MX2014013417A - Ensayo de inmuno deteccion multiplex. - Google Patents

Ensayo de inmuno deteccion multiplex.

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Abstract

La presente invención proporciona kits y métodos de ensayo para la detección temprana de patógenos, la identificación precisa del agente etiológico, y vigilancia de enfermedad mejorada; más específicamente, la presente invención describe un inmunoensayo que conduce a la detección rápida y simultánea de anticuerpos para un amplio intervalo de patógenos infecciosos en fluidos biológicos de pacientes infectados; este inmunoensayo involucra el acoplamiento covalente y orientado de proteínas de fusión que comprenden una enzima AGT y un antígeno viral en un soporte sólido identificable (por ejemplo, microesferas fluorescentes), dicho soporte que está recubierto previamente con un sustrato AGT; este acoplamiento está mediado por la reacción irreversible de la enzima AGT sobre su sustrato; las microesferas acopladas con antígeno así obtenidas muestran mayor captura de anticuerpos específicos en comparación con las microesferas acopladas con antígeno producidas por procedimientos de acoplamiento de amina estándar; los métodos de la invención poseen la capacidad de multiplexar, minimizar la cantidad de muestra biológica, y tienen sensibilidad y especificidad mejoradas hacia los anticuerpos objetivo en comparación con ELISA clásico o ensayos de radio-inmunoprecipitación.

Description

ENSAYO DE INMUNO DETECCIÓN MÚLTIPLEX ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades infecciosas causadas por agentes patogénicos, tales como bacterias, virus (por ejemplo, fiebres hemorrágicas virales (VHF)) y parásitos plantean un problema significativo de salud pública, debido a la severidad de las enfermedades, alta mortalidad, contagio entre humano de ciertos agentes y la falta de un tratamiento eficaz para la mayoría de ellas.
El control de epidemias depende de forma crucial de la detección rápida y precisa identificación del agente, con el fin de definir e implementar una acción oportuna y apropiada. En este contexto, es esencial para producir y validar herramientas para la detección temprana de los brotes, la identificación precisa del agente etiológico y vigilancia de la enfermedad mejorada.
En este sentido, la detección de anticuerpos en los fluidos corporales constituye una parte importante de la diagnosis de enfermedades viralmente inducidas, enfermedades autoinmunes y la detección de cáncer. De hecho, ciertos anticuerpos pueden servir como marcadores de diagnóstico y pueden llevar a pronóstico y tratamiento, ya que se sabe que su presencia se correlaciona con el estallido de un patógeno. Este es el caso particular de los anticuerpos contra los antígenos virales exclusivamente.
Los métodos actuales para la detección de la presencia de anticuerpos incluyen diversas técnicas como la microscopía de la inmunofluorescencia, ensayo de quimioluminiscencia, Western Blot, ensayo de radio inmuno-precipitación (RIP) y ELISA. La detección paralela de varios anticuerpos simultáneamente puede ser particularmente útil al minimizar los efectos de matriz que existen entre los ensayos individuales, tales como en ELISA, porque los calibradores y los anticuerpos son analizados en las mismas condiciones; por lo tanto generará resultados comparables para la medición de múltiples anticuerpos presentes dentro de la misma muestra. Uno de dicho ensayo es el ensayo múltiplex Luminex que utiliza antígenos unidos a perlas. Píckering et al, Clínical and Diagnostic Laboratory Immunology 9:872-876 (2002).
Sin embargo, lo que complica la identificación directa de anticuerpos patógenos relevantes, es que los sueros normales contienen grandes cantidades de anticuerpos naturales que se manifiestan en patrones complejos de tinción (Avrameas S. Immunol. Today 1991 ). La presencia de estos anticuerpos naturales puede complicar la diferenciación de anticuerpos asociados a enfermedad del complejo fondo de "ruido auto inmune", es decir, los autoanticuerpos que ocurren naturalmente. Como se hace notar en Anderson et al., Methods Mol. Biol. 723:227-238 (201 1), la diafonía e interferencia queda como una preocupación con múltiples ensayos.
La unión de anticuerpos humanos directamente a las perlas en un ensayo múltiplex también se ha reportado como un problema. Tainsky et al., Biomarker Insights 2:261-267 (2007); Waterboer et al., J. Immunol Methods 309:200-204 (2006).
Por otra parte, una poca diferencia entre las muestras positivas y de control puede limitar la utilidad de los ensayos múltiplex. Burbelo et al., Exp. Rev Vaccines, 9:567-578 (2010).
Otra complicación es que ELISA y los ensayos múltiplex no necesariamente dan los mismos resultados. Por ejemplo, Pickering et al., 2002, observa numerosas discrepancias entre los dos ensayos al medir los anticuerpos protectores contra varios antígenos virales y bacterianos. Esto puede reflejar las alteraciones en la antigenicidad relativos a cómo el antígeno se une al sustrato. Ambrosino et al., Malaria Journal 9:317 (2010). Del mismo modo, Cham et al., Malaria Journal 7:108 (2008), reporta que algunas muestras mostraron una marcada diferencia entre las lecturas de análisis basados en perla y ELISA, algunos de las cuales tienen mayores lecturas de ELISA. Esto podría ser debido al hecho de que diferentes partes de las proteínas recombinantes son accesibles por los anticuerpos cuando las proteínas están limitadas a una superficie o una esfera. Id.
También se requiere la preparación de cantidades suficientes del antígeno para aplicaciones comerciales (es decir, kits). Burbelo et al., Exp. Rev Vaccines, 9:567-578 (2010).
En vista de lo anterior, existe una necesidad de sistemas y métodos direccionables, que pueden proporcionar mejoras adicionales de alto rendimiento, eficacia y exactitud para el diagnóstico molecular de enfermedades generadoras de anticuerpos. La presente invención satisface estas y otras necesidades.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 representa el acoplamiento orientado de proteínas quiméricas AGT-antígeno a microesferas recubiertas de sustrato. El primer paso del acoplamiento se compone de acoplamiento del sustrato AGT BG-PEG-NH2 a las microesferas activadas por el acoplamiento de amina. El segundo paso consiste en poner en contacto las microesferas de sustrato revestido con las proteínas de fusión que contienen AGT (por ejemplo el muíante SNAP), dicha enzima siendo diseñada para unirse covalentemente a su sustrato BG-PEG-NH2, es decir, a las microesferas.
La figura 2 muestra la eficiencia de acoplamiento de proteínas de antígeno quiméricas SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-ZIKA), como se sigue por el anticuerpo anti SNAP.
La figura 3 compara la sensibilidad del experimento del inmunoensayo para la detección de anticuerpo purificado monoclonal anti-DV2 de proteína quimérica SNAP-DV2.EDIII conjugada con microesferas vía el sustrato de la proteína hAGT (acoplamiento de la invención) o acoplado mediante un procedimiento de acoplamiento estándar amina, por ejemplo un kit de acoplamiento de amina Bio-Plex, BIORAD.
La figura 4 compara la sensibilidad del experimento del inmunoensayo para la detección de anticuerpo purificado monoclonal anti-DV1 en proteína quimérica de SNAP-DV1.EDIII conjugada a microesferas, un formato singleplex o en un formato múltiplex con otras proteínas quiméricas de Ags SNAP-viral (SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
La figura 5 muestra la reactividad y la especificidad del experimento múltiplex de inmunoensayo para la detección de las diluciones del anticuerpo monoclonal purificado anti-WNV en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
Las figuras 6A y 6B muestran la reactividad y la especificidad de la detección de IgG anti-DV3 en suero policlonal de ratón contra DV3 (figura 6A) y la detección de IgG anti-YF en suero policlonal de ratón contra YF (figura 6B) en inmunoensayos múltiplex en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE, SNAP-ZIKA) acoplada a las microesferas Las figuras 7A y 7B muestran la reactividad y la especificidad de la detección de IgM anti-DV1 (figura 7A) y detección de IgG anti-DV1 (figura 7B) en el suero DV1 infectadas de un paciente humano en inmunoensayos múltiplex en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE, SNAP-ZIKA, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
La figura 8 describe la estructura del cásete pDeSNAPuniv.
La figura 9 describe la estructura del cásete pDeSNAPuniv/VSB.N.
Las figuras 10A y 10B muestran (figura 10A) un ensayo immunoblot realizado en los sobrenadantes de células S2/SNAP-VSB.N inducidas por 10 días con Cd2+ (+) o no inducidas (-). La proteína quimérica secretada SNAP-VSB.N (teórica MW 50 kDa) fue detectada usando un anticuerpo anti Histag, en comparación al definir las cantidades de la proteína quimérica altamente purificada SNAP-TOS.N (teórica 49 MW kDa). (Figura 10B) Visualización directa de proteínas en cada fracción de columna de cromatografía por exclusión de tamaño (tinción de azul de Coomassie de PAGE-SDS) correspondiente a la etapa final de purificación de proteína secretada SNAP+SBV.N de células inducidas S2/SNAP+SBV. N durante 10 días.
La figura 11 muestra un ejemplo de un dispositivo que contiene las microesferas recubiertas con antígeno de la invención.
Las figuras 12A a 12F muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 154) y secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 155) de un constructo SNAP que contiene el gen N del virus SARS.
Las figuras 13A a 13D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 156) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 157) de un constructo SNAP que contiene el dominio de unión del receptor del gen S de virus SARS.
Las figuras 14A a 14E muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 158) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 159) de un constructo SNAP que contiene el gen N de coronavirus humano.
Las figuras 15A a 15G muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 160) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 161) de un constructo SNAP que contiene el gen S1 de coronavirus humano.
Las figuras 16A a 16D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 162) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 163) de un constructo SNAP que contiene el dominio de unión del receptor del gen S1 de coronavirus humano (RBD).
Las figuras 17A a 17D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 164) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 165) de un constructo SNAP que contiene el gen LruA de Leptospirosis.
Las figuras 18A a 18D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 166) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 167) de un constructo SNAP que contiene el gen LruB de Leptospirosis.
Las figuras 19A a 19D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 168) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 169) de un constructo SNAP que contiene el gen LipL32 de Leptospirosis.
Las figuras 20A a 20F muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 170) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 171 ) de un constructo SNAP que contiene el gen C de Hepatitis E.
Las figuras 21 A a 21 E muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 172) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 173) de un constructo SNAP que contiene la secuencia de núcleo del gen C de Hepatitis E.
Las figuras 22A a 22C muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 174) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 175) de un constructo SNAP que contiene el gen C de Hepatitis C.
Las figuras 23A a 23D muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 176) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 177) de un constructo SNAP que contiene la secuencia de núcleo del gen C de Hepatitis C.
Las figuras 24A a 24C muestran el nucleótido de codificación (SEQ ID NO: 178) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 179) de un constructo SNAP que contiene secuencias de codificación de la proteína NSs de virus Schmallenberg.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención permite la clasificación simultánea de múltiples antígenos en una muestra biológica con mayor sensibilidad y especificidad utilizando un procedimiento de acoplamiento de antígeno orientado para los antígenos. Los presentes inventores han desarrollado y validado inmunoensayos que conducen a la detección rápida y simultánea de varios anticuerpos generados por un amplio intervalo de enfermedades, en particular enfermedades arbovirales y FHV, en fluidos biológicos.
Para lograr tanto nivel óptimo de sensibilidad y especificidad para la detección de baja cantidad de anticuerpos, se ha desarrollado un antígeno orientado procedimiento de acoplamiento. Este procedimiento orientado de acoplamiento de antígeno se basa en la interacción covalente entre las enzimas AGT y sus sustratos, los derivados O6-bencilguanina, que irreversiblemente reaccionan con las enzimas AGT transfiriendo su grupo bencilo a la cisteína del sitio activo de la enzima. En consecuencia, un número objetivo de antígenos se puede fusionar a una molécula de enzima AGT, dando lugar a proteínas de fusión quimérica diferentes (en lo sucesivo como proteínas de fusión [AGT - Antígeno]), que pueden utilizarse como reactivos de captura para los anticuerpos presentes en una muestra biológica. Los inventores actuales han demostrado que esta captura de anticuerpos se aumenta cuando estas proteínas de fusión están ligadas a soportes sólidos gracias a la interacción de AGT-sustrato específica.
Como se muestra en los ejemplos, los inventores han generado un número de diferentes microesferas fluorescentes recubiertas con antígeno con el procedimiento de acoplamiento de antígeno orientado. Dieciséis conjuntos distintos de microesferas acoplados con 16 proteínas de fusión quiméricas purificadas [AGT - Antígeno] se utilizan en una titulación de 16 anticuerpos séricos específicos de diversas proteínas de los serotipos del dengue 1 a 4, Nilo Occidental, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis transmitida por garrapatas, encefalitis Saint-Louis, encefalitis del Valle de Murray, Wesselsbron, Zika, Roció, Usutu, fiebre del Valle de Rift y el virus chikungunya. Inesperadamente, estos 16 conjuntos distintos de las microesferas se han mezclado en una sola muestra sin afectar la sensibilidad y especificidad de la detección (véase la figura 5). La producción de este sistema es altamente efectiva en tiempo y costo, como sólo una muy pequeña cantidad de antígeno recombinante (< 50 µg) es necesaria para producir un conjunto de microesferas acopladas con antígeno (1.25 x 106 microesferas), dicho conjunto siendo suficiente para llevar a cabo 1000 ensayos individuales.
En consecuencia, la invención abarca métodos y kits para realizar ensayos multiplex basados en el acoplamiento del antígeno orientado de un soporte sólido, preferiblemente una micropartícula etiquetada, con un sustrato AGT, que se acopla a las proteínas de fusión quiméricas, es decir, AGT-antígeno. Este acoplamiento orientado permite una mayor interacción del antígeno con los anticuerpos en una muestra biológica. Un soporte sólido recubierto con sustrato de AGT puede acoplarse con el AGT-antígeno a través de la actividad enzimática de la enzima AGT en estos inmunoensayos.
La enzima 6-alquílguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT, también conocida como ATasa o MGMT y en adelante se refiere como "AGT") está numerada EC 2.1.1.63 en la nomenclatura de la enzima IUBMB. Es una enzima de reparación de 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa ADN de 207 residuos de aminoácidos cuya función en las células es para reparar el ADN alquilado. Más precisamente, AGT actúa sobre 06-met¡lada guanina en el ADN al transferir el grupo metilo irreversiblemente en una reacción SN2 a un residuo de cisteína reactiva (Cys 145). Recientemente, ha demostrado una serie de derivados 06-bencilguanina irreversiblemente reaccionan con dicha enzima transfiriendo su grupo bencilo a la cisteína del sitio activo de la enzima AGT (cf. Damoiseaux et al., ChemBiochem., 2001 , WO 2004/031404 y WO 2005/085470). Así, el antígeno AGT puede ser acoplado a un sustrato AGT a través de esta reacción enzimática.
Los soportes sólidos acoplados al AGT-antígeno pueden incubarse con una muestra biológica que contiene inmunoglobulinas. Después de que las inmunoglobulinas han estado limitadas a los soportes sólidos, la detección de los soportes sólidos que efectivamente están limitados a las inmunoglobulinas puede ser realizada. La identificación del o los soportes sólidos recubiertos por inmunoglobulina permite diagnosticar cual patógeno estaba infectando al paciente (ya que cada soporte sólido coincide con un antígeno patógeno definido). Este paso final detección se realiza por cualquier medio habitual, por ejemplo mediante el uso de anticuerpos de detección etiquetados y mediante la identificación de la naturaleza del soporte sólido.
Ventajosamente, el método de la invención implica sólo la detección de la presencia de anticuerpos en pacientes enfermos, pero no es necesario conocer la identidad de esos anticuerpos.
Métodos para la detección de anticuerpos objetivo múltiples La presente invención se refiere a un método para detectar por lo menos 2 anticuerpos objetivo en una muestra biológica. La invención abarca detectar la presencia o ausencia de por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., anticuerpos objetivo distintos. Por lo tanto, la invención comprende un método compuesto por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., soportes sólidos y un método compuesto por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., diferentes epítopes. El método puede comprender por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., soportes sólidos mezclados juntos antes de la adición de la muestra biológica. Los epitopes pueden ser reconocidos por anticuerpos objetivo.
En una modalidad, el método comprende: (a) poner en contacto una mezcla de por lo menos 2 soportes sólidos con una muestra biológica; en donde por lo menos uno de los soportes sólidos comprende una primera proteína de fusión AGT-Antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT, y en donde al menos uno de los soportes sólidos comprende una segunda proteína de fusión AGT-Antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT; (b) detectar la presencia o ausencia de unión de anticuerpos al primer AGT-Antígeno; y (c) detectar la presencia o ausencia de unión de anticuerpos al segundo AGT-Antígeno.
En una modalidad, el método comprende: (a) poner en contacto una mezcla de por lo menos 10 soportes sólidos con una muestra biológica; en donde un primer soporte sólido comprende una primera proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, en donde un segundo soporte sólido comprende una segunda proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un tercer soporte sólido comprende una tercera proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un cuarto soporte sólido comprende una cuarta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un quinto soporte sólido comprende una quinta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un sexto soporte sólido comprende una sexta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un séptimo soporte sólido comprende una séptima proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un octavo soporte sólido comprende una octava proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un noveno soporte sólido comprende una novena proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; en donde un décimo soporte sólido comprende una décima proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión de anticuerpos a cada uno de los AGT-Antígenos.
En una modalidad, el método comprende: (a) poner en contacto con un primer soporte sólido compuesto por un sustrato AGT covalentemente unido a una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido AGT que tiene una actividad de alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN y un primer epitope que es reconocido por un primer anticuerpo objetivo con la muestra biológica; (b) poner en contacto con un segundo soporte sólido compuesto por un sustrato AGT covalentemente unido a una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido AGT que tiene una actividad de alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN y un segundo epitope que es reconocido por un segundo anticuerpo objetivo, pero no por dicho primer anticuerpo objetivo con la muestra biológica; y (c) detectar la presencia o ausencia de dos anticuerpos objetivo. Preferiblemente, el primero y segundo, etc., soportes sólidos son microesferas. Más preferentemente, las microesferas se etiquetan. Preferentemente, el primero y segundo soportes sólidos están marcados con etiquetas diferentes.
La invención incluye un método de ensayo in vitro para la detección de al menos dos anticuerpos objetivo distintos presentes en una muestra biológica de un sujeto, dicho método que comprende las etapas de: (a) proporcionar una primera proteína de fusión que comprende: - un polipéptido que comprende un primer epitope que es reconocido por un primer anticuerpo objetivo y un polipéptido AGT que tiene una actividad de alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN, (b) poner en contacto dicha primera proteína de fusión con un primer soporte sólido, dicho soporte covalentemente acoplado con un sustrato de dicho polipéptido AGT, (c) obtener un primer soporte sólido covalentemente acoplado con un primer epitope que es reconocido por el primer anticuerpo objetivo, (d) proveer una segunda proteína de fusión que comprende: - un polipéptido que comprende un segundo epitope, dicho segundo epitope que es reconocido por un segundo anticuerpo objetivo pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, y - un polipéptido AGT que tiene una actividad de alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN, (e) poner en contacto dicha segunda proteína de fusión con un segundo soporte sólido, dicho soporte siendo covalentemente acoplado con un sustrato de dicho polipéptido AGT, (f) obtener un segundo soporte sólido covalentemente acoplado con un segundo epitope que es reconocido por el segundo anticuerpo objetivo, pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, en donde dichos primero y segundo soportes sólidos pueden identificarse específicamente uno del otro, (g) poner en contacto dicha muestra biológica con el primero y segundo soportes sólidos obtenidos en los pasos (c) y (f), (h) detectar la presencia de dichos por lo menos dos anticuerpos objetivo.
Como se utiliza en lo sucesivo, los términos "un anticuerpo", "una proteína de fusión", "un epítope", "un antígeno", "un polipéptido AGT", "un soporte sólido" y similares deben obviamente ser entendidos como es habitual en la técnica, es decir, de una manera amplia. En particular, abarcan no sólo las moléculas individuales particulares sino un número de dichas moléculas. Por ejemplo, el término "soporte sólido" abarca un subconjunto de numerosos soportes sólidos idénticos, el término "micropartículas" abarca un subconjunto de numerosas micropartículas idénticas, y el término "proteína de fusión" abarca a un número de moléculas de proteína únicas idénticas. En el contexto de la presente invención, cabe destacar que un soporte sólido lleva un número idéntico de proteínas de fusión, dichas proteínas de fusión que contienen, aparte de la AGT polipéptido antígeno idéntico y por lo tanto epítopes idénticos, para que los anticuerpos que se detectan en el soporte sólido puedan ser claramente identificados.
En este documento, el término "proteína de fusión" significa un polipéptido que contiene una proteína o un polipéptido creado a través de la unión artificial de dos o más polipéptidos véase http://en.wikipedia.org/wiki/pépt¡do). En los inmunoensayos de la invención, dichas proteínas de fusión que contienen un polipéptido AGT y un antígeno, que contiene al menos un epítope. Las proteínas de fusión se pueden obtener a través de ingeniería genética (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Genetic_engineering) de un gen de fusión. Esto normalmente involucra la remoción del codón Analizador (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Codon) de una secuencia de ADNc (véase http://en.wikipedia.org/wiki/CDNA) de codificación de la primera proteína, luego anexar la secuencia de ADNc de la segunda proteína en marco (véase http://en-wikipedia.org/wiki/Reading frame) a través de la ligación (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Ligase) o PCR de extensión de traslape (véase http://en-wikipedia.org/wiki/PCR). Esa secuencia de ADN entonces se expresará (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Protein expression) por una célula (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Cell (biology) como una proteína sencilla. La proteína puede ser diseñada para incluir la secuencia completa de ambas proteínas originales, o solamente una porción de cualquiera de ellas. Si las dos entidades son péptidos de las proteínas, un enlazador (o "espaciador") de péptidos pueden ser agregados, que hace más probable que las proteínas doblan independientemente y se comportan como se esperaba. En particular, la fusión de las proteínas de la invención puede obtenerse al proporcionar vectores que comprenden secuencias de codificación de AGT en marco con un epítope o antígeno codificación de secuencias de codificación, conectada a al lado de la N-terminal o la C-terminal de la secuencia del ADN AGT. Estos vectores pueden introducirse en hospederos procarióticos, incluyendo bacterias como las bacterias E. coli, u hospederos eucariotas, por ejemplo, la levadura, las células de insecto o de células de mamífero y las proteínas de fusión recombinante pueden producirse en condiciones adecuadas. Construcciones típicas se presentan en la parte experimental de esta solicitud.
El término "anticuerpo" en este documento pretende incluir los anticuerpos monoclonales y policlonales y anticuerpos quiméricos. Preferiblemente, los anticuerpos a ser detectados por los inmunoensayos de la invención son anticuerpos policlonales, que están presentes en las muestras biológicas de pacientes enfermos y por lo tanto se han generado diversas fuentes de células B. Como tal, que reconocen diferentes epítopes exhibidos por un antígeno patógeno (por otro lado, los anticuerpos monoclonales se derivan de una línea de células individuales y reconocen el mismo epítope).
Un anticuerpo (o "inmunoglobulina") consiste en una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras de (L) interconectadas por enlaces disulfuros. Cada cadena pesada comprende una región variable de cadena pesada (o dominio) (abreviado en el presente como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1 , CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada aquí como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio, CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse aún más en las regiones de hipervariabilidad, denominada "regiones determinantes de complementariedad" (CDR) o "regiones hipervariables", que son principalmente responsables de ligar un epítope de un antígeno, y que se intercalan con las regiones que más se conservan, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL está compuesta por tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas del extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interacciona con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos o factores hospederos, incluyendo diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.
Lo anticuerpos pueden ser de diferentes isotipos (es decir, IgA, IgD, IgE, IgG o IgM). El presente método puede detectarse anticuerpos tanto de tipo IgG como IgM. Es de destacar que estos isotipos se componen de dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas que están unidas por enlaces disulfuros. De manera importante, los anticuerpos IgM forman polímeros donde múltiples inmunoglobulinas están covalente unidas con enlaces disulfuros, sobre todo como un pentámero, pero también como un hexámero, que tienen un peso molecular de aproximadamente 900 kDa (en su forma pentámero). Ya que cada monómero tiene dos sitios de unión del antígeno, un IgM pentamérica tiene 10 sitios de unión. Por lo general, sin embargo, los anticuerpos IgM no pueden ligar 10 antígenos al mismo tiempo porque el gran tamaño de la mayoría de los antígenos impide ligarse a lugares cercanos. Debido a su naturaleza polimérica, IgM poseen alta avidez. Diferentes isotipos de anticuerpos (por ejemplo, IgG o IgM) pueden ser detectados con el mismo antígeno, permitiendo la discriminación temporal de la respuesta de anticuerpos, tal como si la respuesta de anticuerpos es una respuesta temprana o tardía contra una antígeno/infección. Esta discriminación puede puede proporcionar información sobre el momento de la infección o la exposición al antígeno.
Los fragmentos de anticuerpos también pueden ser detectados gracias al presente método. Este término pretende incluir Fab, Fab', F(ab') 2, scFv, dsFv, ds-scFv, dímeros, minicuerpos, diacuerpos y multímeros del mismo y fragmentos de anticuerpos de biespecíficos.
Los anticuerpos monoclonales pueden utilizarse en los inmunoensayos presentes; por ejemplo, para detectar las inmunoglobulinas que están vinculadas a los soportes sólidos. Como se utiliza en este documento, "anticuerpo monoclonal" define un anticuerpo derivado de una población homogénea de anticuerpos. Más concretamente, los anticuerpos individuales de una población son idénticos excepto por unas pocas mutaciones posibles que ocurren naturalmente que se encuentran en proporciones mínimas. En otras palabras, un anticuerpo monoclonal consta de un anticuerpo homogéneo derivado del crecimiento de un clon de célula única (por ejemplo un hibridoma, una célula hospedera eucariota transfectada con una molécula de ADN de codificación para el anticuerpo homogéneo, una célula hospedera procariótica transfectada con una molécula de ADN de codificación para el anticuerpo homogéneo, etc.) y se caracteriza generalmente por las cadenas pesadas de una y sólo una clase y subclase, y las cadenas ligeras de un único tipo. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y se dirigen contra un solo antígeno. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen varios anticuerpos dirigidos contra varios factores determinantes, o epítopes, cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo epítope del antígeno.
El término "antígeno" aquí significa cualquier sustancia que causa al sistema inmunitario a producir anticuerpos contra la sustancia mencionada. Un antígeno "inmunogénico" es un tipo específico de antígeno que es capaz de estimular una respuesta inmune adaptativa si se inyecta por sí solo. A nivel molecular, un antígeno así se caracteriza por su capacidad de ser "ligado" al sitio de ligamiento del antígeno de un anticuerpo.
En el contexto de la presente invención, un anticuerpo se dice "ligar" a un antígeno (o epítope) definido o "reconocer" dicho antígeno (o epítope) si dicho anticuerpo tiene una constante de afinidad Ka (que es la constante de disociación invertida, es decir 1/Kd) superior a 105 M"1, preferiblemente superior a 06 M"1, más preferiblemente superior a 107 M"1 para dicho antígeno (o epitope). Esta afinidad se puede medir por ejemplo por diálisis del equilibrio o por templado de fluorescencia, ambas tecnologías que se utilizan habitualmente en la técnica.
Los métodos de la invención se pueden acoplar con otras técnicas para la detección de proteínas, ácidos nucleicos, anticuerpos, respuestas inmunes, polisacáridos, etc., por ejemplo, en la detección de alérgenos.
Antígenos para el uso en inmunoensayos múltiplex En el contexto de la invención, antígenos o epitopes incluyen: proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y glicoproteínas. Dichas proteínas incluyen proteínas virales, bacterianas, parasitarias, animales y fúngicas como albúminas, toxoide tetánico, toxoide diftérico, toxoide pertúsico, proteínas de membrana externa bacteriana (incluyendo proteína de membrana externa meningocócica), proteína de RSV-F, péptido derivado palúdico, B-lactoglobulina B, aprotinina, ovoalbúmina, lisozima, péptidos lineales, oligopéptidos etc. Los antigenos y epitopes incluyen cáncer, citoquina, y antígenos de alérgeno y epitopes. Los antígenos pueden ser antígenos involucrados en enfermedades autoinmunes.
Los antígenos pueden ser antígenos asociados al tumor como Alfafetoproteína (AFP, http://en.wikipedia.org/wiki/Alphafetoprotein), antígeno carcinoembrionario (CEA), CA 15-3, CA27-29, CA 125, CA 19-9, Calrefinin, antígeno prostático específico (PSA), MUC-1 (http://en.wikipedia.org/wiki/MUC1), proteína de la membrana epitelial (EMA), antígeno de tumor epitelial (ETA), tirosinasa (http://en.wikipedia.org/wiki/Tyrosinase), antígeno asociado con melanoma (MAGE), complejos de TAA, SSX2 o NERCMSL, ras (http://en.wikipedia.org/wiki/Ras_subfamily), P53, CD34, CD99, CD117, cromogranina, citoqueratina Desmina, Factor VIII (http://en.wikipedia.org/wiki/Factor_VIII), CD31 (http://en.wikipedia.org/wiki/ CD31), FL1 (http://en.wikipedia.org/wiki/FLI), GFAP, GCDFP-15, HMB-45, hCG, mhibin, queratina, PTPRC (CD45), MART-1 , MyoD1 , MSA, NSE, PLAP, proteína S100, SMA, sinaptofisina, tiroglobulina, factor-1 de trascripción de la tiroides, Tumor M2-PK, y vimentina.
Los antígenos pueden ser biomarcadores del cáncer como angiopoyetina-2, sCD40L, EGF, endoglina, sFASL, HB-EGF, IGFBP-1 , IL-6, IL-8, IL-18, PA1-1 , PLGF, TGF-a, TNF-a, uPA, VEGF-A, VEGF-C, VEGF-D, sEGFR, FGF-básico, Follistatina, G-CSF, HGF, sHER-2/neu, slL-6Ra, leptina, osteopontina, PECAM-1 , PDGF-AB/BB, prolactina, SCF, sTIE-2, sVEGFR- y sVEGFR-2.
Los antígenos pueden ser marcadores de toxicidad renal tal como Calbindin, Clusterin, GST-p, IL-18, KIM-1 , MCP-1 , albúmina, B2M, Cistatin C, NGAL, osteopontina y TFF3.
Los antígenos pueden ser citoquinas, quimioquinas y factores de crecimiento tal como el TGF-ß? , TGF- 2, TGF^3, IL-? ß, IL-1 ra, IL-2, IL-4, IL- 5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17, FGF básica, cotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFN-?, IP-10, CP-1 (MCAF), ???-1a, ??-1ß, PDGF-BB, RANTES, TNF-a, VEGF, IL-1a, IL-2Ra, IL-3, IL-12 (p40), IL-16, IL-18, CTACK, GRO-a, HGF, IFN-a2, LIF, MCP-3, M-CSF, MIF, MIG, ß-NGF, SCF, SCGF-ß, SDF-1a, TNF-ß y TRAIL.
Los antígenos pueden ser haptenos, y otros radicales que comprenden moléculas de bajo peso molecular, tal como sacáridos, oligosacáridos, polisacáridos, péptidos, mucinas, toxinas y alérgenos (polen, clara de huevo).
Los antígenos pueden ser alergénicos, tales como alimentos, hierba, árbol, malezas, insectos, moho, epidérmica, o alérgenos de ácaros del polvo. Los antígenos pueden ser animales, mariscos, leche (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Milk), soya (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Soy), huevos (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Egg_(food)), trigo (véase http://en.wikipedia.org/wiki Wheat), cacahuetes (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Peanuts), nueces de árbol (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Tree_nuts), pescado (véase http://en.wikipedia.org/wiki/Fish), o alergénicos de semilla.
Los antígenos pueden ser implicados en las enfermedades autoinmunes y son antígenos humanos preferentemente. Los antígenos preferidos son tiroglobulina, peroxidasa tiroidea, Factor reumatoide (IgA, IgG, IgM), péptido citrulinado, histidil-ARNt sintetasa (Jo-1), PM-Scl, complemento, componentes de complemento C4c y C3c; complemento total (CH50), Sm/RNP, SS-A y -B (Sjogren a y b), Scl-70, topoisomerasa, proteína Ribosomal P, actina, transglutaminasa tisular, mieloperoxidasa, Proteinasa-3, fosfolipasa A tipo M, antígeno microsomal de riñón-hígado tipo-1 (anti-LKM1), citosol anti-hígado tipo 1 (anti-LCI), SMA, subunidad E2 de complejo de deshidrogenasa de piruvato, poro nuclear gp210, cuerpo nuclear sp100, grupo de alta movilidad caja 1 , colágeno, colágeno tipo II, colágeno tipo IV, colágeno VII, hLAMP-2, canal de potasio sincronizado con voltaje (VGKC), receptor de ácido N-metil-D-aspártico (NMDAR), Hu, Yo, Ri, Ma 1/2, CRMP-5, Ampifisin, proteínas de choque térmico (HSPs), HSP60, factor de coagulación VIII, proliferación de antígeno nuclear de célula (PCNA), polimerasa de ADN, recoverin, a-enolasa, transducina-a, proteína básica de mielina (MBP), factor VIII (FVIII), factor IX (FIX), péptido de amiloide ß (?ß), glicoproteína del oligodendrocito de mielina (MOG; véase www.discoverymedicine.com/category/species-and-cell-types/human/brain/oligodendrocyte/), proteína básica de mielina (MBP), factor de estimulación de colonias de macrófagos de granulocito (GM-CSF), interferón (IFN)-y, interleucina-(IL)-6, IL-17A, IL-17F, IL-22, histona H1 , citocromo P450, mielina, aquaporin-4 (AQP-4), Ro, La, quinasa músculo-específica (MuSK), actinina-a4, a-enolasa, factor 2 de elongación, receptor del glutamato (NR2), laminina, miosina, smDI, PM-Scl, fibrillarin, polimerasa 1 de ARN, ÑOR), Scl-70, ciclina I y II, proteína específica de hígado, formiminotransferasa-ciclodeaminasa (LC-1), antígeno soluble del hígado/antígeno de hígado-páncreas (SLA/LP), desmogleina 1 o 3, envoplakina, proteína BP180, proteína BP230, glicoproteina asociada con mielina, decarboxilasa del ácido glutámico (GAD), tirosina fosfatasa (IA2), insulina, H+/K+-ATPasa, elastasa, katepsina G, kactoferrina, BPI, rPAgl (CUZDI) y rPAg2 (GP2), receptor de fosfolipasa A2, péptido de fusión Gliadin análogo, descarboxilasa del ácido glutámico (GAD65) y los antígenos del receptor de tirotropina.
Los antígenos pueden ser toxinas, por ejemplo, las neurotoxinas botulino, la toxina de Clostridium perfringens épsilon, ricina, saxitoxina, shigatoxina, tetrodotoxina, enterotoxinas estafilocócicas, etc. Mucinas también son bien conocidas en la técnica. MUC5AC, MUC5B y MUC2 son sus ejemplos. En particular, pueden ser polisacáridos de origen natural tal como grupo B steptococcal y polisacáridos capsulares neumocócicas (incluyendo el tipo III), mucoexopolisacárido Pseudomonas aeruginosa, y polisacáridos capsulares (incluyendo fisher tipo I) y polisacáridos Haemophilus influenzae.
En otra modalidad preferida, dicho antígeno o epítope es expresado por un virus que se ha seleccionado en el grupo formado por: el virus de la gripe, el virus de la hepatitis A, virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, el virus de la hepatitis E, el virus de la hepatitis G, el virus del VIH, el virus de la fiebre amarilla, el virus del dengue, el virus de la encefalitis japonesa, el virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, los virus Usutu o virus del Nilo Occidental, virus de la fiebre del Valle Rift o Toscana, el virus Chikungunya, virus de fiebre hemorrágica Omsk, virus de fiebre hemorrágica Alkhurma, virus de enfermedad del bosque Kyasanur, virus de encefalitis equina Venezolana, virus de encefalitis equina oriental, virus de encefalitis equina occidental, virus del Rio Ross, el virus Mayara, el virus respiratorio sinticial, virus Roció, morbilivirus, el virus de la encefalitis de Murray, el virus Wesselbron, el virus Zika, el virus Coriomeningitis linfocítica, el virus del Ébola, el virus de Marburg, el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, el virus de Lassa, el virus Junin, el virus Machupo (http://en.wikipedia.org/wiki/Machupo_virus), el virus de Sabia, el virus Guanarito, el virus de las paperas, el virus de la rabia, virus de la rubéola, el virus del zoster de la varicela, el herpes simple tipo 1 y 2, más generalmente un alfavirus un adenovirus, un ecovirus, un rotavirus, un flavivirus, un rinovirus, un ortobuniavirus, un poliovirus, un parvovirus humano (por ejemplo, poxvirus (http://en.wikipedia.org/wiki/Smallpox), viruela símica, viruela negra o viruela de canario), un ortomixovirus (por ejemplo, virus de influenza A, virus de influenza B, virus de influenza C, http://en.wikipedia.org/wiki/influenza_A_virus; http://en.wikipedia.org/wiki(lnfluenzavirus_B; http://en.wikipedia.org/wiki(lnfluenzavirus_C; un picormavirus (por ejemplo, virus de enfermedad de pie o boca, FMDV, http://en.wikipedia.org/wiki/Picornavirus), un parvovirus humano, un enterovirus, un coronavirus (por ejemplo, SARS o betacoronavirus humano), un virus del papiloma humano, un virus de herpes, el citomegalovirus humano, el virus de Epstein-Barr, un paramixovirus (http://en.wikipedia/wiki/Paramyxovirus), tal como el virus de parainfluenza de tipo 1 , 2 y 3 o cualquier virus identificado.
En otra modalidad preferida, dicho antígeno o epítope es expresado por un virus perteneciente a una familia que se selecciona del grupo que consiste de: la Flaviviridae (virus del dengue, fiebre amarilla, Nilo Occidental, encefalitis japonesa, encefalitis por picaduras de garrapatas, Hepatitis C), la Togaviridae (Virus Chikungunya, Ross River, Mayara, encefalitis equina occidental, encefalitis equina oriental, encefalitis equina de Venezuela) la Bunyaviridae (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre del Valle Rift, Schmallenberg), la Caliciviridae (virus de la Hepatitis E), la Arenaviridae (Lassa) y la FHoviridae (ébola, Marburg).
En otra modalidad preferida, dicho antígeno o epítope es expresada por un protozoo parásito (como los del género Leishmania, Toxoplasma Gondii, Entamoeba histolytica, Plasmodium falciparum, (por ejemplo, antígenos MSP1 (19(+ AMA- (III), separadamente o co-expresado) Pneumocystis carinii, Cryplosporídium Naegieria fowleri (http://en.wikipedia.org/wiki/Naegleria_fowleri), o Giardia lamblia), gusanos (por ejemplo, Trypanosoma cruzi, nematodos, cestodos y tremátodos) o artrópodos (como crustáceos, insectos, arácnidos).
En otra modalidad preferida, dicho antígeno o epítope es expresado por una bacteria infecciosa, por ejemplo de los géneros Salmonella, Shigella, Streptococcus, Staphylococcus, Mycoplasma, Diphteriae, Leptospirosa, Rickettsia o Escherichia. En una modalidad más preferida, la bacteria pertenece a una de las especies seleccionadas de Treponema pallidum (http://en.mkipedia.org/wiki/Treponema_pallidum), Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Borrelia burgdoríeri, Legionella pneumophila, Yersinia pestis, Yersinia enterocolitica, Brucella abortus, Burkholderia mallei (http://en.wikipedia.org/wiki/Burkholderia_mallei), Burkholderia pseudomallei (http://en.wikipedia.org/wiki/Burkholderia _pseudomalle¡), Chlamydia pneumonía, Francisella tularensis, Mycoplasma pneumonía, H. influenzae, S. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum (http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridium_botulinum), Clostridium períringens (http://en.wikipedia.org/wiki/Clostridium _perfringens), Listería monocytogenes, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Neisseria meningitidis (http://en.wikipedia.org/wiki/Neisseria_meningitidis), S. epidermidis, N. meningiditis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii (http://en.wikipedia.org/wiki/Rickettsia_prowazekii), Chlamydia psittaci http://en.wikipedia.org/wiki/Chlamydia _psittac¡), Leptospirosa interrogans y E.coli, (por ejemplo, E coli 0157:H7 (http://en.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli_0157:H7)).
En otra modalidad preferida, dicho antígeno o epítope es expresado por un hongo o levadura (por ejemplo, de las especies de Candida, Aspergillus, Cryptococcus, Histoplasma, Pneumocystis o Stachybotrys).
El antígeno o epítope puede ser de la proteína Prion (PrPc). El epítope puede ser de una inmunoglobulia específica, tal como IgD, lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE o IgG total.
Los antígenos generalmente presentan varias características superficiales que pueden actuar como puntos de interacción para anticuerpos específicos. Cualquier dicha característica molecular distinta constituye un epítope. Como se utiliza en este documento, el término "epítope" señala por lo tanto una característica de superficie molecular particular de un antígeno, por ejemplo, un fragmento de un antígeno, que es capaz de ser ligado por al menos un anticuerpo. En un nivel molecular, un epítope por lo tanto, corresponde a una función de superficie molecular particular de un antígeno (por ejemplo, un fragmento de un antígeno) que es reconocido y ligado por un anticuerpo específico. En el contexto de la presente invención, las "proteínas de fusión" contienen al menos un epítope que es reconocido por un anticuerpo objetivo. Preferiblemente, dichas proteínas de fusión contienen antígenos enteros, que comprende varios epítopes (http://en.wikipedia.org/wiki/Epitope). Estos epítopes pueden ser epítopes lineales o de conformación. Como se usa aquí, un epítope lineal (o secuencial) es un epítope que es reconocido por anticuerpos (http://en.wikipedia.org/wiki/Antibody) por su secuencia lineal de aminoácidos (http://en.wikipedia.org/wiki/Amino_acid), o estructura primaria (http://en.wikipedia.org/wiki/Primary_structure). Por el contrario, un epítope conformacional (http://en.wikipedia.org/wiki/Conformational_epitope) es reconocido por su forma tridimensional específica. Preferiblemente, las proteínas de fusión de la invención contienen epítopes conformacionales, ya que la mayoría de los anticuerpos policlonales las reconocen.
Sin embargo es importante que estos antígenos no presenten epítopes reactivos cruzados, es decir epítopes que son reconocidos por los anticuerpos no específicos que se ligarán al mismo. Si fuera el caso, podría reducirse la especificidad del método de la invención.
En una modalidad preferida, dicho epítope está presente en una proteína viral, preferiblemente una proteína EDIII, que se selecciona del grupo que consiste de virus de dengue 1 , el virus de dengue 2, el virus de dengue 3, el virus de dengue 4, virus del Nilo Occidental, virus de fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus Zika, virus Wesselbron, virus Roció, virus de la encefalitis de Murray, virus de la encefalitis Saint-Louis, virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 , virus de la encefalitis japonesa del genotipo 2, virus de la encefalitis japonesa del genotipo 4, virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 y las proteínas del virus Rabensburg.
En una modalidad más preferida, dicho epítope está presente en una proteína viral que es seleccionada en el grupo formado por: la proteína EDIII del virus del dengue 1 codificada por SEQ ID NO: 3, la proteína EDIII del virus del dengue 2 codificada por SEQ ID NO: 4, la proteína EDIII del virus del dengue 3 codificada por SEQ ID NO: 5, la proteína EDIII del dengue virus 4 codificada por SEQ ID NO: 6, la proteína EDIII el virus del Nilo Occidental codificada por SEQ ID NO: 7, la proteína EDIII del virus de la fiebre amarilla codificada por SEQ ID NO: 8, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa codificada por SEQ ID NO: 9, la proteína EDIII del virus Zika codificada por SEQ ID NO: 10, la proteína EDIII del virus Wesselbron codificada por SEQ ID NO: 1 1 , la proteína EDIII del virus de Roció codificada por SEQ ID NO: 12, la proteína EDIII del virus de la encefalitis de Murray codificada por SEQ ID NO: 13, la proteína EDIII del virus de la encefalitis San Louis codificada por SEQ ID NO: 14, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 codificada por SEQ ID NO: 54, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 2 codificada por SEQ ID NO: 55, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 4 codificada por SEQ ID NO: 56, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 codificada por SEQ ID NO: 57 y la proteína EDIII del virus Rabensburg codificada por SEQ ID NO: 58 y la proteína viral del VIH1 , de VIH2, del virus de la Hepatitis B, de los virus de la Hepatitis C, el virus de la Hepatitis E, de la West-Nile virus y de cepas oncogénicas VPH como el VPH 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
En una modalidad preferida, los epítopes primero y segundo (o antígenos) que se fusionan con la enzima hAGT en la fusión de proteínas utilizadas en el método de la invención pertenecen al mismo nivel taxonómico, es decir, pertenecen a la misma familia (por ejemplo, la familia Flaviviridae, la familia Bunyaviridae, la familia Arenaviridae o la familia Filoviridae) o género o especie, pero que tienen diferentes serotipos. En otras palabras, los dichos epítopes primero y segundo pueden ser expresados por los virus estrechamente relacionados, por ejemplo pertenecen a la misma familia, género o especie pero teniendo diferentes serotipos como el virus del dengue 1 , 2, 3 o 4.
Por otra parte, en otra modalidad preferida, dicho primero y segundo epítopes (o antígenos) pertenecen a familias sin relación biológicas o género o especie.
Los epítopes pueden ser epítopes virales. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de epítopes virales. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de virus del Dengue (serotipos 1 , 2, 3 o 4), virus del Nilo Occidental, virus de fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis Saint-Louis, virus de la encefalitis del Valle de Murray, virus de Wesselsbron, virus Zika, virus Roció, virus Usutu, virus de la fiebre del Valle del Rift y epítopes del virus chikungunya. Más preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de virus del Dengue (serotipos 1 , 2, 3 o 4), virus del Nilo Occidental, virus de fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis Saint-Louis, virus de la encefalitis del Valle de Murray, virus Wesselsbron, virus Zika, virus Roció, virus Usutu, virus de la fiebre del Valle del Rift, el virus chikungunya, coronavirus del SRAS, coronavirus humano, virus de Hepatitis C (HCV), virus de Hepatitis E (HEV) o epítopes del virus Schmallenberg.
Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de virus del Dengue (serotipos 1 , 2, 3 o 4), virus del Nilo Occidental, virus de fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis Saint-Louis, virus de la encefalitis del Valle de Murray, virus Wesseisbron, virus Zika, virus Roció, virus Usutu, virus de la fiebre del Valle del Rift, el virus chikungunya, coronavirus del SRAS, coronavirus humano, virus de Hepatitis C (HCV), virus de la Hepatitis E (VHE), virus Schmallenberg, HIV1 , HIV2, virus de la Hepatitis B y epítopes HPV. Al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes alternativamente puede ser elegidos de cualquier grupo de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los virus mencionados anteriormente.
Preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes de Flaviviridae. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes son seleccionadas de epítopes Togaviridae. Preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes Bunyaviridae. Preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes Calicivirídae. Preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes Arenaviridae. Preferentemente, al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes Filoviridae. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de los epítopes Foxviridae.
Los epítopes puede epítopes bacterianos. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de epítopes bacterianos. Preferiblemente, por lo menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes se seleccionan de epítopes Treponema pallidum (http//en. wikipedia. org/wiki/Treponema_pallidum), Helicobacter pylori, Campylobacter jejuni, Borrelia burgdorferi, Legionella pneumophila, Yersinia pestis (http://en.mkipedia.org/wikii/Yersinia _pestis), Yersinia enterocolitica, Brucelh abortus, Burkholderia mallei, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia pneumonía, Frandsella tularensis, Mycoplasma pneumonía, H. influenzae, S. pneumoniae, Klebsieüa pneumoniae, S. aureus, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens, Listeria monocytogenes, Bordetella pertussis, Clostridium tetani, Neisseria meningitidis, S. epidermidis, N. meningiditis, Pseudomonas aeruginosa, Chlamydia trachomatis, Mycobacterium tuberculosis, Coxiella burnetii, Rickettsia prowazekii, Chlamydia psittaci, Leptospirosa interrogans y E.coli (por ejemplo, E.coli, 0157:H7). Al menos 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de los epítopes alternativamente puede ser elegido de cualquier grupo de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 de las bacterias antes mencionadas.
Preferiblemente, al menos 1 , 2, 3 ó 4 epítopes se seleccionan de epítopes Leptospira, más preferiblemente epítopes LruA, LruB, HbpA o LipJ.32.
En algunas modalidades, la primera o segunda proteína de fusión comprende al menos una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de SEQ ID NOs 3-14 y 54-58, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos de los mismos.
En algunas modalidades, la primera y segunda proteína de fusión comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171 , 173, 175, 177 y 179, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos de los mismos.
En algunas modalidades, la primera o segunda proteína de fusión consta de al menos una secuencia de aminoácidos codificada por cualquiera de SEQ ID NOs 3-14 y 54-58 y/o comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171 , 173, 175, 177, 179 o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos de los mismos.
En algunas modalidades, la primera o segunda proteína de fusión comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de una proteína mutada N del coronavirus del SRAS, un RBD de proteína S del coronavirus del SRAS, una proteína N de betacoronavirus humano, una proteína S1 de betacoronavirus humano, un RBD de proteína S de betacoronavirus humano, una proteína mutada C del virus de la Hepatitis C (HCV), un antígeno del núcleo HEV, un antígeno del núcleo HCV, una forma corta del antígeno del núcleo HCV, la proteína NSs de virus Schmallenberg.
En algunas modalidades, la primera o segunda proteína de fusión comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos de secuencias de aminoácidos virales que se muestra en las figuras 12A a 16D y 21 A a 24C.
En algunas modalidades, la primera o segunda proteína de fusión comprende al menos una secuencia de aminoácidos seleccionada de una proteína LruA, LruB o LipL32. Preferentemente, la primera o segunda proteína de fusión comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos de las secuencias de aminoácidos LruA, LruB o LipL32 que se muestra en las figuras 17A a 17D, 18A a 18D o 19A a 19D.
En algunas modalidades, el epítope comprende por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 00, 200 o 300 aminoácidos consecutivo LruA, LruB o LipL32 de las secuencias que se muestra en las figuras 17A a 17D, 18A a 18D o 19A a 19D.
Los inmunoensayos de la invención se basan en la detección de un gran número de anticuerpos, los cuales son conocidos o desconocidos. Por "gran número", en el presente documento es entendido por lo menos 5, más preferiblemente por lo menos 15, más preferiblemente por lo menos 50 y aún más preferiblemente al menos 100 anticuerpos. Por lo tanto, en una modalidad preferida, se utiliza el método de ensayo de la invención para detectar al menos 5, más preferiblemente por lo menos 15 y preferiblemente por lo menos 50 y aún más preferiblemente al menos 100 objetivo anticuerpos en una muestra biológica de un sujeto. No tiene importancia para el método de la invención si los anticuerpos particulares se caracterizan correctamente, puesto que el procedimiento se basa sólo en la detección de la presencia de dichos anticuerpos y no en su naturaleza.
En una modalidad preferida de la invención, las dichas primera y segunda proteínas de fusión que se acoplan con los dichos primeros y segundos soportes sólidos son seleccionadas del grupo formado por: - SEQ ID NO: 21 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-DEN1.EDIII]) SEQ ID NO: 42 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-SBV.N]) SEQ ID NO: 49 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-EV71.VP1]) SEQ ID NO: 51 (correspondiente a la proteína de fusión [JE.sE-SNAP]) SEQ ID NO: 53 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-JE-1.EDIII]) - SEQ ID NO: 60 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-JE-2.EDIII]) SEQ ID NO: 62 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-JE-4.EDIII]) SEQ ID NO: 64 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-JE-5.EDIII]) SEQ ID NO: 66 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-RabV.EDIII]) - SEQ ID NO: 68 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-flavivirus.EDIII]) SEQ ID NO: 70 (correspondiente a la proteína de fusión [RR.sE2-SNAP]) SEQ ID NO: 72 (correspondiente a la proteína de fusión [MAY.sE2-SNAP]) SEQ ID NO: 74 (correspondiente a la proteína de fusión [WEE.SE2-SNAP]) SEQ ID NO: 76 (correspondiente a la proteína de fusión [EEE.sE2-SNAP]) - SEQ ID NO: 78 (correspondiente a la proteína de fusión [VEE.sE2-SNAP]) SEQ ID NO: 80 (correspondiente a la proteína de fusión [AKA.N-SNAP]) SEQ ID NO: 82 (correspondiente a la proteína de fusión [AIN.N-SNAP]) SEQ ID NO: 84 (correspondiente a la proteína de fusión [SHA.N-SNAP]) SEQ ID NO: 86 (correspondiente a la proteina de fusión [huCOV.N-SNAP]) SEQ ID NO: 88 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-huCOV.S]) SEQ ID NO: 90 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-HCV.C]) SEQ ID NO: 92 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-MSP+AMA]) SEQ ID NO: 94 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-HbpA1]) - SEQ ID NO: 96 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-MUB40]) SEQ ID NO: 98 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-moCLEC5A]) SEQ ID NO: 100 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-huCLEC5A]) SEQ ID NO: 102 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-cxVAGO]) SEQ ID NO: 104 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-aaVAGO]) - SEQ ID NO: 109 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-CCHF.N]) SEQ ID NO:111 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-EBO.N]) SEQ ID NO: 113 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-MAR.N]) SEQ ID NO:1 15 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-LAS.N]) - SEQ ID NO: 1 7 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-JUN.N]) SEQ ID NO: 1 19 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-MAC.N]) SEQ ID NO: 121 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-GUA.N]) SEQ ID NO: 123 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-SAB.N]) SEQ ID NO: 125 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-OMSK.EDIII]) - SEQ ID NO: 127 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-KYA.EDIII]) SEQ ID NO: 129 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-ALK.EDIII]) SEQ ID NO: 131 (correspondiente a la proteína de fusión [LAS.ectoGP1-SNAP]) SEQ ID NO: 133 (correspondiente a la proteína de fusión [JUN.ectoGP1-SNAP]) SEQ ID NO: 135 (correspondiente a la proteína de fusión [MAC.ectoGP1-SNAP]) SEQ ID NO: 137 (correspondiente a la proteína de fusión [GUA.ectoGP1-SNAP]) SEQ ID NO: 139 (correspondiente a la proteína de fusión [SAB.ectoGP1-SNAP]) SEQ ID NO: 141 (correspondiente a la proteína de fusión [LAS.ectoGP2-SNAP]) SEQ ID NO: 143 (correspondiente a la proteína de fusión [JUN.ectoGP2-SNAP]) - SEQ ID NO :145 (correspondiente a la proteína de fusión [MAC.ectoGP2-SNAP]) SEQ ID NO: 147 (correspondiente a la proteína de fusión [GUA.ectoGP2-SNAP]) SEQ ID NO: 149 (correspondiente a la proteína de fusión [SAB.ectoGP2-SNAP]), y SEQ ID NO: 151 (correspondiente a la proteína de fusión [SNAP-HEV.C]).
Por consiguiente, el método in vitro de la invención permite detectar enfermedad (es) objetivo que es (son) infección mediada por virus, bacterias, hongos o levaduras. Preferiblemente dicha infección viral es causada por un virus del papiloma o un virus de ARN de las familias de la Flaviviridae (virus del dengue, fiebre amarilla, Nilo Occidental, encefalitis japonesa, encefalitis por picaduras de garrapatas, Hepatitis C), la Togaviridae (Virus Chikungunya, Ross River, Mayaro, encefalitis equina occidental, encefalitis equina oriental, encefalitis equina de Venezuela) la Bunyaviridae (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre del Valle Rift, Schmallenberg), la Caliciviridae (virus de la Hepatitis E), la Arenaviridae (Lassa http://en.wikipedia.org/wiki/Lassa_virus) y la Filoviridae (Ébola, http://en.wikipedia.org/wiki/Ebola_virus, Marburg http://en.wikipedia.org/wiki/Marburg_virus). Preferiblemente, dicha infección bacteriana es causada por Leptospirosa Interrogans. Preferiblemente, dicha infección es causada por Plasmodium falciparum.
Como se utiliza en este documento, el término "muestra biológica" se refiere a las muestras que se han obtenido de un paciente y que podrían contener anticuerpos. Preferiblemente, dicho muestra biológica es un fluido biológico, por ejemplo un líquido biológico sin filtrar tal como orina, líquido cefalorraquídeo, líquido pleural, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido amniótico, fluido gástrico, sangre, suero, plasma, linfa, líquido intersticial, saliva, secreciones fisiológicas, lágrimas, moco, sudor, leche, semen, fluido seminal, secreciones vaginales, líquido de úlceras y otras erupciones superficiales, ampollas y abscesos. También se refiere a un extracto de tejidos, incluyendo biopsias de tejidos normales, malignos y sospechoso o cualesquier otros constituyentes del cuerpo que pueden contener anticuerpos. La dicha muestra biológica puede ser tratada previamente antes de su uso, tal como preparar plasma desde sangre, diluir fluidos viscosos, o similares; métodos de tratamiento pueden involucrar filtración, destilación, concentración, inactivación de compuestos interferentes y la adición de reactivos. En una modalidad preferida, dicha muestra biológica es elegida de sangre entera, suero, plasma, orina, fluido seminal, fluido cerebroespinal y saliva.
Polipéptidos AGT Puede utilizarse cualquier polipéptido con actividad alquiltransferasa de 06-alquilguanina-ADN en el método de la presente invención. Para propósitos de la invención, estos polipéptidos se denominarán "polipéptidos AGT".
AGT irreversiblemente transfiere el grupo alquilo de su sustrato, 06-alquilguanina-ADN, a uno de sus residuos de cisteína. Un análogo del sustrato que reacciona rápidamente con AGT es O6-bencil-guanina, la constante de velocidad de segundo orden siendo aproximadamente 103 seg"1 M"1.
En el contexto de la invención, un polipéptido se dice que tiene "actividad alquilotransferasa de 06-alquilguanina-ADN" (o "Actividad de AGT") si es capaz de transferir irreversiblemente un grupo alquilo de una molécula que contiene 06-alquilguanina a uno de sus propios residuos de cisteína. La " actividad alquilotransferasa de 06-alquilguanina-ADN" de dicho polipéptido puede ser demostrada por, por ejemplo, poner en contacto derivados conocidos de 06-bencil-guanina con etiqueta y monitorear la transferencia de dicha etiqueta en el polipéptido probado. Si el ensayo se realiza in cellulo o en extractos celulares, debe controlarse la reacción de la AGT endógena de las células hospederas, de manera que AGT endógeno no interfiera con dicho polipéptido. Por lo tanto, se utilizan preferiblemente líneas celulares conocidas deficientes de AGT. Ensayos para la identificación de la actividad AGT ahora son bien descritos. Varios derivados de O6-bencil-guanina son comercialmente disponibles (06-bencil-guanina es distribuido por ejemplo por Santa Cruz biotechnology, y marcados con fluorescencia derivados 06-bencil-guan¡na pueden obtenerse de New England Biolabs NEB). Algunos de estos ensayos son descritos en WO 2005/085470 y en WO 2004/031405.
En el contexto de la invención, el "dominio catalítico" del polipéptido AGT corresponde con el sitio activo de dicha enzima, o, en otras palabras, a la parte de la enzima en el cual ocurre la transferencia de los grupos alquilo de su sustrato, 06-alquilguanina-ADN, a un residuo de cisteína reactiva. En la estructura del hAGT ligado con 06-bencilguanina en su sitio activo, cuatro aminoácidos se encuentran en proximidad ya sea del anillo bencílico (Pro140, Ser159, Gly160), o podrían hacer contacto con el N9 de la nucleobase (Asn157). Las mutaciones en la posición Pro 40 y Gly160 han demostrado previamente que afectan la reacción del hAGT con O6-bencilguanina (Xu-Welliver et al., 1999 farmacología bioquímica): una prolina en la posición 140 se cree que es esencial para su interacción con el anillo bencílico, y la mutación Gly160Trp se ha demostrado para aumentar la reactividad de hAGT hacia 06-bencilguanina.
En una modalidad preferida, el polipéptido AGT con actividad alquiltransferasa de 06-alquilguanina-ADN es el polipéptido AGT humano (denominado NP_002403.2) de la secuencia SEQ ID NO: 1 , el AGT de ratón identificado como NP_032624.1 (SEQ ID NO: 18), el MGMT de rata identificado como NP 036993.1 (SEQ ID NO: 19) o una secuencia homologa de la misma, dicha secuencia homologa con actividad de alquiltransferasa O6-alquilguanina-ADN.
Como se utiliza en este documento, el término "homólogo" se refiere a las secuencias que tienen similitud de la secuencia. El término "similitud de la secuencia", en todas sus formas gramaticales, se refiere al grado de identidad o correspondencia entre las secuencias de ácido nucleico o del aminoácido. En el contexto de la invención, dos secuencias de aminoácidos son "homologas" cuando al menos aproximadamente 80%, como alternativa al menos aproximadamente 81%, como alternativa al menos aproximadamente 82%, como alternativa al menos aproximadamente 83%, como alternativa al menos aproximadamente 84%, como alternativa al menos aproximadamente 85%, como alternativa al menos aproximadamente 86%, como alternativa al menos aproximadamente 87%, como alternativa al menos aproximadamente 88%, como alternativa al menos aproximadamente 89%, alternativamente al menos aproximadamente 90%, alternativamente al menos aproximadamente 91%, alternativamente al menos aproximadamente 92%, alternativamente al menos aproximadamente 93%, alternativamente al menos aproximadamente 94%, alternativamente al menos aproximadamente 95%, alternativamente al menos aproximadamente 96%, alternativamente al menos aproximadamente 97%, alternativamente al menos aproximadamente 98%, alternativamente al menos aproximadamente 99% de los aminoácidos son similares. Preferiblemente las secuencias de polipéptidos homologas o similares se identifican mediante el algoritmo Needleman y Wunsch.
Preferiblemente, la secuencia homologa a la enzima AGT comparte al menos el 64% de la identidad de la secuencia del aminoácido, preferiblemente al menos aproximadamente 65% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 66% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 67% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 68% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 69% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 70% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 71 % identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 72% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 73% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 74% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 75% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente identidad de secuencia de aminoácidos de 76%, como alternativa al menos aproximadamente 77% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 78% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 79% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos 80% identidad del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 81 % identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 82% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 83% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 84% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 85% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 86% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 87% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 88% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 89% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 91 % identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 92% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 93% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 94% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente identidad de secuencia del aminoácido de 95%, como alternativa al menos aproximadamente 96% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 97% identidad de secuencia del aminoácido, como alternativa al menos aproximadamente 98% identidad de secuencia del aminoácido y como alternativa al menos aproximadamente 99 identidad de secuencia del aminoácido con SEQ ID NO: 1. En una modalidad preferida, una secuencia homologa de SEQ ID NO: 1 es al menos el 64%, preferiblemente el 70% y más preferiblemente 80% idéntica a SEQ ID NO: 1.
En una modalidad preferida, el polipéptido homólogo dicho es un fragmento o un muíante del polipéptido hAGT de SEQ ID NO: 1 , dicho fragmento o muíante con una actividad de alquiltransferasa O6-alquilguanina-ADN.
Dichos fragmentos pueden tener un tamaño de por lo menos 50, preferiblemente 100 y más preferiblemente 150 aminoácidos y contienen por lo menos el "dominio catalítico" del polipéptido AGT como se definió anteriormente, que es responsable de la actividad alquiloíransferasa O6-alquilguanina-ADN de la enzima AGT. Estos fragmentos pueden obtenerse usando técnicas comunes que son conocidas por el experto en la técnica.
Diferenfes enzimas mufanfes derivadas de AGT nativo han sido descritos hasta ahora (Lim A. et al., 1996; Daniels D.S. et al., 2000; Juillerat A. et al., 2003, WO 2005/085470, WO 2004/031405). En particular, una proteína muíante de 20kDa que contiene las mutaciones Cys62Ala, Lys125Ala, Ala127Thr, Arg128Ala, Gly131 Lys, Gly132Thr, Met134Leu, Arg135Ser, Cys150Ser, Asn157Gly, Ser159Glu íruncado en el aminoácido 182 se ha obíenido (los llamados "AGT26" muíaníes en WO 2005/085470, íambién llamados "SNAP 26" en WO 2006/114409). Este muíante particular "SNAP26" ha demostrado tener actividad etiquetadora mejorada.
En el contexto de la presente invención, la secuencia de un polipéptido más preferido de AGT contiene las mutaciones descritas en WO 2005/085470, que las posiciones pueden fácilmente transponerse en vista de SEQ ID NO: 1 , el residuo de metionina a partir de SNAP26 correspondiente a los residuos de metionina en la posición 32 de SEQ ID NO: 1 (31 aminoácidos se debe por lo tanto agregar a las posiciones divulgadas en WO 2005/085470 para obtener las correspondientes en SEQ ID NO: 1).
En una modalidad preferida, la secuencia homologa AGT útil en la invención corresponde a la secuencia AGT nativa de SEQ ID NO: 1 , en el cual entre 1 y 30, preferiblemente entre 6 y 25, y en particular a 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22 o 23 aminoácidos son sustituidos por otros aminoácidos, y/o 1 a 40, preferiblemente 1 a 20, en particular 10 a 20 aminoácidos, preferiblemente 15 aminoácidos en el C-terminal son deletados.
En una modalidad más preferida, la secuencia homologa AGT contiene las siguientes mutaciones en comparación con SEQ ID NO: : (A) Lys31 sustituido por Arg, o Met32 reemplazado por Ser, o Cys93 sustituido por Ala, o Lys156 sustituido por Ala, o Alai 58 sustituido por Thr, o Arg159 sustituido por Ala, o Gly162 sustituido por Lys, o Gly163 sustituido por Thr, o Met165 sustituido por Leu, o Arg166 sustituido por Ser, o Cys181 sustituido por Ser, o Asn188 sustituido por Gly u Ser190 sustituido por Glu, o Pro sustituida por Gly214, o Ser215 sustituido por Ala, o Ser216 sustituido por Gly, o Gly2 7 sustituido por He, o Leu218 sustituido por Gly, o Gly220 sustituido por Pro, o Ala221 sustituido por Gly o Trp222 sustituido por Ser, o (B) Lys31-Met32 sustituido por Arg-Ser, o Alai 58-Arg 159 sustituido por Thr-Ala, o Gly162-Gly163 sustituido por Lys-Thr, o Metí 65- Arg166 sustituido por Leu-Ser o Gly162-Gly 63/Met165-Arg166 sustituido por Lys-Thr/Leu-ser, o Asn188/Ser190 sustituido por Gly/Glu o Gly214-Ser215-Ser216-Gly217-Leu218 sustituido por Pro-Ala-Gly-lle-Gly, o Gly220-Ala221-Trp222 sustituido por Pro-Gly-Ser, preferiblemente en combinación con cualquier otro reemplazo de aminoácido citado en (A), o (C) Truncamiento después de Leu223 (se deletan aminoácidos 224-238), preferiblemente en combinación con cualquier otro reemplazo del aminoácido citado en (A) o (B).
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas truncadas después de Leu223.
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas en donde dos de las modificaciones (B) están presentes y opcionalmente truncamiento después de Leu223.
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas en donde tres de las modificaciones (B) están presentes y opcionalmente truncamiento después de Leu223.
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas en donde cuatro de las modificaciones (B) están presentes y opcionalmente truncamiento después de Leu223.
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas en donde cinco de las modificaciones (B) están presentes y opcionalmente truncamiento después de Leu223.
Secuencias homologas de AGT preferidas son aquellas en donde seis de las modificaciones (B) están presentes y opcionalmente truncamiento después de Leu223.
Otras secuencias homologas AGT preferidas son aquellas que contienen una combinación de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 mutaciones elegidas entre las modificaciones que se divulgó en (A) y opcionalmente truncadas después de Leu223.
En una modalidad más preferida, el polipéptido AGT de la invención es el muíante SNAP de SEQ ID NO: 2, que es homologa a la enzima hAGT y contiene las mutaciones Lys31Arg, Met32Ser, Cys93Ala, Lys156Ala, Ala158Thr, Arg159Ala, Gly162Lys, Gly163Thr, Met165Leu, Arg166Ser, Cys181 Ser, Asn188Gly, Ser190Glu, Gly214Pro, Ser215Ala, Ser216Gly, Gly217lle, Leu218Gly, Gly220Pro, Ala221Gly, Trp222Ser y truncamiento después de Leu223 en comparación con SEQ ID NO: 1. El mutante SNAP de SEQ ID NO: 2 comparte el 77% de homología con la secuencia de aminoácidos de la 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa humana (SEQ ID NO: 1 , NP_002403.2) y 70% de homología con la secuencia de aminoácidos de la ratón 6-metilguanina-ADN-metiltransferasa (NP_032624.1 , SEQ ID NO: 18).
En una modalidad más preferida, la enzima AGT es la proteína muíante SNAP de SEQ ID NO: 2 o un homólogo, actividad alquilotransferasa de O6-alquilguanina-ADN. Preferiblemente, dicha secuencia homologa a la proteína muíante SNAP es al menos idéntica en más del 80%, preferiblemente 81 %, más preferiblemenfe 82%, más preferiblemente 83%, más preferiblemeníe 84%, más preferiblemenfe 85%, preferiblemente 86%, más preferiblemente 87%, más preferiblemente 88%, más preferiblemenfe 89%, más preferiblemente 90%, más preferiblemente 91 %, más preferiblemente 92%, más preferiblemente 93%, más preferiblemente 94%, más preferiblemente 95%, más preferiblemente 96% y aún más preferiblemeníe 97% de la proteína mutada SNAP de secuencia SEQ ID NO: 2, y íiene actividad alquilotransferasa de O6-alquilguanina-ADN como se definió anteriormente.
Dichos polipéptidos homólogos que tienen actividad alquilotransferasa de O6-alquilguanina pueden ser producidos utilizando íécnicas de ingeniería de proteínas conocidas por el experto en la técnica y/o usando evolución molecular para generar y seleccionar nuevas alquiltransferasas O6-alquilguanina-ADN. Estas técnicas son, por ejemplo mutagénesis dirigida, méfodos de despliegue de fago, mutagénesis de saturación, PCR propenso de errores Para introducir variaciones en cualquier parte de la secuencia, barajado de ADN utilizado después de mutagénesis de saturación o PCR propenso de errores o barajado de familia utilizando genes de varias especies.
En la modalidad preferida, el polipéptido AGT utilizado en el método de la invención es el complemento muíante de SEQ ID NO: 2.
Sustratos AGT La enzima AGT irreversiblemente transfiere el grupo alquilo de su sustrato, 06-alqu¡lguanina-ADN, a uno de sus residuos de cisteína. Sin embargo, sustituciones de 06-bencilguanina en el C4 del anillo bencílico no afectan significativamente la reactividad de AGT contra derivados de O6-bencilguanina. Esta propiedad se ha utilizado para transferir una etiqueta pegada en el C4 del anillo bencílico a AGT (véase WO 2004/031404 y WO 2005/085470).
Un número de derivados de 06-bencilguanina ha demostrado que reaccionan con la enzima AGT al transferir su grupo bencilo a la cisteína del sitio activo de la enzima AGT (cf. Damoiseaux et al., ChemBiochem., 2001 , WO 2004/031404 y WO 2005/085470).
En una modalidad preferida, los sustratos AGT usados en el método de la invención son derivados de O6-bencilguanina que tienen la fórmula I: R1-X-CH2-R3-R4-Y en donde: - R1 es un grupo reconocido por dicho polipéptido AGT como substrato, tal como un grupo heteroaromático que contiene 1 a 5 átomos de nitrógeno y preferiblemente un radical purina de la fórmula: en donde R5 es hidrógeno, halógeno, por ejemplo, cloro o bromo, trifluorometilo, o hidroxi; R6 es hidrógeno, hidroxi o amino sustituidos o no sustituidos; y R2 es hidrógeno, un alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o un radical sacárido; - X es un átomo de oxígeno o azufre; preferiblemente un átomo de oxígeno; - R3 es un grupo aromático o heteroaromático, o un grupo alquilo, cicloalquilo o heterociclilo insaturado opcionalmente sustituido con el doble enlace conectado a CH2; preferiblemente un fenilo, por ejemplo un fenilo sustituido por R4 en la posición para o meta, - R4 es un radical enlazador, - Y es un grupo reactivo, preferiblemente un grupo amino.
En una modalidad preferida, dicho radical enlazador R4 es un enlazador flexible. Las unidades enlazadoras se eligen en el contexto de la aplicación prevista, es decir, en la transferencia del sustrato a una proteína de fusión que comprende AGT. El enlazador no interfiere con la reacción con AGT ni con el anticuerpo objetivo.
Por ejemplo, puede ser un grupo alquileno de cadena recta o ramificada con 1 a 20 átomos de carbono, preferiblemente 5 a 15 átomos de carbono, en la cual: (a) uno o más átomos de carbono son sustituidos por oxígeno, en particular, en donde cada tercer átomo de carbono se sustituye por oxígeno, por ejemplo, un grupo poiletilenooxi con unidades 1 a 5 de etilenoxi; (b) uno o más átomos de carbono son sustituidos por nitrógeno que lleva un átomo de hidrógeno y los átomos de carbono adyacentes son sustituidos por oxo, representando una función amida -NH-CO-; (c) uno o más átomos de carbono se sustituyen por el oxígeno y los átomos de carbono adyacentes son sustituidos por oxo, representando un función de éster -0-CO-; (d) el enlace entre dos átomos de carbono adyacentes es un doble o un triple enlace, representando una función -CH=CH- o -C=C-¡ (e) uno o más átomos de carbono son sustituidos por un fenileno, un cicloalquileno saturado o insaturado, un bicicloalquileno saturado o insaturado, un heteroaromático que puentea o un grupo que puentea heterociclilo saturado o insaturado; (f) dos átomos de carbono adyacentes son sustituidos por un acoplamiento disulfuro -S-S-; o una combinación de dos o más, especialmente dos o tres grupos alquileno y/o alquileno modificado como se define en (a) a (f) arriba, opcionalmente con sustituyentes.
Los sustituyentes considerados son, por ejemplo alquilo inferior, por ejemplo metoxi, alcoxi inferior, por ejemplo, metoxi, aciloxi inferior, por ejemplo acetoxi, o halogenilo, por ejemplo cloro.
En una modalidad preferida, R4 es un grupo de polietilenooxi 1 a 8 con unidades de etilenoxi, compuesto además por uno a cuatro átomos de nitrógeno que lleva un átomo de hidrógeno, que átomos de carbono adyacentes son sustituidos por oxo, representando una función amida -NH-CO- .
En una modalidad más preferida, R4 es -CH2-NH-CO-NH-[C2H4-0]n-, donde n es comprendida entre 1 a 8, preferiblemente de 2 a 6 y es más preferiblemente 3.
En una modalidad preferida, dicho grupo reactivo es un grupo funcional que facilita el apego y la unión del substrato en el soporte sólido. Tales grupos funcionales son bien conocidos en la técnica. Incluyen amina, ésteres activados, acrilamidas, azidas acilo, haluros de acilo, nitrilos acilo, aldehidos, cetonas, haluros de alquilo, anhídridos, haluros de arilo, aziridinas, boronatos, ácidos carboxílicos activados, carbodiimidas, diazoalcanos, epóxidos, haloacetamidas, haloplatinato, halotriazinas, imidos ésteres, isocianatos, isotiocianatos, maleimidas, phosphoramidites, solil haluros, sulfonato ésteres y haluros de sulfonilo. Es preferible el grupo amina -NH2.
En el lado opuesto, el soporte sólido debe ser funcionalizado por grupos complementarios correspondientes a tales grupos reactivos. Los grupos complementarios correspondientes a cada uno de estos grupos reactivos son bien conocidos en la técnica. Se dan por ejemplo en el cuadro I En una modalidad preferida, el substrato AGT utilizado método de la invención es: En otra modalidad preferido, el substrato AGT utilizado en el método de la invención es el enlazador fluorescente señalado "SNAP-cell® 505", con la siguiente fórmula: Este derivado de bencilguanina posee un grupo bencilo purina (guanina) para la interacción específica con el dominio del SNAP, así como un grupo amina libre para el acoplamiento covalente a la superficie de la microesfera. Es comercializada por Nueva Inglaterra BioLabs y ha sido exitosamente acoplado a la superficie de las micropartículas de la invención.
Los sustratos de la invención generalmente son preparados por métodos estándar conocidos en la técnica. Métodos particulares se explican por ejemplo en solicitud de patente WO 2005/085470.
Acoplamiento de sustratos AGT a soportes sólidos La invención incluye substratos AGT se acoplen covalentemente a los soportes sólidos. En el contexto de la presente invención, un sustrato AGT es "covalentemente acoplado" a un soporte sólido si está permanentemente conectado a dicho soporte sólido y sin desorción o lixiviación con el tiempo. Según la invención, un sustrato AGT está conectado permanentemente al dicho soporte sólido si permanece conectado durante un largo periodo de almacenamiento, por ejemplo, típicamente, en menos de 6 meses de almacenamiento. Un número de procedimientos de acoplamiento se han descrito hasta ahora. Cualquiera de estos procedimientos de acoplamiento puede utilizarse en el inmunoensayo de la invención, siempre que el sustrato AGT se convierte permanentemente al soporte sólido.
Acoplamiento de las proteínas de fusión AGT-Antígeno a soportes sólidos La invención además incluye métodos para acoplamiento antígenos a soportes sólidos comprende los dos pasos siguientes: i) el recubrimiento de superficies sólidas con un sustrato AGT (por ejemplo, BG-PEG-amino) y ii) la inmovilización covalente del proteínas de fusión quiméricas [AGT-antígeno] usando el substrato AGT como ancla (véase figura 1 ). Antes de ser recubierto con dicho sustrato AGT, las superficies sólidas son funcionalizadas ventajosamente, preferiblemente usando un proceso de carbodiimida de dos pasos optimizado (Kufer SK, Eur. Biophys. J. 2005), para que el sustrato AGT se una covalentemente a las superficies sólidas. Una vez que se han realizado estos pasos, las superficies sólidas llevan sustratos AGT irreversiblemente enlazados a las proteínas de fusión quiméricas [AGT-antígeno]. Debido a la alta especificidad de esta reacción, la proteína de fusión está acoplada exclusivamente mediante el dominio que contiene cisteína de la enzima AGT, dejando así el antígeno accesible para sus interacciones con los anticuerpos.
Este procedimiento de acoplamiento es muy ventajoso ya que permite la unión del antígeno de una manera orientada sobre los soportes sólidos. También, este procedimiento de acoplamiento de antígeno ventajosamente permite obtener una organización de antígeno multimérica sobre una superficie sólida, con el fin de mejorar la inmunoglobulina G, y potencialmente de la inmunoglobulina M, capturar la eficiencia.
En consecuencia, las microesferas acopladas con antígeno desarrolladas en la parte experimental de la aplicación han mostrado mayor captura de anticuerpos específicos en comparación con las microesferas acopladas con antígeno producidas por procedimientos de acoplamiento de amina no orientada estándar (véase la parte experimental abajo y la figura 3). Finalmente, este procedimiento de acoplamiento de antígeno permite obtener un acoplamiento de alta eficiencia y una estabilidad a largo plazo de las microesferas conjugadas con el antígeno (>6 meses a 4°C).
En el inmunoensayo de la invención, el acoplamiento covalente se realiza preferiblemente poniendo en contacto los sustratos AGT (que contienen un grupo reactivo Y, como se mencionó anteriormente) con soportes sólidos que han sido previamente funcionalizados con un grupo complementario tales como ésos descritos en el cuadro I de WO 2010/107433, cuya descripción se incorpora aquí por referencia.
Así, en una modalidad preferida, los métodos de la invención utilizan soportes sólidos que han sido funcionalizados con un grupo que es complementario al grupo reactivo del sustrato de AGT, antes de estar en contacto con el sustrato AGT.
Un procedimiento preferido y convencional para acoplar covalentemente un sustrato AGT a la superficie de soportes sólidos se basa en la reacción carbodiimida y utiliza carbodiimida soluble en agua. Según este procedimiento, soportes sólidos tienen grupos carboxilos superficiales disponibles para la fijación del sustrato AGT reactivo que contiene amina o sulfidrilo. Así, en esta modalidad preferida, los métodos de la invención utilizan soportes sólidos que han sido funcionalizados con grupos de carboxilo superficial antes de contactarse con el sustrato AGT.
En este caso, el primer paso del método de la invención es activar los grupos carboxilo cubriendo los soportes sólidos. Esta activación se realiza generalmente mediante la adición de un supuesto "regulador de pH de activación", por ejemplo una solución de 50 mg/ml EDAC o una solución de 50 mg/ml S-NHS. Estas soluciones están disponibles comercialmente. La activación de los soportes sólidos se realiza generalmente incubando dichos soportes con el regulador de pH de activación a temperatura ambiente durante aproximadamente minutos (por ejemplo 5 minutos a 30 minutos), según las instrucciones del fabricante.
Lo importante, acoplamiento del sustrato AGT sobre el soporte sólido covalente deberá llevarse a cabo en condiciones particulares, con el fin de preservar la solubilidad del substrato AGT y la integridad del grano (fluorocromo interna). Los inventores han observado que los substratos AGT deben ser suspendidos en un regulador de pH "acoplamiento covalente" que contiene entre 0 y 20% de dimetilsulfóxido (DMSO). En particular, los inventores han observado que las concentraciones de DMSO por encima del 20% pueden afectar el paso de detección de los métodos de la invención. Preferiblemente, dicho regulador de pH es un regulador de pH PBS que contiene entre 0 y 20% de DMSO, más preferiblemente entre 10% y 20% de DMSO.
Ventajosamente, los sitios inespecíficos en los soportes sólidos que no han estado unidos covalentemente al sustrato AGT pueden ser bloqueados aún más por cualquier medio convencional, por ejemplo, mediante el uso de un regulador de pH de bloqueo que contiene 1 % de albúmina sérica bovina (BSA) o cualquier proteína saturación (por ejemplo caseína).
Una vez que los soportes sólidos de la invención han sido acoplados covalentemente con el sustrato AGT (preferiblemente a través de un enlace covalente carbodiimida), los soportes sólidos luego son contactados por las proteínas de fusión de la invención, con el fin de un par de los epítopes específicamente reconocidas por los anticuerpos objetivo a dichos soportes.
Otra vez, este paso del acoplamiento debe ser realizado bajo condiciones particulares. Como un hecho, el sitio catalítico de la enzima AGT y la estructura conformacional de los antígenos/epítopes que son llevadas por las proteínas de fusión deben conservarse durante el procedimiento de acoplamiento. Los inventores identificaron que la proteína de fusión debe ser suspendida en un regulador de pH que contiene ditiotreitol (DTT), preferiblemente un regulador de pH PBS/DTT, para que el acoplamiento sea eficiente. Ventajosamente, dicho regulador de pH de acoplamiento contiene Tween 20; de hecho, se ha observado por los inventores presentes que la adición de Tween 20 al medio de acoplamiento ayuda a evitar la agregación de grano. Preferiblemente, el regulador de pH de acoplamiento contiene 0.02% de Tween 20. Más preferiblemente, el regulador de pH de unión covalente de la invención es un regulador de pH PBS de pH 7.4, que contiene 0.02% Tween 20 y 1 mM DTT.
Otras condiciones de acoplamiento son las habituales. Preferiblemente, el acoplamiento covalente del sustrato AGT y el acoplamiento de la proteína de fusión a los soportes sólidos se realizan a temperatura ambiente. Si los soportes sólidos están etiquetados fluorescentemente, dicho procedimiento se realiza más preferiblemente en la oscuridad.
La presente invención incluye un método para el acoplamiento covalente un polipéptido AGT que tiene actividad alquilotransferasa O6-alquilguanina-ADN, sobre un soporte sólido funcionalizado, que comprende los siguientes pasos: a) activación del dicho soporte sólido funcionalizado, b) adición de un sustrato de dicho polipéptido AGT, dicho sustrato siendo suspendido en un regulador de pH que contiene entre 0 y 20% de DMSO, en condiciones adecuadas para que el sustrato se una covalentemente a dicho soporte, c) poner en contacto dicho polipéptido AGT con el soporte de sustrato revestido de paso b) en un regulador de pH PBS/DTT, en donde se lavan moléculas no ligadas hacia fuera después de los pasos b) y c).
Los lavados pueden realizarse mediante el uso de cualquier tipo de reguladores de pH de lavado adecuados. Dichos reguladores de pH son utilizados habitualmente por los expertos en la técnica y no necesitan ser detallados más aquí. Preferiblemente, se utiliza un regulador de pH PBS.
Como se utiliza en este documento, "las condiciones apropiadas" son las habituales. Preferiblemente, el acoplamiento covalente del sustrato de AGT se realiza a temperatura ambiente y, si los soportes sólidos están etiquetados fluorescentemente, en la oscuridad.
La funcionalización del sólido soporte puede realizarse por cualquier medio convencional (como los recordados más arriba). En consecuencia se realiza la activación de dicho soporte sólido funcionalizado.
En una modalidad preferida, los soportes sólidos dicho son funcionalizados con grupos carboxilos superficiales y activados aún más con un regulador de pH de activación clásica o, por ejemplo una solución de 50 mg/ml EDAC o una solución de 50 mg/ml S-NHS.
En una modalidad preferida, DTT es una concentración de 1 mM en el regulador de pH PBS/DTT.
La presente invención también se refiere a un soporte sólido que ha sido obtenida por el método mencionado y a la utilización de dicho soporte sólido en el inmunoensayo de la invención.
Dichos soportes sólidos luego pueden almacenarse en reguladores de pH de almacenamiento convencional, por ejemplo que contienen 0.5 g/l de azida de sodio, 0.1 % de BSA, 0.02% Tween 20 o 1 mM DTT.
Todos estos pasos de acoplamiento son preferiblemente realizados in vitro, en reguladores de pH que carezcan de células vivas, así que no hay que tener en cuenta la reacción con enzimas endógenas de AGT, y la reacción de la proteína de fusión de AGT (exógena) por lo tanto es altamente específica.
Soportes sólidos Los soportes sólidos que pueden utilizarse en los métodos de la invención pueden ser de cualquier tipo, por ejemplo tubos de ensayo, pocilios de microtitulación, hojas, granos, fichas y/o micropartículas, siempre que puedan ser específicamente identificados unos de otros. Tal identificación es posible por ejemplo cuando se encuentran por separado en el espacio (por ejemplo los pocilios en una placa de m icrotitu lacio n, o en lugares diferentes en una ficha) o cuando están rotuladas diferentemente. Un "soporte sólido" por lo tanto tiene que entenderse en un sentido amplio, es decir, mediante la designación de, ya sea pequeñas partes discretas de un soporte sólido entero (en el caso de una placa o un bioficha), o una gran cantidad de micropartículas idénticas que comparten características comunes detectables (en lo sucesivo, las micropartículas "subconjunto").
En modalidades preferidas, los soportes sólidos utilizados en los inmunoensayos de la invención deben ser intrínsecamente identificables, así es posible determinar precisamente que el antígeno es llevado por el cual soporte sólido. Los soportes sólidos acoplados con antígeno e identificables entonces se utilizan como capturar los reactivos para las inmunoglobulinas humanas específicas y por lo tanto, se ponen en contacto con la muestra biológica del paciente.
En una modalidad preferida, los soportes sólidos utilizados en esta invención pueden ser específicamente identificados por su ubicación específica, tamaño, diámetro, peso, granulometría, y/o etiquetado. Tal etiquetado es por ejemplo un fluorocromo, un fluoróforo, un cromóforo, un radioisótopo, una etiqueta de masa o cualquier etiqueta poco perceptible que se conoce en la técnica.
Los soportes sólidos utilizados en la invención pueden hacerse de cualquier material, por ejemplo poliestireno, celulosa, nitrocelulosa, vidrio, cerámica, resina, caucho, plástico, sílice, silicona, metal y/o polímero. Los materiales poliméricos incluyen poliestireno bromado, ácido poliacrílico, poliacrilonitrilo, poliamida, poliacrilamida, poliacroleina, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato, poliéster, polietileno, polietileno tereftalato, polidimetilsiloxano, poliisopreno, poliuretano, polivinilacetato, policloruro de vinilo, polivinilpiridina, polivinilbencilcloruro, poliviniltolueno, cloruro de polivinilideno, polidivinilbenceno, polimetacrilato de metilo, poliláctido, poliglicolida, poli(lactida-co-glicolida), polianhídrido, poliortoéster, polifosfaceno, polifosofaza, polisulfona, o combinaciones de las mismas, que también son aceptables. La mayoría de estos soportes está comercialmente disponible. Por ejemplo, granos de polímeros sintéticos como el poliestireno, poliacrilamida, poliacrilato o látex están comercialmente disponibles de numerosas fuentes como Bio-Rad Laboratories (Richmond, California) y LKB Produkter (Estocolmo, Suecia). Granos formados por macromoléculas naturales y partículas como agarosa, agarosa reticulado, globulina, ácido nucleico desoxirribosa y liposomas están comercialmente disponibles de fuentes tales como Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, Nueva Jersey), e IBF (Francia). Los granos forman de copolímeros de poliacrilamida y agarosa están comercialmente disponibles de fuentes tales como IBF y Pharmacia.
Cuando se utilizaron soportes poliméricos, grupos carboxilos pueden agregarse a la superficie del sólido soporte mediante la incorporación de monómeros que contienen tales grupos en los polímeros (por ejemplo, ácido acrílico, ácido metacrilico, ácido itacónico y similares). Alternativamente, puede añadirse a la ayuda por otra reacción química de un polímero con otros grupos reactivos precursores que se pueden convertir a los grupos carboxilos (por ejemplo, mediante hidrólisis de anhídridos, tales como anhídrido maleico, o por la oxidación de grupos finales metilol o aldehido superficiales), como ya se describió.
En una modalidad preferida, los soportes sólidos utilizados en la invención son micropartículas. Dichas micropartículas tienen preferiblemente un diámetro de menos de un milímetro, preferiblemente un diámetro de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ,000 micrómetros (µ??). Aunque las micropartículas pueden ser de cualquier tamaño, el tamaño preferido es 1-100 pm, más preferiblemente 2-50 pm, más preferiblemente 3-25 pm y más preferiblemente aproximadamente 6- 2 pm. Las micropartículas están hechas de cualquier material de forma regular. La forma preferida es esférica; sin embargo, las partículas de cualquier otra forma pueden emplearse ya que este parámetro es irrelevante a la naturaleza de la invención. La forma de la partícula puede servir como un parámetro adicional de distinción, que es discriminado por citometría de flujo, por ejemplo, mediante un método de análisis de abertura de alta resolución.
Como se utiliza en lo sucesivo los términos "micropartículas", "microesferas", o "microgranos" se usan indistintamente y tienen significados equivalentes con los que se refieren a las pequeñas partículas con diámetro total que recae esencialmente en la gama micrométrica. Los términos "nanoesferas", "nanopartículas" o "nanogranos" se refieren a las partículas más pequeñas con tamaño total que recae esencialmente en la gama nanométrica. Como se utiliza en lo sucesivo las partículas término general, esferas, o "granos" se refiere tanto a las micropartículas como a las nanopartículas, que efectivamente pueden servir como sólida en los métodos de la invención.
En el contexto de la presente invención, un "subconjunto" de micropartículas corresponde a numerosas micropartículas idénticas que poseen las mismas características y que han sido cubiertas con el mismo epítope. Importantemente, cada subconjunto de micropartículas debe ser distinguible de otros subconjuntos de la población por lo menos una característica (por ejemplo ubicación, tamaño, diámetro, peso, granulometría y/o etiquetado).
En una modalidad preferida, se pueden distinguir los diferentes subconjuntos de micropartículas como están etiquetadas de manera diferente (por ejemplo, con un fluorocromo, un fluoróforo, un cromóforo, un radioisótopo, una etiqueta de masa o cualquier etiqueta poco perceptible que se conoce en la técnica).
En una modalidad más preferida, los diferentes subconjuntos de micropartículas pueden distinguirse porque están etiquetadas fluorescentemente de manera diferente, como se propone en US 5,736,330, US 5,981 ,180, US 6,057,107, US 6,268,222, US 6,449,562, US 6,514,295 , US 6,524,793 y US 6,528,165. Más precisamente, estos subconjuntos diferentes pueden ser teñidos con tintes fluorescentes diferentes y/o diferentes concentraciones de uno o más tintes fluorescentes. Por lo tanto, los diferentes subconjuntos pueden tener diferentes firmas fluorescentes (por ejemplo diferentes longitud(es) de onda fluorescente(s), diferentes intensidades fluorescentes, etc.) que pueden ser medidas y utilizadas por un sistema de medición para determinar el subconjunto al que pertenecen micropartículas individuales (es decir, para clasificar las micropartículas según el subconjunto).
En una modalidad preferida, las micropartículas utilizadas en la invención se etiquetan internamente con tintes fluorescentes, como propone en EP 1 204 869, que se incorpora aquí para referencia.
Estas micropartículas también pueden incorporar imanes u óxidos metálicos magnéticamente receptivos seleccionados del grupo formado por superparamagnéticos, paramagnéticos y ferromagnéticos de óxido de metal. Granos magnéticos son por ejemplo comercialmente disponible de fuentes tales como Dynal Inc. (Great Neck, NY) o se pueden preparar usando los métodos conocidos en la técnica como por ejemplo en U.S. 4,358,388; US 4,654,267; US 4,774,265; US 5,320,944; y US 5,356,713. En una modalidad preferida, los soportes sólidos utilizados en la invención por lo tanto son magnéticos.
En una modalidad más preferida, los soportes sólidos utilizados en la invención son micropartículas internamente etiquetadas con tintes fluorescentes con magnetita encapsuiada en una capa externa de polímeros funcionales que contienen grupos de carboxilo superficiales para el acoplamiento covalente de los ligandos, como los que se comercializan por Luminex Corp bajo el nombre comercial de MagPlex.
También es posible utilizar microesferas MicroPlex (vendidas por Luminex) que son carboxilado poliestireno micro-partículas que han sido codificadas con color en regiones espectralmente distintas. Estas regiones pueden ser distinguidas rápidamente por un xMAP Instrument que permite el interrogatorio de hasta 100 diferentes analitos simultáneamente de una sola muestra de volumen.
También es posible utilizar microesferas SeroMAP (vendidas por Luminex) que son una fórmula especial de microesferas MicroPlex que han sido optimizadas para reducir la fijación no específica en los análisis de serología.
Detección de anticuerpos unidos La invención consiste en detectar la presencia de los anticuerpos que están enlazados a los epítopes y por lo tanto a los soportes sólidos detectables. Al analizar cual subconjunto de anticuerpos de micropartículas están ligados, se puede deducir fácilmente que los anticuerpos estaban presentes en la muestra biológica, y por lo tanto, por qué patógeno estaba infectado el sujeto probado.
Cualquier tecnología conocida puede utilizarse para detectar la presencia de los anticuerpos que están ligados a los soportes sólidos. Por ejemplo, los anticuerpos secundarios etiquetados que reconocen específicamente la parte constante de las inmunoglobulinas del sujeto pueden utilizarse, como se muestra en la parte experimental. Es importante señalar que el etiquetado de los detectores de anticuerpos debe ser diferente del soporte sólido, con el fin de distinguir entre los soportes sólidos que están acoplados a los anticuerpos y aquellos que no lo están.
Alternativamente, las inmunoglobulinas presentan en los sueros de animales infectados o los seres humanos pueden ser conjugadas directamente a R-ficoeritrina (R -PE), usando un protocolo de etiquetado de anticuerpo de un solo paso (Lightning-Link™ kit de conjugación de R-ficoeritrina - Innova Biosciences). El tiempo de prueba durante todo el procedimiento es generalmente 20-30 segundos y permite el etiquetado de pequeñas cantidades de inmunoglobulinas con 100% de recuperación. Este procedimiento elimina la necesidad de reactivos secundarios, tales como anticuerpos anti-especies conjugados y estreptavidina-R-ficoeritrina, en experimentos de inmunoensayo múltiplex.
Cuando las micropartículas internamente etiquetadas con tintes fluorescentes se utilizan, el instrumento de detección fluorescente debe estar equipado con un láser de primero para detectar el tipo de microesfera y un segundo para asegurar la cuantificación de captura de IgM o IgG excitando el fluoróforo que se conjuga con el anticuerpo de detección específica.
Con sus amplias capacidades de multiplexación y límite inferior de detección, este enfoque ofrece ahorros sustanciales en costos y muestras sobre las mediciones tradicionales de ELISA. Por otra parte, los conjuntos seleccionados de las microesferas son adaptables a un sistema de detección fluorescente compacto, robusto y económico como el MagPix (Luminex Corporation).
En esta modalidad, el método de la invención permite analizar simultáneamente hasta 100 tipos de microesferas juntados por pocilio utilizando una herramienta de análisis de flujo y brinda mucha mayor sensibilidad que se espera que sea del orden de varios órdenes de magnitud mayores que la de sistemas y métodos utilizados actualmente.
De interés, el método de la invención permite realizar análisis serológico de alto rendimiento para diagnosticar infecciones múltiples en un individuo, ya sea humano o animal.
Kits de inmunoensavo múltiplex La presente invención proporciona kits adecuados para el uso en la detección de anticuerpos contra antígenos específicos. Cualquiera de los antígenos o epítopes descritos aquí se pueden incorporar en los kits.
La invención abarca los kits para la detección de anticuerpos específicos contra los virus, bacterias, parásitos, animales, prión, levadura y proteínas fúngicas.
El kit comprende al menos dos soportes sólidos. La invención abarca un kit compuesto por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., soportes sólidos y un kit compuesto por al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., diferentes epítopes. El kit comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100 etc., soportes sólidos mezclados juntos. Los epítopes pueden ser reconocidos por los anticuerpos objetivos.
En una modalidad, el kit comprende un primer soporte sólido que comprende una primera proteína de fusión AGT-Antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT, y un segundo soporte sólido que comprende una segunda proteína de fusión de AGT-Antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT.
En una modalidad, el kit comprende: un primer soporte sólido que comprende una primera proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un segundo soporte sólido que comprende una segunda proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un tercer soporte sólido que comprende una tercera proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un cuarto soporte sólido que comprende una cuarta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un quinto soporte sólido que comprende una quinta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un sexto soporte sólido que comprende una sexta proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un séptimo soporte sólido que comprende una séptima proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un octavo soporte sólido que comprende una octava proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un noveno soporte sólido que comprende una novena proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, un décimo soporte sólido que comprende una décima proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, En otras modalidades, el kit puede constar de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 soportes sólidos que comprenden 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 proteínas de fusión AGT-antígeno covalentemente acopladas a un sustrato AGT.
En una modalidad, el kit comprende un primer soporte sólido covalente acoplado con un primer epítope reconocido por el primer anticuerpo objetivo, un segundo soporte sólido covalentemente acoplado con un segundo epítope que es reconocido por un segundo anticuerpo objetivo, y no por dicho primer anticuerpo objetivo, en donde al menos dos soportes sólidos pueden ser específicamente identificados unos de otros y permiten la detección de dos anticuerpos objetivo distintos.
En una modalidad preferida, la invención incluye un kit para la detección de por lo menos dos anticuerpos objetivo en una muestra biológica que comprende: (a) un primer soporte sólido compuesto por un sustrato AGT covalentemente acoplado a una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido AGT que tiene una actividad alquilotransferasa 06-alquilguanina-ADN y un primer epítope que es reconocido por un primer anticuerpo objetivo; y (b) un segundo soporte sólido compuesto por un sustrato AGT covalentemente acoplado a una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido AGT que tiene una actividad alquilotransferasa 06-alquilguanina-ADN y un segundo epítope que es reconocido por un segundo anticuerpo objetivo, pero no por dicho primer anticuerpo objetivo.
En modalidades preferidas, el kit comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., diferentes epítopes virales.
En modalidades preferidas, el kit comprende al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50, 100, etc., diferentes epítopes bacterianos.
El kit puede ser específico para los virus, bacterias o parásitos. El kit puede ser específico para una familia de virus o bacterias, o puede basarse en similares síntomas clínicos asociados (es decir, enfermedades de la niñez, síndromes respiratorios o hemorrágicos, etc.).
El kit puede ser específico para las inmunoglobulinas, en donde el kit detecta anticuerpos a por lo menos 2, 3, 4, o 5 inmunoglobulinas seleccionadas de IgD, !gG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgM, IgE e IgG total.
El kit puede ser específico para un patógeno de bioterrorismo, en el cual el kit detecta anticuerpos a por lo menos 2, 3, 4 o 5 proteínas seleccionadas de Francisella tularencis, Bacillus anthracis, Clostridium botulinum, Yersinia pestis, viruela, virus de Marburg, el virus del Ébola, virus de Lassa y las proteínas del virus Machupo.
El kit puede ser específico para un virus de la gripe, en donde el kit detecta anticuerpos a por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, o 16 influenzas diferentes o proteínas SARS.
El kit puede ser determinado por un poxvirus, en donde se detecta anticuerpos en por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15 o 16 diferentes poxvirus. El poxvirus puede ser un ortopox (virus de viruela/viruela, virus vaccinia (http://en.wikipedia.org/wiki/Vaccinia), virus viruela vacuna (http://en.wikipedia.org/wiki/Cowpox) o virus de viruela símica http://en.wikipedia.org/wiki/Monkeypox), parapox (virus Orí, pseudocowpox, virus de la estomatitis papular bovina), yatapox (virus tanapox (http://en.wikipedia.org/wiki/Tanapox), virus del tumor yaba de mono (http://en.wikipedia.org/wiki/Yaba_monkey_tumor_virus)) o molluscipox (http://en.wikipedia.org/wiki/Molluscum_contagiosum).
La invención incluye kits para la detección de anticuerpos contra las proteínas humanas, incluyendo cáncer y antígenos tumorales, marcadores de toxicidad renal, citocinas, quimiocinas, factores de crecimiento, los antígenos están involucrados en las enfermedades autoinmunes, y las inmuno-globulinas.
La invención incluye kits para la detección de anticuerpos contra alérgenos.
En una modalidad preferida, al menos un epítope es un epítope viral. En una modalidad preferida, dicho primero y/o segundo epítope está presente en una proteína viral elegida en el grupo formado por: la proteína EDIII del virus del dengue 1 de SEQ ID NO: 3, la proteína EDIII del virus del dengue 2 de SEQ ID NO: 4, la proteína EDIII del virus del dengue 3 de SEQ ID NO: 5, la proteína EDIII del dengue virus 4 de SEQ ID NO: 6, la proteína EDIII el virus del Nilo occidental de SEQ ID NO: 7, la proteína EDIII del virus de la fiebre amarilla de SEQ ID NO: 8, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de SEQ ID NO: 9, la proteína EDIII del virus Zika de SEQ ID NO: 10, la proteína EDIII del virus Wesselbron de SEQ ID NO: 11 , la proteína EDIII del Roció virus de SEQ ID NO: 12, la proteína EDIII del virus de la encefalitis de Murray de SEQ ID NO: 13 y la proteína EDIII del virus de la encefalitis de San Louis de SEQ ID NO: 14, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 codificado por SEQ ID NO: 54, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 2 codificados por SEQ ID NO: 55, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 4 codificado por SEQ ID NO: 56, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 codificado por SEQ ID NO: 57, la proteína EDIII del virus Rabensburg codificado por SEQ ID NO: 58y la proteína viral del VIH1 VIH2, del virus de la Hepatitis B, del virus de la Hepatitis C, el virus de la Hepatitis E, del virus del Nilo Occidental y de cepas de VPH oncogénicas como VPH 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
Preferiblemente, este kit contiene también los medios para detectar los al menos dos objetivo anticuerpos que están limitados a los soportes sólidos. Dichos medios son más preferiblemente anticuerpos secundarios reconociendo la parte constante de los anticuerpos objetivo. Dichos anticuerpos secundarios pueden ser etiquetados, siempre que el etiquetado no es lo mismo que los que están presentes en el soporte sólido. Sin embargo, es posible utilizar el mismo etiquetado para todos los anticuerpos secundarios que se utilizan para detectar los anticuerpos que admiten sólidos, ya que la información sobre el patógeno infeccioso se da únicamente por la identificación del soporte sólido que está ligado a los anticuerpos.
El kit de la invención puede contener otros ingredientes que son aceptados como reactivos estándar como un regulador de pH de lavado, recipientes de plástico necesarios, y similares.
En una modalidad preferida, el kit de la invención comprende por lo menos 10, preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 100 sólidos apoyos diferentemente acoplados, dicho soportes sólidos siendo por ejemplo subconjuntos de micropartículas como se definió anteriormente.
En una modalidad más preferida, los soportes sólidos son microesferas, por ejemplo aquellos que internamente están marcados con un pigmento fluorescente con magnetita encapsulado en una capa externa de polímeros funcionales que contienen grupos carboxilo superficial.
En otra modalidad preferida, en el kit de la invención, los soportes sólidos se mezclan en por lo menos un solo compartimiento.
Ventajosamente, el kit de la invención contiene soporte(s) condicional(es), por ejemplo, placas de microtitulación, conteniendo subconjuntos de diferentes micropartículas recubiertas con antígeno definidos anteriormente. En una modalidad preferida, los subconjuntos de micropartículas que se mezclan en por lo menos un solo compartimiento (por ejemplo un pocilio o un tubo). Este dispositivo es descrito en la figura 1 1.
El kit de la invención también puede contener a recipientes (por ejemplo, tubos) que contiene los dichos subconjuntos de micropartículas recubiertas con antígeno.
La presente invención también apunta a la utilización del kit de la invención para la detección de al menos dos, preferiblemente al menos 10, más preferiblemente por lo menos 50 y aún más preferiblemente al menos 100 objetivo anticuerpos en una muestra biológica de un sujeto.
En una modalidad preferida, el kit de la invención se utiliza para detectar al menos dos, preferiblemente al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 anticuerpos objetivos que se generan sobre la infección por virus endémicos o parásitos de la misma región geográfica. Por ejemplo, el kit de la invención podría contener micropartículas que son recubiertas con antígenos de virus o parásitos que son específicos de las regiones de África, como el virus del Dengue tipo 1 , tipo 2, tipo 3, tipo 4, el virus de la fiebre amarilla, el virus del Nilo Occidental, el Usutu virus, el virus Zika, Wesseisbron virus, el virus Shamonda, el virus de la fiebre del Valle del Rift, el virus Chikungunya, el virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, el virus del Ébola, el virus de Marburg, el virus de Lassa, virus de la Hepatitis C, el virus de la Hepatitis E, el Enterovirus 71 , Plasmodium falciparum o Leptospira interrogans.
El Cuadro 1 describe ejemplos de combinaciones de microesferas acopladas con antígeno que pueden ser incluidos en el kit de la invención según la región geográfica que está destinado (Asia, Europa, América, Oceanía o África).
El kit de la invención puede contener alternativa microesferas acopladas con antígeno que permiten el diagnóstico de virus o parásitos que inducen síntomas específicos (similares a la gripe, encefalitis, o fiebre hemorrágica) o que infectan animales específicos, para que pueda ser adaptado a cada paciente/animal.
El Cuadro 1 describe ejemplos de combinaciones de microesferas acopladas con antígeno que pueden ser incluidas en el kit de la invención dependiendo de los síntomas del paciente o del animal.
CUADRO 1 Agente Microesferas acopladas a antígeno Paneles de Microesferas Geográfico Sindrómico Veterinario Género Especie Abreviatura Descripción Flavivirus Virus del Dengue Tipo 1 SNAP+DEN1.EDIII Dominio III envolvente X X X X X X X Virus del Dengue Tipo 2 SNAP+DEN2.EDIII Dominio III envolvente X X X X X X X Virus del Dengue Tipo 3 SNAP+DEN3.EDIII Dominio III envolvente X X X X X X X Virus del Dengue Tipo 4 SNAP+DEN4.EDIII Dominio III envolvente X X X X X X X Virus de Fiebre Amarilla SNAP+YF.EDIII Dominio III envolvente X X X X Virus del Nilo SNAP+WNV.EDIII Forma soluble de la protelna X X X X X X X X Occidental envolvente secretada WNV.pr -sE+SNAP Dominio lil envolvente X X X X X X X X Virus Usutu SNAP+USU.EDIII Dominio III envolvente X X X X Virus de encefalitis JE.pr -sE+S AP Forma soluble de la protelna X X X X japonesa genotipo 3 envolvente secretada Virus de encefalitis SNAP+JE-1.EDIII Dominio III envolvente X X X X japonesa genotipo 1 Virus de encefalitis SNAP+JE-2.EDIII Dominio III envolvente X X X X japonesa genotipo 2 Virus de encefalitis SNAP+JE-2.EDIII Dominio III envolvente X X X X japonesa genotipo 3 Virus de encefalitis SNAP+JE-4.EDIII Dominio III envolvente X X X X japonesa genotipo 4 Virus de encefalitis SNAP+JE-5.EDIII Dominio III envolvente X X X X japonesa genotipo 5 Virus de encefalitis del SNAP+MVE.EDIII Dominio III envolvente X X X X Valle de urray Virus de Encefalitis de SNAP+SLE.EDIII Dominio III envolvente X X X X Saint- Louis Virus Zica SNAP+ZIKV.EDIII Dominio III envolvente X X X X Virus Wesselsbron SNAP+WSL.EDIII Dominio III envolvente X X X Virus Roció SNAP+ROCV.EDIII Dominio III envolvente X X Virus Rabensburg SNAP+RabV.EDIII Dominio III envolvente X Flavivirus Insectívoro SNAP+lnsectflavi.EDIII Dominio III envolvente X (coll. La Timone) Virus de encefalitis SNAP+TBE.EDIII Dominio III envolvente X X X transmitida por garrapatas frica Á Asia pa Euro Acaméri Oaceaní p Gialr iti Encefal aica á Hemorr ebre Fi a Bovin nf. E qa Euin nf. E Virus de fiebre hemorrágica de SNAP+OMSK.EDI 11 Dominio III envolvente X X Omsk Virus de la enfermedad de la SNAP+KAS.EDIII Dominio III envolvente X X selva de Kyasanur Virus de Akhumra SNAP+ALK.EDIII Dominio III envolvente X X Orthobunyavirus Virus de Schmallenberg SNAP+AKA.N Nucleoproteína N X X Virus de Akabano SNAP+AKA.N Nucleoproteína N X X X Virus de Aino SNAP+AIN.N Nucleoproteína N X X X Virus Shamonda SNAP+SHA.N Nucleoproteína N X X X Bunyavirus Virus de fiebre del Valle Rift SNAP+RVF.N Nucleoproteína N X X X X X Alphavirus Virus de Chikungunya CHI .SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X X X X X E2 secretada Virus del Río Ross RR.SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X X E2 secretada Virus de Mayoro AY.SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X E2 secretada Virus de encefalitis equina oriental EEE.SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X X E2 secretada Virus de encefalitis equina WEE.SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X X occidental E2 secretada Encefalitis equina venezolana VEE.SE2+SNAP Forma soluble de glicoproteína X X X E2 secretada Nairovirus Virus de fiebre hemorrágica de SNAP+CCHF.N Nucleoproteína N X X X X X Crimea-Congo Ebolarius Vorus del Ébola (Zaire) SNAP+EBO.N Nucleoproteína N X X Morburgvirus Virus de Marburg SNAP+MAR.N Nucleoproteína N X X Arenavirus Virus de Lassa LAS.ectoGPl+SNAP Ectodominio de Glicoproteínal X X LAS.ectoGP2+SNAP Ectodominio de Glicoproteína2 X X SNAP+LAS.N Nucleoproteína N X X Virus Junin JUN.ectoGPl+SNAP Ectodominio de Glicoproteínal X X JUN.ectoGP2+SNAP Ectodominio de Gllcoproteína2 X X SNAP+JUN.N Nucleoproteína N X X Virus de Machupo ACectoGPl+SNAP Ectodominio de Glicoproteínal X X MAC.ectoGP2+SNAP Ectodominio de Glicoproteína2 X X SNAP+MAC.N Nucleoproteína N X X Virus de Sabia SAB.ectoGPl+SNAP Ectodominio de Glicoproteínal X X SAB.ectoGP2+SNAP Ectodominio de Glicoproteína2 X X SNAP+SAB.N Nucleoproteína N X X Virus de Guanarito GUA.ectoGPl+SNAP Ectodominio de Glicoproteínal X X 6UA.ectoGP2+SNAP Ectodominio de Gllcoproteína2 X X SNAP+GUA.N Nucleoproteína N X X Los kits que contienen combinaciones de antígenos que son propuestas por los organismos sanitarios nacionales son obviamente también contenidos en la presente invención.
En particular, el kit de la invención comprende por lo menos dos soportes sólidos recubiertos con al menos dos proteínas de fusión que se seleccionan en el grupo formado por: SEQ ID NO:21 , SEQ ID NO:42, SEQ ID NO:49, SEQ ID NO:51 , SEQ ID NO:53, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:64, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:74, SEQ ID NO:76, SEQ ID NO:78, SEQ ID NO:80, SEQ ID NO:82, SEQ ID NO:84, SEQ ID NO:86, SEQ ID NO:88, SEQ ID NO:90, SEQ ID NO:92, SEQ ID NO:94, SEQ ID NO:96, SEQ ID NO:98, SEQ ID NO:100, SEQ ID NO:102, SEQ ID NO:104, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:11 1 , SEQ ID NO:113, SEQ ID NO:1 15, SEQ ID NO:117, SEQ ID NO:1 19, SEQ ID NO:121 , SEQ ID NO:123, SEQ ID NO:125, SEQ ID NO:127, SEQ ID NO:129, SEQ ID NO:131 , SEQ ID NO:133, SEQ ID N0.135, SEQ ID N0.137, SEQ ID NO:139, SEQ ID NO:141 , SEQ ID NO:143, SEQ ID NO:145, SEQ ID NO:147, SEQ ID NO:149 y SEQ ID NO:151.
En una modalidad preferida, el kit de la invención contiene una combinación de al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 soportes sólidos recubiertos con dichas proteínas de fusión.
En una modalidad más preferida, el kit de la invención contiene una combinación de por lo menos cinco soportes sólidos (por ejemplo, subconjuntos de microesfera) recubiertos con al menos cinco proteínas de fusión diferentes que contienen antígenos según lo recomendado por la Food and Drug Administration, a saber, los antígenos de la HBV, HCV, HIV1 , HIV2 y virus del Nilo Occidental.
La invención incluye métodos para la fabricación de kits de la invención.
En una modalidad, la invención incluye un método para la fabricación del kit, dicho método que comprende los pasos de: (a) proporcionar una primera proteína de fusión AGT-Antígeno que se reconoce por un primer anticuerpo objetivo, (b) poner en contacto dicha primera proteína de fusión AGT-Antígeno con un primer soporte sólido, dicho soporte estando acoplado covalentemente con un sustrato de dicha proteína de fusión AGT-Antígeno, (c) obtener un primer soporte sólido covalentemente acoplado con una primera proteína de fusión AGT-Antígeno, (d) proveer una segunda proteína de fusión AGT-Antígeno que se reconoce por un segundo anticuerpo objetivo pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, y (e) poner en contacto dicha segunda proteína de fusión AGT-antígeno con un segundo soporte sólido, dicho soporte siendo covalentemente acoplado con un sustrato de dicha proteína de fusión AGT-Antígeno, y (f) obtener un segundo soporte sólido covalentemente acoplado con una segunda proteína de fusión AGT-Antígeno, en donde dicho primero y segundo soporte sólido puede ser identificado específicamente uno de otros.
En una modalidad, los soportes sólidos acoplados covalentemente con las proteínas de fusión AGT-Antígeno se mezclan juntos.
Los pasos anteriores a) a c) pueden repetirse con al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno para generar al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 soportes sólidos covalentemente acoplados con 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 20, 25, 30, 40, 50 o 100 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método para la fabricación del kit de la invención según lo definido anteriormente, dicho método que comprende los pasos de: (a) proporcionar por lo menos una primera proteína de fusión que comprende: - un polipéptido que comprende un primer epítope que es reconocido por un primer anticuerpo objetivo y - un polipéptido AGT que tiene una actividad alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN, (b) poner en contacto dicha primera proteína de fusión con un primer soporte sólido, dicho soporte siendo covalentemente acoplado con un sustrato de dicho polipéptido AGT, (c) obtener un primer soporte sólido covalentemente acoplado con un primer epítope que es reconocido por el primer anticuerpo objetivo, (d) proveer por lo menos una segunda proteína de fusión que comprende: - un polipéptido que comprende un segundo epítope, dicho segundo epítope siendo reconocido por un segundo anticuerpo objetivo pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, y - un polipéptido AGT teniendo una actividad alquiltransferasa 06-alquilguanina-ADN, (e) poner en contacto dicha segunda proteína de fusión con un segundo soporte sólido, dicho soporte siendo covalentemente acoplado con un sustrato de dicho polipéptido AGT, (f) obtener un segundo soporte sólido covalentemente acoplado con un segundo epítope que es reconocido por el segundo anticuerpo objetivo, pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, en donde dicho al menos primero y al menos segundo soportes sólidos pueden ser identificados específicamente uno del otro, el klt de la invención que comprende por lo menos dicho primero y segundo soportes.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un ensayo de clasificación inmuno múltiplex que comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 96 soportes sólidos como se define anteriormente y en donde cada uno de dichos soportes sólidos emite una longitud de onda diferente y distinguible después de la excitación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método de ensayo de inmuno detección múltiplex que comprende: a) poner en contacto una o varias muestras biológicas con por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 o 96 soportes sólidos como se definió anteriormente y en donde cada uno de los soportes sólidos emite una longitud de onda diferente y distinguible después de excitación, y b) detectar la presencia o ausencia de anticuerpos objetivo.
En una modalidad preferida, dichos anticuerpos objetivos son específicos al antígeno del virus para ser detectado en el banco de sangre según la WHO o las directrices de la FDA, como por ejemplo los virus seleccionados de VHB, VHC, VIH1 , VIH2 y WNV.
En otra modalidad preferida, dichos anticuerpos objetivos son específicos para cepas de HPV oncogénicas como HVP 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
En otra modalidad preferida, cada uno de dichos anticuerpos objetivo está etiquetado con una etiqueta detectable.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un aparato para llevar a cabo el método para la fabricación del kit de la invención según lo definido anteriormente, compuesto por un dispositivo técnico para detectar las fuentes de luz emitidas por los soportes sólidos y la fuente de luz emitida por los anticuerpos objetivo o anticuerpos etiquetados ligados a los anticuerpos objetivo y un dispositivo de cálculo o computadora para identificar cuales soportes sólidos están ligados con anticuerpos objetivo, indicando la presencia o ausencia de antígenos, bacterias, virus o parásitos en la muestra analizada.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un método in vitro para el diagnóstico de por lo menos una enfermedad objetivo en un sujeto, dicha enfermedad objetivo que se conoce que inducen la síntesis de por lo menos un anticuerpo objetivo en dicho sujeto, compuesto por realizar el inmunoensayo de la invención, en el que dicho sujeto se diagnostica que padece de dicho al menos una enfermedad objetivo si la cantidad de dicho al menos un anticuerpo objetivo es mayor que un valor de control.
Este método de diagnóstico preferiblemente permite diagnosticar dos, preferiblemente tres, y más preferiblemente cuatro enfermedades objetivo, en un sujeto en necesidad de ello. Este número es sin embargo no limitante: se pretende diagnosticar hasta 100 enfermedades objetivo en la medida en que es posible detectar hasta 100 diversos anticuerpos con el método de detección de la invención.
En una modalidad preferida, dicha por lo menos una enfermedad objetivo es una infección mediada por virus, bacteria, levadura o por hongos, preferiblemente una infección viral causada por un virus del papiloma o un virus de ARN de la familia de la Flaviviridae (virus del dengue, fiebre amarilla, Nilo Occidental, encefalitis japonesa, encefalitis por picaduras de garrapatas, Hepatitis C), la Togaviridae (Virus Chikungunya, Ross River, Mayaro, encefalitis equina occidental, encefalitis equina oriental, encefalitis equina de Venezuela) la Bunyaviridae (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre del Valle Rift, Schmallenberg), la Caliciviridae (virus de la Hepatitis E), la Arenaviridae (Lassa) o la Filoviridae (ébola, Marburg), una infección bacteriana causada por Leptospirosa Interrogans o una infección causada por Plasmodium falciparum.
En una modalidad preferida, dicho método in vitro se utiliza para diagnosticar al menos 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, o 15, más preferiblemente al menos 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 35, 40 o 45 más preferiblemente al menos 50, 60, 70, 80 o 90 y aún más preferiblemente al menos 100 infecciones virales o bacterianas y/o parasitarias en dicho sujeto.
En una modalidad preferida, el valor de control utilizado en dicho método representa la cantidad de dicho anticuerpo objetivo en una muestra de un sujeto que no padece dicha enfermedad objetivo, preferiblemente, un sujeto sano.
Los métodos de la invención pueden usarse para diagnosticar infecciones en animales.
En particular, puede utilizarse para el diagnóstico de enfermedades de animales, así como un enfoque DIVA (diferenciar animales infectados de animales vacunados) para diferenciar los animales infectados naturalmente de animales vacunados. El uso de una estrategia DIVA complementando vacunas novedosas permitiría la implementación de la vacunación como estrategia de control específica junto con estrategias convencionales (prueba, sacrificio e inspección de carne). Por otra parte, mayor especificidad de la prueba tendría un mayor beneficio económico al reducir el número de animales falsos positivos que sean sacrificados innecesariamente. Por último, mayor sensibilidad, especialmente cuando se utilizan ensayos de diagnóstico novedosos, tendría un beneficio adicional en la reducción de la carga económica de control de la enfermedad incluso en la ausencia de vacunación.
En una modalidad preferida, los métodos de la invención se aplican a las personas humanas.
La presente invención finalmente se relaciona con el uso del kit de la invención para el diagnóstico de al menos dos enfermedades objetivo en un sujeto, en el cual dicha enfermedad objetivo es una infección viral causada por un virus del papiloma o un virus de ARN de la familia de la Flaviviridae (virus del dengue, fiebre amarilla, Nilo Occidental, encefalitis japonesa, encefalitis por picaduras de garrapatas, Hepatitis C), la Togaviridae (Virus Chikungunya, Ross River, Mayaro, encefalitis equina occidental, encefalitis equina oriental, encefalitis equina de Venezuela) la Bunyaviridae (virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre del Valle Rift, Schmallenberg), la Caliciviridae (virus de la Hepatitis E), la Arenaviridae (Lassa) y la Filoviridae (ébola, Marburg), una infección bacteriana causada por Leptospirosa Interrogans o una infección causada por Plasmodium falciparum.
Un nuevo arbovirus emergente ha sido recientemente secuenciado y afecta a ganado en Alemania, Benelux y Francia. Este virus se llama virus Schmallenberg (SBV) y se relaciona con el virus Akabane perteneciente al serogrupo Simbu del género Orthobunyavirus de la familia Bunyaviridae. El genoma viral del virus Schmallenberg comprende tres segmentos de RNA monocatenario conocidos como S, L y . El segmento S codifica la nucleoproteína N y la proteína no estructural de NS. La nucleoproteína N acciones determinantes antigénicos con diferentes Bunyavirus. Las tres secuencias virales de ARN de la cepa BH80/11-4 del virus Schmallenberg están disponibles bajo los números HE649913.1 , HE649914.1 y HE649912.1.
Uso de AGT para incrementar la producción de la proteína de fusión AGT Los presentes inventores observaron que la fusión como una proteína quimérica de la enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) con la proteína SBV N mejora grandemente la producción de proteína recombinante N, en particular en células de invertebrados como las células S2.
Los inventores presentes proponen aquí por primera vez usar la enzima AGT (EC 2.1.1.63), un mutante de la misma, un dominio catalítico de la misma o subfragmentos de la misma, para aumentar la producción de la nucleoproteína N de SBV en células hospederas, en particular en las células de no vertebrado. El efecto de aumento se observa cuando las células hospederas expresan un polipéptido de fusión que comprende al menos i) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células del hospedero dicho ii) la enzima AGT, mutante, dominio catalítico o subfragmentos de la misma y iii) la nucleoproteína N de SBV. Para que ocurra el efecto de aumento, la enzima AGT tiene que ser físicamente ligada, directa o indirectamente (pueden introducirse espaciadores y otros aminoácidos), a la proteína de interés. Sin estar limitados por la teoría, se contempla que la enzima AGT actúa como una proteína chaperona, por ejemplo facilitando la secreción de la célula hospedera y estabilizando el polipéptido sintetizado de fusión en el sobrenadante de las células hospederas, o para prevenir que se metabolice durante y después de su síntesis y secreción de las células hospederas. Además, se ha observado que AGT tiene una estructura globular 3D que comprende hélice a (Wibley J.E.A. et al, 2000), que es compatible con un papel de andamio de AGT.
En el contexto de la presente invención, células "hospederas" son todas las células que pueden ser utilizadas para la producción de proteínas recombinantes, tales como células de "no-vertebrado" (o invertebrado), células de vertebrado, células vegetales, células de levadura o células procariotas. Preferiblemente son células de no vertebrado y vertebrado.
Los no vertebrados (también conocido como invertebrados) comprenden diferentes filos, los más famosos siendo los insectos, arácnidos, crustáceos, moluscos, anélidos, cirrípedos, radiados, celentéreos e infusorios.
Ahora se clasifican en más de 30 filos, de organismos simples tales como esponjas de mar y platelmintos hasta animales complejos tales como los artrópodos y moluscos. En el contexto de la invención, las células de no vertebrados son células preferiblemente de insectos como células de Drosophila o Mosquito, más preferiblemente células de Drosophila S2.
Ejemplos de células derivadas de organismos vertebrados que son útiles como líneas de células hospederas incluyen células madre embrionarias no humanas o derivadas de las mismas, por ejemplo células aviarias EBX; línea de riñon de mono CVI transformada por secuencias SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651 ); una línea de riñon embrionario humano (293); células de riñon de hámster bebé (BHK, ATCC CCL 10); células de ovario de hámster chino (CHO); células Sertoli de ratón [TM4]; células de riñon de mono (CVI, ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células del carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); células de riñon canino (MDCK, ATCC CCL 34); células del hígado de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células del pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células del hígado humanas (Hep G2, HB 8065); células del tumor mamario del ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células de hepatoma de rata [HTC, MI.5]; YB2/0 (ATCC n° CRL1662); NIH3T3; células HEK y TRI. En el contexto de la invención, las células de vertebrado son preferiblemente células EBX, CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3 o sus derivados.
Las células vegetales que pueden utilizarse en el contexto de la invención son las variedades de tabaco Bright Yellow 2 (BY2) y Nicotiana tabaccum 1 (NT-1).
Las células de levadura que pueden utilizarse en el contexto de la invención son: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Hansenula polymorpha, así como las levaduras metí lotróp ¡cas como Pichia pastoris y Pichia methanolica.
Las células procariotas que pueden utilizarse en el contexto de la invención son típicamente las bacterias E. coli o bacterias Bacillus subtilis.
En otro aspecto, la presente invención así se refiere a un vector para expresar la nucleoproteína N de SBV en una célula hospedera (SBV.N), que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células del hospedero dicho y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del SBV de SEO. ID NO: 16.
La nucleoproteína N de SBV será referida de aquí en adelante como la "proteína heteróloga", la "proteína de interés", "proteína quimérica" o la "proteína recombinante".
El término "vector" significa aquí el vehículo por el cual una secuencia de ADN o ARN de un gen extranjero puede introducirse en una célula hospedera con el fin de transformarla y promover la expresión de la secuencia introducida. Como se entiende en este documento, un vector es una molécula de ácido nucleico, como, por ejemplo, los plásmidos, fagos y virus. Ellos se discuten con mayor detalle a continuación. Cualquier tipo de vector plásmido, cósmido, YAC o viral puede usarse para preparar un constructo de ácido nucleico recombinante que puede introducirse en una célula hospedera donde se desea la expresión de la proteína de interés. Cuando la expresión de la proteína de interés en un tipo particular de célula hospedera es desead, vectores virales que infectan selectivamente el tipo celular o de tejido deseado pueden ser utilizados. También son importantes en el contexto de la invención vectores para su uso en terapia génica (es decir, que son capaces de transportar la molécula de ácido nucleico a un organismo hospedero).
Por ejemplo, los vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, virus herpes, adenovirus, virus adeno-asociado, virus vaccinia, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Métodos de construcción y uso de vectores virales son conocidos en la técnica (ver, Miller y Rosman, BioTechniques, 7:980-990, 1992).
Vectores virales que en realidad son preferidos en la presente invención son aquellos que están bien adaptados para el uso en células de vertebrados y no vertebrados.
Para las células de no-vertebrados, los vectores preferidos son los arbovirus, siendo particularmente preferido el virus del Nilo Occidental, que son vectores artrópodos. Otros vectores que se conoce que son expresados eficientemente en células de no vertebrados son los baculovirus.
Para las células de vertebrado, vectores lentivirales, AAV, baculovirales y adenovirales son preferibles. Los vectores adecuados para la expresión en las células hospedero mamífero pueden ser también de origen no-viral (por ejemplo ADN de plásmido). Los vectores de plásmido adecuados incluyen, sin limitación, pREP4, pCEP4 (Invitrogen), pCI (Promega), pCDM8 y pMT2PC, pVAX y pgWiz.
Para las células procarióticas, vectores plásmidos, bacteriófagos y cósmido son preferibles. Los vectores adecuados para su uso en sistemas procarióticos incluyen sin limitación vectores pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), p Poly, pTrc; pET 1 1d; pIN; y pGEX.
Para células vegetales, los vectores de la expresión del plásmido como plásmidos Ti y vectores de la expresión del virus como el virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y virus del mosaico del tabaco TMV son preferibles.
La expresión de proteínas recombinantes en células de levadura se puede realizar mediante tres tipos de vectores: vectores de integración (Ylp), plásmidos episomales (YEp), y plásmidos centroméricas (YCp): Vectores adecuados para la expresión en levaduras (por ejemplo S. cerevisiae) incluyen, pero no se limitan a pMFa, pJRY88, pYepSed , pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, California) y pTEF-MF (Dualsystems Biotech Product code: P03303).
Los vectores que pueden ser utilizados para la terapia genética son bien conocidos en la técnica. Están por ejemplo los lentivirus, retrovirus, adenovirus, poxvirus, virus herpes, virus del sarampión, virus espumoso o virus adeno-asociado (AAV). Los vectores virales pueden ser competentes para replicación, o pueden deshabilitarse genéticamente para ser de Defectuosos para la replicación o deteriorados para la replicación. Los vectores de terapia génica preferidos son los vectores Flap de ADN descritos en WO 99/055892, US 6,682,507 y WO 01/27300.
Una secuencia de "codificación" de un producto de expresión, tal como un ARN, polipéptido, proteína o enzima, es una secuencia nucleótida que, cuando se expresa, resulta en la producción de ese ARN, polipéptido, proteína o enzima; es decir, la secuencia de nucleótidos "codifica" eso ARN o codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido, proteína o enzima.
El vector de la invención contiene una secuencia de nucleótidos que codifica una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma. Estos polipéptidos han sido definidos anteriormente. Preferiblemente, dicho AGT mutante es la enzima SNAP de SEQ ID NO: 2 y está codificada por ejemplo por SEQ ID NO: 15 o SEQ ID NO: 31 , el último con un contenido de G/C de 51 %.
Preferiblemente, el vector de expresión del nucleótido de la invención comprende adicionalmente sitios de clonación que permite la inserción en el marco de una secuencia de ADN heteróloga que codifica la proteína de interés.
Como en la presente invención, el término "péptido de señal de secreción" señala una cadena peptídica corta (3-60 aminoácidos largos) que dirige el transporte de la nucleoproteína N fuera de las células hospederas.
Ejemplos de señales de secreción apropiadas para la presente invención incluyen, pero no se limitan a, las secuencias de péptido de señal del factor de apareamiento (MF) alfa (US 5,879,926); invertasa (WO 84/01 153); PHO5 (DK 3614/83); YAP3 (levadura aspártica proteasa 3; WO95/02059); y BAR1 (WO87/02670).
En el contexto de la invención, este péptido de señal de secreción es preferiblemente funcional ya sea en células de no vertebrado o en células de vertebrados, o ambas.
Son ejemplos de péptidos de señal de secreción que funcionan en células de insectos: el ssBiP de insecto (SEQ ID NO: 37, por ejemplo, codificada por el ADN de la secuencia NO SEQ ID: 22), la señal de péptido tipo BiP de SEQ ID NO: 24 (por ejemplo codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 23), la señal de péptido tipo BiP de SEQ ID NO: 153 (por ejemplo codificado por la secuencia de ADN SEQ ID NO: 152) y cualquier señal de péptidos presentes en un arbovirus, por ejemplo la proteína de envoltura E del virus del Nilo Occidental (SEQ ID NO: 38).
Curiosamente, la señal de péptido tipo BiP mencionada antes de SEQ ID NO: 24 es funcional en las células tanto de no vertebrado como de vertebrado. Esta señal tipo BiP corresponde a la señal BiP de péptido de SEQ ID NO: 37 en donde el último aminoácido de glicina se ha sustituido por el aminoácido de la secuencia Ala Pro Thr Ala Leu (SEQ ID NO: 39) que se corresponde con el sitio de escisión de la proteína E del virus del Dengue. En consecuencia, la señal tipo BiP va ser escindida ventajosamente una vez que la proteína será traducida y secretada en el sobrenadante de las células hospederas.
Una variedad de señales de secreción también está disponible para su expresión en células hospederas de levadura, por ejemplo en S. cerevisiae. Estas incluyen el factor prepro-alfa, HSp150, PH01 , SUC2, KILM1 (toxina asesina tipo 1), y GGP1.
Un sitio de clonación es una secuencia que facilita la clonación de un gen que codifica una proteína de interés en el sistema de expresión. Contiene sitios de restricción, o sitios de restricción reconocimiento, es decir, las ubicaciones de una molécula de ADN que contienen secuencias específicas de nucleótidos, que son reconocidas por enzimas de restricción (véase por ejemplo en las figuras). Estos son generalmente secuencias palindrómicas (ya que las enzimas de restricción se unen generalmente como homodímeros), y una particular enzima de restricción puede cortar la secuencia entre dos nucleótidos dentro de su sitio de reconocimiento, o en algún lugar cercano. Los sitios de clonación son bien conocidos por el experto en la técnica.
En una modalidad preferida de la invención, la secuencia de ADN que codifica dicha enzima AGT está situado en 5' o 3' de la secuencia de ADN que codifican dicha proteína heteróloga del interés, preferiblemente en 5'. Por lo tanto, la enzima AGT es directa o indirectamente enlazada a la proteína/polipéptido heterólogo de interés y preferiblemente ubicada en el extremo N-terminal de la proteína/polipéptido heterólogo de interés. La secuencia de ADN que codifican la fusión del polipéptido que comprende dicho péptido de señal, dicha enzima AGT, mutante o dominio catalítico y dichas proteínas recombinantes de interés, pueden ser asociados operativamente a un promotor inducible que es funcional en las mismas células hospederas como el péptido de señal.
Más preferiblemente, en el vector de la invención, dicho marco de lectura abierto está asociado operativamente con un promotor inducible que es funcional en la misma célula hospedera que el péptido de señal.
Una secuencia de codificación se "asocia operativamente con" una secuencia de control de expresión (es decir, secuencias de control transcripcionales y traslacionales) en una célula, cuando la polimerasa ARN transcribe la secuencia de codificación en ARN, que luego es empalmada (si contiene intrones) trans-ARN y, si la secuencia codifica una proteína, es traducida a esa proteína.
Un "promotor" es una secuencia de nucleótidos de la cual puede iniciarse transcripción del ADN vinculado operablemente corriente abajo (es decir, en la dirección de 3' en la cadena sentido del ADN de doble cadena). Dentro de la secuencia de promotor se puede encontrar un sitio de inicio de transcripción (convenientemente encontrado, por ejemplo, mapeado con la nucleasa S1 ), así como dominios de unión a proteína (secuencias de consenso) responsables del ligue de polimerasa ARN.
Los promotores que pueden ser usados para controlar la expresión génica en el contexto de la presente invención son por ejemplo los que son funcionales en células de no vertebrado o en células de vertebrados.
Por ejemplo, para las células de no vertebrado, pueden utilizarse las secuencias reguladoras del gen metalotioneína (Brinster et al., Nature, 296:39-42, 1982).
Preferiblemente, el promotor inducible que está presente en el vector de la invención tiene una actividad de promotor en una célula de insecto y más preferiblemente en una célula de Drosophila. Es por ejemplo el promotor Drosophila metalotionein pMT (Lastowski-Perry et al, J.Biol. Chem. 260:1527 (1985)), que dirige el alto nivel transcripción del gen en presencia de metales, por ejemplo CuSO4. Por otra parte, el promotor del gen Drosophila actina 5C, que es un promotor constitutivo y no requiere la adición de un metal, puede ser utilizado (B.J.Bond et al., Mol. Cell. Biol. 6:2080 (1986)). Ejemplos de otros promotores conocidos de Drosophila incluyen, por ejemplo los promotores inducibles heatshock (Hsp70) y COPIA LTR. El promotor temprano SV40 da nivel de la expresión más bajo que el promotor de la metalotioneína de Drosophila.
Preferiblemente, el promotor inducible que está presente en el vector de la invención tiene una actividad de promotor en una célula de Drosophila melanogaster, preferiblemente en las células S2 de Drosophila. Por ejemplo es el promotor de metalotioneína minuciosamente descrita en Lastowski-Perry et al, J.Biol. Chem. 260:1527 (1985).
Los promotores adecuados para expresión constitutiva en células de mamíferos incluyen el promotor temprano inmediato del citomegalovirus (CMV), promotor tardío de adenovirus principal, el promotor de la quinasa fosfoglicero (PGK) y el promotor de quinasa timidina (TK) del virus del herpes simple (HSV)-1. Los promotores inducibles eucariotas regulados por compuestos suministrados exógenamente, incluyen sin limitación, el promotor metalotioneína cinc-inducible (MT), el promotor del virus del tumor mamario de ratón (Dex)-inducible por dexametasona (MMTV), el sistema de promotor polimerasa T7 (WO 98/10088), el promotor insectos ecdisona, el promotor represible por tetraciclina, el promotor inducible por tetraciclina, el promotor inducible por RU486 y el promotor inducible por rapamicina.
Preferiblemente, el promotor que está presente en el vector de la invención tiene una actividad de promotor en una célula de mamífero, preferiblemente en células HeLa. Por ejemplo es el promotor SV 40.
Un intervalo de promotores de levadura está disponible para la expresión de proteínas en las células hospederas de levadura. Algunos como ADH2, SUC2 son inducibles y otros como GAPDH son constitutivos en su expresión. Otros promotores adecuados para la expresión en levadura incluyen los promotores TEF, PGK, MF alfa, CYC-1 , GAL-1 , GAL4, GAL10, PHO5, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP o GAPDH), y alcohol deshidrogenasa (ADH).
Para el uso en las células vegetales, el promotor más comúnmente utilizado es el promotor del virus mosaico de coliflor (CaMV)35S o su versión mejorada, pero pueden utilizarse un número de promotores alternativos, como el promotor híbrido (ocs)3mas o el promotor de ubiquitina de maíz y Arabidospsis thaliana. En contraste a estos promotores constitutivos, el promotor de arroz a-amilasa RAmy3D se induce por privación de azúcar (Hellwig S et al., Nat. Biotechnol.2004; 22(1 1 ): 1415-22).
Los promotores convenientes para su expresión en la célula hospedera E. coli incluyen, pero no se limitan a, el promotor bacteriófago lamba pL, los promotores lac, TRP y pTAC inducibles por IPTG.
Es preferible que el péptido de señal de secreción y el promotor inducible sean funcionales en la misma célula hospedera.
Más preferiblemente, el péptido de señal de secreción y el promotor inducible son funcionales tanto en las células S2 de Drosophila como en las células de vertebrados.
El término "inducible" aplicado a un promotor es bien entendido por los expertos en la materia. En esencia, la expresión bajo el control de un promotor inducible se "enciende" o aumenta en respuesta a un estímulo aplicado. La naturaleza del estímulo varía entre promotores. Algunos promotores inducibles causan poca o niveles indetectables de expresión (o ninguna expresión) en ausencia del estímulo apropiado. Otros promotores inducibles causan expresión detectable constitutiva en ausencia del estímulo. Sin importar el nivel de expresión en ausencia del estímulo, la expresión de cualquier promotor inducible se incrementa ante el estímulo correcto.
Una vez que un vector apropiado ha sido construido y transfectado en la célula hospedera seleccionada, preferiblemente una línea de células de Drosophila, la expresión de una proteína heteróloga es inducida por la adición de un agente inductor apropiado para el promotor inducible. Por ejemplo cadmio o cobre son agentes inductores para el promotor Hsp70. Para los promotores constitutivos, como el promotor de actina 5C, ningún agente inductor es necesario para la expresión.
En otra modalidad de la invención, el vector de expresión de nucleótidos codifica por lo menos un sitio de la escisión del péptido, preferiblemente situado entre la enzima AGT o su dominio catalítico y las proteínas recombinantes de interés.
Un sitio de escisión del péptido (también llamado "sitio de la escisión del péptido") es una secuencia de aminoácidos que es reconocida por al menos una enzima proteasa (por ejemplo proteasa de serina, proteasa de cisteína, entre otros). Un ejemplo de un sitio de la escisión del péptido es el sitio de la escisión de enteroquinasa de SEQ ID NO: 40 (AspAspAspAspLys/Asp). La enteroquinasa es una enzima proteasa de serina (EC 3.4.21.9) que se conoce para convertir inactivo tripsinógeno en tripsina activa por escisión en el extremo c-terminal de la secuencia: Val-(Asp) 4-Lys--lle - Val ~ (tripsinógeno) ? Val-4-Lys (hexapéptido) + lie - Val (Asp) ~ (tripsina). La enteroquinasa se divide después de lisina si el Lys es precedido por cuatro Asp y no seguido de un residuo de la prolina.
Otro sitio de la escisión de péptido útil es el sitio de la escisión de la llamada "proteasa TEV", teniendo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 32 (pro-TEV1 ) o SEQ ID NO: 33 (pro-TEV2) (Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Ser o Gly respectivamente). Tales sitios de escisión pueden ser codificados por ejemplo por SEQ ID NO: 29 y 30. La proteasa TEV es el nombre común para el dominio catalítico de 27 kDa de la inclusión nuclear proteína codificada por el virus del grabado del tabaco. Es comercialmente disponible (Invitrogen).
El sitio de la escisión del precursor de membrana prM del virus del Dengue serotipo 1 (SEQ ID NO: 39) también puede utilizarse en el vector de la invención.
En otra modalidad, el vector de expresión del nucleótido de la invención codifica adicionalmente una etiqueta, situada preferiblemente en el extremo c-terminal de la proteína recombinante en el polipéptido de la fusión de la invención (que comprende la señal del péptido, la proteína AGT u homologas de la misma y la proteína recombinante). En el contexto de la invención, una "etiqueta" está dedicada a facilitar la recuperación del polipéptido desde el lisado crudo de la célula hospedera y preferiblemente se selecciona del grupo compuesto por: proteínas fluorescentes, poli-histidina (poli-his) o etiquetas de poli-histidina-glicina (poli-his-gli); etiquetas de la gripe HA; etiquetas del virus c-myc Herpes simplex glicoproteína D (gD), etiquetas péptidas, epítopes alfa-tubulina o etiquetas de péptido de proteína 10 gen T7. No obstante, puede utilizarse cualquier otra etiqueta. En una modalidad preferida de la invención, los vectores forman el ADN de SEQ ID NO: 28 que codifica una etiqueta hexa-histidina que tiene la SEQ ID NO: 27.
En otra modalidad, el vector de expresión del nucleótido de la invención además codifica secuencias del espaciador, situado preferiblemente entre la enzima AGT (o su dominio catalítico) y la proteína recombinante de interés y/o entre la proteína recombinante del interés y la etiqueta. En el contexto de la invención, una secuencia espaciadora es una secuencia de aminoácidos que comprende al menos tres aminoácidos, dedicadas a separar espacialmente dos polipéptidos enlazados (estos polipéptidos entonces son enlazados indirectamente). Estos espaciadores pueden ser por ejemplo la secuencia del aminoácido glicina-glicina-glicina-serina (GGGS, SEQ ID NO: 25) y la secuencia del ADN espaciador codificándolo puede ser SEQ ID NO: 26. En el contexto de esta invención, esta secuencia de ADN en adelante designada como "secuencia espaciadora de ADN" y se encuentra entre el ADN que codifica AGT o su dominio catalítico, y la secuencia de ADN recombinante, preferiblemente corriente arriba de la secuencia de ADN que codifican el sitio de la escisión del péptido.
Casetes SNAP y expresión de antígeno Como se utiliza en este documento, el término "pDeSNAPUniv" señala una codificación de cásete ADN, en un marco de lectura abierto sencillo, desde 5' a 3': a) un péptido de señal de secreción, b) una proteína AGT de SEQ ID NO: 1 , un mutante, un fragmento o un dominio catalítico, en particular el mutante SNAP de SEQ ID NO: 2, c) al menos un sitio de escisión de péptido, d) al menos una etiqueta, y e) al menos una secuencia espadadora.
Este cásete de ADN pDeSNAPUniv codifica un péptido de señal de secreción que es ventajoso la señal péptido tipo BiP de SEQ ID NO: 24 o la señal de péptido ssBiP de SEQ ID NO: 37, el muíante SNAP de SEQ ID NO: 2, una etiqueta que ventajosamente es una etiqueta His de SEQ ID NO: 27, un sitio de la escisión de péptido que es ventajoso o el pro-TEV de SEQ ID NO: 32 o el pro-TEV de SEQ ID NO: 33, y/o una secuencia espadadora que tiene de manera conveniente la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 25.
Más preferiblemente, el cásete de ADN pDeSNAPUniv abarca, desde 5' a 3', la secuencia SEQ ID NO: 23 que codifica la señal de secreción como BiP, la SEQ ID NO: 15 o 31 que codifica el mutante SNAP, la secuencia espadadora de SEQ ID NO: 26, el sitio de escisión de péptido pro-TEV de SEQ ID NO: 29, el sitio de escisión de péptido pro-TEV de SEQ ID NO: 30, la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 26 y la secuencia SEQ ID NO: 28 de codificación de His-tag (ver la figura 8 mostrando la estructura del cásete pDeSNAPUniv). Tal cásete de ADN pDeSNAPUniv es por ejemplo SEQ ID NO: 34.
Este cásete de "pDeSNAPUniv" se mantiene como "universal" ya que puede ser insertado en cualquier tipo de vectores dedicados para transfectar células hospederas para producir proteínas heterólogas, es decir vectores de vertebrados (como vectores pcDNA3 o pCI-neo) así como vectores de no vertebrados (como pMT/BiP/V5-HisA que es útil en el sistema DES de Invitrogen). Ejemplos de plásmido que comprende dicha secuencia universal SEQ ID NO: 43 (pMT/BiP/V5-HisA de Invitrogen que comprende el cásete pDeSNAP Univ), SEQ ID NO: 44 (pUC57 de Invitrogen que comprende el cásete pDeSNAP Univ) o SEQ ID NO: 45 (pcDNA3 de Invitrogen que comprende el cásete Univ pDeSNAP).
Otro ejemplo de plásmido que comprende dicho secuencia universal es SEQ ID NO: 105, que es un plásmido pUC57 que abarca, desde 5' a 3', el promotor constitutivo del promotor Orgyia pseudotsugata multicapsida nucleoproteína virus-inmediata-temprana 2 (OplE2SP) el péptido de señal tipo BiP de SEQ ID NO: 152, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia espadadora de SEQ ID NO: 26, la secuencia de pro-TEV1 SEQ ID NO: 29 y la etiqueta de péptido C-término de SEQ ID NO: 106.
Una vez que la secuencia heteróloga de una proteína de interés como SBV.N se clona en el presente, un vector tal puede ser ventajosamente transfectado en ya sea células hospederas de vertebrado o de no vertebrados, con el fin de producir la proteína de interés en grandes cantidades.
En una modalidad preferida, el vector de la invención comprende el llamado "cásete pDeSNAP Univ/SBV.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv en el que se ha insertado la secuencia de la nucleoproteína N de SBV, dicho cásete pDeSNAP Univ/SBV.N que comprende una codificación de secuencia nucleotídica, en un solo marco de lectura abierto, desde 5' a 3': a) un péptido de señal de secreción, b) una proteína AGT de SEQ ID NO: 1 , un mutante, un fragmento o un dominio catalítico, en particular el mutante SNAP de SEQ ID NO: 2, c) al menos un sitio de escisión de péptido, d) la nucleoproteína N del SBV de SEQ ID NO: 16, e) al menos una etiqueta, y f) al menos una secuencia espadadora.
Este cásete de ADN pDeSNAP Univ/SBV.N codifica un péptido de señal de secreción que es ventajosamente la señal de péptido tipo BiP de SEQ ID NO: 24 o la señal de péptido ssBiP de SEQ ID NO: 37, el muíante SNAP de SEQ ID NO: 2, la nucleoproteína N de SBV de SEQ ID NO: 16, una etiqueta que ventajosamente es un His-tag de SEQ ID NO: 27, un sitio de la escisión de péptido que es ventajoso o el pro-TEV de SEQ ID NO: 32 o el pro-TEV de SEQ ID NO: 33, y/o una secuencia de espaciador tiene ventajosamente el aminoácido de la secuencia SEQ ID NO: 25.
Más preferiblemente, el cásete de ADN pDeSNAP Univ/SBV.N comprende, desde 5' a 3', la secuencia SEQ ID NO: 23, de codificación de la señal de secreción tipo BiP o la SEQ ID NO: 22 de codificación de la señal de secreción ssBiP, la SEQ ID NO: 15 o 31 que codifica el muíante SNAP, la secuencia espadadora de SEQ ID NO: 26, el sitio de escisión de péptido pro-TEV1 de SEQ ID NO: 29, la secuencia de SEQ ID NO: 17 de codificación de la nucleoproteína N de SBV, el sitio de escisión de péptido pro-TEV2 de SEQ ID NO: 30, la secuencia espadadora de SEQ ID NO: 26 y la secuencia SEQ ID NO: 28 que codifica la etiqueta His-tag.
Incluso más preferiblemente, el cásete de ADN pDeSNAP Univ/SBV.N comprende, desde 5' a 3', la secuencia SEQ ID NO: 22, que codifica la señal de secreción ssBiP, la SEQ ID NO: 31 que codifica el muíante SNAP, la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 26, el sitio de escisión de péptido pro-TEV1 de SEQ ID NO: 29, la secuencia de SEQ ID NO ID: 17 de codificación de la nucleoproteína N de SBV, el sitio de escisión de péptido pro-TEV2 de SEQ ID NO: 30, la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 26 y la secuencia SEQ ID NO: 28 que codifica la etiqueta His-tag. Tal cásete pDeSNAP Univ/SBV.N es por ejemplo SEQ ID NO: 35.
Alternativamente, el cásete de ADN pDeSNAP Univ/SBV.N puede constar de 5' a 3', la secuencia SEQ ID NO: 23 que codifica la señal de secreción tipo BiP, la SEQ ID NO: 31 de codificación de muíante SNAP, la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 26, el sitio de escisión de pépíido pro-TEV1 de SEQ ID NO: 29, la secuencia de SEQ ID NO: 17 de codificación de la nucleoproleína N de SBV, el sitio de escisión de péptido pro-TEV2 de SEQ ID NO: 30, la secuencia espaciadora de SEQ ID NO: 26 y la secuencia SEQ ID NO: 28 la etiqueta His-tag. Tal cásete pDeSNAP Univ/SBV.N es por ejemplo SEQ ID NO: 36 (cuya estructura se muestra en la figura 9).
Así, en una modalidad preferida, el vector de la invención comprende el cásete pDeSNAP Univ/SBV.N que tiene la secuencia nucleoíídica SEQ ID NO: 35 o la secuencia del nucleótido SEQ ID NO: 36.
Más precisamente, la secuencia de nucleótido del cásete pDeSNAP Univ/SBV.N de SEQ ID NO: 35 comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN VSB.N SEQ ID NO: 17 (que corresponde con la secuencia SBV.N natural, en donde se ha eliminado el sitio EcoRV interno y dos sitios EcoRV y Xmal se han añadido en las extremidades), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 de codificación de una secuencia His-Tag.
Y la secuencia de nucleótidos de cásete pDeSNAP Univ/SBV.N SEQ ID NO: 36 comprende (véase también la figura 9): una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia VSB.N ADN SEQ ID NO: 17 (que corresponde con la secuencia SBV.N natural, en donde se ha eliminado el sitio EcoRV interno y dos sitios EcoRV y Xmal se han añadido en las extremidades), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
De interés, la secuencia de nucleótido del cásete pDeSNAP Univ/SBV.N de SEQ ID NO: 36 también comprende además un sitio Nhel corriente arriba del ATG, un sitio de Bglll entre la secuencia tipo BiP y tipo SNAP, y un sitio Agel y un sitio Hindlll que están situados corriente abajo del codón finalizador.
Los vectores de la invención son por ejemplo SEQ ID NO: 43 (que es el plásmido pMT/BiP/V5-HisA de Invitrogen que comprende el cásete Univ pDeSNAP) en donde la secuencia de ADN VSB.N de SEQ ID NO: 17 ha sido insertada, SEQ ID NO: 44 (que es el plásmido pUC57 de Invitrogen que comprende el cásete Univ pDeSNAP) en el cual la secuencia de ADN VSB.N de SEQ ID NO: 17 ha sido insertada o SEQ ID: 45 (que es el plásmido pcDNA3 de Invitrogen que comprende el cásete Univ pDeSNAP) en el cual la secuencia de ADN VSB.N de SEQ ID NO: 17 ha sido insertada.
Los vectores de la invención también se proporcionan en las células S2 que fueron depositadas en el Centro Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM), Instituí Pasteur (25 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15, Francia) el 24 de abril de 2012, bajo el número CNCM-4616.
En otro aspecto, la presente invención hace objetivo a una célula recombinante que es transfectada de forma estable por un vector de la invención, preferiblemente un vector que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36.
Preferiblemente, en este aspecto de la invención, dicha célula recombinante es una célula de no vertebrado, preferiblemente una célula de insecto y más preferiblemente una célula S2.
Las células de no-vertebrados pueden ser cualquiera de las células de los insectos, arácnidos, crustáceos, moluscos, anélidos, cirrípedos, radiados, celentéreos e infusorios. En el contexto de la invención, las células de no vertebrados son preferiblemente células de insectos como células de Drosophila o Mosquito. Son más preferiblemente una célula S2 de Drosophila. En este caso, el vector de expresión de la invención abarca por ejemplo SEQ ID NO: 35.
Las células de Drosophila S2 han sido ampliamente descritas.
Son adecuadas especialmente a la producción de alto rendimiento de proteína, porque pueden ser mantenidos en los cultivos de suspensión a temperatura ambiente (24 + 1 ° C). El medio de cultivo es suplementado M3 con entre 5 y 10% (v/v) suero fetal bovino (SFB) inactivado con calor. En la modalidad preferida de la invención, el medio de cultivo contiene 5% FBS. Después de la inducción, las células se cultivan en medio sin suero. En este medio, las células S2 pueden cultivarse en culturas de suspensión, por ejemplo de 250 mi a matraces de centrifugación de 2000 mi, con agitación a 50-60 rpm. Las densidades de las células se mantienen normalmente entre 106 y 107 células por mi.
En una modalidad preferida, la célula recombinante de la invención es la célula S2 que se ha depositado en el Centro Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM), Instituí Pasteur (25 rué du Docteur Roux, 75724 París cedex 15, Francia) el 24 de abril de 2012, bajo el número CNCM-4616.
En otra modalidad preferida, dicha célula recombinante es una célula de vertebrado.
Preferiblemente, dicha célula de vertebrado recombinante es una célula de mamífero, preferiblemente una célula CHO, YB2/O, COS, HEK, NIH3T3, HeLa o sus derivados. Más preferiblemente, en este caso, el vector de expresión de la invención comprende SEQ ID NO: 36.
En otro aspecto de la presente invención, la dicha célula recombinante se utiliza para amplificar y purificar los vectores de expresión de la invención, preferiblemente aquellos que comprenden SEQ ID NO: 35 o 36.
Con este objetivo, los vectores de la expresión del nucleótido de la invención también pueden componerse de un gen que codifica un marcador de selección, y/o una secuencia terminadora. Los genes marcadores de selección que pueden ser incluidos en la construcción son típicamente los que confieren fenotipos seleccionables como resistencia a los antibióticos (por ejemplo blasticidina, ampicilina, kanamicina, Higromicina, puromicina, cloranfenicol).
Los métodos para la producción de vectores de la expresión son conocidos en la técnica.
En otro aspecto, la célula recombinante de la invención se utiliza para producir la nucleoproteína N del virus Schmallenberg en grandes cantidades.
Así, en una modalidad particular, la presente invención también se refiere a un método para la producción de la nucleoproteína N del virus Schmallenberg, el método que comprende los pasos de: (a) obtener el vector de la invención, dicho vector que comprende por ejemplo la secuencia de ADN SEQ ID NO: 35 o SEQ ID NO: 36, (b) transfectar una célula hospedera (preferiblemente una célula de insecto o una célula de mamífero) con el polinucleótido obtenido en el paso (a); (c) permitir la expresión de dicho polinucleótido obtenido bajo el paso (b) para producir la nucleoproteína N del virus Schmallenberg; (d) opcionalmente, dividendo el polipéptido AGT, (e) recuperar la nucleoproteína N del virus Schmallenberg (f) opcionalmente, purificar la nucleoproteína N del virus Schmallenberg.
Para realizar los diferentes pasos del método de la presente invención, se puede emplear técnicas convencionales de biología molecular, microbiología y ADN recombinante dentro de las habilidades del experto en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edición (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (aquí referido como "Sambrook, et al., 1989"); DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes I and II (D. N. Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984); Nucleic Acid Hybridization(B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1986); Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. E. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); F. M. Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. (1994).
El término "transfección" significa la introducción de un de ácido nucleico extraño en una célula eucariota hospedera para que la célula hospedera exprese el gen introducido o secuencia para producir la nucleoproteína N de virus Schmallenberg. Una célula hospedera que recibe y expresa ADN o ARN introducido ha sido "transfectada" y es un "transfectante" o un "clon". El ADN o ARN introducido a una célula hospedera puede provenir de cualquier fuente, incluyendo células del mismo género o especie que la célula hospedera o células de diferente género o especie.
En el contexto de la invención, la transfección de las células hospederas con los polinucleótidos puede realizarse mediante un método clásico en la técnica, por ejemplo por la transfección, infección o electroporación. En otra modalidad, el vector de la invención puede ser introducido en vivo por lipofección (como ADN desnudo), o con otros agentes que facilitan la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Los lípidos catiónicos sintéticos pueden utilizarse para preparar liposomas para transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 84:7413-7417, 1987). Los compuestos y composiciones de lípidos útiles para la transferencia de ácidos nucleicos se describen en WO 95/18863 y WO 96/17823 y en U.S 5,459,127. Los lípidos pueden ser acoplados químicamente a otras moléculas con el propósito de focalización (ver, Mackey et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 85:8027-8031 , 1988). Los péptidos focalizados, tales como las hormonas o neurotransmisores y proteínas tales como anticuerpos, o las moléculas no péptido podrían acoplarse a liposomas químicamente. Otras moléculas son también útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, como un oligopéptidos catiónico (véase WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de unión a ADN (véase WO 96/25508), o un polímero catiónico (véase WO 95/21931 ). También es posible introducir el vector in vivo como un plásmído de ADN desnudo Los vectores de ADN desnudo para la terapia génica pueden introducirse en las células hospederas deseadas por métodos conocidos en la técnica, como la electroporación, microinyección, fusión celular, dextrano DEAE, precipitación de fosfato de calcio, uso de un pistola de genes, o el uso de un transportador de vector de ADN (ver, Wu et al., J. Biol. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Biol. Chem., 263:14621-14624, 1988; Williams et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88:2726-2730, 1991).
El término "permitiendo la expresión" de un polinucleótido aquí significa que el estímulo de las secuencias reguladoras que están presentes en el vector (por ejemplo el estímulo activando el promotor inducible) y todos los componentes necesarios están presentes en una cantidad suficiente para que la traducción del polinucleótido ocurra.
Si fuera necesario, el polipéptído AGT/SNAP puede ser dividido de la proteína de fusión producida mediante la adición de una proteasa teniendo un sitio escote definida para el sobrenadante de o en las células recombinantes. Por ejemplo, cuando el vector formado por el cásete pDeSNAP Univ de SEQ ID NO: 35 o 36 se utiliza, la escisión del sitio de escisión de pro-TEV ENLKYFQ/G(S) se obtiene mediante la adición de la proteasa TEV en el sobrenadante de las células recombinantes. Alternativamente, se puede mantener el polipéptído AGT/SNAP para realzar la vida útil de la nucleoproteína N de SBV.
Por otra parte, el experto en la técnica podrá apreciar que una proteína secretada o expresada o un polipéptído puede detectarse en el medio de cultivo utilizado para mantener o hacer crecer las células hospederas presentes. El medio de cultivo se puede separar de las células hospederas por los procedimientos conocidos, tales como centrifugación o filtración. La proteína o polipéptído puede entonces detectarse en el medio de cultivo celular libre aprovechando propiedades conocidas características de la proteína o polipéptído. Estas propiedades pueden incluir las propiedades inmunológicas, enzimáticas o físicas distintas de la proteína o polipéptído. Por ejemplo, si una proteína o polipéptído tiene una actividad enzimática única se puede realizar un ensayo para esa actividad en el medio de cultivo utilizado por las células hospederas. Lo que es más, cuando los anticuerpos reactivos contra una determinada proteína o polipéptido están disponibles, tales anticuerpos pueden utilizarse para detectar la proteína o polipéptido en cualquier ensayo inmunológico conocido (como por ejemplo en Harlowe, et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press).
La recuperación de la nucleoproteína N de SBV es mediada por los medios conocidos en la técnica, incluyendo, sin limitarse a, electroforesis preparativa de disco-gel, isoeléctrica, HPLC, HPLC de fase inversa, filtración de gel, intercambio iónico y cromatografía de partición, cromatografía de precipitación y salación, extracción, distribución contracorriente y similares. Como es preferible producir la proteína de interés en el sistema recombinante de la invención vinculado con una etiqueta, dicha etiqueta facilitará la recuperación del polipéptido de lisado de la célula hospedera el crudo por cromatografía en una matriz de fase sólida apropiada. Alternativamente, pueden utilizarse anticuerpos producidos contra las proteínas o péptidos derivados de los mismos como reactivos de recuperación.
Los presentes inventores descubrieron que las proteínas de fusión generadas con el método de la invención generalmente no necesitan ser purificadas más. Sin embargo, un paso más (g) de purificación puede ser efectuado, si es necesario.
Un material purificado puede contener menos de aproximadamente 50%, preferiblemente menos aproximadamente 75% y más preferiblemente menos de aproximadamente 90%, de los componentes celulares con el cual fue originalmente asociado. El término "sustancialmente puro" indica el más alto grado de pureza que puede lograrse utilizando técnicas de purificación convencionales conocidas en la técnica.
En una modalidad de la invención, los métodos de la invención permiten obtener por lo menos 40 mg/l, preferiblemente al menos 50 mg/l, más preferiblemente al menos 60 mg/l de la nucleoproteína N substancialmente pura del virus Schmallenberg en el sobrenadante de cultivo celular recuperado.
, En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Schmallenberg de SEQ ID NO: 16.
En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente).
Este polipéptido de fusión preferiblemente además consta de una etiqueta, como se definió anteriormente. Esta etiqueta es preferiblemente una etiqueta poli-histidina y se encuentra preferiblemente en el extremo terminal C de la nucleoproteína N del virus Schmallenberg.
El polipéptido de la fusión del ejemplo invento es para la secuencia del aminoácido del SEQ ID NO: 41 (correspondiente a la proteína de fusión BiPlike/SNAP/VSB.N/Histag) o SEQ ID NO: 46 (correspondiente a la proteína de fusión ssBiP/SNAP/VSB.N/Histag) o SEQ ID NO: 42 (correspondiente a la proteína de fusión SNAP/VSB.N).
La invención abarca un vector que comprende el cásete de la proteína DeSNAPuniv-NSs Schmallenberg que tiene la secuencia de nucleotido de SEQ ID NO: 178 y/o codificación de la secuencia del aminoácido de SEQ ID NO: 179. El vector puede constar de una secuencia de ADN que codifica el péptido de señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV o la proteína NSs de virus Schmallenberg representado en las figuras 24A a 24C, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
Por último, la proteína quimérica SNAP-VSB.N puede ser útil como agente de diagnóstico para la detección de la infección viral por el virus de Schmallenberg, o para la detección de anticuerpos específicos de dicho virus en fluidos biológicos, tales como sangre, suero, saliva y similares.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere a la utilización de la proteína de fusión [SNAP - SBV. N] obtenida por cualquier método de la invención para identificar la presencia de microorganismos patógenos o no patógenos en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otros aspectos, la presente invención se refiere también a vectores de expresión de proteínas de fusión de particular interés, proteínas de fusión que comprende una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma, que se fusionó en marco con antígenos interesantes, como los antígenos virales o bacterianos, péptidos microbianos y/o polipéptidos de interés. Estos vectores se detallan a continuación.
Antígeno del Echovirus En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector para expresar un antígeno del ecovirus, por ejemplo la proteína VP1 del enterovirus 71 (Picornaviridae), en una célula hospedera. En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células del hospedero dicho, b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína VP1 del enterovirus 71 (EV71 , véase por ejemplo Kolpe A.B. et al., Virus Research 2012).
En una modalidad preferida, este vector compone de un llamado "cásete pDeSNAP EV71/Univ.VP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv según lo definido anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia SEQ ID NO: 47 que codifica las proteínas VP1 de la cepa del virus EV71 JL-AFP-EV71-07-03 (Genebank#JQ715713).
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/EV71.VP1 que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 48 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia del ADN SEQ ID NO: 47 que codifica las proteínas VP1 de la cepa del virus EV71 JL-AFP-EV71 -07-03 (Genebank#JQ715713), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), la secuencia de ADN segundo SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico mismos y b) las proteínas VP1 del virus EV71. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 49 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/EV71.VP1/proTEV2/Histag). Altos niveles (30 mg/l) de esta proteína se produce después de la inducción de S2/.
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP - EV71.VP1] para identificar la presencia de los enterovirus 71 en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígenos de flavivirus En otro aspecto, la presente invención se refiere a los vectores para expresar antígenos particulares Flavivirus en una célula hospedera.
En una modalidad preferida, dicho antígeno de Flavivirus es la proteína soluble E (sE) del virus de la encefalitis japonesa (JEV.sE). Más concretamente, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico del mismo y c) la proteína sE del virus de encefalitis Japonesa.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un supuesto "cásete pDeSNAP Univ/JEV.sE" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el que se han insertado las secuencias del gen que codifica la proteína E soluble (sE) del virus de la encefalitis japonesa (JEV).
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete de pDeSNAP Univ/JEV.sE que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 50 que comprende, de 5' a 3': una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica la secuencia de prM/M de JEV cepa SA-14 (Genbank #M55506), la secuencia de ADN que codifica la secuencia de E [1-395] de JEV cepa SA-14 (Genbank #M55506), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteina soluble E (sE) del virus de la encefalitis japonesa (JEV.sE). En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 51 (correspondiente a la proteína de fusión JEV.sE/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también es atraída por el uso de esta proteína de fusión [SNAP-JEV.sE] para identificar la presencia del virus de la encefalitis japonesa (JEV) en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En una modalidad preferida, dicho antígeno de Flavivirus es el dominio III de la proteína envolvente E (EDlll) del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 (JE-1.EDlll), de genotipo 2 (JE-3. EDlll), del genotipo 4 (JE-4.EDIII), o del genotipo 5 (JE-5.EDIII).
En otro aspecto, la presente invención por lo tanto se refiere a un vector para expresar el dominio III de la proteína envolvente E (EDlll) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo I (JE-me.EDIII), de genotipo 2 (JE-2.EDIII), del genotipo 4 (JE-4.EDIII), o del genotipo 5 (JE-5.EDIII) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína EDlll del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 (JE-me.EDIII), de genotipo 2 (JE-2.EDIII), del genotipo 4 (JE-4.EDIII), o del genotipo 5 (JE-5.EDIII).
En una modalidad preferida, este vector comprende un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JE-I. EDlll" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual la secuencia del gen de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDlll) del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 (JE-1. EDIII) se ha insertado.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JE-1. EDIII que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 52 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia del ADN SEQ ID NO: 54 de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 (Genebank #AY377577), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En una modalidad preferida, este vector comprende un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JE-2.EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv según lo definido anteriormente, en el cual la secuencia del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 2 (JE-2.EDIII) se ha insertado.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JE-2. EDIII que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 59 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , la secuencia del ADN SEQ ID NO: 55 de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 2 (Genebank #L-43566), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En una modalidad preferida, este vector comprende un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JE-4. EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv según lo definido anteriormente, en el cual la secuencia del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 4 (JE-4. EDIII) se ha insertado.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JE-4.EDIII que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 61 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia del ADN SEQ ID NO: 56 de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 4 (Genebank#U70408), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En una modalidad preferida, este vector comprende un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual la secuencia del gen de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 (JE-5. EDIII) se ha insertado.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JE-5.EDIII que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 63 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia del ADN SEQ ID NO: 57 de codificación del dominio III de la proteína envolvente E (EDI 11) del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 (Genebank#JN587258), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a las células recombinantes que son transfectadas establemente por dichos vectores.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteína EDIII de la JE-1 , 2-JE, JE-4 o virus JE-5. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 53 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JE-1.EDIII/Histag), SEQ ID NO: 60 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JE-2.EDItl/Histag) SEQ ID NO: 62 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JE-4.EDIII/Histag) o SEQ ID NO: 64 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JE-5.EDIII/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de cualquiera de estas proteínas de fusión [SNAP-JE-1.EDIII], [SNAP-JE-2.EDIII], [SNAP-JE-4.EDIII] o [SNAP-JE-5.EDIII] para identificar la presencia del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 , 2, 4 o 5 respectivamente en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector para expresar el dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de Rabensburg (RabV) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el dominio III de la proteína envolvente E (EDIII) del virus de Rabensburg (RabV).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/RabV.EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de la proteína EDIII del virus Rabensburg.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/RabV.EDIII que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 65 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia del ADN SEQ ID NO: 58 que codifica el dominio III de la proteína envolvente E (EDI 11) del virus de Rabensburg (Genebank#AY65264), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la proíeína EDIII del virus Rabensburg. En esíe polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 66 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/RabV.EDIII/Histag).
Por lo tanío, en otro aspecto, la presente invención lambién se refiere al uso de esía proteína de fusión [SNAP - RabV.EDIII] para identificar la presencia del virus Rabensburg en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antíqenos de Alfavirus En otro aspecto, la presente invención se relaciona con vectores para expresar antígenos alfavirus particular, por ejemplo la proteína de E2 soluble del virus Ross River (RR.sE2) o desde el virus Mayaro (MAY.sE2), en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína sE2 del virus Ross River.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/RR.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen sE2 del virus Ross River.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/RR.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 69 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica la proteína sE2 de la cepa de virus Ross River QML1 (Genbank #GQ433354), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de las mismas y b) la proteína sE2 del virus Ross River. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 70 (correspondiente a la proteína de fusión RR.sE2/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP - RR.sE2] para identificar la presencia del virus Ross River en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
La presente invención también se refiere a un vector para expresar la proteína E2 soluble del virus Mayaro (MAY.sE2) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína sE2 del virus Mayaro.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MAY.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen sE2 del virus Ross River.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAY.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 71 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, La secuencia de ADN que codifica la proteína corregida sE2 (E2-S203C) de la cepa del virus Mayaro IQD2668 (Genbank#DQ487429.1), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteína sE2 del virus Mayaro (MAY.sE2). En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 72 (correspondiente a la proteína de fusión MAY.sE2/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MAY.sE2] para identificar la presencia del virus Mayaro en una muestra biológica, por ejemplo gracias al ¡nmunoensayo de la presente invención.
Antí enos de virus de la encefalitis equina En otro aspecto, la presente invención se refiere a los vectores para expresar antígenos particulares del virus de la encefalitis equina, por ejemplo la proteína E2 soluble de los virus de la encefalitis equina occidental (WEE.sE2), el virus de la encefalitis equina del este (EEE.sE2) o el virus de la encefalitis equina venezolana (VEE.sE2) en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptído de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína E2 soluble del virus de encefalitis equina occidental.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/WEE.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado el gen sE2 del virus de encefalitis equina occidental.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/WEE.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 73 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica la proteína sE2 de la cepa de virus de encefalitis equina occidental (Genbank #NC00390808), - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) las proteínas sE2 del virus WEE. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 74 (correspondiente a la proteína de fusión WEE.sE2/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-WEE.sE2] para identificar la presencia del virus de la encefalitis equina occidental en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector para expresar la proteína E2 soluble del virus de encefalitis equina occidental (EEE.sE2) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifican a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína E2 soluble del virus de encefalitis equina oriental.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/EEE.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen sE2 del virus de encefalitis equina oriental.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/EEE.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 75 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica la proteína sE2 de la cepa de virus de encefalitis equina oriental (Genbank #EF151502), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN- alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) las proteínas sE21 del virus EEE. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 76 (correspondiente a la proteína de fusión EEE.sE2/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteina de fusión [SNAP-EEE.sE2] para identificar la presencia del virus de encefalitis equina oriental en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención también se refiere a un vector para expresar la proteína E2 soluble del virus de la encefalitis equina venezolana (VEE.sE2) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-DNA-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína E2 soluble del virus de la encefalitis equina venezolana.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/EEE.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen sE2 del virus de la encefalitis equina venezolana.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/EEE.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 77 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica la proteína sE2 de la cepa de virus de la encefalitis equina venezolana (Genbank #AY973944), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) las proteínas sE2 del virus VEE. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 78 (correspondiente a la proteína de fusión VEE.sE2/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-VEE.sE2] para ideníificar la presencia del virus de la encefalitis equina venezolana en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antíqenos de Qrthobunvavirus En otro aspecto, la presente invención se refiere a los vectores para expresar antígenos de orthobunyavirus particulares, por ejemplo la nucleoproteína N del virus Akabane (AKA.N), desde el virus Aino (AIN.N) o del virus Shamonda (SHA.N), en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Akabane.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/AKA.sE2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la nucleoproteína N del virus Akabane.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/AKA.sE2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 79 que comprende: - una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N natural del virus Akabane, - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Akabane. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 80 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/AKA.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-AKA.N] para identificar la presencia del virus Akabane en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención también se refiere a un vector para expresar la nucleoproteína N del virus Aino (AIN.N) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-DNA-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Aino.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/AIN.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la nucleoproteína N del virus Aino.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/AIN.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 81 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N natural del virus Aino, una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalííico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Aino. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 82 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/AIN.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecío, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP -AIN.N] para identificar la presencia del virus Aino en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la présenle invención.
En otra modalidad, la presente invención también se refiere a un vector para expresar la nucleoproteína N del virus Shamonda (SHA.N) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-DNA-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Shamonda.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/SHA.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la nucleoproteína N del virus Shamonda.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/SHA.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 83 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), - la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N natural del virus Shamonda, una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Shamonda. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 84 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/SHA.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-SHA.N] para identificar la presencia del virus Shamonda en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígenos de betacoronavirus En otro aspecto, la presente invención se refiere a los vectores para expresar antígenos de betacoronavirus particulares, por ejemplo la nucleoproteína N del betacoronavirus humano (huCOV.N), o la proteína S del betacoronavirus humano (huCOV.S), en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus betacoronavirus.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/huCOV.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la nucleoproteína N del betacoronavirus humano.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/huCOV.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 85 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica el gen N de betacoronavirus humano 2cEMC/2012 (Genbank#JX869059), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del beíacoronavirus. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemenfe es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo íal como se definió anferiormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 86 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/huCOV.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-huCOV.N] para identificar la presencia del beíacoronavirus humano en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención también se refiere a un vector para expresar la forma soluble de la proteína S spike (huCOV.N) en una célula hospedera, que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas y b) una enzima 6-alquilguanina-DNA-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la forma soluble de la proteína S spike del betacoronavirus humano.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/huCOV.S" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen S de betacoronavirus humano.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/huCOV.S que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 87 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el gen S del betacoronavirus humano 2cEMC/2012 (Genbank#JX869059), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de la proteína N DeSNAPuniv- virus SARS que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 154 y/o codificación de la secuencia del aminoácido del SEQ ID NO: 155. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia de SNAO, los sitios pro-TEV, o la proteína mutada del coronavirus del SRAS, representado en las figuras 12A a 12F, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete DeSNAP + SARS S-RDB que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 156 y/o codificación de la secuencia del aminoácido de SEQ ID NO: 157. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifican el péptido señal de SNAP, la secuencia de SNAP, los sitios pro-TEV o el dominio de unión al receptor de proteína S del virus del SARS representado en las figuras 13A a 13D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-huCOV.N (coronavirus humano) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 158 y/o codificación de la secuencia del aminoácido del SEQ ID NO: 159. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifican el péptido señal de SNAP, la secuencia de SNAP, los sitios pro-TEV o el gen N de betacoronavirus humano representado en las figuras 14A a 14E, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete -huCOV.SI + DeSNAP (coronavirus humano) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 160 y/o codificación de la secuencia del aminoácido del SEQ ID NO: 161. El vector puede constar de una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de la proteína quimérica, la secuencia SNAP, o el gen S1 de betacoronavirus humano representado en las figuras 15A a 15G, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-huCoV.S-RDB que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 162 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 163. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de la proteína quimérica, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV o el RBD de proteína S de betacoronavirus humano representado en las figuras 16A a 16D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la forma soluble de la proteína S spike del betacoronavirus humano. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 88 (correspondiente a la proteína de fusión huCOV.S/tipo SNAP/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-huCOV.S] para identificar la presencia del betacoronavirus humano en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígeno de hepacivirus En otro aspecto, la presente invención se relaciona con vectores para expresar antígenos de hepacivirus particulares, por ejemplo la proteína C del virus de hepatitis C (HCV.C) o del virus de hepatitis E (HEV.C), en una célula hospedera.
En una modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína C del virus de hepatitis C.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/HCV.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la proteína C del virus de hepatitis C.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/HCV.C que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 89 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la proteína C del virus de la hepatitis C 1b (cepa TCHM-R2/03), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia E LYFQG (SEQ ID NO: 33), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-HEV.C que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 170 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 171. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV, o la proteína C mutada de virus de la Hepatitis E representada en las figuras 20A a 20F, o por lo menos 10, 5, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de dominio central de proteína DeSNAPuniv-HEV.C que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 172 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 173. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV o el antígeno de núcleo HEV representado en las figuras 21 A a 21 E, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de antígeno de núcleo DeSNAPuniv-HCV que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 174 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 175. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV, o el antígeno de núcleo VHC representado en las figuras 22A a 22C, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de núcleo (C) de DeSNAPuniv-HCV corto que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 176 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos del SEQ ID NO: 177. El vector puede constar de una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV, o la forma corta de la proteína del núcleo HCV representada en las figuras 23A a 23D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteína C del virus de hepatitis C. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 90 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1 /EV71.VP 1 /proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-HCV.C] para identificar la presencia del virus de hepatitis C en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio caíalítico de la misma y c) la proteína C del virus de hepatitis E (HEV.C).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "caseíe pDeSNAP Univ/HEV.C" es decir, un caseíe de ADN pDeSNAPUniv como se definió aníeriormenfe, en el cual se ha insertado la secuencia del gen de la proíeína C del virus de hepaíiíis E.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/HEV.C que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 150 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 23, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , - una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la proteína C del virus de la hepatitis E (Genbank #AB29196), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteína C del virus de hepatitis E (HEV.C). En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 151 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/HEV.C/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP -HEV.C] para identificar la presencia del virus de hepatitis E en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígenos de malaria En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector para expresar antígenos particulares de Malaria, por ejemplo, el MSP-1 y las proteínas de AMA-1 del Plasmodium falciparum (MSP-1 +AMA-1) (véase Pan W. et al., The Journal of Immunology, 2004), en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, b) una enzima 6-alquílguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) las proteínas MSP-1 y AMA-1 del parásito Plasmodium falciparum.
En una modalidad preferida, este vector comprende un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MSP-1+AMA-1 " es decir, un cásete pDeSNAPUniv ADN según lo definido anteriormente, en donde se ha insertado la secuencia de codificación de las proteínas MSP-1 y AMA-1 del parásito Plasmodium falciparum.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MSP-1 +AMA-1 que tiene la secuencia de nucleotido SEQ ID NO: 91 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), la secuencia de ADN que codifica de la secuencia MSP-1 (19) (50% G+C) de Plasmodium falciparum, - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), la secuencia de ADN que codifica de la secuencia AMA-1 (III) (50% G+C) de Plasmodium falciparum, una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de los mismos y b) la proleína MSP-1 + AMA-1 de Plasmodium falciparum. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 92 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/MSP-1/proTEV2/AMA-1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MSP-1+AMA-1] para identificar la presencia del parásito Plasmodium falciparumln en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígenos de leptospirosis En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector para expresar un antígeno particular de leptospirosis, tal como las proteínas HbpA de las bacterias Leptospira (véase Sivakolundu S. et al, Journal of Medical Microbiology, 2012), en una célula hospedera. Los vectores preferidos son SNAP-Lru y SNAP-Lru B. particularmente preferidas son las líneas celulares S2 que contiene estos vectores. Las líneas celulares SN/SNAP-Lru A y S2/SNAP-Lru B se depositan el 2 de Mayo de 2013, en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM), 25, Rué du Docteur Roux, 75724 Paris Cedex 15, Francia, bajo los nombres CNCM I-4745 y CNCM I-47-46, respectivamente.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína HbpA de las bacterias Leptospira interrogans.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/HbpA" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación de la proteína HbpA de las bacterias Leptospira.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/HbpA que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 93 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la forma corta modificada de HbpA (receptor de membrana externa dependiente de TonB o LB191 ) de Leptospira interrogans serovar Lai str.56601 (Genbank #AA51750.1 ), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-LruA corto (leptospirosis) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 164 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 165. El vector puede constar de una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia de SNAP, los sitios pro-TEV, o las formas cortas modificadas de LruA representado en las figuras 17A a 17D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismo, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-LruB corto (leptospirosis) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 166 y/o codificación de la secuencia de aminoácidoa de SEQ ID NO: 167. El vector puede constar de una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia SNAP, los sitios pro-TEV, o las formas cortas modificadas de LruB representado en las figuras 18A a 18D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismos, solos o en combinación.
En otra modalidad, el vector comprende el cásete de DeSNAPuniv-LipL32 (leptospirosis) que tiene la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 168 y/o codificación de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 169. El vector puede comprender una secuencia de ADN que codifica el péptido señal de SNAP, la secuencia de SNAP, los sitios pro-TEV, o las formas cortas modificadas de LipL32 representado en las figuras 9A a 19D, o por lo menos 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 100, 200 o 300 aminoácidos consecutivos del mismos, solos o en combinación.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de los mismos y b) la proteína HbpA de bacterias Leptospira interrogans. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 94 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/HbpA/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-HbpA] para identificar la presencia de la bacteria Leptospira en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Péptidos microbianos En otro aspecto, la presente invención se refiere a un vector para expresar un péptido microbiano, por ejemplo, el péptido microbiano MUB-40, en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio caíalítico de la misma y c) el péptido MUB-40.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MUB40" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación del péptido MUB40.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/ UB40 que tiene la secuencia de nucleólido SEQ ID NO: 95 que comprende: - una secuencia BiP de insecío SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN de codificación del péptido MUB-40, una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33) y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) el péptido MUB 40. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 96 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/MUB40/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MUB40] para identificar la presencia de un ligando biológico, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Lectinas implicadas en la patogenia de Flavivirus En otro aspecto, la presente invención se refiere a vectores para expresar lectinas particulares implicadas en la patogenia de Flavivirus, por ejemplo el ratón o la forma soluble humana de lectinas tipo C (CLEC5A), en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la CLE5A de ratón (mo-CLEC5A) o CLEC5A de humano (hu-CLEC5A).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación que codifica la forma soluble de ratón de lectina tipo C.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/mo-CLEC5A que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 97 que comprende: - una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la forma soluble de ratón de lectina tipo C (CLEC5A). una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25) y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación de la forma soluble humana de lectina tipo C.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/hu-CLEC5A que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 99 que comprende: - una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la forma soluble humana de lectina tipo C (CLEC5A), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25) y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la forma soluble, de ratón o humana, de lectina tipo C (CLEC5A). En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 98 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/mo-CLEC5A/proTEV2/Histag) o la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 00 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/hu-CLEC5A/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-mo-CELC5A] o [SNAP-hu-CLEC5A] para la detección de la presencia de flavivirus en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Proteínas de mosquito anti-flavivirales En otro aspecto, la presente invención se refiere a vectores para la expresión de proteínas de mosquito antivirales particulares, por ejemplo la proteína VAGO de la especie Culex (cxVAGO) o de la especie Aedes (aaVAGO) en una célula hospedera.
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en las células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína VAGO del mosquito Aedes albopictus.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/aaVAGO" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la proteína VAGO del mosquito Aedes albopictus.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/aaVAGO que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 103 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 152, - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), la secuencia de ADN que codifica la proteína VAGO del mosquito Aedes albopictus, y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de los mismos y b) la proteína VAGO del mosquito Aedes albopictus. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 104 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SN AP/aaVAGO/H istag) .
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-aaVAGO] para identificar la presencia de un ligando en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la proteína VAGO del mosquito Culex quinquefasciatus.
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/cxVAGO" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación de la proteína VAGO del mosquito Culex quinquefasciatus.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/cxVAGO que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 101 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 152, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), la secuencia de ADN que codifica la proteína VAGO del mosquito Culex quinquefasciatus, una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de los mismos y b) la proteína VAGO del mosquito Culex quinquefasciatus. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteina de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 102 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/cxVAGO/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-hxVAGO] para identificar la presencia de un ligando en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
Antígenos virales de fiebre hemorráqica En otro aspecto, la presente invención se refiere a vectores para expresar antígenos de fiebre hemorrágica viral particulares tales como: la nucleoproteína N del virus de Crimea-Congo (CCHF.N), del virus de Ébola (EBO.N), del virus de Marburg (MAR.N), del virus de Lassa (LAS.N), del virus Junin (JUN.N), del virus Machupo (MacN), del virus de Sabia (SAB.N), o del virus Guanarito (GUA.N), el ectodominio de GP1 del virus de Lassa (LAS.ectoGPI), del virus Junin (JUN.ectoGPI), del virus Machupo (MAC.ectoGPI), del virus de Sabia (SAB.ectoGP ) o del virus Guanarito (GUA.ectoGPI ), el ectodominio de GP2 del virus de Lassa (LAS.ectoGP2), del virus Junin (JUN.ectoGP2), del virus Machupo (MAC.ectoGP2), del virus de Sabia (SAB.ectoGP2) o del virus Guanarito (GUA.ectoGP2), el dominio III de la proteína envolvente E del virus Omsk (OMSK.EDIII), del virus Kasyanur (KAS.EDIII), o del virus Alkhurma (ALK.EDIII).
En particular, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleotidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalííico de la misma y c) la nucleoprofeína N del virus de Crimea-Congo (CCHF.N).
En una modalidad preferida, esfe veclor se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/CCHF.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia de codificación de la nucleoproteína N del virus de Criema-Congo.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/CCHF.N que tiene la secuencia de nucleófido SEQ ID NO: 108 que comprende: una secuencia BiP de insecfo SEQ ID NO: 22, la secuencia fipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus de Crimea-Congo, una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus de Crimea-Congo. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 109 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/CCHF.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención fambién se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-CCHF.N] para identificar la presencia del virus de Crimea-Congo en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus de ébola (EBO.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/EBO.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia del gen que codifica la nucleoproteína N del virus del ébola.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/EBO.N que tiene la secuencia de nucleótidos SEQ ID NO: 110 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31, - una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus de ébola (Genbank #NC_002549), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus del ébola. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 111 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/EBO.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-EBO.N] para identificar la presencia del virus de ébola en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Marburg (MAR.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MAR.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus Marburg.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAR.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 112 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus Marburg (Genbank #NC_001608), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Marburg. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 113 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/MAR.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MAR.N] para identificar la presencia del virus Marburg en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Lassa (LAS. N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/LAS.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus Lassa.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/LAS.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 114 que comprende: - una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus Lassa (Genbank #NC_004296), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), - una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Lassa. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 1 15 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/LAS.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-LAS.N] para identificar la presencia del virus Lassa en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Junin (JUN.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JUN.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus Junin.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JUN.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 116 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus Junin (Genbank #NC_005081 ), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Junin. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 7 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/JUN.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-JUN.N] para identificar la presencia del virus Junin en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Machupo (MAC.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MAC.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus Machupo.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAC.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 118 que comprende: - una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus Machupo (Genbank#NC_005078), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Machupo. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 1 19 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/MAC.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MAC.N] para identificar la presencia del virus Machupo en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Guanarito (GUA.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/GUA.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus Guanarito.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/GUA.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 120 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus Guanarito (Genbank #NC_005077), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Guanarito. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 121 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/GUA.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-GUA.N] para identificar la presencia del virus Guanarito en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) la nucleoproteína N del virus Sabia (SAB.N).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/SAB.N" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la nucleoproteína N del virus de Sabia.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/SAB.N que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 122 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), la secuencia de ADN que codifica la nucleoproteína N del virus de Sabia (Genbank #NC_006317), - una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión de pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una segunda secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espaciadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la nucleoproteína N del virus Sabia. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 123 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/proTEV1/SAB.N/proTEV2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-SAB.N] para identificar la presencia del virus Sabia en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el dominio III de la proteína envolvente E del virus Omsk (OMSK.EDIII).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/OMSK.EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la proteína EDI II del virus Omsk.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/OMSK.EDIIII que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 124 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 152, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , - la secuencia de ADN que codifica la proteína EDI II del virus Omsk (Genbank #NC_005062), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de las mismas y b) la proteína EDI 11 del virus Omsk. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 125 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/OMSK.EDIII/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-OMSK.EDIII] para identificar la presencia del virus Omsk en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el dominio III de la proteína envolvente E del virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur (KYA.EDIII).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/KYA.EDIM" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la proteína EDIII de la enfermedad del bosque de Kyasanur.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/KYA.EDIM que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 126 que comprende: - una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 152, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , la secuencia de ADN que codifica la proteína EDIII del virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur (Genbank #JF4 6958), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) la proteína EDIII del virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 127 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/KYA.EDIII/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-KYA.EDIII] para identificar la presencia del virus de la enfermedad del bosque de Kyasanur en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende ia secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el dominio III de la proteína envolvente E del virus Alkhurma (ALK.EDIII).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/ALK.EDIII" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica la proteína EDIII del virus Alkhurma.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/ALK.EDIII que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 128 que comprende: una secuencia tipo BiP de insecto de SEQ ID NO: 152, la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , - la secuencia de ADN que codifica la proteína EDIII del virus Alkhurma (Genbank #NC_004355), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquiltransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de las mismas y b) la proteína EDIII del virus Alkhurma. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 129 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/ALK.EDIII/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteina de fusión [SNAP-ALK.EDIII] para identificar la presencia del virus Alkhurma en una muestra biológica, por ejemplo gracias al ¡nmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Lassa (LAS.ectoGPI).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Lassa.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP1 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 130 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Lassa (Genbank #NC_004296), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Lassa. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 131 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/LAS.ectoGP1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP -LAS.ectoGPI] para identificar la presencia del virus Lassa en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Junin (JUN.ecíoGPI).
En una modalidad preferida, esíe vecíor se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Junin.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP1 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 32 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Junin (Genbank #NC_005081), - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Junin. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 133 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JUN.ectoGP1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP -JUN.ectoGPI] para identificar la presencia del virus Junin en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de la misma y c) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Machupo (MAC.ectoGPI).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Machupo.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP1 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 134 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Machupo (Genbank#NC_005078), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Machupo. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 135 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/MAC.ectoGP1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MAC.ectoGP1] para identificar la presencia del virus Machupo en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio caíalííico de la misma y c) el ectodominio de glicoproíeína GP1 del virus Guanarito (GUA.ectoGPI).
En una modalidad preferida, esíe vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Un¡v/GUA.ectoGP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Guanarito.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/Gua.ectoGP1 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 136 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Guanarito (Genbank #NC_005077), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 3 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Guanarito. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 137 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/GUA.ectoGP1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-GUA.ectoGP1] para identificar la presencia del virus Guanarito en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Sabia (SAB.ectoGPI).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Sabia.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/SAB.ectoGP1 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 138 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Guanarito (Genbank #NC_006317), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, ia presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP1 del virus Sabia. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 139 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/SAB.ectoGP1/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-SAB.ectoGP1] para identificar la presencia del virus Sabia en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Lassa (LAS.ectoGP2).
En una modalidad preferida, este vector se compone del llamado "cásete pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Lassa.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/LAS.ectoGP2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 140 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Lassa (Genbank #NC_004296), - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Lassa. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 141 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/LAS.ectoGP2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-LAS.ectoGP2] para identificar la presencia del virus Lassa en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Junin (JUN.ectoGP2).
En una modalidad preferida, este vector se compone del llamado "cásete pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Junin.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/JUN.ectoGP2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 142 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Junin (Genbank #NC_005081 ), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 de codificación de una secuencia His-Tag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Junin. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 143 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/JUN.ectoGP2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-JUN.ectoGP2] para identificar la presencia del virus Junin en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Machupo (MAC.ectoGP2).
En una modalidad preferida, este vector se compone del llamado "cásete pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Machupo.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 144 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Machupo (Genbank#NC_005078), - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Machupo. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 145 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/MAC.ectoGP2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-MAC.ectoGP2] para identificar la presencia del virus Machupo en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un muíante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Guanarito (GUA.ectoGP2).
En una modalidad preferida, este vector se compone del llamado "cásete pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Guanarito.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/GUA.ectoGP2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 146 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, - la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Guanarito (Genbank #NC_005077), la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un mutante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Guanarito. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 147 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/GUA.ectoGP2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-GUA.ectoGP2] para identificar la presencia del virus Guanarito en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
En otra modalidad, la presente invención se refiere a un vector que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica a) un péptido de señal de secreción que es funcional en dichas células hospederas, y b) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT), un mutante, un fragmento o un dominio catalítico de los mismos y c) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Sabia (SAB.ectoGP2).
En una modalidad preferida, este vector se compone de un llamado "cásete pDeSNAP Un¡v/SAB.ectoGP2" es decir, un cásete de ADN pDeSNAPUniv como se definió anteriormente, en el cual se ha insertado la secuencia codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Sabia.
En una modalidad preferida, este vector comprende el cásete pDeSNAP Univ/MAC.ectoGP2 que tiene la secuencia de nucleótido SEQ ID NO: 148 que comprende: una secuencia BiP de insecto SEQ ID NO: 22, la secuencia de ADN que codifica el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Sabia (Genbank #NC_006317), - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 , y una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a una célula recombinante que es transfectada establemente por dicho vector.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a un polipéptido de fusión que comprende a) una enzima 6-alquilguanina-ADN-alquilotransferasa (AGT) (EC 2.1.1.63), un muíante o un dominio catalítico de la misma y b) el ectodominio de glicoproteína GP2 del virus Sabia. En este polipéptido de fusión, dicha enzima AGT preferiblemente es la proteína de SEQ ID NO: 2, o un homólogo de la misma (dicho homólogo tal como se definió anteriormente). Este polipéptido de fusión es por ejemplo la secuencia del aminoácido SEQ ID NO: 149 (correspondiente a la proteína de fusión tipo SNAP/SAB.ectoGP2/Histag).
Por lo tanto, en otro aspecto, la presente invención también se refiere al uso de esta proteína de fusión [SNAP-SAB.ectoGP2] para identificar la presencia del virus Sabia en una muestra biológica, por ejemplo gracias al inmunoensayo de la presente invención.
EJEMPLOS En el contexto de la invención, un inmunoensayo basado en granos múltiplex fue desarrollado para la detección rápida y simultánea de anticuerpos contra arbovirus en fluidos biológicos.
El sistema se basa en la tecnología xMAP (Luminex corporation) y utiliza una mezcla de microesferas recubiertas con antígeno como reactivos de captura para las inmunoglobulinas humanas concretas. Conjuntos distintos de microesferas (Magplex, Luminex corporation) fueron acoplados con proteínas de fusión AGT purificadas, es decir las proteínas recombinantes virales SNAP-etiquetadas: sSNAP-DVI .EDIII, sSNAP-DV2.EDIII, sSNAP-DV3.EDIII, sSNAP-DV4.EDU!, sSNAP-WN.EDIII, sSNAP-JE.EDIII, sSNAP-USU.EDIII, sSNAP-TBE.EDIII, sSNAP-YF.EDIII, sSNAP-MVE.EDIII, sSNAP-Rocio.EDIII, sSNAP-WSLEDIII, sSNAP-ZIKA.EDIII, SNAP-DV ectoM, sSNAP-N.RVF, sSNAP-N.TOS, y CHIK.sE2-SNAP. Los antígenos recombinantes fueron acoplados covalentemente a la superficie de la microesfera carboxilo usando un substrato de la proteína AGT como enlazador (BG-PEG-NH2, New England Biolabs), aumentando así la eficiencia de captura de anticuerpo en comparación con los procedimientos de acoplamiento amina estándar.
La validación técnica usando los anticuerpos de etiqueta anti SNAP y anticuerpos monoclonales de ratón específico confirmó la eficiencia de acoplamiento y demostró estabilidad a largo plazo del antígeno (hasta seis meses). Esta solicitud no se limita a los antígenos virales ya que cualquier péptido o polipéptido puede utilizarse para el recubrimiento del grano y captura de anticuerpo posterior.
I. Materiales y Métodos 1. Los siguientes reguladores de pH y soluciones se utilizan: a) Regulador de pH PBS: 100ml de 10X PBS, pH 7.4 en 1 L H20 estéril b) Regulador de pH de acoplamiento SNAP (PBS-DTT): 100 mL de 10X PBS, pH 7.4, 0.5 mi 10 % tween20, 1 mL de 1.0M DTT, en 1 L H20 estéril c) Regulador de pH de bloqueo/ensayo (PBS-B): PBS, 1 % BSA, pH 7.4 en 1L H20 estéril d) Regulador de pH de almacenamiento (PBS-TBN): 100 mL de 10X PBS, 1g de BSA, 2 mL de 10 % Tween 20, 500 mg de azida de sodio, 1 mL de 1.0M DTT, en 1L H20 estéril e) Solución de sustrato (4 mg/mL): 2 mg de BG-PEG-NH2, DMSO 200 µ?. f) Solución de activación (EDAC /SNHS): 50 mg/ml de solución EDAC o 50 mg/ml de SNSHS en agua destilada 2. Se usaron los siguientes materiales: 2.1. Microesferas MagPlex Luminex: MC 100XX-ID (donde XX es la región de fluorescencia), XX puede ser, por ejemplo 26, 27, 28, 29, 34, 35, 36, 37, 45, 52, 53, 63, 64, como se mencionó en la figura 7B. 2.2. Sustrato hAGT: PEG-BG-NH2 (NEB S9150S) 2.3. Proteínas de fusión SNAP-viral EDIII: La generación de una proteína de fusión que comprende AGT y radicales EDIII virales es bien conocida por la persona calificada. Todos los procedimientos de síntesis conocida pueden utilizarse para este propósito, siempre que la enzima AGT permanezca activa en la proteína de fusión.
En el presente caso, el muíante SNAP AGT de SEQ ID NO: 2 se ha utilizado y proteínas de fusión EDIII SNAP-viral se han generado.
El sistema de expresión inducible por Drosophila S2 (DES, Invitrogen), ha sido elegida para la producción masiva de EDIII individual de flaviviruses en las células no-vertebrado y se ha utilizado el plásmido pMT/B¡PA/5-HisA de Invitrogen.
Este plásmido contiene: El promotor de metalotioneína pMT, Una secuencia de insecto ssBiP de SEQ ID NO: 22, Sitios de restricción Bgl II y Age I, - el ADN de SEQ ID NO: 28 de codificación de His6tag situado corriente abajo del sitio de restricción Age I, y la secuencia espadadora del ADN de SEQ ID NO: 26 situada entre el sitio de la restricción Age I y el ADN que codifica un H¡S6tag.
Los genes sintéticos de codificación para el dominio de longitud completa III de las proteínas E de flavivirus WN, USU, JE, TBE, DEN- a DEN-4, YF, Roció, MVE, Zika, SLE, y WSL aparecen en SEQ ID NO: 3 a SEQ ID NO: 14. Las secuencias de aminoácidos de ED III fueron fusionadas en el marco al C-terminal de la proteína SNAP, con ambos radicales están separados por un enlazador GGGS (SEQ ID NO: 25). Las secuencias de ADN de codificación de SNAP-EDIII fueron insertadas en el plásmido pMT/BiPA 5-Histag (Invitrogen) para generar los plásmidos pMT/BiP/SNAP/EDIII/Histag.
Los plásmidos resultantes pMT/BiP/SNAP-EDIII-Histag, que puede conducir la expresión de proteínas de fusión SNAP-EDIII-His6 secretadas, fueron co transfectadas con marcador de selección pCo-Blast en células S2 para generar la línea de células S2/sSNAP-ED lll-Histag estable mostrando resistencia a blasticidina.
Las líneas de células estables S2 cultivadas en una centrifuga (1000 mi) fueron estimulados 10 días con metal pesado cadmio (Cd2+) y proteínas del medio extracelular se concentraron y purificaron.
La acumulación de proteína secretada EDIII SNAP-etiquetado fue observada en los sobrenadantes de células S2/sSNAP-EDIII-Histag estables después de 10 días de inducción con metal pesado cadmio.
Las proteínas SNAP-DEN1. EDIII de SEQ ID NO:21 , SNAP- DEN2.EDIII de SEQ ID NO.X, SNAP-DEN3. EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-DEN4.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-WN.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-JE.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-YF.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-MVE.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-Rocio.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-WSL.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-ZIKA.EDIII de SEQ ID NO:X, SNAP-SLE.EDIII de SEQ ID NO:X se han producido en consecuencia. 3. Preparación de granos del antígeno-acoplado La producción de granos de antígeno-acoplado consta de dos pasos: funcionalización de microesfera las superficies con un derivado O6-bencilguanina (BG-PEG-amino) e inmovilización covalente de las proteínas virales SNAP Ags quiméricas usando el BG-PEG-amino como un anclaje (figura 1 ). Las superficies de microesfera carboxilo covalentemente fueron cubiertas con sustrato BG-PEG-aminos mediante un procedimiento de dos pasos optimizado de carbodiimida (Wong et al Journal of Clinical Microbiology 42(1). 65-72, 2004). Posteriormente, los compuestos BG-PEG-amino acoplados se ligaron irreversiblemente a las proteínas quiméricas de Ags SNAP-viral por la transferencia del grupo bencilo a la cisteína del sitio activo de la proteína SNAP. Debido a la alta especificidad de esta reacción, la proteína de fusión está acoplada exclusivamente mediante el dominio SNAP, dejando accesible para las interacciones con los anticuerpos del antígeno viral. 3.1. En primer lugar, los granos comerciales se activan según las instrucciones del fabricante (utilizando las soluciones de activación EDAC y SNS) y lavados en un regulador de pH de PBS. Se realizaron todos los pasos en la oscuridad para evitar que el amortiguamiento fluorescente de los granos, según las instrucciones del fabricante.
Aproximadamente 1.25 x 106 granos fueron utilizados para cada procedimiento de acoplamiento. 3.2. El substrato AGT PEG-BG-NH2 en la solución de DMSO se agregó luego de 6 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4o C en los granos activados y posteriormente lavado con regulador de pH PBS. 3.3. Los sitios carboxílicos no ligados luego fueron bloqueados con el regulador de pH de bloqueo durante 30 minutos a temperatura ambiente y los granos lavados posteriormente con el regulador de pH de acoplamiento SNAP. 3.4. Las proteínas SNAP-EDIII resuspendidas en el regulador de pH de acoplamiento SNAP (1 mg/ml) fueron incubadas con los granos así obtenidos durante dos horas a temperatura ambiente y luego lavados una vez con el regulador de pH de unión del complemento y tres veces con el regulador de pH de almacenamiento (PBS-TBN). 4. Inmunoensayos de fluorescencia de microesfera Los conjuntos de granos, conjugados con diferentes Ags SNAP-viral, se mezclaron con vórtice para asegurar la dispersión total de granos. Después de ajusfar la densidad de granos a 100 granos/pL, 25 pl de cada uno de los conjuntos (contiene microesferas 2500) fueron transferidos a una placa de microtitulación de 96 pocilios (Bio-Plex Pro placa de fondo plano, BíoRad) en pocilios separado para los ensayos de singleplex, o mezclado en los mismos pocilios para ensayos multiplex. Las microesferas se lavaron tres veces con regulador de pH de lavado 100 µ? (regulador de pH de lavado BioPlex, BioRad) utilizando una estación de lavado de microplacas para granos magnéticos (BioPlex Pro estación de lavado, BioRad). Las muestras (anticuerpos o sueros) se diluyeron en regulador de pH de ensayo (PBS-BSA) y 50 µ? de las soluciones resultantes se agregaron a los pocilios de prueba que contiene los granos conjugados. Después de la incubación en la oscuridad en un agitador de placa por 30 min, se lava la placa como anteriormente. Posteriormente, un anticuerpo secundario marcado con fluorocromo se diluyó en regulador de pH de ensayo (PBS-BSA) a 2 pg/ml, y 50 pl de las soluciones resultantes se agregaron a los pocilios de prueba que contiene los granos conjugados. Después de la incubación en la oscuridad en un agitador de placa por 30 min, se lava la placa anteriormente. Finalmente, estreptavidina-ficoeritrina (SAPE, Invitrogen Molecular Probes) se diluyó en regulador de pH de ensayo (PBS-BSA) 2 pg/ml y 50 pl de la solución resultante se añade a los pocilios de la microplaca. La placa fue incubada en la oscuridad en un agitador de placa durante 10 min y lavada como previamente, antes de resuspender el contenido de los pocilios en 125 µ? de regulador de pH de ensayo. Se evaluó la intensidad de fluorescencia media (MFI) del anticuerpo de detección a las microesferas individuales de análisis de flujo de 50 microesferas por bien usando un analizador de flujo doble láser (BioPlex 200 Instrument, BioRad). El instrumento de detección fluorescente está equipado con un primer láser para detectar el tipo de grano y un segundo para asegurar la cuantificación de IgM capturado o IgG excitando el fluoróforo (rojo-ficoeritrina) conjugado con el anticuerpo de detección específica. 4.1 Confirmación de acoplamiento de antígeno El acoplamiento del antígeno fue confirmado por la prueba las microesferas antígeno-acoplado con diluciones de anticuerpo policlonal de etiqueta anti SNAP de conejo (GenScript). El inmunoensayo de fluorescencia se realizó en formato singleplex, como se describió anteriormente. Una serie de doble dilución del anticuerpo anti SNAP a partir de 4000 ng/ml y terminando en 3.9 ng/ml fue realizado en PBS-BSA y volúmenes de cada dilución se agregaron a los pocilios de prueba que contiene los granos. Un conjugado con biotina cabra anti-conejo IgG (2pg/ml en 50µ?_ PBS-BSA) fue utilizado como anticuerpo secundario para detectar los anticuerpos anti SNAP ligados.
La figura 2 muestra que los resultados de la fluorescencia observaron para la detección de anticuerpos anti-SNAP en 8 diferentes conjuntos de microesferas junto a los antígenos virales SNAP quiméricos proteínas (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-TBE). 4.2 Detección de anticuerpos específicos La captura y detección de anticuerpos específicos por las microesferas conjugadas con el antígeno se evaluó mediante los anticuerpos purificados anticuerpo monoclonal de ratón (anti-WNV, anti-DV1 y anti-DV2) y sueros policlonales de ratón (anti DV3, anti DV4, anti YF y anti JE) o suero humano (anti DV1). El inmunoensayo de fluorescencia se realizó en formato multiplex y singleplex como se describió anteriormente. Una serie de diluciones cuádruple de anticuerpos monoclonales de ratón purificada a partir de 400 ng/mL y terminando en 0.1 ng/ml y suero del ratón y suero humano a partir de 1 :25 y terminando en 1 :102400, se realizó en PBS-BSA y volúmenes de cada dilución se agregaron a los pocilios de prueba que contiene los granos. Un IgG anti ratón de cabra conjugado con biotina (2pg/ml en 50 pL PBS-BSA), fue utilizado como anticuerpo secundario para detectar anticuerpos de ratón ligados monoclonales y policlonales. Un IgM anti humano de cabra conjugado con biotina (2pg/ml en 50pL PBS-BSA) o un IgG anti humano de cabra conjugado con biotina (2pg/ml en 50 µ? PBS-BSA), fue utilizado para detectar anticuerpos IgM o IgG ligados en suero humano, respectivamente.
La figura 3 compara la sensibilidad del experimento del inmunoensayo para la detección de anticuerpo purificado monoclonal anti DV2 en proteína quimérica SNAP-DV2.EDIII conjugada con microesferas vía el sustrato de la proteína hAGT (acoplamiento de la invención) o acoplado mediante el kit de acoplamiento de amina Bio-Plex, BIORAD.
La figura 4 compara la sensibilidad del experimento del inmunoensayo para la detección de anticuerpo purificado monoclonal anti-DV1 en proteína quimérica de SNAP-DV1.EDIII conjugada a microesferas, un formato singleplex o múltiplex con otras proteínas quiméricas de Ags SNAP-viral (SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
La figura 5 muestra la reactividad y la especificidad del experimento múltiplex de inmunoensayo para la detección de las diluciones del anticuerpo monoclonal purificado anti-WNV en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
Las figuras 6A y 6B muestran la reactividad y la especificidad de la detección de IgG anti DV3 en suero policlonal del ratón contra DV3 (figura 6A) y la detección de IgG anti YFen suero policlonal del ratón contra YF (figura 6B) en inmunoensayos múltiplex en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDU I, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE, SNAP-ZIKA) acoplada a las microesferas Las figuras 7A y 7B muestran la reactividad y la especificidad de la detección de IgM anti DV1 (figura 7A) y detección de IgG anti DV1 (figura 7B) en el suero infectado por DV1 de un paciente humano en inmunoensayos múltiplex en las proteínas quiméricas Ags SNAP-viral (SNAP-DV1.EDIII, SNAP-DV2.EDIII, SNAP.DV3.EDIII, SNAP.DV4.EDIII, SNAP-WNV, SNAP-YF, SNAP-JE, SNAP-WSL, SNAP-ROCIO, SNAP-MVE, SNAP-SLE, SNAP-ZIKA, SNAP-TBE) acoplada a las microesferas.
II. Resultados El sistema de la invención utiliza una mezcla de microesferas Magplex (Luminex Corporation) recubiertas con antígeno como reactivos de captura para las inmunoglobulinas humanas específicas. Cada conjunto de microesferas internamente con códigos de colores han sido acoplados a un antígeno recombinante específico y mezclado con otros tipos de microesferas en un volumen de muestra pequeño. El poder de este sistema radica en el hecho de que es posible analizar simultáneamente hasta 100 tipos de microesferas juntados por pocilio utilizando una herramienta de análisis de flujo. El instrumento de detección fluorescente está equipado con un primer láser para detectar el tipo de grano y un segundo para la cuantificación de captura de IgM o IgG excitando el fluoróforo (ficoeritrina) conjugado con el anticuerpo de detección específica. Con sus amplias capacidades de multiplexación y límite inferior de detección, este enfoque ofrece sustanciales costos y ahorros muestra las mediciones tradicionales de ELISA.
En la actualidad, 16 conjuntos distintos de las microesferas han sido ligadas con proteínas purificadas SNAP-viral Ags quiméricas, permitiendo la titulación de anticuerpos séricos específicos de serotipos de dengue 1 a 4, Nilo Occidental, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis transmitida por garrapatas, encefalitis San Louis, encefalitis del Valle de Murray, Wesselsbron, Zika, Roció, Usutu, fiebre del Valle del Rift y el virus Chikungunya. La producción del sistema es altamente efectiva en tiempo y costos, ya que sólo una muy pequeña cantidad de antígeno recombinante (<50 pg) es necesaria para producir un sistema de microesferas acopladas a antígenos (~1.25 x 106 microesferas), suficientes para llevar a cabo 500 ensayos individuales. Por otra parte, los conjuntos seleccionados de las microesferas son adaptables a un sistema de detección fluorescente compacto, robusto y económico como el MagPix (Luminex Corporation).
La evaluación del acoplamiento del antígeno con un anticuerpo anti-SNAP (figura 2) confirmó la eficacia de acoplamiento y demostró que las cantidades relativas de los antígenos ligados son comparables entre los conjuntos diferentes de microesferas acopladas. La evaluación de la captura de anticuerpos y detección mediante anticuerpos de ratón purificados demostró mayor captura de anticuerpos específicos por las microesferas acopladas a antígenos producidas en comparación con las microesferas acopladas a antígenos obtenidas por procedimientos de acoplamiento amina estándar (figura 3). Además, se demostró el límite de detección bajo del método y confirmó que la multiplexación no afecta la detección de anticuerpos (figura 4). Además, las microesferas conjugados con antígeno exhibieron estabilidad a largo plazo cuando se almacena a 4o C (> 6 meses). Finalmente, la especificidad de cada conjunto de microesferas acopladas en inmunoensayos multiplexes fue demostrada por anticuerpos monoclonales de ratón purificados (figura 5), por los anticuerpos de IgG en suero policlonal de ratón (figuras 6A a 6B) y para los anticuerpos IgM e IgG en el suero policlonal de seres humanos infectados (figuras 7A y 7B).
Con sus amplias capacidades de multiplexación (hasta 100 tipos de microesferas juntados por pocilio) y límite de detección bajo, este enfoque ofrece sustanciales ahorros en costos y muestras respecto a las mediciones tradicionales de ELISA.
III. Generación de una proteína de fusión que comprende SNAP y la nucleoproteína N del virus Schmallenberq 1. Construcción de los vectores de codificación de la proteína de fusión SNAP-VSB.N La proteína de fusión quimérica compuesta por SNAP y la nucleoproteína N del virus Schmallenberg ha sido obtenida de la siguiente manera: En un primer paso, la secuencia del marco de lectura abierto del segmento S que codifica la nucleoproteína N y el NS de la proteína de la cepa BH80/1 1-4 fue mutada insertando un sitio de restricción EcoRV en su terminal 5' y un sitio de restricción Xmal en su terminal 3'. Además, el sitio de restricción EcoRV interno fue quitado por mutación del nucleótido 294T en 294A. Esta secuencia mutada se muestra en SEQ ID NO: 17.
Esta secuencia mutada entonces fue insertada en los sitios de restricción EcoRV y Xmal del cásete pDeSNAP Univ de SEQ ID NO: 34, generando el "cásete pDeSNAP Univ/SBV.N "ADN de SEQ ID NO: 36.
El así llamado cásete de ADN "pDeSNAP Univ/SBV.N" comprende (véase la figura 9 y SEQ ID NO: 36): la secuencia de insecto tipo BiP de SEQ ID NO: 23, - la secuencia tipo SNAP de SEQ ID NO: 31 una primera secuencia de ADN SEQ ID NO: 26 que codifica la secuencia espadadora GGGS (SEQ ID NO: 25), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 29 que codifica un sitio de escisión pro-TEV1 de la secuencia ENLYFQS (SEQ ID NO: 32), - la secuencia de ADN SBV.N SEQ ID NO: 17 (que corresponde con la secuencia SBV.N natural, en donde se ha eliminado el sitio EcoRV interno y dos sitios EcoRV y Xmal se han añadido en las extremidades), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 30 que codifica un sitio de escisión pro-TEV2 de la secuencia ENLYFQG (SEQ ID NO: 33), una secuencia de ADN SEQ ID NO: 28 que codifica una secuencia HisTag.
Nótese que este cásete comprende además un sitio Nhel corriente arriba del ATG, un sitio de Bglll entre la secuencia tipo BiP y la secuencia tipo SNAP, y un sitio Agel y un sitio Hindlll que están situados corriente abajo del codón finalizador.
La secuencia comprendida entre los sitios de restricción Bglll y / ge/ del cásete pDeSNAPUniv/SBV.N (ver la figura 9) se divide por digestión enzimática, entonces se clonó en el plásmido pMT/BiP/V5-A (Invitrogen) para generar el vector pMT/BiP/SNAP-VSB.N Este vector se ha utilizado para generar células secretoras S2 estables de la proteína de fusión SNAP-VSB.N.
La secuencia comprendida entre los sitios de restricción Nhel y Notl del cásete pDeSNAPUniv/SBV.N luego se clona en el plásmido pcDNA3 (Invitrogen) para generar el vector SBV/SNAP-pcDNA3.N. Este vector luego se utiliza para generar células de mamífero estables secretando la proteína de fusión SNAP-VSB.N. 2. Producción de la proteína de fusión SNAP-SBV.N Los plásmidos resultantes pMT/BiP/SNAP-VSB.N que permiten la producción de proteínas SBV.N etiquetadas SNAP como proteínas de fusión secretada, fueron co transfectadas con marcador de selección pCo-Blast en células S2 para generar la línea celular estable S2/SNAP-SBV.N mostrando resistencia a blasticidina.
Esta línea celular se ha depositado en la Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos (CNCM) del Instituto Pasteur, 25, rué du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, bajo el número CNCM-4616.
Líneas de células estables S2 cultivadas en una centrifuga (1000 mi) fueron estimuladas 10 días con metal pesado cadmio (Cd2+).
La acumulación de la proteína secretada SNAP-SBV.N fue observada en los sobrenadantes de las células S2/SNAP-VSB.N después de 10 días de inducción con metal pesado cadmio. 0.01 mi de 4 mi del sobrenadante de células S2/SNAP-SBV.N inducida por 10 días con Cd2+ fueron probadas por el análisis de ¡mmunoblot usando el anticuerpo anti-Histag (dilución 1 :1 ,000) (véase las figuras 10A y 10B).
La proteína quimérica SNAP-VSB.N se comparó con cantidades definidas de la proteína quimérica SNAP-TOS.N (correspondiente a la proteína de fusión que comprende SNAP y la nucleoproteína N del virus de Toscana, que es un flebovirus).
La producción de SNAP-SBV.N purificado de células inducidas S2/SNAP+SBV.N durante 10 días es 18 mg por litro de cultivo celular (figura 10B).
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Claims (36)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1- Un método de ensayo in vitro para detectar al menos dos diferentes anticuerpos objetivo presentes en una muestra biológica de un sujeto, dicho método que comprende los pasos de: (a) poner en contacto una mezcla de por lo menos 2 soportes sólidos con una muestra biológica; en donde por lo menos uno de los soportes sólidos comprende una primera proteína de fusión AGT-antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT, y en donde al menos uno de dichos soportes sólidos comprende una segunda proteína de fusión AGT-antígeno acoplada covalentemente a un sustrato AGT; (b) detectar la presencia o ausencia de unión de anticuerpos al primer AGT-antígeno; y (c) detectar la presencia o ausencia de unión de anticuerpos al segundo AGT-antígeno.
2. - El método de ensayo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende poner en contacto una mezcla de al menos 5 soportes sólidos con una muestra biológica de un sujeto.
3. - El método de ensayo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende poner en contacto una mezcla de al menos 10 soportes sólidos con una muestra biológica de un sujeto.
4. - El método de ensayo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende poner en contacto una mezcla de al menos 15 soportes sólidos con una muestra biológica de un sujeto.
5.- El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque ambas proteínas de fusión AGT-antígeno comprenden el muíante SNAP de SEQ ID NO: 2.
6.- El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque dichos soportes sólidos se pueden identificar específicamente por su ubicación específica, tamaño, diámetro, peso, granulometría, o etiquetado.
7. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caractenzado además porque dichos soportes sólidos se etiquetan con un fluorocromo, un cromóforo, un radioisótopo, y/o una etiqueta de masa.
8. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado además porque dichos soportes sólidos son micropartículas.
9. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado además porque dichos soportes sólidos son magnéticos.
0. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado además porque dichos soportes sólidos son micropartículas etiquetadas internamente con tintas fluorescentes.
11. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado además porque cada uno de los soportes sólidos emite una longitud de onda diferente y distinguible después de la excitación.
12. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende por lo menos 30 aminoácidos consecutivos de la proteína EDIII del virus del dengue 1 de SEQ ID NO: 3, la proteína EDIII del virus del dengue 2 de SEQ ID NO: 4, la proteína EDIII del virus del dengue 3 de SEQ ID NO: 5, la proteína EDIII del virus del dengue 4 de SEQ ID NO: 6, la proteína EDIII el virus del Nilo Occidental de SEQ ID NO: 7, la proteína EDIII del virus de la fiebre amarilla de SEQ ID NO: 8, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de SEQ ID NO: 9, la proteína EDIII del virus Zika de SEQ ID NO: 10, la proteína EDIII del virus Wesselbron de SEQ ID NO: 11 , la proteína EDIII del virus de Roció de SEQ ID NO: 12, la proteína EDIII del virus de la encefalitis de Murray de SEQ ID NO: 13, la proteína EDIII del virus de la encefalitis San Louis de SEQ ID NO: 14, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 codificada por SEQ ID NO: 54, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 2 codificada por SEQ ID NO: 55, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 4 codificada por SEQ ID NO: 56, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 codificada por SEQ ID NO: 57, la proteína EDIII del virus Rabensburg codificada por SEQ ID NO: 58.
13. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende al menos 20 aminoácidos consecutivos de una proteína viral de HIV1 , de HIV2, del virus de hepatitis B, del virus de hepatitis C, del virus de hepatitis E, del virus del Nilo occidental y de HPV de cepas de HPV oncogénico 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
14. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111 , SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121 , SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 , SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO :145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, y SEQ ID NO: 151.
15. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende por lo menos 30 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171 , 173, 175, 177 y 179.
16. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171 , 173, 175, 177 y 179.
17. - El método de ensayo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado además porque dicha muestra biológica es suero o plasma.
18. - Un kit para la detección de por lo menos dos diferentes anticuerpos objetivo presentes en una muestra biológica de un sujeto que comprende: (a) un primer soporte sólido que comprende una primera proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, y (b) un segundo soporte sólido que comprende una segunda proteína de fusión AGT-antígeno covalentemente acoplada a un sustrato AGT, en donde los soportes sólidos se mezclan juntos en al menos un compartimiento único.
19. - El kit de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque comprende al menos 5 soportes sólidos, cada uno acoplado a una proteína de fusión AGT-antígeno diferente covalentemente acoplada a un sustrato AGT.
20. - El kit de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque comprende al menos 10 soportes sólidos, cada uno acoplado a una proteína de fusión AGT-antígeno diferente covalentemente acoplada a un sustrato AGT.
21. - El kit de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque comprende al menos 15 soportes sólidos, cada uno acoplado a una proteína de fusión AGT-antígeno diferente covalentemente acoplada a un sustrato AGT.
22. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21 , caracterizado además porque dichos soportes sólidos son micropartículas.
23. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22, caracterizado además porque dichos soportes sólidos son micropartículas que se mezclan juntas en por lo menos un pozo de una placa microtituladora o al menos un tubo.
24.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 23, caracterizado además porque comprende anticuerpos secundarios etiquetados para detectar al menos dos anticuerpos objetivo que se unen a los soportes sólidos.
25.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 24, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende por lo menos 30 aminoácidos consecutivos de la proteína EDIII del virus del dengue 1 de SEQ ID NO: 3, la proteína EDIII del virus del dengue 2 de SEQ ID NO: 4, la proteína EDIII del virus del dengue 3 de SEQ ID NO: 5, la proteína EDIII del virus del dengue 4 de SEQ ID NO: 6, la proteína EDIII el virus del Nilo Occidental de SEQ ID NO: 7, la proteína EDIII del virus de la fiebre amarilla de SEQ ID NO: 8, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de SEQ ID NO: 9, la proteína EDIII del virus Zika de SEQ ID NO: 10, la proteína EDIII del virus Wesselbron de SEQ ID NO: 11 , la proteína EDIII del virus de Roció de SEQ ID NO: 12, la proteína EDIII del virus de la encefalitis de Murray de SEQ ID NO: 13, la proteína EDIII del virus de la encefalitis San Louis de SEQ ID NO: 14, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 1 codificada por SEQ ID NO: 54, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 2 codificada por SEQ ID NO: 55, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa de genotipo 4 codificada por SEQ ID NO: 56, la proteína EDIII del virus de la encefalitis japonesa del genotipo 5 codificada por SEQ ID NO: 57, la proteína EDIII del virus Rabensburg codificada por SEQ ID NO: 58.
26.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 25, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende al menos 20 aminoácidos consecutivos de una proteína viral de HIV1 , de HIV2, del virus de hepatitis B, del virus de hepatitis C, del virus de hepatitis E, del virus del Nilo occidental y de HPV de cepas de HPV oncogénico 16, 18, 31 , 33, 35, 39, 45, 51 , 52, 56, 58, 59, 66 y 68.
27.- El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de: SEQ ID NO: 21 , SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 51 , SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 66, SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 76, SEQ ID NO: 78, SEQ ID NO: 80, SEQ ID NO: 82, SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 86, SEQ ID NO: 88, SEQ ID NO: 90, SEQ ID NO: 92, SEQ ID NO: 94, SEQ ID NO: 96, SEQ ID NO: 98, SEQ ID NO: 100, SEQ ID NO: 102, SEQ ID NO: 104, SEQ ID NO:109, SEQ ID NO:111, SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO:115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121 , SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 125, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 131 , SEQ ID NO: 133, SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141 , SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO :145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, y SEQ ID NO: 151.
28. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 27, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende por lo menos 30 aminoácidos consecutivos de SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171 , 173, 175, 177 y 179.
29. - El kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 18 a 28, caracterizado además porque dicha primera o segunda proteína de fusión AGT-antígeno comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NOs: 155, 157, 159, 161 , 163, 165, 167, 171, 173, 175, 177 y 179.
30 - El uso de un kit como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 29, para detectar por lo menos dos anticuerpos objetivo en una muestra biológica de un sujeto.
31. - El uso del kit como se define en cualquiera de las reivindicaciones 18 a 30, para diagnosticar por lo menos dos enfermedades en un sujeto, en donde dicha enfermedad objetivo es una infección viral causada por un virus del papiloma o un dengue, fiebre amarilla, Nilo Occidental, encefalitis japonesa, encefalitis por picaduras de garrapatas, Hepatitis C, Chikungunya, Ross River, Mayaro, encefalitis equina occidental, encefalitis equina oriental, encefalitis equina de Venezuela, fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, fiebre del Valle Rift, Schmallenberg, Hepatitis E, Lassa, Ébola, virus Marburg, una infección bacteriana causada por Leptospirosa Interrogans, o una infección causada por Plasmodium falciparum.
32. - Un método in vitro para diagnosticar al menos una enfermedad objetivo en un sujeto, dicha enfermedad objetivo siendo conocida para inducir la síntesis de por lo menos un anticuerpo objetivo en dicho sujeto, que comprende realizar el método de ensayo de cómo se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en donde dicho sujeto es diagnosticado que sufre de dicha al menos una enfermedad objetivo si la cantidad de dicho al menos un anticuerpo objetivo es mayor de un valor de control.
33. - Un método para fabricar un kit, dicho método comprende los pasos de: (a) proporcionar una primera proteína de fusión AGT-antígeno que se reconoce por un primer anticuerpo objetivo, (b) poner en contacto dicha primera proteína de fusión AGT-antígeno con un primer soporte sólido, dicho soporte estando acoplado covalentemente con un sustrato de dicha proteína de fusión AGT-antígeno, (c) obtener un primer soporte sólido covalentemente acoplado con una primera proteína de fusión AGT-antígeno, (d) proveer una segunda proteína de fusión AGT-antígeno que se reconoce por un segundo anticuerpo objetivo pero no por dicho primer anticuerpo objetivo, y (e) poner en contacto dicha segunda proteína de fusión AGT-antígeno con un segundo soporte sólido, dicho soporte siendo covalentemente acoplado con un sustrato de dicha proteína de fusión AGT-antígeno, y (f) obtener un segundo soporte sólido covalentemente acoplado con una segunda proteína de fusión AGT-antígeno, en donde dicho primero y segundo soportes sólidos pueden ser identificados específicamente uno de otro, en donde dichos soportes sólidos se mezclan juntos en por lo menos un compartimiento único.
34. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque comprende adicionalmente los siguientes pasos a) a c) con por lo menos 5 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno para generar al menos 5 soportes sólidos covalentemente acoplados con 5 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno.
35. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque comprende adicionalmente los siguientes pasos a) a c) con por lo menos 10 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno para generar al menos 10 soportes sólidos covalentemente acoplados con 10 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno.
36. - El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque comprende adicionalmente los siguientes pasos a) a c) con por lo menos 15 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno para generar al menos 15 soportes sólidos covalentemente acoplados con 15 diferentes proteínas de fusión AGT-antígeno.
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