BR112014013745B1 - Método de teste in vitro, kit de detecção e seu uso, método in vitro de diagnóstico, método de fabricação de kit, e teste de imunosseleção multiplex - Google Patents

Método de teste in vitro, kit de detecção e seu uso, método in vitro de diagnóstico, método de fabricação de kit, e teste de imunosseleção multiplex Download PDF

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Abstract

MÉTODO DE TESTE IN VITRO, KIT DE DETECÇÃO E SEU USO, MÉTODO IN VITRO DE DIAGNÓSTICO, MÉTODO DE ACOPLAMENTO COVALENTE DE POLIPEPTÍDEO AGT, SUPORTE SÓLIDO E SEU USO, MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE KIT, TESTE DE IMUNOSSELEÇÃO MULTIPLEX E APARELHO PARA CONDUZIR O TESTE. A presente invenção fornece kits e métodos de tes te para detecção inicial de patógenos, identificação precis a do agente etiológico e melhoria da vigilância sanitária. Mais especificamente, a presente invenção descreve um imunoteste que gera detecção rápida e simultânea de anticorpos para uma ampla variedade de patógenos infecciosos e m fluidos biológicos de pacientes infectados. Este imunoteste envolve o acoplamento covalente e orientado de proteínas de fusão que compreendem uma enzima AGT e um antígeno viral sobre um suporte sólido identificável (tal como microesferas fluorescentes), em que o mencionado suporte é previ amente revestido com um substrato AGT. Este acoplamento é mediado pela reação irreversível da enzima AGT sobre o seu substrato. As microesferas acopladas a antígeno obtidas desta forma exibem captura aprimorada de anticorpos específicos em comparação com microesferas acopladas a antígenos produzidas por meio de procedimentos de acoplamento de amina padrão. Os mé todos de acordo com a presente invenção possuem a capacidade de (...).

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[001] Doenças infecciosas e febres hemorrágicas virais (VHFs) apresentam um problema de saúde pública significativo, devido à severidade das doenças, alta letalidade, contágio entre seres humanos de certos agentes e falta de tratamento eficaz para a maior parte deles.
[002] Algumas delas são causadas por vírus de RNA altamente infecciosos de diversas famílias que incluem os flavivirídeos (vírus da dengue, febre amarela, oeste do Nilo, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos e hepatite C), os togavirídeos (vírus Chikungunya, do Rio Ross, Mayaro, encefalite equina do oeste, encefalite equina do leste e encefalite equina da Venezuela), os buniavirídeos (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, febre do Vale do Rift e Schmallenberg), os calicivirídeos (vírus da hepatite E), os arenavirídeos (Lassa) e os filovirídeos (Ebola, Marburg). A transmissão normalmente ocorre por meio de contato com reservatórios de animais infectados ou vetores artrópodes. Embora a maior parte desses vírus possua ocorrência mais alta nos trópicos e subtrópicos, a expansão geográfica dos seus vetores e reservatórios naturais e o aumento das viagens internacionais tornaram o surgimento desses agentes em áreas não endêmicas altamente provável. O controle de epidemias depende de forma crucial da detecção rápida e identificação precisa do agente, a fim de definir e implementar ações oportunas e apropriadas. Neste contexto, é essencial produzir e validar ferramentas de detecção precoce de surtos, identificação precisa do agente etiológico e aumento do monitoramento de doenças.
[003] Neste particular, a detecção de anticorpos nos fluidos do corpo constitui uma parte importante do dagnóstico de doenças induzidas por vírus, doenças autoimunes e detecção de câncer. Na verdade, certos anticorpos podem servir de marcadores de diagnóstico e podem gerar prognóstico e tratamento, pois sabe-se que a sua presença é correlacionada com o surto de um patógeno. Este é particularmente o caso exclusivo dos antígenos virais dirigidos a anticorpos.
[004] Os métodos atuais de detecção da presença de anticorpos incluem diversos métodos tais como microscopia por imunofluorescência, teste de quimioluminescência, Western Blot, teste de radioimunoprecipitação (RIP) e ELISA. A equipe de Kim, H-J. et al, por exemplo, descobriu recentemente um ELISA competitivo para detecção de anticorpos para vírus da Febre do Vale do Rift em cabras e bois (The Journal of Veterinary Medical Science, 2011). Esses métodos exigem, entretanto, a medição separada de cada anticorpo e, portanto, não são úteis para análise paralela, rápida e de alto rendimento de anticorpos multiplex em uma amostra isolada de fluido biológico. A detecção paralela de diversos anticorpos simultaneamente pode ser particularmente útil minimizando os efeitos de matriz existentes entre testes individuais, tal como em ELISAs, pois os calibradores e os anticorpos são analisados sob as mesmas condições; ela gerará, portanto, resultados comparáveis para a medição de anticorpos multiplex presentes dentro da mesma amostra.
[005] Complicando a identificação direta de anticorpos patogenicamente relevantes, entretanto, está o fato de que soro normal contém grandes quantidades de anticorpos naturais que se manifestam em padrões de manchas complexos (Avrameas, S., Immunol. Today, 1991). A presença desses anticorpos naturais pode complicar a diferenciação de anticorpos associados a doenças do fundo complexo de “ruído autoimune”, ou seja, autoanticorpos de ocorrência natural. É por isso que a maior parte dos estudos anteriores avaliou um ou mais anticorpos relativos a doenças específicos e selecionou apenas uma quantidade limitada de proteínas homólogas ou heterólogas purificadas na forma de antígenos por meio de ELISA ou RIA. Foi impossível estabelecer um diagnóstico com base nesses anticorpos. Por outro lado, Western Blot evoluiu como a ferramenta mais importante de detecção de anticorpos porque permite a seleção simultânea para um amplo espectro de antígenos diferentes. Um novo método recente, capaz de analisar esses padrões de manchas complexos de Western Blots simultaneamente, é baseado em análise de imagens digitais. Este método foi utilizado com sucesso em estudos de miastenia grave, mal de Grave e uveíte experimental (Zimmerman, C. W., Electrophoresis, 1995). Os anticorpos podem também ser detectados e medidos sobre um conjunto de chip de proteína utilizando métodos de espectrometria de massa de ionização/dessorção a laser assistida por matriz ou ionização/dessorção a laser amplificada na superfície (SELDI), preferencialmente método de espectrometria de massa SELDI (US 2006/166268). Ainda assim, esses métodos utilizam grande equipamento complicado cuja manutenção é cara e complexa e exige alta quantidade das amostras biológicas para atingir a detecção de anticorpos que se encontram em baixa quantidade.
[006] Em vista do acima, existe a necessidade de sistemas e métodos endereçáveis que possam fornecer aprimoramentos adicionais em alto rendimento, eficácia para seu custo e precisão no diagnóstico molecular de doenças geradoras de anticorpos. A presente invenção satisfaz estas e outras necessidades.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[007] A Figura 1 representa o acoplamento orientado de proteínas de antígeno-AGT quiméricas a microesferas revestidas com substrato. A primeira etapa de acoplamento consiste de acoplamento do substrato de AGT BG-PEG-NH2 às microesferas ativadas por meio de acoplamento de amina. A segunda etapa consiste do contato das microesferas revestidas com substrato com proteínas de fusão que contêm AGT (por exemplo, o mutante SNAP), em que a mencionada enzima destina-se a ligar-se covalentemente ao seu substrato de BG-PEG-NH2, ou seja, às microesferas.
[008] A Figura 2 exibe a eficiência de acoplamento de proteínas de antígenos virais-SNAP quiméricas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP- ZIKA), seguidas por anticorpo anti-SNAP.
[009] A Figura 3 compara a sensibilidade do experimento de imunoteste para detecção de anticorpo anti-DV2 monoclonal purificado sobre proteína SNAP-DV2.EDIII quimérica conjugada a microesferas por meio do substrato da proteína hAGT (acoplamento de acordo com a presente invenção) ou acoplada por meio de um procedimento de acoplamento de amina padrão, tal como Kit de Acoplamento de Amina Bio-Plex, BIORAD.
[010] A Figura 4 compara a sensibilidade do experimento de imunoteste para detecção de anticorpo anti-DV1 monoclonal purificado sobre proteína SNAP-DV1.EDIII quimérica conjugada a microesferas, seja em formato uniplex ou multiplex com outras proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP-TBE) acopladas a microesferas.
[011] A Figura 5 exibe a reatividade e especificidade do experimento de imunoteste multiplex para detecção de diluições de anticorpo anti-WNV monoclonal purificado sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP- WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP-TBE) acopladas a microesferas.
[012] A Figura 6 exibe a reatividade e a especificidade de detecção de IgG anti-DV3 em soro policlonal de camundongo contra a detecção de IgG anti-YF e DV3 (A) em soro policlonal de camundongo contra YF (B) em imunotestes multiplex sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP- DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE e SNAP-ZIKA) acopladas a microesferas.
[013] A Figura 7 exibe a reatividade e a especificidade de detecção de IgM anti-DV1 (A) e detecção de IgG anti-DV1 (B) em soro infectado por DV1 de pacientes humanos em imunotestes multiplex sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP- WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE e SNAP-ZIKA) acopladas a microesferas.
[014] A Figura 8 descreve a estrutura do conjunto pDeSNAPuniv.
[015] A Figura 9 descreve a estrutura do conjunto pDeSNAPuniv/SBV.N.
[016] A Figura 10 exibe (a) um teste de imunomanchas realizado sobre os sobrenadantes de células S2/SNAP-SBV.N induzidas por dez dias com Cd2+ (+) ou não induzidas (-).A proteína quimérica secretada SNAP-SBV.N (MW teórico de 50 kDa) foi detectada utilizando um anticorpo anti-marca His, em comparação para definir quantidades de proteína quimérica altamente purificada SNAP-TOS.N (MW teórico de 49 kDa). (b) Imunomancha realizada sobre frações de coluna de cromatografia de exclusão de tamanhos (manchas de azul de Coomassie de SDS PAGE) correspondente à etapa de purificação final de proteína SNAP+SBV.N secretada de células S2/SNAP+SBV.N induzidas por dez dias.
[017] A Figura 11 exibe um exemplo de dispositivo que contém as microesferas revestidas com antígeno de acordo com a presente invenção.
DESCRIÇÃO DETALHADAS DA INVENÇÃO
[018] A enzima alquiltransferase de 6-alquilguanina-DNA (AGT, também conhecida como ATase ou MGMT e denominada a seguir “AGT”) recebeu o número EC 2.1.1.63 na nomenclatura de enzimas IUBMB. Trata-se de uma enzima de reparo de DNA de alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina com 207 resíduos de aminoácidos, cuja função nas células é a de reparar DNA alquilado. Mais precisamente, AGT age sobre guanina O6-metilada em DNA por meio de transferência irreversível do grupo metila em uma reação SN2 para um resíduo de cisteína reativo (Cys 145). Recentemente, demonstrou-se que diversos derivados de O6-benzilguanina reagem irreversivelmente com a mencionada enzima por meio de transferência do seu grupo benzila para a cisteína de local ativo da enzima AGT (cf. Damoiseaux et al, ChemBiochem., 2001, WO 2004/031404 e WO 2005/085470).
[019] Os inventores do presente desenvolveram e validaram imunotestes, gerando detecção rápida e simultânea de vários anticorpos gerados por uma ampla variedade de doenças, particularmente doenças arbovirais e VHFs, em fluidos biológicos.
[020] Para atingir sensibilidade e especificidade ideais para detecção de baixa quantidade de anticorpos, foi desenvolvido um procedimento de acoplamento de antígenos orientado. Este procedimento de acoplamento de antígenos orientado é baseado na interação covalente entre as enzimas AGT e seus substratos, os derivados de O6-benzilguanina, que reagem irreversivelmente com enzimas AGT por meio de transferência do seu grupo benzila para a cisteína de local ativo da enzima. Consequentemente, diversos antígenos alvo podem ser fundidos a uma porção de enzima AGT, resultando em diferentes proteínas de fusão quiméricas (denominadas a seguir proteínas de fusão de [AGT - Antígeno]), que podem ser utilizadas como reagentes de captura para os anticorpos presentes em uma amostra biológica. Os inventores do presente demonstraram que esta captura de anticorpo é aprimorada quando essas proteínas de fusão são ligadas a suportes sólidos graças à interação de substrato de AGT específica. O revestimento dos mencionados suportes sólidos com substrato AGT é, portanto, uma etapa essencial do imunoteste de acordo com a presente invenção.
[021] Mais precisamente, no contexto da presente invenção, o método de acoplamento de antígenos a suportes sólidos compreende as duas etapas a seguir: (i) o revestimento de superfícies sólidas com um substrato AGT (tal como BG-PEG-amino); e (ii) a imobilização covalente de proteínas de fusão [AGT - Antígeno] quiméricas utilizando o substrato AGT como âncora (vide a Figura 1). Antes do revestimento com o mencionado substrato AGT, as superfícies sólidas são convenientemente funcionalizadas, preferencialmente utilizando um processo de carbodi-imida em duas etapas otimizado (Kufer, S. K., Eur. Biophys. J., 2005), de tal forma que o substrato AGT é ligado covalentemente às superfícies sólidas. Após a realização dessas etapas, as superfícies sólidas conduzem substratos AGT que são ligados irreversivelmente às proteínas de fusão [AGT - antígeno] quiméricas. Devido à alta especificidade desta reação, a proteína de fusão é exclusivamente acoplada por meio do domínio que contém cisteína da enzima AGT, de forma a deixar o antígeno acessível para suas interações com anticorpos.
[022] Este procedimento de acoplamento é muito vantajoso, pois permite a ligação do antígeno de forma orientada sobre os suportes sólidos. Além disso, este procedimento de acoplamento de antígenos permite convenientemente a obtenção de organização de antígenos multiméricos sobre uma superfície sólida, de forma a aprimorar a eficiência de captura da imunoglobulina G e, potencialmente, da imunoglobulina M. Consequentemente, as microesferas acopladas a antígenos desenvolvidas na parte experimental do pedido demonstraram captura aprimorada de anticorpos específicos em comparação com microesferas acopladas a antígenos produzidas por meio de procedimentos de acoplamento de amina não orientados padrão (vide a parte experimental abaixo e a Figura 3). Finalmente, este procedimento de acoplamento de antígenos permite a obtenção de alta eficiência de acoplamento e estabilidade a longo prazo das microesferas conjugadas a antígenos (mais de seis meses a 4°C).
[023] De forma importante, os suportes sólidos utilizados nos imunotestes de acordo com a presente invenção deverão ser intrinsecamente identificáveis, de forma a possibilitar a determinação precisa de qual antígeno é conduzido por qual suporte sólido. Os suportes sólidos identificáveis e acoplados a antígenos são utilizados em seguida como reagentes de captura para imunoglobulinas humanas específicas e, portanto, são colocados em contato com a amostra biológica do paciente.
[024] A etapa final do método de acordo com a presente invenção envolve a detecção dos suportes sólidos que são efetivamente ligados a imunoglobulinas. A identificação de suporte(s) sólido(s) revestido(s) com imunoglobulina permite o diagnóstico de qual patógeno estava infectando o paciente (pois cada suporte sólido coincide com um antígeno patogênico definido). Esta etapa de detecção final é realizada por qualquer meio habitual, utilizando, por exemplo, anticorpos de detecção marcados e por meio da identificação da natureza do suporte sólido.
[025] Convenientemente, o método de acordo com a presente invenção envolve apenas a detecção da presença de anticorpos em pacientes doentes, mas não é necessário conhecimento sobre a identidade desses anticorpos.
[026] Conforme exibido na parte experimental do presente pedido, os inventores utilizaram o procedimento de acoplamento de antígenos de acordo com a presente invenção para gerar uma série de microesferas fluorescentes revestidas por antígeno diferentes. Atualmente, dezesseis conjuntos de microesferas distintos foram acoplados a dezesseis proteínas de fusão [AGT - Antígeno] quiméricas purificadas, permitindo a titulação de dezesseis anticorpos de soro específicos para diferentes proteínas dos vírus de sorotipos 1 a 4 de dengue, Oeste do Nilo, febre amarela, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos, encefalite de Saint-Louis, encefalite do Vale de Murray, Wesselsbron, Zika, Rocio, Usutu, febre do Vale do Rift e Chikungunya. Estes dezesseis conjuntos distintos de microesferas foram misturados em uma única amostra sem afetar a sensibilidade e especificidade da detecção (vide a Figura 5). A produção deste sistema é altamente eficaz para seu custo e tempo, pois apenas uma quantidade muito pequena de antígeno recombinante (< 50 μg) é necessária para produzir um conjunto de microesferas acopladas a antígenos (~1,25 x 106 microesferas), em que este conjunto é suficiente para realizar quinhentos testes individuais.
[027] Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de detecção de pelo menos dois anticorpos alvo em uma amostra biológica que compreende: a. contato de um primeiro suporte sólido que compreende um substrato AGT acoplado covalentemente a uma primeira proteína de fusão que compreende um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina e um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo com a amostra biológica; b. contato de um segundo suporte sólido que compreende um substrato AGT acoplado covalentemente a uma segunda proteína de fusão que compreende um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina e um segundo epítopo que é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo com a amostra biológica; e c. detecção da presença ou ausência dos dois anticorpos alvo.
[028] Mais precisamente, a presente invenção refere-se a um método de teste in vitro de detecção de pelo menos dois anticorpos alvo diferentes presentes em uma amostra biológica de pacientes, em que o mencionado método compreende as etapas de: a. fornecimento de uma primeira proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina; b. contato da mencionada primeira proteína de fusão com um primeiro suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; c. obtenção de um primeiro suporte sólido acoplado covalentemente a um primeiro epítopo que é reconhecido pelo primeiro anticorpo alvo; d. fornecimento de uma segunda proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um segundo epítopo, em que o mencionado segundo epítopo é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina; e. contato da mencionada segunda proteína de fusão com um segundo suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; f. obtenção de um segundo suporte sólido acoplado a um segundo epítopo que é reconhecido pelo segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado segundo anticorpo alvo; em que os mencionados primeiro e segundo suportes sólidos podem ser especificamente identificados entre si; g. contato da mencionada amostra biológica com os primeiro e segundo suportes sólidos obtidos nas etapas (c) e (f); h. detecção da presença dos mencionados pelo menos dois anticorpos alvo.
[029] Da forma utilizada em seguida, as expressões “um anticorpo”, “uma proteína de fusão”, “um epítopo”, “um antígeno”, “um polipeptídeo AGT”, “um suporte sólido” e similares obviamente necessitam ser compreendidas como habitual na técnica, ou seja, de forma ampla. Particularmente, elas englobam não apenas moléculas isoladas específicas, mas diversas das mencionadas moléculas. A expressão “suporte sólido”, por exemplo, engloba um subconjunto de diversos suportes sólidos idênticos, o termo “micropartícula” engloba um subconjunto de numerosas micropartículas idênticas e a expressão “proteína de fusão” engloba uma série de moléculas de proteína isoladas idênticas. No contexto da presente invenção, vale a pena notar que um suporte sólido conduz diversas proteínas de fusão idênticas, em que as mencionadas proteínas de fusão contêm, além do polipeptídeo AGT, antígeno idêntico e, portanto, epítopos idênticos, de tal forma que os anticorpos que serão detectados sobre o suporte sólido possam ser identificados sem ambiguidade.
[030] Da forma utilizada no presente, a expressão “proteína de fusão” indica um polipeptídeo que contém uma proteína ou polipeptídeo criado por meio da junção artificial de dois ou mais genes. Nos imunotestes de acordo com a presente invenção, as mencionadas proteínas de fusão contêm um polipeptídeo AGT e um antígeno, que contém pelo menos um epítopo. Proteínas de fusão podem ser obtidas por meio da elaboração genética de um gene de fusão. Isso tipicamente envolve a remoção do códon de parada de uma sequência de cDNA que codifica a primeira proteína e anexação em seguida da sequência de cDNA do segundo quadro de leitura da proteína por meio de ligase ou PCR de extensão de sobreposição. Aquela sequência de DNA será expressa por proteína por uma célula na forma de proteína isolada. A proteína pode ser elaborada para incluir a sequência completa das duas proteínas originais ou apenas uma parte delas. Caso as duas entidades sejam proteínas, podem ser adicionados peptídeos ligantes (ou “espaçadores”), o que torna mais provável que as proteínas dobrem-se independentemente e comportem-se conforme esperado. Particularmente, as proteínas de fusão de acordo com a presente invenção podem ser obtidas por meio do fornecimento de vetores que compreendem sequências de codificação de AGT em quadro com um epítopo ou sequências de codificação de antígenos, ligadas ao lado terminal N ou terminal C da sequência de DNA de AGT. Estes vetores podem ser introduzidos em hospedeiros procarióticos, que incluem eubactérias tais como bactérias de E. coli ou hospedeiros eucarióticos, tais como leveduras, células de insetos ou células de mamíferos e as proteínas de fusão recombinantes, podem ser produzidos sob condições apropriadas. Construções típicas são apresentadas na parte experimental do presente pedido.
[031] O termo “anticorpo”, da forma utilizada no presente, destina- se a incluir anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e anticorpos quiméricos. Preferencialmente, os anticorpos que devem ser detectados pelos imunotestes de acordo com a presente invenção são anticorpos policlonais, que estão presentes em amostras biológicas de pacientes doentes e, portanto, foram gerados de fontes de células B diferentes. Desta forma, eles reconhecem epítopos diferentes exibidos por um antígeno patogênico (por outro lado, anticorpos monoclonais são derivados de uma linhagem celular isolada e reconhecem o mesmo epítopo).
[032] Um anticorpo (ou “imunoglobulina”) consiste de uma glicoproteína que compreende pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesada compreende uma região (ou domínio) variável de cadeia pesada (abreviada no presente como HCVR ou HV) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada compreende três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve compreende uma região variável de cadeia leve (abreviada no presente LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve compreende um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas “regiões de determinação de complementaridade” (CDR) ou “regiões hipervariáveis”, que são principalmente responsáveis pela ligação de um epítopo de antígeno e são intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de terminal amino para terminal carbóxi na ordem a seguir: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. As regiões variáveis das cadeias leve e pesada contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a fatores ou tecidos hospedeiros, incluindo várias células do sistema imunológico (tais como células efetoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.
[033] O anticorpo pode ser de isotipos diferentes (nomeadamente, IgA, IgD, IgE, IgG ou IgM). Os anticorpos do tipo IgG e IgM podem ser ambos detectados pelo método do presente. Merece observação que esses isotipos são compostos de duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas que são unidas por ligações de dissulfeto. De forma importante, anticorpos IgM formam polímeros em que imunoglobulinas multiplex são ligadas covalentemente entre si com ligações de dissulfeto, principalmente na forma de pentâmero mas também como hexâmero, de forma que possuem massa molecular de cerca de 900 kDa (na sua forma de pentâmero). Como cada monômero contém dois locais de ligação de antígenos, um IgM pentamérico contém dez locais de ligação. Tipicamente, entretanto, anticorpos IgM não podem ligar dez antígenos ao mesmo tempo porque o grande tamanho da maior parte dos antígenos causa obstrução da ligação a locais próximos. Devido à sua natureza polimérica, IgM possui alta avidez.
[034] Fragmentos de anticorpos podem também ser detectados graças ao método do presente. Esta expressão destina-se a incluir Fab, Fab’, F(ab')2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicorpos, diacorpos, seus multímeros fragmentos de anticorpos biespecíficos.
[035] Anticorpos monoclonais podem ser utilizados nos imunotestes do presente; por exemplo, para detectar as imunoglobulinas que são ligadas aos suportes sólidos. Da forma utilizada no presente, "anticorpo monoclonal" define um anticorpo decorrente de uma população de anticorpos homogêneos. Mais especificamente, os anticorpos individuais de uma população são idênticos, exceto por algumas possíveis mutações de ocorrência natural que podem ser encontradas em proporções mínimas. Em outras palavras, um anticorpo monoclonal consiste de um anticorpo homogêneo decorrente do crescimento de um clone celular isolado (tal como um hibridoma, uma célula hospedeira eucariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica o anticorpo homogêneo, uma célula hospedeira procariótica transfectada com uma molécula de DNA que codifica o anticorpo homogêneo etc.) e geralmente é caracterizado por cadeias pesadas de uma única classe e subclasse e cadeias leves de apenas um tipo. Anticorpos monoclonais são altamente específicos e dirigidos contra um antígeno isolado. Além disso, ao contrário de preparações de anticorpos policlonais que incluem tipicamente diversos anticorpos dirigidos contra vários determinantes ou epítopos, cada anticorpo monoclonal é dirigido a um único epítopo do antígeno.
[036] O termo “antígeno” no presente indica qualquer substância que faça com que o sistema imunológico produza anticorpos contra a mencionada substância. Um antígeno “imunogênico” é um tipo específico de antígeno que é capaz de estimular uma reação imunológica adaptativa quando injetado isoladamente. Em nível molecular, um antígeno é caracterizado, portanto, pela sua capacidade de ser “ligado” ao local de ligação de antígeno de um anticorpo.
[037] No contexto da presente invenção, afirma-se que um anticorpo “liga” um antígeno (ou epítopo) definido ou “reconhece” o mencionado antígeno (ou epítopo) caso o mencionado anticorpo possua uma constante de afinidade Ka (que é a constante de dissociação invertida, ou seja, 1/Kd) de mais de 105 M-1, preferencialmente mais de 106 M-1 e, de maior preferência, mais de 107 M-1 para o mencionado antígeno (ou epítopo). Essa afinidade pode ser medida, por exemplo, por meio de diálise de equilíbrio ou de resfriamento por fluorescência, em que ambas as tecnologias são utilizadas rotineiramente na técnica.
[038] No contexto da presente invenção, antígenos ou epítopos incluem: proteínas, lipoproteínas, polissacarídeos e glicoproteínas. As mencionadas proteínas incluem proteínas virais, bacterianas, parasíticas, animais e fúngicas tais como albuminas, toxoide do tétano, toxoide de difteria, toxoide da coqueluche, proteínas da membrana externa bacteriana (incluindo proteína da membrana externa meningocócica), proteína RSV-F, peptídeo derivado da malária, B-lactoglobulina B, aprotinina, ovalbumina, lisozima, peptídeos lineares, oligopeptídeos etc. Os mencionados antígenos podem também ser antígenos associados a tumores tais como antígeno carcinoembriônico (CEA), CA 15-3, CA 125, CA 19-9, antígeno específico da próstata (PSA), complexos TAA, SSX2 ou NERCMSL. Os mencionados antígenos podem também ser haptenos e outras porções que compreendem moléculas com baixo peso molecular, tais como sacarídeos, oligossacarídeos, polissacarídeos, peptídeos, mucinas, toxinas e alérgenos (pólen, clara de ovo). Toxinas infecciosas são bem conhecidas na técnica. Pode-se mencionar, por exemplo, as neurotoxinas de bolutinum, a toxina Y de Clostridium perfringens, rícino, saxitoxina, shigatoxina, tetrodotoxina, enterotoxinas de estafilococos etc. Mucinas também são bem conhecidas na técnica. MUC5AC, MUC5B e MUC2 são seus exemplos. Particularmente, elas podem ser polissacarídeos de ocorrência natural tais como polissacarídeos capsulares de pneumococos e estreptococos do Grupo B (incluindo tipo III), mucoexopolissacarídeo de Pseudomonas aeruginosa e polissacarídeos capsulares (incluindo Fisher tipo I) e polissacarídeos de Haemophilus influenzae.
[039] Em outra realização preferida, o mencionado antígeno ou epítopo é expresso por um vírus que é selecionado a partir do grupo que consiste de: vírus da influenza, vírus da hepatite A, vírus da hepatite B, vírus da hepatite C, vírus da hepatite E, vírus da hepatite G, vírus HIV, vírus da febre amarela, vírus da dengue, vírus da encefalite japonesa, vírus da encefalite transmitido por carrapatos, vírus Usutu ou do oeste do Nilo, vírus da Tocana ou da febre do Vale do Rift, vírus chikungunya, vírus sinticial respiratório, vírs Rocio, morbilivírus, vírus da encefalite de Murray, vírus Wesselbron, vírus Zika, vírus da coreomeningite linfocítica, vírus Ebola, vírus Marburg, vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, vírus Lassa, vírus Junin, vírus Machupo, vírus Sabiá, vírus Guanarito, vírus da caxumba, vírus da raiva, vírus da rubéola, vírus zoster da varicela, simplex da herpes tipos 1 e 2, mais geralmente um alfavírus, adenovírus, ecovírus, rotavírus, flavivírus, rinovírus, ortobuniavírus, vírus da pólio, parvovírus humano, enterovírus, coronavírus, papilomavírus humano, citomegalovírus humano, vírus Epstein-Barr, vírus da parainfluenza dos tipos 1, 2 e 3 ou qualquer vírus identificado.
[040] Em outra realização preferida, o mencionado antígeno ou epítopo é expresso por um vírus pertencente a uma família que é selecionada a partir do grupo que consiste de: os flavivirídeos (vírus da dengue, febre amarela, oeste do Nilo, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos e hepatite C), os togavirídeos (vírus Chikungunya, do Rio Ross, Mayaro, encefalite equina do oeste, encefalite equina do leste e encefalite equina da Venezuela), os buniavirídeos (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, febre do Vale do Rift e Schmallenberg), os calicivirídeos (vírus da hepatite E), os arenavirídeos (Lassa) e os filovirídeos (Ebola, Marburg).
[041] Em outra realização preferida, o mencionado antígeno ou epítopo é expresso por um protozoário parasítico (tal como os do gênero Leishmania ou Toxoplasma gondii, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, Pneumocystis carinii ou Giardia lamblia), vermes (tais como nematoides, céstodes ou trematoides) ou artrópodes (tais como crustáceos, insectos e aracnídeos).
[042] Em outra realização preferida, o mencionado antígeno ou epítopo é expresso por uma bactéria infecciosa, tal como dos gêneros Salmonella, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Mycoplasma, Diphtheriae, Leptospirosa, Rickettsia ou Escherichia. Em uma realização preferida adicional, a mencionada bactéria pertence a uma das espécies selecionadas a partir de H. influenzae, S. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, Bacillus anthracis, Listeria monocytogenes, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, S. epidermidis, N. meningiditis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetii, Leptospirosa interrogans e E. coli.
[043] Em outra realização preferida, o mencionado antígeno ou epítopo é expresso por um fungo ou levedura (tal como das espécies Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis ou Stachybotrys).
[044] Os antígenos normalmente apresentam diversas características de superfície que podem agir como pontos de interação para anticorpos específicos. Qualquer dessas características moleculares distintas constitui um epítopo. Da forma utilizada no presente, o termo “epítopo” designa, portanto, uma característica de superfície molecular específica de um antígeno, tal como um fragmento de antígeno, que é capaz de ser ligada por pelo menos um anticorpo. Em nível molecular, um epítopo corresponde, portanto, a uma característica de superfície molecular específica de um antígeno (tal como um fragmento de um antígeno) que é reconhecido e ligado por um anticorpo específico. No contexto da presente invenção, as “proteínas de fusão” contêm pelo menos um epítopo que é reconhecido por um anticorpo alvo. Preferencialmente, as mencionadas proteínas de fusão contêm antígenos inteiros, que compreendem diversos epítopos. Estes epítopos podem ser epítopos lineares ou conformacionais. Da forma utilizada no presente, epítopo linear (ou sequencial) é um epítopo que é reconhecido por um anticorpo pela sua sequência linear de aminoácidos ou estrutura primária. Por outro lado, um epítopo de conformação é reconhecido pelo seu formato tridimensional específico. Preferencialmente, as proteínas de fusão de acordo com a presente invenção contêm epítopos de conformação, pois a maior parte dos anticorpos policlonais as reconhece.
[045] É importante, entretanto, que esses antígenos não apresentem epítopos de reação cruzada, ou seja, epítopos que são reconhecidos por anticorpos não específicos que se ligarão a eles. Se fosse este o caso, a especificidade do método de acordo com a presente invenção seria reduzida.
[046] Em uma realização de maior preferência, o mencionado epítopo está presente sobre uma proteína viral que é selecionada a partir do grupo que consiste de: proteína EDIII do vírus da dengue 1 codificada por SEQ ID N° 3, proteína EDIII do vírus da dengue 2 codificada por SEQ ID N° 4, proteína EDIII do vírus da dengue 3 codificada por SEQ ID N° 5, proteína EDIII do vírus da dengue 4 codificada por SEQ ID N° 6, proteína EDIII do vírus do oeste do Nilo codificada por SEQ ID N° 7, proteína EDIII do vírus da febre amarela codificada por SEQ ID N° 8, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa codificada por SEQ ID N° 9, proteína EDIII do vírus Zika codificada por SEQ ID N° 10, proteína EDIII do vírus Wesselbron codificada por SEQ ID N° 11, proteína EDIII do vírus Rocio codificada por SEQ ID N° 12, proteína EDIII do vírus da encefalite de Murray codificada por SEQ ID N° 13, proteína EDIII do vírus da encefalite de Saint-Louis codificada por SEQ ID N° 14, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 1 codificada por SEQ ID N° 54, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 2 codificada por SEQ ID N° 55, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 4 codificada por SEQ ID N° 56, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 5 codificada por SEQ ID N° 57, proteína EDIII do vírus Rabensburg codificada por SEQ ID N° 58 e proteína viral de HIV1, HIV2, do vírus da hepatite B, do vírus da hepatite C, do vírus da hepatite E, do vírus do oeste do Nilo e de linhagens de HPV oncogênicas tais como HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.
[047] Em uma realização preferida, os primeiro e segundo epítopos (ou antígenos) que são fundidos com a enzima hAGT nas proteínas de fusão utilizadas no método de acordo com a presente invenção pertencem ao mesmo nível taxonômico, ou seja, pertencem à mesma família (tal como a família dos flavirídeos, a família dos buniavirídeos, a família dos arenavirídeos ou a família dos filovirídeos), gênero ou espécie, mas possuem sorotipos diferentes. Em outras palavras, os mencionados primeiro e segundo epítopos podem ser expressos por vírus com relação próxima, que pertencem, por exemplo, à mesma família, gênero ou espécie, mas possuem sorotipos diferentes, tais como o vírus da dengue 1, 2, 3 ou 4.
[048] Alternativamente, em outra realização preferida, os mencionados primeiro e segundo epítopos (ou antígenos) pertencem a famílias, gêneros ou espécies biológicas não relacionadas.
[049] De forma importante, os imunotestes de acordo com a presente invenção dependem da detecção de uma grande quantidade de anticorpos, que são conhecidos ou desconhecidos. Por “grande quantidade”, compreende-se no presente pelo menos cinco, de maior preferência pelo menos quinze, de maior preferência pelo menos cinquenta e, de preferência ainda maior, pelo menos cem anticorpos. Em uma realização preferida, portanto, o método de teste de acordo com a presente invenção é utilizado para detectar pelo menos cinco, de maior preferência pelo menos quinze, preferencialmente pelo menos cinquenta e, de preferência ainda maior, pelo menos cem anticorpos alvo em uma amostra biológica de um paciente. Não é relevante para o método de acordo com a presente invenção se os anticorpos específicos são adequadamente caracterizados, pois o procedimento depende apenas da detecção da presença dos mencionados anticorpos e não da sua natureza.
[050] Em uma realização preferida da presente invenção, as mencionadas primeira e segunda proteínas de fusão que são acopladas aos mencionados primeiro e segundo suportes sólidos são selecionadas a partir do grupo que consiste de: - SEQ ID N° 21 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- DEN1.EDIII]); - SEQ ID N° 42 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- SBV.N]); - SEQ ID N° 49 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- EV71.VP1]); - SEQ ID N° 51 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JE.sE]); - SEQ ID N° 53 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JE1.EDIII]); - SEQ ID N° 60 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JE-2.EDIII]); - SEQ ID N° 62 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JE-4.EDIII]); - SEQ ID N° 64 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JE-5.EDIII]); - SEQ ID N° 66 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- RabV.EDIII]); - SEQ ID N° 680 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- flavivírus.EDIII]); - SEQ ID N° 70 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- RR.sE2]); - SEQ ID N° 72 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MAY.sE2]); - SEQ ID N° 74 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- WEE.sE2]); - SEQ ID N° 76 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- EEE.sE2]); - SEQ ID N° 78 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- VEE.sE2]); - SEQ ID N° 80 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- AKA.N]); - SEQ ID N° 82 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- AIN.N]); - SEQ ID N° 84 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- SHA.N]); - SEQ ID N° 86 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- huCOV.N]); - SEQ ID N° 88 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- huCOV.S]); - SEQ ID N° 90 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- HCV.C]); - SEQ ID N° 92 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MSP+AMA]); - SEQ ID N° 94 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- HbpA1]); - SEQ ID N° 96 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MUB40]); - SEQ ID N° 98 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- moCLEC5A]); - SEQ ID N° 100 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- huCLEC5A]); - SEQ ID N° 102 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- cxVAGO]); - SEQ ID N° 104 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- aaVAGO]); - SEQ ID N° 109 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- CCHF.N]); - SEQ ID N° 111 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- EBO.N]); - SEQ ID N° 113 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MAR.N]); - SEQ ID N° 115 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- LAS.N]); - SEQ ID N° 117 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JUN.N]); - SEQ ID N° 119 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MAC.N]); - SEQ ID N° 121 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- GUA.N]); - SEQ ID N° 123 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- SAB.N]); - SEQ ID N° 125 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- OMSK.EDIII]); - SEQ ID N° 127 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- KYA.EDIII]); - SEQ ID N° 129 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- ALK.EDIII]); - SEQ ID N° 131 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- LAS.ectoGP1]); - SEQ ID N° 133 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JUN.ectoGP1]); - SEQ ID N° 135 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MAC.ectoGP1]); - SEQ ID N° 137 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- GUA.ectoGP1]); - SEQ ID N° 139 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- SAB.ectoGP1]); - SEQ ID N° 141 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- LAS.ectoGP2]); - SEQ ID N° 143 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- JUN.ectoGP2]); - SEQ ID N° 145 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- MAC.ectoGP2]); - SEQ ID N° 147 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- GUA.ectoGP2]); - SEQ ID N° 149 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- SAB.ectoGP2]); e - SEQ ID N° 151 (correspondente à proteína de fusão [SNAP- HEV.C]).
[051] Consequentemente, o método in vitro de acordo com a presente invenção permite a detecção de doença(s) alvo que é(são) infecção(ões) viral(is), bacteriana(s), de levedura(s) ou mediada(s) por fungo(s). Preferencialmente, a mencionada infecção viral é causada por papilomavírus ou vírus de RNA das famílias dos flavivirídeos (vírus da dengue, febre amarela, oeste do Nilo, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos e hepatite C), os togavirídeos (vírus Chikungunya, do Rio Ross, Mayaro, encefalite equina do oeste, encefalite equina do leste e encefalite equina da Venezuela), os buniavirídeos (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, febre do Vale do Rift e Schmallenberg), os calicivirídeos (vírus da hepatite E), os arenavirídeos (Lassa) e os filovirídeos (Ebola, Marburg). Preferencialmente, a mencionada infecção bacteriana é causada por Leptospirosa interrogans. Preferencialmente, a mencionada infecção é causada por Plasmodium falciparum.
[052] Da forma utilizada no presente, a expressão “amostra biológica” designa qualquer amostra que tenha sido obtida de um paciente e que poderá conter anticorpos. Preferencialmente, a mencionada amostra biológica é um fluido biológico, tal como um fluido biológico não filtrado como urina, fluido cerebroespinhal, fluido pleural, fluido sinovial, fluido peritoneal, fluido amniótico, fluido gástrico, sangue, soro, plasma, fluido linfático, fluido intersticial, saliva, secreções fisiológicas, lágrimas, muco, suor, leite, sêmen, fluido seminal, secreções vaginais, fluido de úlceras e outras erupções superficiais, bolhas e abscessos. Ela também se refere a um extrato de tecidos que incluem biópsias de tecidos normais, malignos e suspeitos ou quaisquer outros componentes do corpo que podem conter anticorpos. A mencionada amostra biológica pode ser previamente tratada antes do uso, tal como por meio da preparação de plasma de sangue, diluição de fluidos viscosos ou similares; métodos de tratamento podem envolver filtragem, destilação, concentração, desativação de compostos interferentes e adição de reagentes. Em uma realização preferida, a mencionada amostra biológica é selecionada a partir de sangue integral, soro, plasma, urina, fluido seminal, fluido cerebroespinhal e saliva.
[053] Qualquer polipeptídeo que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina pode ser utilizado no método de acordo com a presente invenção. Para o propósito da presente invenção, estes polipeptídeos serão denominados “polipeptídeos AGT”.
[054] AGT transfere irreversivelmente o grupo alquila do seu substrato, DNA de O6-alquilguanina, para um dos seus resíduos de cisteína. Um substrato análogo que reage rapidamente com AGT é O6-benzilguanina, em que a constante de taxa de segunda ordem é de cerca de 103 seg-1 M-1.
[055] No contexto da presente invenção, afirma-se que um polipeptídeo possui “atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina” (ou “atividade de AGT”) se for capaz de transferir irreversivelmente um grupo alquila de uma molécula que contém O6-alquilguanina para um dos seus próprios resíduos de cisteína. A “atividade de alquiltransferase de DNA de O6- alquilguanina” do mencionado polipeptídeo pode ser demonstrada, por exemplo, por meio do contato de derivados de O6-benzilguanina marcada conhecidos e monitoramento da transferência da mencionada marca para o polipeptídeo testado. Caso o teste seja realizado em células ou em extratos celulares, a reação do AGT endógeno das células hospedeiras deverá ser controlada, de forma que o AGT endógeno não interfira com o mencionado polipeptídeo. São preferencialmente utilizadas, portanto, linhagens celulares com deficiência de AGT conhecidas. São agora bem descritos testes de identificação da atividade de AGT. Vários derivados de O6-benzilguanina são disponíveis comercialmente (O6-benzilguanina é distribuída, por exemplo, pela Santa Cruz Biotechnology e derivados de O6-benzilguanina com marca fluorescente podem ser obtidos por meio da New England Biolabs NEB). Alguns destes testes são descritos em WO 2005/085470 e em WO 2004/031405.
[056] No contexto da presente invenção, o “domínio catalítico” do polipeptídeo AGT corresponde ao local ativo da mencionada enzima ou, em outras palavras, à parte da enzima na qual ocorre a transferência do grupo alquila do seu substrato, DNA de O6-alquilguanina, para um resíduo de cisteína reativo. Na estrutura de hAGT ligado com O6-benzilguanina no seu local ativo, quatro aminoácidos encontram-se nas proximidades do anel benzila (Pro140, Ser159, Gly160) ou poderão fazer contato com o N9 da nucleobase (Asn157). Demonstrou-se anteriormente que mutações na posição Pro140 e Gly160 afetam a reação de hAGT com O6-benzilguanina (Xu-Welliver et al, Biochemical Pharmacology 1999): acredita-se que uma linha pro na posição 140 seja essencial para sua interação com o anel benzila e demonstrou-se que a mutação Gly160Trp aumenta a reatividade de hAGT contra O6-benzilguanina.
[057] Em uma realização preferida, o polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina é o polipeptídeo AGT humano (denominado NP_002403.2) da sequência SEQ ID N° 1, o AGT de camundongo identificado como NP_032624.1 (SEQ ID N° 18), o MGMT de rato identificado como NP_036993.1 (SEQ ID N° 19) ou uma de suas sequências homólogas, em que a mencionada sequência homóloga possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina.
[058] Da forma utilizada no presente, o termo “homólogo” designa sequências que possuem similaridade de sequências. A expressão “similaridade de sequências”, em todas as suas formas gramaticais, designa o grau de identidade ou correspondência entre sequências de ácidos nucleicos ou aminoácidos. No contexto da presente invenção, duas sequências de aminoácidos são “homólogas” quando pelo menos cerca de 80%, alternativamente pelo menos cerca de 81%, alternativamente pelo menos cerca de 82%, alternativamente pelo menos cerca de 83%, alternativamente pelo menos cerca de 84%, alternativamente pelo menos cerca de 85%, alternativamente pelo menos cerca de 86%, alternativamente pelo menos cerca de 87%, alternativamente pelo menos cerca de 88%, alternativamente pelo menos cerca de 89%, alternativamente pelo menos cerca de 90%, alternativamente pelo menos cerca de 91%, alternativamente pelo menos cerca de 92%, alternativamente pelo menos cerca de 93%, alternativamente pelo menos cerca de 94%, alternativamente pelo menos cerca de 95%, alternativamente pelo menos cerca de 96%, alternativamente pelo menos cerca de 97%, alternativamente pelo menos cerca de 98% ou alternativamente pelo menos cerca de 99% dos aminoácidos são similares. Preferencialmente, as sequências de polipeptídeos homólogas ou similares são identificadas utilizando o algoritmo de Needleman e Wunsch.
[059] Preferencialmente, a sequência homóloga à enzima AGT compartilha identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos 64%, preferencialmente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 65%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 66%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 67%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 68%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 69%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 70%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 71%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 72%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 73%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 74%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 75%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 76%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 77%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 78%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 79%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 80%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 81%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 82%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 83%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 84%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 85%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 86%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 87%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 88%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 89%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 90%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 91%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 92%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 93%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 94%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 95%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 96%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 97%, alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 98% e alternativamente identidade de sequências de aminoácidos de pelo menos cerca de 99% com SEQ ID N° 1. Em uma realização preferida, uma sequência homóloga de SEQ ID N° 1 é pelo menos 64%, preferencialmente 70% e, de maior preferência, 80% idêntica a SEQ ID N° 1.
[060] Em uma realização preferida, o mencionado polipeptídeo homólogo é um fragmento ou mutante do polipeptídeo hAGT de SEQ ID N° 1, em que o mencionado fragmento ou mutante possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina.
[061] Os mencionados fragmentos podem ter tamanho de pelo menos 50, preferencialmente 100 e, de maior preferência, 150 aminoácidos e contêm pelo menos o “domínio catalítico” do polipeptídeo AGT conforme definido acima, que é responsável pela atividade de alquiltransferase de DNA de O6- alquilguanina da enzima AGT. Estes fragmentos podem ser obtidos utilizando métodos comuns que são conhecidos pelos técnicos no assunto.
[062] Foram descritas até aqui enzimas mutantes diferentes derivadas de AGT nativo (Lim, A. et al, 1996; Daniels, D. S. et al, 2000; Juillerat, A. et al, 2003, WO 2005/085470 e WO 2004/031405). Particularmente, foi obtida uma proteína mutante de 20 kDa que contém as mutações Cys62Ala, Lys125Ala, Ala127Thr, Arg128Ala, Gly131Lys, Gly132Thr, Met134Leu, Arg135Ser, Cys150Ser, Asn157Gly e Ser159Glu truncadas no aminoácido 182 (o chamado mutante “AGT26” em WO 2005/085470, também denominado “SNAP 26” em WO 2006/114409). Demonstrou-se que esse mutante específico “SNAP26” possui atividade de marcação aprimorada.
[063] No contexto da presente invenção, a sequência de um polipeptídeo AGT de maior preferência contém as mutações descritas em WO 2005/085470, cujas posições podem ser facilmente transpostas em vista de SEQ ID N° 1, em que o resíduo de metionina inicial e SNAP26 corresponde ao resíduo de metionina na posição 32 de SEQ ID N° 1 (31 aminoácidos deverão, portanto, ser adicionados às posições descritas em WO 2005/085470, de forma a obter os correspondentes em SEQ ID N° 1).
[064] Em uma realização preferida, a sequência homóloga de AGT útil na presente invenção corresponde à sequência AGT nativa de SEQ ID N° 1, na qual de 1 a 30, preferencialmente de 6 a 25 e, particularmente, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 ou 23 aminoácidos são substituídos por outros aminoácidos e/ou 1 a 40, preferencialmente 1 a 20, particularmente 10 a 20 aminoácidos, de maior preferência 15 aminoácidos no terminal C são excluídos.
[065] Em uma realização de maior preferência, a sequência homóloga de AGT contém as mutações a seguir em comparação com SEQ ID N° 1: a. Lys31 substituído por Arg, Met32 substituído por Ser, Cys93 substituído por Ala, Lys156 substituído por Ala, Ala158 substituído por Thr, Arg159 substituído por Ala, Gly162 substituído por Lys, Gly163 substituído por Thr, Met165 substituído por Leu, Arg166 substituído por Ser, Cys181 substituído por Ser, Asn188 substituído por Gly, Ser190 substituído por Glu, Gly214 substituído por Pro, Ser215 substituído por Ala, Ser216 substituído por Gly, Gly217 substituído por Ile, Leu218 substituído por Gly, Gly220 substituído por Pro, Ala221 substituído por Gly ou Trp222 substituído por Ser; ou b. Lys31-Met32 substituído por Arg-Ser, Ala158-Arg159 substituído por Thr-Ala, Gly162-Gly163 substituído por Lys-Thr, Met165-Arg166 substituído por Leu-Ser, Gly162-Gly163/Met165-Arg166 substituído por Lys- Thr/Leu-Ser, Asn188/Ser190 substituído por Gly/Glu, Gly214-Ser215-Ser216- Gly217-Leu218 substituído por Pro-Ala-Gly-Ile-Gly ou Gly220-Ala221-Trp222 substituído por Pro-Gly-Ser, preferencialmente em combinação com quaisquer outras substituições de aminoácidos mencionadas em (a); ou c. truncagem após Leu223 (os aminoácidos 224-238 são excluídos), preferencialmente em combinação com qualquer outra substituição de aminoácido mencionada em (a) ou (b).
[066] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas que são truncadas após Leu223.
[067] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas nas quais duas das modificações (B) estão presentes e, opcionalmente, truncagem após Leu223.
[068] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas nas quais duas das modificações (b) estão presentes e, opcionalmente, truncagem após Leu223.
[069] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas nas quais quatro das modificações (b) estão presentes e, opcionalmente, truncagem após Leu223.
[070] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas nas quais cinco das modificações (b) estão presentes e, opcionalmente, truncagem após Leu223.
[071] Sequências homólogas de AGT preferidas são aquelas nas quais seis das modificações (b) estão presentes e, opcionalmente, truncagem após Leu223.
[072] Outras sequências homólogas de AGT preferidas são as que contêm uma combinação de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 19 ou 20 mutações selecionadas a partir das modificações descritas em (a) e, opcionalmente, truncadas após Leu 223.
[073] Em uma realização de preferência muito maior, o polipeptídeo AGT de acordo com a presente invenção é o mutante SNAP de SEQ ID N° 2, que é homólogo à enzima hAGT e contém as mutações Lys31Arg, Met32Ser, Cys93Ala, Lys156Ala, Ala158Thr, Arg159Ala, Gly162Lys, Gly163Thr, Met165Leu, Arg166Ser, Cys181Ser, Asn188Gly, Ser190Glu, Gly214Pro, Ser215Ala, Ser216Gly, Gly217Ile, Leu218Gly, Gly220Pro, Ala221Gly, Trp222Ser e truncagem após Leu223 em comparação com SEQ ID N° 1. O mutante SNAP de SEQ ID N° 2 compartilha 77% de homologia com a sequência de aminoácidos da metiltransferase de DNA 6-metilguanina humana (NP_002403.2, SEQ ID N° 1) e 70% de homologia com a sequência de aminoácidos da metiltransferase de DNA 6-metilguanina de camundongo (NP_032624.1, SEQ ID N° 18).
[074] Em uma realização de preferência ainda maior, a enzima AGT é a proteína mutante de SNAP de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos, que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina. Preferencialmente, a mencionada sequência homóloga à proteína mutante SNAP é pelo menos idêntica em mais de 80%, preferencialmente 81%, de maior preferência 82%, de maior preferência 83%, de maior preferência 84%, de maior preferência 85%, de maior preferência 86%, de maior preferência 87%, de maior preferência 88%, de maior preferência 89%, de maior preferência 90%, de maior preferência 91%, de maior preferência 92%, de maior preferência 93%, de maior preferência 94%, de maior preferência 95%, de maior preferência 96% e, de preferência ainda maior, 97% à proteína mutante SNAP da sequência SEQ ID N° 2 e possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina conforme definido acima.
[075] Os mencionados polipeptídeos homólogos que possuem atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina podem ser produzidos utilizando métodos de elaboração de proteínas conhecidos dos técnicos no assunto e/ou utilizando evolução molecular para gerar e selecionar novas alquiltransferases de DNA O6 alquilguanina. Esses métodos são, por exemplo, mutagênese dirigida, métodos de exibição de fagos, mutagênese de saturação, PCR propensa a erros para introduzir variações em qualquer ponto da sequência, comutação de DNA utilizada após mutagênese de saturação e/ou PCR propensa a erros ou comutação de famílias utilizando genes de diversas espécies.
[076] Na realização de preferência superior, o polipeptídeo AGT utilizado no método de acordo com a presente invenção é o mutante SNAP de SEQ ID N° 2.
[077] A enzima AGT transfere irreversivelmente o grupo alquila do seu substrato, DNA de O6-alquilguanina, para um dos seus resíduos de cisteína. Substituições de O6-benzilguanina no C4 do anel benzila não afetam significativamente a reatividade de AGT contra derivados de O6-benzilguanina. Esta propriedade foi utilizada para transferir uma marca ligada ao C4 do anel benzila para AGT (vide WO 2004/031404 e WO 2005/085470).
[078] Demonstrou-se que diversos derivados de O6-benzilguanina reagem com a mencionada enzima AGT por meio de transferência do seu grupo benzila para a cisteína de local ativo da enzima AGT (cf. Damoiseaux et al, ChemBiochem., 2001, WO 2004/031404 e WO 2005/085470).
[079] Em uma realização preferida, os substratos AGT utilizados no método de acordo com a presente invenção são derivados de O6 benzil guanina que possuem a fórmula I: R1-X-CH2-R3-R4-Y em que: - R1 é um grupo reconhecido pelo mencionado polipeptídeo AGT como substrato, tal como um grupo heteroaromático que contém de um a cinco átomos de nitrogênio e, preferencialmente, um radical purina da fórmula:
Figure img0001
em que R5 é hidrogênio, halogênio, tal como cloro ou bromo, trifluorometila ou hidróxi; R6 é hidrogênio, hidróxi ou amino substituído ou não substituído; e R2 é hidrogênio, alquila com um a dez átomos de carbono ou uma porção de sacarídeo; - X é um átomo e oxigênio ou enxofre; preferencialmente, um átomo de oxigênio; - R3 é um grupo aromático ou heteroaromático, ou um grupo alquila, cicloalquila ou heterociclila insaturado e opcionalmente substituído com a ligação dupla conectada a CH2; preferencialmente, fenila, tal como fenila substituído por R4 na posição para ou meta; - R4 é uma porção ligante; e - Y é um grupo reativo, preferencialmente um grupo amino.
[080] Em uma realização preferida, a mencionada porção ligante R4 é um ligante flexível. As unidades ligantes são selecionadas no contexto da aplicação idealizada, ou seja, na transferência do substrato para uma proteína de fusão que compreende AGT. O ligante não interfere com a reação com AGT nem com o anticorpo alvo.
[081] Ele pode ser, por exemplo, um grupo alquileno com cadeia linear ou ramificada com um a vinte átomos de carbono, preferencialmente cinco a quinze átomos de carbono, em que: a. um ou mais átomos de carbono são substituídos por oxigênio, particularmente em que cada terceiro átomo de carbono é substituído por oxigênio, tal como um grupo polietileno-óxi com uma a cinco unidades etileno-óxi; b. um ou mais átomos de carbono são substituídos por nitrogênio que conduz um átomo de hidrogênio e os átomos de carbono adjacentes são substituídos por oxo, que representa uma função amida -NH-CO- ; c. um ou mais átomos de carbono são substituídos por oxigênio e os átomos de carbono adjacentes são substituídos por oxo, que representa uma função éster -O-CO-; d. a ligação entre dois átomos de carbono adjacentes é uma ligação dupla ou tripla, que representa uma função -CH=CH- ou -C=C-; e. um ou mais átomos de carbono são substituídos por um fenileno, cicloalquileno saturado ou insaturado, bicicloalquileno saturado ou insaturado, heteroaromático de ligação ou um grupo heterociclila saturado ou insaturado de ligação; f. dois átomos de carbono adjacentes são substituídos por uma ligação de dissulfeto -S-S-; ou uma combinação de dois ou mais, especialmente dois ou três grupos alquileno e/ou alquileno modificado conforme definido em (a) a (f) acima, que contêm opcionalmente substituintes.
[082] Os substituintes considerados são, por exemplo, alquila inferior, tal como metila, alcóxi inferior, como metóxi, acilóxi inferior, tal como acetóxi, ou halogenila, tal como cloro.
[083] Em uma realização preferida, R4 é um grupo polietileno-óxi com uma a oito unidades etileno-óxi, que compreende adicionalmente um a quatro átomos de nitrogênio que conduzem um átomo de hidrogênio, cujos átomos de carbono adjacentes são substituídos por oxo, que representa uma função amida -NH-CO-.
[084] Em uma realização de maior preferência, R4 é -CH2-NH-CO- NH-[C2H4-O]n-, em que n está compreendido entre 1 e 8, preferencialmente de 2 a 6 e, de preferência superior, é 3.
[085] Em uma realização preferida, o mencionado grupo reativo é um grupo funcional que facilita a fixação e ligação do substrato sobre o suporte sólido. Esses grupos funcionais são bem conhecidos na técnica. Eles incluem amina, ésteres ativados, acrilamidas, acil azidas, haletos de acila, acil nitrilas, aldeídos, cetonas, haletos de alquila, anidridos, haletos de arila, aziridinas, boronatos, ácidos carboxílicos ativados, carbodi-imidas, diazoalcanos, epóxidos, haloacetamidas, haloplatinato, halotriazinas, imido ésteres, isocianatos, isotiocianatos, maleimidas, fosforamiditas, haletos de solila, ésteres de sufonato e haletos de sulfonila. É preferencialmente o grupo amina -NH2.
[086] Por outro lado, o suporte sólido deverá ser funcionalizado por grupos complementares correspondentes a esses grupos reativos. Os grupos complementares correspondentes a cada um desses grupos reativos são bem conhecidos na técnica. Eles são fornecidos, por exemplo, na Tabela I de WO 2010/107433.
[087] Em uma realização preferida, o substrato AGT utilizado no método de acordo com a presente invenção é:
Figure img0002
[088] Em outra realização preferida, o substrato AGT utilizado no método de acordo com a presente invenção é o ligante fluorescente denominado “célula SNAP® 505”, que possui a fórmula a seguir:
Figure img0003
[089] O derivado de benzilguanina possui um grupo benzil purina (guanina) para interação específica com o domínio SNAP, bem como um grupo amina livre para acoplamento covalente à superfície de microesfera. Ele é comercializado pela New England BioLaps e foi acoplado com sucesso à superfície das micropartículas de acordo com a presente invenção.
[090] Os substratos de acordo com a presente invenção são geralmente preparados por meio de métodos padrão conhecidos na técnica. Métodos específicos são explicados, por exemplo, no Pedido de Patente WO 2005/085470.
[091] Os métodos de acordo com a presente invenção necessitam que os substratos AGT sejam acoplados covalentemente aos suportes sólidos. No contexto da presente invenção, um substrato AGT é “acoplado covalentemente” a um suporte sólido caso seja ligado permanentemente ao mencionado suporte sólido e não sofra dessorção nem percolação ao longo do tempo. Segundo a presente invenção, um substrato AGT é permanentemente ligado ao mencionado suporte sólido caso permaneça ligado por um longo período de armazenagem, tal como, tipicamente, pelo menos seis meses de armazenagem. Foram descritos até aqui diversos procedimentos de acoplamento. Qualquer um desses procedimentos de acoplamento pode ser utilizado no imunoteste de acordo com a presente invenção, desde que o substrato AGT fique permanentemente ligado ao suporte sólido.
[092] No imunoteste de acordo com a presente invenção, o acoplamento covalente é preferencialmente realizado por meio de contato dos substratos AGT (que contêm um grupo reativo Y, conforme mencionado acima) com suportes sólidos que foram anteriormente funcionalizados com um grupo complementar tal como os descritos na Tabela I de WO 2010/107433, cujo relatório descritivo é incorporado ao presente como referência.
[093] Desta forma, em uma realização preferida, os métodos de acordo com a presente invenção utilizam suportes que tenham sido funcionalizados com um grupo que é complementar ao grupo reativo do substrato AGT, antes do contato com o substrato AGT.
[094] Um procedimento preferido e convencional de acoplamento covalente de um substrato AGT à superfície de suportes sólidos é baseado na reação de carbodi-imida e utiliza carbodi-imida hidrossolúvel. Segundo este procedimento, suportes sólidos possuem grupos carboxila de superfície disponíveis para ligação do substrato AGT que contém sulfidrila ou amina reativo. Assim, nesta realização preferida, os métodos de acordo com a presente invenção utilizam suportes sólidos que tenham sido funcionalizados com grupos carboxila de superfície antes do contato com o substrato AGT.
[095] Neste caso, a primeira etapa do método de acordo com a presente invenção é a ativação dos grupos carboxila que revestem os suportes sólidos. Esta ativação normalmente é realizada por meio da adição de um chamado “tampão de ativação”, tal como uma solução de 50 mg/ml de EDAC ou uma solução de 50 mg/ml de S-NHS. Estas soluções são disponíveis comercialmente. A ativação dos suportes sólidos é tipicamente realizada por meio de incubação dos mencionados suportes com o tampão de ativação à temperatura ambiente por alguns minutos (tal como cinco minutos a trinta minutos) de acordo com as instruções do fabricante.
[096] De forma importante, é necessário realizar acoplamento covalente do substrato AGT ao suporte sólido sob condições específicas, de forma a preservar a solubilidade do substrato AGT e a integridade da esfera (fluorocromo interno). Os inventores observaram que os substratos AGT deverão ser suspensos em um tampão de “acoplamento covalente” que contém de 0 a 20% de sulfóxido de dimetila (DMSO). Particularmente, os inventores observaram que concentrações de DMSO acima de 20% podem afetar a etapa de detecção dos métodos de acordo com a presente invenção. Preferencialmente, o mencionado tampão é um tampão PBS que contém de 0 a 20% de DMSO e, de maior preferência, de 10% a 20% de DMSO.
[097] Convenientemente, os locais não específicos sobre os suportes sólidos que não foram ligados covalentemente ao substrato AGT podem ser adicionalmente bloqueados por quaisquer meios convencionais, por exemplo, utilizando um tampão de bloqueio que contém 1% de albumina de soro bovino (BSA) ou qualquer proteína saturante (tal como caseína).
[098] Após o acoplamento covalente dos suportes sólidos de acordo com a presente invenção com o substrato AGT (preferencialmente por meio de uma ligação covalente de carbodi-imida), o suportes sólidos são colocados em contato em seguida pelas proteínas de fusão de acordo com a presente invenção, de forma a acoplar os epítopos que são especificamente reconhecidos pelos anticorpos alvo aos mencionados suportes.
[099] Novamente, esta etapa de acoplamento necessita ser realizada sob condições específicas. Na verdade, o local catalítico da enzima AGT e a estrutura de conformação dos antígenos/epítopos que são conduzidos pelas proteínas de fusão necessitam ser conservados durante os procedimentos de acoplamento. Os inventores identificaram que a proteína de fusão deverá ser suspensa em um tampão que contém ditiotreitol (DTT), preferencialmente um tampão de PBS/DTT, para que o acoplamento seja eficiente. Convenientemente, o mencionado tampão de acoplamento contém Tween 20; de fato, os inventores do presente observaram que a adição de Tween 20 ao meio de acoplamento ajuda a evitar a agregação das esferas. Preferencialmente, o tampão de acoplamento contém 0,02% de Tween 20. De maior preferência, o tampão de acoplamento covalente de acordo com a presente invenção é um tampão de PBS com pH 7,4, que contém 0,02% de Tween 20 e 1 mM de DTT.
[0100] Outras condições de acoplamento são as habituais. Preferencialmente, o acoplamento covalente do substrato AGT e o acoplamento da proteína de fusão aos suportes sólidos são realizados à temperatura ambiente. Caso os suportes sólidos possuam marcas fluorescentes, os mencionados procedimentos são, de maior preferência, realizados no escuro.
[0101] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se, portanto, a um método de acoplamento covalente de um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina ou um suporte sólido funcionalizado que compreende as etapas a seguir: g. ativação do mencionado suporte sólido funcionalizado; h. adição de um substrato do mencionado polipeptídeo AGT, em que o mencionado substrato é suspenso em um tampão que contém de 0 a 20% de DMSO, em condições apropriadas, de tal forma que o suporte seja ligado covalentemente ao mencionado suporte; e i. contato do mencionado polipeptídeo AGT com o suporte revestido por substrato da etapa (b) em um tampão de PBS/DTT; em que moléculas não ligadas são lavadas após as etapas (b) e (c).
[0102] As lavagens podem ser realizadas utilizando qualquer tipo de tampões de lavagem apropriados. Esses tampões são utilizados rotineiramente pelos técnicos no assunto e não necessitam ser adicionalmente detalhados no presente. Preferencialmente, é utilizado um tampão de PBS.
[0103] Da forma utilizada no presente, “condições apropriadas” são as habituais. Preferencialmente, o acoplamento covalente do substrato AGT é realizado à temperatura ambiente e, se os suportes sólidos possuírem marcas fluorescentes, no escuro.
[0104] A funcionalização do suporte sólido pode ser realizada por qualquer meio convencional (como os relembrados acima). A ativação do mencionado suporte sólido funcionalizado é consequentemente realizada. Em uma realização preferida, os mencionados suportes sólidos são funcionalizados com grupos carboxila de superfície e adicionalmente ativados com um tampão de ativação clássico, tal como uma solução de 50 mg/ml de EDAC ou uma solução de 50 mg/ml de S-NHS.
[0105] Em uma realização preferida, DTT encontra-se em concentração de 1 mM no tampão PBS/DTT.
[0106] A presente invenção também se refere a um suporte sólido que tenha sido obtido por meio do mencionado método e ao uso do mencionado suporte sólido no imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0107] Os mencionados suportes sólidos podem ser armazenados em seguida em tampões de armazenagem convencionais, contendo, por exemplo, 0,5 g/l de azida de sódio, 0,1% de BSA, 0,02% de Tween 20 e/ou 1 mM de DTT.
[0108] Todas essas etapas de acoplamento são preferencialmente realizadas in vitro, em tampões que são isentos de células vivas, de forma que não há necessidade de levar em consideração a reação com enzimas AGT endógenas e a reação da proteína de fusão AGT (exógena) é, portanto, altamente específica.
[0109] Os suportes sólidos que podem ser utilizados nos métodos de acordo com a presente invenção podem ser de qualquer tipo, tais como tubos de ensaio, cavidades de microtítulos, folhas, esferas, chips e/ou micropartículas, desde que possam ser especificamente identificados entre si. Essa identificação é possível, por exemplo, quando eles estão localizados separadamente no espaço (por exemplo, as cavidades em uma placa de microtítulos ou locais diferentes sobre um chip) ou quando estão marcados de forma diferente. “Suporte sólido”, portanto, deve ser compreendido em significado amplo, ou seja, designando partes pequenas discretas de um suporte sólido inteiro (no caso de uma placa ou biochip) ou uma grande quantidade de micropartículas idênticas que compartilham características detectáveis comuns (denominada a seguir “subconjunto” de micropartículas).
[0110] Em uma realização preferida, os suportes sólidos utilizados na presente invenção podem ser identificados especificamente pelo seu local, tamanho, diâmetro, peso, granulometria e/ou marcação específica. Essa marcação é, por exemplo, um fluorocromo, fluoroforo, cromóforo, radioisótopo, marca de massa ou qualquer tipo de marca detectável que seja conhecida na técnica.
[0111] Os suportes sólidos utilizados na presente invenção podem ser elaborados com qualquer material, por exemplo de poliestireno, celulose, nitrocelulose, vidro, cerâmica, resina, borracha, plástico, sílica, silicone, metal e/ou polímero. Materiais poliméricos incluem poliestireno bromatado, ácido poliacrílico, poliacrilonitrila, poliamida, poliacrilamida, poliacroleína, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato, poliéster, polietileno, tereftalato de polietileno, polidimetilsiloxano, póli-isopreno, poliuretano, acetato de polivinila, cloreto de polivinila, polivinilpiridina, cloreto de polivinilbenzila, poliviniltolueno, cloreto de polivinilideno, polidivinilbenzeno, metacrilato de polimetila, polilactida, poliglicolida, póli(lactida-coglicolida), polianidrido, poliortoéster, polifosfazeno, polifosofazo, polissulfona ou uma de suas combinações, que também são aceitáveis. A maior parte desses suportes é disponível comercialmente. Esferas de polímeros sintéticos tais como poliestireno, poliacrilamida, poliacrilato ou látex, por exemplo, são disponíveis comercialmente de diversas fontes, tais como Bio-Rad Laboratories (Richmond, Califórnia) e LKB Produkter (Estocolmo, Suécia). Esferas formadas a partir de partículas e macromoléculas naturais tais como agarose, agarose reticulada, globulina, ácido desoxirribosenucleico e lipossomos são disponíveis comercialmente por meio de fontes tais como a Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, NJ) e IBF (França). Esferas formadas com copolímeros de poliacrilamida e agarose são disponíveis comercialmente por meio de fontes tais como IBF e Pharmacia.
[0112] Ao utilizar-se suportes poliméricos, podem ser adicionados grupos carboxila à superfície do suporte sólido por meio da incorporação de monômeros que contenham esses grupos nos polímeros (tais como ácido acrílico, ácido metacrílico, ácido itacônico e similares). Alternativamente, eles podem ser adicionados ao suporte por meio de reação química adicional de um polímero que possui outros grupos reativos precursores que podem ser convertidos em grupos carboxila (por exemplo, por meio de hidrólise de anidridos, tais como anidrido maleico, ou por meio de oxidação de grupos terminais aldeído ou metilol de superfície), como já descrito.
[0113] Em uma realização preferida, os suportes sólidos utilizados na presente invenção são micropartículas. As mencionadas micropartículas possuem preferencialmente diâmetro de menos de um milímetro, preferencialmente diâmetro que varia de cerca de 0,1 a cerca de 1000 micrômetros (μm). Muito embora as micropartículas possam ser de qualquer tamanho, o tamanho preferido é de 1 a 100 μm, de maior preferência de 2 a 50 μm, de maior preferência de 3 a 25 μm e, de preferência ainda maior, cerca de 6 a 12 μm. Micropartículas são elaboradas com qualquer material com formato regular. A forma preferida é esférica; podem, entretanto, ser empregadas partículas com qualquer outro formato, pois esse parâmetro é indiferente para a natureza da presente invenção. O formato da partícula pode servir de parâmetro de distinção adicional, que é discriminado por meio de citometria de fluxo, por exemplo, por meio de um método de varredura de fendas de alta resolução.
[0114] Da forma utilizada a seguir, os termos “micropartículas” ou “microesferas” são utilizados de forma intercambiável e possuem significados equivalentes por referirem-se a partículas pequenas com diâmetro geral que cai essencialmente na faixa dos micrômetros. Os termos “nanoesferas” ou “nanopartículas” designam partículas menores com tamanho geral que cai essencialmente na faixa dos nanômetros. Da forma utilizada a seguir, o termo geral partículas ou “esferas” designa micropartículas e nanopartículas, que podem servir efetivamente de suportes sólidos nos métodos de acordo com a presente invenção.
[0115] No contexto da presente invenção, um “subconjunto” de micropartículas corresponde a diversas micropartículas idênticas que possuem as mesmas características e foram revestidas com o mesmo epítopo. De forma importante, cada subconjunto de micropartículas deverá ser diferenciável de outros subconjuntos da população por pelo menos uma característica (tal como local, tamanho, diâmetro, peso, granulometria e/ou marcação.
[0116] Em uma realização preferida, os diferentes subconjuntos de micropartículas podem ser diferenciados por possuírem marcas diferentes (por exemplo, com um fluorocromo, fluoroforo, cromóforo, radiosiótopo, marca de massa ou qualquer tipo de marca detectável que seja conhecido na técnica).
[0117] Em uma realização de maior preferência, os diferentes subconjuntos de micropartículas podem ser diferenciados por possuírem marcas fluorescentes diferentes, conforme proposto em US 5.736.330, US 5.981.180, US 6.057.107, US 6.268.222, US 6.449.562, US 6.514.295, US 6.254.793 e US 6.528.165. Mais precisamente, esses subconjuntos diferentes podem ser tingidos com diferentes tinturas fluorescentes e/ou concentrações diferentes de uma ou mais tinturas fluorescentes. Desta forma, os diferentes subconjuntos podem possuir diferentes assinaturas fluorescentes (tais como diferente(s) comprimento(s) de onda fluorescente(s), diferentes intensidades fluorescentes etc.) que podem ser medidas e utilizadas por um sistema de medição para determinar o subconjunto ao qual pertencem as micropartículas individuais (ou seja, para classificar as micropartículas de acordo com o subconjunto).
[0118] Em uma realização preferida, as micropartículas utilizadas na presente invenção são marcadas internamente com tinturas fluorescentes, conforme proposto em EP 1.204.869.
[0119] Essas micropartículas podem também incorporar ímãs ou óxidos metálicos magneticamente reagentes selecionados a partir do grupo que consiste de óxido metálico superparamagnético, paramagnético e ferromagnétco. Esferas magnéticas são, por exemplo, disponíveis comercialmente a partir de fontes tais como Dynal Inc. (Great Neck, NY) ou podem ser preparadas utilizando métodos conhecidos na técnica, conforme descrito, por exemplo, em US 4.358.388, US 4.654.267, US 4.774.265, US 5.320.944 e US 5.356.713. Em uma realização preferida, os suportes sólidos utilizados na presente invenção são, portanto, magnéticos.
[0120] Em uma realização de maior preferência, os suportes sólidos utilizados na presente invenção são micropartículas marcadas internamente com tinturas fluorescentes com magnetita encapsulada em um revestimento externo de polímero funcional que contém grupos carboxila de superfície para acoplamento covalente de ligantes, tais como os comercializados pela Luminex Corp. com o nome comercialMagPlex.
[0121] Também é possível utilizar micresferas MicroPlex (vendidas pela Luminex) que são micropartículas de poliestireno carboxilado que foram codificadas por cores em regiões distintas no espectro. Estas regiões podem ser facilmente diferenciadas por um instrumento xMAP que permite a interrogação de até cem analisados diferentes simultaneamente a partir de um único volume de amostra.
[0122] Também é possível utilizar microesferas SeroMAP (vendidas pela Luminex) que são uma formulação especial de microesferas MicroPlex que foram otimizadas para reduzir a ligação não específica em testes de sorologia.
[0123] A última etapa do método de acordo com a presente invenção consiste na detecção da presença dos anticorpos que são ligados aos epítopos e, portanto, ao suporte sólido detectável. Analisando-se a qual subconjunto de micropartículas são ligados os anticorpos, pode-se facilmente deduzir quais anticorpos estavam presentes na amostra biológica e, portanto, por qual patógeno o paciente examinado foi infectado.
[0124] Qualquer tecnologia conhecida pode ser utilizada para detectar a presença dos anticorpos que são ligados aos suportes sólidos. Anticorpos secundários marcados que reconhecem especificamente a parte constante das imunoglobulinas em questão, por exemplo, podem ser utilizados, conforme exibido na parte experimental abaixo. É importante observar que a marcação dos anticorpos detectores deverá ser diferente do suporte sólido, de forma a diferenciar entre os suportes sólidos que são acoplados a anticorpos e os que não são.
[0125] Alternativamente, imunoglobulinas presentes em soro de animais ou seres humanos infectados podem ser conjugadas diretamente a R- ficoeritrina (R-PE), utilizando um protocolo de marcação de anticorpos em uma etapa (Kit de Conjugação de Ficoeritrina Lightning-Link® - Innova Biosciences). O tempo de preparo para todo o procedimento é normalmente de 20 a 30 segundos e permite a marcação de pequenas quantidades de imunoglobulinas com 100% de recuperação. Este procedimento elimina a necessidade de reagentes secundários, tais como anticorpos antiespécies conjugados e estreptavidina-R-ficoeritrina, em experimentos de imunotestes multiplex.
[0126] Ao utilizar-se micropartículas marcadas internamente com tinturas fluorescentes, o instrumento de detecção fluorescente deverá ser equipado com um primeiro laser para detectar o tipo de microesfera e um segundo laser para garantir a quantificação de IgM ou IgG capturado por meio de excitação do fluoroforo que é conjugado ao anticorpo de detecção específico.
[0127] Com as suas extensas capacidades multiplex e limite de detecção mais baixo, esta abordagem oferece economias substanciais de custo e amostras sobre as medições de ELISA tradicionais. Além disso, os conjuntos selecionados de microesferas são adaptáveis a um sistema de detecção fluorescente barato, compacto e robusto tal como o MagPix (Luminex Corporation).
[0128] Nesta realização, o método de acordo com a presente invenção possibilita a análise simultânea de até cem tipos de microesferas acopladas por cavidade utilizando uma ferramenta de análise de fluxo e gera sensibilidade grandemente aumentada, que é esperada na ordem de várias ordens de magnitude maior que a dos sistemas e métodos utilizados atualmente.
[0129] De forma interessante, o método de acordo com a presente invenção permite seleção sorológica de alto rendimento para diagnosticar infecções multiplex em indivíduos, sejam eles humanos ou animais.
[0130] Em um terceiro aspecto, a presente invenção fornece um kit que é apropriado para uso na detecção de anticorpos segundo o método de acordo com a presente invenção.
[0131] Este kit compreende pelo menos dois suportes sólidos conforme definido acima, mais precisamente: - um primeiro suporte sólido conforme obtido na etapa (c) do método de acordo com a presente invenção, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo; e - um segundo suporte sólido conforme obtido na etapa (f) do método de acordo com a presente invenção, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um segundo epítopo que é reconhecido por um segundo anticorpo alvo e não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; em que os pelo menos dois suportes sólidos podem ser especificamente indicados entre si e permitem a detecção de dois anticorpos alvo diferentes.
[0132] Em outras palavras, a presente invenção refere-se a um kit de detecção de pelo menos dois anticorpos alvo em uma amostra biológica que compreende: a. um primeiro suporte sólido que compreende um substrato AGT acoplado covalentemente a uma primeira proteína de fusão que compreende um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina e um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo; e b. um segundo suporte sólido que compreende um substrato AGT acoplado covalentemente a uma segunda proteína de fusão que compreende um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA de O6-alquilguanina e um segundo epítopo que é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo.
[0133] Em uma realização preferida, o mencionado primeiro e/ou segundo epítopo está presente sobre uma proteína viral selecionada a partir do grupo que consiste de: proteína EDIII do vírus da dengue 1 de SEQ ID N° 3, proteína EDIII do vírus da dengue 2 de SEQ ID N° 4, proteína EDIII do vírus da dengue 3 de SEQ ID N° 5, proteína EDIII do vírus da dengue 4 de SEQ ID N° 6, proteína EDIII do vírus do oeste do Nilo de SEQ ID N° 7, proteína EDIII do vírus da febre amarela de SEQ ID N° 8, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de SEQ ID N° 9, proteína EDIII do vírus Zika de SEQ ID N° 10, proteína EDIII do vírus Wesselbron de SEQ ID N° 11, proteína EDIII do vírus Rocio de SEQ ID N° 12, proteína EDIII do vírus da encefalite de Murray de SEQ ID N° 13, proteína EDIII do vírus da encefalite de Saint-Louis de SEQ ID N° 14, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 1 codificada por SEQ ID N° 54, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 2 codificada por SEQ ID N° 55, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 4 codificada por SEQ ID N° 56, proteína EDIII do vírus da encefalite japonesa de genótipo 5 codificada por SEQ ID N° 57, proteína EDIII do vírus Rabensburg codificada por SEQ ID N° 58 e proteína viral de HIV1, HIV2, do vírus da hepatite B, do vírus da hepatite C, do vírus da hepatite E, do vírus do oeste do Nilo e de linhagens de HPV oncogênicas tais como HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.
[0134] Preferencialmente, este kit também contém o meio de detecção dos pelo menos dois anticorpos alvo que são ligados aos suportes sólidos. Os mencionados meios são, de maior preferência, anticorpos secundários que reconhecem a parte constante dos anticorpos alvo. Os mencionados anticorpos secundários podem ser marcados, desde que a marcação não seja idêntica àquelas presentes sobre o suporte sólido. É possível, entretanto, utilizar a mesma marcação para todos os anticorpos secundários que são utilizados para detectar os anticorpos ligados a suporte(s) sólido(s), pois as informações referentes ao(s) patógeno(s) infeccioso(s) somente são fornecidas pela identificação do suporte sólido que é ligado aos anticorpos.
[0135] O kit de acordo com a presente invenção pode conter outros ingredientes que são aceitos como reagentes padrão, tais como tampão de lavagem, plásticos necessários e similares.
[0136] Em uma realização preferida, o kit de acordo com a presente invenção compreende pelo menos 10, preferencialmente pelo menos 50 e, de maior preferência, pelo menos 100 suportes sólidos acoplados de forma diferente, em que os mencionados suportes sólidos são, por exemplo, subconjuntos de micropartículas conforme definido acima.
[0137] Em uma realização de maior preferência, os mencionados suportes sólidos são microesferas, tais como aquelas que são marcadas internamente com uma tintura fluorescente com magnetita encapsulada em um revestimento externo de polímero funcional que contém grupos carboxila de superfície.
[0138] Em outra realização preferida, no kit de acordo com a presente invenção, os mencionados suportes sólidos são misturados entre si em pelo menos um único compartimento.
[0139] Convenientemente, o kit de acordo com a presente invenção compreende suporte(s) convencional(is), tal(is) como placas de microtítulos, que contêm os diferentes subconjuntos de micropartículas revestidos com antígeno definidos acima. Em uma realização específica, os mencionados subconjuntos de micropartículas são misturados entre si em pelo menos um único compartimento (tal como uma cavidade ou tubo). Esse dispositivo é descrito na Figura 11.
[0140] O kit de acordo com a presente invenção pode também conter recipientes (tais como tubos) que contêm os mencionados subconjuntos de micropartículas revestidas com antígenos.
[0141] A presente invenção também se refere ao uso do kit de acordo com a presente invenção para detectar pelo menos dois, de maior preferência pelo menos dez, preferencialmente pelo menos cinquenta e, de preferência ainda maior, pelo menos cem anticorpos alvo em uma amostra biológica de um paciente.
[0142] Em uma realização preferida, o kit de acordo com a presente invenção é utilizado para detectar pelo menos dois, preferencialmente pelo menos dez e, de maior preferência, pelo menos vinte anticorpos alvo que são gerados mediante infecção por vírus endêmicos ou parasitas da mesma região geográfica. O kit de acordo com a presente invenção poderá conter, por exemplo, micropartículas que são revestidas com antígenos de vírus ou parasitas que são específicos de regiões africanas, tais como o vírus da dengue tipo 1, tipo 2, tipo 3, tipo 4, o vírus da febre amarela, o vírus do oeste do Nilo, o vírus Usutu, o vírus Zika, o vírus Wesselsbron, o vírus Shamonda, o vírus da febre do Vale do Rift, o vírus Chikungunya, o vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, o vírus Ebola, o vírus Marburg, o vírus Lassa, o vírus da hepatite C, o vírus da hepatite E, o enterovírus 71, Plasmodium falciparum ou Leptospira interrogans.
[0143] A Tabela 1 abaixo descreve exemplos de combinações de microesferas acopladas a antígenos que podem ser incluídas no kit de acordo com a presente invenção, dependendo da região geográfica à qual se destina (Ásia, Europa, América, Oceania ou África).
[0144] O kit de acordo com a presente invenção pode alternativamente conter microesferas acopladas a antígenos que permitem o diagnóstico de vírus ou parasitas que induzem sintomas específicos (similares a gripe, encefalite ou febre hemorrágica) ou infectam animais específicos, de forma que pode ser adaptado a cada paciente/animal.
[0145] A Tabela 1 abaixo descreve exemplos de combinações de microesferas acopladas a antígenos que podem ser incluídas no kit de acordo com a presente invenção, dependendo dos sintomas do paciente ou do animal.
[0146] Por fim, kits que contêm combinações de antígenos que são propostas por agências sanitárias nacionais obviamente também são englobados na presente invenção.
[0147] Particularmente, o kit de acordo com a presente invenção compreende pelo menos dois suportes sólidos revestidos com pelo menos duas proteínas de fusão que são selecionadas a partir do grupo que consiste de: SEQ ID N° 21, SEQ ID N° 42, SEQ ID N° 49, SEQ ID N° 51, SEQ ID N° 53, SEQ ID N° 60, SEQ ID N° 62, SEQ ID N° 64, SEQ ID N° 66, SEQ ID N° 68, SEQ ID N° 70, SEQ ID N° 72, SEQ ID N° 74, SEQ ID N° 76, SEQ ID N° 78, SEQ ID N° 80, SEQ ID N° 82, SEQ ID N° 84, SEQ ID N° 86, SEQ ID N° 88, SEQ ID N° 90, SEQ ID N° 92, SEQ ID N° 94, SEQ ID N° 96, SEQ ID N° 98, SEQ ID N° 100, SEQ ID N° 102, SEQ ID N° 104, SEQ ID N° 109, SEQ ID N° 111, SEQ ID N° 113, SEQ ID N° 115, SEQ ID N° 117, SEQ ID N° 119, SEQ ID N° 121, SEQ ID N° 123, SEQ ID N° 125, SEQ ID N° 127, SEQ ID N° 129, SEQ ID N° 131, SEQ ID N° 133, SEQ ID N° 135, SEQ ID N° 137, SEQ ID N° 139, SEQ ID N° 141, SEQ ID N° 143, SEQ ID N° 145, SEQ ID N° 147, SEQ ID N° 149 e SEQ ID N° 151.
[0148] Em uma realização preferida, o kit de acordo com a presente invenção contém uma combinação de pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, pelo menos dez, pelo menos onze, pelo menos doze, pelo menos treze, pelo menos quatorze, pelo menos quinze, pelo menos dezesseis, pelo menos dezessete, pelo menos dezoito, pelo menos dezenove ou pelo menos vinte suportes sólidos revestidos com as mencionadas proteínas de fusão.
[0149] Em uma realização de maior preferência, o kit de acordo com a presente invenção contém uma combinação de pelo menos cinco suportes sólidos (tais como subconjuntos de microesferas) que são revestidos com pelo menos cinco proteínas de fusão diferentes que contêm antígenos conforme recomendado pela Administração de Alimentos e Drogas, nomeadamente antígenos dos vírus HBV, HCV, HIV2, HIV2 e do oeste do Nilo.
TABELA 1
[0150] Combinações vantajosas de microesferas acopladas a antígenos a serem incluídas no kit de acordo com a presente invenção:
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[0151] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de fabricação do kit de acordo com a presente invenção conforme definido acima, em que o mencionado método compreende as etapas de: a. fornecimento de pelo menos uma primeira proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina; b. contato da mencionada primeira proteína de fusão com um primeiro suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; c. obtenção de um primeiro suporte sólido acoplado covalentemente a um primeiro epítopo que é reconhecido pelo primeiro anticorpo alvo; d. fornecimento de pelo menos uma segunda proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um segundo epítopo, em que o mencionado segundo epítopo é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de DNA O6-alquilguanina; e. contato da mencionada segunda proteína de fusão com um segundo suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; f. obtenção de um segundo suporte sólido acoplado covalentemente a um segundo epítopo que é reconhecido pelo segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; em que os mencionados pelo menos primeiro e pelo menos segundo suportes sólidos podem ser especificamente identificados entre si; em que o kit de acordo com a presente invenção compreende pelo menos os mencionados primeiro e segundo suportes.
[0152] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um teste de imunosseleção multiplex que compreende pelo menos 2, 25, 50 ou 96 suportes sólidos conforme definido acima, em que cada um dos mencionados suportes sólidos emite um comprimento de onda diferente e diferenciável após a excitação.
[0153] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de teste de imunosseleção multiplex que compreende: a. contato de uma ou mais amostras biológicas com pelo menos 2, 25, 50 ou 96 suportes sólidos conforme definido acima, em que cada um dos suportes sólidos emite um comprimento de onda diferente e diferenciável após a excitação; e b. detecção da presença ou ausência de anticorpos alvo.
[0154] Em uma realização preferida, os mencionados anticorpos alvo são específicos para antígeno de vírus a serem detectados em banco de sangue de acordo com orientações da OMS ou FDA, tais como vírus selecionados a partir de HBV, HCV, HIV1, HIV2 e WNV.
[0155] Em outra realização preferida, os mencionados anticorpos alvo são específicos para linhagens de HPV oncogênicas, tais como HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 e 68.
[0156] Em outra realização preferida, cada um dos mencionados anticorpos alvo é marcado com uma marca detectável.
[0157] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um aparelho para conduzir o método de fabricação do kit de acordo com a presente invenção conforme definido acima, que compreende um dispositivo técnico para detectar as fontes de luz emitidas pelos suportes sólidos e a fonte de luz emitida pelos anticorpos alvo ou anticorpos marcados que se ligam aos anticorpos alvo e um dispositivo de cálculo ou computador para identificar quais suportes sólidos são ligados a anticorpos alvo, de forma a indicar a presença ou ausência de antígenos, bactérias, vírus ou parasitas na amostra analisada.
[0158] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método in vitro de diagnóstico de pelo menos uma doença alvo em pacientes, em que a mencionada doença alvo é conhecida por induzir a síntese de pelo menos um anticorpo alvo no mencionado paciente, que compreende a realização do imunoteste de acordo com a presente invenção, em que o mencionado paciente é diagnosticado como sofrendo da mencionada pelo menos uma doença alvo caso a quantidade do mencionado pelo menos um anticorpo alvo seja mais alta que um valor controle.
[0159] Este método de diagnóstico permite preferencialmente o diagnóstico de duas, preferencialmente três e, de maior preferência, quatro doenças alvo em pacientes dele necessitados. Este número, entretanto, não é limitador: realmente é possível diagnosticar até cem doenças alvo, pois é possível detectar até cem anticorpos diferentes com o método de detecção de acordo com a presente invenção.
[0160] Em uma realização preferida, a mencionada pelo menos uma doença alvo é uma infecção viral, bacteriana, de levedura ou mediada por fungo, preferencialmente uma infecção viral causada por papilomavírus ou vírus de RNA das famílias dos flavivirídeos (vírus da dengue, febre amarela, oeste do Nilo, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos e hepatite C), os togavirídeos (vírus Chikungunya, do Rio Ross, Mayaro, encefalite equina do oeste, encefalite equina do leste e encefalite equina da Venezuela), os buniavirídeos (vírus da febre hemorrágica da Crimeia-Congo, febre do Vale do Rift e Schmallenberg), os calicivirídeos (vírus da hepatite E), os arenavirídeos (Lassa) ou os filovirídeos (Ebola, Marburg), uma infecção bacteriana causada por Leptospirosa interrogans ou uma infecção causada por Plasmodium falciparum.
[0161] Em uma realização preferida, o mencionado método in vitro é utilizado para diagnosticar pelo menos cinco, de maior preferência pelo menos quinze, de maior preferência pelo menos cinquenta e, de preferência ainda maior, pelo menos cem infecções virais e/ou bacterianas e/ou de parasitas no mencionado paciente.
[0162] Em uma realização preferida, o valor de controle utilizado no mencionado método representa a quantidade do mencionado anticorpo alvo em uma amostra de paciente que não sofre da mencionada doença alvo e, preferencialmente, um paciente saudável.
[0163] Os métodos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados para diagnosticar infecções em animais.
[0164] Particularmente, eles podem ser utilizados para diagnóstico de doenças de animais, bem como abordagem de DIVA (diferenciação infectada de animais vacinados) para diferenciar animais infectados naturalmente de animais vacinados. O uso de uma estratégia de DIVA em complementação a vacinas inovadoras permitiria a implementação de vacinação como estratégia de controle alvo em conjunto com estratégias convencionais (teste, abate e inspeção da carne). Além disso, o aumento da especificidade de testes teria benefício econômico importante ao reduzir as quantidades de animais falsos positivos que podem ser abatidos sem necessidade. Por fim, maior sensibilidade, particularmente ao utilizar-se testes de diagnóstico inovadores, teriam benefício adicinoal na redução do encargo econômico do control das doenças, mesmo na ausência de vacinação.
[0165] Em uma realização preferida, os métodos de acordo com a presente invenção são aplicados a indivíduos humanos.
[0166] A presente invenção refere-se, por fim, ao uso do kit de acordo com a presente invenção no diagnóstico de pelo menos duas doenças alvos em pacientes, em que a mencionada doença alvo é uma infecção viral causada por papilomavírus ou vírus de RNA das famílias dos flavivirídeos (vírus da dengue, febre amarela, oeste do Nilo, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos e hepatite C), os togavirídeos (vírus Chikungunya, do Rio Ross, Mayaro, encefalite equina do oeste, encefalite equina do leste e encefalite equina da Venezuela), os buniavirídeos (vírus da febre hemorragia da Crimeia-Congo, febre do Vale do Rift e Schmallenberg), os calicivirídeos (vírus da hepatite E), os arenavirídeos (Lassa) ou os filovirídeos (Ebola, Marburg), uma infecção bacteriana causada por Leptospirosa interrogans ou uma infecção causada por Plasmodium falciparum.
[0167] Um novo arbovírus emergente foi recentemente sequenciado e afeta o gado na Alemanha, Benelux e na França. Este vírus é denominado vírus Schmallenberg (SBV) e está relacionado com o vírus Akabane pertencente ao sorogrupo Simbu do gênero Orthobunyavirus da família dos buniavirídeos. O genoma viral do vírus Schmallenberg compreende três segmentos de RNA de fita simples conhecidos como S, L e M. O segmento S codifica a nucleoproteína N e a proteína não estrutural NSs. A nucleoproteína N compartilha determinantes antigênicos com diferentes buniavírus. As três sequências virais de RNA da linhagem BH80/11-4 do vírus Schmallenberg são disponíveis com os números HE649913.1, HE649914.1 e HE649912.1.
[0168] Os inventores do presente observaram que a fusão como proteína quimérica da enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) com a proteína SBV N aumenta muito a produção de proteína N recombinante, particularmente em células invertebradas tais como células S2.
[0169] Os inventores do presente propõem aqui o uso, pela primeira vez, da enzima AGT (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes, um de seus domínios catalíticos ou seus subfragmentos, para aumentar a produção da nucleoproteína N de SBV em células hospedeiras, particularmente em células de invertebrados. O efeito de aprimoramento é observado quando as células hospedeiras expressam um polipeptídeo de fusão que compreende pelo menos (i) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras, (ii) a enzima AGT, um de seus mutantes, domínios catalíticos ou subfragmentos e (iii) a nucleoproteína N de SBV. Para que ocorra o efeito de aprimoramento, a enzima AGT necessita ser ligada fisicamente, direta ou indiretamente (poderão ser introduzidos espaçadores e outros aminoácidos), à proteína de interesse. Sem restrições à teoria, contempla-se que a enzima AGT aja como proteína de chaperona, por exemplo, facilitando a secreção da célula hospedeira e estabilizando o polipeptídeo de fusão sintetizado no sobrenadante das células hospedeiras ou para evitar a sua metabólise durante e após a sua síntese e secreção das células hospedeiras. Além disso, observou-se que AGT possui uma estrutura globular 3D que compreende hélice α (Wibley, J. E. A. et al, 2000), que é compatível com um papel de armação de AGT.
[0170] No contexto da presente invenção, células “hospedeiras” são quaisquer células que podem ser utilizadas para produzir proteínas recombinantes, tais como células de “não vertebrados” (ou invertebrados), células de vertebrados, células vegetais, células de leveduras ou células procarióticas. Elas são preferencialmente células de vertebrados e invertebrados.
[0171] Não vertebrados (também conhecido como invertebrados) compreendem filos diferentes, dos quais os mais famosos são insetos, aracnídeos, crustáceos, moluscos, anelídeos, cirripédias, radiatas, coelenteratas e infusórias. Eles são agora classificados em mais de trinta filos, de organismos simples tais como esponjas do mar e platelmintos até animais complexos tais como artrópodes e moluscos. No contexto da presente invenção, células de invertebrados são preferencialmente células de insetos, tais como células de drosófilas ou mosquitos e, de maior preferência, células de drosófilas S2.
[0172] Exemplos de células derivadas de organismos vertebrados que são úteis como linhagens de células hospedeiras incluem células haste embriônicas não humanas ou seus derivados, tais como células EBX de aves; linhagem CVI de rim de macaco transformada por sequências SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); uma linhagem de rim embriônico humano (293); células de rim de filhote de hamster (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês (CHO); células Sertori de camundongo (TM4); células de rim de macaco (CVI, ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células de carcinoma da cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células do fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células do pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células do fígado humano (Hep G2, HB 8065); células de tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células de hepatoma de ratos (HTC, Ml.5); células YB2/O (ATCC n° CRL 1662); NIH3T3; HEK e TRI. No contexto da presente invenção, células de vertebrados são preferencialmente células EBX, CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3 ou seus derivados.
[0173] Células vegetais que podem ser utilizadas no contexto da presente invenção são os cultivares de fumo Amarelo Brilhante 2 (BY2) e Nicotiana tabaccum 1 (NT-1).
[0174] Células de leveduras que podem ser utilizadas no contexto da presente invenção são: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe e Hansenula polymorpha, bem como leveduras metilotrópicas como Pichia pastoris e Pichia methanolica.
[0175] Células procarióticas que podem ser utilizadas no contexto da presente invenção são tipicamente bactérias E. coli ou bactérias Bacillus subtilis.
[0176] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se, portanto, a um vetor para expressão da nucleoproteína N de SBV em uma célula hospedeira (SBV.N), que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um mutante, um fragmento ou seu domínio catalítico e (c) a nucleoproteína N de SBV de SEQ ID N° 16.
[0177] A nucleoproteína N de SBV será denominada a seguir “proteína heteróloga”, “proteína de interesse”, “proteína quimérica” ou “proteína recombinante”.
[0178] O termo “vetor” no presente indica o veículo por meio do qual uma sequência de DNA ou RNA de um gene exógeno pode ser introduzida em uma célula hospedeira, de forma a transformá-la e promover a expressão da sequência introduzida. Conforme compreendido no presente, um vetor é uma molécula de ácido nucleico, tal como plasmídeos, fagos e vírus. Eles são discutidos com mais detalhes abaixo. Qualquer tipo de plasmídeo, cosmídeo, YAC ou vetor viral pode ser utilizado para preparar uma construção de ácido nucleico recombinante que pode ser introduzida em uma célula hospedeira na qual se deseja a expessão da proteína de interesse. Quando se desejar a expressão da proteína de interesse em um tipo específico de célula hospedeira, podem ser utilizados vetores virais que infectam seletivamente o tipo de célula ou tipo de tecido desejado. Também são importantes no contexto da presente invenção vetores para uso em terapia genética (ou seja, que são capazes de fornecer a molécula de ácido nucleico a um organismo hospedeiro).
[0179] Vetores virais, por exemplo, tais como lentivírus, retrovírus, vírus da herpes, adenovírus, vírus adenoassociados, vírus de vaccínia, bacilovírus e outros vírus recombinantes com tropismo celular desejável. Métodos de construção e uso de vetores virais são conhecidos na técnica (vide Miller e Rosman, BioTechniques, 7: 980-990, 1992).
[0180] Vetores virais que são realmente preferidos na presente invenção são aqueles que são apropriados para uso em células de vertebrados e invertebrados.
[0181] Para células de invertebrados, vetores preferidos são os arbovírus, em que o vírus do oeste do Nilo é particularmente preferido, que são vetores de artrópodes. Outros vetores que são conhecidos como expressos eficientemente em células de invertebrados são os bacilovírus.
[0182] Para células de vertebrados, são preferidos vetores lentivirais, AAV, bacilovirais e adenovirais. Os vetores apropriados para expressão em células de hospedeiros mamíferos podem também ser de origem não viral (tal como DNA de plasmídeo). Vetores de plasmídeos apropriados incluem, sem limitações, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pCDM8 e pMT2PC, pVAX e pgWiz.
[0183] Para células procarióticas, são preferidos vetores de plasmídeo, bacteriófago e cosmídeo. Vetores apropriados para uso em sistemas procarióticos incluem, sem limitações, vetores pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pPoly, pTrc; pET 11d; pIN; e pGEX.
[0184] Para células vegetais, são preferidos vetores de expressão de plasmídeos tais como plasmídeos Ti e vetores de expressão viral tais como vírus mosaico da couve-flor (CaMV) e vírus mosaico do fumo TMV.
[0185] A expressão de proteínas recombinantes em células de levedura pode ser realizada utilizando três tipos de vetores: vetores de integração (YIp), plasmídeos epissomais (YEp) e plasmídeos centroméricos (YCp): Vetores apropriados para expressão em levedura (tais como S. cerevisiae) incluem, mas sem limitações, pYepSec1, pMFa, pJRY88, pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, Califórnia) e pTEF-MF (código de produto da Dualsystems Biotech: P03303).
[0186] Vetores que podem ser utilizados para terapia genética são bem conhecidos na técnica. Eles são, por exemplo, lentivírus, retrovírus, adenovírus, vírus da catapora, vírus da herpes, vírus do sarampo, vírus espumosos ou vírus adenoassociados (AAV). Vetores virais podem ser competentes para reprodução ou podem ser geneticamente incapacitados de forma a serem defeituosos para reprodução ou terem reprodução impedida. Os vetores de terapia genética preferidos são os vetores DNA Flap conforme descrito em WO 99/055892, US 6.682.507 e WO 01/27300.
[0187] Uma sequência “que codifica” um produto de expressão, tal como RNA, polipeptídeo, proteína ou enzima, é uma sequência de nucleotídeos que, quando expressa, resulta na produção daquele RNA, polipeptídeo, proteína ou enzima; ou seja, a sequência de nucleotídeos “codifica” aquele RNA ou codifica a sequência de aminoácidos para aquele polipeptídeo, proteína ou enzima.
[0188] O vetor de acordo com a presente invenção contém uma sequência de nucleotídeos que codifica uma enzima alquiltransferase de DNA 6- alquilguanina (AGT) ou um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos. Esses polipeptídeos foram definidos acima. Preferencialmente, o mencionado mutante AGT é a enzima SNAP de SEQ ID N° 2 e é codificado, por exemplo, por SEQ ID N° 15 ou SEQ ID N° 31, em que este último possui teor G/C de 51%.
[0189] Preferencialmente, o vetor de expressão de nucleotídeos de acordo com a presente invenção compreende adicionalmente locais de clonagem que permitem a inserção em quadro de uma sequência de DNA heteróloga que codifica a proteína de interesse.
[0190] Conforme indicado na presente invenção, a expressão “peptídeo de sinal de secreção” designa uma cadeia de peptídeos curtos (3 a 60 aminoácidos de comprimento) que dirige o transporte da nucleoproteína N para fora das células hospedeiras.
[0191] Exemplos de sinais de secreção apropriados para a presente invenção incluem, mas sem limitações, as sequências de peptídeo de sinal do fator de acasalamento (MF) alfa (US 5.879.926); invertase (WO 84/01153); PHO5 (DK 3614/83); YAP3 (protease aspártica de levedura 3; WO 95/02059); e BAR1 (WO 87/02670).
[0192] No contexto da presente invenção, este peptídeo de sinal de secreção é preferencialmente funcional, seja em células de invertebrados, em células de vertebrados ou em ambas.
[0193] Exemplos de peptídeos de sinal de secreção que são funcionais em células de insetos são: ssBiP de inseto (SEQ ID N° 37 por exemplo, codificado pela sequência de DNA de SEQ ID N° 22), o sinal de peptídeo similar a BiP de SEQ ID N° 24 (por exemplo, codificado pela sequência de DNA de SEQ ID N° 23), o sinal de peptídeo similar a BiP de SEQ ID N° 153 (por exemplo, codificado pela sequência de DNA de SEQ ID N° 152) e qualquer sinal de peptídeo presente em um arbovírus, tal como a proteína de envelope E do vírus do oeste do Nilo (SEQ ID N° 38).
[0194] De forma interessante, o sinal de peptídeo similar a BiP de SEQ ID N° 24 mencionado acima é funcional em células de vertebrados e invertebrados. Este sinal similar a BiP corresponde ao sinal de peptídeo BiP de SEQ ID N° 37 no qual o último aminoácido Glicina foi substituído pela sequência de aminoácidos Pro Thr Ala Leu Ala (SEQ ID N° 39), que corresponde ao local de divisão da proteína E do vírus da dengue. Consequentemente, o sinal similar a BiP será convenientemente dividido após a tradução e secreção da proteína no sobrenadante das células hospedeiras.
[0195] Diversos sinais de secrção também são disponíveis para expressão em células hospedeiras de leveduras, por exemplo, em S. cerevisiae. Estes incluem o fator pré-pró-alfa, Hsp150, PHO1, SUC2, KILM1 (toxina mortal tipo 1) e GGP1.
[0196] Um local de clonagem é uma sequência que facilita a clonagem de um gene que codifica uma proteína de interesse no sistema de expressão. Ele contém locais de restrição ou locais de reconhecimento de restrição, ou seja, locais sobre uma molécula de DNA que contêm sequências específicas de nucleotídeos, que são reconhecidas por enzimas de restrição (vide, por exemplo, as figuras). Estas são geralmente sequências palindrômicas (pois as enzimas de restrição normalmente são ligadas como homodímeros) e uma enzima de restrição específica pode cortar a sequência entre dois nucleotídeos dentro do seu local de reconhecimento ou em algum lugar próximo. Os locais de clonagem são bem conhecidos dos técnicos no assunto.
[0197] Em uma realização preferida da presente invenção, a sequência de DNA que codifica a mencionada enzima AGT está localizada em 5’ ou 3’ da sequência de DNA que codifica a mencionada proteína heteróloga de interesse, preferencialmente em 5’. A enzima AGT, portanto, é direta ou indiretamente ligada ao polipeptídeo/proteína heteróloga de interesse e preferencialmente localizada na extremidade N-terminal do polipeptídeo/proteína heteróloga de interesse. A sequência de DNA que codifica o polipeptídeo de fusão que compreende o mencionado sinal de peptídeo, a mencionada enzima AGT, domínio mutante ou catalítico e a mencionada proteína recombinante de interesse pode ser associada operativamente a um promotor indutível que é funcional nas mesmas células hospedeiras do sinal de peptídeo.
[0198] De maior preferência, no vetor de acordo com a presente invenção, o mencionado quadro de leitura aberta é associado operativamente a um promotor indutível que é funcional na mesma célula hospedeira do sinal de peptídeo.
[0199] Uma sequência de codificação é “associada operativamente a” uma sequência de controle de expressão (ou seja, sequências de controle de transcrição e tradução) em uma célula quando a polimerase de RNA transcreve a sequência de codificação em RNA, que é dividida em trans-RNA em seguida (caso contenha introns) e, se a sequência codificar uma proteína, é traduzida naquela proteína.
[0200] “Promotor” é uma sequência de nucleotídeos da qual pode ser iniciada a transcrição de DNA ligado operativamente abaixo no fluxo (ou seja, na direção 3’ da fita com sentido de DNA de fita dupla). Dentro da sequência promotora, será encontrado um local de início de transcrição (convenientemente encontrado, por exemplo, por meio de mapeamento com nuclease S1), bem como domínios de ligação de proteínas (sequências de consenso) responsáveis pela ligação de polimerase de RNA.
[0201] Promotores que podem ser utilizados para controlar a expressão genética no contexto da presente invenção são, por exemplo, os funcionais em células de invertebrados ou em células de vertebrados. Para células de invertebrados, por exemplo, podem ser utilizadas as sequências reguladoras do gene metalotioneína (Brinster et al, Nature, 296: 39-42, 1982).
[0202] Preferencialmente, o promotor indutível que está presente no vetor de acordo com a presente invenção possui atividade promotora em uma célula de inseto e, e maior preferência, em uma célula de Drosophila. É, por exemplo, o promotor pMT de Drosophila metallothionein (Lastowski-Perry et al, J. Biol. Chem. 260: 1527 (1985)), que dirige a transcrição de alto nível do gene na presença de metais, tais como CuSO4. Alternativamente, pode ser utilizado o promotor de gene actina 5C de Drosophila, que é um promotor constitutivo e não necessita da adição de metais (B. J. Bond et al, Mol. Cell. Biol. 6: 2080 (1986)). Exemplos de outros promotores de Drosophila conhecidos incluem, por exemplo, os promotores de choque quente indutível (Hsp70) e LTR COPIA. O promotor inicial de SV40 fornece nível mais baixo de expressão que o promotor de metalotioneína de Drosophila.
[0203] Preferencialmente, o promotor indutível que está presente no vetor de acordo com a presente invenção possui atividade promotora em uma célula de Drosophila melanogaster, preferencialmente em células de Drosophila S2. É, por exemplo, o promotor de metalotioneína amplamente descrito em Lastowski-Perry et al, J. Biol. Chem. 260: 1527 (1985).
[0204] Os promotores apropriados para expressão constitutiva em células de mamíferos incluem o promotor inicial imediato de citomegalovírus (CMV), o promotor final principal de adenovírus, o promotor de fosfogliceroquinase (PGK) e o promotor timidino quinase de vírus simplex da herpes (HSV)-1. Os promotores eucarióticos indutíveis regulados por compostos fornecidos de forma exógena incluem, sem limitações, o promotor metalotioneína indutível por zinco (MT), o promotor do vírus do tumor mamário de camundongo indutível por dexametasona (Dex) (MMTV), o sistema promotor de polimerase T7 (WO 98/10088), o promotor de insetos de ecdisona, o promotor reprimível por tetraciclina, o promotor indutível por tetraciclina, o promotor indutível por RU486 e o promotor indutível por rapamicina.
[0205] Preferencialmente, o promotor que está presente no vetor de acordo com a presente invenção possui atividade promotora em uma célula de mamíferos, preferencialmente em células de HeLa. Trata-se, por exemplo, do promotor SV 40.
[0206] Diversos promotores de levedura são disponíveis para expressão de proteína em células hospedeiras de leveduras. Algumas, como ADH2 e SUC2, são indutíveis e outras, como GAPDH, são constitutivas na expressão. Outros promotores apropriados para expressão em levedura incluem os promotores TEF, PGK, MF alfa, CYC-1, GAL-1, GAL4, GAL10, PHO5, desidrogenase 3-fosfato de gliceraldeído (GAP ou GAPDH) e desidrogenase de álcool (ADH).
[0207] Para uso em células vegetais, o promotor mais comumente utilizado é o promotor de vírus mosaico da couve-flor (CaMV) 35S ou sua versão amplificada, mas diversos promotores alternativos podem ser utilizados, tais como o promotor (ocs)3mas híbrido ou o promotor de ubiquitina de milho e Arabidopsis thaliana. Ao contrário desses promotores constitutivos, o promotor de α-amilase de arroz RAmy3D é induzido por escassez de açúcar (Hellwig, S. et al, Nat. Biotechnol. 2004; 22 (11): 1415-22).
[0208] Os promotores apropriados para expressão em células hospedeiras de E. coli incluem, mas sem limitações, o promotor lambda de bacteriófago pL e os promotores lac, TRP e pTAC indutível por IPTG.
[0209] Prefere-se que o peptídeo de sinal de secreção e o promotor indutível sejam funcionais na mesma célula hospedeira.
[0210] De maior preferência, o peptídeo de sinal de secreção e o promotor indutível são funcionais em células S2 de Drosophila e em células de vertebrados.
[0211] O termo “indutível”, da forma aplicada a um promoor, é bem compreendido pelos técnicos no assunto. Essencialmente, a expressão sob o controle de um promotor indutível é “ligada” ou aumentada em reação a um estímulo aplicado. A natureza do estímulo varia entre os promotores. Alguns promotores indutíveis causam níveis baixos de expressão baixos ou indetectáveis (ou ausência de expressão) na ausência do estímulo apropriado. Outros promotores indutíveis causam expressão constitutiva detectável na ausência do estímulo. Seja qual for o nível de expressão na ausência do estímulo, a expressão de qualquer promotor indutível aumenta na presença do estímulo correto.
[0212] Após a construção e transfecção de um vetor apropriado para a célula hospedeira selecionada, preferencialmente uma linhagem de células de Drosophila, a expressão de uma proteína heteróloga é induzida pela adição de um agente indutor apropriado para o promotor indutível. Cádmio ou cobre, por exemplo, são agentes indutores para o promotor Hsp70. Para promotores constitutivos, tais como o promotor de actina 5C, nenhum agente indutor é necessário para expressão.
[0213] Em outra realização da presente invneção, o vetor de expressão de nucleotídeos codifica pelo menos um local de divisão de peptídeos, que é preferencialmente localizado entre a enzima AGT ou seu domínio catalítico e a proteína recombinante de interesse.
[0214] Um local de divisão de peptídeos (também denominado “local de divisão de peptídeos”) é uma sequência de aminoácidos que é reconhecida por pelo menos uma enzima protease (tal como protease de serina, protease de cisteína e outras). Um exemplo de local de divisão de peptídeo é o local de divisão de enteroquinase de SEQ ID N° 40 (AspAspAspAspLys/Asp). A enteroquinase é uma enzima de protease de serina (EC 3.4.21.9) que é conhecida por converter tripsinogene inativo em tripsina ativa por meio de divisão na extremidade C-terminal da sequência: Val--(Asp)4--Lys--Ile--Val~ (tripsinogene) ^ Val--(Asp)4--Lys (hexapeptídeo) + Ile--Val~ (tripsina). Enteroquinase divide-se após lisina caso a Lys seja precedida por quatro Asp e não seguida por um resíduo de prolina.
[0215] Outro local de divisão de peptídeo útil é o local de divisão da chamada “protease TEV”, que contém a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 32 (pró-TEV1) ou SEQ ID N° 33 (pró-TEV2) (Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser ou Gly, respectivamente). Esses locais de divisão podem ser codificados, por exemplo, por SEQ ID N° 29 e 30. Protease TEV é o nome comum do domínio catalítico de 27 kDa da proteína de inclusão nuclear codificada pelo vírus da ferrugem do fumo. Ele é disponível comercialmente (Invitrogen).
[0216] O local de divisão do precursor de membrana prM do sorotipo 1 do vírus da dengue (SEQ ID N° 39) pode também ser utilizado no vetor de acordo com a presente invenção.
[0217] Em outra realização, o vetor de expressão de nucleotídeos de acordo com a presente invenção codifica adicionalmente uma marca, preferencialmente localizada na extremidade C-terminal da proteína recombinante no polipeptídeo de fusão de acordo com a presente invenção (que compreende o sinal de peptídeo, a proteína AGT ou seu homólogo e a proteína recombinante). No contexto da presente invenção, “marca” é dedicada a facilitar a recuperação do polipeptídeo do lisato bruto da célula hospedeira e é preferencialmente selecionado a partir do grupo que compreende: proteínas fluorescentes, marcas póli-histidina (póli-his) ou póli-histidina-glicina (póli-his- gly); marcas HA de gripe; marcas de glicoproteína D (gD) de vírus Herpes simplex marca c-myc, peptídeos de marca, epítopos de alfatubulina ou marcas de peptídeos de proteína de gene T7 10. Poderá, entretanto, ser utilizada qualquer outra marca. Em uma realização preferida da presente invenção, os vetores compreendem o DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma marca de hexa- histidina que possui SEQ ID N° 27.
[0218] Em outra realização, o vetor de expressão de nucleotídeos de acordo com a presente invenção codifica adicionalmente sequência(s) espaçadora(s), localizada(s) preferencialmente entre a enzima AGT (ou seu domínio catalítico) e a proteína recombinante de interesse e/ou entre a proteína recombinante de interesse e a marca. No contexto da presente invenção, uma sequência espaçadora é uma sequência de aminoácidos que compreende pelo menos três aminoácidos, dedicada a separar no espaço dois polipeptídeos ligados (em que estes polipeptídeos são ligados indiretamente em seguida). Esse espaçador pode ser, por exemplo, a sequência de aminoácidos Glicina- Glicina-Glicina-Serina (GGGS, SEQ ID N° 25) e a sequência espaçadora de DNA que a codifica pode ser SEQ ID N° 26. No contexto da presente invenção, esta sequência de DNA é denominada a seguir “sequência espaçadora de DNA” e está localizada entre o DNA que codifica AGT ou seu domínio catalítico e a sequência de DNA recombinante, preferencialmente acima no fluxo da sequência de DNA que codifica o local de divisão de peptídeo.
[0219] Da forma utilizada no presente, o termo “pDeSNAPUniv” designa um conjunto de DNA que codifica, em uma única estrutura de leitura aberta, de 5’ para 3’: a. um peptídeo de sinal de secreção; b. uma proteína AGT de SEQ ID N° 1, um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos, particularmente o mutante SNAP de SEQ ID N° 2; c. pelo menos um local de divisão de peptídeo; d. pelo menos uma marca; e e. pelo menos uma sequência espaçadora.
[0220] Este conjunto de DNA pDeSNAPUniv codifica um peptídeo de sinal de secreção que é convenientemente o sinal de peptídeo similar a BiP de SEQ ID N° 24 ou o sinal de peptídeo ssBip de SEQ ID N° 37, o mutante de SNAP de SEQ ID N° 2, uma marca que é convenientemente uma marca His de SEQ ID N° 27, um local de divisão de peptídeos que é convenientemente o pró-TEV de SEQ ID N° 32 ou o pró-TEV de SEQ ID N° 33 e/ou uma sequência espaçadora que contém convenientemente a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 25.
[0221] De maior preferência, o conjunto de DNA pDeSNAPUniv compreende, de 5’ para 3’, a sequência SEQ ID N° 23 que codifica o sinal de secreção similar a BiP, SEQ ID N° 15 ou 31 que codifica o mutante de SNAP, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26, o local de divisão de peptídeo pró- TEV de SEQ ID N° 29, o local de divisão de peptídeo pró-TEV de SEQ ID N° 30, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26 e a sequência SEQ ID N° 28 que codifica a marca His (vide a Figura 8, que exibe a estrutura do conjunto pDeSNAPUniv). Esse conjunto de DNA pDeSNAPUniv é, por exemplo, SEQ ID N° 34.
[0222] Este conjunto “pDeSNAPUniv” é mantido como “universal”, pois ele pode ser inserido em qualquer tipo de vetores dedicados a transfectar células hospedeiras a fim de produzir proteínas heterólogas, nomeadamente vetores de vertebrados (tais como vetores pcDNA3 ou pCI-neo), bem como vetores de invertebrados (tais como pMT/BiP/V5-HisA, que é útil no sistema DES da Invitrogen). Exemplos de plasmídeos que compreendem a mencionada sequência universal são SEQ ID N° 43 (pMT/BiP/V5-HisA da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ), SEQ ID N° 44 (pUC57 da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ) ou SEQ ID N° 45 (pcDNA3 da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ).
[0223] Outro exemplo de plasmídeo que compreende a mencionada sequência universal é SEQ ID N° 105, que é um plasmídeo pUC57 que compreende, de 5’ para 3’, o promotor constitutivo de promotor inicial imediato de vírus da nucleoproteína de multicapsídeos de Orgyia pseudotsugata 2 (OpIE2SP), o peptídeo de sinal similar a BiP de SEQ ID N° 152, a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26, a sequência pró-TEV1 de SEQ ID N° 29 e a marca de peptídeo C-terminal de SEQ ID N° 106.
[0224] Após a clonagem da sequência heteróloga de uma proteína de interesse tal como SBV.N no presente, esse vetor pode ser convenientemente transfectado em células hospedeiras de vertebrados ou invertebrados, de forma a produzir a proteína de interesse em altas quantidades.
[0225] Em uma realização preferida, o vetor de acordo com a presente invenção compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/SBV.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv no qual a sequência da nucleoproteína N de SBV foi inserida, em que o mencionado conjunto pDeSNAP Univ/SBV.N compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica, em estrutura de leitura aberta isolada, de 5’ para 3’: a. um peptídeo de sinal de secreção; b. uma proteína AGT de SEQ ID N° 1, um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos, particularmente o mutante SNAP de SEQ ID N° 2; c. pelo menos um local de divisão de peptídeo; d. a nucleoproteína N de SBV de SEQ ID N° 16; e. pelo menos uma marca; e f. pelo menos uma sequência espaçadora.
[0226] Este conjunto de DNA pDeSNAPUniv/SBV.N codifica um peptídeo de sinal de secreção que é convenientemente o sinal de peptídeo similar a BiP de SEQ ID N° 24 ou o sinal de peptídeo ssBip de SEQ ID N° 37, o mutante de SNAP de SEQ ID N° 2, a nucleoproteína N de SBV de SEQ ID N° 16, uma marca que é convenientemente uma marca His de SEQ ID N° 27, um local de divisão de peptídeos que é convenientemente o pró-TEV de SEQ ID N° 32 ou o pró-TEV de SEQ ID N° 33 e/ou uma sequência espaçadora que contém convenientemente a sequência de aminoácidos SEQ ID N° 25.
[0227] De maior preferência, o conjunto de DNA pDeSNAP Univ/SBV.N compreende, de 5’ para 3’, a sequência SEQ ID N° 23 que codifica o sinal de secreção similar a BiP, SEQ ID N° 22 que codifica o sinal de secreção ssBiP, SEQ ID N° 15 ou 31 que codifica o mutante de SNAP, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26, o local de divisão de peptídeo pró-TEV de SEQ ID N° 29, a sequência SEQ ID N° 17 que codifica a nucleoproteína N de SBV, o local de divisão de peptídeo pró-TEV2 de SEQ ID N° 30, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26 e a sequência de SEQ ID N° 28 que codifica a marca His.
[0228] De preferência ainda maior, o conjunto de DNA pDeSNAP Univ/SBV.N compreende, de 5’ para 3’, a sequência SEQ ID N° 22 que codifica o sinal de secreção ssBip, SEQ ID N° 31 que codifica o mutante de SNAP, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26, o local de divisão de peptídeo pró-TEV1 de SEQ ID N° 29, a sequência SEQ ID N° 17 que codifica a nucleoproteína N de SBV, o local de divisão de peptídeo pró-TEV2 de SEQ ID N° 30, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26 e a sequência SEQ ID N° 28 que codifica a marca His. Esse conjunto de DNA pDeSNAP Univ/SBV.N é, por exemplo, SEQ ID N° 35.
[0229] Alternativamente, o conjunto de DNA pDeSNAP Univ/SBV.N pode compreender, de 5’ a 3’, a sequência SEQ ID N° 23 que codifica o sinal de secreção similar a Bip, SEQ ID N° 31 que codifica o mutante de SNAP, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26, o local de divisão de peptídeo pró-TEV1 de SEQ ID N° 29, a sequência SEQ ID N° 17 que codifica a nucleoproteína N de SBV, o local de divisão de peptídeo pró-TEV2 de SEQ ID N° 30, a sequência espaçadora de SEQ ID N° 26 e a sequência SEQ ID N° 28 que codifica a marca His. Esse conjunto de DNA pDeSNAP Univ/SBV.N é, por exemplo, SEQ ID N° 36 (cuja estrutura é exibida na Figura 9).
[0230] Desta forma, em uma realização preferida, o vetor de acordo com a presente invenção compreende o conjunto pDeSNAP Univ/SBV.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 35 ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 36.
[0231] Mais precisamente, a sequência de nucleotídeos do conjunto pDeSNAP Univ/SBV.N de SEQ ID N° 35 compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 (que corresponde à sequência SBV.N natural, na qual o local EcoRV interno foi excluído e dois locais EcoRV e XmaI foram adicionados nas extremidades); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His; e a sequência de nucleotídeos do conjunto pDeSNAP Univ/SBV.N de SEQ ID N° 36 compreende (vide também a Figura 9): - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 (que corresponde à sequência SBV.N natural, na qual o local EcoRV interno foi excluído e dois locais EcoRV e XmaI foram adicionados nas extremidades); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0232] De forma interessante, a sequência de nucleotídeos do conjunto pDeSNAP Univ/SBV.N do conjunto de SEQ ID N° 36 também compreende adicionalmente um local NheI acima no fluxo de ATG, um local BglII entre a sequência similar a BiP e a sequência similar a SNAP, um local AgeI e um local HindIII que estão ambos localizados abaixo no fluxo do códon de parada.
[0233] Os vetores de acordo com a presente invenção são, por exemplo, SEQ ID N° 43 (que é o plasmídeo pMT/BiP/V5-HisA da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ) no qual a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 foi inserida, SEQ ID N° 44 (que é o plasmídeo pUC57 da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ) na qual a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 foi inserida ou SEQ ID N° 45 (que é o plasmídeo pcDNA3 da Invitrogen que compreende o conjunto pDeSNAP Univ) na qual a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 foi inserida.
[0234] Os vetores de acordo com a presente invenção também são fornecidos nas células S2, que foram depositadas no Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur (25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, França) em 24 de abril de 2012 sob o número CNCM I-4616.
[0235] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que sofre transfecção estável por um vetor de acordo com a presente invenção, preferencialmente um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 35 ou SEQ ID N° 36.
[0236] Preferencialmente, neste aspecto da presente invenção, a mencionada célula recombinante é uma célula de invertebrado, preferencialmente uma célula de inseto e, de maior preferência, uma célula S2.
[0237] Células de invertebrados podem ser quaisquer células de insetos, aracnídeos, crustáceos, moluscos, anelídeos, Cirripedia, Radiata, Coelenterata e Infusoria. No contexto da presente invenção, células de invertebrados são preferencialmente células de insetos, tais como células de drosófilas ou mosquitos. Elas são, de maior preferência, células S2 de drosófilas. Neste caso, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende, por exemplo, SEQ ID N° 35.
[0238] Foram amplamente descritas células S2 de drosófilas. Elas são especialmente apropriadas para a produção em alto rendimento de proteína, pois podem ser mantidas em cultivos em suspensão à temperatura ambiente (24 ± 1 °C). O meio de cultivo é M3 suplementado com 5 a 10% (v/v) de soro de feto bovino desativado por calor (FBS). Na realização preferida da presente invenção, o meio de cultivo contém 5% de FBS. Após a indução, as células são cultivadas em meios livres de soro. Neste meio, as células S2 podem ser cultivadas em cultivos de suspensão, tal como em frascos agitadores de 250 ml a 2000 ml, com agitação a 50-60 rpm. As densidades celulares são tipicamente mantidas entre 106 e 107 células por mililitro.
[0239] Em uma realização preferida, a célula recombinante de acordo com a presente invenção é a célula S2 que foi depositada no Centre National de Culture et de Microorganismes (CNCM), Institut Pasteur (25 rue du Docteur Roux, 75724 Paris cedex 15, França) em 24 de abril de 2012 sob o número CNCM I-4616.
[0240] Em outra realização preferida, a mencionada célula recombinante é uma célula de vertebrado.
[0241] Preferencialmente, a mencionada célula recombinante de vertebrado é uma célula de mamífero, preferencialmente uma célula de CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3, HeLa ou seus derivados. De maior preferência, neste caso, o vetor de expressão de acordo com a presente invenção compreende SEQ ID N° 36.
[0242] Em outro aspecto da presente invenção, a mencionada célula recombinante é utilizada para amplificar e purificar os vetores de expressão de acordo com a presente invenção, preferencialmente aqueles que compreendem SEQ ID N° 35 ou 36.
[0243] Com este propósito, os vetores de expressão de nucleotídeos de acordo com a presente invenção podem também compreender um gene que codifica um marcador de seleção e/ou uma sequência de término. Genes marcadores de seleção que podem ser incluídos na construção são tipicamente aqueles que conferem fenótipos selecionáveis tais como resistência a antibióticos (tais como blasticidina, ampicilina, canamicina, higromicina, puromicina e cloranfenicol).
[0244] Métodos de produção de vetores de expressão são bem conhecidos na técnica.
[0245] Em outro aspecto, a célula recombinante de acordo com a presente invenção é utilizada de forma a produzir a nucleoproteína N do vírus Schmallenberg em altas quantidades.
[0246] Desta forma, em uma realização específica, a presente invenção também se refere a um método de produção da nucleoproteína N do vírus Schmallenberg, em que o método compreende as etapas de: a. obtenção do vetor de acordo com a presente invenção, em que o mencionado vetor comprende, por exemplo, a sequência de DNA de SEQ ID N° 35 ou SEQ ID N° 36; b. transfecção de células hospedeiras (preferencialmente células de inseto ou células de mamífero) com o polinucleotídeo obtido na etapa (a); c. manutenção para expressão do mencionado polinucleotídeo obtido na etapa (b) para produzir a nucleoproteína N do vírus Schmallenberg; d. divisão opcional do polipeptídeo AGT; e. recuperação da nucleoproteína N do vírus Schmallenberg; e f. purificação opcional da nucleoproteína N do vírus Schmallenberg.
[0247] Para realizar as diferentes etapas do método de acordo com a presente invenção, pode-se empregar biologia molecular convencional, microbiologia e métodos de DNA recombinante dentro do conhecimento dos técnicos no assunto. Esses métodos são totalmente explicados na literatura. Vide, por exemplo, Sambrook, Fitsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque (denominado a seguir “Sambrook et al, 1989”); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I e II (D. N. Glover, ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, Ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames e S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons Inc. (1994).
[0248] O termo “transfecção” indica a introdução de um ácido nucleico exógeno em uma célula hospedeira eucariótica, de tal forma que a célula hospedeira expresse o gene ou sequência introduzida para produzir a nucleoproteína N do vírus Schmallenberg. Uma célula hospedeira que recebe e expressa DNA ou RNA introduzido foi “transfectada” e é um “transfectante” ou “clone”. O DNA ou RNA introduzido em uma célula hospedeira pode vir de qualquer fonte, incluindo células do mesmo gênero ou espécie da(s) célula(s) hospedeira(s) de um gênero ou espécie diferente.
[0249] No contexto da presente invenção, a transfecção das células hospedeiras com os polinucleotídeos pode ser realizada por meio de um método clássico na técnica, tal como por meio de transfecção, infecção ou eletroporação. Em outra realização, o vetor de acordo com a presente invenção pode ser introduzido in vivo por meio de lipofecção (como DNA bruto) ou com outros agentes facilitadores da transfecção (peptídeos, polímeros etc.). Lipídios catiônicos sintéticos podem ser utilizados para preparar lipossomos para transfecção in vivo de um gene que codifica um marcador (Felgner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84: 7413-7417 (1987). Compostos de lipídios úteis e composições de transferência de ácidos nucleicos são descritos em WO 95/18863 e WO 96/17823 e em US 5.459.127. Os lipídios podem ser acoplados quimicamente a outras moléculas para fins de ligação (vide Mackey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85: 8027-8031 (1988). Peptídeos alvo, tais como hormônios ou neurotransmissores, e proteínas, tais como anticorpos, ou moléculas não de peptídeos poderão ser acoplados quimicamente a lipossomos. Outras moléculas também são úteis para facilitar a transfecção de ácidos nucleicos in vivo, tais como oligopeptídeos catiônicos (vide WO 95/21931), peptídeos derivados de proteínas de ligação de DNA (vide WO 96/25508) ou um polímero catiônico (vide WO 95/21931). Também é possível introduzir o vetor in vivo como um plasmídeo de DNA bruto. Vetores de DNA brutos para terapia genética podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE dextran, precipitação de fosfato de cálcio, uso de disparador genético ou uso de um transportador de vetor de DNA (vide Wu et al, J. Biol. Chem., 267: 963-967, 1992; Wu e Wu, J. Biol. Chem., 263: 14621-14624, 1988; Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 88: 2726-2730, 1991).
[0250] A expressão “manutenção para expressão” de um polinucleotídeo no presente indica que o estímulo das sequências regulatórias que estão presentes no vetor (tal como o estímulo que ativa o promotor indutível) e todos os componentes necessários estão presentes em quantidade suficiente para que ocorra a tradução do polinucleotídeo.
[0251] Em caso de necessidade, o polipeptídeo AGT/SNAP pode ser dividido da proteína de fusão produzida por meio da adição de uma protease que possui um local de divisão definido ao sobrenadante ou às células recombinantes. Quando for utilizado um vetor que compreende o conjunto pDeSNAP Univ de SEQ ID N° 35 ou 36, por exemplo, é obtida a divisão do local de divisão pró-TEV ENLKYFQ/G(S) por meio da adição da protease de TEV ao sobrenadante das células recombinantes. Alternativamente, o polipeptídeo AGT/SNAP pode ser mantido de forma a aumentar a vida útil da nucleoproteína N de SBV.
[0252] Além disso, os técnicos no assunto apreciarão que uma proteína ou polipeptídeo expresso ou secretado pode ser detectado no meio de cultivo utilizado para manter ou cultivar as células hospedeiras do presente. O meio de cultivo pode ser separado das células hospedeiras por meio de procedimentos conhecidos, tais como centrifugação ou filtragem. A proteína ou o polipeptídeo podem ser detectados no meio de cultivo livre de células utilizando propriedades conhecidas características da proteína ou polipeptídeo. Estas propriedades podem incluir as diferentes propriedades imunológicas, enzimáticas ou físicas da proteína ou polipeptídeo. Caso uma proteína ou polipeptídeo possua atividade enzimática exclusiva, por exemplo, pode ser realizado ensaio para aquela atividade sobre o meio de cultivo utilizado pelas células hospedeiras. Além disso, quando forem disponíveis anticorpos reativos contra uma dada proteína ou polipeptídeo, estes anticorpos podem ser utilizados para detectar a proteína ou polipeptídeo em qualquer ensaio imunológico conhecido (por exemplo, como em Harlowe et al, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
[0253] A recuperação da nucleoproteína N de SBV é mediada pelos meios bem conhecidos na técnica, que incluem, mas sem limitações, eletroforese de gel-disco preparativo, concentração isoelétrica, HPLC, HPLC de fase reversa, filtragem de gel, cromatografia de partição e troca de íons, cromatografia de dessalinização e precipitação, extração, distribuição contracorrente e similares. Como é preferível produzir a proteína de interesse no sistema recombinante de acordo com a presente invenção ligado com uma marca, a mencionada marca facilitará a recuperação do polipeptídeo do lisato bruto da célula hospedeira por meio de cromatografia sobre uma matriz de fase sólida apropriada. Alternativamente, anticorpos produzidos contra a proteína ou contra peptídeos dela derivados podem ser utilizados como reagentes de recuperação.
[0254] Os inventores do presente descobriram que as proteínas de fusão geradas com o método de acordo com a presente invenção geralmente não necessitam ser adicionalmente purificadas. Pode ser realizada, entretanto, uma etapa adicional (g) de purificação.
[0255] Um material purificado pode conter menos de cerca de 50%, preferencialmente menos de cerca de 75% e, de preferência superior, menos de cerca de 90% dos componentes celulares aos quais foi originalmente associado. A expressão “substancialmente puro” indica o grau mais alto de pureza que pode ser atingido utilizando métodos de purificação convencionais conhecidos na técnica.
[0256] Em uma realização da presente invenção, os métodos de acordo com a presente invenção permitem a obtenção de pelo menos 40 mg/l, preferencialmente pelo menos 50 mg/l, de maior preferência pelo menos 60 mg/l da nucleoproteína N substancialmente pura do vírus Schmallenberg no sobrenadante de cultivo celular recuperado.
[0257] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N de vírus Schmallenberg de SEQ ID N° 16.
[0258] Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima).
[0259] Este polipeptídeo de fusão preferencialmente compreende ainda uma marca conforme definido acima. Esta marca é preferencialmente uma marca de póli-histidina e está preferencialmente localizada na extremidade C terminal da nucleoproteína N do vírus Schmallenberg.
[0260] O polipeptídeo de fusão de acordo com a presente invenção é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 41 (correspondente à proteína de fusão similar a BiP/SNAP/SBV.N/marca His) ou SEQ ID N° 46 (correspondente à proteína de fusão ssBiP/SNAP/SBV.N/marca His) ou SEQ ID N° 42 (correspondente à proteína de fusão SNAP/SBV.N).
[0261] Por fim, a proteína quimérica SNAP-SBV. N pode ser útil como agente de diagnóstico para detecção da infecção viral pelo vírus Schmallenberg ou para detecção de anticorpos específicos do mencionado vírus em fluidos biológicos, tais como sangue, soro, saliva e similares.
[0262] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso da proteína de fusão (SNAP-SBV. N) obtida por meio de qualquer método de acordo com a presente invenção para identificar a presença dos mencionados micro-organismos patogênicos ou não patogênicos em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0263] Em outros aspectos, a presente invenção também se refere a vetores que expressam proteínas de fusão de interesse específico, em que as mencionadas proteínas de fusão compreendem uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos, que é fundida em quadro a antígenos interessantes, tais como antígenos virais ou bacterianos, peptídeos microbianos e/ou polipeptídeos de interesse. Estes vetores são detalhados abaixo.
ANTÍGENO DE ECOVÍRUS
[0264] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão de um antígeno de ecovírus, tal como a proteína VP1 do enterovírus 71 (picornavirídeos), em uma célula hospedeira. Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína VP1 do enterovírus 71 (EV71; vide, por exemplo, Kolpe, A. B. et al, Virus Research, 2012).
[0265] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/EV71.VP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência SEQ ID N° 47 que codifica a proteína VP1 da linhagem de vírus EV71 JL-AFP-EV71-07-03 (Genebank n° JQ715713) foi inserida.
[0266] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/EV71.VP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 48 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA de SEQ ID N° 47 qhe codifica a proteína VP1 da linhagem de vírus EV71 JL-AFP-EV71-07-03 (Genebank n° JQ715713); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0267] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0268] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína VP1 do vírus EV71. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 49 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/EV71.VP1/pró-TEV2/marca His).
[0269] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-EV71.VP1) para identificar a presença do enterovírus 71 em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DE FLAVIVÍRUS
[0270] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos de flavivírus específicos em células hospedeiras.
[0271] Em uma realização preferida, o mencionado antígeno de flavivírus é a proteína E solúvel (sE) do vírus da encefalite japonesa (JEV.sE). Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína sE do vírus da encefalite japonesa.
[0272] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JEV.sE”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual as sequências do gene que codifica a proteína E solúvel (sE) do vírus da encefalite japonesa (JEV) foram inseridas.
[0273] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JEV.sE que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 50 que compreende, de 5’ para 3’: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a sequência prM/M da linhagem de SA-14 de JEV (Genbank n° M55506); - a sequência de DNA que codifica a sequência E[1-395] da linhagem SA-14 de JEV (Genbank n° M55506); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0274] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0275] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína E solúvel (sE) do vírus da encefalite japonesa (JEV.sE). Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 51 (correspondente à proteína de fusão JEV.sE/similar a SNAP/marca His).
[0276] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-JEV.sE) para identificar a presença do vírus da encefalite japonesa (JEV) em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a present invenção.
[0277] Em uma realização preferida, o mencionado antígeno de flavivírus é o domínio III da proteína de envelope E (proteína EDIII) do genótipo 1 (JE-1.EDIII), do genótipo 2 (JE-3.EDIII), do genótipo 4 (JE-1.EDIII) ou do genótipo 5 (JE-5.EDIII) do vírus da encefalite japonesa.
[0278] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se, portanto, a um vetor de expressão do domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 1 (JE-I.EDIII), do genótipo 2 (JE-2.EDIII), do genótipo 4 (JE-4.EDIII) ou do genótipo 5 (JE-5.EDIII) do vírus da encefalite japonesa em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras, (b) uma enzima de alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína EDIII do genótipo 1 (JE- I.EDIII), do genótipo 2 (JE-2.EDIII), do genótipo 4 (JE-4.EDIII) ou do genótipo 5 (JE-5.EDIII) do vírus da encefalite japonesa.
[0279] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JE-I.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 1 do vírus da encefalite japonesa (JE-1.EDIII) foi inserida.
[0280] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JE-1.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 52 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA de SEQ ID N° 54 que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 1 do vírus da encefalite japonesa (Genebank n° AY377577); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0281] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JE-2.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 2 do vírus da encefalite japonesa (JE-2.EDIII) foi inserida.
[0282] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JE-2.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 59 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA de SEQ ID N° 55 que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 2 do vírus da encefalite japonesa (Genebank n° L-43566); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0283] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JE-4.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 4 do vírus da encefalite japonesa (JE-4.EDIII) foi inserida.
[0284] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JE-4.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 61 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA de SEQ ID N° 56 que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 4 do vírus da encefalite japonesa (Genebank n° U70408); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0285] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 5 do vírus da encefalite japonesa (JE-5.EDIII) foi inserida.
[0286] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 63 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA de SEQ ID N° 57 que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do genótipo 5 do vírus da encefalite japonesa (Genebank n° JN587258); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0287] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a células recombinantes que são transfectadas de forma estável pelos mencionados vetores.
[0288] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína EDIII do vírus JE-1, JE-2, JE-4 ou JE-5. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 53 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JE-1.EDIII/marca His), SEQ ID N° 60 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JE-2.EDIII/marca His), SEQ ID N° 62 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JE-4.EDIII/marca His) ou SEQ ID N° 64 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JE- 5.EDIII/marca His).
[0289] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso de qualquer uma dessas proteínas de fusão (SNAP- JE-1.EDIII), (SNAP-JE-2.EDIII), (SNAP-JE-4.EDIII) ou (SNAP-JE-5.EDIII) para identificar a presença do genótipo 1, 2, 4 ou 5, respectivamente, do vírus da encefalite japonesa em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0290] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de expressão do domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do vírus Rabensburg (RabV) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do vírus Rabensburg (RabV).
[0291] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/RabV.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência da proteína EDIII do vírus Rabensburg foi inserida.
[0292] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/RabV.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 65 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA de SEQ ID N° 58 que codifica o domínio III da proteína E de envelope (proteína EDIII) do vírus Rabensburg (Genebank n° AY65264); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0293] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0294] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína EDIII do vírus Rabensburg. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 66 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/RabV.EDIII/marca His).
[0295] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-RabV.EDIII) para identificar a presença do vírus Rabensburg em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção. ANTÍGENOS DE ALFAVÍRUS
[0296] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos de alfavírus específicos, tais como a proteína E2 solúvel do vírus do Rio Ross (RR.sE2) ou do vírus Mayaro (MAY.sE2) em células hospedeiras.
[0297] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína sE2 do vírus do Rio Ross.
[0298] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/RR2.sE2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene sE2 do vírus do Rio Ross foi inserida.
[0299] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/RR.sE2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 69 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a proteína sE2 da linhagem QML1 do vírus do Rio Ross (Genbank n° GQ433354); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0300] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0301] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína sE2 do vírus do Rio Ross. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 70 (correspondente à proteína de fusão RR.sE2/similar a SNAP/marca His).
[0302] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-RR.sE2) para identificar a presença do vírus do Rio Ross em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0303] A presente invenção também se refere a um vetor de expressão da proteína E2 solúvel do vírus Mayaro (MAY.sE2) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína sE2 do vírus Mayaro.
[0304] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MAY.sE2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene sE2 do vírus do Rio Ross foi inserida.
[0305] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/MAY.sE2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 71 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a proteína sE2 corrigida (E2-S203C) da linhagem de vírus Mayaro IQD2668 (Genbank n° DQ487429.1); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0306] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0307] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína sE2 do vírus Mayaro (MAY.sE2). Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 72 (correspondente à proteína de fusão MAY.sE2/similar a SNAP/marca His).
[0308] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MAY.sE2) para identificar a presença do vírus Mayaro em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DO VÍRUS DA ENCEFALITE EQUINA
[0309] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos do vírus da encefalite de equinos específicos, tais como a proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina do oeste (WEE.sE2), o vírus da encefalite equina do leste (EEE.sE2) ou o vírus da encefalite equina da Venezuela (VEE.sE2) em uma célula hospedeira.
[0310] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina do oeste.
[0311] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/WEE.sE2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene sE2 do vírus da encefalite equina do oeste foi inserida.
[0312] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/WEE.sE2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 73 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a proteína sE2 da linhagem do vírus da encefalite equina do oeste (Genbank n° NC00390808); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0313] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0314] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína sE2 do vírus WEE. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 74 (correspondente à proteína de fusão WEE.sE2/similar a SNAP/marca His).
[0315] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-WEE.sE2) para identificar a presença do vírus da encefalite equina do oeste em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0316] Em outra realização, a presente invenção também se refere a um vetor de expressão da proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina do leste (EEE.sE2) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina do leste.
[0317] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/EEE.sE2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene sE2 do vírus da encefalite equina do leste foi inserida.
[0318] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/EEE.sE2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 75 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a proteína sE2 da linhagem do vírus da encefalite equina do leste (Genbank n° EF151502); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0319] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0320] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína sE2 do vírus EEE. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 76 (correspondente à proteína de fusão EEE.sE2/similar a SNAP/marca His).
[0321] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-EEE.sE2) para identificar a presença do vírus da encefalite equina do leste em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0322] Em outra realização, a presente invenção também se refere a um vetor de expressão da proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina da Venezuela (VEE.sE2) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína E2 solúvel do vírus da encefalite equina da Venezuela.
[0323] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/VEE.sE2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene sE2 do vírus da encefalite equina da Venezuela foi inserida.
[0324] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/VEE.sE2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 77 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica a proteína sE2 da linhagem do vírus da encefalite equina da Venezuela (Genbank n° AY973944); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0325] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0326] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína sE2 do vírus VEE. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 78 (correspondente à proteína de fusão VEE.sE2/similar a SNAP/marca His).
[0327] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-VEE.sE2) para identificar a presença do vírus da encefalite equina da Venezuela em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DE ORTOBUNIAVÍRUS
[0328] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos de ortobuniavírus específicos, tais como a nucleoproteína N do vírus Akabane (AKA.N), do vírus Aino (AIN.N) ou do vírus Shamonda (SHA.N), em uma célula hospedeira.
[0329] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Akabane.
[0330] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/AKA.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica a nucleoproteína N do vírus Akabane foi inserida.
[0331] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/AKA.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 79 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N natural do vírus Akabane; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0332] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0333] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Akabane. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 80 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/AKA.N/pró-TEV2/marca His).
[0334] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-AKA.N) para identificar a presença do vírus Akabane em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0335] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão da nucleoproteína N do vírus Aino (AIN.N) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Aino.
[0336] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/AIN.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica a nucleoproteína N do vírus Aino foi inserida.
[0337] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/AIN.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 81 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N natural do vírus Aino; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0338] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0339] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Aino. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 82 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/AIN.N/pró-TEV2/marca His).
[0340] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-AIN.N) para identificar a presença do vírus Aino em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0341] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão da nucleoproteína N do vírus Shamonda (SHA.N) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Shamonda.
[0342] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/SHA.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica a nucleoproteína N do vírus Shamonda foi inserida.
[0343] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/SHA.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 83 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N natural do vírus Shamonda; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0344] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0345] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Shamonda. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 84 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/SHA.N/pró-TEV2/marca His).
[0346] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-SHA.N) para identificar a presença do vírus Shamonda em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DE BETACORONAVÍRUS
[0347] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos de betacoronavírus específicos, tais como a Nucleoproteína N de betacoronavírus humano (huCOV.N) ou a proteína S do betacoronavírus humano (huCOV.S), em uma célula hospedeira.
[0348] Especificamente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N de betacoronavírus humano.
[0349] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/huCOV.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene que codifica a nucleoproteína N de betacoronavírus humano foi inserida.
[0350] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/huCOV.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 85 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica o gene N de betacoronavírus humano 2cEMC/2012 (Genbank n° JX869059); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0351] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0352] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N de betacoronavírus humano. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 86 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/huCOV.N/pró-TEV2/marca His).
[0353] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-huCOV.N) para identificar a presença do betacoronavírus humano em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0354] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão da forma solúvel da proteína S spike de betacoronavírus humano (huCOV.S) em uma célula hospedeira, que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA de 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a forma solúvel da proteína S spike de betacoronavírus humano.
[0355] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/huCOV.S”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene S de betacoronavírus humano foi inserida.
[0356] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/huCOV.S que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 87 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o gene S de betacoronavírus humano 2cEMC/2012 (Genbank n° JX869059); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0357] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0358] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a forma solúvel da proteína S Spike de betacoronavírus humano. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 88 (correspondente à proteína de fusão huCOV.S/similar a SNAP/marca His).
[0359] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-huCOV.S) para identificar a presença do betacoronavírus humano em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENO DE HEPACIVÍRUS
[0360] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos de hepacivírus específicos, tais como a proteína C do vírus da hepatite C (HCV.C) ou do vírus da hepatite E (HEV.C), em uma célula hospedeira.
[0361] Em uma realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína C do vírus da hepatite C.
[0362] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/HCV.C”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene da proteína C de vírus da hepatite C foi inserida.
[0363] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/HCV.C que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 89 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a proteína C do genótipo 1b do vírus da hepatite C (linhagem TCHM-R2/03); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0364] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0365] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína C do vírus da hepatite C (HCV.C). Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 90 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/HCV.C/pró-TEV2/marca His).
[0366] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-HCV.C) para identificar a presença do vírus da hepatite C em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0367] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína C do vírus da hepatite E (HEV.C).
[0368] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/HEV.C”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência do gene da proteína C de vírus da hepatite E foi inserida.
[0369] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/HEV.C que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 150 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a proteína C do vírus da hepatite E (Genbank n° AB29196); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0370] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0371] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína C do vírus da hepatite E (HEV.C). Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 151 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/HEV.C/pró-TEV2/marca His).
[0372] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-HEV.C) para identificar a presença do vírus da hepatite E em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DA MALÁRIA
[0373] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão de antígenos de malária específicos, tais como as proteínas MSP-1 e AMA-1 de Plasmodium falciparum (MSP-1+AMA-1) (vide Pan, W. et al, The Journal of Immunology, 2004) em células hospedeiras.
[0374] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) as proteínas MSP-1 e AMA- 1 do parasita Plasmodium falciparum.
[0375] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MSP-1+AMA-1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica as proteínas MSP-1 e AMA-1 do parasita Plasmodium falciparum foi inserida.
[0376] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/MSP-1+AMA-1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 91 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - a sequência de DNA que codifica a sequência MSP-1 (19) (50% G+C) de Plasmodium falciparum; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - a sequência de DNA que codifica a sequência AMA-1 (III) (50% G+C) de Plasmodium falciparum; - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0377] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0378] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína MSP-1+AMA-1 de Plasmodium falciparum. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 92 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/MSP-1/pró-TEV2/AMA-1/marca His).
[0379] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MSP-1+AMA-1) para identificar a presença do parasita Plasmodium falciparum em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
ANTÍGENOS DA LEPTOSPIROSE
[0380] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão de um antígeno da leptospirose específico, tal como a proteína HbpA de bactérias Leptospira (vide Sivakolundu, S. et al, Journal of Medical Microbiology, 2012), em células hospedeiras.
[0381] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína HbpA da bactéria Leptospira interrogans.
[0382] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/HbpA”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína HbpA de bactéria Leptospira foi inserida.
[0383] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/HbpA que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 93 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a forma curta modificada de HbpA (receptor de membrana externa dependente de TonB ou LB191) de Leptospira interrogans serovar Lai linhagem 56601 (Genbank n° AA51750.1); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0384] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0385] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína HbpA da bactéria Leptospira interrogans. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 94 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/HbpA/pró-TEV2/marca His).
[0386] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-HbpA) para identificar a presença da bactéria Leptospira em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
PEPTÍDEOS MICROBIANOS
[0387] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor para expressão de um peptídeo microbiano, tal como o peptídeo microbiano MUB-40, em células hospedeiras.
[0388] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o peptídeo MUB-40.
[0389] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MUB40”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o peptídeo MUB40 foi inserida.
[0390] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/MUB40 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 95 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica o peptídeo MUB-40; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0391] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0392] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o peptídeo MUB 40. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 96 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/MUB40/pró-TEV2/marca His).
[0393] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MUB40) para identificar a presença de um ligante em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
LECTINAS ENVOLVIDAS NA PATOGÊNESE DE FLAVIVÍRUS
[0394] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores para expressar lectinas específicas envolvidas na patogênese de flavivírus, tal como a forma solúvel humana ou de camundongo de lectina similar a tipo C (CLEC5A) em células hospedeiras.
[0395] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o CLEC5A de camundongo (mo-CLEC5A) ou o CLEC5A humano (hu-CLEC5A).
[0396] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a forma solúvel de camundongo de lectina similar a tipo C foi inserida.
[0397] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 97 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a forma solúvel em camundongo de lectina similar a tipo C (CLEC5A); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0398] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0399] Em outra realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a forma solúvel humana de lectina similar a tipo C foi inserida.
[0400] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 99 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a forma solúvel humana de lectina similar a tipo C (CLEC5A); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0401] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0402] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a forma solúvel humana ou de camundongo de lectina similar do tipo C (CLEC5A). Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 98 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/mo-CLEC5A/pró-TEV2/marca His) ou a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 100 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/hu-CLEC5A/pró-TEV2/marca His).
[0403] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-mo-CLEC5A) ou (SNAP-hu- CLEC5A) para detecção da presença de flavivírus em amostras bilógicas, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
PROTEÍNAS DE MOSQUITO ANTIFLAVIVIRAIS
[0404] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de proteínas de mosquio antivirais específicas, tais como a proteína VAGO da espécie Culex (cxVAGO) ou da espécie Aedes (aaVAGO) em células hospedeiras.
[0405] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína VAGO do mosquito Aedes albopictus.
[0406] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/aaVAGO”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína VAGO do mosquito Aedes albopictus foi inserida.
[0407] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/aaVAGO que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 103 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 152; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - a sequência de DNA que codifica a proteína VAGO do mosquito Aedes albopictus; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0408] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0409] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína VAGO do mosquito Aedes albopictus. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 104 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/aaVAGO/marca His).
[0410] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-aaVAGO) para identificar a presença de um ligante em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0411] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a proteína VAGO do mosquito Culex quinquefaciatus.
[0412] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/cxVAGO”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína VAGO do mosquito Culex quinquefasciatus foi inserida.
[0413] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/cxVAGO que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 101 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 152; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - a sequência de DNA que codifica a proteína VAGO do mosquito Culex quinquefasciatus; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0414] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0415] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína VAGO do mosquito Culex quinquefasciatus. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 102 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/cxVAGO/marca His).
[0416] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-cxVAGO) para identificar a presença de um ligante em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção. ANTÍGENOS DA FEBRE HEMORRÁGICA VIRAL
[0417] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a vetores de expressão de antígenos da febre hemorrágica viral específicos, tais como: - a nucleoproteína N do vírus da Crimeia-Congo (CCHF.N), do vírus Ebola (EBO.N), do vírus Marburg (MAR.N), do vírus Lassa (LAS.N), do vírus Junin (JUN.N), do vírus Machupo (MAC.N), do vírus Sabiá (SAB.N) ou do vírus Guanarito (GUA.N); - o ectodomínio de GP1 do vírus Lassa (LAS.ectoGP1), do vírus Junin (JUN.ectoGP1), do vírus Machupo (MAC.ectoGP1), do vírus Sabiá (SAB.ectoGP1) ou do vírus Guanarito (GUA.ectoGP1); - o ectodomínio de GP2 do vírus Lassa (LAS.ectoGP2), do vírus Junin (JUN.ectoGP2), do vírus Machupo (MAC.ectoGP2), do vírus Sabiá (SAB.ectoGP2) ou do vírus Guanarito (GUA.ectoGP2); e - o domínio III da proteína E de envelope do vírus Omsk (OMSK.EDIII), do vírus Kasyanur (KAS.EDIII) ou do vírus Alkhurma (ALK.EDIII).
[0418] Particularmente, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus da Crimeia-Congo (CCHF.N).
[0419] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/CCHF.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus da Crimeia-Congo foi inserida.
[0420] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/CCHF.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 108 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus da Crimeia-Congo; - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0421] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0422] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus da Crimeia-Congo. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 109 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/CCHF.N/pró-TEV2/marca His).
[0423] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-CCHF.N) para identificar a presença do vírus da Crimeia-Congo em amostras biológicas, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0424] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Ebola (EBO.N).
[0425] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/EBO.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Ebola foi inserida.
[0426] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/EBO.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 110 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Ebola (Genbank n° NC_002549); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0427] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0428] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Ebola. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 111 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/EBO.N/pró-TEV2/marca His).
[0429] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-EBO.N) para identificar a presença do vírus Ebola em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0430] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Marburg (MAR.N).
[0431] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MAR.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Marburg foi inserida.
[0432] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/MAR.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 112 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Marburg (Genbank n° NC_001608); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0433] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0434] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Marburg. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 113 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/MAR.N/pró-TEV2/marca His).
[0435] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MAR.N) para identificar a presença do vírus Marburg em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0436] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Lassa (LAS.N).
[0437] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/LAS.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Lassa foi inserida.
[0438] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/Las.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 114 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Lassa (Genbank n° NC_004296); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0439] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0440] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Lassa. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 115 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/LAS.N/pró-TEV2/marca His).
[0441] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-LAS.N) para identificar a presença do vírus Lassa em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0442] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Junin (JUN.N).
[0443] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JUN.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Junin foi inserida.
[0444] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/JUN.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 116 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Junin (Genbank n° NC_005081); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0445] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0446] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Junin. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 117 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/JUN.N/pró-TEV2/marca His).
[0447] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-JUN.N) para identificar a presença do vírus Junin em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0448] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Machupo (MAC.N).
[0449] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MAC.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Machupo foi inserida.
[0450] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/MAC.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 118 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Machupo (Genbank n° NC_005078); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0451] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0452] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Machupo. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 119 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/AKA.N/pró-TEV2/marca His).
[0453] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MAC.N) para identificar a presença do vírus Machupo em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0454] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Guanarito (GUA.N).
[0455] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/GUA.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Guanarito foi inserida.
[0456] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/GUA.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 120 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Guanarito (Genbank n° NC_005077); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0457] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0458] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Guanarito. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 121 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró-TEV1/GUA.N/pró-TEV2/marca His).
[0459] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-GUA.N) para identificar a presença do vírus Guanarito em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0460] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) a nucleoproteína N do vírus Sabiá (SAB.N).
[0461] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/SAB.N”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a nucleoproteína N do vírus Sabiá foi inserida.
[0462] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/SAB.N que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 122 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA que codifica a nucleoproteína N do vírus Sabiá (Genbank n° NC_006317); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); - uma segunda sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0463] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0464] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a nucleoproteína N do vírus Sabiá. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 123 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/pró- TEV1/SAB.N/pró-TEV2/marca His).
[0465] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-SAB.N) para identificar a presença do vírus Sabiá em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0466] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o domínio III da proteína E de envelope do vírus Omsk (OMSK.EDIII).
[0467] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/OMSK.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína EDIII do vírus Omsk foi inserida.
[0468] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/OMSK.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 124 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 152; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA que codifica a proteína EDIII do vírus Omsk (Genbank n° NC_005062); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0469] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0470] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína EDIII do vírus Omsk. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 125 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/OMSK.EDIII/marca His).
[0471] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-OMSK.EDIII) para identificar a presença do vírus Omsk em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0472] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o domínio III da proteína E de envelope do vírus da doença da floresta de Kyasanur (KYA.EDIII).
[0473] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/KYA.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína EDIII do vírus da doença da floresta de Kyasanur foi inserida.
[0474] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/KYA.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 126 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 152; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA que codifica a proteína EDIII do vírus da doença da floresta de Kyasanur (Genbank n° JF416958); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0475] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0476] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína EDIII do vírus da doença da floresta de Kyasanur. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 127 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/KYA.EDIII/marca His).
[0477] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-KYA.EDIII) para identificar a presença do vírus da doença da floresta de Kyasanur em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0478] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o domínio III da proteína E de envelope do vírus Alkhurma (ALK.EDIII).
[0479] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/ALK.EDIII”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica a proteína EDIII do vírus Alkhurma foi inserida.
[0480] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto de pDeSNAP Univ/ALK.EDIII que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 128 que compreende: - uma sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 152; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - a sequência de DNA que codifica a proteína EDIII do vírus Alkhurma (Genbank n° NC_004355); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0481] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0482] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) a proteína EDIII do vírus Alkhurma. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 129 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/ALK.EDIII/marca His).
[0483] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-ALK.EDIII) para identificar a presença do vírus Alkhurma em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0484] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Lassa (LAS.ectoGP1).
[0485] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Lassa foi inserida.
[0486] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 130 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Lassa (Genbank n° NC_004296); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0487] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0488] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Lassa. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 131 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/LAS.ectoGP1/marca His).
[0489] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-LAS.ectoGP1) para identificar a presença do vírus Lassa em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0490] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Junin (JUN.ectoGP1).
[0491] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Junin foi inserida.
[0492] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 132 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Junin (Genbank n° NC_005081); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0493] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0494] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Junin. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 133 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JUN.ectoGP1/marca His).
[0495] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-JUN.ectoGP1) para identificar a presença do vírus Junin em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0496] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Machupo (MAC.ectoGP1).
[0497] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Machupo foi inserida.
[0498] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 134 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Machupo (Genbank n° NC_005078); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0499] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0500] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Machupo. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 135 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/MAC.ectoGP1/marca His).
[0501] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MAC.ectoGP1) para identificar a presença do vírus Machupo em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0502] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Guanarito (GUA.ectoGP1).
[0503] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Guanarito foi inserida.
[0504] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 136 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Guanarito (Genbank n° NC_005077); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0505] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0506] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Guanarito. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 137 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/GUA.ectoGP1/marca His).
[0507] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-GUA.ectoGP1) para identificar a presença do vírus Guanarito em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0508] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Sabiá (SAB.ectoGP1).
[0509] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Sabiá foi inserida.
[0510] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 138 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Guanarito (Genbank n° NC_006317); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0511] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0512] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP1 do vírus Sabiá. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 139 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/SAB.ectoGP1/marca His).
[0513] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-SAB.ectoGP1) para identificar a presença do vírus Sabiá em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0514] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Lassa (LAS.ectoGP2).
[0515] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Lassa foi inserida.
[0516] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 140 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Lassa (Genbank n° NC_004296); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0517] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0518] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Lassa. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 141 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/LAS.ectoGP2/marca His).
[0519] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-LAS.ectoGP2) para identificar a presença do vírus Lassa em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0520] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Junin (JUN.ectoGP2).
[0521] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Junin foi inserida.
[0522] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 142 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Junin (Genbank n° NC_005081); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0523] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0524] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Junin. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 143 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/JUN.ectoGP2/marca His).
[0525] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-JUN.ectoGP2) para identificar a presença do vírus Junin em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0526] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Machupo (MAC.ectoGP2).
[0527] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Machupo foi inserida.
[0528] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 144 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Machupo (Genbank n° NC_005078); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0529] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0530] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Machupo. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 145 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/MAC.ectoGP2/marca His).
[0531] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-MAC.ectoGP2) para identificar a presença do vírus Machupo em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0532] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Guanarito (GUA.ectoGP2).
[0533] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Guanarito foi inserida.
[0534] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2 que possui a sequência de nucleotídeos de SEQ ID N° 146 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Guanarito (Genbank n° NC_005077); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0535] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0536] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Guanarito. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 147 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/GUA.ectoGP2/marca His).
[0537] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-GUA.ectoGP2) para identificar a presença do vírus Guanarito em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
[0538] Em outra realização, a presente invenção refere-se a um vetor que compreende a sequência de nucleotídeos que codifica (a) um peptídeo de sinal de secreção que é funcional nas mencionadas células hospedeiras e (b) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT), um de seus mutantes, fragmentos ou domínios catalíticos e (c) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Sabiá (SAB.ectoGP2).
[0539] Em uma realização preferida, este vetor compreende um chamado “conjunto de pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP2”, ou seja, um conjunto de DNA pDeSNAPUniv conforme definido acima, no qual a sequência que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Sabiá foi inserida.
[0540] Em uma realização preferida, este vetor compreende o conjunto pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2 que possui a sequência de nucleotídeos SEQ ID N° 148 que compreende: - uma sequência BiP de inseto de SEQ ID N° 22; - a sequência de DNA que codifica o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Sabiá (Genbank n° NC_006317); - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0541] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula recombinante que é transfectada de forma estável pelo mencionado vetor.
[0542] Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a um polipeptídeo de fusão que compreende (a) uma enzima alquiltransferase de DNA 6-alquilguanina (AGT) (EC 2.1.1.63), um de seus mutantes ou domínios catalíticos e (b) o ectodomínio de glicoproteína GP2 do vírus Sabiá. Neste polipeptídeo de fusão, a mencionada enzima AGT é preferencialmente a proteína de SEQ ID N° 2 ou um de seus homólogos (em que o mencionado homólogo é conforme definido acima). Este polipeptídeo de fusão é, por exemplo, a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° 149 (correspondente à proteína de fusão similar a SNAP/SAB.ectoGP2/marca His).
[0543] Desta forma, em outro aspecto, a presente invenção também se refere ao uso dessa proteína de fusão (SNAP-SAB.ectoGP2) para identificar a presença do vírus Sabiá em uma amostra biológica, por exemplo, graças ao imunoteste de acordo com a presente invenção.
EXEMPLOS
[0544] No contexto da presente invenção, foi desenvolvido um imunoteste com base em esferas multiplex para detecção rápida e simultânea de anticorpos para arbovírus em fluidos biológicos.
[0545] O sistema é baseado na tecnologia xMAP (Luminex Corporation) e utiliza uma mistura de microesferas revestidas com antígeno como reagentes de captura para imunoglobulinas humanas específicas. Conjuntos distintos de microesferas (Magplex, Luminex Coporation) foram acoplados a proteínas de fusão AGT purificadas, nomeadamente as proteínas recombinantes virais marcadas com SNAP: sSNAP-DV1.EDIII, sSNAP- DV2.EDIII, sSNAP-DV3.EDIII, sSNAP-DV4.EDIII, sSNAP-WN.EDIII, sSNAP- JE.EDIII, sSNAP-USU.EDIII, sSNAP-TBE.EDIII, sSNAP-YF.EDIII, sSNAP- MVE.EDIII, sSNAP-Rocio.EDIII, sSNAP-WSL.EDIII, sSNAP-ZIKA.EDIII, SNAP-DV1ectoM, sSNAP-N.RVF, sSNAP-N.TOS e CHIK.sE2-SNAP. Antígenos recombinantes foram acoplados covalentemente à superfície de microesferas de carboxila utilizando um substrato da proteína AGT como ligante (BG-PEG-NH2, New England Biolabs), de forma a aumentar a eficiência de captura de anticorpos em comparação com procedimentos de acoplamento de amina padrão.
[0546] Validação técnica utilizando anticorpos antimarca SNAP e anticorpos monoclonais de camundongos específicos confirmou a eficiência de acoplamento e demonstrou estabilidade do antígeno a longo prazo (até seis meses). O presente pedido não é limitado a antígenos virais, pois qualquer peptídeo ou polipeptídeo pode ser utilizado para revestimento de esferas e captura de anticorpos subsequente. 1. MATERIAIS E MÉTODOS: 1. São utilizados os tampões e soluções a seguir: a. Tampão PBS: 100 ml de 10X PBS, pH 7,4 em 1 l de H2O estéril. b. Tampão de acoplamento SNAP (PBS-DTT): 100 ml de 10 X PBS, pH 7,4, 0,5 ml de Tween 20 a 10% e 1 ml de 1,0 M de DTT em 1 l de H2O estéril. c. Tampão de teste/bloqueio (PBS-B): PBS, 1% de BSA, pH 7,4 em 1 l de H2O estéril. d. Tampão de armazenagem (PBS-TBN): 100 ml de 10 X PBS, 1 g de BSA, 2 ml de Tween 20 a 10%, 500 mg de azida de sódio e 1 ml de 1,0 M de DTT em 1 l de H2O estéril. e. Solução de substrato (4 mg/ml): 2 mg de BG-PEG-NH2, DMSO 500 μl. f. Solução de ativação (EDAC/SNHS): 50 mg/ml de solução de EDAC ou 50 mg/ml de SNSHS em água desilada. 2. Foram utilizados os materiais a seguir: 2.1 Microesferas MagPlex Luminex: MC 100XX-ID (em que XX é a região de fluorescência); XX pode ser, por exemplo, 26, 27, 28, 29, 34, 35, 36, 37, 45, 52, 53, 63 ou 64, conforme mencionado na Figura 7B. 2.2 Substrato hAGT: PEG-BG-NH2 (NEB S9150S).
Figure img0010
2.3 Proteínas de fusão SNAP-EDIII viral:
[0547] A geração de uma proteína de fusão que compreende porções AGT e EDIII viral é bem conhecida dos técnicos no assunto. Todos os processos de síntese conhecidos podem ser utilizados com este propósito, desde que a enzima AGT permaneça ativa na proteína de fusão.
[0548] No caso presente, foi utilizado o SNAP mutante de AGT de SEQ ID N° 2 e foram geradas proteínas de fusão de SNAP e EDIII viral.
[0549] O sistema de expressão indutível de Drosophila S2 (DES, Invitrogen) foi selecionado para produção em massa de EDIII individual de flavivírus em células de invertebrados e foi utilizado o plasmídeo pMT/BiP/V5- HisA da Invitrogen.
[0550] Este plasmídeo contém: - o promotor de metalotioneína pMT; - uma sequência ssBiP de inseto de SEQ ID N° 22; - locais de restrição BglII e AgeI; - o DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma marca His6 localizado abaixo no fluxo do local de restrição AgeI; e - a sequência espaçadora de DNA de SEQ ID N° 26 localizada entre o local de restrição AgeI e o DNA que codifica uma marca His6.
[0551] Os genes sintéticos que codificam o domínio III com comprimento total das proteínas E de flavivírus WN, USU, JE, TBE, DEN-1 to DEN-4, YF, Rocio, MVE, Zika, SLE e WSL encontram-se relacionados em SEQ ID N° 3 até SEQ ID N° 14. As sequências de aminoácidos ED III foram fundidas em quadro ao terminal C da proteína SNAP, com as duas porções separadas por um ligante GGGS (SEQ ID N° 25). As sequências de DNA que codificam SNAP-EDIII foram inseridas no plasmídeo pMT/BiP/V5-marca His (Invitrogen) para gerar os plasmídeos pMT/BiP/SNAP/EDIII/marca His.
[0552] Os plasmídeos resultantes pMT/BiP/SNAP-EDIII-marca His, que podem dirigir a expressão de proteínas de fusão SNAP-EDIII-His6 secretadas, foram cotransfectados com marcador de seleção pCo-Blast em células S2 para gerar a linhagem celular S2/sSNAP-ED III-marca His estável que exibe resistência a blasticidina.
[0553] Linhagens de células S2 estáveis cultivadas em centrifugador (1000 ml) foram estimuladas por dez dias com metal pesado cádmio (Cd2+) e proteínas de meio extracelular foram concentradas e purificadas.
[0554] Observou-se acúmulo de proteína EDIII marcada com SNAP secretada nos sobrenadantes de células S2/SNAP-EDIII-marca His estáveis após dez dias de indução com metal pesado cádmio.
[0555] As proteínas SNAP-DEN1.EDIII de SEQ ID N° 21, SNAP- DEN2.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-DEN3.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP- DEN4.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-WN.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-JE.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-YF.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-MVE.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-Rocio.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-WSL.EDIII de SEQ ID N° X, SNAP-ZIKA.EDIII de SEQ ID N° X e SNAP-SLE.EDIII de SEQ ID N° X foram produzidas adequadamente.
3. PREPARAÇÃO DAS ESFERAS ACOPLADAS A ANTÍGENOS:
[0556] A produção de esferas acopladas a antígenos compreendeu duas etapas: funcionalização de superfícies de microesferas com um derivado de O6-benzilguanina (BG-PEG-amino) e imobilização covalente das proteínas Ags virais-SNAP quiméricas utilizando o BG-PEG-amino como âncora (Figura 1). As superfícies de microesferas de carboxila foram revestidas covalentemente com substrato de BG-PEG-amino utilizando um processo de carbodi-imida em duas etapas otimizado (Wong et al, Journal of Clinical Microbiology 42 (1): 6572, 2004). Em seguida, compostos BG-PEG-amino acoplados foram ligados irreversivelmente às proteínas SNAP-Ags viral quiméricas por meio de transferência do grupo benzila para a cisteína de local ativo da proteína SNAP. Devido à alta especificidade desta reação, a proteína de fusão é exclusivamente acoplada por meio do domínio SNAP, deixando o antígeno viral acessível para interações com anticorpos. 3.1 Em primeiro lugar, as esferas comerciais foram ativadas de acordo com as instruções do fabricante (utilizando as soluções de ativação EDAC e SNHS) e lavadas em tampão PBS. Todas as etapas foram realizadas no escuro, de forma a evitar o resfriamento fluorescente das esferas, de acordo com as instruções do fabricante.
[0557] Cerca de 1,25 x 106 esferas foram utilizadas para cada proesso de acoplamento. 3.2 O substrato de AGT PEG-BG-NH2 na solução de DMSO foi adicionado em seguida por seis horas à temperatura ambiente ou por uma noite a 4 °C sobre as esferas ativadas e lavado em seguida com tampão PBS. 3.3 Os locais carboxílicos não ligados foram bloqueados em seguida com o tampão de bloqueio por trinta minutos à temperatura ambiente e as esferas foram lavadas em seguida com o tampão de acoplamento SNAP. 3.4 Proteínas SNAP-EDIII novamente suspensas no tampão de acoplamento SNAP (1 mg/ml) foram incubadas com as esferas obtidas desta forma por duas horas à temperatura ambiente e lavadas uma vez em seguida com o tampão de acoplamento SNAP e três vezes com o tampão de armazenagem (PBS-TBN).
4. IMUNOTESTES DE FLUORESCÊNCIA DE MICROESFERAS:
[0558] Os conjuntos de esferas, conjugados com diferentes SNAP- Ags vial, foram misturados por meio de turbilhonamento para garantir dispersão total das esferas. Após o ajuste da densidade de esferas a 100 esferas/μl, 25 μl de cada um dos conjuntos de esferas (contendo 2500 microesferas) foram transferidos para uma placa de microtítulos com 96 cavidades (placa com fundo plano Bio-Plex Pro, BioRad) em cavidades separadas para testes uniplex ou misturados nas mesmas cavidades para testes multiplex. As microesferas foram lavadas por três vezes com 100 μl de tampão de lavagem (tampão de lavagem BioPlex, BioRad) utilizando uma estação de lavagem de microplacas para esferas magnéticas (Estação de Lavagem BioPlex Pro, BioRad). As amostras (anticorpos ou soros) foram diluídas em tampão de teste (PBS-BSA) e foram adicionados 50 μl das soluções resultantes às cavidades de teste que contêm as esferas conjugadas. Após incubação no escuro sobre um agitador de placas por trinta minutos, a placa foi lavada como anteriormente. Em seguida, um anticorpo secundário marcado por fluorocromos foi diluído em tampão de teste (PBS-BSA) a 2 μg/ml e 50 μl das soluções resultantes foram adicionados às cavidades de teste que contêm as esferas conjugadas. Após incubação no escuro sobre um agitador de placas por trinta minutos, a placa foi lavada como anteriormente. Por fim, estreptavidina-ficoeritrina (SAPE, Invitrogen Molecular Probes) foi diluída em tampão de teste (PBS-BSA) a 2 μg/ml e 50 μl da solução resultante foram adicionados às placas de microtítulos. A placa foi incubada no escuro sobre um agitador de placas por dez minutos e lavada como anteriormente, antes da nova suspensão do conteúdo das cavidades em 125 μl de tampão de teste. A intensidade de fluorescência média (MFI) do anticorpo de detecção ligado às microesferas individuais foi avaliada a partir da análise de fluxo de 50 microesferas por cavidade utilizando um analisador de fluxo de laser duplo (instrumento BioPlex 200, BioRad). O instrumento de detecção fluorescente é equipado com um primeiro laser para detectar o tipo de esfera e um segundo laser para garantir a quantificação de IgM ou IgG capturado por meio de excitação do fluoroforo (ficoeritrina vermelha) que é conjugado ao anticorpo de detecção específico. 4.1 CONFIRMAÇÃO DE ACOPLAMENTO DE ANTÍGENOS:
[0559] O acoplamento de antígenos foi confirmado por meio de teste das microesferas acopladas a antígenos com diluições de anticorpo policlonal antimarca SNAP de coelho (GenScript). Os imunotestes de fluorescência foram realizados em formato uniplex, conforme descrito acima. Uma série de diluição em duas vezes de anticorpo anti-SNAP que começa a 4000 ng/ml e termina a 3,9 ng/ml foi realizada em PBS-BSA e volumes de cada diluição foram adicionados às cavidades de teste que contêm as esferas. Foi utilizado IgG anticoelho de cabra conjugado a biotina (2 μg/ml em 50 μl de PBS-BSA) como anticorpo secundário para detectar anticorpos anti-SNAP ligados.
[0560] A Figura 2 exibe os resultados de fluorescência observados para a detecção de anticorpo anti-SNAP sobre oito conjuntos diferentes de microesferas acoplados a proteínas de antígenos virais-SNAP quiméricos (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP- WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP-TBE). 4.2 DETECÇÃO DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS:
[0561] A captura e detecção de anticorpos específicos pelas microesferas conjugadas a antígenos foi determinada utilizando anticorpos de camundongos monoclonais purificados (anti-WNV, anti-DV1 e anti-DV2) e soro de camundongo policlonal (anti-DV3, anti-DV4, anti-YF e anti-JE) ou soro humano (anti-DV1). Os imunotestes de fluorescência foram realizados em formato uniplex e multiplex, conforme descrito acima. Uma série de diluição em quatro vezes de anticorpos monoclonais de camundongos purificados que começa em 400 ng/ml e termina em 0,1 ng/ml e de soro humano e de camundongo que começa a 1:25 e termina a 1:102400 foi reaizada em PBS-BSA e volumes de cada diluição foram adicionados às cavidades de teste que contêm as esferas. Foi utilizado IgG anticamundongo de cabra conjugado a biotina (2 μg/ml em 50 μl de PBS-BSA) como anticorpo secundário para detectar anticorpos de camundongos monoclonais e policlonais ligados. Um IgM anti- humano de cabra conjugado a biotina (2 μg/ml em 50 μl de PBS-BSA) ou um IgG anti-humano de cabra conjugado a biotina (2 μg/ml em 50 μl de PBS-BSA) foi utilizado para detectar anticorpos IgM ou IgG ligados em soro humano, respectivamente.
[0562]A Figura 3 compara a sensibilidade do experimento de imunoteste para detecção de anticorpo anti-DV2 monoclonal purificado sobre proteína SNAP-DV2.EDIII quimérica conjugada a microesferas por meio do substrato da proteína hAGT (acoplamento de acordo com a presente invenção) ou acoplada por meio do Kit de Acoplamento de Amina Bio-Plex, BIORAD.
[0563] A Figura 4 compara a sensibilidade do experimento de imunoteste para detecção de anticorpo anti-DV1 monoclonal purificado sobre proteína SNAP-DV1.EDIII quimérica conjugada a microesferas, seja em formato uniplex ou multiplex com outras proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP-TBE) acopladas a microesferas.
[0564] A Figura 5 exibe a reatividade e especificidade do experimento de imunoteste multiplex para detecção de diluições de anticorpo anti-WNV monoclonal purificado sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP- WNV, SNAP-YF, SNAP-JE e SNAP-TBE) acopladas a microesferas.
[0565] A Figura 6 exibe a reatividade e a especificidade de detecção de IgG anti-DV3 em soro policlonal de camundongo contra a detecção de IgG anti-YF e DV3 (A) em soro policlonal de camundongo contra YF (B) em imunotestes multiplex sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP- DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE e SNAP-ZIKA) acopladas a microesferas.
[0566] A Figura 7 exibe a reatividade e a especificidade de detecção de IgM anti-DV1 (A) e detecção de IgG anti-DV1 (B) em soro infectado por DV1 de pacientes humanos em imunotestes multiplex sobre proteínas Ags virais de SNAP quiméricas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP- WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE e SNAP-ZIKA) acopladas a microesferas.
II. RESULTADOS:
[0567] O sistema de acordo com a presente invenção utiliza uma mistura de microesferas Magplex revestidas com antígeno (Luminex Corporation) como reagentes de captura para imunoglobulinas humanas específicas. Cada conjunto de microesferas codificadas internamente por cores foi acoplado a um antígeno recombinante específico e misturado com outros tipos de microesferas em um pequeno volume de amostra. O poder deste sistema reside no fato de que é possível analisar simultaneamente até cem tipos de microesferas acopladas por cavidade utilizando uma ferramenta de análise de fluxo. O instrumento de detecção fluorescente é equipado com um primeiro laser para detectar o tipo de esfera e um segundo laser para garantir a quantificação de IgM ou IgG capturado por meio de excitação do fluoroforo (ficoeritrina) conjugado ao anticorpo de detecção específico. Com as suas extensas capacidades multiplex e o limite inferior de detecção, esta abordagem oferece economias substanciais de custo e amostras sobre as medições de ELISA tradicionais.
[0568] Atualmente, dezesseis conjuntos distintos de microesferas foram acoplados a proteínas SNAP-Ags viral quiméricas purificadas, permitindo a titulação de anticorpos de soro específicos para sorotipos de dengue 1 a 4, Oeste do Nilo, febre amarela, encefalite japonesa, encefalite transmitida por percevejos, encefalite de Saint-Louis, encefalite do Vale de Murray, Wesselsbron, Zika, Rocio, Usutu, febre do Vale do Rift e Chikungunya. A produção do sistema é altamente eficaz para seu custo e tempo, pois apenas uma quantidade muito pequena de antígeno recombinante (< 50 μg) é necessária para produzir um conjunto de microesferas acopladas a antígenos (~1,25 x 106 microesferas), suficiente para realizar quinhentos testes individuais. Além disso, os conjuntos selecionados de microesferas são adaptáveis a um sistema de detecção fluorescente barato, compacto e robusto tal como o MagPix (Luminex Corporation).
[0569] A avaliação de acoplamento de antígeno utilizando um anticorpo anti-SNAP (Figura 2) confirmou a eficiência do acoplamento e demonstrou que as quantidades relativas de antígenos ligados são comparáveis entre os diferentes conjuntos de microesferas acopladas. A determinação da detecção e captura de anticorpo utilizando anticorpos de camundongo purificados exibiu captura aprimorada de anticorpos específicos pelas microesferas acopladas a antígenos produzidas em comparação com microesferas acopladas a antígenos obtidas por meio de procedimentos de acoplamento de amina padrão (Figura 3). Além disso, demonstrou-se o baixo limite de detecção do método e confirmou-se que o multiplex não afeta a detecção de anticorpos (Figura 4). Adicionalmente, as microesferas conjugadas a antígenos exibiram estabilidade a longo prazo quando armazenadas a 4 °C (> 6 meses). Por fim, a especificidade de cada conjunto de microesferas acopladas em imunotestes multiplex foi demonstrada para anticorpos monoclonais de camundongo purificados (Figura 5), para anticorpos IgG em soro de camundongo policlonal (Figura 6A-B) e para anticorpos IgM e IgG em soros policlonais de seres humanos infectados (Figura 7).
[0570] Com as suas extensas capacidades multiplex (até cem tipos de microesferas acopladas por cavidade) e limite de detecção mais baixo, esta abordagem oferece economias substanciais de custo e amostras sobre as medições de ELISA tradicionais.
III. GERAÇÃO DE UMA PROTEÍNA DE FUSÃO QUE COMPREENDE SNAP E A NUCLEOPROTEÍNA N DO VÍRUS SCHMALLENBERG: 1. CONSTRUÇÃO DOS VETORES QUE CODIFICAM A PROTEÍNA DE FUSÃO SNAP- SBV.N:
[0571] A proteína de fusão quimérica que compreende SNAP e a nucleoproteína N do vírus Schmallenberg foi obtida conforme segue:
[0572] Em uma primeira etapa, a sequência do quadro de leitura aberta do segmento S que codifica a nucleoproteína N e a proteína NSs da linhagem BH80/11-4 sofreu mutação por meio da inserção de um local de restrição EcoRV no seu terminal 5’ e um local de restrição XmaI no seu terminal 3’. Além disso, o local de restrição EcoRV interno foi removido por meio de mutação do nucleotídeo 294T em 294A. Essa sequência que sofreu mutação é exibida em SEQ ID N° 17.
[0573] Essa sequência que sofreu mutação foi inserida em seguida nos locais de restrição EcoRV e XmaI do conjunto pDeSNAP Univ de SEQ ID N° 34, gerando o conjunto de DNA “pDeSNAP Univ/SBV.N” de SEQ ID N° 36.
[0574] O chamado conjunto de DNA “pDeSNAP Univ/SBV.N” (vide Figura 9 e SEQ ID N° 36): - a sequência similar a BiP de inseto de SEQ ID N° 23; - a sequência similar a SNAP de SEQ ID N° 31; - uma primeira sequência de DNA de SEQ ID N° 26 que codifica a sequência espaçadora GGGS (SEQ ID N° 25); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 29 que codifica um local de divisão pró-TEV1 da sequência ENLYFQS (SEQ ID N° 32); - a sequência de DNA SBV.N SEQ ID N° 17 (que corresponde à sequência SBV.N natural, na qual o local EcoRV interno foi excluído e dois locais EcoRV e XmaI foram adicionados nas extremidades); - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 30 que codifica um local de divisão pró-TEV2 da sequência ENLYFQG (SEQ ID N° 33); e - uma sequência de DNA de SEQ ID N° 28 que codifica uma sequência de marca His.
[0575] Observe-se que este conjunto compreende adicionalmente um local NheI acima no fluxo do ATG, um local BglII entre a sequência similar a BiP e a sequência similar a SNAP, um local AgeI e um local HindIII que estão ambos localizados abaixo no fluxo do códon de parada.
[0576] A sequência compreendida entre os locais de restrição BglII e AgeI do conjunto pDeSNAPUniv/SBV.N (vide a Figura 9) foi extirpada por meio de digestão enzimática e clonada em seguida no plasmídeo pMT/BiP/V5-A (Invitrogen) para gerar o vetor pMT/BiP/SNAP-SBV.N. Este vetor foi utilizado para gerar células S2 estáveis que secretam a proteína de fusão SNAP-SBV.N.
[0577] A sequência compreendida entre os locais de restrição NheI e NotI do conjunto pDeSNAPUniv/SBV.N é clonada em seguida no plasmídeo pcDNA3 (Invitrogen) para gerar o vetor pcDNA3/SNAP-SBV.N. Este vetor é utilizado em seguida para gerar células de mamíferos estáveis que secretam a proteína de fusão SNAP-SBV.N. 2. PRODUÇÃO DA PROTEÍNA DE FUSÃO SNAP-SBV.N:
[0578] Os plasmídeos resultantes pMT/BiP/SNAP-SBV.N que permitem a produção de proteínas SBV.N marcadas por SNAP na forma de proteínas de fusão secretadas foram cotransfectados com marcador de seleção pCo-Blast em células S2 para gerar a linhagem celular S2/SNAP-SBV.N estável que exibe resistência a blasticidina.
[0579] Esta linhagem celular foi depositada na Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) do Institut Pasteur, 25, rue du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, com o número CNCM I-4616.
[0580] Linhagens de células S2 estáveis cultivadas em centrifugador (1000 ml) foram estimuladas por dez dias com metal pesado cádmio (Cd2+).
[0581] Observou-se acúmulo de proteína SNAP-SBV.N secretada nos sobrenadantes de células S2/SNAP-SBV.N após dez dias de indução com metal pesado cádmio.
[0582] 0,01 ml de 4 ml de sobrenadante de células S2/SNAP-SBV.N induzidas por dez dias com Cd2+ foram testados por meio de teste de imunomanchas utilizando anticorpo antimarca His (diluição 1:1.000) (vide a Figura 10).
[0583] A proteína quimérica SNAP-SBV.N foi comparada com quantidades definidas da proteína quimérica SNAP-TOS.N (correspondente à proteína de fusão que compreende SNAP e a nucleoproteína N do vírus Toscana, que é um flebovírus).
[0584] A produção de SNAP-SBV.N purificado a partir de células S2/SNAP+SBV.N induzidas por dez dias é de 18 mg por litro de cultivo celular (Fig. 10B). Referências bibliográficas: Avrameas, S., Immunol. Today, maio de 1992; 12 (5): 154-9. Zimmerman, C. W., Electrophoresis, junho de 1995; 16 (6): 941-7. Kim, H-J., The Journal of Veterinary Medical Science, 2011. Damoiseaux et al, ChemBiochem. 4:285-287, 2001 Xu-Welliver et al, Biochemical Pharmacology 58: 1279-85, 1999. Lim, A. et al, EMBO J. 15: 4050-4060, 1996. Daniels, D. S. et al, EMBO J. 19: 1719-1730, 2000; Juillerat, A. et al, Chemistry & Biology, vol. 10, 313-317, 2003. Wong et al, Journal of Clinical Microbiology 42, n° 1 (janeiro de 2004): 65-72. Wibley, J. E. A. et al, 2000. Felgner et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 84: 7413-7417 (1987). Mackey et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 85: 8027-8031 (1988). Wu et al, J. Biol. Chem., 267: 963-967, 1992. Wu e Wu, J. Biol. Chem., 263: 14621-14624, 1988. Williams et al, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 88: 2726-2730 (1991). Kolpe, A. B. et al, Virus Research 2012; 168: 64-72. Pan, W. et al, The Journal of Immunology, 2004, 172: 6167-6174. Sivakolundu, S. et al, Journal of Medical Microbiology, 2012.

Claims (15)

1. MÉTODO DE TESTE IN VITRO, para detecção de pelo menos dois anticorpos alvo em uma amostra biológica, caracterizado por compreender: (a) contato de um primeiro suporte sólido compreendendo um substrato AGT covalentemente acoplado a uma primeira proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA e um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo com a amostra biológica, em que o mencionado substrato AGT é também covalentemente acoplado ao mencionado primeiro suporte sólido; (b) contato de um segundo suporte sólido compreendendo um substrato AGT covalentemente acoplado a uma segunda proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA e um segundo epítopo que é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo com a amostra biológica, em que o mencionado substrato AGT é também covalentemente acoplado ao mencionado segundo suporte sólido; e (c) detecção da presença ou ausência dos pelo menos dois anticorpos alvo.
2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser utilizado para detectar pelo menos 5 anticorpos alvo em uma amostra biológica de paciente.
3. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo mencionado substrato do mencionado polipeptídeo AGT ser um derivado de O6 benzil guanina que possui a fórmula I: R1-X-CH2-R3-R4-Y em que: - R1 é um grupo heteroaromático que contém de um a cinco átomos de nitrogênio, - X é um átomo de oxigênio ou enxofre; - R3 é um grupo aromático ou heteroaromático ou um grupo alquila, cicloalquila ou heterociclila insaturado opcionalmente substituído com a ligação dupla conectada a CH2; - R4 é uma porção ligante; e - Y é um grupo reativo.
4. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelos mencionados suportes sólidos poderem ser especificamente identificados pelo seu local, tamanho, diâmetro, peso, granulometria e/ou marcação específica.
5. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelos mencionados suportes sólidos serem marcados com fluorocromo, cromóforo, radioisótopo e/ou uma marca de massa (mass tag).
6. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelos mencionados suportes sólidos serem micropartículas.
7. MÉTODO, de acordo com qualquer uma das reivindicações (I) a 6, caracterizado pelo primeiro e pelo segundo suporte sólido serem obtidos por acoplamento covalente de polipeptídeo AGT compreendido na proteína de fusão, a um primeiro e um segundo suporte sólido funcionalizado, por realizar um método que compreende as seguintes etapas: (II) ativação de cada um dos mencionados suportes sólidos funcionalizados; (III) adição de um substrato do mencionado polipeptídeo AGT, em que o mencionado substrato é suspenso em tampão que contém de 0 a 20% de DMSO, em condições apropriadas para que o substrato seja ligado covalentemente ao mencionado suporte; e (IV) ) contato do mencionado polipeptídeo AGT com cada um dos suportes revestidos de substrato da etapa (b) em tampão PBS/DTT, em que moléculas não ligadas são lavadas após as etapas (ii) e (iii).
8. KIT DE DETECÇÃO, de pelo menos dois anticorpos alvo diferentes em uma amostra biológica, caracterizado por compreender: (a) um primeiro suporte sólido compreendendo um substrato AGT covalentemente acoplado a uma primeira proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA e um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo, e em que o mencionado substrato AGT é também covalentemente acoplado ao mencionado primeiro suporte sólido; e (b) um segundo suporte sólido compreendendo um substrato AGT covalentemente acoplado a uma segunda proteína de fusão compreendendo um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA e um segundo epítopo que é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo, em que o mencionado substrato AGT é também covalentemente acoplado ao mencionado primeiro suporte sólido; em que os ditos suportes sólidos são misturados em pelo menos um compartimento único.
9. KIT, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender pelo menos 10 suportes sólidos acoplados de forma diferente.
10. USO DO KIT, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado por ser para detectar pelo menos dois anticorpos alvo em uma amostra biológica de paciente.
11. MÉTODO IN VITRO DE DIAGNÓSTICO, de pelo menos uma doença alvo em pacientes, em que a mencionada doença alvo é conhecida por induzir a síntese de pelo menos dois anticorpos alvo no mencionado paciente, caracterizado por compreender a realização do método de teste, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que o mencionado paciente é diagnosticado como sofrendo da mencionada pelo menos uma doença alvo se a quantidade do mencionado pelo menos dois anticorpos alvo for mais alta que um valor controle.
12. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por ser utilizado para diagnosticar pelo menos 5 infecções virais no mencionado paciente.
13. MÉTODO DE FABRICAÇÃO DE KIT, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 9, caracterizado por compreender as etapas de: (a) fornecimento de pelo menos uma primeira proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um primeiro epítopo que é reconhecido por um primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA; (b) contato da mencionada primeira proteína de fusão com um primeiro suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; (c) obtenção de um primeiro suporte sólido acoplado covalentemente a um primeiro epítopo que é reconhecido pelo primeiro anticorpo alvo; (d) fornecimento de pelo menos uma segunda proteína de fusão que compreende: - um polipeptídeo que compreende um segundo epítopo, em que o mencionado segundo epítopo é reconhecido por um segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; e - um polipeptídeo AGT que possui atividade de alquiltransferase de O6-alquilguanina-DNA; (e) contato da mencionada segunda proteína de fusão com um segundo suporte sólido, em que o mencionado suporte é acoplado covalentemente a um substrato do mencionado polipeptídeo AGT; e (f) obtenção de um segundo suporte sólido acoplado covalentemente a um segundo epítopo que é reconhecido pelo segundo anticorpo alvo, mas não pelo mencionado primeiro anticorpo alvo; em que os mencionados pelo menos primeiro e pelo menos segundo suportes sólidos podem ser especificamente identificados entre si.
14. TESTE DE IMUNOSSELEÇÃO MULTIPLEX, caracterizado por compreender pelo menos 2, 25, 50 ou 96 suportes sólidos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 ou 13, e em que cada um dos mencionados suportes sólidos emite um comprimento de onda diferente e diferenciável após excitação.
15. TESTE, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por compreender: (a) contato de uma ou mais amostras biológicas com pelo menos 2, 25, 50 ou 96 suportes sólidos, conforme definidos em qualquer uma das reivindicações 1 ou 13, e em que cada um dos suportes sólidos emite um comprimento de onda diferente e diferenciável após excitação; e (b) detecção da presença ou ausência de anticorpos alvo.
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