AGT活性的分析是公知的。几个O6-苄基鸟嘌呤衍生物是商业上可获得的(例如通过Santa Cruz生物技术分销得到O6-苄基鸟嘌呤,以及荧光标记的O6-苄基-鸟嘌呤衍生物可从New EnglandBiolabs NEB获得)。这些分析中的一些在WO 2005/085470和WO2004/031405中公开。
在本发明的上下文中,AGT多肽的“催化结构域”对应于所述酶的活性位点,或者换句话说,对应于酶的部分,其中发生从其底物O6-烷基鸟嘌呤-DNA将烷基至反应半胱氨酸残基的转移。在hAGT于其活性位点结合O6-苄基鸟嘌呤的结构中,4个氨基酸在苄基环(Pro140、Ser159、Gly160)上接近,或可以接触核碱基(Asn157)的N9。之前已证明在位置Pro140和Gly160上的突变影响hAGT与O6-苄基鸟嘌呤的反应(Xu-Welliver等人,Biochemical Pharmacology 1999):认为在位置140上的脯氨酸对于其与苄基环的相互作用是至关重要的,以及突变Gly160Trp已被证明增加hAGT对O6-苄基鸟嘌呤的反应性。
在优选的实施方案中,具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽是序列SEQ ID NO:1的人AGT多肽(参考NP_002403.2)、鉴定为NP_032624.1的小鼠AGT(SEQ ID NO:18)、鉴定为NP_036993.1的大鼠MGMT(SEQ ID NO:19)或者其同源序列,所述源序列具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
如本文所用,术语“同源的”是指具有序列相似性的序列。术语“序列相似性”,以其所有语法形式,是指核酸或氨基酸序列之间的同一性或对应程度。在本发明的上下文中,当至少约80%、或者至少约81%、或者至少约82%、或者至少约83%、或者至少约84%、或者至少约85%、或者至少约86%、或者至少约87%、或者至少约88%、或者至少约89%、或者至少约90%、或者至少约91%、或者至少约92%、或者至少约93%、或者至少约94%、或者至少约95%、或者至少约96%、或者至少约97%、或者至少约98%、或者至少约99%的氨基酸相似时,两条氨基酸序列是“同源的”。优选,通过使用Needleman和Wunsch算法鉴定相似或同源的多肽序列。
优选地,AGT酶的同源序列与SEQ ID NO:1分享至少64%的氨基酸序列同一性,优选至少约65%的氨基酸序列同一性、或者至少约66%的氨基酸序列同一性、或者至少约67%的氨基酸序列同一性、或者至少约68%的氨基酸序列同一性、或者至少约69%的氨基酸序列同一性、或者至少约70%的氨基酸序列同一性、或者至少约71%的氨基酸序列同一性、或者至少约72%的氨基酸序列同一性、或者至少约73%的氨基酸序列同一性、或者至少约74%的氨基酸序列同一性、或者至少约75%的氨基酸序列同一性、或者至少约76%的氨基酸序列同一性、或者至少约77%的氨基酸序列同一性、或者至少约78%的氨基酸序列同一性、或者至少约79%的氨基酸序列同一性、或者至少是80%的氨基酸序列同一性、或者至少约81%的氨基酸序列同一性、或者至少约82%的氨基酸序列同一性、或者至少约83%的氨基酸序列同一性、或者至少约84%的氨基酸序列同一性、或者至少约85%的氨基酸序列同一性、或者至少约86%的氨基酸序列同一性、或者至少约87%的氨基酸序列同一性、或者至少约88%的氨基酸序列同一性、或者至少约89%的氨基酸序列同一性、或者至少约90%的氨基酸序列同一性、或者至少约91%的氨基酸序列同一性、或者至少约92%的氨基酸序列同一性、或者至少约93%的氨基酸序列同一性、或者至少约94%的氨基酸序列同一性、或者至少约95%的氨基酸序列同一性、或者至少约96%的氨基酸序列同一性、或者至少约97%的氨基酸序列同一性、或者至少约98%的氨基酸序列同一性以及或者至少约99%的氨基酸序列同一性。在优选的实施方案中,SEQ ID NO:1的同源序列与SEQ ID NO:1至少64%,优选70%,以及更优选80%相同。
在优选的实施方案中,所述同源多肽是SEQ ID NO:1的hAGT多肽的片段或突变体,所述片段或突变体具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
所述片段可具有至少50种,优选100种,以及更优选150种氨基酸的尺寸,并且至少包含如上定义的AGT多肽的“催化结构域”,其负责AGT酶的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。这些片段可使用技术人员已知的一般技术获得。
到目前为止,已经描述了源自天然AGT的不同突变酶(Lim A.等人,1996;Daniels D.S.等人,2000;Juillerat A.等人,2003、WO 2005/085470、WO 2004/031405)。尤其是,获得了含有突变Cys62Ala、Lys125Ala、Ala127Thr、Arg128Ala、Gly131Lys、Gly132Thr、Met134Leu、Arg135Ser、Cys150Ser、Asn157Gly、Ser159Glu、在182位氨基酸被截短的20kDa的突变蛋白(WO 2005/085470中所谓的“AGT26”突变体,在WO 2006/114409中也称为“SNAP 26”)。这种特定突变体“SNAP26”已被证明具有增强的标记活性。
在本发明的上下文中,更优选的AGT多肽序列包含WO 2005/085470中描述的突变,其位置相对于SEQ ID NO:1可以很容易地调换,SNAP26的起始蛋氨酸残基对应于SEQ ID NO:1第32位的蛋氨酸残基(因此,31个氨基酸应加入到WO 2005/085470所公开的位置中,从而获得SEQ ID NO:1中对应的那些)。
在优选的实施方案中,用于本发明的AGT同源序列对应着SEQ ID NO:1的天然AGT序列,其中在1和30个之间,优选6和25个之间,以及特别是14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸被其它氨基酸所取代,和/或在C-端1至40个,优选1至20个,特别是10至20个氨基酸,更优选15个氨基酸被删除。
在更优选的实施方案中,与SEQ ID NO:1相比,AGT同源序列包含以下突变:
(A)Lys31取代为Arg、或Met32取代为Ser、或Cys93取代为Ala、或Lys156取代为Ala、或Ala158取代为Thr、或Arg159取代为Ala、或Gly162取代为Lys、或Gly163取代为Thr、或Met165取代为Leu、或Arg166取代为Ser、或Cys181取代为Ser、或Asn188取代为Gly、或Ser190取代为Glu、或Gly214取代为Pro、或Ser215取代为Ala、或Ser216取代为Gly、或Gly217取代为Ile、或Leu218取代为Gly、或Gly220取代为Pro、或Ala221取代为Gly、或Trp222取代为Ser,或
(B)Lys31-Met32取代为Arg-Ser、或Ala158-Arg159取代为Thr-Ala、或Gly162-Gly163取代为Lys-Thr、或Met165-Arg166取代为Leu-Ser、或Gly162-Gly163/Met165-Arg166取代为Lys-Thr/Leu-Ser、或Asn188/Ser190取代为Gly/Glu、或Gly214-Ser215-Ser216-Gly217-Leu218取代为Pro-Ala-Gly-Ile-Gly、或Gly220-Ala221-Trp222取代为Pro-Gly-Ser,优选与(A)中描述的任何其它氨基酸取代相组合,或
(C)在Leu223后截断(氨基酸224-238被删除),优选与(A)或(B)中描述的任何其它氨基酸取代相组合。
优选的AGT同源序列是在Leu223后被截断的那些。
优选的AGT同源序列是在其中存在修饰(B)中的2个的那些,以及任选在Leu223后截断。
优选的AGT同源序列是在其中存在修饰(B)中的3个的那些,以及任选在Leu223后截断。
优选的AGT同源序列是在其中出现修饰(B)中的4个的那些,以及任选在Leu223后截断。
优选的AGT同源序列是在其中存在修饰(B)中的5个的那些,以及任选在Leu223后截断。
优选的AGT同源序列是在其中存在修饰(B)中的6个的那些,以及任选在Leu223后截断。
其它优选的AGT同源序列是含有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个选自(A)中公开的修饰的突变的组合的那些,以及任选在Leu223后截断。
在一个非常更优选的实施方案中,本发明的AGT多肽是SEQ ID NO:2的SNAP突变体,其与hAGT酶同源并且与SEQ ID NO:1相比含有突变Lys31Arg、Met32Ser、Cys93Ala、Lys156Ala、Ala158Thr、Arg159Ala、Gly162Lys、Gly163Thr、Met165Leu、Arg166Ser、Cys181Ser、Asn188Gly、Ser190Glu、Gly214Pro、Ser215Ala、Ser216Gly、Gly217Ile、Leu218Gly、Gly220Pro、Ala221Gly、Trp222Ser、以及在Leu223后截断。SEQ ID NO:2的SNAP突变体与人6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(NP_002403.2,SEQ ID NO:1)的氨基酸序列共享77%的同源性,并且与小鼠6-甲基鸟嘌呤-DNA-甲基转移酶(NP_032624.1,SEQ ID NO:18)的氨基酸序列共享70%的同源性。
在甚至更优选的实施方案中,AGT酶是SEQ ID NO:2的具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的SNAP突变蛋白或其同源物。优选地,所述SNAP突变蛋白的同源序列与序列SEQ ID NO:2的SNAP突变蛋白是至少高于80%、优选81%、更优选82%、更优选83%、更优选84%、更优选85%、优选86%、更优选87%、更优选88%、更优选89%、更优选90%、更优选91%、更优选92%、更优选93%、更优选94%、更优选95%、更优选96%到甚至更优选97%相同,并且具有如上定义的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性。
可以使用技术人员已知的蛋白工程技术、和/或使用分子进化来产生所述具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的同源多肽,以产生和选择新的O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶。这种技术是,例如靶向诱变、噬菌体展示法、饱和诱变、易错PCR以在序列的任何地方引入变化,在饱和诱变和/或易错PCR后使用的DNA改组(shuffling)、或者使用来自几个物种的基因进行的家族改组。
在最优选的实施方案中,在本发明方法中使用的AGT多肽是SEQ ID NO:2的SNAP突变体。
AGT酶从其底物O6-烷基鸟嘌呤-DNA上将烷基不可逆地转移至其半胱氨酸残基之一上。然而,在苄基环C4上的O6-苄基鸟嘌呤的取代并不显著影响AGT对O6-苄基鸟嘌呤衍生物的反应性。这种性质已用来将附在苄基环C4上的标记转移至AGT的苄基环(参见WO 2004/031404和WO 2005/085470)。
已证明一些O6-苄基鸟嘌呤衍生物通过将其苄基转移至AGT酶的活性位点半胱氨酸上来与AGT酶反应(参见Damoiseaux等人,ChemBiochem.,2001、WO2004/031404和WO 2005/085470)。
在优选的实施方案中,在本发明方法中使用的AGT底物是O6苄基鸟嘌呤衍生物,其具有式I:
R1-X-CH2-R3-R4-Y
其中:
-R1是被所述AGT多肽作为底物识别的基团,例如含有1至5个氮原子的杂芳基团,以及优选如下式的嘌呤自由基:
其中R5是氢、卤素如氯或溴、三氟甲基、或羟基;R6为氢、羟基、或未取代的或取代的氨基;以及R2是氢、1至10个碳原子的烷基、或糖部分;
-X是氧或硫原子;优选为氧原子;
-R3是芳香或杂芳基团,或任选地用连接至CH2的双键所取代的不饱和烷基、环烷基或杂环基团;优选苯基,例如由在对位或间位的R4所取代的苯基;
-R4是接头部分;
-Y是反应性基团,优选为氨基。
在优选的实施方案中,所述接头部分R4是柔性接头。根据所预期的应用背景来选择接头单元,即把底物转移至含AGT的融合蛋白。接头不干扰与AGT或与靶抗体的反应。
例如,其可以是具有1至20个碳原子、优选5至15个碳原子的直链或支链亚烷基,其中:
(a)一个或多个碳原子被氧取代,特别地其中每第三个碳原子被氧取代,例如,具有1至5个乙烯氧基(ethyleneoxy)单元的聚乙烯氧基;
(b)一个或多个碳原子被携带氢原子的氮取代,并且相邻的碳原子被代表酰胺官能团-NH-CO-的oxo取代;
(c)一个或多个碳原子被氧取代,并且相邻的碳原子被代表酯官能团-O-CO-的oxo取代;
(d)两个相邻碳原子之间的键为双键或三键,代表官能团-CH=CH-或-C≡C-;
(e)一个或多个碳原子被亚苯基、饱和或不饱和的环亚烷基、饱和或不饱和的双环亚烷基、桥连的杂芳基团或桥连饱和或不饱和的杂环基所取代;
(f)两个相邻的碳原子被二硫键-S-S-所取代;或者如上文(a)至(f)所定义的两个或更多、尤其是两个或三个亚烷基和/或修饰的亚烷基基团的组合所取代,任选地含有取代。
可考虑的取代是,例如低级烷基如甲基、低级烷氧基如甲氧基、低级酰氧基如乙酰氧基、或卤代基(halogenyl)如氯。
在优选的实施方案中,R4是具有1至8个乙烯氧基单元的聚乙烯氧基,还包括:一至四个携带氢原子的氮原子,其相邻的碳原子被代表酰胺官能团-NH-CO-的oxo所取代。
在更优选的实施方案中,R4是-CH2-NH-CO-NH-[C2H4-O]n-,其中n包含在1至8之间,优选为2至6之间,以及最优选为3。
在优选的实施方案中,所述反应性基团是有利于底物在固体支持物上附着和结合的官能团。这样的官能团是本领域众所周知的。其包括胺、活化的酯、丙烯酰胺、酰叠氮、酰卤、酰基腈、醛、酮、烷基卤、酸酐、芳基卤、氮丙啶、硼酸酯/盐、活性羧酸(carnoxylic acid)、碳二亚胺、重氮烷、环氧化物、卤代乙酰胺、卤代铂酸酯/盐(haloplatinate)、卤代三嗪(halotriazine)、酰亚氨基酯、异氰酸酯/盐、异硫氰酸酯/盐、马来酰亚胺、亚磷酰胺、solyl卤化物、磺酸酯和磺酰卤。优选为胺基-NH2。
相反,固体支持物应被互补基团官能化以对应这样的反应性基团。与这些反应性基团的每一个相对应的互补基团是本领域公知的。其在例如WO 2010/107433的表I中给出。
在优选的实施方案中,在本发明的方法中使用的AGT底物是:
在另一优选的实施方案中,在本发明的方法中使用的AGT底物是荧光接头指定的“SNAP细胞505”,其具有以下的式:
这种苄基鸟嘌呤衍生物具有一个苄基嘌呤基团(鸟嘌呤)用于与SNAP结构域特异性地相互作用,以及一个游离胺基用于共价偶联到微球表面。其由NewEngland BioLaps进行商业化,并已成功地偶联到本发明微粒的表面。
本发明的底物一般由本领域已知的标准方法制备。具体方法解释在,例如专利申请WO2005/085470中。
本发明的方法要求AGT底物共价偶联到固体支持物上。在本发明上下文中,如果AGT底物永久地附着在固体支持物上,则其被“共价偶联”至所述固体支持物,并且将不会随时间释出(desorb)或滤出。根据本发明,如果AGT底物在长时间储存(例如在通常至少6个月储存)中保持附着,则其永久地附着在所述固体支持物上。目前为止,一些偶联方法得以描述。只要所述AGT底物永久地附着于固体支持物,可以在本发明的免疫分析中使用任何这些偶联方法。
在本发明的免疫分析中,优选地通过使AGT底物(含有反应性基团Y,如上所述)接触固体支持物来进行共价偶联,所述固体支持物之前已使用互补基团(例如WO2010/107433的表I中公开的那些)官能化,其公开通过参考并入本文中。
因此,在优选的实施方案中,本发明方法使用固体支持物,其在接触AGT底物之前已使用与AGT底物的反应基团互补的基团进行官能化。
用于将AGT底物共价偶联至固体支持物表面的优选和常规的方法是基于碳二亚胺反应并使用水溶性碳二亚胺。根据此方法,固体支持物具有可用于附着反应胺或含巯基的AGT底物的表面羧基基团。因此,在此优选的实施方案中,本发明的方法使用固体支持物,其在与AGT底物接触之前已使用表面羧基基团进行官能化。
在这种情况下,本发明方法的第一步是活化包被固体支持物的羧基。通常通过加入所谓“活化缓冲液”,例如50mg/mL EDAC溶液或50mg/mL的S-NHS溶液来进行这种活化。这些溶液是商业上可获得的。根据制造商的说明书,通常通过在室温下用活化缓冲液孵育所述支持物几分钟(例如,5分钟到30分钟)进行固体支持物的活化。
重要的是,将AGT底物共价偶联至固体支持物必须在特定条件下进行,以便保持AGT底物的溶解性和珠(内部荧光染料)的完整性。本发明人已经观察到,AGT底物应当悬浮在含有0和20%之间的二甲基亚砜(DMSO)的“共价偶联”缓冲液中。特别是,本发明人已观察到20%以上的DMSO浓度可影响本发明方法的检测步骤。优选地,所述缓冲液是含有0和20%之间的DMSO,更优选为10%和20%之间的DMSO的PBS缓冲液。
有利地,在固体支持物上的没有共价附着至AGT底物的非特异性位点可以进一步通过任何常规方法进行封闭,例如通过使用含有1%的牛血清白蛋白(BSA)或任何饱和蛋白(如,酪蛋白)的封闭缓冲液。
如果本发明的固体支持物已与AGT底物(优选通过碳二亚胺共价键)共价偶联,则随后使所述固体支持物接触本发明的融合蛋白,以便将由靶抗体特异性识别的表位偶联至所述支持物。
再次,此偶联步骤必须在特定的条件下进行。事实上,融合蛋白带有的AGT酶催化位点和抗原/表位的构象结构在偶联过程中必须是保守的。本发明人认为融合蛋白应悬浮在含二硫苏糖醇(DTT)的缓冲液,优选PBS/DTT缓冲液中以使得有效偶联。有利地,所述偶联缓冲液含有吐温20;实际上,本发明人已观察到向偶联介质添加吐温20有助于避免珠凝聚。优选地,偶联缓冲液含有0.02%的吐温20。更优选地,本发明的共价偶联缓冲液是pH7.4的、含有0.02%吐温20和1mMDTT的PBS缓冲液。
其它偶联条件是常见的。优选地,在室温下进行AGT底物的共价偶联以及融合蛋白与固体支持物的偶联。如果固体支持物是荧光标记的,更优选在黑暗中进行所述过程。
在第二方面,本发明因而涉及在官能化的固体支持物上用于共价偶联具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a)活化所述官能化的固体支持物;
b)加入所述AGT多肽的底物,所述底物悬浮于含有0和20%之间的DMSO的缓冲液中,在适当条件下以使得底物共价附着于所述支持物;
c)在PBS/DTT缓冲液中,使所述AGT多肽接触步骤b)的底物包被的支持物,
其中未结合的分子在步骤b)和c)后被洗脱。
洗涤可以通过使用任何类型的合适洗涤缓冲液进行。这种缓冲液是本领域技术人员常规使用的,不需在此进一步详细说明。优选地,使用PBS缓冲液。
如本文所用,“合适的条件”是常见的。优选地,所述AGT底物的共价偶联在室温下进行,并且如果固体支持物是荧光标记的则在黑暗中进行。
固体支持物的官能化可通过任何常规方法进行(如上述提醒的那些)。相应进行所述官能化固体支持物的活化。在优选的实施方案中,使用表面羧基来官能化所述固体支持物,并且使用经典活化缓冲液,例如50mg/mL的EDAC溶液、或50mg/mL的S-NHS溶液来进一步活化。
在优选的实施方案中,在PBS/DTT缓冲液中DTT浓度是1mM。
本发明还涉及已经通过所述方法获得的固体支持物,以及所述固体支持物在本发明免疫分析中的用途。
然后,所述固体支持物可储存在常规的储存缓冲液中,例如含有0.5g/L的叠氮化钠、0.1%BSA、0.02%吐温20和/或1mM DTT。
所有这些偶联步骤优选在体外、在缺乏活细胞的缓冲液中进行,以便无须考虑与内源AGT酶的反应,因此(外源)AGT融合蛋白的反应是高度特异性的。
可在本发明方法中使用的固体支持物可以是任何种类的,例如试管、微量滴定孔、片、珠、芯片和/或微粒,只要它们可以特异性地相互鉴别。例如当它们在空间中被分开定位(例如,在微量滴定板的孔中、或在芯片上的不同位置)或者当它们被不同标记时,这种鉴别是可能的。因此,“固体支持物”必须在广意上理解,即指定整个固体支持物(在板或生物芯片的情况下)的离散小部件、或者享有共同可检测特征的大量相同微粒(以下称为微粒“子集”)。
在优选的实施方案中,本发明使用的固体支持物可通过其特殊定位、尺寸、直径、重量、粒度和/或标记来特异性鉴定出。这样的标记是,例如荧光染料、荧光团、生色团、放射性同位素、质量标签,或本领域已知的任何种类的可检测标签。
在本发明中使用的固体支持物可以用任何材料,例如聚苯乙烯、纤维素、硝基纤维素、玻璃、陶瓷、树脂、橡胶、塑料、二氧化硅、硅树脂、金属、和/或聚合物中制成。聚合材料包括溴化聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚丙烯腈、聚酰胺、聚丙烯酰胺、聚丙烯醛、聚丁二烯、聚己内酯、聚碳酸酯、聚酯、聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚二甲基硅氧烷、聚异戊二烯、聚氨酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡啶、聚乙烯基氯苄、聚乙烯基甲苯、聚偏氯乙烯、聚二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯、聚丙交酯、聚乙交酯、聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚酐、聚原酸酯、聚磷腈、polyphosphaze、聚砜、或其组合,也可以接受。这些支持物的大多数的是商业上可获得的。例如,来自合成聚合物(如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸酯、或乳胶)的珠商业上可获自许多来源,例如Bio-Rad Laboratories(Richmond,Calif)和LKB Produkter(Stockholm,瑞典)。从天然大分子和颗粒(例如琼脂糖、交联琼脂糖、球蛋白、脱氧核糖核酸和脂质体)形成的珠商业上可获得自来源,例如Bio-Rad Laboratories,Pharmacia(Piscataway,NJ)和IBF(法国)。从聚丙烯酰胺和琼脂糖的共聚物形成的珠商业上可获得自诸如IBF和Pharmacia的来源。
当使用聚合支持物时,通过将含有这种基团的单体并入聚合物(例如,丙烯酸、甲基丙烯酸、衣康酸等)上,将羧基加到固体支持物的表面。或者,如已经描述的,通过具有可转化为羧基的其它前体反应性基团(例如,通过水解酸酐如马来酸酐、或通过氧化表面羟甲基或醛末端基团)的聚合物的进一步化学反应可将其加至支持物上。
在优选的实施方案中,本发明中使用的固体支持物是微粒。所述微粒优选地具有小于1毫米的直径,优选的直径范围从约0.1至约1,000微米(μm)。即使微粒可以是任何尺寸的,优选的尺寸为1-100μm,更优选2-50μm,更优选3-25μm,以及甚至更优选约6-12μm。微粒由任何规则形状的材料制成。优选的形状为球形;然而,因为此参数对本发明的性质无关紧要,所以可以采用任何其它形状的颗粒。颗粒的形状可以作为附加的区分参数,其可以通过流式细胞术区分,例如通过高分辨率的狭缝扫描方法。
下文所用的术语“微粒”、“微球”或“微珠”可互换使用并具有等同含义,因为其指的是总直径基本落在微米范围内的小颗粒。术语“纳米球”、“纳米颗粒”或“纳米珠”指的是总尺寸基本落在纳米范围内的更小颗粒。如下文所用,通用术语的颗粒、球或“珠”指微粒和纳米颗粒两者,其在本发明的方法中可有效地用作固体支持物。
在本发明的上下文中,微粒的“子集”对应于许多具有相同特征并被相同表位所包被的一致微粒。重要地,微粒的每个子集应通过至少一个特征(例如,位置、尺寸、直径、重量、粒度和/或标签)来区别于群体的其它子集。
在优选的实施方案中,微粒的不同子集因其是不同标记的而可以被区分开(例如,使用荧光染料、荧光团、生色团、放射性同位素、质量标签、或者任何种类的本领域已知的可检测标签)。
在更优选的实施方案中,如US5,736,330、US5,981,180、US6,057,107、US6,268,222、US6,449,562、US6,514,295、US6,524,793和US6,528,165所述,微粒的不同子集因其是不同荧光标记的而可以被区分开。更确切地说,这些不同子集可以用不同荧光染料、和/或不同浓度的一种或多种荧光染料进行染色。因此,不同的子集可有不同的荧光签名(例如,不同的荧光波长、不同的荧光强度等),荧光签名可被测量并通过测量***来用以确定个体微粒所属于的子集(即,根据子集对微粒进行分类)。
在优选的实施方案中,如EP 1 204 869所述,在本发明中使用的微粒用荧光染料进行内部标记。
这些微粒也可合并磁体或磁响应金属氧化物,其选自超顺磁性、顺磁性和铁磁性金属氧化物。例如,磁珠商业上可获得自来源,例如Dynal Inc(Great Neck,NY),或可使用本领域已知方法制备,例如在US4,358,388、US4,654,267、US4,774,265、US5,320,944、和US5,356,713中所公开。因此在优选的实施方案中,本发明使用的固体支持物具有磁性。
在更优选的实施方案中,本发明使用的固体支持物是用荧光染料进行内部标记的具有磁性的微粒,其封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被中以便共价偶联配体,例如由Luminex公司以商标名MagPlex销售的那些。
也可能使用MicroPlex微球(由Luminex出售),其是已被颜色编码为光谱不同区的羧化聚苯乙烯微粒。这些区可以通过xMAP设备快速区分,所述设备允许同时讯问来自一个单一样本容积的多达100种不同分析物。
也可能使用SeroMAP微球(由Luminex出售),其是MicroPlex微球的特殊形式(formulation),其已被优化以减少在血清学分析中的非特异性结合。
本发明方法的最后步骤在于检测结合至表位并因此结合至可检测的固体支持物的抗体的存在。通过分析抗体结合至微粒的哪种子集,可以很容易地推断哪种抗体存在于生物样本中,并因此测试的受试者被哪种病原所感染。
任何已知技术可用于检测结合固体支持物的抗体的存在。例如,如以下实验部分所示,可以使用特异性识别受试免疫球蛋白恒定部分的标记的第二抗体。要注意的是,检测抗体的标记应与固体支持物上的标记不同,以便在偶联至抗体的固体支持物和未偶联至抗体的固体支持物之间做出区分。
可替代地,使用一步抗体标记操作规程(Lightning-LinkTM R-藻红蛋白缀合试剂盒-Innova Biosciences),可将感染动物或人的血清中存在的免疫球蛋白直接缀合至R-藻红蛋白(R-PE)。整个过程的操作时间通常是20-30秒,并允许以100%回收率标记少量免疫球蛋白。这种方法消除了在多重免疫分析实验中对二级试剂的需求,如缀合的抗物种抗体和链霉亲和素-R-藻红蛋白。
当使用内部标记荧光染料的微粒时,所述荧光检测设备应配有用于检测微球类型的第一激光器、和第二激光器,其通过激发缀合至特异检测抗体的荧光团以确保定量所捕获的IgM或IgG。
凭借其广泛的多重化能力和更低的检测限,这种方法提供了比传统的ELISA测量更实质性的成本和样本节约。此外,选择的微球集适用于可负担的、紧凑以及稳健的荧光检测***,如MagPix(Luminex公司)。
在本实施方案中,通过使用流式分析工具,本发明的方法使得能够同时分析每孔多达100种类型的偶联微球,并提供极大提高的灵敏度,其预计将成为比目前使用的***和方法大几个数量级的量级。
有趣的是,本发明的方法能够进行高通量血清学筛选以诊断在个体(人或动物)中的多重感染。
在第三方面,本发明提供适用于根据本发明方法的抗体检测的试剂盒。
所述试剂盒包含至少两种如上述所定义的固体支持物,更确切的:
-如本发明方法步骤(c)中获得的第一固体支持物,所述支持物共价偶联至第一靶抗体所识别的第一表位,以及
-如本发明方法步骤(f)中获得的第二固体支持物,所述支持物共价偶联至第二靶抗体、而不是所述第一靶抗体所识别的第二表位,
其中所述至少两种固体支持物可以特异性地彼此鉴定以便能够检测两种不同靶抗体。
在其它方面,本发明涉及用于在生物样本中检测至少两种靶抗体的试剂盒,其包括:
(a)第一固体支持物,其包括共价偶联至第一融合蛋白的AGT底物,所述第一融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗体识别第一表位;以及
b)第二固体支持物,其包含共价偶联至第二融合蛋白的AGT底物,所述第二融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗体、而不是由第一靶抗体识别的第二表位。
在一个优选的实施方案中,所述第一和/或第二表位存在于病毒蛋白中,病毒蛋白选自:SEQ ID NO:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID NO:4的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID NO:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID NO:6的登革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID NO:7的西尼罗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:8的黄热病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:9的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:10的寨卡病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:11的威塞尔布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ IDNO:12的罗西奥病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:13的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO:14的圣路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:56编码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:57编码的基因型5的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ IDNO:58编码的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒的病毒蛋白以及致癌HPV株例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
优选地,此试剂盒还包含检测结合到固支持物的至少两种靶抗体的工具(means)。所述工具更优选地是识别靶抗体的恒定部分的第二抗体。所述第二抗体可被标记,只要所述标记与存在于固体支持物上的那些不同。然而,对用于检测结合到固体支持物的抗体的所有第二抗体也可能使用相同的标记,由于涉及传染性病原体的信息仅由鉴定结合至抗体的固体支持物所给出。
本发明的试剂盒可以包含被接受作为标准试剂的其它成分,如洗涤缓冲液、必要的塑料制品等。
在优选的实施方案中,本发明的试剂盒包括至少10种,优选至少50种,更优选至少100种不同的偶联固体支持物,所述固体支持物是例如如上述定义的微粒的子集。
在更优选的实施方案中,所述固体支持物是微球,例如用荧光染料进行内部标记的具有磁性的那些,其封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被中。
在另一优选的实施方案中,在本发明的试剂盒中,所述固体支持物在至少一个单区室中混合在一起。
有利地,本发明的试剂盒含有常规支持物,例如,含有上述定义的不同抗原包被的微粒子集的微量滴定板。在一个优选的实施方案中,所述微粒子集在至少一个单区室(例如,孔或管)中混合在一起。这样的装置公开于图11。
本发明的试剂盒也可包含含有抗原包被微粒的所述子集的容器(例如,管)。
本发明还靶向本发明的试剂盒用于在来自受试者的生物样本中检测至少2个,优选至少10个,更优选至少50,以及甚至更优选至少100个靶抗体的用途。
在优选的实施方案中,本发明的试剂盒用于检测至少2个,优选至少10个,以及更优选至少20个靶抗体,其通过相同地理区域的流行病毒或寄生虫感染而产生。例如,本发明的试剂盒可包含微粒,微粒被非洲区特异的病毒或寄生虫的抗原所包被,所述病毒或寄生虫例如登格病毒1型、2型、3型、4型、黄热病毒、西尼罗病毒、乌苏图病毒、寨卡病毒、威塞尔布朗病毒、沙门达(Shamonda)病毒、裂谷热病毒、基孔肯雅病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、埃博拉病毒、马尔堡病毒、拉沙病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、肠病毒71、恶性疟原虫、或问号钩端螺旋体。
下表1中公开抗原偶联的微球组合的实例,取决于其意欲用在的地理区域(亚洲、欧洲、美洲、大洋洲、或非洲),其可以包括在本发明的试剂盒中。
本发明的试剂盒可以可选地包括抗原偶联的微球,其使得能够诊断诱导特定症状(流感样、脑炎或出血热)或感染特定动物的病毒或寄生虫,这样其可适应于每个患者/动物。
下表1中公开抗原偶联的微球组合的实例,取决于患者或动物的症状,其可以包括在本发明的试剂盒中。
最后,在本发明中显然还包括试剂盒,试剂盒包含由国家卫生机构所提出的抗原组合。
具体地,本发明的试剂盒包括由至少两种融合蛋白所包被的至少两种固体支持物,所述至少两种融合蛋白选自:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ IDNO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ IDNO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149以及SEQ ID NO:151。
在一个优选的实施方案中,本发明的试剂盒包含至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20种被所述融合蛋白包被的固体支持物的组合。
在一个更优选的实施方案中,本发明的试剂盒包含被至少5种不同融合蛋白所包被的至少5种固体支持物的组合(例如,微球子集),所述融合蛋白含有美国食品药品管理局推荐的抗原,即来自HBV、HCV、HIV1、HIV2和西尼罗病毒的抗原。
表1:包括在本发明试剂盒中的抗原偶联微球的有利组合
在另一方面,本发明涉及制造如上定义的本发明试剂盒的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)至少提供第一融合蛋白,其包含:
-含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物;
(d)至少提供第二融合蛋白,其包括
-含有第二表位的多肽,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(f)获得与第二表位共价偶联的第二固体支持物,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体识别,
其中所述至少第一和至少第二固体支持物可彼此特异性地鉴定出;
本发明的试剂盒包含至少所述第一和第二支持物。
在另一方面,本发明涉及包含至少2、25、50、96种如上定义的固体支持物的多重免疫筛选分析,并且其中每种所述固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长。
在另一方面,本发明涉及多重免疫筛选分析方法,所述方法包括:
a)使一种或几种生物样本接触至少2、25、50、96种如上定义的固体支持物,并且其中每种固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长,以及
b)检测靶抗体的存在或不存在。
在优选的实施方案中,所述靶抗体对来自病毒的抗原是特异的,所述病毒根据WHO或FDA的指南为在血液库中待检测的,比如例如选自HBV、HCV、HIV1、HIV2和WNV的病毒。
在另一优选的实施方案中,所述靶抗体特异于致癌HPV株,例如HPV 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68。
在另一优选的实施方案中,每种所述靶抗体使用可检测标记进行标记。
在另一方面,本发明涉及用于实施上述定义的制造本发明试剂盒的方法的设备,所述设备包括技术装置,其用于检测从固体支持物发射的光源和从靶抗体或结合到靶抗体的标记抗体所发射的光源,以及包括计算或计算机装置,其用于鉴定哪种固体支持物与靶抗体结合,从而说明在分析样本中抗原、细菌、病毒或寄生虫存在或不存在。
在另一个方面,本发明涉及用于诊断受试者中至少一种靶疾病的体外方法,所述靶疾病已知在所述受试者中诱导至少一种靶抗体的合成,所述体外方法包括进行本发明的免疫分析,其中如果所述至少一种靶抗体的量高于对照值,则所述受试者被诊断为患有所述至少一种靶疾病。
这种诊断方法优选地能够诊断需要其的受试者中2种,优选3种,以及更优选4种靶疾病。然而,这个数字不是限制性的:只要使用本发明的检测方法能够检测多达100种不同抗体,的确就能够诊断多达100种靶疾病。
在优选的实施方案中,所述至少一种靶疾病是病毒、细菌、酵母或真菌介导的感染,优选由***瘤病毒或来自黄病毒科(登革、黄热、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(拉沙)或丝状病毒科(埃博拉、马尔堡)的RNA病毒所引起的病毒感染;由问号钩端螺旋体引起的细菌感染;或者由恶性疟原虫引起的感染。
在优选的实施方案中,所述体外方法用于诊断所述受试者中至少5种,更优选至少15种,更优选至少50种,以及甚至更优选至少100种病毒和/或细菌和/或寄生虫感染。
在优选的实施方案中,在所述方法中使用的对照值表示来自受试者的样本中所述靶抗体的量,所述受试者没有患所述靶疾病,优选地,健康受试者。
本发明的方法可用于诊断在动物中的感染。
具体地,其可以用于动物疾病的诊断,以及DIVA(区分感染的动物和接种疫苗的动物)方法以便从接种疫苗的动物中区分出天然感染的动物。使用DIVA策略来补偿新型疫苗将允许疫苗接种的实施作为传统策略平行的靶对照策略(测试、屠宰及肉类检验)。此外,通过减少了可不必屠宰的假阳性动物的数量,增加的测试特异性将具有重大的经济利益。最后,改进的灵敏度,特别是当使用新型诊断分析时,在减少疾病控制甚至在没有接种疫苗时的经济负担中将具有进一步的益处。
在一个优选的实施方案中,本发明的方法应用到人类个体。
最后,本发明涉及本发明的试剂盒用于诊断受试者中至少两种靶疾病的用途,其中所述靶疾病是由***瘤病毒或来自黄病毒科(登革、黄热、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(拉沙)或丝状病毒科(埃博拉、马尔堡)的RNA病毒所引起的病毒感染;由问号钩端螺旋体引起的细菌感染;或者由恶性疟原虫引起的感染。
新出现的虫媒病毒最近被测序,并影响在德国、比荷卢经济联盟(Benelux)和法国的牛。此病毒称为施马伦贝格病毒(SBV),并涉及属于本雅病毒科的正本雅病毒属(Orthobunyavirus)的西姆布(Simbu)血清群的赤羽(Akabane)病毒。所述施马伦贝格病毒的病毒基因组中包含称为S、L和M的3个单链RNA段。S段编码N核蛋白和NSs非结构蛋白。N核蛋白具有与本雅病毒不同的抗原决定簇。施马伦贝格病毒的BH80/11-4株的3种RNA病毒序列可获得于编号HE649913.1、HE649914.1和HE649912.1。
本发明人观察到作为6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)与SBV N蛋白的嵌合蛋白的融合极大地改善重组N蛋白的生产,特别是在无脊椎动物细胞,如S2细胞中。
此处本发明人首次提出使用AGT酶(EC 2.1.1.63)、其突变体、其催化结构域或其子片段,用于增强N核蛋白在宿主细胞、特别是在非脊椎动物细胞的SBV中的生产。当宿主细胞表达融合多肽时,融合多肽包括至少i)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽、ii)AGT酶、其突变体、催化结构域或子片段、和iii)SBV的N核蛋白,观察到增强效果。为了使增强效果发生,AGT酶直接或间接地(可引入间隔序列及其它氨基酸)物理连接至目的蛋白。不受理论约束,可设想AGT酶可以作为伴侣蛋白,例如通过促进从宿主细胞的分泌以及在宿主细胞上清中稳定合成的融合多肽,或防止从宿主细胞合成和分泌的过程中和之后被代谢掉。此外,已经观察到,AGT具有包括α螺旋的3D球状结构(Wibley J.E.A等人,2000),其和AGT的支架作用相兼容。
在本发明的上下文中,“宿主”细胞是可用于生产重组蛋白的任何细胞,如“非脊椎动物”(或无脊椎动物)细胞、脊椎动物细胞、植物细胞、酵母细胞或原核细胞。优选地,其是非脊椎动物和脊椎动物细胞。
非脊椎动物(也称为无脊椎动物)包括不同的门,最熟知的是昆虫(Insect)、蛛形纲(Arachnida)、甲壳纲(Crustacea)、软体动物门(Mollusca)、环节动物门(Annelida)、蔓足纲(Cirripedia)、放射虫纲(Radiata)、腔肠动物门(Coelenterata)和纤毛虫纲(Infusoria)。它们现在被分为超过30个门,从简单的生物体如海绵和扁形虫到复杂的动物如节肢动物和软体动物。在本发明的上下文中,非脊椎动物细胞优选是昆虫细胞,如果蝇或蚊子细胞,更优选为果蝇S2细胞。
用作宿主细胞系的源自脊椎动物生物体的细胞实例包括非人类胚胎干细胞或其衍生物,例如禽EBX细胞;由SV40序列转化的猴肾CVI系(COS-7,ATCC CRL1651);人胚胎肾系(293);幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞(CHO);小鼠支持细胞[TM4];猴肾细胞(CVI,ATCC CCL 70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,ATCC CRL-1587);人***细胞(HeLa,ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34);布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCCCRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL 75);人肝细胞(Hep G2,HB 8065);小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562,ATCC CCL51);大鼠肝癌细胞[HTC,Ml.5];YB2/O(ATCC n℃RL1662);NIH3T3;HEK和TRI细胞。在本发明的上下文中,脊椎动物细胞优选是EBX、CHO、YB2/O、COS、HEK、NIH3T3细胞或其衍生物。
在本发明的上下文中,可用的植物细胞是烟草栽培品种嫩黄2(Bright Yellow)(BY2)和红花烟草1(Nicotiana tabaccum)(NT-1)。
在本发明的上下文中可用的酵母细胞是:酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、***酵母(Schizosaccharomyces pombe)和多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha),以及甲醇营养型酵母(methylotropic yeast)如毕赤酵母(Pichiapastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。
在本发明的上下文中,可用的原核生物细胞通常是大肠杆菌细菌或枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细菌。
因此在另一方面,本发明涉及用于从宿主细胞的SBV表达N核蛋白(SBV.N)的载体,其包括编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;和b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)SEQ ID NO:16的SBV的N核蛋白。
来自SBV的N核蛋白在下文中将被称为“异源蛋白”、“目的蛋白”、“嵌合蛋白”、或“重组蛋白”。
术语“载体”此处意为,外源基因的DNA或RNA序列借此可以引入宿主细胞中从而转化和促进所引入的序列表达的媒介物。如本文所理解,载体是核酸分子,例如,如质粒、噬菌体、和病毒。其在下文进一步详述。任何类型的质粒、粘粒、YAC或病毒载体可用于制备重组核酸构建体,其可被引入需要目的蛋白表达的宿主细胞中。当需要在特定类型的宿主细胞中表达目的蛋白时,可以使用选择性感染所需细胞类型或组织类型的病毒载体。在本发明的上下文中,用于基因治疗的载体(即,能够向宿主生物体递送核酸分子的载体)也很重要。
例如,病毒载体如慢病毒、逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺相关病毒、牛痘病毒、杆状病毒和其它具有所需细胞嗜性的重组病毒。用于构建和使用病毒载体的方法在本领域中是已知的(参见,Miller和Rosman,BioTechniques,7:980-990,1992)。
在本发明中实际优选的病毒载体是非常适用于脊椎动物和非脊椎动物细胞中的那些。
对于非脊椎动物细胞,优选的载体是虫媒病毒,特别优选西尼罗病毒,其是节肢动物载体。已知在非脊椎动物细胞中被有效表达的其它载体是杆状病毒。
对于脊椎动物细胞,优选慢病毒、AAV、杆状病毒和腺病毒载体。适于在哺乳动物宿主细胞中表达的载体也可以是非病毒(如质粒DNA)来源。合适的质粒载体包括但不限于pREP4、pCEP4(Invitrogen)、pCI(Promega)、pCDM8和pMT2PC、pVAX和pgWiz。
对于原核细胞,优选质粒、噬菌体和粘粒载体。用于原核***的合适载体包括但不限于pBR322(Gibco BRL)、pUC(Gibco BRL)、pBluescript(Stratagene)、p Poly、pTrc;pET 11d;pIN;和pGEX载体。
对于植物细胞,优选质粒表达载体如Ti质粒,和病毒表达载体如花椰菜花叶病毒(CaMV)和烟草花叶病毒TMV。
重组蛋白在酵母细胞中的表达可以通过三种类型的载体来实施:整合载体(YIp)、附加体质粒(YEp)和中心粒质粒(YCp);用于在酵母(例如酿酒酵母)中表达的合适载体包括但不局限于pYepSec1、pMFa、pJRY88、pYES2(Invitrogen Corporation,San Diego,Calif.)和pTEF-MF(Dualsystems Biotech产品编号:P03303)。
可用于基因治疗的载体是本领域已知的。它们是,例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒或腺相关病毒(AAV)。病毒载体是能够复制的,或可遗传上有缺陷的从而成为复制缺陷的或复制受损的。优选的基因治疗载体是在WO 99/055892、US 6,682,507和WO 01/27300中所描述的DNA Flap载体。
“编码”表达产物(如RNA、多肽、蛋白或酶)的序列是,当表达时导致RNA、多肽、蛋白或酶产生的核苷酸序列;即核苷酸序列“编码”RNA或其编码多肽、蛋白或酶的氨基酸序列。
本发明的载体含有编码6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域的核苷酸序列。这些多肽已在上文定义。优选地,所述AGT突变体是SEQ ID NO:2的SNAP酶,以及例如由SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:31所编码,后者具有51%的G/C含量。
优选地,本发明的核苷酸表达载体进一步包括能够使编码目的蛋白的异源DNA序列符合阅读框地***的克隆位点。
如本发明中所表示的,术语“分泌信号肽”表示指导N核蛋白运输出宿主细胞的短(3-60个氨基酸长)肽链。
适用于本发明的分泌信号的实例包括但不限于交配因子(MF)α的信号肽序列(US 5,879,926);转化酶(WO 84/01153);PHO5(DK 3614/83);YAP3(酵母天冬氨酸蛋白酶3;WO 95/02059);和BAR1(WO 87/02670)。
在本发明的上下文中,这种分泌信号肽优选在非脊椎动物细胞或脊椎动物细胞或者在两种当中具有功能。
在昆虫细胞中具有功能的分泌信号肽的实例是:昆虫ssBiP(SEQ ID NO:37,例如由DNA序列SEQ ID NO:22所编码)、SEQ ID NO:24的BiP样肽信号(例如,由DNA序列SEQ ID NO:23所编码)、SEQ ID NO:153的BiP样肽信号(例如,由DNA序列SEQ ID NO:152所编码)以及虫媒病毒中存在的任何肽信号,例如西尼罗病毒的包膜E蛋白(SEQ ID NO:38)。
有趣的是,上述提到的SEQ ID NO:24的BiP样肽信号在非脊椎动物和脊椎动物细胞中均是有功能的。这种BiP样信号对应着SEQ ID NO:37的BiP肽信号,其中最后的甘氨酸氨基酸被对应着登革病毒E蛋白切割位点的氨基酸序列Pro ThrAla Leu Ala(SEQ ID NO:39)所取代。因此,一旦蛋白被翻译和分泌到宿主细胞上清中,有利地,BiP样信号将被切割掉。
各种分泌信号也可用于在酵母宿主细胞中的表达,如在酿酒酵母中。这包括前体α因子、HSp150、PHO1、SUC2、KILM1(1型杀伤毒素)和GGP1。
克隆位点是方便将编码目的蛋白的基因克隆至表达***中的序列。其含有限制性位点、或限制性识别位点,即,含有特异性核苷酸序列的DNA分子上的位置,其被限制性酶所识别(参见图中实例)。其通常是回文序列(因为限制性酶通常作为同型二聚体结合),且特定的限制性酶可切割其识别位点之内或附近的两条核苷酸之间的序列。克隆位点是本领域技术人员已知的。
在本发明的优选实施方案中,编码所述AGT酶的DNA序列位于编码所述目的异源蛋白的DNA序列的5'或3',优选在5'。因此,AGT酶直接或间接连接至目的异源蛋白/多肽,优选位于目的异源蛋白/多肽的N端。DNA序列编码融合多肽,融合多肽包括所述肽信号、所述AGT酶、突变体或催化结构域、以及所述目的重组蛋白,所述DNA序列可以操作地连接至在相同宿主细胞中作为肽信号行使功能的诱导型启动子。
更优选地,在本发明的载体中,所述开放阅读框操作地连接至在相同宿主细胞中作为肽信号行使功能的诱导型启动子。
当RNA聚合酶将编码序列转录成RNA时,编码序列在细胞中“操作地连接至”表达控制序列(即转录和翻译控制序列),然后RNA被进行反式RNA剪接(如果其包含内含子)以及,如果所述序列编码蛋白则RNA被翻译成蛋白。
“启动子”是一种由此起始转录可操作地连接至其下游的DNA的核苷酸序列(即在双链DNA的正义链3'方向)。启动子序列内可见转录起始位点(例如,通过用核酸酶S1作图可以方便地找到),以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合结构域(共有序列)。
本发明的上下文中可用于控制基因表达的启动子是,例如在非脊椎动物细胞或脊椎动物细胞中行使功能的那些。例如,对于非脊椎动物细胞,可以使用金属硫蛋白基因的调节序列(Brinster等人,Nature,296:39-42,1982)。
优选地,存在于本发明载体中的诱导型启动子在昆虫细胞中,更优选在果蝇细胞中具有启动子活性。例如果蝇金属硫蛋白启动子pMT(Lastowski-Perry等人,J.Biol.Chem.260:1527(1985)),其在金属如CuSO4存在下指导高水平的基因转录。或者,可以使用果蝇肌动蛋白5C基因启动子,其是组成型启动子并且不需要添加金属(B.J.Bond等人,Mol.Cell.Biol.6:2080(1986))。其它已知果蝇启动子的实例包括例如诱导型热休克(Hsp70)和COPIA LTR启动子。SV40早期启动子给出比果蝇金属硫蛋白启动子更低的表达水平。
优选地,存在于本发明载体中的诱导型启动子在黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)细胞中,优选在果蝇S2细胞中具有启动子活性。例如在Lastowski-Perry等人,J.Biol.Chem.260:1527(1985)中充分描述的金属硫蛋白启动子。
适于在哺乳动物细胞中组成型表达的启动子包括巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子、以及单纯疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)启动子。受外源性提供的化合物调节的诱导型真核启动子包括但不限于锌诱导的金属硫蛋白(MT)启动子、***(Dex)诱导型小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)启动子、T7聚合酶启动子***(WO 98/10088)、昆虫蜕皮激素启动子、四环素阻遏型启动子、四环素诱导型启动子、RU486诱导型启动子和雷帕霉素诱导型启动子。
优选地,存在于本发明载体的启动子在哺乳动物细胞中,优选在HeLa细胞中具有启动子活性。例如SV 40启动子。
一系列酵母启动子可用于在酵母宿主细胞中表达蛋白。有些例如ADH2、SUC2是诱导型的,而其它的比如GAPDH在表达中是组成型的。适于在酵母中表达的其它启动子包括TEF、PGK、MFα、CYC-1、GAL-1、GAL4、GAL10、PHO5、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAP或GAPDH)和乙醇脱氢酶(ADH)启动子。
为了用于植物细胞中,最常用的启动子是花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子或其增强版,但可以使用一些替代启动子,如来自玉米和拟南芥(Arabidospsisthaliana)的杂交(ocs)3mas启动子或泛素启动子。与这些组成型启动子相反,水稻α-淀粉酶RAmy3D启动子由糖剥夺诱导(Hellwig S等人,Nat.Biotechnol.2004;22(11):1415-22)。
适于在大肠杆菌宿主细胞中表达的启动子包括但不仅限于噬菌体lamba pL启动子、lac、TRP和IPTG诱导型pTAC启动子。
优选,分泌信号肽和诱导型启动子在相同宿主细胞中是有功能的。
更优选,分泌信号肽和诱导型启动子在果蝇S2细胞和脊椎动物细胞中是有功能的。
术语“诱导型”用于启动子是本领域技术人员众所周知的。本质上,在诱导型启动子控制下的表达在响应所施加的刺激时被“开启”或增加。刺激的性质随启动子而不同。在没有适当刺激时,有些诱导型启动子导致很少或检测不到的表达水平(或不表达)。在没有刺激时,其它诱导型启动子导致可检测到的组成型表达。在没有刺激时,无论表达水平如何,当存在正确刺激时来自任何诱导型启动子的表达是增加的。
一旦适当载体已构建并转染到所选择的宿主细胞优选果蝇细胞系中,通过加入适于诱导型启动子的诱导剂来诱导异源蛋白的表达。例如镉或铜是Hsp70启动子的诱导剂。对于组成型启动子,如肌动蛋白5C启动子,表达不需要诱导剂。
在本发明的另一个实施方案中,核苷酸表达载体编码至少一个肽切割位点,其优选位于AGT酶或其催化结构域和目的重组蛋白之间。
肽的切割位点(也称为“肽切割位点”)是由至少一种蛋白酶(例如,丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶,以及其它)所识别的氨基酸序列。肽切割位点的实例是SEQ ID NO:40的肠激酶切割位点(AspAspAspAspLys/Asp)。肠激酶是一种丝氨酸蛋白酶(EC 3.4.21.9),已知其通过在以下序列的C末端进行切割将非活性胰蛋白酶原转换为活性胰蛋白酶:Val--(Asp)4--Lys--Ile--Val~(胰蛋白酶原)→Val--(asp)4--Lys(六肽)+Ile--Val~(胰蛋白酶)。如果Lys前面是四个Asp并且后面没有脯氨酸残基,则肠激酶在赖氨酸后切割。
另一种有用的肽切割位点是所谓的“TEV蛋白酶”切割位点,其具有氨基酸序列SEQ ID NO:32(pro-TEV1)或SEQ ID NO:33(pro-TEV2)(分别为Glu AsnLeu Tyr Phe Gln Ser或Gly)。这种切割位点可被,例如SEQ ID NO:29和30所编码。TEV蛋白酶是烟草蚀纹病毒(tobacco etch virus)编码的核包涵体蛋白的27kDa催化结构域的通用名。其是商业上可获得的(Invitrogen)。
来自登革病毒血清型1的膜前体prM的切割位点(SEQ ID NO:39)也可用于本发明的载体中。
在另一个实施方案中,本发明核苷酸表达载体还编码一个标记,其优选位于本发明融合多肽中重组蛋白的C端(包括肽信号、AGT蛋白或其同源物和重组蛋白)。在本发明的上下文中,“标记”专门促进从宿主细胞的粗裂解物中回收多肽,并优选选自于:荧光蛋白、多聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸(poly-his-gly)标签;flu HA标签;c-myc标签单纯疱疹(Herpes simplex)病毒糖蛋白D(gD)标签、Flag-肽、α-微管蛋白表位或T7基因10蛋白肽标签。然而,可以使用任何其它标记。在本发明的优选实施方案中,载体包括编码具有SEQ ID NO:27的六个组氨酸标签的SEQ ID NO:28的DNA。
在另一个实施方案中,本发明的核苷酸表达载体还编码间隔序列,优选位于AGT酶(或其催化结构域)和目的重组蛋白之间和/或目的重组蛋白和标记之间。在本发明的上下文中,间隔序列是包括至少三个氨基酸的氨基酸序列,专门用于空间分隔两条连接的多肽(然后这些多肽间接地连接起来)。这样的间隔序列可以是例如氨基酸序列甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸(GGGS,SEQ ID NO:25),以及编码它的DNA间隔序列可以是SEQ ID NO:26。在本发明的上下文中,下文中这种DNA序列称为“DNA间隔序列”并位于编码AGT或其催化结构域的DNA和重组DNA序列之间,优选编码肽切割位点的DNA序列的上游。
如本文所用,术语“pDeSNAP Univ”指定为在单一开放阅读框中从5'到3'的编码如下的DNA盒:
a)分泌信号肽,
b)SEQ ID NO:1的AGT蛋白、其突变体、片段或催化结构域,特别是SEQID NO:2的SNAP突变体,
c)至少一个肽切割位点,
d)至少一种标记,以及
e)至少一个间隔序列。
这种pDeSNAPUniv DNA盒编码分泌信号肽,其有利地为SEQ ID NO:24的BiP样肽信号或SEQ ID NO:37的ssBiP肽信号、SEQ ID NO:2的SNAP突变体,有利地为SEQ ID NO:27的His标签的标记,有利地为SEQ ID NO:32的pro-TEV或SEQ ID NO:33的pro-TEV的肽切割位点,和/或有利地具有SEQ ID NO:25的氨基酸序列的间隔序列。
更优选地,pDeSNAPUniv DNA盒从5'到3'包括:编码BiP样分泌信号的序列SEQ ID NO:23、编码SNAP突变体的SEQ ID NO:15或31、SEQ ID NO:26的间隔序列、SEQ ID NO:29的肽切割位点pro-TEV、SEQ ID NO:30的肽切割位点pro-TEV、SEQ ID NO:26的间隔序列、和编码His标签标记的序列SEQ ID NO:28(参见图8,示出pDeSNAPUniv盒的结构)。这种pDeSNAP Univ DNA盒是,例如SEQ ID NO:34。
这种“pDeSNAPUniv”盒保持“通用”,因为其可以***任何类型的载体以专门用于转染宿主细胞来产生异源蛋白,即脊椎动物载体(例如,pcDNA3或PCI-neo载体)以及非脊椎动物的载体(例如,用于Invitrogen的DES***的pMT/BiP/V5-HisA)。包含所述通用序列的质粒的实例是SEQ ID NO:43(来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pMT/BiP/V5-HisA)、SEQ ID NO:44(来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pUC57)或SEQ ID NO:45(来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pcDNA3)。
包含所述通用序列的质粒的另一实例是SEQ ID NO:105,其是从5'到3'包括以下的pUC57质粒:黄杉毒蛾(Orgyia pseudotsugata)的多衣壳核蛋白的组成型启动子、病毒立即早期启动子2(OpIE2SP)、SEQ ID NO:152的BiP样信号肽、SEQ ID NO:31的SNAP样序列、SEQ ID NO:26的间隔序列、pro-TEV1序列SEQID NO:29和SEQ ID NO:106的C端肽标签。
一旦在本文中克隆目的蛋白的异源序列,例如SBV.N,则这样的载体可以有利地在脊椎动物或无脊椎动物宿主细胞中进行转染以便产生高量的目的蛋白。
在优选的实施方案中,本发明的载体包括称为“pDeSNAP Univ/SBV.N盒”,即其中***SBV的N核蛋白序列的pDeSNAP Univ DNA盒,所述pDeSNAPUniv/SBV.N盒包括核苷酸序列,其在单一开放阅读框中从5'到3'编码以下:
a)分泌信号肽;
b)SEQ ID NO:1的AGT蛋白、其突变体、片段或催化结构域,特别是SEQID NO:2的SNAP突变体;
c)至少一个肽切割位点;
d)SEQ ID NO:16的SBV的N核蛋白;
e)至少一种标记,以及;
f)至少一个间隔序列。
这种pDeSNAP Univ/SBV.N DNA盒编码分泌信号肽,其有利地为SEQ IDNO:24的BiP样肽信号或SEQ ID NO:37的ssBiP肽信号、SEQ ID NO:2的SNAP突变体、SEQ ID NO:16的SBV的N核蛋白、有利地为SEQ ID NO:27的His标签的标记、有利地为SEQ ID NO:32的pro-TEV或SEQ ID NO:33的pro-TEV的肽切割位点、和/或有利地具有氨基酸序列SEQ ID NO:25的间隔序列。
更优选地,pDeSNAP Univ/SBV.N DNA盒从5'到3'包括:编码BiP样分泌信号的序列SEQ ID NO:23或编码ssBiP分泌信号的SEQ ID NO:22、编码SNAP突变体的SEQ ID NO:15或31、SEQ ID NO:26的间隔序列、SEQ ID NO:29的肽切割位点pro-TEV1、编码SBV的N核蛋白的序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:30的肽切割位点pro-TEV2、SEQ ID NO:26的间隔序列、和编码His标签标记的序列SEQ ID NO:28。
甚至更优选地,pDeSNAP Univ/SBV.N DNA盒从5'到3'包括:编码ssBiP分泌信号的序列SEQ ID NO:22、编码SNAP突变体的SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:26的间隔序列、SEQ ID NO:29的肽切割位点pro-TEV1、编码SBV的N核蛋白的序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:30的肽切割位点pro-TEV2、SEQ ID NO:26的间隔序列、和编码His标签标记的序列SEQ ID NO:28。这样的pDeSNAPUniv/SBV.N盒是例如SEQ ID NO:35。
或者,pDeSNAP Univ/SBV.N DNA盒从5'到3'包括:编码BiP样分泌信号的序列SEQ ID NO:23、编码SNAP突变体的SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:26的间隔序列、SEQ ID NO:29的肽切割位点pro-TEV1、编码SBV的N核蛋白的序列SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:30的肽切割位点pro-TEV2、SEQ ID NO:26的间隔序列、以及编码His标签标记的序列SEQ ID NO:28。这样的pDeSNAPUniv/SBV.N盒是例如SEQ ID NO:36(其结构显示在图9中)。
因此,在优选的实施方案中,本发明的载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:35或核苷酸序列SEQ ID NO:36的pDeSNAP Univ/SBV.N盒。
更确切地,SEQ ID NO:35的pDeSNAP Univ/SBV.N盒核苷酸序列包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-SBV.N DNA序列SEQ ID NO:17(其对应于天然SBV.N序列,其中已删除内部EcoRV位点并在末端加入两个EcoRV和XmaI位点),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
以及pDeSNAP Univ/SBV.N盒核苷酸序列SEQ ID NO:36包括(也参见图9):
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-SBV.N DNA序列SEQ ID NO:17(其对应于天然SBV.N序列,其中已删除内部EcoRV位点并在末端加入两个EcoRV和XmaI位点),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
有趣的是,SEQ ID NO:36盒的pDeSNAP Univ/SBV.N盒核苷酸序列还另外包括ATG上游的NheI位点、在BiP样序列和SNAP样序列之间的BglII位点,以及都定位在终止密码子下游的AgeI位点和HindIII位点。
本发明的载体是例如:已***SBV.N DNA序列SEQ ID NO:17的SEQ IDNO:43(其是来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pMT/BiP/V5-HisA质粒)、已***SBV.N DNA序列SEQ ID NO:17的SEQ ID NO:44(其是来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pUC57质粒)、或者已***SBV.N DNA序列SEQ IDNO:17的SEQ ID NO:45(其是来自Invitrogen的含有pDeSNAP Univ盒的pcDNA3质粒)。
本发明的载体还提供于S2细胞中,其已在2012年4月24日以编号CNCMI-4616保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM),巴斯德研究所(法国巴黎15区邮编75724,Docteur Roux大街25号)。
在另一方面,本发明靶向被本发明的载体,优选含有核苷酸序列SEQ ID NO:35或SEQ ID NO:36的载体所稳定转染的重组细胞。
优选地,在本发明的这种方面,所述重组细胞是非脊椎动物细胞,优选昆虫细胞,以及更优选S2细胞。
非脊椎动物细胞可以是来自昆虫、蛛形纲、甲壳纲、软体动物门、环节动物门、蔓足纲、放射虫纲、腔肠动物门和纤毛虫纲的任何细胞。在本发明的上下文中,非脊椎动物细胞优选是昆虫细胞,如果蝇或蚊子细胞。其更优选为果蝇S2细胞。在这种情况下,本发明的表达载体包含例如SEQ ID NO:35。
果蝇S2细胞已被广泛描述。它们尤其适合蛋白的高产量生产,因为在室温(24±1℃)下它们可以保持在悬浮培养中。培养基是补充有5和10%(v/v)之间的热灭活胎牛血清(FBS)的M3。在本发明的优选实施方案中,培养基含有5%FBS。诱导后,细胞培养在无血清介质中。在这样的介质中,S2细胞可以在悬浮培养中生长,例如在250mL至2000mL转瓶中,以50-60rpm搅拌。细胞密度通常保持在每mL106和107个细胞之间。
在优选的实施方案中,本发明的重组细胞是S2细胞,其已在2012年4月24日以编号CNCM I-4616保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM),巴斯德研究所(法国巴黎15区邮编75724,Docteur Roux大街25号)。
在另一优选的实施方案中,所述重组细胞是脊椎动物细胞。
优选地,所述脊椎动物重组细胞是哺乳动物细胞,优选CHO、YB2/O、COS、HEK、NIH3T3、HeLa细胞或其衍生物。更优选地,在这种情况下,本发明的表达载体包含SEQ ID NO:36。
在另一优选的实施方案中,所述重组细胞用于扩增和纯化本发明的表达载体,优选包含SEQ ID NO:35或36的那些。
出于此目的,本发明的核苷酸表达载体还可包含编码筛选标志物、和/或终止子序列的基因。在构建体中可包括的筛选标志物基因通常是赋予可选择表型的那些,例如对抗生素的抗性(例如,杀稻瘟菌素、氨苄青霉素、卡那霉素、潮霉素、嘌呤霉素、氯霉素)。
产生表达载体的方法是本领域公知的。
在另一方面,使用本发明的重组细胞以便高量生产施马伦贝格病毒的N核蛋白。
因此,在具体的实施方案中,本发明还涉及用于生产施马伦贝格病毒的N核蛋白的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)获得本发明的载体,所述载体含有例如DNA序列SEQ ID NO:35或SEQID NO:36;
(b)用步骤(a)获得的多核苷酸转染宿主细胞(优选昆虫细胞或哺乳动物细胞);
(c)允许步骤(b)获得的所述多核苷酸进行表达来生产施马伦贝格病毒的N核蛋白;
(d)任选地,切割AGT多肽,
(e)回收施马伦贝格病毒的N核蛋白,
(f)任选,纯化施马伦贝格病毒的N核蛋白。
为了进行本发明方法的不同步骤,可以采用本领域技术人员技能范围内的常规分子生物学、微生物学和重组DNA技术。这种技术在文献中都有完整的解释。见,例如,Sambrook,Fitsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(此处称为"Sambrook等人,1989");DNA Cloning:A Practical Approach,卷I和II(D.N.Glover编,1985);Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编,1984);Nucleic AcidHybridization(B.D.Hames&S.J.Higgins,编,1984);Animal Cell Culture(R.I.Freshney,编,1986);Immobilized Cells and Enzymes(IRL出版社,1986);B.E.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984);F.M.Ausubel等人,(编),CurrentProtocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.(1994)。
术语“转染”是指将外源核酸引入到真核宿主细胞,从而宿主细胞将表达所引入的基因或序列以产生施马伦贝格病毒的N核蛋白。接受且表达所引入的DNA或RNA的宿主细胞是“被转染的”并成为“转染子”或“克隆”。引入到宿主细胞中的DNA或RNA可以来自任何来源,包括与宿主细胞属于相同属或种的细胞,或不同属或种的细胞。
在本发明的上下文中,用多核苷酸转染宿主细胞可以通过本领域中的经典方法进行,例如通过转染、感染或电穿孔。在另一个实施方案中,可以通过脂质体转染(以裸露DNA的形式),或与其它转染促进剂(肽、聚合物等)体内引入本发明的载体。合成的阳离子脂可用于制备编码标志物的基因的体内转染的脂质体(Felgner等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,84:7413-7417,1987)。可用于转移核酸的脂质化合物或组合物描述于WO 95/18863和WO 96/17823、以及U.S.5,459,127中。出于靶向的目的,脂质可化学偶联至其它分子(见Mackey等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85:8027-8031,1988)。靶向肽如激素或神经递质、和蛋白如抗体、或非肽分子可以化学偶联至脂质体。其它分子也用于促进核酸在体内的转染,如阳离子寡肽(参见WO95/21931)、源自DNA结合蛋白的肽(见WO 96/25508)、或阳离子聚合物(见WO 95/21931)。也可能在体内引入作为裸露DNA质粒的载体。可通过本领域已知方法,如电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪、或使用DNA载体转运体,将用于基因疗法的裸露DNA载体引入所需宿主细胞中(见Wu等人,J.Biol.Chem.,267:963-967,1992;Wu和Wu,J.Biol.Chem.,263:14621-14624,1988;Williams等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,88:2726-2730,1991)。
术语多核苷酸的“允许表达”在本文指在载体中存在的调控序列的刺激(例如,活化诱导型启动子的刺激)、和以足以发生多核苷酸翻译的量而存在的所有所需成分。
如果需要的话,通过向上清中或重组细胞内加入具有限定切割位点的蛋白酶而可从产生的融合蛋白切下AGT/SNAP多肽。例如,当使用含有SEQ ID NO:35或36的pDeSNAP Univ盒的载体时,通过向重组细胞上清中加入TEV蛋白酶而获得pro-TEV切割位点ENLKYFQ/G(S)的切割。或者,可以维持AGT/SNAP多肽从而增强来自SBV的N核蛋白的寿命。
此外,技术人员将理解可以在用于维持或培养本宿主细胞的培养基中检测表达或分泌的蛋白或多肽。通过已知方法,如离心或过滤可以将培养基和宿主细胞分离。然后,通过利用蛋白或多肽的已知性质特征,可以在无细胞培养基中检测蛋白或多肽。这种性质可以包括蛋白或多肽的区别免疫、酶或物理性质。例如,如果蛋白或多肽具有独特的酶活性,可以在宿主细胞所用培养基上进行针对这种活性的分析。此外,当可以获得针对给定蛋白或多肽的反应性抗体时,这种抗体可用于在任何已知免疫学分析中检测蛋白或多肽(例如,在Harlowe,等人,1988,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press)。
来自SBV的N核蛋白的回收由本领域中公知的方法介导,包括但不限于制备型圆盘凝胶电泳、等电聚焦、HPLC、反相HPLC、凝胶过滤、离子交换和分配色谱、沉淀和盐析色谱、萃取和逆流分配(countercurrent distribution)等。因为优选在连接有标记的本发明重组***中产生目的蛋白,所述标记有助于通过色谱在适当的固相基质上从宿主细胞粗裂解物中回收多肽。或者,针对蛋白或针对源自蛋白的肽所产生的抗体可用作回收剂。
本发明人发现使用本发明的方法生成的融合蛋白通常不需要进一步纯化。然而,如果需要的话,可进行进一步的纯化步骤(g)。
被纯化的物质可含有小于约50%,优选小于约75%,以及最优选小于约90%的与该被纯化的物质原始相关的细胞成分。术语“基本上纯的”表示使用本领域已知的常规纯化技术可以实现的最高纯度。
在本发明的一个实施方案中,本发明的方法能够在回收的细胞培养上清中获得至少40mg/L,优选至少50mg/L,更优选至少60mg/L基本上纯的施马伦贝格病毒的N核蛋白。
在另一方面,本发明涉及融合蛋白,其含有a)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;和b)SEQ ID NO:16的施马伦贝格病毒的N核蛋白。
在这种融合多肽中,所述AGT酶优选是SEQ ID NO:2的蛋白或其同源物(所述同源物如上述限定)。
如上所述,这种融合多肽优选地进一步含有标记。这种标记优选为聚组氨酸标记,以及优选地定位在施马伦贝格病毒的N核蛋白的C末端。
本发明的融合多肽例如,SEQ ID NO:41的氨基酸序列(对应于BiP样/SNAP/SBV.N/His标签融合蛋白)、或SEQ ID NO:46的氨基酸序列(对应于ssBiP/SNAP/SBV.N/His标签融合蛋白)或SEQ ID NO:42的氨基酸序列(对应于SNAP/SBV.N融合蛋白)。
最后,嵌合蛋白SNAP-SBV.N可用作检测施马伦贝格病毒的病毒感染的诊断试剂,或用于在生物液体,如血液、血清、唾液等中检测对所述病毒特异的抗体。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,通过本发明的任何方法获得的融合蛋白[SNAP-SBV.N]用于鉴定在生物样本中所述致病性或非致病性微生物的存在的用途。
在其它方面,本发明还涉及表达具体目的融合蛋白的载体,所述融合蛋白包含6烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT),其突变体、片段或催化结构域,其与目的抗原(例如病毒或细菌抗原、微生物肽和/或目的多肽)符合阅读框地融合。这些载体详述如下。
艾柯病毒(Echovirus)抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达艾柯病毒抗原,例如肠病毒71(小核糖核酸病毒(Picornaviridae))的VP1蛋白的载体。具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)肠病毒71的VP1蛋白(EV71,参见例如Kolpe A.B.等人,Virus Research2012)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/EV71.VP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自EV71病毒株JL-AFP-EV71-07-03(Genbank#JQ715713)的VP1蛋白的序列SEQ ID NO:47。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:48的pDeSNAP Univ/EV71.VP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自EV71病毒株JL-AFP-EV71-07-03(Genbank#JQ715713)的VP1蛋白的DNA序列SEQ ID NO:47,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自EV71病毒的VP1蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:49的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/EV71.VP1/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-EV71.VP1]用于鉴定在生物样本中肠病毒71的存在的用途。
黄病毒抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定黄病毒抗原的载体。
在优选的实施方案中,所述黄病毒抗原是来自日本脑炎病毒(JEV.sE)的可溶E蛋白(sE)。更具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自日本脑炎病毒的sE蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JEV.sE盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自日本脑炎病毒(JEV)的可溶E蛋白(sE)的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:50的pDeSNAP Univ/JEV.sE盒,从5’至3’包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自JEV株SA-14的prM/M序列的DNA序列(Genbank#M55506),
-编码来自JEV株SA-14的E[1-395]序列的DNA序列(Genbank#M55506),
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的DNA序列SEQ ID NO:26,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自日本脑炎病毒(JEV.sE)的可溶E蛋白(sE)。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:51的氨基酸序列(对应于JEV.sE/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-JEV.sE]用于鉴定在生物样本中日本脑炎病毒(JEV)的存在的用途。
在优选的实施方案中,所述黄病毒抗原是来自日本脑炎病毒的基因型1(JE-1.EDIII)、基因型2(JE-3.EDIII)、基因型4(JE-4.EDIII)或基因型5(JE-5.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III。
在另一方面,因此本发明涉及用于在所述宿主细胞中表达来自日本脑炎病毒的基因型I(JE-I.EDIII)、基因型2(JE-2.EDIII)、基因型4(JE-4.EDIII)或基因型5(JE-5.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的载体,其包括编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自日本脑炎病毒的基因型1(JE-I.EDIII)、基因型2(JE-2.EDIII)、基因型4(JE-4.EDIII)或基因型5(JE-5.EDIII)的EDIII蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JE-I.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自日本脑炎病毒的基因型1(JE-1.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:52的pDeSNAP Univ/JE-1.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码来自日本脑炎病毒的基因型1的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的DNA序列SEQ ID NO:54(Genebank#AY377577),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JE-2.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自日本脑炎病毒的基因型2(JE-2.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:59的pDeSNAP Univ/JE-2.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码来自日本脑炎病毒的基因型2的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的DNA序列SEQ ID NO:55(Genebank#L-43566),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JE-4.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自日本脑炎病毒的基因型4(JE-4.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:61的pDeSNAP Univ/JE-4.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码来自日本脑炎病毒的基因型4的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的DNA序列SEQ ID NO:56(Genebank#U70408),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自日本脑炎病毒的基因型5(JE-5.EDIII)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:63的pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码来自日本脑炎病毒的基因型5的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的DNA序列SEQ ID NO:57(Genebank#JN587258),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自JE-1、JE-2、JE-4、或JE-5病毒的EDIII蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ IDNO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQID NO:53的氨基酸序列(对应于SNAP样/JE-1.EDIII/His标签融合蛋白)、SEQ IDNO:60的氨基酸序列(对应于SNAP样/JE-2.EDIII/His标签融合蛋白)、SEQ IDNO:62的氨基酸序列(对应于SNAP样/JE-4.EDIII/His标签融合蛋白)、或SEQ IDNO:64的氨基酸序列(对应于SNAP样/JE-5.EDIII/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这些融合蛋白[SNAP-JE-1.EDIII]、[SNAP-JE-2.EDIII]、[SNAP-JE-4.EDIII]或[SNAP-JE-5.EDIII]中的任意者用于分别鉴定在生物样本中日本脑炎病毒基因型1、2、4或5的存在的用途。
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达拉本斯堡病毒(RabV)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自拉本斯堡病毒(RabV)的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/RabV.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自拉本斯堡病毒的EDIII蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:65的pDeSNAP Univ/RabV.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫样BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码拉本斯堡病毒的包膜E蛋白(EDIII蛋白)的结构域III的DNA序列SEQID NO:58(Genebank#AY65264),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自拉本斯堡病毒的EDIII蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:66的氨基酸序列(对应于SNAP样/RabV.EDIII/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-RabV.EDIII]用于鉴定在生物样本中拉本斯堡病毒的存在的用途。
甲病毒(Alphavirus)抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定甲病毒抗原,例如来自罗斯河病毒的可溶E2蛋白(RR.sE2)、或来自马雅罗病毒的可溶E2蛋白(MAY.sE2)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自罗斯河病毒的sE2蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/RR.sE2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自罗斯河病毒的sE2基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:69的pDeSNAP Univ/RR.sE2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码罗斯河病毒株QML1的sE2蛋白的DNA序列(Genbank#GQ433354),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自罗斯河病毒的sE2蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:70的氨基酸序列(对应于RR.sE2/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-RR.sE2]用于鉴定在生物样本中罗斯河病毒的存在的用途。
本发明还涉及用于在宿主细胞中表达马雅罗病毒的可溶E2蛋白(MAY.sE2)的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自马雅罗病毒的sE2蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MAY.sE2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自罗斯河病毒的sE2基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:71的pDeSNAP Univ/MAY.sE2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码马雅罗病毒株IQD2668修正的sE2蛋白(E2-S203C)的DNA序列(Genbank#DQ487429.1),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自马雅罗病毒的sE2蛋白(MAY.sE2)。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ IDNO:72的氨基酸序列(对应于MAY.sE2/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MAY.sE2]用于鉴定在生物样本中马雅罗病毒的存在的用途。
马脑炎病毒抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定马脑炎病毒抗原,例如来自西部马脑炎病毒的可溶E2蛋白(WEE.sE2)、来自东部马脑炎病毒的可溶E2蛋白(EEE.sE2)、或来自委内瑞拉马脑炎病毒的可溶E2蛋白(VEE.sE2)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自西部马脑炎病毒的可溶E2蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/WEE.sE2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自西部马脑炎病毒的sE2基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:73的pDeSNAP Univ/WEE.sE2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码西部马脑炎病毒株的sE2蛋白的DNA序列(Genbank#NC00390808),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自WEE病毒的sE2蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:74的氨基酸序列(对应于WEE.sE2/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-WEE.sE2]用于鉴定在生物样本中西部马脑炎病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明还涉及用于在宿主细胞中表达来自东部马脑炎病毒的可溶E2蛋白(EEE.sE2)的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自东部马脑炎病毒的可溶E2蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/EEE.sE2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自东部马脑炎病毒的sE2基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:75的pDeSNAP Univ/EEE.sE2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码东部马脑炎病毒株的sE2蛋白的DNA序列(Genbank#EF151502),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自EEE病毒的sE2蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:76的氨基酸序列(对应于EEE.sE2/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-EEE.sE2]用于鉴定在生物样本中东部马脑炎病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明还涉及用于在宿主细胞中表达来自委内瑞拉马脑炎病毒的可溶E2蛋白(VEE.sE2)的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自委内瑞拉马脑炎病毒的可溶E2蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/VEE.sE2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自委内瑞拉马脑炎病毒的sE2基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:77的pDeSNAP Univ/VEE.sE2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码委内瑞拉马脑炎病毒株的sE2蛋白的DNA序列(Genbank#AY973944),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自VEE病毒的sE2蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:78的氨基酸序列(对应于VEE.sE2/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-VEE.sE2]用于鉴定在生物样本中委内瑞拉马脑炎病毒的存在的用途。
正本雅病毒抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定正本雅病毒抗原,例如来自赤羽病毒的核蛋白N(AKA.N)、来自艾诺病毒的核蛋白N(AIN.N)、或来自沙门达病毒的核蛋白N(SHA.N)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自赤羽病毒的核蛋白N。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/AKA.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自赤羽病毒的核蛋白N的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:79的pDeSNAP Univ/AKA.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码赤羽病毒的天然N核蛋白的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自赤羽病毒的N核蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:80的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/AKA.N/pro-TEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-AKA.N]用于鉴定在生物样本中赤羽病毒的存在的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及用于在宿主细胞中表达来自艾诺病毒的核蛋白N(AIN.N)的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自艾诺病毒的核蛋白N。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/AIN.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自艾诺病毒的核蛋白N的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:81的pDeSNAP Univ/AIN.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码艾诺病毒的天然N核蛋白的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自艾诺病毒的N核蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:82的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/AIN.N/pro-TEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-AIN.N]用于鉴定在生物样本中艾诺病毒的存在的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及用于在宿主细胞中表达来自沙门达病毒的核蛋白N(SHA.N)的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自沙门达病毒的核蛋白N。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/SHA.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自沙门达病毒的核蛋白N的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:83的pDeSNAP Univ/SHA.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码沙门达病毒的天然N核蛋白的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自沙门达病毒的N核蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:84的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/SHA.N/pro-TEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-SHA.N]用于鉴定在生物样本中沙门达病毒的存在的用途。
乙型冠状病毒抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定乙型冠状病毒抗原,例如来自人类乙型冠状病毒的核蛋白N(huCOV.N)、或人类乙型冠状病毒的蛋白S(huCOV.S)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自人类乙型冠状病毒的核蛋白N。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/huCOV.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自人类乙型冠状病毒的核蛋白N的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:85的pDeSNAP Univ/huCOV.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自人类乙型冠状病毒2cEMC/2012(Genbank#JX869059)的基因N的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自人类乙型冠状病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:86的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/huCOV.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-huCOV.N]用于鉴定在生物样本中人类乙型冠状病毒的存在的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及用于在宿主细胞中表达来自人类乙型冠状病毒的刺突S蛋白(huCOV.S)的可溶型的载体,其包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自人类乙型冠状病毒的刺突S蛋白的可溶型。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/huCOV.S盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自人类乙型冠状病毒的基因S的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:87的pDeSNAP Univ/huCOV.S盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自人类乙型冠状病毒2cEMC/2012(Genbank#JX869059)的基因S的DNA序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的DNA序列SEQ ID NO:26,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自人类乙型冠状病毒的刺突S蛋白的可溶型。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ IDNO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQID NO:88的氨基酸序列(对应于huCOV.S/SNAP样/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-huCOV.S]用于鉴定在生物样本中人类乙型冠状病毒的存在的用途。
肝炎病毒抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定肝炎病毒抗原,例如来自丙型肝炎病毒的蛋白C(HCV.C)、或来自戊型肝炎病毒的蛋白C(HEV.C)的载体。
在一个实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自丙型肝炎病毒的蛋白C。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/HCV.C盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自丙型肝炎病毒的蛋白C的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:89的pDeSNAP Univ/HCV.C盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自丙型肝炎病毒基因型1b(株TCHM-R2/03)的C蛋白的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自丙型肝炎病毒的蛋白C(HCV.C)。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:90的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/HCV.C/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-HCV.C]用于鉴定在生物样本中丙型肝炎病毒的存在的用途。
在另一个实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自戊型肝炎病毒的蛋白C(HEV.C)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/HEV.C盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***来自戊型肝炎病毒的蛋白C的基因的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:150的pDeSNAP Univ/HEV.C盒,其包括:
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自戊型肝炎病毒的C蛋白的DNA序列(Genbank#AB29196),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自戊型肝炎病毒的蛋白C(HEV.C)。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:151的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/HEV.C/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-HEV.C]用于鉴定在生物样本中戊型肝炎病毒的存在的用途。
疟疾抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定疟疾抗原,例如来自恶性疟原虫(MSP-1+AMA-1)的MSP-1和AMA-1蛋白(参见Pan W.等人,The Journalof Immunology,2004)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自寄生虫恶性疟原虫的MSP-1和AMA-1蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MSP-1+AMA-1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自寄生虫恶性疟原虫的MSP-1和AMA-1蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:91的pDeSNAP Univ/MSP-1+AMA-1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码来自恶性疟原虫的MSP-1(19)序列(50%G+C)的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码来自恶性疟原虫的AMA-1(III)序列(50%G+C)的DNA序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自恶性疟原虫的MSP-1+AMA-1蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ IDNO:92的氨基酸序列(对应于SNAP样/MSP-1/proTEV2/AMA-1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MSP-1+AMA-1]用于鉴定在生物样本中寄生虫恶性疟原虫的存在的用途。
钩端螺旋体病(Leptospirosis)抗原
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定钩端螺旋体病抗原,例如钩端螺旋体(Leptospira)细菌的HbpA蛋白(参见Sivakolundu S.等人,Journal ofMedical Microbiology,2012)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自问号钩端螺旋体(Leptospira interrogans)细菌的HbpA蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/HbpA盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自钩端螺旋体细菌的HbpA蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:93的pDeSNAP Univ/HbpA盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自问号钩端螺旋体血清变型Lai株56601(Genbank#AA51750.1)的HbpA(TonB依赖的外膜受体或LB191)的改短型的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自问号钩端螺旋体细菌的HbpA蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:94的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/HbpA/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-HbpA]用于鉴定在生物样本中钩端螺旋体细菌的存在的用途。
微生物肽
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达微生物肽,例如微生物肽MUB-40的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)MUB-40肽。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MUB40盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码MUB40肽的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:95的pDeSNAP Univ/MUB40盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码MUB-40肽的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)MUB-40肽。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:96的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/MUB40/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MUB40]用于鉴定在生物样本中配体的存在的用途。
涉及黄病毒发病机制的凝集素
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定涉及黄病毒发病机制的凝集素,例如C型类凝集素(CLEC5A)的小鼠或人类可溶型的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)小鼠CLEC5A(mo-CLEC5A)或人类CLEC5A(hu-CLEC5A)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码C型类凝集素的小鼠可溶型的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:97的pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码C型类凝集素(CLEC5A)的小鼠可溶型的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码C型类凝集素的人类可溶型的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:99的pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码C型类凝集素(CLEC5A)的人类可溶型的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)C型类凝集素(CLEC5A)的小鼠或人类可溶型。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:98的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/mo-CLEC5A/proTEV2/His标签融合蛋白)、或SEQ ID NO:100的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/hu-CLEC5A/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-mo-CLEC5A]或[SNAP-hu-CLEC5A]用于检测在生物样本中黄病毒的存在的用途。
抗黄病毒蚊子蛋白
在另一方面,本发明涉及用于在宿主细胞中表达特定抗病毒蚊子蛋白,例如来自库蚊(Culex)种的VAGO蛋白(cxVAGO)、或来自伊蚊(Aedes)种的VAGO蛋白(aaVAGO)的载体。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自白纹伊蚊(Aedes albopictus)蚊子的VAGO蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/aaVAGO盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自白纹伊蚊蚊子的VAGO蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:103的pDeSNAP Univ/aaVAGO盒,其包括:
-SEQ ID NO:152的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码来自白纹伊蚊蚊子的VAGO蛋白的DNA序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自白纹伊蚊蚊子的VAGO蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:104的氨基酸序列(对应于SNAP样/aaVAGO/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-aaVAGO]用于鉴定在生物样本中配体的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)蚊子的VAGO蛋白。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/cxVAGO盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自致倦库蚊蚊子的VAGO蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:101的pDeSNAP Univ/cxVAGO盒,其包括:
-SEQ ID NO:152的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码来自致倦库蚊蚊子的VAGO蛋白的DNA序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自致倦库蚊蚊子的VAGO蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:102的氨基酸序列(对应于SNAP样/cxVAGO/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-cxVAGO]用于鉴定在生物样本中配体的存在的用途。
病毒出血热抗原
在另一方面,本发明涉及用于表达特定病毒出血热抗原的载体,所述病毒出血热抗原例如:
-来自克里米亚-刚果病毒的核蛋白N(CCHF.N)、来自埃博拉病毒的核蛋白N(EBO.N)、来自马尔堡病毒的核蛋白N(MAR.N)、来自拉沙病毒的核蛋白N(LAS.N)、来自胡宁病毒的核蛋白N(JUN.N)、来自马丘波病毒的核蛋白N(MAC.N)、来自萨比亚病毒的核蛋白N(SAB.N)、或来自瓜纳里多病毒的核蛋白N(GUA.N);
-来自拉沙病毒的GP1的胞外域(LAS.ectoGP1)、来自胡宁病毒的GP1的胞外域(JUN.ectoGP1)、来自马丘波病毒的GP1的胞外域(MAC.ectoGP1)、来自萨比亚病毒的GP1的胞外域(SAB.ectoGP1)、或来自瓜纳里多病毒的GP1的胞外域(GUA.ectoGP1);
-来自拉沙病毒的GP2的胞外域(LAS.ectoGP2)、来自胡宁病毒的GP2的胞外域(JUN.ectoGP2)、来自马丘波病毒的GP2的胞外域(MAC.ectoGP2)、来自萨比亚病毒的GP2的胞外域(SAB.ectoGP2)、或来自瓜纳里多病毒的GP2的胞外域(GUA.ectoGP2);
-来自鄂木斯克(Omsk)病毒的包膜E蛋白的结构域III(OMSK.EDIII)、来自基亚萨努(Kasyanur)病毒的包膜E蛋白的结构域III(KAS.EDIII)、或来自奥克荷马(Alkhurma)病毒的包膜E蛋白的结构域III(ALK.EDIII)。
具体地,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自克里米亚-刚果病毒的核蛋白N(CCHF.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/CCHF.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自克里米亚-刚果病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:108的pDeSNAP Univ/CCHF.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自克里米亚-刚果病毒的核蛋白N的DNA序列,
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自克里米亚-刚果病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:109的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/CCHF.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-CCHF.N]用于鉴定在生物样本中克里米亚-刚果病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自埃博拉病毒的核蛋白N(EBO.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/EBO.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自埃博拉病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:110的pDeSNAP Univ/EBO.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自埃博拉病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_002549),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自埃博拉病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:111的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/EBO.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-EBO.N]用于鉴定在生物样本中埃博拉病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自马尔堡病毒的核蛋白N(MAR.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MAR.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自马尔堡病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:112的pDeSNAP Univ/MAR.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自马尔堡病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_001608),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自马尔堡病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:113的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/MAR.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MAR.N]用于鉴定在生物样本中马尔堡病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自拉沙病毒的核蛋白N(LAS.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/LAS.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自拉沙病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:114的pDeSNAP Univ/LAS.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自拉沙病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_004296),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自拉沙病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:115的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/LAS.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-LAS.N]用于鉴定在生物样本中拉沙病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自胡宁病毒的核蛋白N(JUN.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JUN.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自胡宁病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:116的pDeSNAP Univ/JUN.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自胡宁病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_005081),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自胡宁病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:117的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/JUN.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-JUN.N]用于鉴定在生物样本中胡宁病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自马丘波病毒的核蛋白N(MAC.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MAC.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自马丘波病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:118的pDeSNAP Univ/MAC.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自马丘波病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_005078),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自马丘波病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:119的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/MAC.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MAC.N]用于鉴定在生物样本中马丘波病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自瓜纳里多病毒的核蛋白N(GUA.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/GUA.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自瓜纳里多病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:120的pDeSNAP Univ/GUA.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自瓜纳里多病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_005077),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自瓜纳里多病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:121的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/GUA.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-GUA.N]用于鉴定在生物样本中瓜纳里多病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自萨比亚病毒的核蛋白N(SAB.N)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/SAB.N盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自萨比亚病毒的核蛋白N的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:122的pDeSNAP Univ/SAB.N盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-编码来自萨比亚病毒的核蛋白N的DNA序列(Genbank#NC_006317),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第二DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自萨比亚病毒的核蛋白N。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:123的氨基酸序列(对应于SNAP样/proTEV1/SAB.N/proTEV2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-SAB.N]用于鉴定在生物样本中萨比亚病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自鄂木斯克病毒的包膜蛋白E的结构域III(OMSK.EDIII)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/OMSK.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自鄂木斯克病毒的EDIII蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:124的pDeSNAP Univ/OMSK.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:152的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码鄂木斯克病毒的EDIII蛋白的DNA序列(Genbank#NC_005062),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自鄂木斯克病毒的EDIII蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:125的氨基酸序列(对应于SNAP样/OMSK.EDIII/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-OMSK.EDIII]用于鉴定在生物样本中鄂木斯克病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自基亚萨努森林病病毒的包膜蛋白E的结构域III(KYA.EDIII)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/KYA.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自基亚萨努森林病病毒的EDIII蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:126的pDeSNAP Univ/KYA.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:152的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码基亚萨努森林病病毒的EDIII蛋白的DNA序列(Genbank#JF416958),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自基亚萨努森林病病毒的EDIII蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:127的氨基酸序列(对应于SNAP样/KYA.EDIII/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-KYA.EDIII]用于鉴定在生物样本中基亚萨努森林病病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自奥克荷马病毒的包膜蛋白E的结构域III(ALK.EDIII)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/ALK.EDIII盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自奥克荷马病毒的EDIII蛋白的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:128的pDeSNAP Univ/ALK.EDIII盒,其包括:
-SEQ ID NO:152的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码奥克荷马病毒的EDIII蛋白的DNA序列(Genbank#NC_004355),
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自奥克荷马病毒的EDIII蛋白。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:129的氨基酸序列(对应于SNAP样/ALK.EDIII/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-ALK.EDIII]用于鉴定在生物样本中奥克荷马病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自拉沙病毒的糖蛋白GP1胞外域(LAS.ectoGP1)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自拉沙病毒的糖蛋白GP1胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:130的pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自拉沙病毒的糖蛋白GP1胞外域的DNA序列(Genbank#NC_004296),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自拉沙病毒的糖蛋白GP1胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:131的氨基酸序列(对应于SNAP样/LAS.ectoGP1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-LAS.ectoGP1]用于鉴定在生物样本中拉沙病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自胡宁病毒的糖蛋白GP1胞外域(JUN.ectoGP1)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自胡宁病毒的糖蛋白GP1胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:132的pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自胡宁病毒的糖蛋白GP1胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005081),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自胡宁病毒的糖蛋白GP1胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:133的氨基酸序列(对应于SNAP样/JUN.ectoGP1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-JUN.ectoGP1]用于鉴定在生物样本中胡宁病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自马丘波病毒的糖蛋白GP1胞外域(MAC.ectoGP1)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自马丘波病毒的糖蛋白GP1胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:134的pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自马丘波病毒的糖蛋白GP1胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005078),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自马丘波病毒的糖蛋白GP1胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:135的氨基酸序列(对应于SNAP样/MAC.ectoGP1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MAC.ectoGP1]用于鉴定在生物样本中马丘波病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP1胞外域(GUA.ectoGP1)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP1胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:136的pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP1胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005077),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP1胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ IDNO:137的氨基酸序列(对应于SNAP样/GUA.ectoGP1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-GUA.ectoGP1]用于鉴定在生物样本中瓜纳里多病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自萨比亚病毒的糖蛋白GP1胞外域(SAB.ectoGP1)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自萨比亚病毒的糖蛋白GP1胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:138的pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP1胞外域的DNA序列(Genbank#NC_006317),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自萨比亚病毒的糖蛋白GP1胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:139的氨基酸序列(对应于SNAP样/SAB.ectoGP1/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-SAB.ectoGP1]用于鉴定在生物样本中萨比亚病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自拉沙病毒的糖蛋白GP2胞外域(LAS.ectoGP2)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自拉沙病毒的糖蛋白GP2胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:140的pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自拉沙病毒的糖蛋白GP2胞外域的DNA序列(Genbank#NC_004296),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自拉沙病毒的糖蛋白GP2胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:141的氨基酸序列(对应于SNAP样/LAS.ectoGP2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-LAS.ectoGP2]用于鉴定在生物样本中拉沙病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自胡宁病毒的糖蛋白GP2胞外域(JUN.ectoGP2)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自胡宁病毒的糖蛋白GP2胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:142的pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自胡宁病毒的糖蛋白GP2胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005081),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自胡宁病毒的糖蛋白GP2胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:143的氨基酸序列(对应于SNAP样/JUN.ectoGP2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-JUN.ectoGP2]用于鉴定在生物样本中胡宁病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自马丘波病毒的糖蛋白GP2胞外域(MAC.ectoGP2)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自马丘波病毒的糖蛋白GP2胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:144的pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自马丘波病毒的糖蛋白GP2胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005078),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自马丘波病毒的糖蛋白GP2胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:145的氨基酸序列(对应于SNAP样/MAC.ectoGP2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-MAC.ectoGP2]用于鉴定在生物样本中马丘波病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP2胞外域(GUA.ectoGP2)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP2胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:146的pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP2胞外域的DNA序列(Genbank#NC_005077),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自瓜纳里多病毒的糖蛋白GP2胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ IDNO:147的氨基酸序列(对应于SNAP样/GUA.ectoGP2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-GUA.ectoGP2]用于鉴定在生物样本中瓜纳里多病毒的存在的用途。
在另一实施方案中,本发明涉及包含编码以下的核苷酸序列的载体:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;以及b)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)来自萨比亚病毒的糖蛋白GP2胞外域(SAB.ectoGP2)。
在优选的实施方案中,这种载体包含所谓“pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP2盒”,即上述限定的pDeSNAPUniv DNA盒,其中已***编码来自萨比亚病毒的糖蛋白GP2胞外域的序列。
在优选的实施方案中,这种载体包含具有核苷酸序列SEQ ID NO:148的pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2盒,其包括:
-SEQ ID NO:22的昆虫BiP序列,
-编码来自萨比亚病毒的糖蛋白GP2胞外域的DNA序列(Genbank#NC_006317),
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,以及
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
在另一方面,本发明涉及被所述载体稳定转染的重组细胞。
在另一方面,本发明涉及融合多肽,其包括:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)(EC 2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;以及b)来自萨比亚病毒的糖蛋白GP2胞外域。在这种融合多肽中,所述AGT酶优选为SEQ ID NO:2的蛋白、或其同源物(所述同源物如上文定义)。这种融合多肽是,例如SEQ ID NO:149的氨基酸序列(对应于SNAP样/SAB.ectoGP2/His标签融合蛋白)。
因此,在另一方面,本发明还涉及,例如由于本发明的免疫分析,这种融合蛋白[SNAP-SAB.ectoGP2]用于鉴定在生物样本中萨比亚病毒的存在的用途。
实施例
在本发明的上下文中,开发多重基于珠的免疫分析用于快速和同步检测生物液体中抗虫媒病毒的抗体。
所述***基于xMAP技术(Luminex公司),并使用抗原包被的微球混合物作为对特异性人类免疫球蛋白的捕获剂。不同组的微球(Magplex,Luminex公司)偶联有纯化的AGT融合蛋白,即SNAP-标签病毒重组蛋白:sSNAP-DV1.EDIII、sSNAP-DV2.EDIII、sSNAP-DV3.EDIII、sSNAP-DV4.EDIII、sSNAP-WN.EDIII、sSNAP-JE.EDIII、sSNAP-USU.EDIII、sSNAP-TBE.EDIII、sSNAP-YF.EDIII、sSNAP-MVE.EDIII、sSNAP-Rocio.EDIII、sSNAP-WSL.EDIII、sSNAP-ZIKA.EDIII、SNAP-DV1ectoM、sSNAP-N.RVF、sSNAP-N.TOS、以及CHIK.sE2-SNAP。用AGT蛋白的底物作为接头(BG-PEG-NH2,New England Biolabs),将重组抗原共价偶联至羧基微球表面,从而与标准胺偶联程序相比增强抗体捕获效率。
使用抗SNAP-标签抗体和特异性小鼠单克隆抗体的技术验证确认了偶联效率,并表明了长期的抗原稳定性(长达6个月)。本申请不限于病毒抗原,因为任何肽或多肽可用于珠包被和随后的抗体捕获。
I.材料和方法
1、使用下列缓冲液和溶液:
a)PBS缓冲液:在1L无菌水中pH 7.4的100mL的10×PBS;
b)SNAP偶联缓冲液(PBS-DTT):在1L无菌水中pH 7.4的100mL 10×PBS、0.5mL 10%吐温20、1mL 1.0M DTT;
c)封闭/分析缓冲液(PBS-B):在1L无菌水中pH 7.4的PBS、1%BSA;
d)储存缓冲液(PBS-TBN):在1L无菌水中的100mL的10×PBS、1g BSA、2mL的10%吐温20、500mg的叠氮化钠、1mL的1.0M DTT;
e)底物溶液(4mg/mL):2mg的BG-PEG-NH2、DMSO 500μL。
f)活化溶液(EDAC/SNHS):在蒸馏水中的50mg/mL的EDAC溶液或50mg/mL的SNSHS。
2、使用下列材料
2.1.MagPlex Luminex微球:MC 100XX-ID(其中XX是荧光区),如在图7B所述,XX可以是例如26、27、28、29、34、35、36、37、45、52、53、63、64。
2.2.hAGT底物:PEG-BG-NH2(NEB S9150S)
2.3融合蛋白SNAP病毒EDIII
本领域技术人员公知包括AGT和病毒EDIII部分的融合蛋白的生成。只要AGT酶在融合蛋白中保持活性,出于这一目的可以使用所有已知的合成方法。
在本例中,已使用SEQ ID NO:2的AGT突变体SNAP并已生成SNAP-病毒EDIII融合蛋白。
在果蝇S2诱导表达***(DES,Invitrogen)已被选择用于在非脊椎动物细胞中批量生产来自黄病毒的个体EDIII以及已经使用来自Invitrogen的质粒pMT/BiP/V5-HisA。
这种质粒包括:
-金属硫蛋白启动子pMT;
-SEQ ID NO:22的昆虫ssBiP序列;
-BglII和AgeI限制性位点;
-编码定位于AgeI限制性位点下游的His6标签的SEQ ID NO:28的DNA;以及
-定位于AgeI限制性位点与编码His6标签的DNA之间的SEQ ID NO:26的DNA间隔序列。
编码来自虫媒病毒WN、USU、JE、TBE、DEN-1至DEN-4、YF、罗西奥、MVE、寨卡、SLE、和WSL的E蛋白的全长结构域III的合成基因列在SEQ ID NO:3至SEQ ID NO:14中。EDIII氨基酸序列符合阅读框地融合至SNAP蛋白的C末端,其中两部分由接头GGGS(SEQ ID NO:25)所隔开。编码SNAP-EDIII的DNA序列***至质粒pMT/BiP/V5-His标签(Invitrogen)以生成质粒pMT/BiP/SNAP/EDIII/His标签。
所得质粒pMT/BiP/SNAP-EDIII-His标签,其可驱动分泌的SNAP-EDIII-His6融合蛋白表达,融合蛋白与筛选标记物pCo-Blast共转染至S2细胞以生成显示杀稻瘟素(blasticidine)抗性的稳定S2/sSNAP-ED III-His标签细胞系。
使用重金属镉(Cd2+)刺激在转瓶(1000ml)中生长的稳定S2细胞系10天,以及浓缩和纯化来自细胞外介质的蛋白。
在重金属镉诱导10天后,观察到在稳定的S2/sSNAP-EDIII-His标签细胞上清中分泌的SNAP-标签EDIII蛋白的积累。
相应地已经生产蛋白SEQ ID NO:21的SNAP-DEN1.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-DEN2.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-DEN3.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-DEN4.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-WN.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-JE.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-YF.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-MVE.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-Rocio.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-WSL.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-ZIKA.EDIII、SEQ ID NO:X的SNAP-SLE.EDIII。
3、制备抗原偶联的珠
生产抗原偶联珠包括两步骤:具有O6-苄基鸟嘌呤衍生物(BG-PEG-氨基)的微球表面的官能化,和使用BG-PEG-氨基作为锚的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白的共价固定(图1)。使用优化的两步碳二亚胺方法使BG-PEG-氨基底物共价包被羧基微球表面(Wong等人,Journal of Clinical Microbiolog 42(1):65-72,2004)。随后,通过将苄基转移到SNAP蛋白的活性位点半胱氨酸来把偶联BG-PEG-氨基化合物不可逆地连接至嵌合SNAP-病毒Ag蛋白。由于这种反应的高特异性,所述融合蛋白唯独通过SNAP结构域偶联,使得病毒抗原能接近以便与抗体相互作用。
3.1首先,按照制造商说明将商业珠活化(通过使用EDAC和SNHS活化溶液),并在PBS缓冲液中洗涤。按照制造商说明,在黑暗中进行所有步骤以防止珠的荧光淬灭。
每个偶联过程使用约1.25×106个珠。
3.2然后在活化珠中加入在DMSO溶液中的AGT底物PEG-BG-NH2在室温中6小时或在4℃过夜,并随后用PBS缓冲液洗涤。
3.3然后在室温下使用封闭缓冲液30分钟以封闭未结合的羧基位点,随后用SNAP偶联缓冲液洗涤珠。
3.4重悬在SNAP偶联缓冲液中的SNAP-EDIII蛋白(1mg/mL)与这样获得的珠在室温孵育两小时,然后使用SNAP偶联缓冲液洗涤一次,并用储存缓冲液(PBS-TBN)洗涤三次。
4、微球荧光免疫分析
与不同SNAP-病毒Ag缀合的珠组,通过涡流混合以确保全部珠分散。调整珠密度为100个珠/μL之后,将25μL的每种珠组(含2500微球)转移至96孔微量滴定板(Bio-Plex Pro平底板,BioRad),在分离的孔中用作单重分析、或在相同孔中混合用作多重分析。使用100μl洗涤缓冲液(BioPlex洗涤缓冲液,BioRad)洗涤微球三次,对于磁珠使用微量板洗涤站(BioPlex Pro洗涤站,BioRad)。样本(抗体或血清)稀释在分析缓冲液(PBS-BSA),并将50μL所得溶液加入到含有缀合珠的测试孔中。在黑暗中在平板摇床上孵育30分钟之后,将板如前所述洗涤。随后,荧光染料标记的第二抗体在分析缓冲液(PBS-BSA)中稀释至2μg/mL,将50μL的所得溶液加入至含缀合珠的测试孔中。在黑暗中在平板摇床上孵育30分钟之后,将板如前所述洗涤。最后,链霉亲和素藻红蛋白(SAPE,Invitrogen MolecularProbes)在分析缓冲液(PBS-BSA)中稀释至2μg/mL,将50μL的所得溶液加入至微板孔中。将板在黑暗中在平板摇床上孵育10分钟,并如前所述洗涤,之后将孔中内容物重悬于125μl分析缓冲液中。使用双激光流式分析仪(BioPlex200设备,BioRad)从每孔50个微球的流式分析中评估结合到单个微球的检测抗体的中值荧光强度(MFI)。荧光检测设备配备有用于检测珠类型的第一激光器、以及第二激光器,其通过激发缀合至特异检测抗体的荧光团(红藻红蛋白)以确保对捕获的IgM或IgG进行定量。
4.1抗原偶联的确认
通过使用兔抗-SNAP-标签多克隆抗体(GenScript)的稀释液测试抗原偶联微球来确认抗原偶联。如上所述,以单重格式进行荧光免疫分析。在PBS-BSA中进行抗SNAP抗体的两倍稀释系列(在4000ng/mL起始以及在3.9ng/mL终止),并将每个稀释的体积加入到含有珠的测试孔中。生物素缀合的山羊抗兔IgG(在50μLPBS-BSA中2μg/mL)用作第二抗体以检测结合的抗SNAP抗体。
图2显示对偶联到嵌合SNAP-病毒抗原蛋白的8组不同微球进行抗SNAP抗体检测所观察到的荧光结果(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)。
4.2检测特异性抗体
用纯化的单克隆小鼠抗体(抗-WNV、抗-DV1和抗-DV2)和多克隆小鼠血清(抗-DV3、抗-DV4、抗-YF和抗-JE)或人血清(抗-DV1)来评估抗原缀合微球对特异性抗体的捕获和检测。如上所述,以单重和多重格式进行荧光免疫分析。在PBS-BSA中进行纯化的小鼠单克隆抗体的四倍稀释系列(在400ng/mL起始以及在0.1ng/mL终止),以及小鼠和人类血清的四倍稀释系列(以1:25起始以及在1:102400终止),并将每个稀释的体积加入到含有珠的测试孔中。生物素缀合的山羊抗鼠IgG(在50μL PBS-BSA中2μg/mL)用作第二抗体以便检测结合的单克隆和多克隆小鼠抗体。生物素缀合的山羊抗人IgM(在50μL PBS-BSA中2μg/mL)或生物素缀合的山羊抗人IgG(在50μL PBS-BSA中2μg/mL)分别用于在人血清中检测结合的IgM或IgG抗体。
图3比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV2抗体对嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白的免疫分析实验的灵敏度,所述嵌合SNAP-DV2.EDIII蛋白通过hAGT蛋白的底物(本发明的偶联)缀合至微球、或者通过Bio-Plex的胺偶联试剂盒(BIORAD)进行偶联。
图4比较了用于检测纯化的单克隆抗-DV1抗体对嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白的免疫分析实验的灵敏度,所述嵌合SNAP-DV1.EDIII蛋白以单重格式缀合至微球,或者与其它嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)以多重格式缀合至微球。
图5显示用于检测纯化的单克隆抗-WNV抗体的稀释液对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-TBE)的多重免疫分析实验的反应性和特异性。
图6显示以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-ROCIO、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA)进行的在小鼠多克隆血清中针对DV3的抗-DV3 IgG检测(A)、和在小鼠多克隆血清中针对YF的抗-YF IgG检测(B)的反应性和特异性。
图7显示以多重免疫分析对偶联至微球的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白(SNAP-DV1.EDIII、SNAP-DV2.EDIII、SNAP.DV3.EDIII、SNAP.DV4.EDIII、SNAP-WNV、SNAP-YF、SNAP-JE、SNAP-WSL、SNAP-ROCIO、SNAP-MVE、SNAP-SLE、SNAP-ZIKA、SNAP-TBE)进行的DV1感染的人患者血清中抗-DV1IgM检测(A)和抗-DV1 IgG检测(B)的反应性和特异性。
II.结果
本发明的***使用抗原包被Magplex微球(Luminex公司)的混合物作为对特异性人免疫球蛋白的捕获试剂。每组内部颜色编码的微球已被偶联到特定的重组抗原并与其它类型的微球以小样本体积混合。这种***的能力在于实际上它可能使用流式分析工具同时分析每孔多达100种类型的偶联微球。荧光检测设备配备有用于检测珠类型的第一激光器、以及第二激光器,其通过激发缀合至特异检测抗体的荧光团(藻红蛋白)以确保对捕获的IgM或IgG进行定量。凭借其广泛的多重能力和更低的检测限,这种方法提供了比传统的ELISA测量实质性的成本和样本节约。
目前,16组不同微球已经与纯化的嵌合SNAP-病毒Ag蛋白相偶联,这允许对登革血清型1至4、西尼罗病毒、黄热、日本脑炎、蜱传脑炎、圣路易脑炎、穆雷谷脑炎、威塞尔布朗、寨卡、罗西奥、乌苏图、裂谷热和基孔肯雅病毒特异的血清抗体进行滴定。这种***的生产是高度时间和成本效益的,因为产生一组抗原偶联微球(~1.25×106微球)仅仅需要很少量的重组抗原(<50μg),其足以进行500个个体的分析。此外,选择的微球组适应于可负担的、紧凑、以及稳健的荧光检测***,例如MagPix(Luminex公司)。
使用抗SNAP抗体对抗原偶联的评价(图2)确认偶联效率,并证明在不同偶联微球组之间的结合抗原的相对量是可比的。使用纯化的小鼠抗体对抗体捕获和检测进行评估显示,与用标准胺偶联方法获得的抗原偶联微球相比,产生的抗原偶联微球对特异性抗体具有提高的捕获(图3)。此外,其表明这种方法的低检测限并确认多重化不影响抗体的检测(图4)。此外,当保存在4℃时,抗原缀合的微球表现出长期稳定性(>6个月)。最后,证明在多重免疫分析中每组偶联微球针对纯化的小鼠单克隆抗体(图5),针对在多克隆小鼠血清中的IgG抗体(图6A-B)以及针对在来自感染人类的多克隆血清中的IgM和IgG抗体两者(图7)的特异性。
凭借其广泛的多重能力(每孔多达100种类型的偶联微球)和低检测限,这种方法提供比传统的ELISA测量实质性的成本和样本节约。
III.产生包含SNAP和施马伦贝格病毒的N核蛋白的融合蛋白
1、构建编码融合蛋白SNAP-SBV.N的载体
包含SNAP和施马伦贝格病毒的N核蛋白的嵌合融合蛋白已如下获得:
在第一步,通过在其5'末端***EcoRV限制性位点和在其3'末端***XmaI限制性位点来突变编码BH80/11-4株的N核蛋白和NSs蛋白的S段的开放阅读框的序列。此外,通过将294T核苷酸突变为294A除去内部EcoRV限制性位点。此突变的序列示于SEQ ID NO:17。
然后,将此突变的序列***到SEQ ID NO:34的pDeSNAP Univ盒的EcoRV和XmaI限制性位点以产生SEQ ID NO:36的“pDeSNAP Univ/SBV.N”DNA盒。
所谓“pDeSNAP Univ/SBV.N”DNA盒包括(参见图9和SEQ ID NO:36):
-SEQ ID NO:23的昆虫BiP样序列,
-SEQ ID NO:31的SNAP样序列,
-编码间隔序列GGGS(SEQ ID NO:25)的第一DNA序列SEQ ID NO:26,
-编码序列ENLYFQS(SEQ ID NO:32)的pro-TEV1切割位点的DNA序列SEQID NO:29,
-SBV.N DNA序列SEQ ID NO:17(其对应于天然SBV.N序列,其中已删除内部EcoRV位点并在末端加入两个EcoRV和XmaI位点),
-编码序列ENLYFQG(SEQ ID NO:33)的pro-TEV2切割位点的DNA序列SEQ ID NO:30,
-编码His标签序列的DNA序列SEQ ID NO:28。
注意到此盒还另外包括ATG上游的NheI位点、在BiP样序列和SNAP样序列之间的BglII位点,以及定位在终止密码子下游的AgeI位点和HindIII位点两者。
在pDeSNAP Univ/SBV.N盒(见图9)的BglII和AgeI限制性位点之间所包含的序列通过酶消化被切除,然后将其克隆到pMT/BiP/V5-A质粒(Invitrogen)以产生pMT/BiP/SNAP-SBV.N载体。这种载体已经用于产生稳定的分泌SNAP-SBV.N融合蛋白的S2细胞。
然后,将pDeSNAP Univ/SBV.N盒的NheI和NotI限制性位点之间所包含序列克隆到pcDNA3质粒(Invitrogen)中以产生pcDNA3/SNAP-SBV.N载体。将后,使用此载体以产生分泌SNAP-SBV.N融合蛋白的稳定哺乳动物细胞。
2、产生融合蛋白SNAP-SBV.N
所得质粒pMT/BiP/SNAP-SBV.N,其允许产生SNAP标签的SBV.N蛋白作为分泌的融合蛋白,与选择标记物pCo-Blast共转染入S2细胞以产生显示杀稻瘟素抗性的稳定的S2/SNAP-SBV.N细胞系。
这种细胞系已经以编号CNCM I-4616保藏在巴黎15区邮编75724,DocteurRoux大街25号,巴斯德研究所的法国国家微生物保藏中心(CNCM)。
使用重金属镉(Cd2+)对转瓶(1000ml)中生长的稳定S2细胞系刺激10天。
在重金属镉诱导10天后,观察到在S2/SNAP-SBV.N细胞上清中分泌的SNAP-SBV.N蛋白的积累。
使用Cd2+诱导10天的S2/SNAP-SBV.N细胞上清的4mL中的0.01mL通过使用抗-His标签抗体(稀释1∶1,000)的免疫印迹分析进行测试(参见图10)。
嵌合蛋白SNAP-SBV.N与限定量的SNAP-TOS.N嵌合蛋白(对应于包含SNAP和来自白蛉病毒属托斯卡纳病毒的N核蛋白的融合蛋白)相比较。
来自诱导10天的S2/SNAP+SBV.N细胞的纯化SNAP-SBV.N的产量是每升细胞培养物18mg(图10B)。
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Claims (56)
1.一种用于检测存在于来自受试者的生物样本中至少两种不同靶抗体的体外分析方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供第一融合蛋白,其包括:
-含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物;
(d)提供第二融合蛋白,其包括:
-含有第二表位的多肽,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(f)获得第二固体支持物,其与由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位共价偶联,
其中所述第一和第二固体支持物可彼此特异性地鉴定;
(g)使所述生物样本与获自步骤(c)和(f)的第一和第二固体支持物相接触;
(h)检测所述至少两种靶抗体的存在。
2.根据权利要求1所述的分析方法,其中所述的方法用于检测来自受试者的生物样本中至少5种,更优选至少15种以及甚至更优选至少50种靶抗体。
3.根据权利要求1或2所述的分析方法,其中所述第一和第二表位属于相同的生物种或属于不相关的生物种。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的分析方法,其中所述AGT多肽是SEQID NO:2的SNAP突变体。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的分析方法,其中所述AGT多肽的所述底物是O6苄基鸟嘌呤衍生物,其具有式I:
R1-X-CH2-R3-R4-Y
其中:
-R1是含有1至5个氮原子的杂芳基团,优选如下式的嘌呤自由基:
其中R5是氢、卤素如氯或溴、三氟甲基、或羟基;R6是氢、羟基或者未取代的或取代的氨基;以及R2是氢、1至10个碳原子的烷基、或糖部分;
-X是氧或硫原子;优选氧原子;
-R3是芳香或杂芳基团,或任选地被连接至CH2的双键所取代的不饱和烷基、环烷基或杂环基团;优选苯基,例如由在对位或间位的R4所取代的苯基;
-R4是接头部分,优选-CH2-NH-CO-NH-[C2H4-O]n-,其中n在1至8,优选2至6之间;
-Y是反应性基团。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物可通过其特定定位、尺寸、直径、重量、粒度测定、和/或标记来特异性鉴定。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物使用荧光染料、生色团、放射性同位素、和/或质量标签来标记。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物由聚苯乙烯、纤维素、硝基纤维素、玻璃、陶瓷、树脂、橡胶、塑料、二氧化硅、硅树脂、金属、和/或聚合物制成。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物在接触AGT底物之前已使用与AGT底物的反应性基团互补的基团进行官能化。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物使用表面羧基基团进行官能化。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的分析方法,其中所述AGT底物通过碳二亚胺反应共价偶联至所述固体支持物。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物是试管、微量滴定孔、片、珠、芯片、和/或微粒。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物是微粒。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物有磁性。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物是用荧光染料进行内部标记的微粒。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的分析方法,其中所述固体支持物是用荧光染料进行内部标记的具有磁性的微粒,其封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被中以便共价偶联配体。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分析方法,其中所述第一和/或第二表位存在于病毒蛋白中,所述病毒蛋白选自:SEQ ID NO:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID NO:4的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID NO:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID NO:6的登革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID NO:7的西尼罗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:8的黄热病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:9的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:10的寨卡病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:11的威塞尔布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:12的罗西奥病毒的EDIII蛋白、SEQ IDNO:13的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO:14的圣路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:56编码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:57编码的基因型5的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:58编码的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒以及致癌HPV株例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
18.根据权利要求1至16中任一项所述的分析方法,其中与所述第一和第二固体支持物偶联的所述第一和第二融合蛋白选自:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ ID NO:113、SEQ IDNO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ ID NO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149和SEQ ID NO:151。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分析方法,其中所述生物样本选自全血、血清、血浆、尿液、***、脑脊髓液和唾液。
20.一种试剂盒,其用于检测存在于来自受试者的生物样本中的至少两种不同的靶抗体,其包括在权利要求1中所限定的至少两种固体支持物:
-在权利要求1的步骤(c)中所获得的第一固体支持物,其共价偶联至第一
靶抗体所识别的第一表位;以及
-在权利要求1的步骤(f)中所获得的第二固体支持物,其共价偶联至第二
靶抗体、而不是所述第一靶抗体所识别的第二表位;
其中所述至少两种固体支持物可以特异性地彼此鉴定以便能够检测两种不同靶抗体。
21.根据权利要求20所述的试剂盒,其包括至少10种,优选至少50种,更优选至少100种不同的偶联固体支持物。
22.根据权利要求20或21所述的试剂盒,其中所述固体支持物是微粒。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的试剂盒,其中所述固体支持物在至少一个单区室中混合在一起。
24.根据权利要求20至23中任一项所述的试剂盒,其中所述固体支持物是混合在微滴定板的至少一个孔或在至少一个管中的微粒。
25.根据权利要求20至24中任一项所述的试剂盒,其进一步包括用于检测结合至固体支持物的至少两种靶抗体的工具。
26.根据权利要求25所述的试剂盒,其中所述工具是识别靶抗体恒定部分的第二抗体,所述第二抗体优选被标记。
27.根据权利要求20至26中任一项所述的试剂盒,其中所述第一和/或第二表位存在于病毒蛋白中,所述病毒蛋白选自:SEQ ID NO:3的登革病毒1的EDIII蛋白、SEQ ID NO:4的登革病毒2的EDIII蛋白、SEQ ID NO:5的登革病毒3的EDIII蛋白、SEQ ID NO:6的登革病毒4的EDIII蛋白、SEQ ID NO:7的西尼罗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:8的黄热病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:9的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:10的寨卡病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:11的威塞尔布朗病毒的EDIII蛋白、SEQ ID NO:12的罗西奥病毒的EDIII蛋白、SEQ IDNO:13的穆雷脑炎病毒的EDIII蛋白、以及SEQ ID NO:14的圣路易斯脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:54编码的基因型1的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:55编码的基因型2的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:56编码的基因型4的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:57编码的基因型5的日本脑炎病毒的EDIII蛋白、由SEQ ID NO:58编码的拉本斯堡病毒的EDIII蛋白、以及HIV1、HIV2、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、西尼罗病毒的病毒蛋白以及致癌HPV株如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68的病毒蛋白。
28.根据权利要求20至26中任一项所述的试剂盒,其包含由至少两种融合蛋白所包被的至少两种固体支持物,所述至少两种融合蛋白选自:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:111、SEQ IDNO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:117、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:123、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:127、SEQ ID NO:129、SEQ IDNO:131、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:149以及SEQ ID NO:151。
29.权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒用于检测来自受试者的生物样本中至少两种靶抗体的用途。
30.权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒用于诊断受试者中至少两种靶疾病的用途,其中所述靶疾病是由***瘤病毒或来自黄病毒科(Flaviviridae)(登革、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(Togaviridae)(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(Bunyaviridae)(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(Caliciviridae)(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(Arenaviridae)(拉沙)或丝状病毒科(Filoviridae)(埃博拉、马尔堡)的RNA病毒所引起的病毒感染,由问号钩端螺旋体(Leptospirosa Interrogans)引起的细菌感染,或者由恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)引起的感染。
31.一种用于诊断受试者中至少一种靶疾病的体外方法,所述靶疾病已知在所述受试者中诱导至少一种靶抗体的合成,所述体外方法包括进行权利要求1至19中任一项所限定的分析方法,其中如果所述至少一种靶抗体的量高于对照值,则所述受试者被诊断为患有所述至少一种靶疾病。
32.根据权利要求31所述的体外诊断方法,其中所述至少一种靶疾病是由***瘤病毒或来自黄病毒科(登革、黄热病、西尼罗、日本脑炎、蜱传脑炎、丙型肝炎病毒)、披膜病毒科(基孔肯雅、罗斯河、马雅罗、西部马脑炎、东部马脑炎、委内瑞拉马脑炎病毒)、本雅病毒科(克里米亚-刚果出血热、裂谷热、施马伦贝格病毒)、杯状病毒科(戊型肝炎病毒)、沙粒病毒科(拉沙)或丝状病毒科(埃博拉病毒、马尔堡)的RNA病毒所引起的病毒感染,由问号钩端螺旋体引起的细菌感染,或者由恶性疟原虫引起的感染。
33.根据权利要求31或32所述的体外诊断方法,其中所述方法用于诊断所述受试者中至少5种,更优选至少15种以及甚至更优选至少50种病毒感染。
34.根据权利要求31至33中任一项所述的体外诊断方法,其中所述对照值表示在来自未患所述靶疾病的受试者样本中所述靶抗体的量。
35.一种用于在官能化的固体支持物上共价偶联具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽的方法,所述方法包括以下步骤:
a)活化所述官能化的固体支持物;
b)加入所述AGT多肽的底物,所述底物悬浮于含有在0和20%之间的DMSO的缓冲液中,在适当条件下使得底物共价附着于所述支持物;
c)在PBS/DTT缓冲液中使所述AGT多肽接触步骤b)的底物包被的支持物;
其中未结合的分子在步骤b)和c)后被洗脱。
36.根据权利要求35所述的方法,其中DTT在PBS/DTT缓冲液中浓度是1mM。
37.根据权利要求35至36中任一项所述的方法,其中所述固体支持物是使用荧光染料进行内部标记的具有磁性的微球,所述微球封装入含有表面羧基基团的官能聚合物外包被中。
38.一种通过权利要求35至37中任一项所述的方法获得的固体支持物。
39.根据权利要求38所述的固体支持物,其中所述固体支持物是微球。
40.根据权利要求38或39所述的固体支持物在根据权利要求1至19所述的分析方法中的用途。
41.一种载体,其用于在宿主细胞中表达施马伦贝格病毒的N核蛋白,所述载体包含编码以下的核苷酸序列:a)在所述宿主细胞中具有功能的分泌信号肽;b)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)、其突变体、片段或催化结构域;以及c)SEQ ID NO:16的施马伦贝格病毒的N核蛋白。
42.根据权利要求41所述的载体,其包含核苷酸序列SEQ ID NO:35或SEQ IDNO:36的核苷酸序列。
43.一种重组细胞,其被根据权利要求41或42所述的载体稳定地转染。
44.根据权利要求43所述的重组细胞,其中所述重组细胞是昆虫细胞,优选S2细胞。
45.根据权利要求43或44所述的重组细胞,其中所述重组细胞是S2细胞,其已在2012年4月24日以编号CNCM I-4616保藏在法国国家微生物保藏中心(CNCM),巴斯德研究所(法国,巴黎15区邮编75724,Docteur Roux大街25号)。
46.一种融合多肽,其包含:a)6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶(AGT)(EC2.1.1.63)、其突变体或催化结构域;和b)SEQ ID NO:16的施马伦贝格病毒的N核蛋白。
47.根据权利要求46所述的融合多肽,其具有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42或SEQ ID NO:46。
48.一种用于制造权利要求20至28中任一项所限定的试剂盒的方法,所述方法包括以下步骤:
(a)提供至少第一融合蛋白,其包含:
-含有由第一靶抗体识别的第一表位的多肽,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(b)使所述第一融合蛋白与第一固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(c)获得与第一靶抗体识别的第一表位共价偶联的第一固体支持物;
(d)提供至少第二融合蛋白,其包括:
-含有第二表位的多肽,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别,以及
-具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽;
(e)使所述第二融合蛋白与第二固体支持物相接触,所述支持物与所述AGT多肽的底物共价偶联;
(f)获得与第二表位共价偶联的第二固体支持物,所述第二表位由第二靶抗体而不是由所述第一靶抗体所识别;
其中所述至少第一和至少第二固体支持物可彼此特异性地鉴定出。
49.一种多重免疫筛选分析,其包含至少2、25、50、96种权利要求1或48所限定的固体支持物,并且其中每种所述固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长。
50.一种多重免疫筛选分析方法,其包括:
a)使一种或几种生物样本接触至少2、25、50、96种权利要求1或48所限定的固体支持物,并且其中每种固体支持物在激发后发射不同的和可区分的波长;以及
b)检测靶抗体的存在或不存在。
51.根据权利要求50所述的方法,其中所述靶抗体选自对来自病毒的抗原特异的抗体,所述病毒根据WHO或FDA的指南为在血液库中待检测的,如例如选自HBV、HCV、HIV1、HIV2和WNV的病毒。
52.根据权利要求50所述的方法,其中所述靶抗体选自对致癌HPV株,例如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68特异的抗体。
53.根据权利要求50至52中任一项所述的方法,其中每种所述靶抗体使用可检测的标记进行标记。
54.一种用于进行根据权利要求49所述的分析或根据权利要求50所述的方法的设备,所述设备包括:
-技术装置,其用于检测从固体支持物中发射的光源和从靶抗体或结合到靶抗体的标记抗体中所发射的光源;以及
-计算或计算机装置,其用于鉴定哪种固体支持物与靶抗体结合,从而说明在分析样本中存在或不存在抗原、细菌、病毒或寄生虫。
55.一种用于在生物样本中检测至少两种靶抗体的试剂盒,所述试剂盒包括:
(a)第一固体支持物,其包含与第一融合蛋白共价偶联的AGT底物,所述第一融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表位;以及
(b)第二固体支持物,其包含与第二融合蛋白共价偶联的AGT底物,所述第二融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位。
56.一种用于在生物样本中检测至少两种靶抗体的方法,所述方法包括:
(a)使第一固体支持物与生物样本相接触,所述第一固体支持物包含共价偶联至第一融合蛋白的AGT底物,所述第一融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第一靶抗体识别的第一表位;
(b)使第二固体支持物与生物样本相接触,所述第二固体支持物包含共价偶联至第二融合蛋白的AGT底物,所述第二融合蛋白包含具有O6-烷基鸟嘌呤-DNA烷基转移酶活性的AGT多肽和由第二靶抗体、而不是由所述第一靶抗体识别的第二表位;以及
(c)检测两种靶抗体的存在或不存在。
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