CN105368873A - 一种表达施马伦贝格病毒重组n基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用 - Google Patents

一种表达施马伦贝格病毒重组n基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用 Download PDF

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Abstract

一种表达施马伦贝格病毒重组N基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用，参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB，等等。本发明的有益效果为，开展了SBV核蛋白在昆虫细胞上的表达，最终通过蛋白电泳、免疫印迹的方法表明实验获得了具有生物活性的SBVN蛋白，准确地鉴定了Vbacmid-SBV-N杆状病毒。

Description

一种表达施马伦贝格病毒重组N基因杆状病毒的制备、鉴定方法以及应用
技术领域
本发明属于一种杆状病毒的制备、鉴定及其应用技术领域，具体为一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的制备、鉴定及其应用技术领域。
背景技术
施马伦贝格病毒英文缩写：SBV，施马伦贝格病毒病是一种新发的、流行于欧洲的动物传染病。SBV可引起牛、山羊、绵羊、野牛等动物发病，主要通过库蠓传播，也可通过胎盘垂直传播。主要的临床症状表现为发热、腹泻、乏力、死胎、畸形胎、产奶量下降、新生幼畜先天缺陷等临床症状。SBV严重影响牲畜生产性能，危害畜牧业发展。欧洲是我国种畜引进及畜产品进口的主要来源地区之一。鉴于SBV可能对我国畜牧业带来的巨大经济损失，研究该病毒的检测方法具有重要意义。
发明内容
本发明通过将SBVN基因重组于昆虫杆状病毒表达载体基因中，并将其在昆虫细胞中成功表达。表达蛋白的获得为该病毒相应检测方法的研究奠定了物质基础。
本发明中Vbacmid-SBV-N杆状病毒指的是表达施马伦贝格病毒N蛋白的杆状病毒。
本发明采用如下技术方案实现。
一种制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒方法，步骤如下：
1)参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；
2)将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB；
3)以步骤2得到的质粒转化DH10Bac感受态细胞，得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N；
4)将步骤3得到的重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞，得到Vbacmid-SBV-N的杆状病毒。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的鉴定方法，步骤为，取Vbacmid-SBV-N杆状病毒，按1:1～1:10的比例感染Sf9昆虫细胞，27℃培养96h～120h后，取培养的病毒上清液，通过SDS-PAGE方法进行病毒鉴定：使用Bio-Radmini电泳仪，参照Bio-Radmini电泳仪操作手册说明书，对培养的病毒上清液进行SDS-PAGE电泳，同时做两块凝胶，一块用于染色分析，另一块用于Westernblot分析。SDS-PAGE电泳后，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
通过SDS-PAGE方法进行病毒表达特征蛋白鉴定后，再通过Westernblot方法对病毒表达特征蛋白进行鉴定：用Bio-Rad转膜仪将SDS-PAGE凝胶电泳的各蛋白条带转移至固相载体硝酸纤维素膜上，以抗SBV核蛋白的单克隆抗体1F2(1:1000倍稀释)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀释)为二抗做Westernblot分析，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物，SBVF：5′-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3′；SBVR：5′-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3′。
一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物的酶切位点，SBVF的酶切位点为GGATCC；SBVR的酶切位点为CTGCAG。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒稳定表达SBV的核蛋白：N蛋白。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒与抗SBVN蛋白的单克隆抗体存在免疫学反应。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中酶联免疫吸附试剂制备中的包被用抗原。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中，胶体金试纸条制备中的金标物质。
本发明的有益效果为，发明人基于昆虫杆状病毒表达***优于原核表达***的优点——表达外源蛋白时具有完备的翻译后加工修饰能力，开展了SBV核蛋白在昆虫细胞上的表达。在表达SBV蛋白的过程中，发明人为了控制转染过程中试剂、操作等因素造成的误差，在转染时，以实验室前期构建的Bacmid-GFP作为阳性对照，转染后通过观察绿色荧光蛋白的表达证明转染过程的可靠性，最终发明人通过蛋白电泳、免疫印迹的方法表明实验获得了具有生物活性的SBVN蛋白，准确地鉴定了Vbacmid-SBV-N杆状病毒。
下面就附图和具体实施方式对本发明做进一步解释。
附图说明
图1重组质粒SBV-N的PCR扩增图(Fig.1PCRamplificationofrecombinantplasmidSBV-N)
其中：M.DNA标准DL2000；1-4.SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段(M.DNAMarkerDL2000；1-4.PCRproductsofrecombinantplasmidSBV-NwithSBVF/SBVRprimers)；
图2重组质粒pMD18T-SBV-N的PCR扩增图(Fig.2PCRamplificationofrecombinantplasmidpMD18T-SBV-N)
其中：M.DNA标准DL2000；1-2.pMD18T-SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段(M.DNAMarkerDL2000；1-2.PCRproductsofrecombinantplasmidpMD18T-SBV-NwithSBVF/SBVRprimers)；
图3重组质粒pFastBacHTB-SBV-N的酶切鉴定图(Fig.3IdentificationoftherecombinantplasmidofpFastBacHTB-SBV-Nbyenzymedigestion)
其中：M.DNA标准MarkerIV；1.pFastBacHTB-SBV-N经BamⅠ和PstⅠ双酶切(M.DNAMarkerIV；1.RestrictionenzymeidentificationofrecombinantplasmidpFastBacHTB-SBV-NbyBamⅠ&PstⅠ)；
图4重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N的PCR扩增图(Fig.4PCRamplificationofrecombinantshuttleplasmidBacmid-SBV-N)
M.DNA标准DL2000；1-5.Bacmid-SBV-N引物SBVF/SBVR扩增片段
(M.DNAMarkerDL2000；1-5.PCRproductsofrecombinantplasmidBacmid-SBV-NwithSBVF/SBVRprimers)；
图5重组质粒Bacmid-SBV-N的PCR鉴定图(Fig.5IdentificationoftherecombinantplasmidBacmid-SBV-NbyPCR)
其中：M.DNA标准DL10000；1-11.Bacmid-SBV-N用引物M13F和M13R的PCR产物；12.Bacmid用引物M13F和M13R的PCR产物；(M.DNAMarkerDL10000；1-11.PCRproductsofrecombinantplasmidBacmid-SBV-NwithM13FandM13Rprimers；12.PCRproductsofcontrplplasmidBacmidwithM13FandM13Rprimers)；
图6重组蛋白在Sf9昆虫细胞上表达图(10×16)(Fig.6ExpressionofrecombinatproteininSf9cell)其中：(a).正常Sf9细胞；(b).转染Bacmid-PPRV-N杆粒的Sf9细胞；(c)转染Bacmid-GFP24h的Sf9细胞；(d)转染Bacmid-GFP120h的Sf9细胞；(a).normalSf9cells；(b).Sf9cellstransfectedwithBacmid-PPRV-N；(c).Sf9cellstransfectedwithBacmid-GFPfor24h；(d).Sf9cellstransfectedwithBacmid-GFPfor120h；
图7重组蛋白的表达鉴定图(Fig.7Identificationofrecombinantprotein)
其中：M.蛋白预染Marker；1.Vbacmid-SBV-N(原液)；2.Vabcmid-SBV-N(原液)；3.纯化的His-SBV-N蛋白(3倍稀释)；4.纯化的MBP-SBV-N蛋白(3倍稀释)
M.Marker；1.Vbacmid-SBV-Nprotein；2.Vabcmid-SBV-Nprotein；3.PurifiedHis-SBV-Nprotein(3timesdilution)；4.PurifiedMBP-SBV-Nprotein(3timesdilution)
(a).SDS-PAGE；(b).Western-blot。
具体实施方式
一种制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒方法，步骤如下：
1)参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；
2)将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB；
3)以步骤2得到的质粒转化DH10Bac感受态细胞，得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N；
4)将步骤3得到的重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞，得到Vbacmid-SBV-N的杆状病毒。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的鉴定方法，步骤为，取Vbacmid-SBV-N杆状病毒，按1:1～1:10的比例感染Sf9昆虫细胞，27℃培养96h～120h后，取培养的病毒上清液，通过SDS-PAGE方法进行病毒鉴定：使用Bio-Radmini电泳仪，参照Bio-Radmini电泳仪操作手册说明书，对培养的病毒上清液进行SDS-PAGE电泳，同时做两块凝胶，一块用于染色分析，另一块用于Westernblot分析。SDS-PAGE电泳后，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
通过SDS-PAGE方法进行病毒表达特征蛋白鉴定后，再通过Westernblot方法对病毒表达特征蛋白进行鉴定：用Bio-Rad转膜仪将SDS-PAGE凝胶电泳的各蛋白条带转移至固相载体硝酸纤维素膜上，以抗SBV核蛋白的单克隆抗体1F2(1:1000倍稀释)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀释)为二抗做Westernblot分析，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物，SBVF：5′-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3′；SBVR：5′-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3′。
一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物的酶切位点，SBVF的酶切位点为GGATCC；SBVR的酶切位点为CTGCAG。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒稳定表达SBV的核蛋白：N蛋白。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒与抗SBVN蛋白的单克隆抗体存在免疫学反应。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中酶联免疫吸附试剂制备中的包被用抗原。
一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中，胶体金试纸条制备中的金标物质。
实施例：
1材料与方法
1.1菌种、质粒、细胞
SBV-N质粒、针对SBVN蛋白的单抗1F2，原核表达的两种SBVN纯化蛋白(His-SBV-N：带组氨酸标签的融合蛋白His-SBV-N；MBP-SBV-N：带麦芽糖结合蛋白标签的融合蛋白MBP-SBV-N)，在TIANGEN公司购得；pFastBacHTB质粒、Bacmid-GFP、Top10E.coli和DH10BacE.coli菌种及Sf9细胞系在TIANGEN公司购得。
1.2主要试剂
小量凝胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒购自AxyGEN公司；PrimerSTARHSDNAPloymerase、限制性内切酶BamHI和PstI、T4连接酶，LATaq酶、DNAMarker(DL2000、DL10000)购自宝生物工程(大连)有限公司；DNAMarkerIV购自天根生化科技有限公司；蛋白质Marker购自Fermentas公司；胎牛血清(FBS)、Grace’s昆虫细胞培养基、CellfectinII转染试剂盒购自invitrogen公司；乙醇、氯仿、丙三醇、异丙醇等为国产分析纯试剂；EDTA、SDS、β-巯基乙醇等购自上海生物工程公司；营养肉汤和营养琼脂购自中国进出口商品检验技术研究所北京陆桥技术有限责任公司；山羊抗小鼠IgG/辣根酶(HRP)标记购自SouthernBiotech公司；DAB显色试剂购自TIANGEN公司。
1.3引物的设计与合成
根据SBV(GenBank登录号：)碱基序列设计了一对引物用于N基因的扩增和鉴定，SBVF：5′-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3′；SBVR：5′-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3′；下划线分别为BamⅠ和PstⅠ限制性酶切位点，扩增的目的片段长度为722bp。
参照《Bac-to-Bac杆状病毒表达***使用手册》，合成用于鉴定DH10Bac杆粒的通用引物M13Forward：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；M13Reverse：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。引物由宝生物公司合成。
1.4目的基因的扩增
以SBV-N质粒为模板，SBVF/SBVR为引物对SBVN基因进行特异性扩增得到目的片段。
1.5克隆载体pMD18T-SBV-N的构建与鉴定
将扩增得到的目的片段与pMD18-TVector于16℃水浴锅过夜连接，将连接产物转化到Top10感受态细胞后涂板，倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取形态良好的单菌落，进行PCR鉴定，对PCR鉴定为阳性的菌液进行保存。
1.6重组质粒pMD18T-SBV-N与表达载体pFastBacHTB的纯化
将冻存的含有pMD18T-SBV-N质粒的Top10E.coli与含表达载体pFastBacHTB的Top10E.coli复苏后扩大培养，采用AxyGEN公司的小量质粒提取试剂盒提取质粒，于-20℃保存。
1.7重组供体质粒pFastBacHTB-SBV-N的构建与鉴定
将pMD18T-SBV-N质粒与表达载体pFASTbacHTB质粒用限制性内切酶BamⅠ和PstⅠ于37℃进行双酶切，酶切后分别纯化回收，酶切产物用T4DNA连接酶16℃恒温水浴锅连接过夜。将连接产物转化到Top10感受态细胞，涂板，倒置平板于37℃恒温培养箱中过夜培养，挑取形态良好的单菌落，进行PCR鉴定，阳性菌抽提质粒进行双酶切鉴定，并送至宝生物工程(大连)有限公司测序。
1.8重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N的构建与鉴定
重组供体质粒pFastBacHTB-SBV-N转化DH10BacE.coli感受态细胞，涂布于含卡那霉素、四环素、庆大霉素三种抗生素(Gen、Kan、Tet)的营养琼脂(LB)平板上，37℃恒温培养箱中倒置培养48h，挑取形态良好的单菌落，以SBVF/SBVR引物与M13引物进行PCR鉴定。
1.9重组穿梭质粒在昆虫细胞中的表达
参照InvitrogenBac-to-BacBaculovirusExpressionSystem使用说明手册进行转染，将重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N和Bacmid-GFP在脂质体介导下转染对数期生长的Sf9昆虫细胞，其中Bacmid-GFP转染作为阳性对照。28℃细胞培养箱中培养，每隔24h观察一次细胞的生长情况，根据细胞生长情况于96h～120h左右收集细胞培养液，反复冻融细胞3次，3000rpm/min离心10min，上清液即为重组杆状病毒液。经传代得到第二代病毒，用于SDS-PAGE和Westernblot分析，结果为阳性时可以将其分装，冻存作种毒。
1.10重组蛋白的SDS-PAGE鉴定和Westernblot分析
1.10.1SDS-PAGE鉴定
使用Bio-Radmini电泳仪，参照Bio-Radmini电泳仪操作手册说明书，对重组蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，同时做两块凝胶，一块用于染色分析，另一块用于Westernblot分析。剥离出的凝胶先用蒸馏水冲洗，再用考马斯亮兰染色液浸泡凝胶，放在摇床上室温染色1h。染色完成后，用考马斯亮兰脱色液脱色至背景无色透明，自然光下观察电泳结果，参照蛋白质Maker和阴性对照判断目的蛋白是否已经表达，照相记录实验结果。该步骤的鉴定结果为，该杆状病毒是否能表达SBVN蛋白。
1.10.2Westernblot分析鉴定
用Bio-Rad转膜仪将SDS-PAGE凝胶电泳的各蛋白条带转移至固相载体硝酸纤维素膜上，以抗SBV核蛋白的单克隆抗体1F2(1:1000倍稀释)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀释)为二抗做Westernblot分析鉴定。该步骤的鉴定结果为，该蛋白具有生物学活性或否。
2实验结果
2.1目的基因的扩增
用引物SBVF/SBVR对SBV-N质粒进行扩增，在722bp处出现单一条带(图1)，证明获得克隆所需的目的基因片段。
2.2克隆载体pMD18T-SBV-N的鉴定
重组质粒pMD18T-SBN-N用引物SBVF/SBVR进行PCR初步鉴定，扩增产物为722bp(图2)，与理论值相符。
2.3重组供体质粒pFastBacHTB-SBV-N的鉴定
重组质粒pFastBacHTB-SBV-N经BamⅠ和PstⅠ双酶切可以切出722bp的SBVN目的基因条带(图3)，大小与预期结果相符，进一步测序结果证实***的外源目的片段大小及阅读框架正确，证明已成功构建了重组供体质粒pFastBacHTB-SBV-N。
2.4重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N的PCR鉴定
pFastBacHTB-SBV-N转入DH10Bac感受态细胞后，经Gen、Kan、Tet3种抗生素平皿筛选后，提取其DNA，用引物SBVF/SBVR进行PCR鉴定，扩增产物为722bp(图4)，同时用M13正向和反向引物进行PCR鉴定，扩增产物为3152bp，未转化质粒的DH10Bac菌株扩增出300bp的目的条带(图5)，该结果证明目的片段已经转座到Bacmid，重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N构建成功。
2.5重组蛋白在昆虫细胞中的表达
提取转座杆粒DNA，在脂质体介导下转染对数期生长的转染Sf9昆虫细胞，同时以表达绿色荧光蛋白的Bacmid-GFP作为转染时的阳性对照，28℃培养48h左右在倒置显微镜下可见细胞病变，与正常细胞相比，转染细胞变大、变圆(图6(a)和(b))。转染Bacmid-GFP的昆虫细胞24h看到的荧光蛋白(图6(c))，转染后120h，表达荧光蛋白的细胞达80％以上(图6(d))，根据荧光蛋白的表达情况，可估计最佳的病毒收获时间。
2.6重组蛋白的表达鉴定
将重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N和阳性对照Bacmid-GFP转染对数期生长的sf9昆虫细胞，于28℃细胞培养箱中培养96h～120h左右收集细胞培养液作为种毒。经传代得到的第二代病毒(Vbacmid-SBV-N)鉴定SBV核蛋白的表达。SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果均表明，重组蛋白成功表达(图7(a,b))。

Claims (9)

1.一种制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒方法，其特征在于，步骤如下：
1)参照NCBI上公布的施马伦贝格病毒：SBV的N基因开放阅读框序列设计了一对含特异性酶切位点的引物，扩增SBVN基因；
2)将扩增的SBVN基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB；
3)以步骤2得到的质粒转化DH10Bac感受态细胞，得到重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N；
4)将步骤3得到的重组穿梭质粒Bacmid-SBV-N在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞，得到Vbacmid-SBV-N的杆状病毒。
2.一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的鉴定方法，其特征在于，取Vbacmid-SBV-N杆状病毒，按1:1～1:10的比例感染Sf9昆虫细胞，27℃培养96h～120h后，取培养的病毒上清液，通过SDS-PAGE方法进行病毒鉴定：使用Bio-Radmini电泳仪，参照Bio-Radmini电泳仪操作手册说明书，对培养的病毒上清液进行SDS-PAGE电泳，同时做两块凝胶，一块用于染色分析，另一块用于Westernblot分析；SDS-PAGE电泳后，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
3.根据权利要求2所述的一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的鉴定方法，其特征在于，通过SDS-PAGE方法进行病毒表达特征蛋白鉴定后，再通过Westernblot方法对病毒表达特征蛋白进行鉴定：用Bio-Rad转膜仪将SDS-PAGE凝胶电泳的各蛋白条带转移至固相载体硝酸纤维素膜上，以抗SBV核蛋白的单克隆抗体1F2(1:1000倍稀释)为一抗，羊抗鼠IgG-HRP(1:3000倍稀释)为二抗做Westernblot分析，蛋白质分子量在29.6KD处出现一条特征性的条带。
4.一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物，其特征在于，SBVF：5′-TTAGGATCCATGTCAAGCCAATTCA-3′；SBVR：5′-ATTCTGCAGCGTTAGATGTTGATACCGA-3′。
5.根据权利要求4所述的一对制备Vbacmid-SBV-N杆状病毒使用的引物的酶切位点，其特征在于，SBVF的酶切位点为GGATCC；SBVR的酶切位点为CTGCAG。
6.一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用，其特征在于，该应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒稳定表达SBV的核蛋白：N蛋白。
7.一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用，其特征在于，该应用为，Vbacmid-SBV-N杆状病毒与抗SBVN蛋白的单克隆抗体存在免疫学反应。
8.一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用，其特征在于，该应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中酶联免疫吸附试剂制备中的包被用抗原。
9.一种Vbacmid-SBV-N杆状病毒的应用，其特征在于，该应用为，利用Vbacmid-SBV-N杆状病毒表达的SBV核蛋白，作为SBV抗体检测中，胶体金试纸条制备中的金标物质。
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