CN107102144A - 快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 - Google Patents

快速检测寨卡病毒ns1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法，试纸条包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸且它们依次搭接；结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；包被膜的检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，质控区包被有鸡IgY抗体。制作方法包括步骤:荧光微球的清洗与活化、荧光微球标记抗体的制备、荧光标记抗体结合垫的制备、包被膜的制备、纸条的组装，本发明制作的试纸条可快速、特异、精准检测寨卡病毒NS1蛋白，实现现场快速定量检测。

Description

快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其 制作方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种病毒的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法，尤其涉及一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条及其制作方法。
背景技术
寨卡病毒(Zika Virμs)属于黄病毒科(Flaviviridae)、黄病毒属(Flavivirμsgenμs)，是一种主要由伊蚊传播的虫媒病毒。该病毒于1947年在乌干达首次发现，此后多年持续发现散在病例或发生小规模疫情。但自2015年以来，由寨卡病毒引起的人类感染不断发生，美洲、西太平洋、非洲及亚洲已累计有32个国家和地区报告寨卡病毒在本地传播。
目前，寨卡病毒主要是通过荧光PCR法，通过对血液和尿液进行病毒核酸的检测。该方法检测成本较高，耗时较长且对检测人员有一定的资质要求，很难应用于大规模人群快速筛查和既往感染史的调查研究，因此，能否快速精准的检测该病毒是控制疫情的关键因素。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种快速、特异、精准检测的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，可实现现场快速定量检测。
本发明进一步要解决的技术问题是提供一种工艺简单、易操作的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，且所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸依次搭接；
所述结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜包含检测区和质控区，所述检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区包被有鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫为玻璃纤维材料，经Tris盐溶液浸泡处理后热烘干处理后裁切制成；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫为奥斯龙8964玻纤材料，并通过含有5％糖和2％吐温的Tris溶液浸泡后烘干处理并裁剪而成。
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
A、.荧光微球的清洗与活化：将荧光微球水洗离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用；
B、荧光微球标记抗体的制备：向步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用含1％BSA的TBST溶液重悬，超声混匀，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体悬液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
C、荧光标记抗体结合垫的制备：将步骤B得到两种荧光微球标记抗体混合并使用含15％糖的TBST溶液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤A的荧光微球的清洗与活化步骤为：将荧光微球水洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，使得溶液浓度为10mg/ml；再依次加入浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀并离心处理，弃上清液，用20～50mMpH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤B的荧光微球标记抗体的制备步骤为：在步骤A得到的荧光微球悬液中，逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使悬液中抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液复容，得到终浓度为0.1～2mg/ml的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体工作液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法中，优选所述步骤D的包被膜的制备步骤为：分别将一种与荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别用1～10mM的PBS溶液调节终浓度至0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
NS1蛋白属于寨卡病毒非结构蛋白，该蛋白的表面电荷分布于其他黄热病毒显著不同，检测该蛋白能较大可能避免登革热和其他黄热病毒带来的干扰。NS1蛋白在发病初期就能被检出，可用于早期诊断，有利于病人的隔离治疗，较大程度的遏制疫情爆发。本发明所述的寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条，是利用不同粒径的荧光微球上的羧基、醛基、羟甲基等基团共价偶联抗体上，样本经过样品垫前处理后流经结合垫时，样本中的寨卡NS1蛋白与结合垫上的抗体结合，在层析作用下移动至硝酸纤维素膜，被检测区的另一寨卡NS1蛋白抗体捕获形成三明治结构的抗体-抗原-抗体复合物并聚集在检测区域，当荧光微球受到光源激发并释放出其特定波长的发射光，通过荧光检测***将收集到的光信号转化为数字信号，从而可快速精准的测定样本中寨卡NS1蛋白的含量。
本发明首次将寨卡NS1抗体与荧光定量微球结合，可快速、特异、精准的检测出寨卡NS1蛋白的含量，相对于免疫胶体金等检测方法具有更灵敏、更准确、更稳定的优点，可以对待测样品实现快速、超敏、准确的现场检测，并且提供定量的检测结果。本发明检测物质为寨卡病毒NS1蛋白，该蛋白在人感染初期便可被检测出来，而人抗寨卡病毒IgG和IgM抗体的检测则需要感染后7天，本发明具有更早检测寨卡病毒的优势。另外，本发明检测人血清寨卡病毒NS1蛋白的灵敏度为0.1ng/ml，该灵敏度为其他方法如胶体金不能达到，为寨卡病毒的精准研究提供更好的支持。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1是本发明实施例1的结构示意图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图详细说明本发明的具体实施方式。
实施例1、如图1所示，一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，包括底板5，所述底板5上依次设有样品垫1、结合垫2、包被膜3和吸水纸4，且所述样品垫1、结合垫2、包被膜3和吸水纸4依次搭接；所述结合垫2上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜3包含检测区T和质控区C，所述检测区T包被有与结合垫2上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区C包被有鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条中，优选所述样品垫为玻璃纤维材料，经Tris盐溶液浸泡处理后热烘干处理后裁切制成；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述结合垫为奥斯龙8964玻纤材料，并通过含有5％糖和2％吐温的Tris溶液浸泡后烘干处理并裁剪而成。
一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
A、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球水洗离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用；具体为将荧光微球清洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声混匀，使得溶液浓度为10mg/ml；再依次加入终浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀并离心处理，弃上清液，用20～50mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀得到荧光微球悬液备用。
B、荧光微球标记抗体的制备：在步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。具体为在步骤A得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，使抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到终浓度为0.1～2mg/ml的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体工作液或荧光微球标记的羊抗鸡抗体工作液。
C、荧光标记抗体结合垫的制备：将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并使用含15％糖的TBST溶液稀释，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；具体为：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1～10mM的PBS溶液调节浓度至0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；具体为：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度45～50℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5～1.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10～20μg/cm2。
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
本发明采用以下具体实施例来详细说明本发明：
实施例2、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为500nm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为470nm、525nm。将荧光微球悬液12000×g离心处理10min，去除上清后沉淀物用20mM pH5.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，再超生波100W处理50s，使荧光微球悬液的浓度为10mg/ml，依次加入50μl的浓度100mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀15min后，12000×g离心20min，弃除上清后用20mM pH5.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为0.1mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1后12000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为0.1mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体；
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为0.1mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后12000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1后12000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为0.1mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：1的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以0.2μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1mM的PBS溶液调节终浓度至0.5mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5mm，在湿度<20％、温度45℃的环境中热烘干36h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度45℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂0.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接2mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条。
在本实施例中，结合垫上的是Merck生产的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白抗体和羊抗鸡抗体，荧光微球粒径为500nm，荧光微球的激发光和发射光波长分别为470nm、525nm。包被膜检测区域T处包被为另一株寨卡NS1蛋白抗体。鼠IgG用于消除样本中的人抗鼠IgG，防止其对T、C区域测试的影响。
实施例3、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为0.2μm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为400nm、750nm。荧光微球悬液12000×g离心20min，去除上清后沉淀物用20mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，超生波300W处理20s，使荧光微球终浓度为10mg/ml，依次加入100μl的50mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，置于旋转混匀仪，室温混匀30min后15000×g离心10min，弃除上清后用50mM pH6.5的吗啉乙磺酸溶液溶重悬，重复清洗一次后超声复容备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)、逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为2.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后15000×g离心清洗1次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应2h后15000×g离心清洗2次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为2mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体；
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为2.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应3h后15000×g离心清洗1次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应2h后15000×g离心清洗2次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为2mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：200的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以0.5μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用10mM的PBS溶液调节浓度至2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔8mm,在湿度<20％、温度50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度50℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.5mg/ml的鼠IgG，喷涂量为10μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接3mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条.
实施例4、一种荧光定量检测寨卡NS1蛋白免疫层析试纸条的制作方法，包括以下步骤：
1.荧光微球的清洗与活化：
选用粒径为0.2μm的荧光微球，荧光微球的激发光和发射光波长分别为400nm、750nm。荧光微球悬液14000×g离心15min，去除上清后沉淀物用30mM pH6.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，超生波200W处理40s，使荧光微球终浓度为10mg/ml，加入70μl的80mg/ml碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺，置于旋转混匀仪，室温混匀20min后14000×g离心15min，弃除上清后用40mM pH6.0的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用。
2.荧光微球标记抗体的制备
1)、逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体，使抗体终浓度为1.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应2.5h后14000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1.5h后13000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为1mg/ml，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
2)逐滴加入羊抗鸡抗体抗体，使抗体终浓度为1.0mg/ml，混匀后室温置于旋转混匀仪上反应2.5h后14000×g离心清洗2次，沉淀用5％BSA的PBS溶液重悬后室温旋转反应1.5h后13000×g离心清洗1次，用1％BSA的TBST溶液重悬，使抗体终浓度为1mg/ml，得到荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
3.荧光标记抗体结合垫的制备
将步骤B得到的两种荧光微球标记抗体混合并按照1：100的稀释比例，使用含15％糖的TBST溶液稀释，以1.0μg/cm2的用量将稀释后的溶液喷涂在结合垫上，热烘24h后置于湿度<30％的环境中储存备用。
4.包被膜的制备
分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用1～10mM的PBS溶液调节浓度至1.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm,在湿度<20％、温度47℃的环境中热烘干35h后置于湿度<30％的室温下备用。
5.样品垫的制备：将玻璃纤维裁切成30cm×20mm的条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后置于湿度<20％，温度47℃的环境中烘干，烘干后上面喷涂1.0mg/ml的鼠IgG，喷涂量为15μg/cm2。
6.试纸条的组装
在PVC底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜、吸水纸，各组分之间互相搭接2.5mm，按照产品要求切割成合适宽度的试纸条。
试验结果检测：
本发明中利用测试荧光定量免疫层析试纸条的荧光定量光谱检测***，该***主要有荧光光源***、检测***和软件分析***组成。试纸条检测区和质控区捕获的荧光微球标记抗体，荧光微球在荧光光源激发光照射下被激发，发射出荧光信号被荧光信号检测***捕获后转换为电信号并通过软件分析***得出测试结果，实现对寨卡NS1蛋白的精确定量。
采用的荧光定量光谱检测***：AFS-100免疫荧光单通道荧光测试仪，该仪器为广州蓝勃生物科技有限公司生产。
一、测试参数建立：
1.校准品配置，使用人阴性血清将Meridian公司zika virus NS1蛋白按照梯度稀释配置成以下浓度校准品：0、0.34、0.68、1.37、2.74、5.47、10.94、21.88、43.76ng/ml；
2.将实施例2-4制作的试纸条其中一种准备好，按照从低到高顺序将校准品依次加样到测试卡，每个浓度加样3张卡，15min上机测试；
3.测试完毕后选定各浓度测试数据，选取拟合算法后生成曲线导入HEX文件并录入ID芯片；
二、检测：
1.样本：由于本地没有临床寨卡病毒样本，本测试采用寨卡病毒样本为使用人阴性血清和Meridian zika virusNS1蛋白混合稀释而成为模拟样本。
2.测试：取模拟样本75μl分别加入到实施例2-4的试纸条的和现有的金标检测寨卡病毒NS1蛋白试纸条的测试孔中，15min后上机测试或观察条带。
同时使用实施例2的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值0.00、0.68、1.37、2.73、5.47、10.94ng/ml的样本。定量检测结果如下表：
表1：实施例2寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果0、0.68、1.37使用定性试纸条测试未出现T条带；2.73、5.47、10.94三个浓度值出现T带。
同时使用实施例3的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值0.46、1.82、7.29、17.58、29.16ng/ml的样本。定量检测结果如下表：
表2：实施例3寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果：0.46、1.82使用定性试纸条测试未出现T条带；7.29、17.58、29.16ng/ml浓度值样本出现T条带。
同时使用实施例4的试纸条和现有的定性试纸条测试以下几个浓度值：0.17、1.23、2.38、8.68、16.78、27.91ng/ml的样本，定量检测结果如下表：
表3：实施例4寨卡病毒NS1蛋白荧光定量试纸条测试结果
定性试纸条测试检测结果：0.17、1.23使用定性试纸条测试未出现T条带；2.38、8.68、16.76、27.91ng/ml浓度值样本出现T条带。
从上述数据可以看出：本发明中所述试纸条，相比于现有PCR检测方法学，具有更灵活便捷、快速的特点，不受操作地点的限制，人员要求低，更适用于区域性疫情的监控研究。本发明中所述的试纸条，只需少量样本，15min内即可显示结果，配套仪器轻便便捷，可手持式，可与疾控、边检、医院直接网络连接，无需人工数据录入，数据处理分析更便捷。同样，本发明与现有市场上金标检测人抗寨卡病毒IgG/IgM试纸条相比，本发明检测物质为寨卡病毒NS1蛋白，该蛋白在人感染初期便可被检测出来，而人抗寨卡病毒IgG和IgM抗体的检测则需要感染后7天，本发明具有更精准、更早检测寨卡病毒的优势，同金标法检测寨卡病毒NS1蛋白试纸条相比具有更灵敏，可定量优势，对疫情的监控和寨卡病毒的研究更有意义。本发明检测人血清寨卡病毒NS1蛋白的灵敏度为0.1ng/ml，该灵敏度为其他方法学如胶体金不能达到，为寨卡病毒的精准研究提供更好的支持。

Claims (10)

1.一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，包括底板，所述底板上依次设有样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，且所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸依次搭接；
所述结合垫上含有荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
所述包被膜包含检测区和质控区，所述检测区包被有与结合垫上的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体，所述质控区包被有鸡IgY抗体。
2.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述结合垫包被有终浓度为0.1-1.5mg/mL的荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体、终浓度为0.5-1.5mg/mL的荧光微球标记的羊抗鸡抗体，所述荧光微球标记的寨卡NS1单克隆抗体固化后在结合垫上的含量为0.6-1.2μg/cm2；所述荧光微球标记的羊抗鸡抗体固化后在结合垫上的含量为0.4-0.6μg/cm2。
3.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述样品垫通过浓度为0.5～1.5mg/ml的鼠IgG包被。
4.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被膜上检测区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的寨卡NS1蛋白单克隆抗体。
5.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述包被膜上质控区包被有终浓度为0.5-2.0mg/ml、用量为25μl/27-29cm的鸡IgY抗体。
6.根据权利要求1所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条，其特征在于，所述荧光微球的粒径为0.2-0.8μm，且荧光微球的激发光和发射光波长都为400～750nm。
7.一种快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、荧光微球的清洗与活化：将荧光微球悬液离心处理后，加入吗啉乙磺酸溶液进行超声处理；接着依次加入碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，再用吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声混匀备用；
B、荧光微球标记抗体的制备：在步骤A活化后得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，混匀后室温反应，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应，离心清洗，沉淀再用含1％BSA的TBST溶液超声重悬，得到荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体；
C、荧光标记抗体结合垫的制备：使用含15％糖的TBST溶液稀释步骤B得到的两种荧光微球标记抗体，喷涂在结合垫上，烘干备用；
D、包被膜的制备：分别将另一种寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体用PBS溶液调节浓度，然后将二者分别在检测区和质控区间隔划膜，烘干备用；
E、样品垫的制备：将制作样品垫的材料裁切成条状，用含5％糖、2％吐温的Tris溶液浸泡，浸泡充分后烘干，烘干后上面喷涂鼠IgG；
F、纸条的组装：在底板上顺次粘贴样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸，所述样品垫、结合垫、包被膜和吸水纸之间互相搭接，然后切割成试纸条。
8.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，所述步骤A的荧光微球的清洗与活化步骤为：将荧光微球清洗，离心处理后，加入50mM pH为5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液进行超声处理，使得微球悬液浓度为10mg/ml；再依次加入浓度为50～100mg/ml的碳二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺溶液，室温混匀后离心处理，弃上清液，用20～50mM pH5.0～6.5的吗啉乙磺酸溶液重悬，重复清洗一次后超声复容得到荧光微球悬液备用。
9.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条的制作方法，其特征在于，所述步骤B的荧光微球标记抗体的制备步骤为：在步骤A得到的荧光微球悬液中，分别逐滴加入寨卡NS1蛋白单克隆抗体或羊抗鸡抗体，使悬液中抗体的终浓度为0.1～2.0mg/ml，混匀室温反应2～3h，离心清洗，沉淀用含有5％BSA的PBS溶液重悬后室温反应1～2h，离心清洗，沉淀用含1％BSA的TBST溶液重悬，得到终浓度为0.1～2mg/ml的的荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体或荧光微球标记的羊抗鸡抗体。
10.根据权利要求7所述的快速检测寨卡病毒NS1蛋白的荧光定量免疫层析试纸条制作方法，其特征在于，所述步骤D的包被膜的制备步骤为：分别将一种与荧光微球标记的寨卡NS1蛋白单克隆抗体具有不同表位的寨卡NS1蛋白单克隆抗体和鸡IgY抗体分别用1～10mM的PBS溶液调节至终浓度为0.5～2.0mg/mL，二者分别以25μl/27-30cm的包被液量在检测区和质控区划膜，二者间隔5-8mm，在湿度<20％、温度45～50℃的环境中热烘干36～48h后置于湿度<30％的室温下备用。
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