ES2447115T3 - Vectores para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas - Google Patents
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Abstract
Uso de: a) un transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situado bajo el control deseñales reguladoras de transcripción y expresión, b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origenretroviral o similar a retroviral, y c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que puedenadoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral,en la preparación de un vector.
Description
Vectores para la preparación de composiciones inmunoterapéuticas
5 La presente solicitud se refiere al uso de vectores retrovirales, y especialmente a vectores lentivirales para la preparación de composiciones que son capaces de inducir o contribuir a que tenga lugar o la mejora de una reacción inmunológica in vitro, y en una realización preferida in vivo, frente a epítopos que son codificados por secuencias de nucleótidos presentes en los vectores.
Los inventores han mostrado que los vectores preparados según la presente invención permiten obtener una respuesta inmune mediada por células, especialmente una reacción de linfocitos T citotóxicos (LTC) frente a epítopos.
La invención se refiere al uso de (a) un transgén que codifica uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o
15 linfoma, situado bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, (b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y (c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral e insertándose en una orientación funcional con respecto a las señales reguladoras de origen retroviral o similar a retroviral mencionadas anteriormente, en la preparación de un vector.
Además han obtenido datos que muestran que esta respuesta inmune mediada por células puede ser una respuesta específica, obtenida frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de nucleótidos contenidos en los vectores.
25 También la solicitud da a conocer medios que podrían utilizarse para el tratamiento o profilaxis de enfermedades infecciosas, especialmente enfermedades asociadas con infección por virus y por ejemplo, con infección por retrovirus.
Los inventores además han obtenido resultados que muestran que la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta LTC asociada con el tratamiento mediante las composiciones de la invención puede ser específica para el antígeno del tumor o del virus o células infectadas por el virus, y también puede limitarse a moléculas específicas del CMH (complejo mayor de histocompatibilidad).
35 Particularmente la solicitud se refiere al uso de los vectores en composiciones inmunógenas, con el fin de obtener una respuesta inmune mediada por células limitada a las moléculas de clase I del complejo CMH y por ejemplo limitada a moléculas HLA-A2 o B7.
En consecuencia, la solicitud describe una composición inmunógena que comprende un vector recombinante que comprende un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y la región de terminación de acción en cis (CTS). Durante la transcripción inversa, las secuencias cPPT y CTS inducen la formación de una estructura de ADN de tres cadenas denominada aquí en el presente documento como ADN tricatenario. El ADN tricatenario estimula la importación nuclear de genomas del ADN del vector, siendo estas regiones de origen lentiviral, comprendiendo dicho vector además una secuencia de nucleótidos definida (transgén o
45 secuencia de interés) y señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen lentiviral,en el que la composición es capaz de inducir o estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) o de CD4 frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.
En una realización preferida, la respuesta inmune mediada por células y especialmente la respuesta de LTC o la respuesta de CD4 frente a uno o varios epítopos es una respuesta de LTC o de CD4 de memoria.
Se enfatiza que la presencia, en el vector, de las regiones cPPT y CTS permiten que de ese modo se forme una estructura de ADN tricatenario influyendo y especialmente mejorando la importación nuclear del genoma del vector en células recombinadas con dicho vector.
55 Esta capacidad de la composición inmunógena para inducir, mejorar o en general para asociarse a los acontecimientos de la respuesta de LTC de memoria, permite proponer el uso de la composición inmunógena en los protocolos de terapia antitumoral o terapia antivírica o antipatógena, incluyendo si la respuesta inmune tiene que inducirse en un largo periodo de tiempo o ser al menos inducible cuando se busca una respuesta en un periodo de tiempo que puede ser inducción a largo plazo de la respuesta, tras la administración de la composición inmunógena. En otras palabras, puede usarse la composición inmunógena para la preparación de composición terapéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales o participando en la aparición de una respuesta inmune mediada por células, especialmente una respuesta de LTC o una respuesta de memoria.
65 Se enfatiza que la composición inmunógena, como consecuencia de la presencia de la estructura tricatenaria en la secuencia del vector, que resulta de la presencia de las regiones CTS y cPPT en el vector y en las partículas del
La presenta solicitud describe también el uso de una secuencia nucleotídica que comprende las secuencias CTS y 5 cPPT de origen lentiviral o sintético para aumentar la entrada de las secuencias de nucleótidos o de péptidos en el núcleo de las células diana o células receptoras.
Como ejemplo, se entiende que dicha secuencia de triple cadena comprende secuencias ajenas o secuencias propias con respecto a las células receptoras.
Por tanto, la solicitud describe una composición que podría utilizarse en protocolos terapéuticos que presentan analogías con los protocolos de vacunación, para el tratamiento de tumores y especialmente como tratamiento antineoplásico y anti enfermedades infecciosas.
15 Es interesante observar que de acuerdo con la presente invención este transgén o secuencia de interés puede ser una secuencia que codifique uno o varios epítopos de una o varias células tumorales de carcinomas, leucemia o linfoma, por ejemplo epítopos que se han identificado en antígenos diana potenciales para la inducción de una respuesta inmune mediada por células contra carcinomas, leucemia o linfoma.
Varios epítopos que forman un múltiple epítopo, pueden codificarse por el transgén de la invención. En una realización particular, pueden derivar de antígenos diana identificados en estos tumores, y pueden seleccionarse de tal modo que cuando su secuencia codificante se combine para formar el transgén, se obtenga una respuesta inmune mediada por células contro todos los epítopos o contra la mayoría de ellos. Puede ensayarse la respuesta inmune mediada por células in vitro o en una realización preferida in vivo. Los protocolos que permiten llevar a cabo
25 tales ensayos se describen en los ejemplos.
Se han identificado antígenos diana en varios tipos de tumores. Dentro de la presente invención, el o los epítopos son de carcinomas, incluyendo carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón, cáncer de mama, leucemia y linfoma.
Se añade también que los vectores preparados según la invención que se utilizan en las composiciones inmunógenas pueden expresar epítopos o pueden estar presentes en proteínas (incluyendo glucoproteínas u otros compuestos derivados de proteínas) identificadas como antígenos diana en las células tumorales anteriormente mencionadas.
35 Además, se observa que epítopos, polipéptidos o proteínas utilizadas para proporcionar epítopos, pueden modificarse, por ejemplo mediante mutación, deleción o inserción y por ejemplo pueden modificarse para mejorar su estabilidad.
La solicitud desvela también una composición inmunógena que comprende partículas retrovirales recombinantes que comprenden:
1) una secuencia de nucleótidos recombinante que contiene una secuencia de nucleótidos definida (transgén), situada bajo el control de las señales reguladoras de la transcripción y expresión, señales reguladoras de la
45 retrotranscripción , expresión y encapsidación y, 2) un polinucleótido que engloba la región de iniciación central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen lentiviral e insertándose en una localización y orientación funcionales con señales reguladoras de retrotranscripción de origen retroviral o similar a retroviral o señales reguladoras de transposones,
en la que la composición inmunógena es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presente en el vector.
El fragmento de ADN que engloba las secuencias activas-en cis CTS y cPPT es capaz de adoptar una estructura de 55 ADN de tres cadenas, el
ADN tricatenario
, tras la transcripción inversa y de estimular la entrada nuclear del ADN del vector.
Según una realización particular, la composición inmunógena que es capaz de inducir o de estimular una respuesta de LTC (linfocitos T citotóxicos) frente a uno o varios epítopos codificados por la secuencia de transgén presentes en el vector, comprenden partículas de vector retroviral recombinante que comprenden:
a. un polipéptido gag que corresponde a nucleoproteínas de un lentivirus o a polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos GAG),
b. un polipéptido pol constituido por las proteínas RT, PRO, IN de un lentivirus o un polipéptido derivado 65 funcional (polipéptido POL),
- c.
- un polipéptido de envoltura o polipéptidos derivados funcionales (polipéptidos ENV)
- d.
- una secuencia de nucleótidos recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos definida (transgén
o secuencia de interés), que codifica para uno o varios epítopos, situada bajo el control de señales reguladoras de transcripción y expresión, una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral y un polinucleótido que contiene una región de iniciación
5 central de acción en cis (cPPT) y una región de terminación de acción en cis (CTS), siendo estas regiones de origen lentiviral e insertándose en una orientación funcional con las señales reguladoras mencionadas anteriormente de origen retroviral o similar a retroviral.
Las partículas de vector retroviral recombinantes que están presentes en la composición inmunógena que responden a una u otra de las definiciones anteriores son capaces en una realización preferida de inducir, mejorar o estar asociadas a la aparición de una respuesta inmune mediada por células de memoria y especialmente una respuesta de LTC de memoria.
Según lo anterior, pueden prepararse las definiciones descritas de la composición inmunógena que contiene los 15 vectores o las partículas de vector según varias realizaciones posibles.
En una realización preferida, se prepara la composición inmunógena de manera que las secuencias de origen retroviral se derivan de un genoma de lentivirus.
Según otra realización, estas secuencias son de origen similar a retroviral y se derivan de retrotransposón.
En otra realización, o además de las características anteriormente definidas, el transgén o secuencia de interés que se contiene en el vector recombinante se contiene en un casete de expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.
25 Alternativamente, las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación del vector son de origen lentiviral y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT es de origen lentiviral.
Según otra realización, las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT en el vector, se derivan de un retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.
Pueden utilizarse otros virus y especialmente lentivirus para diseñar las señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación, y también para derivar el polinucleótido que comprende las regiones CTS y cPPT.
35 Especialmente, por tanto pueden utilizarse los lentivirus CAEV, EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.
Para la obtención de las partículas retrovirales recombinantes de la composición inmunógena, las secuencias que codifican para los polipéptidos o proteínas necesarias para la transcomplementación de los vectores son por ejemplo proteínas GAG, POL, y ENV derivadas de lentivirus, y especialmente de VIH, que incluye retrovirus VIH-1 y VIH-2.
Alternativamente, pueden derivarse las secuencias GAG y POL de un virus diferente que el de la secuencia ENV. Por ejemplo, pueden derivarse las secuencias GAG y POL del retrovirus VIH y la secuencia ENV puede derivarse de otro virus o retrovirus, y pueden ser secuencias ENV o bien anfotrópicas o bien ecotrópicas.
45 En otra realización, la secuencia ENV se deriva del virus de la estomatitis vesicular (VEV).
La solicitud se refiere también a constructos de vector que se han depositado con la CNCM (Collection Nationale de Culture de Microorganismes en el Instituto Pasteur en París, Francia) el 11 de octubre de 1999.
Un primer vector es pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP, depositado bajo el número I-2326 el 11 de octubre de 1999 y un segundo vector se designa pTRIP-ILKE-IRES-GFP, y se ha depositado bajo el número I-2327 el 11 de octubre de 1999.
Un tercer vector, pTRIP.DES-IRES-GFP se ha depositado con la CNCM bajo el número I-2331 el 11 de octubre de 55 1999.
Las secuencias que codifican para los antígenos que están presentes en los constructos anteriores pueden sustituirse por cualquier otro antígeno o epítopo de interés, incluyendo el gen DES completo citado anteriormente de
M. tuberculosis.
Según otro aspecto, los vectores, partículas de vector y composiciones inmunógenas que comprenden los mismos, se diseñan de tal manera que las regiones CTS y cPPT se localizan centralmente dentro de la secuencia del vector.
Por «localizada centralmente», se quiere decir que las regiones CTS y cPPT están el centro de la secuencia del
65 vector, o aproximadamente en el centro de esta secuencia. Especialmente, las regiones CTS y cPPT pueden estar en el tercio central del ADN del vector lineal retrotranscrito.
5 Alternativamente, según una variante del vector, puede insertarse la unidad de transcripción del vector, que incluye el transgén dentro de la región U3 de la región LTR. En consecuencia, tras la retrotranscripción, se duplica el transgén y por tanto aparece a cada lado de la secuencia tricatenaria, permitiendo por tanto que la secuencia tricatenaria se localice en la posición central en el vector, cualquiera que sea el tamaño del transgén.
10 La solicitud también describe células que se han puesto en contacto con la composición inmunógena descrita en el presente documento y especialmente se refiere a células recombinantes transducidas por el vector o partículas de vector de la composición inmunógena.
Estas células son, ventajosamente, células presentadoras de antígeno. A modo de ejemplo, pueden seleccionarse
15 estas células de entre células de pulmón, células de cerebro, células epiteliales, astrocitos, microglía, oligodendrocitos, neuronas, células musculares, hepáticas, dendríticas, neuronales, cepas celulares de la médula ósea, macrófagos, fibroblastos, células hematopoyéticas.
Los tumores que pueden tratarse con las composiciones descritas en el presente documento son, por ejemplo, 20 carcinomas, incluyendo (de pulmón, de vejiga, renal, de colon) y linfoproliferación.
Los tumores que pueden tratarse son también los tumores desvelados en el párrafo anterior que expresan antígenos específicos de tumor incluyendo proteína propia mutada y/o proteína propia sobreexpresada.
25 Son de interés cualquier vía de administración posible aceptable de la composición inmunógena desvelada en la solicitud incluyendo protocolos de administración que comprenden etapas ex vivo, por ejemplo transducción de células diana ex vivo seguida de administración de las células tratadas al paciente que va a tratarse.
Alternativamente, la composición inmunógena puede administrarse directamente al paciente a través de vías
30 usuales de administración, incluyendo las vías de administración sistémica (IV), local, cutánea, intradérmica, por ejemplo intratumoral.
En una realización particular, la composición inmunógena puede administrarse directamente al paciente, de manera que inducirá, mejorará o participará in vivo en la aparición de una respuesta inmune mediada por células,
35 especialmente una respuesta inmune mediada por LTC.
En otra realización, se utilizan las composiciones inmunógenas de modo que pueden permitir la aparición de una respuesta mediada por células de memoria a largo plazo.
40 Se enfatiza que la composición inmunógena tiene un particular interés debido a la propiedad de las secuencias CTS y cPPT que están presentes en el vector y partículas de vector, para inducir o para estimular la importación nuclear del genoma del vector en las células diana.
Una ventaja particular de las composiciones inmunógenas es que pueden utilizarse para provocar o estimular una
45 respuesta inmune mediada por células frente a epítopos múltiples codificados por la secuencia de nucleótidos de interés o transgén presente en el vector o partículas de vector, y también pueden utilizarse para provocar o estimular una respuesta inmune mediada por células frente al producto de una secuencia completa de un gen, por ejemplo un gen de un agente patógeno o fragmentos de dicho gen capaz de codificar para al menos de 8 a 15 aminoácidos preferiblemente de 9 a 12 aminoácidos. La solicitud describe también una secuencia de nucleótidos que comprende
50 una secuencia de nucleótidos que codifica para una repetición múltiple (al menos 2 secuencias idénticas) de dicha secuencia de aminoácidos que induce una respuesta celular y/o una secuencia de aminoácidos que contiene al menos 2 secuencias diferentes que correspondena2epítoposdeantígenos tumoralescomose hadefinido anteriormente.
Figura 1: vector recombinante positivo de ADN tricatenario derivado de VIH-1 que codifica para múltiples epítopos de melanoma.
60 Figura 2: respuestas de LTC de ratones HHD tras la inmunización con el vector TRIP-mel-IRES-GFP.
Figura 3: expresión de GFP en células humanas 5 días después de su transducción por los vectores derivados de VIH-1 negativo o positivo de ADN tricatenario central.
65 Figura 4: respuestas de LTC in vitro utilizando células dendríticas humanas.
Figura 5: mapa de restricción del vector pHR.MEL-IRES-GFP Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC específicos de melanoma 5 Construcción de HR.MEL-IRES-GFP Para construir el plásmido HL.MEL-IRES-GFP, el fragmento NdeI/XhoI del TRIP.MEL-IRES-GFP depositado en la
CNCM con el número I-2185 el 20 de abril de 1999 que contiene parte del promotor de CMV, los múltiples epítopos
MEL y el IRES-GFP en lugar del fragmento NdeI/XhoI de HR GFP que contiene parte del promotor CMV y el GFP.
Figura 6: mapa de restricción del vector pTRIP.ILKE-IRES-GFP
Secuencias de uno o múltiples epítopos de LTC específicos de VIH, cuyo epítopo I9V.(ILKE); (RT 476-484)
15 Construcción de TRIP.ILKE-IRES-GFP (depositado en la CNCM, París, Francia el 11 de octubre de 1999 con el
número I-2327).
Se construyó TRIP.ILKE-IRES-GFP mediante inserción del producto de PCR de ILKE en TRIP
EIRES-GFP, entre
el promotor de CMV y el IRES. Se amplificó mediante PCR la región que rodeaba al epítopo LTC que empezaba por
ILKE en la matriz pLAI con los cebadores:
Se insertó una secuencia de Kozak dentro del cebador en el sentido de 5´ y se insertó un codón de parada dentro
25 del cebador en el sentido de 3´. Tras la digestión con BglII/Eco RI se insertó el producto de PCR dentro de TRIP
E IRES-GFP dentro de los sitios BamHI/EcoRI. El vector expresa un mensajero bi-cistrónico que codifica para GFP y una región del gen de RT (transcriptasa inversa) de VIH, que corresponde a un grupo de epítopos, que comprenden especialmente el epítopo I9V (RT 476-484) restringido a HLA.A2.1 (Walker B.D., 1989 PNAS 86 pág. 9514-9518).
Figura 7: mapa de restricción del vector pTRIP.TEL/AML-IRES-GFP.
Secuencia de TEL/AML de translocación
Se construyó TRIP.TEL/AML-IRES-GFP mediante inserción del producto de PCR de TEL/AML dentro de TRIP
E
35 IRES-GFP, entre el promotor de CMV y el IRES. Se amplificó mediante PCR la región que rodeaba la translocación entre TEL y AML con los cebadores:
Se insertó una secuencia Kozak dentro del cebador en el sentido de 5´ y se insertó un codón de parada en el cebador en el sentido de 3´.
Tras la digestión con Bgl II/EcoRI se insertó el producto de PCR dentro de TRIP
E IRES-GFP dentro de los sitios de BamHI/EcoRI.
45 Figura 8: capacidad de transducción del vector positivo de ADN tricatenario derivado de VIH que codifica para el péptido de epítopo I9V (derivado de pol VIH-1) y GFP de células dendríticas murinas que se produjeron utilizando células de médula ósea de ratones transgénicos HHD. Se transdujeron aproximadamente el 80% de las células dendríticas murinas mediante el vector recombinante positivo tricatenario derivado de VIH tal como se documenta en los análisis FACS de expresión de GFP intracelular.
Figura 9: evaluación de las respuestas de LTC en ratones HHD después de la inmunización con el vector TRIP-desIRES-GFP que codifica para el gen DES de Mycobacterium tuberculosis.
55 Figura 10: mapa de restricción de pTRIP.DES-IRES-GFP depositado en la CNCM el 11 de octubre de 1999.
Los vectores lentivirales tienen la capacidad de transducir células, incluyendo células que no se dividen, y se proponen de manera creciente para la terapia génica. Recientemente, se mostró que los lentivirus que contienen la secuencia de acción en cis del tracto de polipurina (ADN tricatenario central) muestran una transducción más eficaz
de células murinas y humanas que aquellos con el ADN tricatenario central eliminado (CharneauP.etal, J. Mol. Biol. 1994, 241, 651-662). Se han probado ahora los vectores lentivirales que contienen o no ADN tricatenario central y que codifican para los mismos múltiples epítopos de LTC de melanoma restringido por HLA-A2.1 para determinar sus capacidades para inducir respuestas de LTC. La administración directa in vivo del vector lentiviral 5 que contiene ADN central indujo respuestas de LTC fuertes frente a todos los péptidos epítopos codificados por las secuencias de múltiples epítopos en ratones HHD de
HLA-A2.1 pura
. Se mostró una clara ventaja para el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario. Además, se mostró que el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario transduce las células dendríticas humanas de manera hasta 7 veces más eficaz que el vector que no contiene el ADN tricatenario. Estas células dendríticas transducidas ex vivo provocaron respuestas de LTC primarias
10 específicas eficaces frente a la mayoría de los péptidos epítopos de melanoma. Ya que ha sido resuelto en mayor parte el asunto de la seguridad del vector lentiviral modificado, se propone el uso de ese vector no solo para terapia génica humana in vivo, sino también para inmunoterapia de pacientes con cáncer.
15 La subclase lentiviridae de retrovirus puede infectar a la mayoría de los tipos de células incluyendo las células que no se dividen. Esta propiedad hace a los lentivirus atractivos para la terapia génica. Ya se han construido varios vectores lentivirales recombinantes de replicación defectuosa por diferentes grupos (Naldini PNAS 93, 11382-8, Science, 1996). Estos vectores lentivirales destoxificados y creados de nuevo por ingeniería se proponen como los
20 vectores de terapia génica más eficaces y seguros (Zufferey R, y Kim V.N. J Virol, 72, 9873-80, 1998). Se desarrolló un vector basado en VIH lentiviral humano, pseudotipado con glucoproteína G de virus de estomatitis vesicular (VSVG) (Bums J.C., 1993 PNAS 90, 8033-7). Este vector se suprimió para la mayoría de las proteínas virales no esenciales pero contiene una secuencia de acción en cis del tracto de polipurina (cPPT, ADN tricatenario central). El ADN tricatenario central aumenta de manera considerable la importación nuclear de moléculas de ADN de VIH
25 retrotranscritas. Además, se observó que el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central presenta una transducción más eficaz de células murinas y humanas in vitro que el vector que no contiene el ADN tricatenario.
La solicitud WO98/39463 describe vectores con proteínas no esenciales eliminadas, en el estudio de la transducción celular, y demuestra que la eliminación de la mayoría de las proteínas no esenciales no alteró la transducción ni la
30 importación nuclear del genoma viral y su integración. Menciona que algunos otros factores deben mediar la transferencia del complejo de preintegración en el núcleo, y que esta función parece retenerse en los genes gag, pol, tat o rev. No se indicó ni la naturaleza del factor, ni su ubicación.
El ratón transgénico HHD de
HLA-A2.1 pura
(Pascolo et al., J. Exp. Med., 1997, 185: 2043-2051) permite una
35 evaluación controlada de manera experimental del potencial inmunógeno de péptidos epítopos y de varias estrategias de inmunización. Utilizando estos ratones HHD, se ha informado de la capacidad de múltiples epítopos de melanoma codificados por diferentes vectores recombinantes para inducir repuestas de LTC simultáneas en un único animal. Se ha estudiado en primer lugar la capacidad de los vectores lentivirales que contienen o no ADN tricatenario central y que codifican para los mismos múltiples epítopos de melanoma para la inducción de LTC in vivo
40 en ratones transgénicos HHD. Además, también se investigó si las células dendríticas humanas (DCh) transducidas mediante los mismos vectores lentivirales recombinantes inducen repuestas de LTC primarias frente al motivo de múltiples epítopos de melanoma ex vivo. Los presentes resultados demuestran que el ADN tricatenario aumenta de manera significativa la capacidad del vector lentiviral para inducir respuestas de LTC específicas in vivo mediante la administración directa de los vectores recombinantes o ex vivo utilizando las células dendríticas transducidas.
Datos comparativos
50 Tras establecer que la inyección de ADN recombinante que codifica para un motivo de múltiples epítopos derivado de melanoma puede provocar respuestas de LTC simultáneas frente a varios epítopos de melanoma en ratones HHD, se probó la capacidad inmunógena de un vector lentiviral que codifica para el mismo motivo de múltiples epítopos de melanoma (fig. 1 y tabla 1). Se administró un vector TRIP-mel-IRES-GFP (CNCM I-2185 depositado el 20 de abril de 1999) a 1,25
g/p24 por ratón por vía intravenosa, intraperitoneal o subcutánea. Se usaron al menos 55 3 ratones por grupo.
Se indujeron simultáneamente respuestas de LTC específicas múltiples frente a la mayoría de los diez epítopos de melanoma. Se observaron respuestas de LTC similares independientemente de la vía de administración frente a ambos péptidos cargados (tabla 2) y células HeLa transfectadas de HHD, transducidas de TRIP-mel-IRES-GFP 60 (valores no mostrados). Sin embargo, la inyección intraperitoneal indujo respuestas de LTC levemente mejores. Se provocaron respuestas fuertes frente a péptidos epítopos NA17-A.nt38 y gp100.154. También se observaron repuestas significativas frente a gp100.457, MART.1.27, Mage-3, y Tirosinasa.368-D. Las respuestas de LTC fueron débiles frente a gp100.209, gp100.280, MART-1.32, y Tirosinasa.1. Los epítopos que provocan respuestas de LTC débiles seguidas de inmunización del vector TRIP-mel-IRES-GFP caen todos en los grupos de no inductores de LTC
65 cuando se administran utilizando otros vectores no lentivirales.
Se determinó la dosis mínima de vector lentiviral que provoca una respuesta de LTC significante en ratones HHD utilizando inyecciones intraperitoneales del vector TRIP-mel-IRES-GFP en seis dosis diferentes utilizando 4 ratones
5 por dosis. Se llevaron a cabo dos experimentos en los cuales se mezclaron células efectoras de dos ratones para tener razones similares E/T justo antes del ensayo de 51Cr. Se probaron en la mayoría de los experimentos respuestas de LTC frente a todos los péptidos epítopos de melanoma. Debido a que los resultados fueron altamente similares y muy homogéneos, se tuvieron en cuenta solamente las respuestas de LTC frente al péptido epítopo NA17/A para comparar la relación
dosis-efecto
por elbiendelaclaridad y simplicidad.Seobtuvieronlas mejores respuestas de LTC utilizando dosis de entre 500 ng y 2500 ng/p24 por ratón (tabla 2). Aunque se obtuvieron repuestas de LTC detectables frente a algunos de los epítopos de melanoma, altas dosis de lentiviral no indujeron mejores respuestas de LTC que las dosis bajas. Incluso aunque se pusieron en evidencia algunas respuestas de LTC específicas frente a algunos péptidos epítopos de melanoma, dosisinferioresa500ng/p24por ratónnofueron suficientes para inducir respuestas de LTC eficaces. Debe observarse que en dosis de 1250 ng/p24 por ratón algún
15 ratón generó respuestas de LTC frente a diez de los diez epítopos incluidos en el motivo de múltiples epítopos (fig. 3).
Se inyectaron a ocho ratones con el vector TRIP-mel-IRES-GFP. Se sacrificaron los ratones o bien 12 días o bien 5 meses después de la inmunización. Tras 5 días después de la estimulación in vitro con los péptidos epítopos de melanoma y dos días adicionales con TCGF al 10%, se mezclaron las células efectoras de los cuatro ratones y se probaron frente a células RMAS transfectadas de HHD cargadas con péptidos. Se evidenciaron las respuestas de LTC específicas para todos los péptidos epítopos de melanoma menos para gp100.209 y Mart1.32 en ratones
25 inmunizados 12 días antes. Cinco meses después de la inyección del TRIP-mel-IRES-GFP, todavía indujeron respuestas de LTC fuertes todos los epítopos inductores de LTC primarios (fig. 2). Fue sorprendentemente comparable el nivel de las respuestas de LTC 12 días o 5 meses después de la inmunización de los ratones. Esto sugiere que las células transducidas in vivo mediante el vector lentiviral no se destruyen por el sistema inmunitario y continúan produciendo los múltiples epítopos de melanoma codificantes.
Se inmunizaron individualmente ratones HHD con los vectores TRIP-mel-IRES-GFP y HR-mel-IRES-GFP al mismo tiempo administrados por vía intraperitoneal en dosis de 800 ng, 200 ng, 50 ng, 12 ng, y 3 ng/p24 por ratón. Se
35 probaron al menos cuatro ratones para cada dosis en dos experimentos separados. Tras la estimulación in vitro mediante péptidos sintéticos, se probó la capacidad citolítica de células de bazo utilizando células diana RMAS-HHD impulsadas por péptido. Debido a que los resultados fueron altamente homogéneos, se probaron solamente las respuestas de LTC frente a péptido epítopo NA17/A, Mart-1.27, gp100.154, y Tirosinasa.368-D por el bien de la claridad y simplicidad.
Se ilustran los resultados en la tabla 3. En general, los ratones inmunizados con el vector TRIP-LV en dosis de 800 ng, 200 ng, y 50 ng/p24 por ratón, provocaron repuestas de LTC mejores que los ratones inmunizados con el vector HR-LV. Independientemente de los vectores utilizados no hubo respuesta de LTC detectable en dosis inferiores a 12 ng/p24 por ratón (valores no mostrados). Esto confirma la capacidad de transducción mejorada de los vectores
45 lentivirales que contienen el complejo de ADN central en comparación con aquellos que carecen de este complejo.
Se observó inicialmente que las células tumorales tales como células MT4 y HeLa pueden transducirse de manera hasta 30 veces más eficaz mediante el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central que mediante el vector que carece de ADN tricatenario central. Se probó entonces la capacidad de transducción de estos dos vectores lentivirales en diferentes concentraciones en DC de donantes sanos o de ratones HHD. Se midieron el porcentaje de DC que expresa GFP y su intensidad de fluorescencia media mediante FACS y se consideraron como el nivel de transducción de DC mediante los dos vectores lentivirales.
55 El vector TRIP-GFP transdujo las células de manera más eficaz que el vector HR-GFP en todas las concentraciones de vector. La expresión de GFP de DC murina y humana transducida mediante el vector TRIP-GFP fue respectivamente hasta 3 y 7 veces más alta que la expresión de aquellas transducidas mediante el vector HR-GFP (fig. 3).
Se estimularon in vitro células mononucleares (MNC) obtenidas de donantes de HLA-A2.1 sanos una vez a la
65 semana utilizando las DC del mismo donante transducidas mediante TRIP mel-IRES-GFP.Seanalizó lapresencia de la expresión de GFP en las células dendríticas mediante FACS para verificar la transducción eficaz. Después de
Las DCh transducidas con el vector TRIP-mel-IRES-GFP indujeron respuestas de LTC significantes frente a todos 5 los péptidos epítopos de melanoma menos Mart1.31, mientras que las DCh no transducidas indujeron sólo respuestas de fondo habituales (fig. 4).
Recientes informes muestran que los vectores derivados de lentivirus defectuosos de replicación pueden transducir una variedad de células que no se dividen (Naldini, 1996, Kafri, 1997). Los lentivirus pueden entrar a través de la membrana celular intacta de células que no se dividen (Case, 1999). Se ha evidenciado ahora que este procedimiento se organiza de manera larga mediante una secuencia de acción en cis del tracto de polipurina, denominada el ADN tricatenario central. La introducción de esta secuencia dentro de los vectores derivados de
15 lentiviral permitió una transducción estable ex vivo e in vivo de hasta 30 veces más alta de varios tipos de células que incluyen neuronas, hepatocitos, y células progenitoras/madre hematopoyéticas.
Recientemente, se ha logrado un progreso para tratar el asunto de la seguridad de vectores derivados de lentivirus y su uso en terapia génica (Narry Kim V et al 1988, Zufferey, 1999). Sin embargo, no se han estudiado nunca los vectores lentivirales para aplicaciones inmunoterapéuticas para las que se utilizaron con éxito el vector retroviral murino clásico y vectores no retrovirales (Condon, 1996, Song 1997, Specht, 1997). Para desarrollar una estrategia de vacunación potente, se ha probado la capacidad inmunógena de un vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central y que codifica para múltiples epítopos de melanoma. Se estudió primero la inyección directa de este vector para someter a ensayo si puede provocar respuestas de LTC específicas in vivo frente a los epítopos de
25 melanoma. Se compararon previamente varias estrategias de inmunización en ratones HHD transgénicos de HLAA2.1
pura
. Utilizando ADN de pCMV-B10 (HBs) recombinante o vacunas recombinantes que codifican para los mismos múltiples epítopos de melanoma, fue posible inducir de manera simultánea, en un solo ratón, respuestas de LTC frente a cuatro de seis péptidos diferentes incluidos en el polipéptido de melanoma. Se obtuvieron mejores resultados de manera significante para el vector TRIP mel IRES-GFP que codifica para los mismos múltiples epítopos de melanoma que para otros vectores que codifican para el mismo motivo de múltiples epítopos en cuanto alalisis específica pero además en cuanto al número de péptidos que provocan repuestas de LTC. De manera particular, la inyección por vía subcutánea e intraperitoneal del vector indujeron en algunos ratones respuestas de LTC frente a todos los epítopos codificados por el vector TRIP mel IRES-GFP.
35 Varios grupos informaron que pueden utilizarse las células dendríticas que son transducidas o cargadas con péptido como un enfoque de inmunización potente frente a una variedad de células cancerígenas (Mayordomo, JI, 1995, Song W, 1997, Specht, JM, 1997). Para el fin de esta invención, se ha estudiado por tanto si las células dendríticas humanas o murinas pueden transducirse de manera eficaz e inducir respuestas de LTC primarias in vitro.Los presentes resultados demuestran de manera clara que estas células pueden transducirse fácilmente. Además, estas células transducidas presentaron todos los epítopos codificados por el vector lentiviral recombinante. De manera interesante, probablemente las células dendríticas humanas fueron transducidas de la manera más fácil. La transducción in vitro de las células evita a los vectores lentivirales integrar su genoma dentro de una variedad de células huésped de manera peligrosa. Por esta razón, las células transducidas in vitro debe constituir un método de administración seguro y apropiado para una primera aplicación clínica.
45 Warner et al fueron los primeros que mostraron la capacidad del vector retroviral para inducir respuestas de LTC eficaces en varios modelos de animales, pero además en pacientes con VIH utilizando fibroblastos transducidos de vector retoviral murino que expresan proteínas VIH-1 (revisado por Warner 1998). Se detectaron ADN provirales en células dendríticas que presentan antígenos de manera eficaz, inyectado directamente en el ratón (Song, 1997). Sin embargo, en contraste con los vectores lentivirales, los vectores retrovirales murinos no pueden transducir células que no se dividen tales como DC y la expresión in vivo del gen codificante se somete a menudo a un
apagado (
shut off
). Consecuentemente, estos vectores retrovirales no son los mejores candidatos para la inmunoterapia humana (Kafri).
55 Los resultados demuestran de manera clara que los vectores derivados de lentiviral que contienen el ADN tricatenario central inducen respuestas de LTC más fuertes in vivo en ratones HHD que aquellos que no contienen el ADN tricatenario central. Además, el vector lentiviral que contiene el ADN tricatenario central puede transducir fácilmente DCh in vitro lo que puede utilizarse posteriormente para inmunoterapia clínica.
Materiales y Métodos
Plásmidos de vector: pTRIP-EGFP derivado de HR CMVLacZ (Naldini et al, PNAS 93,11382-8, 1996). El gen
65 indicador de LacZ se sustituyó por el gen EGFP (Clontech).Seinsertó el genEGFPenTRIP-EGFP,enelsitio ClaI de un fragmento central de VIH-1LAI que comprende las secuencias cPPT y CTS.
5 Se construyó el vector HR GFP volviendo a clonar este fragmento de PCR en los sitios BamHI y Xhol de pHR CMVLacZ, sustituyendo LacZ ORF por EGFP.
Se amplificó un fragmento de 178 pb de pLAl3 (4793 a 4971), que engloba cPPT y CTS, mediante PCR. Se 10 añadieron los sitios de restricción de NarI en el sentido de 5 de los cebadores con el propósito de insertar este fragmento dentro del sitio ClaI único de HR GFP:
15 La inserción de esta secuencia tricatenaria en la orientación correcta dio una elevación del vector del plásmido TRIP GFP, y TRIPinv GFP en la orientación inversa. Alternativamente, se amplificó el mismo fragmento tricatenario de los plásmidos pcPPT-AG, pcPPT-D, pcPPT-225 y pCTS para generar vectores que incluyen las mismas mutaciones en el cPPT o en el CTS tal como los virus correspondientes.
20 En primer lugar, se rellenó el sitio EcoRI presente en el vector TRIP GFP o TRIP-EGFP (depositado en la CNCM bajo el nº I-2005 el 15 de abril de 1998), creando el vector TRIP GFP
E. Entonces se clonó en el sentido de 5´ del EGFP un fragmentodeBamHI/XhoIde1,2 Kb quecontieneel sitio de entrada del ribosoma interno (IRES) de un picornavirus en lugar del BamHI/XhoI EGFP de 0,7 Kb en un vector TRIP GFP
E, creando el vector TRIP
EIRES GFP. Los sitios presentes entre el promotor CMV y la secuencia de IRES GFP son BamHI-BstXI-SnaBI y EcoRI. Se
25 generó un fragmento de melanoma (mel) de múltiple epítopo LTC mediante PCR en el pBS mel poly, insertando una secuencia consenso de kozac dentro de los cebadores 5BglMlu Mel:
30 Se digirió el fragmento de PCR de mel mediante BgIII/EcoRI y se insertó en los sitios BamHI/EcoRI de TRIP
E IRES GFP, creando el TRIP
E mel IRES GFP también llamado TRIP mel IRES GFP.
Se creó el HR mel IRES GFP intercambiando el fragmento de NdeI/XhoI que contiene los múltiples epítopos de melanoma y el IRES GFP de TRIP mel IRES GFP con el de HR GFP. Se sitúa el sitio NdeI en el extremo del 35 promotor CMV.
Se produjeron los vectores lentivirales tal como se describió anteriormente (Naldini I.M. PNAS 1996 y science 1996)
40 mediante una transfección transitoria de células 293T con plásmido ramificado utilizando la técnica de calcio-fosfato. Brevemente, se transfectaron las células 293T con 20 µg del plásmido de envuelta de VEV (pMDG) y 40 µg de varios acondicionamientos (8.2 ó 8.91) y plásmidos de vector lentiviral. Se recogieron medios condicionados 60 h y 84 h después de la transfección. Entonces se concentró el virus y se trataron los dNTPs tal como se describió anteriormente (Naldini science 1996). Se determinaron las titulaciones virales en células HeLa P4.2 y células MT4
45 mediante dilución seriada y por ensayo ELISA p24 (Naldini Science 1996).
Se llevóacabouna titulación de ciclodevirus portriplicadomedianteinfección de célulasP4situadas enplacasde 96 pocillos, con cantidades equivalentes de partícula (1 ng de antígeno viral p24 por pocillo), en presencia de 20 µM de DEAE-dextrano. Se añadió el inhibidor de proteasa Saquinavir (Roche) a 1 µM en todo el experimento, para
50 restringir el análisis a un único ciclo de infección. Se inhibió la mitosis celular mediante el tratamiento con aphidicolin (8 µM), el día anterior a la infección. Se midió la actividad
-galactosidasa 48 h después de la infección utilizando un ensayo de gen indicador de
-Gal quimioluminiscente (Boehringer).
Se infectaron las células HeLa por triplicado con la cantidad equivalente de partículas de vector (5 ng de p24 por 55 pocillo). A las 48 horas después de la transducción, se sustituyó el medio por 200 µl de TNB (Tris 50 mM pH 7.5, NaCl 150 mM) y se cuantificó la fluorescencia de las células vivas utilizando un fluorímetro de microplaca (Victor2,
Ratones. Se han descrito anteriormente los ratones HHD (Pascolo, 1997). Estos expresan una molécula de clase I de histocompatibilidad de cadena sencilla transgénica en la que el C terminal de la b2m humana se une
5 covalentemente mediante un brazo peptídico (GGGGS) x 3 al N terminal de una cadena pesada quimérica (HLAA2.1 a1-a2, H-2Db a3-transmembrana, y dominios intracitoplásmicos). Se han interrumpido adicionalmente el H-2Db y los genes b2m de ratón de estos ratones mediante recombinación homóloga dando como resultado una ausencia completa de expresión en superficie de células detectable serológicamente de moléculas de clase I de histocompatibilidad de ratón.
Se obtuvieron células dendríticas humanas a partir de productos de citaféresis de donantes sanos de haplotipo de HLA-A2.1 (IDM, París, Francia). El análisis FACS de estas DC utilizando mAbs frente a CD3, CD14, CD80, CD83, 15 HLA-ABC, y HLA-DR mostró el fenotipo de DC inmaduro. Se transdujeron las DCh en 1 ml de medio de cultivo AMV5 con los vectores lentivirales en concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por 1x106 células durante 10 días. Se midieron el porcentaje y la intensidad de fluorescencia media de la expresión de GFP en DCh transducida con los dos vectores lentivirales mediante FACS (Becton Dickinson, BD, EE.UU). Se estimularon células mononucleares (MNC) del mismo donante in vitro mediante la DCh o la DCh transducida con una razón de 4 MNC
20 con respecto a 1 DCh. Se volvieron a estimular las MNC dos veces utilizando la misma DCh transducidacrioconservada y después se comprobó la actividad citolítica en un ensayo de liberación de 51Cr durante4h, utilizando como dianas células T2 cargadas con péptidos de control negativo o relevante (Inf.m.58) (10 µg/ml, 5x106 células/ml, en medio RPMI libre de FCS, 2 h a TA).
Se generaron células dendríticas derivadas de médula ósea tal como se describió anteriormente [43, 51]. Se cultivaron las células mononucleares de médula ósea en medio RPMI complementado con FCS al 10%, L glutamina 2 mM, 50 U/ml de penicilina, 50 µg/ml de estreptomicina, 2-mercaptoetanol 5
105 M(medio RPMI completo), 30 complementado adicionalmente con 20 ng/ml de GM-CSF de ratón recombinante y 100 ng/ml de IL4 de ratón recombinante (ambos de GENZYME, Cambridge, MA). Se retiraron cuidadosamente las células no adherentes, en el día 2 y 6, y se añadió medio RPMI completo nuevo, complementado con 10 ng/ml de GM-CSF de ratón y 50 ng de IL4deratón.Sesustituyó el mediodecultivo en el día7por 1mldemedio RPMI completo complementadocon los vectores lentivirales a concentraciones de 600 ng, 300 ng, 150 ng, y 150 ng/p24 por 1
106 células. Las células
35 dendríticas recogidas en el día 9 tenían una pureza de más del 95% (IAb+, HHD+, CD3-,33D1+,NDL145+,y CD 11c+), tal como se ensayó con mAb apropiado. Entonces se midió el porcentaje y la intensidad media de fluorescencia de la expresión de GFP en DC murina en los días 9 y 12 mediante FACS.
40 Se inyectaron vectores lentivirales en ratones HHD bien por víaintraperitoneal,por víaintravenosaobienpor vía subcutánea durante 12 días. Entonces se volvieron a estimular de manera individual las células del bazo de ratones cebados en medio RPMI completo mediante cada péptido epítopo durante siete días. En los dos últimos días, se volvieron a estimular las células cultivadas mediante TCGF al 10%. En el día 7 se comprobó la actividad citolítica de
45 las células cultivadas tal como ya se ha descrito (Pascolo, 1997), en un ensayo de liberación de 51Cr durante 4 h, utilizando como dianas células TAP-RMA-S transfectadas con HHD cargadas con péptidos de control negativo o relevante (Inf.m.58) (10 µg/ml, 5
106 células/ml,enmedio RPMI libre de FCS, 2haTA).Seutilizaron paralelamente como células diana las células HeLa transfectadas con HHD transducidas o no con TRIP-mel-ITES-GFP. Se calculó el porcentaje de lisis específica tal como sigue: (liberación experimental
liberación espontánea) / (liberación total 50 liberación espontánea) x 100.
Ejemplo II. Evaluación de respuestas LTC en ratones HHD tras la inmunización con el vector TRIP-des-IRES-GFP que codifica para el gen DES de Mycobacterium tuberculosis.
55 El gen DES se describe en el documento WO 98/04711.
Procedimiento experimental
En una primera etapa, se utilizaron los vectores TRIP-des-IRES-GFP para transducir las células HeLa-HDD. Estas
60 células se transdujeron y se clonaron limitando la dilución. Se seleccionó el clon que expresó el nivel más alto de GFP para utilizarlo como células diana en pruebas de LTC de 51Cr clásicas.
En una segunda etapa, se inyectaron ratones HDD por vía intraperitoneal utilizando 1,2 µg/p24 por ratón de las partículas de vector TRIP-des-IRES-GFP. Se estimularon in vitro células del bazo de estos ratones 12 días después 65 de la inyección conobien 0,2 µgo1µg/p24/ml (2
106 células por ml) de partículas de vector o bien con blastocitos
singénicos estimulados con LPS, transducidos con TRIP-des-IRES-GFP con 1 µg/p24/ml/2
106 células/ml. Seis días después de la estimulación in vitro, se comprobó la capacidad citolítica de las células en un ensayo de 51Cr utilizando células diana HeLa-HDD transducidas con des. Las células diana de control fueron células HeLa-HDD transducidas por el múltiple epítopo de melanoma (TRIP-mel-IRES-GFP).
5
Resultados
Estos experimentos se han realizado para estudiar si los vectores positivos tricatenarios derivados de VIH que codifican para un gen completo son capaces de transducir células y de inducir respuestas específicas de LTC frente 10 a las células diana que expresan el mismo gen. Tal como se ilustra en la figura 9, se obtiene una lisis específica en todas las condiciones. Los blastocitos de LPS transducidos indujeron respuestas de LTC débiles. Se obtuvieron los mejores resultados utilizando 1 µg/p24/ml de partículas de vector. Estos resultados muestran que puede introducirse un gencompletoenel genomadelacélulahuésped y seprocesa ypresentasuproducto, einduce respuestasde LTC significativas. Estos resultados también demuestran que el gen des contiene al menos uno o más péptidos
15 epítopos de LTC restringidos por HLA-A2.1.
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lt;212gt; ADN
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25 lt;220gt;
lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
lt;220gt;
lt;221gt; misc_feature
lt;222gt; (1)..(39)
lt;223gt; Cebador
lt;400gt; 1
tcagatctgc caccatggca ctaacagaag taataccac 39 35
lt;210gt; 2
lt;211gt; 30
lt;212gt; ADN
lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
lt;220gt; 45 lt;221gt; misc_feature
lt;222gt; (1)..(30)
lt;223gt; Cebador
lt;400gt; 2
cggaattctt attggccttg cccctgcttc 30
lt;210gt; 3
lt;211gt; 38
lt;212gt; ADN 55 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt;
lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
lt;220gt;
lt;221gt; misc_feature
lt;222gt; (1)..(38)
lt;223gt; Cebador
65 lt;400gt; 3 gaagatctgc caccatgaag cccatcaacc tctctcat 38
- 5
- lt;210gt; 4 lt;211gt; 27 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial lt;220gt; lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
- lt;220gt; lt;221gt; misc_feature lt;222gt; (1)..(27) lt;223gt; Cebador
- 15
- lt;400gt; 4 cggaattctt acccagcgca acgcctc 27
- lt;210gt; 5 lt;211gt; 23 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
- lt;220gt; lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
- 25
- lt;220gt; lt;221gt; misc_feature lt;222gt; (1)..(23) lt;223gt; Cebador
- lt;400gt; 5 ccggatcccc accggtcgcc acc
- 23
- 35
- lt;210gt; 6 lt;211gt; 23 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
- lt;220gt; lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
- 45
- lt;220gt; lt;221gt; misc_feature lt;222gt; (1)..(23) lt;223gt; Cebador lt;400gt; 6 ccctcgagct agagtcgegg ccg 23
- lt;210gt; 7 lt;211gt; 38 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
- 55
- lt;220gt; lt;223gt; Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido
- lt;220gt; lt;221gt; misc_feature lt;222gt; (1)..(38) lt;223gt; Fragmento de triple cadena
- lt;400gt; 7 gtcgtcggcg ccgaattcac aaatggcagt attcatcc
- 38
- 65
- lt;210gt; 8 lt;211gt; 34
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- 5
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- 10
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- lt;400gt; 8 gtcgtcggcg ccccaaagtg gatctctgct gtcc
- 34
- 15
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- 20
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- 25
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- 30 35
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- 40
- lt;220gt; lt;221gt; misc_feature lt;222gt; (1)..(27) lt;223gt; Cebador
- 45
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- lt;220gt; lt;221gt; PÉPTIDO
- 55
- lt;222gt; (1)..(92) lt;223gt; epítopo de melanoma
- lt;400gt; 11
Claims (11)
- REIVINDICACIONES1. Uso de: a) un transgén que codifica para uno o varios epítopos de carcinomas, leucemia o linfoma, situado bajo el control de5 señales reguladoras de transcripción y expresión, b) una secuencia que contiene señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación de origen retroviral o similar a retroviral, y c) regiones de iniciación central de acción en cis (cPPT) y de terminación de acción en cis (CTS) que pueden adoptar una estructura de tres cadenas tras transcripción inversa, siendo estas regiones de origen lentiviral,10 en la preparación de un vector.
- 2. Usosegún la reivindicación 1, en el quedichosunoovarios epítopos codificande8a15 aminoácidos, preferentemente de 9 a 12 aminoácidos.15 3. Uso según la reivindicación 1 o 2, en el que dichos epítopos de carcinomas son de carcinomas renales, carcinomas de vejiga, carcinomas de colon, carcinomas de pulmón o cáncer de mama.
- 4. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de señales reguladoras de origen retroviral se derivande un genoma de lentivirus. 20
- 5. Uso según la reivindicación 1, en el que dichas secuencias de señales reguladoras de origen similar a retroviral se derivan de un retrotransposón.
- 6. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho transgén está contenido en un casete de 25 expresión que incluye señales reguladoras de transcripción y expresión.
- 7. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación son de origen lentiviral, y dichas regiones de cPPT y de CTS son de origen lentiviral.
- 8. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y dichas regiones de cPPT y de CTS, se derivan de un lentivirus seleccionado de CAEV, EIAV, VISNA, VIH, VIS o VIF.35 9. Uso según la reivindicación 8, en el que dichas señales reguladoras de retrotranscripción, expresión y encapsidación y dichas regiones de cPPT y de CTS se derivan de un retrovirus de tipo VIH, en particular VIH-1 o VIH-2.
- 10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dichas regiones de cPPT y de CTS tienen una 40 localización central dentro de la secuencia del vector.
- 11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicho transgén se inserta en la región U3 de las señales de regulación para retrotranscripción.45 12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,enelque dichovector esadecuadoparainducir o estimular una respuesta inmune mediada por células contra uno o varios epítopos codificados por dicho transgén.
- 13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11,enelque dichovector esadecuadoparainducir oestimular una respuesta inmune mediada por células contra todos o la mayoría de los epítopos contenidos en el 50 poliepítopo.
- 14. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11,enelque dicho vector es adecuado para inducir o estimular una respuesta inmune mediada por células contra el tumor que expresa dichos uno o varios epítopos.55 15. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14, en el que dicha respuesta inmune es una respuesta de linfocitos T citotóxicos (CTL) o una respuesta de CD4.
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