CN113480616B - 异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用 - Google Patents

异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用，该异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，该异源三聚体化结构域能够与不同来源的蛋白质融合形成异源三聚体化融合蛋白。实验表明，异源三聚体化融合蛋白能与某些对应的抗体相识别并有效地高滴度结合，也能作为抗原诱导产生高滴度的抗体。基于本发明所构建的技术平台，为诸如制备有效疫苗抗原防御疫病、制备功能性有效细胞因子治疗免疫***疾病及针对某些癌症制备防御和治疗性疫苗、针对疫病检测监测制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂等设想提供了可行性的解决方法。

Description

异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及 应用
技术领域
本发明涉及生物工程及病毒疫苗技术领域，尤其涉及一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备疫苗、制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用。
背景技术
自然界中无论是复杂的高等生物如哺乳动物还是简单的低等生物如噬菌体和包膜病毒等都存在功能性的寡聚蛋白体，参与机体的机能运作。寡聚蛋白体，也叫多聚蛋白质或多亚基蛋白体，是指由两个或两个以上亚基蛋白组成的蛋白体。与单亚基蛋白质相比，寡聚蛋白体的分子体积大，多亚基协同，能产生变构效应以利于细胞识别，信号传导和功能调节等。例如人体的免疫***是一个多细胞体系高度协调作用的***，其中的信号传导途径中就涉及到细胞受体和细胞配体的相互识别、结合及触发信号传递通路的激活，引发免疫细胞的系列反应。在这个过程中，细胞膜上的受体及相对应的配体(如细胞因子)常常以寡聚蛋白多肽形式出现，例如同型二聚体或三聚体。它们的异常变化，都会引起机体功能出现异常，导致诸如内风湿关节炎、癌症等病变。
寡聚蛋白体的功能作用，在具囊膜的病毒尤其是RNA囊膜病毒家族中最具表现性，例如肺炎合胞病毒、流感病毒、新型冠状病毒等。这类病毒在侵入其宿主细胞时，首先靠其囊膜上的特殊糖蛋白与宿主细胞膜上的对应受体结合，引起细胞膜融合，进而将病毒遗传物质注入宿主细胞内，以便病毒的大量复制。病毒囊膜上的这种寡聚糖蛋白自然成为了疫苗研究中刺激免疫***产生针对性有效中和抗体的主要靶标。然而，这种囊膜病毒尤其是RNA病毒囊膜上的寡聚糖蛋白有着其特殊的结构与功能。在病毒与宿主细胞融合前与融合后，病毒囊膜蛋白的空间构像发出了变化，从融合前的弱稳定构象变成了融合后的强稳定构象，但病毒囊膜蛋白融合前的形式含有不存在于融合后的形式上的抗原表位。就拿现在大流行的新型冠状病毒为例，病毒囊膜上的刺突S糖蛋白是以同源三聚体形式出现，其单体则由S1亚基和S2亚基共同构成，S1亚基含有与宿主细胞ACE2受体结合的区域RBD(ReceptorBanding Domain)。当S1亚基中的RBD与宿主细胞ACE2结合后，引发S蛋白三聚体不稳定性变化，进而造成S1亚基和S2亚基发生解离。S2亚基的构象变为高度稳定的融合后结构，因此S蛋白具有融合前(Prefusion)和融合后(Postfusion)两种构象。在此变化过程中，S蛋白多肽处于囊膜最外端的带有免疫抗原决定簇结构部分的RBD移入到下面被遮盖，而非抗原决定簇部分则稳稳地暴露在外端。这种空间构像的变化，给疫苗的研制带来了挑战，因为免疫***激发的强有力的保护性中和抗体需要与融合前的S蛋白三聚体反应。遗憾的是，用常规制备重组蛋白亚基作为疫苗抗原的方法只会产生融合后的强稳定构象的抗原蛋白，大大降低甚至失活了抗原的免疫原性，致使疫苗失去保护功效。正因为S蛋白的重要功能及构象易变的特性，获得性质稳定、构象均一的正确的S蛋白三聚体结构是成功开发疫苗、中和性抗体以及血清学检测试剂盒的关键因素，以便最大限度地刺激免疫***产生正确的免疫应答反应，当天然病毒真正来袭时这些中和性抗体将把病毒的S蛋白锁定在无法入侵细胞的形式，起到保护人体健康的作用。
多数寡聚蛋白体其结构上都有一共性，即蛋白单体的某一段多肽是构成及稳定蛋白体寡聚化构象的功能结构域，形成同源或异源二聚体、三聚体、四聚体等多聚蛋白体。鉴于此，本发明提供一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白，为诸如制备有效疫苗抗原防御疫病、制备功能性有效细胞因子治疗免疫***疾病、针对某些癌症制备防御和治疗性疫苗及制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂等设想提供了可行性的解决方法。
发明内容
为了克服现有技术的上述不足，本发明提供了一种异源三聚体化结构域、包含有该异源三聚体化结构域的融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备疫苗、制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明第一个目的是提出一种异源三聚体化结构域，所述异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，定向突变后的异源三聚体化结构域中每条多肽的N端含有一个长形的a-螺旋片段、C端含有一个反向平行的短形的a-螺旋片段，这两个螺旋片段之间由一个柔性小环相连接。
进一步地，所述位点定向突变使长形a-螺旋片段上引入2个S-S共价键位点。
更进一步地，所述定向突变的位点分别是多肽片段的G29C和F30C。
更进一步地，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
更进一步地，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列还包括SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的突变体、SEQ ID NO.1所示氨基酸中的单个或多个氨基酸的嵌合体。
进一步地，所述病毒囊膜糖蛋白来源于全部人流感病毒和动物流感病毒。
本发明的第二个目的是提出一种融合蛋白三聚体，所述三聚体的每个蛋白单体融合多肽包含：
(1)其C-端融合的上述任一项所述的异源三聚体化结构域多肽，
(2)其C-端与异源三聚体化结构域多肽之间***的一个GSGGSG编码铰链。
本发明的第三个目的是提出一种异源三聚体化融合蛋白组合物，其包含三条多肽链，其中每条多肽链包含：
(1)上述任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽，
(2)与上述任一项所述异源三聚体化结构域部分的多肽的N-末端连接的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽。
进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽来自于同源的分泌性蛋白。
进一步地，其特征在于，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽来自于非同源的分泌性蛋白。
进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽是预防用疫苗抗原蛋白多肽分子。
更进一步地，所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽选自新冠病毒膜表面的刺突S蛋白多肽、流感病毒膜表面的血凝素蛋白HA多肽。
本发明的第四个目的是提出上述任一项所述异源三聚体化融合蛋白组合物的制备方法，包括如下步骤：
(1)对结构域多肽的G29C和F30C两个位点的D N A碱基进行PCR定点突变得到三聚体化结构域DNA片段；回收三聚体化结构域DNA片段，并将该DNA片段克隆至质粒载体，构建三聚体化结构域重组质粒；
(2)将待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽基因片段***到三聚体化结构域重组质粒形成异源三聚体化融合蛋白重组质粒；
(3)将异源三聚体化融合蛋白重组质粒克隆至表达质粒载体，获得异源三聚体化融合蛋白的重组表达质粒载体；
(4)将所述异源三聚体化融合蛋白的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞培养上清液，提取纯化异源三聚体化融合蛋白组合物。
进一步地，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。
更进一步地，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳细胞、大肠杆菌细胞、真菌细胞中的任一种。
本发明的第五个目的是提出一种疫苗，所述疫苗包括上述任一项所述的异源三聚体化融合蛋白组合物。
进一步地，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自铝盐佐剂、CpG Toll-Like佐剂、水包油包水佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、脂质体佐剂、纳米颗粒佐剂或弗氏佐剂中的至少一种。
本发明的第六个目的是提出上述任一项所述异源三聚体化融合蛋白组合物在制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。
因此，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明的以病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成的异源三聚体化结构域能够与不同来源的蛋白质融合形成异源三聚体化融合蛋白组合物。实验表明，异源三聚体化融合蛋白组合物能与某些相对应的抗体相识别并有效地高滴度结合，其作为抗原也能诱导产生高滴度的抗体。基于本发明所构建的技术平台，为诸如制备有效疫苗抗原防御疫病、制备功能性有效细胞因子治疗免疫***疾病及针对某些癌症制备防御和治疗性疫苗、制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂等设想提供了可行性的解决方法。
(2)本发明通过构建的异源三聚体化融合蛋白的重组表达质粒载体转染宿主细胞，得到细胞培养液，回收并纯化细胞培养液获得异源三聚体化融合蛋白组合物，该方法表达水平高，安全性好，表达产物可保持生物活性和免疫活性，且易于大规模生产和纯化异源三聚体化融合蛋白组合物。
附图说明
图1为新冠病毒S蛋白胞外域、S蛋白的受体结合域(RBD)和禽流感病毒H7N9的HA蛋白三聚体化设计，该设计中蛋白天然的跨膜和胞质域被三聚体结构域(TD)取代，图中各部分没按比例显示。其中：图1A为重组S蛋白三聚体化设计的线性表示，图1B为重组S蛋白的受体结合域(RBD)三聚体化设计的线性表示，图1C为重组HA蛋白三聚体化设计的线性表示。
图2为实施例2中重组杆状病毒目标基因DNA片段的PCR扩增电泳图。其中：图2中A列为1KB DNA分子标准，图2中B列为S蛋白基因DNA片段，图2中C列为RBD蛋白基因DNA片段，图2中D列为流感病毒H7N9膜蛋白HA基因DNA片段。
图3为纯化的S-TD、RBD-TD和H7-TD在还原和非还原条件下SDS-PAGE蛋白电泳图。其中：图3A为纯化的S-TD样品，图3B为纯化的RBD-TD样品，图3C为纯化的H7-TD样品。
图4为细胞培养上清液里S-TD、RBD-TD和H7-TD在还原和非还原条件下的WesternBlots电泳图。其中：图4A为S-TD细胞培养上清液样品，图4B为RBD-TD细胞培养上清液样品，图4C为H7-TD细胞培养上清液样品。
图5为斑点杂交印迹法检测三聚体化结构域对特异性单抗的亲和性。图5中A、B、C、D所对应的点依次为样品RBD-GCN4-6xHis、样品RBD-TD-6xHis、样品S-TD和新鲜细胞培养基样品。
图6为用鸡红细胞检测H7-TD三聚体蛋白的血凝效价滴度图。图中A、B、C三行对应的分别是H7-TD三聚体的细胞上清液样品H7-TD#1、对照样品H7N9-VLP、H7-TD三聚体的细胞上清液样品H7-TD#2。
图7为使用
Figure BDA0003143613610000071
色谱***对纯化的S-TD三聚体状态进行高分辨率分析的结果。
图8为实施例7中S-TD、RBD-TD与恢复期的新冠肺炎患者血清中的抗体高滴度亲合结果示意图，本实施例中使用BSA作为阴性对照。
图9为S蛋白三聚体作为抗原免疫小鼠后产生的抗体滴度测试结果示意图。图中点代表单个小鼠，水平线表示每组小鼠EC50的几何平均滴度(GMT)。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。下述实施例的方法如无特别说明均为常规方法。
实施例1：S-TD三聚体蛋白、RBD-TD三聚体蛋白、禽流感H7N9的H7-TD三聚体蛋白重组表达质粒的构建
1、PCR定点突变三聚体化结构域及构建三聚体化结构域重组质粒
本发明提供的异源三聚体化结构域是由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变形成、并保持病毒囊膜糖蛋白结构域本身的结构特点，即结构域中每条多肽的N端含有一个长形的a-螺旋片段、C端含有一个反向平行的短形的a-螺旋片段，这两个螺旋片段之间由一个柔性小环相连接。本实施例以禽流感病毒为例，对禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的C端结构域多肽的G29C和F30C两个位点的D N A碱基进行PCR定点突变得到三聚体化结构域DNA片段。
人工合成了禽流感病毒H5N1血凝素蛋白HA的C端结构域的DNA片段，加上了两个与质粒相关的酶切位点BamHI和HindIII。为了使这部分结构域DNA片段表达的多肽功能更加优化，本发明技术人员采用PCR定点突变的常规方法，对这部分的DNA片段进行了多个碱基点突变。通过筛选和比较，最终确定了突变两个碱基对，直接引入两个二硫键，使得此结构域的异源蛋白三聚体化功能更强。这段经修饰后的共有72个氨基酸的短肽称为三聚体化结构域TD(Trimerization Domain)。异源三聚体化结构域TD多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其两个氨基酸突变点为G29C(GGA/TGT)和F30C(TTC/TGC)，编码异源三聚体化结构域TD多肽的碱基序列如SEQ ID NO.6所示。
下面介绍PCR定点突变及三聚体化结构域重组质粒构建及表达：
(1)PCR定点突变结构域DNA
设计合成带有突变位点的寡核苷酸片段(见碱基序列SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10)，以人工合成的结构域DNA片段为模板，分步骤地采用PCR多聚链式反应获得了带有两个点突变的三聚体化结构域(TD)DNA片段。用凝胶电泳纯化及回收其DNA片段，用T4链接酶接入到细菌质粒上，转化到DH5α感受态细菌细胞中，挑选阳性细菌斑培养并抽提带有目的DNA片段的重组质粒。
(2)构建三聚体化结构域TD重组质粒
分别用BamHI和HindIII酶切穿梭质粒pFastBac后纯化。步骤(1)中抽提后的带有目的DNA片段的重组质粒亦被同样的两种酶水解后纯化，得到目的三聚体化结构域(TD)DNA片段。在T4链接酶作用下，将上述处理好的三聚体化结构域(TD)DNA片段连接到经酶切的pFastBac质粒载体上，挑选阳性细菌斑抽提DNA质粒，获得带有TD片段的重组穿梭质粒pFastBac-TD。
2、构建S蛋白三聚体重组质粒
结合抗原分析和密码子优化，将SARS-CoV-2病毒膜上的刺突蛋白(Spike，S蛋白)(GenBank：MN908947.3)的胞外域部分的DNA进行密码子优化，使其更适合在昆虫细胞Sf9(Spodoptera frugiperda)中表达。人工合成这段优化后的S蛋白基因DNA片段，并在两端添加了相应的HindIII酶切位点。S蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码S蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.5所示。
分别用HindIII酶切重组质粒pFastBac-TD和S蛋白的DNA片段，经纯化、T4链接酶联接后，将S蛋白的DNA片段***到pFastBac-TD质粒的阅读框上游，以便形成分泌型融合蛋白S-TD。挑选阳性细菌斑抽提DNA质粒，获得重组质粒pFastBac-S-TD。重组S蛋白三聚体化设计的线性表示如图1A。
3、构建RBD三聚体重组质粒
S蛋白的受体结合域RBD(Receptor Binding Domain)的DNA片段的获得是通过用合成的S蛋白做模板，经PCR反应扩增得到。RBD蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码RBD蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.7所示。
用PCR方法将S蛋白的RBD区域扩增出来，所用的引物含有上述的HindIII酶切位点。将此RBD片段和重组质粒pFastBac-TD分别用HindIII酶切、纯化和T4酶联接，将RBD片段***到pFastBac-TD质粒的阅读框的上游，形成分泌型融合蛋白RBD-TD。挑选阳性细菌斑抽提DNA质粒，获得重组质粒pFastBac-RBD-TD。重组S蛋白的受体结合域(RBD)三聚体化设计的线性表示如图1B。
4、构建H7蛋白三聚体重组质粒
禽流感病毒H7N9的血凝素蛋白HA(H7)基因DNA片段亦是经人工合成而来。禽流感病毒H7N9的血凝素H7蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，编码禽流感病毒H7N9的血凝素H7蛋白的碱基序列如SEQ ID NO.8所示。
分别用HindIII酶切重组质粒pFastBac-TD和H7蛋白的DNA片段，经纯化、T4链接酶联接后，将H7蛋白的DNA片段***到pFastBac-TD质粒的阅读框上游，以便形成分泌型融合蛋白H7-TD。挑选阳性细菌斑抽提DNA质粒，获得重组质粒pFastBac-H7-TD。重组HA蛋白三聚体化设计的线性表示如图1C。
当然，由于氨基酸密码子的简并性，一个确定的蛋白氨基酸序列，可以有成千上万种表达序列，因此，表达S蛋白、三聚体化结构域TD多肽、RBD蛋白和血凝素H7蛋白的碱基序列并不唯一，本实施例中优选为如SEQ ID NO.5-8所示的碱基编码序列。
实施例2：S-TD、RBD-TD和H7-TD重组杆状病毒的制备合成及检测
(1)S-TD重组杆状病毒的制备合成及检测
将所得的重组穿梭质粒pFastBac-S-TD转入DH10Bac感受态细胞，采用菌落蓝白斑筛选法，获得阳性白斑菌落，抽提其DNA质粒，获得重组杆状病毒质粒Bacmid-S-TD。在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，用获得的重组杆状病毒质粒Bacmid-S-TD做细胞转染，六天后收获含有重组杆状病毒的细胞培养上清液。
加入含有SDS的裂解液至细胞上清液中裂解重组杆状病毒，用氯仿抽提、乙醇沉淀获得重组杆状病毒DNA。以此DNA做模板，加入对应S蛋白基因的PCR引物，进行PCR扩增反应。扩增产物跑凝胶电泳，获得预期的DNA片段，证明所制备的重组杆状病毒带有目标外源S蛋白基因。凝胶电泳结果见图2。PCR扩增引物如SEQ ID NO.10-11所示。
SEQ ID NO.11：Spike-F，ATGTTCGTGTTCTTGGTGCTG
SEQ ID NO.12：Spike-R，TTAGGTGTAGTGCAGCTTGAC
(2)RBD-TD和H7-TD重组杆状病毒的制备合成及检测
用上述同样方法合成检测了RBD-TD以及H7-TD的重组杆状病毒，均获得了预期的DNA片段。凝胶电泳结果见图2。PCR扩增引物如SEQ ID NO.13-16所示。
SEQ ID NO.13：RBD-F，CGTGTGCAGCCCACCGAGTCC
SEQ ID NO.14：RBD-R，GAAGTTCACGCATTTGTTCTTG
SEQ ID NO.15：H7-F，ATGAACACTCAAATCCTGG
SEQ ID NO.16：H7-R，TTATATACAAATAGTGCACC
实施例3：三聚体化融合蛋白组合物的表达、纯化及检测
1、三聚体化融合蛋白组合物的表达、纯化
(1)S-TD三聚体化融合蛋白组合物的表达、纯化
在一个6孔细胞培养板中铺上昆虫细胞sf-9，采用脂质法将重组杆状病毒质粒Bacmid-S-TD进行转染，六天后收取细胞上清液，获得第一代重组杆状病毒毒种，称为P1代。用P1代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得第二代重组杆状病毒毒种，称为P2代。再用P2代毒种感染昆虫细胞进行毒种放大，获得P3代作为生产毒种。将生长状态良好的Sf-9细胞接种到摇瓶中悬浮培养，待细胞成长至对数生长期时，稀释细胞浓度至每毫升3.0×106个细胞。将P3代毒种按MOI为0.1比率接种到细胞摇瓶中，3至4天后收获细胞上清液，进行纯化及检测S-TD三聚体化融合蛋白组合物的表达合成。
为了有效地纯化出表达的各三聚体化融合蛋白组合物，本发明者构建、筛选和制备出针对异源三聚体结构域TD的单克隆抗体。此单抗的制备采用常规的杂交瘤制备单克隆抗体的方法。简单而言，将异源三聚体结构域多肽注射小鼠三次，取其脾脏细胞与瘤细胞融合。用96孔细胞板培养这些杂交瘤细胞，筛选和放大培养抗体表达量高的阳性杂交瘤细胞株。收获细胞培养上清，A-蛋白亲和层析纯化出单克隆抗体。
将上述单克隆抗体与经NHS活化的HP色谱柱(Cytiva,U.S.A)偶联，得到自制的免疫亲和色谱柱。使用
Figure BDA0003143613610000121
蛋白质纯化***(GE，U.S.A)和自制的亲和色谱柱，对表达制备的三聚体蛋白进行亲和层析纯化。具体操作是：将上述收获后的带有S-TD三聚体化融合蛋白组合物的细胞上清液在4℃以4000×g离心10分钟，收集离心后的上清液，用孔径为0.22μm的滤器过滤。将过滤后的上清液添加到上述亲和层析柱上，进行挂柱和洗脱。从亲和层析柱上流下来的洗脱液立即被中和，并使用ZebaSpin脱盐柱(ThermoFisher Scientific，U.S.A)进行缓冲液交换。NanoDropOne(ThermoFisher Scientific，U.S.A)测定纯化后的三聚体化融合蛋白组合物浓度。
(2)用上述同样方法表达制备和纯化了RBD-TD及H7-TD三聚体化融合蛋白组合物。
2、重组三聚体蛋白的检测
对纯化后的上述三聚体化融合蛋白组合物进行SDS-PAGE和Western Blots定性分析，具体操作如下：
(1)SDS-PAGE实验
取15μl含有三聚体化融合蛋白组合物的纯化样品，加入4μl Laemmli上样液，再加入1μl还原剂DTT(100mM)混匀后，95℃加热约5分钟，并根据需要涡旋以确保完全溶解，然后在台式微量离心机中快速离心1分钟。点样入Protean Minigel仪器(Bio-Rad，U.S.A)制备的聚丙烯酰胺凝胶孔中。另取15μl同样的纯化样品，加入4μl水剂甘油上样液，1μl去离子水，涡旋混匀后，95℃加热约5分钟，点样入同一聚丙烯酰胺凝胶中的另外孔中，接上电源跑胶。电泳完毕后，将凝胶在去离子水中漂洗一下，加入考马斯亮蓝G-250染料溶液(Bio-Rad，U.S.A)染色，并在去离子水中脱色。图3为纯化的S-TD、RBD-TD和H7-TD在还原和非还原条件下SDS-PAGE蛋白电泳图，图3实验结果清晰显示，在非还原的自然状态下，三个纯化后的蛋白体均以三聚体蛋白形式存在，只有在还原及变性条件下，三个三聚体蛋白均解聚成为单体形式。说明本发明的异源三聚体结构域在蛋白单体形成蛋白三聚体时，起到了决定性地功能作用。
(2)Western Blots实验
通过使用上述同样的实验步骤，在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离含有三聚体化融合蛋白组合物的细胞培养上清液样品，然后做Western Blots印膜转印。用5％脱脂奶粉液封闭转印膜后，与抗S蛋白RBD的兔多克隆抗体(针对样品S-TD和RBD-TD)(Elabscience，U.S.A)或与抗His标签抗体(针对带有His标签的样品H7-TD)(Applied BiologicalMaterials Inc.U.S.A)一起，用5％脱脂牛奶1000x稀释并孵育过夜。用PBST洗涤3次后，室温下，将膜与经5％脱脂奶粉液稀释3000x的带HRP酶的羊抗兔二抗孵育1小时。再次用PBST清洗膜3次后，使用Immobilon Crescendo Western HRP底物(MILLPORE,MA,U.S.A)和Hyperfilm ECL(GE-Amersham,U.S.A)产生荧光信号。图4为细胞培养上清液里S-TD、RBD-TD和H7-TD在还原和非还原条件下的Western Blots电泳图。图4实验结果显示出的特异性条带，指明了还原变性后的单体蛋白及非还原状态下的特异性三聚体蛋白。证明本发明的异源三聚体结构域在蛋白单体形成蛋白三聚体时，起到了决定性地功能作用。
实施例4：印迹法检测三聚体化融合蛋白组合物中的异源三聚体结构域TD
为了准确有效地实施斑点印迹法鉴定三聚体化融合蛋白组合物中的异源三聚体结构域，使用实施例3所述的具有针对此异源结构域的单克隆抗体，采用斑点印迹杂交实验确定了三聚体化融合蛋白组合物中的异源三聚体结构域TD。另外，作为对照样品，用公众已知的三聚体结构域GCN4序列构建制备了RBD-GCN4三聚体蛋白并加上了标记物6xHis，以区别鉴定本发明的异源三聚体结构域TD的特异性，证明上述所表达的各种三聚体化融合蛋白组合物皆是由于此异源三聚体结构域的功能作用聚合而成。
斑点印迹法实验的具体操作简述如下：将实施例三中已被证明含有表达了RBD-TD-6xHis蛋白三聚体的Sf-9细胞培养上清液及S-TD细胞培养上清液用PBS稀释，通过斑点印迹设备(Bio-Dot Apparatus，Bio-Rad，U.S.A)，用移液枪将15μl稀释液点加到硝酸纤维膜(Bio-Rad，U.S.A)上。做为对照，点上了15μl含有三聚体RBD-GCN4-6XHis的稀释液。阴性对照则使用未感染的Sf-9细胞培养上清液。风干点样后的硝酸纤维膜，室温下用封闭膜专用的脱脂奶粉配液封膜1小时。用含0.5％脱脂奶粉的PBST溶液将自制的单克隆抗体及抗His蛋白的单克隆抗体稀释1000倍，作为一抗，与膜共孵育1小时。用PBST洗涤3次后，用0.5％脱脂奶粉PBST溶液将含有HRP的二抗稀释3000倍，37℃与膜孵育1小时。其后，再次清洗膜，使用Immobilon Crescendo Western HRP底物(Millipore,MA,U.S.A)和HyperfilmECL(GE-Amersham，U.S.A)激发荧光，进行检测。结果如图5所示，图5中A、B、C、D所对应的点依次为样品RBD-GCN4-6xHis、样品RBD-TD-6xHis、样品S-TD和新鲜细胞培养基样品，该结果表明所表达的RBD-TD-6xHis和S-TD三聚体化融合蛋白组合物中的寡聚结构域即为所预期的异源三聚体结构域TD。
实施例5：检测H7-TD三聚体化融合蛋白的血凝效价
用检测血凝效价方法可得知细胞上清液中H7-TD三聚体化融合蛋白的表达和存在。禽流感病毒血凝素蛋白HA能结合红细胞表面的受体，这一特性可用来做为血凝效价检测的判断指标。因此可以用鸡红细胞凝集反应来检测细胞上清液中的H7-TD三聚体蛋白。
具体步骤是：在一块微量血凝板上，用移液器从第1孔至12孔各加入PBS0.025ml，用移液器吸取收获的细胞上清液0.025ml，从第1孔起，依次做2倍倍比稀释，至最后一个孔，弃去移液器内0.025ml液体。再向每孔加入1％鸡红细胞悬液0.025ml，并设不加样品的红细胞对照孔，立即在微量板振荡器上摇匀，放置于25℃孵育30分钟。当对照孔中的红细胞呈显著纽扣状时判定结果。以使红细胞完全凝集的最高稀释度，作为判定终点。
结果见图6，其中A、B、C三行对应的分别是H7-TD三聚体的细胞上清液样品H7-TD#1、对照样品H7N9-VLP、H7-TD三聚体的细胞上清液样品H7-TD#2，样品为H7-TD#1的血凝效价滴度约9.5左右，样品为H7N9-VLP的血凝效价滴度约7.5左右，样品为H7-TD#2的血凝效价滴度约9.5左右。因此，H7-TD三聚体的两个细胞上清液样品1#和2#的血凝效价比对照样品的血凝效价要高出2个幂指数。说明表达的H7-TD结构域融合蛋白自组装形成了H7-TD三聚体化融合蛋白并释放到了细胞上清液中。
实施例6：采用用分子排阻色谱法对纯化后的S-TD三聚体化融合蛋白进行粒径及均匀性分析
为了有效检测纯化后的S-TD样品是否仍然保留着完整的S蛋白三聚体结构，用分子排阻色谱法(SEC)对样品进行了分析。具体方法简述如下：
1、SEC的校准标准制备
校准的标准分子量标记为1,350至670,000Da(Bio-rad,U.S.A)。用0.5ml去离子水将标准品溶解后，离心除去任何细小颗粒。调整制备好的标准品上柱体积与纯化柱体积之间的比例，以最终280nm检测的OD值达到0.1-0.2范围为准。
2、纯化样品SEC检测
使用
Figure BDA0003143613610000161
色谱***，Superdex 200、150mm column(Cytiva，U.S.A)柱子对纯化后的S-TD三聚体蛋白进行分子排阻色谱分析。上柱的流动相为磷酸盐缓冲液(PBS)，流速为0.25ml/分钟，检测OD280nm。实验结果如图7和表1所示。
表1
Figure BDA0003143613610000162
色谱***对纯化的S-TD三聚体状态进行高分辨率分析结果
Figure BDA0003143613610000163
图7显示在5分钟左右出现的第二个峰形，也是峰面积最大的峰，其分子量为558.5kDa，与S蛋白三聚体的分子量相符合。
实施例7：新冠肺炎康复患者血清中的抗体与S-TD和RBD-TD三聚体化融合蛋白高滴度亲和
为了鉴定S-TD和RBD-TD三聚体化融合蛋白是否能与抗新冠病毒刺突蛋白抗体亲和结合，采用了间接ELISA方法对S-TD、RBD-TD三聚体化融合蛋白、牛血清白蛋白(BSA)进行检测。
将上述三种蛋白作为目标抗原分别包被在96孔ELISA板上。将数名新冠肺炎康复患者血清混合后，以十倍稀释法连续稀释，然后添加至包被的各孔中。这里牛血清白蛋白BSA作为实验阴性对照样品。按常规的间接ELISA操作步骤，检测样品的亲和滴度。检测结果如图8所示，S-TD和RBD-TD三聚体化融合蛋白能与患者血清中的抗体相识别，并有效地高滴度结合。
实施例8：疫苗的制备及免疫小鼠IgG的检测
1、疫苗制备
本实施例采用二种佐剂(分别为市售的商品化的铝盐佐剂和自制的与AS03佐剂相仿的脂质体佐剂)制备了两款疫苗，检测纯化的S-TD三聚体蛋白能否作为疫苗的抗原来免疫动物产生抗体保护。两款疫苗的制备方法分别为：(1)取纯化好的S-TD三聚体化融合蛋白溶液与铝盐佐剂，按生产厂家提供的说明书中的方法，以3：1的体积比率混合均匀；(2)取纯化好的S-TD三聚体化融合蛋白溶液与自制的脂质体佐剂按1：1的体积比率混合搅拌乳化，制备成疫苗待用。
2、小鼠免疫试验
6-8周BALB/c小鼠共计29只，分成5组，样品组各6只，空白组5只，具体分组安排见下表2。样品免疫组小鼠注射10μg/0.2ml/只，样品佐剂对照组小鼠注射0.2ml/只。首免后第21天，按上述条件进行二免，再间隔14天，加强免疫一针后，第10天全部小鼠摘眼球各取血1ml。离心小鼠血液样品，取上清分装保存在4℃或-20℃，以供后续检测。
表2疫苗的配制及实验动物分组
Figure BDA0003143613610000181
3、免疫小鼠抗体IgG滴度检测
主要采用间接ELISA方法检测鼠抗新冠IgG抗体，操作简述如下：用包被液稀释市场上购买的标准S蛋白包被96孔ELISA板，20ng/100μl/孔，保鲜膜包好放置4℃冰箱过夜。第二天早上洗涤酶标板，拍干。加封闭液200μl/孔，保鲜膜包好，37℃反应2h。用PBS-T溶液200μl/孔洗3次，拍干。用PBS按1：1000稀释采集的各实验小鼠抗体血清以及空白对照血清，混匀后在酶标板的第一排加入200μl，后边所有各排孔内先各加入100μl的PBS，之后从第一排吸取100μl稀释血清加入第二排，以此类推进行倍比稀释。最后一排不加倍比稀释血清，做为板孔的底色空白对照。加完后封好，37℃孵育1小时。倒掉反应液，加PBS-T200μl/孔，洗涤3次，拍干；用PBS 1：5000稀释含偶联辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)的羊抗鼠二抗100μl/孔，37℃孵育45分钟；倒掉反应液，用PBS-T 200ul/孔洗涤3次，拍干；加入配好的TMB 100ul/孔，显色10-15分钟，加入终止液50μl/孔，用酶标仪取波长450测定每孔OD值。用EC50计算和判定血清检测结果的抗体滴度。结果见图9，显示用两种佐剂制备的两款S-TD三聚体蛋白疫苗均能诱导免疫小鼠产生高滴度的抗体。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 许雁
加拿大诺华生物科技有限公司（Nova Biologiques Inc.）
<120> 异源三聚体化结构域、异源三聚体化融合蛋白、制备方法及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 72
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Asn Thr Gln Phe Glu Ala Val Gly Arg Glu Phe Asn Asn Leu Glu
1 5 10 15
Arg Arg Ile Glu Asn Leu Asn Lys Lys Met Glu Asp Cys Cys Leu Asp
20 25 30
Val Trp Thr Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Leu Met Glu Asn Glu Arg
35 40 45
Thr Leu Asp Phe His Asp Ser Asn Val Lys Asn Leu Tyr Asp Lys Val
50 55 60
Arg Leu Gln Leu Arg Asp Asn Ala
65 70
<210> 2
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu
1010 1015 1020
Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val
1025 1030 1035 1040
Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala
1045 1050 1055
Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu
1060 1065 1070
Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His
1075 1080 1085
Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val
1090 1095 1100
Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr
1105 1110 1115 1120
Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr
1125 1130 1135
Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu
1140 1145 1150
Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp
1155 1160 1165
Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp
1170 1175 1180
Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu
1185 1190 1195 1200
Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile
1205 1210 1215
Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile
1220 1225 1230
Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro Val
1250 1255 1260
Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 3
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn
1 5 10 15
Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val
20 25 30
Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser
35 40 45
Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val
50 55 60
Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp
65 70 75 80
Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln
85 90 95
Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr
100 105 110
Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly
115 120 125
Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys
130 135 140
Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr
145 150 155 160
Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser
165 170 175
Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val
180 185 190
Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly
195 200 205
Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe
210 215 220
<210> 4
<211> 564
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Asn Thr Gln Ile Leu Val Phe Ala Leu Ile Ala Ile Ile Pro Thr
1 5 10 15
Asn Ala Asp Lys Ile Cys Leu Gly His His Ala Val Ser Asn Gly Thr
20 25 30
Lys Val Asn Thr Leu Thr Glu Arg Gly Val Glu Val Val Asn Ala Thr
35 40 45
Glu Thr Val Glu Arg Thr Asn Thr Pro Arg Ile Cys Ser Lys Gly Lys
50 55 60
Arg Thr Val Asp Leu Gly Gln Cys Gly Leu Leu Gly Thr Ile Thr Gly
65 70 75 80
Pro Pro Gln Cys Asp Gln Phe Leu Glu Phe Ser Ala Asp Leu Ile Ile
85 90 95
Glu Arg Arg Glu Gly Ser Asp Val Cys Tyr Pro Gly Lys Phe Val Asn
100 105 110
Glu Glu Ala Leu Arg Gln Ile Leu Arg Glu Ser Gly Gly Ile Asp Lys
115 120 125
Glu Pro Met Gly Phe Thr Tyr Asn Gly Ile Arg Thr Asn Gly Val Thr
130 135 140
Ser Ala Cys Arg Arg Ser Gly Ser Ser Phe Tyr Ala Glu Met Lys Trp
145 150 155 160
Leu Leu Ser Asn Thr Asp Asn Ala Ala Phe Pro Gln Met Thr Lys Ser
165 170 175
Tyr Lys Asn Thr Lys Glu Ser Pro Ala Ile Ile Val Trp Gly Ile His
180 185 190
His Ser Val Ser Thr Ala Glu Gln Thr Lys Leu Tyr Gly Ser Gly Asn
195 200 205
Lys Leu Val Thr Val Gly Ser Ser Asn Tyr Gln Gln Ser Phe Val Pro
210 215 220
Ser Pro Gly Ala Arg Pro Gln Val Asn Gly Gln Ser Gly Arg Ile Asp
225 230 235 240
Phe His Trp Leu Ile Leu Asn Pro Asn Asp Thr Val Thr Phe Ser Phe
245 250 255
Asn Gly Ala Phe Ile Ala Pro Asp Arg Ala Ser Phe Leu Arg Gly Lys
260 265 270
Ser Met Gly Ile Gln Ser Arg Val Gln Val Asp Ala Asn Cys Glu Gly
275 280 285
Asp Cys Tyr His Ser Gly Gly Thr Ile Ile Ser Asn Leu Pro Phe Gln
290 295 300
Asn Ile Asp Ser Arg Ala Val Gly Lys Cys Pro Arg Tyr Val Lys Gln
305 310 315 320
Arg Ser Leu Leu Leu Ala Thr Gly Met Lys Asn Val Pro Glu Val Pro
325 330 335
Lys Arg Lys Arg Thr Ala Arg Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe
340 345 350
Ile Glu Asn Gly Trp Glu Gly Leu Ile Asp Gly Trp Tyr Gly Phe Arg
355 360 365
His Gln Asn Ala Gln Gly Glu Gly Thr Ala Ala Asp Tyr Lys Ser Thr
370 375 380
Gln Ser Ala Ile Asp Gln Ile Thr Gly Lys Leu Asn Arg Leu Ile Ala
385 390 395 400
Lys Thr Asn Gln Gln Phe Lys Leu Ile Asp Asn Glu Phe Asn Glu Val
405 410 415
Glu Lys Gln Ile Gly Asn Val Ile Asn Trp Thr Arg Asp Ser Ile Thr
420 425 430
Glu Val Trp Ser Tyr Asn Ala Glu Leu Leu Val Ala Met Glu Asn Gln
435 440 445
His Thr Ile Asp Leu Ala Asp Ser Glu Met Asp Lys Leu Tyr Glu Arg
450 455 460
Val Lys Arg Gln Leu Arg Glu Asn Ala Glu Glu Asp Gly Thr Gly Cys
465 470 475 480
Phe Glu Ile Phe His Lys Cys Asp Asp Asp Cys Met Ala Ser Ile Arg
485 490 495
Asn Asn Thr Tyr Asp His Arg Lys Tyr Arg Glu Glu Ala Met Gln Asn
500 505 510
Arg Ile Gln Ile Asp Pro Val Lys Leu Ser Ser Gly Tyr Lys Asp Val
515 520 525
Ile Leu Trp Phe Ser Phe Gly Ala Ser Cys Phe Ile Leu Leu Ala Ile
530 535 540
Val Met Gly Leu Val Phe Ile Cys Val Lys Asn Gly Asn Met Arg Cys
545 550 555 560
Thr Ile Cys Ile
<210> 5
<211> 3822
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgttcgtgt tcttggtgct gctgcccctg gtgtcctctc agtgcgtgaa cctgaccacc 60
aggactcagc tgcctccagc ttacaccaac agcttcaccc gtggtgtcta ctaccccgac 120
aaggtgttcc gttcctccgt gctgcactct acccaggacc tgttcctgcc tttcttctcc 180
aacgtgacct ggttccacgc tatccacgtg tccggtacta acggcaccaa gcgtttcgac 240
aaccccgtgc tgcctttcaa cgacggcgtg tacttcgctt ccaccgagaa gtccaacatc 300
atccgtggct ggatcttcgg tactaccctg gactccaaga ctcagtccct gctgatcgtg 360
aacaacgcta ccaacgtggt catcaaagtg tgcgagttcc agttctgcaa cgaccccttc 420
ctgggcgttt actaccacaa gaacaacaag tcctggatgg aatccgagtt ccgtgtgtac 480
tcctccgcta acaactgcac cttcgagtac gtgtcccagc ctttcctgat ggacctcgag 540
ggcaagcagg gcaacttcaa gaacctgcgc gagttcgtgt tcaagaacat cgacggctac 600
ttcaagatct actccaagca cacccctatc aacctcgtgc gtgacctgcc tcagggcttc 660
tctgctctgg aacctctggt ggacctgcca atcggtatca acatcacccg tttccagact 720
ctgctggctc tgcaccgttc ctacttgacc cctggcgact cctcttctgg atggactgct 780
ggcgctgctg cttactacgt gggttacctg cagcctcgta ccttcctgct gaagtacaac 840
gagaacggaa ccatcaccga cgctgtggac tgcgctctgg accctttgtc cgagactaag 900
tgcaccctga agtccttcac cgtcgagaag ggcatctacc agacctccaa cttccgtgtg 960
cagcccaccg agtccatcgt gcgtttccct aacatcacca acttgtgccc cttcggcgag 1020
gtgttcaacg ctactcgttt cgcttccgtg tacgcttgga accgcaagcg catctctaac 1080
tgcgtggccg actactccgt cctgtacaac tccgcttcct tcagcacctt caagtgctac 1140
ggtgtctccc ctaccaagct gaacgacctg tgcttcacca acgtctacgc tgactccttc 1200
gtgatccgtg gcgacgaagt gcgtcagatc gctcctggtc aaaccggcaa gatcgctgac 1260
tacaactaca agctgcccga cgacttcacc ggttgcgtga tcgcctggaa ctccaacaac 1320
ctggactcta aagtcggcgg caactacaat tacctgtacc gtctgttccg caagtccaac 1380
ctgaagcctt tcgagcgtga catctctacc gagatctacc aggctggttc taccccttgc 1440
aacggtgtcg agggtttcaa ctgctacttc ccactgcagt cctacggttt ccagcctacc 1500
aacggcgtcg gttaccagcc ttaccgtgtg gtggtgctgt ccttcgaact gctgcacgct 1560
cctgctactg tgtgcggtcc caagaaatcc accaacctgg tcaagaacaa atgcgtgaac 1620
ttcaacttca acggcctgac cggcaccggt gtcctgaccg agtctaacaa gaagttcctg 1680
ccattccagc aattcggccg tgatatcgct gacaccactg acgctgtgcg cgaccctcag 1740
actctggaaa tcctggacat caccccatgc agcttcggtg gtgtctccgt gatcacccct 1800
ggtactaaca cctccaacca ggtggccgtg ctgtaccagg acgtgaactg cactgaagtg 1860
cccgtggcta ttcacgctga ccagctgact ccaacctggc gcgtgtactc caccggttcc 1920
aacgtgttcc agacacgtgc tggttgcctg atcggtgctg agcacgtcaa caactcctac 1980
gagtgcgaca tccccatcgg cgctggtatc tgcgcttcct accagactca gaccaactct 2040
ccccgtcgtg ctcgttccgt ggcttcccag tccatcattg cttacactat gtccctgggt 2100
gctgagaact ccgtcgctta ctctaacaac tctatcgcta tccccaccaa cttcaccatc 2160
tccgtcacca ccgagatcct gcctgtgtcc atgaccaaga cctccgtgga ctgcaccatg 2220
tacatctgcg gcgactccac cgagtgctct aacctgctgc tgcagtacgg ttccttctgc 2280
acccagctga accgtgctct gaccggtatc gctgtcgagc aggacaagaa cacccaagag 2340
gtgttcgctc aagtgaagca gatctacaag acccctccta tcaaggactt cggcggattc 2400
aacttctccc agatcttgcc cgatccttct aagccctcca agcgctcctt catcgaggac 2460
ctgctgttca acaaagtgac cctggctgac gctggtttca tcaagcagta cggcgactgc 2520
ctgggcgaca ttgctgctcg tgatctgatc tgcgctcaga agttcaacgg attgaccgtc 2580
ctgcctcctc tgctgaccga cgagatgatc gctcagtaca cctccgctct gctcgctggc 2640
actatcacct ccggatggac tttcggagct ggtgctgccc tgcagatccc cttcgctatg 2700
cagatggctt accgtttcaa cggtatcggt gtcacccaga acgtgctcta cgagaaccag 2760
aagctgatcg ccaaccagtt caactccgcc atcggaaaga tccaggattc cctgtcctcc 2820
accgcttccg ctctgggaaa gctgcaagac gtggtcaacc agaacgctca ggctctgaac 2880
accctcgtga agcagctgtc ctctaacttc ggtgctatct cctctgtcct gaacgacatc 2940
ctgtctcgtc tggacaaggt cgaggccgag gtgcaaatcg accgtctgat cactggtcgt 3000
ctgcagtctc tgcagaccta cgtgacccag cagttgatcc gcgctgctga gatccgtgct 3060
tccgctaact tggctgctac caagatgtcc gagtgcgtgc tgggacagtc caagcgtgtt 3120
gacttctgcg gcaagggtta ccacctgatg agcttccctc agtccgctcc tcacggtgtc 3180
gtgttccttc acgtcaccta cgtgcccgct caagagaaga acttcactac cgctccagct 3240
atctgccacg acggcaaggc tcatttccca cgtgaaggcg tgttcgtgtc caacggcacc 3300
cattggttcg tcacccagcg caacttctac gagccccaga tcatcactac cgacaacacc 3360
ttcgtgtccg gcaactgcga cgtcgtgatc ggtatcgtta acaatactgt gtacgaccct 3420
ctgcagcccg agctggactc cttcaaagag gaactggaca agtacttcaa aaaccacact 3480
agccccgacg tggacctggg agacatctct ggtatcaacg cttccgtcgt gaacatccag 3540
aaagagatcg accgcctgaa cgaggtggcc aagaacctca acgagtccct gatcgacctg 3600
caagagctgg gcaaatacga gcagtacatc aagtggccct ggtacatctg gctgggtttc 3660
attgctggcc tgatcgctat cgtgatggtc actatcatgc tgtgctgtat gacctcctgc 3720
tgctcctgcc tgaagggctg ctgctcttgt ggttcttgct gcaagttcga cgaggacgac 3780
tccgagcctg tgctcaaggg tgtcaagctg cactacacct aa 3822
<210> 6
<211> 216
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atgaacactc aatttgaggc cgttggaagg gaatttaata acttagaaag gagaatagag 60
aatttaaaca agaaaatgga agactgttgc ctagatgtct ggacttataa tgctgaactt 120
ctagttctca tggaaaatga gagaactcta gatttccatg actcaaatgt caagaacctt 180
tacgataaag tccgactaca gcttagggac aatgca 216
<210> 7
<211> 669
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgtgtgcagc ccaccgagtc catcgtgcgt ttccctaaca tcaccaactt gtgccccttc 60
ggcgaggtgt tcaacgctac tcgtttcgct tccgtgtacg cttggaaccg caagcgcatc 120
tctaactgcg tggccgacta ctccgtcctg tacaactccg cttccttcag caccttcaag 180
tgctacggtg tctcccctac caagctgaac gacctgtgct tcaccaacgt ctacgctgac 240
tccttcgtga tccgtggcga cgaagtgcgt cagatcgctc ctggtcaaac cggcaagatc 300
gctgactaca actacaagct gcccgacgac ttcaccggtt gcgtgatcgc ctggaactcc 360
aacaacctgg actctaaagt cggcggcaac tacaattacc tgtaccgtct gttccgcaag 420
tccaacctga agcctttcga gcgtgacatc tctaccgaga tctaccaggc tggttctacc 480
ccttgcaacg gtgtcgaggg tttcaactgc tacttcccac tgcagtccta cggtttccag 540
cctaccaacg gcgtcggtta ccagccttac cgtgtggtgg tgctgtcctt cgaactgctg 600
cacgctcctg ctactgtgtg cggtcccaag aaatccacca acctggtcaa gaacaaatgc 660
gtgaacttc 669
<210> 8
<211> 1695
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atgaacactc aaatcctggt attcgctctg attgcgatca ttccaacaaa tgcagacaaa 60
atctgcctcg gacatcatgc cgtgtcaaac ggaaccaaag taaacacatt aactgaaaga 120
ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa caaacacccc caggatctgc 180
tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac tcctggggac aatcactgga 240
ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcggccgatt taattattga gaggcgagaa 300
ggaagtgatg tctgttatcc tggaaaattc gtgaatgaag aagctttgag gcaaattctc 360
agagaatcag gcggaattga caaggaaccc atgggattca catacaatgg aataagaact 420
aatggggtga ccagtgcatg taggagatca ggatcttcat tctatgcaga aatgaaatgg 480
ctcctgtcaa acacagataa tgctgcattc ccgcagatga ctaagtcata taaaaataca 540
aaagaaagcc cagctataat agtatggggg atccatcatt ccgtttcaac tgcagagcaa 600
accaagctat atgggagtgg aaacaagctg gtgacagttg ggagttctaa ttatcaacaa 660
tctttcgtac cgagtccagg agcaagacca caagttaatg gtcaatctgg aagaattgac 720
tttcattggc taatactaaa tcccaatgat acagtcactt tcagtttcaa tggggctttc 780
atagctccag accgtgcaag cttcctgaga ggaaaatcta tgggaatcca gagtagagta 840
caggttgatg ccaattgtga aggggactgc tatcatagtg gagggacaat aataagtaac 900
ttgccatttc agaacataga tagcagggca gttggaaaat gtccgagata tgttaagcaa 960
aggagtcttc tgctggcaac agggatgaag aatgttcctg aggttccaaa gagaaaacgg 1020
actgcgagag gcctatttgg tgctatagcg ggtttcattg aaaatggatg ggaaggccta 1080
attgatggtt ggtatggttt cagacaccag aatgcacagg gagagggaac tgctgcagat 1140
tacaaaagca ctcaatcggc aattgatcaa ataacaggga aattaaaccg gcttatagca 1200
aaaaccaacc aacaatttaa gttgatagac aatgagttta atgaggtaga gaagcaaatc 1260
ggtaatgtga taaattggac cagagattct ataacagaag tatggtcata caatgctgaa 1320
ctcttggtgg caatggagaa ccagcataca attgatctgg ctgattcaga aatggacaaa 1380
ctgtacgaac gagtgaaaag acagctgaga gagaatgctg aagaagacgg cacgggttgc 1440
tttgaaatat ttcacaagtg tgatgatgac tgtatggcca gtattagaaa taacacctat 1500
gatcacagaa aatacagaga agaggcaatg caaaatagaa tacagattga cccagtcaaa 1560
ctaagcagcg gctacaaaga tgtgatactt tggtttagct tcggggcatc atgtttcata 1620
cttctagcca ttgtaatggg ccttgtcttc atatgtgtga agaatggaaa catgcggtgc 1680
actatttgta tataa 1695
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ttaaacaaga aaatggaaga ctgttgccta gatgtctgga cttataatg 49
<210> 10
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cattataagt ccagacatct aggcaacagt cttccatttt cttgtttaa 49
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
atgttcgtgt tcttggtgct g 21
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ttaggtgtag tgcagcttga c 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cgtgtgcagc ccaccgagtc c 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gaagttcacg catttgttct tg 22
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atgaacactc aaatcctgg 19
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ttatatacaa atagtgcacc 20

Claims (9)

1.一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述异源三聚体化结构域由病毒囊膜糖蛋白结构域多肽片段的DNA碱基经位点定向突变而形成，定向突变后的异源三聚体化结构域中每条多肽的N端含有一个长形的a-螺旋片段、C端含有一个反向平行的短形的a-螺旋片段，这两个螺旋片段之间由一个柔性小环相连接；
所述位点定向突变使长形a-螺旋片段上引入2个S-S共价键位点；
所述定向突变的位点分别是多肽片段的G29C和F30C；所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的一种异源三聚体化结构域，其特征在于，所述异源三聚体化结构域多肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，DNA序列如SEQ ID NO.6所示。
3.一种异源三聚体化融合蛋白组合物，其特征在于，选自S-TD三聚体蛋白、RBD-TD三聚体蛋白或H7-TD三聚体蛋白；其中各三聚体蛋白由如下(1)和(2)组成：
(1)权利要求1或2所述异源三聚体化结构域部分的多肽，所述异源三聚体化结构域部分的多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)与权利要求1或2所述异源三聚体化结构域部分的多肽的N-末端连接的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽；
所述S-TD三聚体蛋白的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
所述RBD-TD三聚体蛋白的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽的氨基酸序列如SEQID NO.3所示；
所述H7-TD三聚体蛋白的待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽的氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
4.权利要求3所述异源三聚体化融合蛋白组合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)对结构域多肽的G29C和F30C两个位点的DNA碱基进行PCR定点突变得到三聚体化结构域DNA片段；回收三聚体化结构域DNA片段，并将该DNA片段克隆至质粒载体，构建三聚体化结构域重组质粒，突变后结构域多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽基因片段***到三聚体化结构域重组质粒形成异源三聚体化融合蛋白重组质粒；所述待三聚体化的非结构域的融合蛋白多肽基因片段的核苷酸序列选自如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8所示的核苷酸序列；
3)将异源三聚体化融合蛋白重组质粒克隆至表达质粒载体，获得异源三聚体化融合蛋白的重组表达质粒载体；
(4)将所述异源三聚体化融合蛋白的重组表达质粒载体转染宿主细胞，回收宿主细胞培养上清液，提取纯化异源三聚体化融合蛋白组合物。
5.根据权利要求4所述的异源三聚体化融合蛋白组合物的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自真核细胞或原核细胞。
6.根据权利要求5所述的异源三聚体化融合蛋白组合物的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自昆虫细胞、哺乳细胞、大肠杆菌细胞、真菌细胞中的任一种。
7.一种疫苗，其特征在于，所述疫苗包括权利要求3所述的异源三聚体化融合蛋白组合物。
8.根据权利要求7所述的一种疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括佐剂，所述佐剂选自铝盐佐剂、CpG Toll-Like佐剂、水包油包水佐剂、角鲨烯佐剂、植物油佐剂、脂质体佐剂、纳米颗粒佐剂或弗氏佐剂中的至少一种。
9.权利要求3所述异源三聚体化融合蛋白组合物在制备疫病病毒抗体检测制剂或疫病病原监测制剂中的应用，其特征在于，所述制剂包含ELISA检测试剂盒、胶体金试纸条、化学发光检测盒或荧光发光检测盒中的任一种。
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