CN116249902A

CN116249902A - SARS-CoV-2免疫测定及其材料

Info

Publication number: CN116249902A
Application number: CN202180048679.XA
Authority: CN
Inventors: R·P·沃克; H·肖尔茨
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2021-05-07
Publication date: 2023-06-09
Also published as: US20210349105A1; EP4146343A4; WO2021226437A1; EP4146343A1

Abstract

本发明涉及开发用于检测患者样品中的SARS‑CoV‑2抗原和/或SARS‑CoV‑2特异性抗体，以及，任选地，一种或多种细胞因子的新型免疫测定。

Description

SARS-CoV-2免疫测定及其材料

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月7日提交的美国临时申请序列号63/021,628、2020年5月30日提交的序列号63/032,541和2020年11月17日提交的序列号63/114,675的权益，其公开内容通过引用其全文(包括所有附图、表格和氨基酸或核酸序列)的方式纳入本文。

此申请的序列表被记为“Seq-List.txt”，其于2021年5月5日创建，大小为30KB。序列表的全部内容通过引用其全部内容纳入本文。

背景技术

冠状病毒SARS-CoV-2是COVID-19疾病的致病病毒剂，COVID-19疾病是一种高度传染性的人类呼吸道感染，威胁全球公共健康。截至2021年4月，已知该病毒已感染全球至少1.52亿人，已知死亡人数约为319万。

冠状病毒(CoV)是包含单链正义RNA的包膜病毒。之前称之为2019-nCoV，SARS-CoV-2是一种新出现的冠状病毒，其主要影响呼吸道，可导致严重急性呼吸***综合症(SARS)。由该病毒引起的基础疾病被命名为COVID-19。在过去的二十年中，冠状病毒是世界上数次严重爆发的罪魁祸首。2003年和2014年，冠状病毒分别主要在亚洲(SARS-CoV)和中东(MERS-CoV)爆发。在新型SARS-CoV-2出现之前，已知存在6种冠状病毒影响人类(SARS-CoV、MERS-CoV和导致轻度上呼吸道和下呼吸道综合征的其他四种冠状病毒)。

SARS-CoV-2被发现之后，数名患者出现了类似于SARS-CoV引起的严重肺炎。此后，该病毒迅速在全球传播，2020年3月，WHO正式宣布COVID-19为大流行病。该病毒在人与人之间的传播导致COVID-19的快速传播，并且大量需要重症监护的患者导致采取了遏制措施。感染COVID-19的个体会在感染后约2-14天后出现疾病症状。

已在呼吸道分泌物中检测到该病毒，而呼吸道分泌物被认为是主要的传播途径。一旦病毒颗粒进入呼吸道，病毒就会通过ACE-2受体附着于肺细胞，然后被内吞。SARS-CoV-2也可以通过粪便途径传播。

SARS-CoV-2呈阳性且有症状的患者被诊断为COVID-19。症状可能千差万别，主要包括发烧、干咳、嗅觉丧失、咳痰、头痛、呼吸困难、疲劳、恶心和腹泻。虽然一些病例可能是无症状的，但是其他病例可能导致与“细胞因子风暴”甚至死亡相关的急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

诊断主要依靠对呼吸道试样的实时逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测。然而，RT-PCR可能导致假阴性结果，原因是病毒载量低或不适合收集、处理和储存拭子(口咽部或鼻咽部)，或在反应过程中失败。也可以进行成像技术，如计算机断层扫描(CT)，并显示双侧多小叶磨玻璃样肺不透明，以帮助诊断。

血清学检测在了解和抗击病毒爆发中发挥着关键作用。血清学检测可以提供可靠的流行病学数据，这些数据对于确定感染率以及因此而得的真实死亡率指标非常宝贵。此外，其还可以帮助确定产生强大免疫反应的个体，然后这些个体可以成为治疗剂(例如免疫(恢复期)血浆)的供体。血清学检测还可以帮助确定无症状个体的免疫反应。这对医疗服务和紧急救援工作人员特别有用，因为它可以帮助限制风险并为人员配置决策提供信息。

目前正在进行研究，以了解对这种病毒的抗体反应，以及个体的抗体反应是否会赋予免疫力。早期研究显示，抗体反应在感染的早期几周(感染后7至30天)就开始产生。了解抗体产生和血清转化的时间，以及了解何时和是否发生类别转换非常重要。血清学类别转换是指B细胞抗体的产生从一种同种型的抗体转换到另一种(或例如IgM到IgG的类别转换)。了解从IgM同种型抗体(在疾病的急性期产生)到IgG同种型抗体(在疾病的恢复期出现，通常具有免疫力)的转变很重要。

SARS-CoV-2基因组编码四个主要结构蛋白：刺突(S)、包膜(E)、核蛋白(N)(也称为“N”蛋白或核衣壳蛋白)和膜(M)蛋白。发现刺突糖蛋白与ACE-2受体结合以进入细胞。根据对SARS-CoV和MERS-CoV病毒的研究，抗原呈递会刺激体液和细胞免疫。这些病毒表现出典型的IgM和IgG产生模式。IgM抗体通常在12周后消失，而IgG抗体持续存在，这表明这些抗体可能起到保护作用。研究表明，IgG抗体主要针对S和N蛋白。刺突蛋白有两个主要亚基：亚基1(S1)，其包含将病毒附接于细胞膜的受体结合结构域(RBD)，从而与人ACE2受体结合。亚基2(S2)，其介导病毒与细胞膜的融合。

发明内容

本发明涉及开发用于检测患者样品中的SARS-CoV-2抗原和/或SARS-CoV-2特异性抗体，以及，任选地，一种或多种细胞因子的新型免疫测定。免疫测定可以通过标准免疫测定形式或在自动化平台上进行。在各种实施方式中，免疫测定使用一种或多种下述SARS-CoV-2结构蛋白(抗原)：刺突(S)、S1、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段。作为一个例子，S1蛋白的片段是S1蛋白的RBD部分。SARS-CoV-2结构蛋白可以固定在基材上，用于检测从对象获得的生物样品中的抗体。其他实施方式提供了免疫测定，所述免疫测定使用一种或多种下述SARS-CoV-2结构蛋白(抗原)：刺突(S)、S1、S2、刺突蛋白变体、S1变体、RBD变体、S2变体、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段。这些方法允许对这些抗原的抗体进行定量、半定量和/或定性检测，以及区分SARS-CoV-2感染对象和用基于刺突蛋白的疫苗接种的对象的手段。然而，其他实施方式提供了利用对SARS-CoV-2结构蛋白具有特异性的抗体的免疫测定。其他实施方式提供了一种免疫测定法，该方法检测生物样品中的一种或多种SARS-CoV-2抗原和/或SARS-CoV-2结构蛋白(抗原)的特异性抗体，以及，任选地，一种或多种细胞因子。在一些实施方式中，可以根据与核蛋白(也称为核衣壳或“N”蛋白)结合的抗体来区分接受mRNA刺突蛋白特异性疫苗或S1/S2特异性蛋白疫苗的疫苗接种个体和被SARS-CoV-2感染的个体。所公开的免疫测定也能有效地检测由SARS-CoV-2变种产生的抗体，如P1(巴西)、B.1.1.7(UK)和B.1.351(南非)。在不同的实施方式中，免疫测定可以使用标记的抗体(例如，与被测生物样品中的IgG、IgA和/或IgM抗体结合的抗-人IgG-PE和/或IgM-PE报告物)来检测和/或量化生物样品(例如，来自对象的血清样品)中的SARS-CoV-2特异性抗体。本发明的其他方面提供了用于本文所述的免疫测定的抗原/基材或抗体/基材组合。

附图说明

图1说明了形式A，并显示了使用单一抗-人Ig的抗体检测。图中显示了抗-人IgG检测，但也可以用抗-人IgA和抗-人IgM进行IgA和/或IgM抗体检测。当使用抗-人IgA和/或抗-人IgM抗体时，可以采用能吸附人IgG的样品稀释剂。

图2说明了形式B，显示了总抗体检测，使用多种抗-人Ig偶联物的组合检测人IgG、IgA和IgM。

图3说明了形式C，显示了利用固体表面的抗原检测总抗体，但也用于检测结合的抗体。对于结合抗体IgA、IgM或IgG，生物素化的抗原结合至可用抗***点。结合生物素的链霉亲和素-PE被用于检测。

图4说明了形式D，并显示了使用夹心免疫测定形式的抗原检测。如图3所示，抗原检测也可以与总抗体检测组合。

图5说明了形式E，并显示了检测总抗体加抗原的免疫测定。

图6显示了同时检测多种SARS-CoV-2分析物，并使用多种生物素化的偶联物(偶联物1)以检测抗体和/或SARS-CoV-2抗原与珠试剂的结合。

图7说明了同时(多重)检测抗-SARS-CoV-2抗体和细胞因子IL-6。

图8说明了所公开的试验检测感兴趣的变体(VOI)或关注的变体(VOC)的能力。框图显示了最小、最大和中位的IgG抗体水平(U/mL)，这是由它们与固定在磁珠表面的重组蛋白的反应性来衡量的。珠信号对每种蛋白质都是独立校准的，并处理成个体抗体指数(AI)值。变体L452R代表加利福尼亚变体。

图9提供了说明WHO标准和参考组的血清-反应性的图示，所述反应性是对于：三聚体野生型、B1.1.7(UK变体；HV69-70 del、Y144del、N501Y、A570D、D614G、P681H、T7161、S982A、D1118H)、B1.351(南非变体；L18F、D80A、D215G、LAL 242-244del、R246I、K417N、E484K、N501Y、D614G、A701V)和P1(巴西变体；L18F、T20N、P26S、D138Y、R190S、K417T、E484K、N501Y、D614G、H655Y、T1021I、V1176F)刺突蛋白。

具体实施方式

如本文所用，单数形式的“一个”，“一种”和“该”也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，就在具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包括”，“包含”，“具有”，“含有”，“有”或其变化形式的程度而言，这些术语意在以类似术语“包含”的方式表示包含在内(inclusive)。过渡术语/短语“包含”、“包括”、“含有”、“基本上由……组成”、“基本上由……构成”、“由……组成”和“由……构成”(及其任何语法变体)，可互换使用。

术语“约”或“大约”表示就特定数值而言在本领域普遍技术人员能够确定的可接受的误差范围内，这将部分取决于该数值的测量或确定方式，例如，测量体系的极限。例如，根据本领域的实践，“约”可以指1个或超过1个标准偏差。或者，“约”可以指给定值的至多0-20％、0-10％、0-5％或至多1％的范围。

在本公开内容中，范围是简写形式，以避免不必要详细列出并描述范围内的每个值。适当时，可选择该范围内的任何合适值作为该范围的上限值，下限值或终点。例如，范围0.1-1.0表示终值0.1和1.0，以及中间值0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9，并且所有中间范围都包含在0.1-1.0内，例如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5-10的范围表示5.0和10.0之间以及5.00和10.00之间的所有值，包括端点值。

本公开可以根据数字或字母(例如，可检测标记物1、珠(ii)等)指代诸如标记物、固体支持物、珠、分析物等项目。在使用此命名法的情况下，这些数字和字母旨在将该项目与其他同类项目区分开来(例如，珠(i)相对珠(ii))，并不意味着将特定属性与数字或字母相关联。本文所述方法、装置和材料的实施可采用任何与本文所述相似或等同的方法、装置和材料。以下定义用来帮助理解本文中的一些常用术语但不对本文公开的范围构成限制。

多重测定是同时测量单个样品中超过一种分析物水平的分析。多重测定方法和试剂述于例如美国专利号5,888,86和WO2008148883(其各自通过引用其全部内容纳入本文)。在本申请的上下文中，待测的分析物是对固定在本文所公开的固体基材上的肽或蛋白质的特异性抗体。在优选的实施方式中，抗体是IgG和/或IgM类的抗体。任选地，待测的其他分析物是固定在本文所公开的固体基质上的抗体的特异性抗原。

术语“固体支持物”或“基材”(以及这些术语的语法等同形式)用于表示可以固定试剂，例如抗体或肽或蛋白质的固体惰性表面或物体。这些术语(“固体支持物”或“基材”(以及这些术语的语法等同形式))可以互换使用。固体支持物或基材的非限制性示例包括塑料、聚苯乙烯、硝酸纤维素、膜、芯片和颗粒。如果使用了颗粒以外的固体支持物，例如玻璃、聚合物或二氧化硅芯片(例如微芯片)、板、载玻片等，本文公开的肽和/或蛋白质(目标分析物)可以特定位置(例如，在板的特定孔中(例如，微量滴定板)或在芯片、微芯片、板或载玻片上的特定位置)固定在支持物的表面。因此，可以通过样品中的抗体与本文所公开的肽和/或蛋白质在支持物表面发生特异性结合的位置来区分样品中的抗体。

或者，侧流免疫测定可以类似于美国专利号5,851,776和6,777,190中公开的方式进行(其各自通过引用其全部内容纳入本文，并且涉及在膜或其他多孔或无孔材料进行的横流色谱分析)。如上所述，本文所公开的肽和/或蛋白质(目标分析物)被固定在膜或其他多孔或无孔材料上的离散位置(每个位置对特定的抗原/目标分析物具有特异性)，然后与含有特异结合至所公开的肽和/或蛋白质(目标分析物)的抗体的生物样品接触。然后使用常规方法检测抗体进行肽和/或蛋白质的特异性结合，所述肽和/或蛋白质被固定在膜或其他多孔或无孔材料上的离散位置。术语“颗粒”在本文中用于指代任何形状或表面纹理的固体或半固体，通常具有微米级的线性尺寸(即，小于约100微米)。除非另有说明，该术语可与“颗粒”和“珠”互换使用，所述“颗粒”指微米级的颗粒，所述“珠”指球形或接近球形的颗粒，其组成通常为聚合物。在本申请中使用时，术语“颗粒”和“珠”(以及这些术语的语法等同形式)可以互换，不改变本申请中段落的上下文。

本文所用的术语“固化(的)”表示，在本文所述的测定的步骤期间施加的条件下未显著解偶联的基于分子的偶联。这种固定可以通过共价键、非共价键、离子键、亲和力(affinity)相互作用(例如亲和素-生物素或聚组氨酸-Ni⁺⁺)或任何其他化学键来实现。

本申请中公开的肽和/或蛋白质的多种组合的固定可以通过在基材上的共价或非共价固定来进行。例如，非共价固定可以是非特异性的(例如，一种或多种肽和/或蛋白质与聚苯乙烯表面的非特异性结合)。与基材的特异性或半特异性结合可以通过具有这样部分的肽和/或蛋白质实现，所述部分能够使肽和/或蛋白质与包被有结合该部分的配体的基材共价或非共价结合。例如，该部分可以是与肽的氨基酸基团结合的生物素或生物素基团或其类似物，例如6-氨基己酸，那么配体是是亲和素、链霉亲和素或其类似物。或者，该部分可以是His-His-His-His-His-His肽，并且基材可以用带有Ni⁺⁺离子的次氮基三乙酸衍生物(NTA)衍生化。

适用于所公开方法的各种基材包括但不限于，磁珠，聚苯乙烯珠，乳胶珠，包含共聚物的珠，例如苯乙烯-二乙烯基苯；羟基化苯乙烯-二乙烯基苯；聚苯乙烯；羧化聚苯乙烯；碳黑；未激活的聚苯乙烯或聚氯乙烯活性玻璃；或环氧激活多孔磁性玻璃。在其他实施方式中，基材可以是微量滴定孔的底或壁；过滤表面或膜(例如，硝酸纤维素膜或PVDF(聚偏二氟乙烯)膜，例如Immobilon膜)；中空纤维；珠状层析介质(例如，琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶)；磁珠；纤维状纤维素基质；HPLC基质；FPLC基质；或任何其他合适的运载体、支持物或表面。在一个实施方式中，将本公开的SARS-CoV-2蛋白固定到聚苯乙烯珠(微球)上，其中将各种蛋白质固定到具有独特的可检测物理参数的珠，并通过能够区分可检测物理参数的平台进行分析。这类测定可以称为“多重免疫测定”，并在下文详细讨论。

用于进行特异性结合测定，特别是免疫测定的装置是已知的并且可以容易地适用于本方法。一般来说，固相测定比需要分离步骤(例如沉淀、离心、过滤、层析或磁力)的异相测定方法更容易执行，因为试剂的分离更快更简单。固相测定装置包括微量滴定板，流通测定装置，芯片，微芯片，侧流基材试纸和免疫毛细管或免疫层析免疫测定装置。

目前，在美国有三种主要的COVID-19疫苗获得了美国食品和药物管理局的紧急使用授权(EUA)。辉瑞-生物技术(Pfizer-BioNTech)和莫德纳(Moderna)公司的疫苗是mRNA疫苗，而授权的强生杨森(Johnson&

Johnson Janssen)公司的疫苗是病毒载体疫苗。所有这三种疫苗都是针对SARS-CoV2病毒的S1/S2刺突蛋白。因此，可以基于对感染个体的核衣壳具有特异性的抗体来区分感染个体和疫苗接种个体。

术语“器具”、“器皿”、“管”、“孔”等指可以容纳试剂或试验的容器。如果容器在试剂盒中并装有试剂，那么其通常将是闭合的或密封的。如果将容器用于试验，那么其通常在化验步骤期间是打开的或可及的。

术语“生物样品”涵盖获自生物体的多种样品类型。该术语涵盖体液，例如血液，血液成分，唾液，鼻粘液，血清，血浆，脑脊髓液(CSF)，尿液和其他生物来源的液体样品，实体组织活检，组织培养物或采集自培养的患者细胞的上清液。在本公开的上下文中，生物样品通常是具有可检测量抗体或病毒的体液，例如血液或血液成分(例如血浆或血清)或鼻分泌物(粘液)。可以在测定之前处理生物样品，例如，以去除细胞或细胞碎片。该术语包括在采购后经过处理的样品，例如通过试剂处理、溶解、沉淀或富集某些成分。

本文所用的术语“抗体”指由一个或多个免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性结合并识别分析物(抗原)。公认的免疫球蛋白轻链分类为κ或λ。免疫球蛋白重链分类为γ、μ、α、δ或ε，进而确定了免疫球蛋白类型，分别为IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。免疫球蛋白G(IgG抗体)结构单元的示例是四聚体。各个这类四聚体包含相同的两对多肽链，每对包含一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N末端确定约100至110个或更多个氨基酸构成的可变区，所述可变区主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别指这些轻链和重链。

抗体以完整的免疫球蛋白形式或以由用多种肽酶消化而产生的已充分表征片段的形式存在。因此，例如，胃蛋白酶消化铰链区中二硫键附近的抗体，以产生Fab的二聚体F(ab)'₂，所述Fab本身是通过二硫键接合到VH-CH1的轻链。可以在温和条件下还原F(ab')₂二聚体，以打断铰链区中的二硫键，从而将F(ab')₂二聚体转化为两个Fab'单体。Fab'单体本质上是具有部分绞链区的Fab(参见Paul(编著),《基础免疫学》(FundamentalImmunology),第三版,瑞文出版社(Raven Press),纽约(1993))。虽然根据对完整抗体的消化定义了多种抗体片段，但是本领域技术人员会理解，这类片段也可利用化学方法或重组DNA方法从头合成。因此，本文所用的术语“抗体”还包括通过修饰整个抗体产生的抗体片段。

抗体通常根据其靶标来命名。虽然命名法有所不同，但本领域技术人员将熟悉并理解的是，可以将多个名称应用于同一抗体。例如，对IgM具有特异性的抗体可称为“抗IgM”、“IgM抗体”、“抗IgM抗体”等。

术语对“……具有特异性”、“特异性”、“特异性结合”和语法上等同的术语指分子(例如抗体或抗体片段)与靶标结合的亲和性比与其与非靶标化合物结合的亲和性高至少2倍，例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如，特异性结合给定抗体靶标的抗体通常以与非抗体靶标相比高至少2倍的亲和力结合抗原靶标。可以使用标准方法确定特异性，例如，固相ELISA免疫测定(参见例如，Harlow和Lane,《使用抗体：实验室手册》(Using Antibodies,A Laboratory Manual)(1998)，关于可用于确定特异性免疫反应性的免疫测定形式和条件的描述)。

关于抗体靶标(例如，抗原、分析物)的术语“结合”通常表示抗体结合纯的群体中的大多数抗体靶标(假定适当的摩尔比)。例如，结合给定抗体靶标的抗体通常结合溶液中至少2/3的抗体靶标(例如，75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％)。本领域技术人员应理解，取决于测定结合的方法和/或阈值，可出现一些变化。

术语“标记物”、“可检测标记物”和“可检测部分”等指通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括荧光染料(荧光团)，发光剂，电子致密试剂，酶(例如通常用于ELISA)，生物素，作用于基材的酶(例如，辣根过氧化物酶)，异羟基洋地黄毒苷(digoxigenin)、³²P以及其他可检测的同位素，半抗原和蛋白质，其可以例如通过将放射性标记物掺入肽中或用于检测与肽特异性反应的抗体来成为可检测的。该术语包括单一标记试剂的组合，例如，提供独特可检测特征(signature)(例如，以特定波长或波长组合下)的荧光团的组合。可以使用本领域已知用于使标记物与所需试剂偶联的任何方法，例如，使用Hermanson,Bioconjugate Techniques 1996,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.)圣地亚哥中所述的方法。

当述及结果或信号时，术语“阳性”表示样品中存在进行检测的分析物或项目。当述及结果或信号时，术语“阴性”表示样品中不存在进行检测的分析物或项目。阳性和阴性通常通过与至少一个对照(例如，确定样品呈阳性所需的阈值水平)或阴性对照(例如，已知的空白)进行比较来确定。“对照”样品或值是指用作参照的样品，通常是已知参照，用于与测试样品进行比较。例如，测试样品可以取自测试条件，例如，在测试化合物存在的情况下，并与来自已知条件的样品进行比较，例如，在测试化合物(阴性对照)不存在的情况下，或在已知化合物(阳性对照)存在的情况下。对照还可以表示从多个测试或结果中收集的平均值。本领域技术人员将认识到的是，可以设计对照用于评估任何数量的参数，并且将理解何种对照在给定情况下是有价值的并且能够基于与对照值的比较来分析数据。控制对于确定数据的显著性也很有价值。例如，如果给定参数的值在对照中是可变的，那么测试样品中的变化将不被视为是显著的。

“校准对照”类似于阳性对照，因其包括已知量的已知分析物。在多重测定的情况下，校准控制可以设计成包括已知量的多种已知分析物。校准对照中的一种或多种分析物的数量可以设置为最小截止量，例如，使得较高的数量将被视为对一种或多种分析物呈“阳性”，而较低的数量将被视为对分析物呈“阴性”。在某些情况下，可以使用多级校准控制，从而可以更准确地确定分析物量的范围。例如，测定可以包括处于已知低量和高量或已知最小量、中间量和最大量的校准对照。

术语“诊断”是指对象患有感染、病症或疾病的相对可能性。同样，“预后”一词是指对象未来可能出现某种结果的相对概率。例如，在本公开的上下文中，预后可以指个体已经感染SARS-CoV-2并且已经或将会发展为疾病的可能性。这些术语并不是绝对的，医学诊断领域的任何一位技术人员都会理解。

“对象”、“患者”、“个体”及其语法等同形式可互换使用；除非另有说明，其指哺乳动物，如人和非人类灵长类动物，以及兔子、猫科动物、犬科动物、大鼠、小鼠、松鼠、山羊、猪、鹿和其他哺乳动物。该术语不一定表示受试者已被诊断出患有特定疾病，但通常是指在医疗或兽医监督下的个体。患者可以是正在寻求治疗、监测、调整或修改现有治疗方案等的个体。

术语“结构蛋白”、“肽”、“抗原”、“分析物”和“片段”(及其语法等同形式)可以互换使用，并且指代本公开所公开的SARS-CoV-2蛋白及其片段。如本文所讨论的，所公开的SARS-CoV-2蛋白的片段是给定的SARS-CoV-2蛋白或片段的5至(n-1)个连续氨基酸，如S1蛋白的RBD，其中n是所公开的SARS-CoV-2蛋白或片段的长度。长度可以包括或排除经加工的信号肽。因此，在刺突蛋白的情况下，长度可以包括或排除蛋白质的信号肽。在一些实施方式中，“分析物”可以是对SARS-CoV-2结构蛋白(抗原)具有特异性的抗体。在这类实施方式中，该术语在检测作为分析物的抗体的上下文中的使用将是清楚的。在其他实施方式中，包括下述趋化因子和细胞因子中的一种或多种作为待检测和/或定量的一种或多种“分析物”：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。虽然IL-1β，IFN-γ，IFNγ型诱导蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α被归类为细胞因子或趋化因子(在IP-10的情况下)，但是细胞因子和趋化因子(IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)，单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎性蛋白-1A和TNF-α)在本文中可称为“(一种)细胞因子”、“(多种)细胞因子”或“一种或多种细胞因子”。如上所述，该术语在检测或固定这些趋化因子和/或细胞因子(“(一种)细胞因子”、“(多种)细胞因子”或“一种或多种细胞因子”)的上下文中使用将是清楚的。

如上所述，本发明涉及开发新型多重免疫测定，用于检测疑似感染病毒的患者样品中针对SARS-CoV-2抗体，以及任选地，一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。本公开的免疫测定旨在测量抗体(如IgM、IgA和/或IgG抗体)，以及，任选地，测量此类患者中一种或多种细胞因子的水平。免疫测定可通过使用利用手动或使用自动化平台的ELISA、侧流、磁性试验的标准免疫测定来进行。具体而言，所公开的免疫测定使用一种或多种SARS-CoV-2蛋白或其片段，选自SARS-CoV-2刺突(S)、S1或S1蛋白的RBD、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段以及所述蛋白的任何组合(例如两种、三种、四种、五种或六种抗原的任何组合)，以及任选地一种或多种细胞因子，选自IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白1A和TNF-α(例如，这些分析物中的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个或十一个的任何组合)。如上所述，所公开的免疫测定法可通过检测SARS-CoV-2感染个体样品中抗-核衣壳抗体的存在来区分感染SARS-CoV-2的个体。在接种过疫苗的个体中，疫苗会诱导出针对SARS-CoV2病毒的S1/S2刺突蛋白的抗体，因此接种过疫苗的个体的样品预计不会含有针对核衣壳的抗体。然而，其中观察到“突破性”感染的个体(后来感染了SARS-CoV-2的经疫苗接种的个体)将有望产生对SARS-CoV-2核衣壳的免疫反应。

另一实施方式提供了这样的免疫测定，其中将单个SARS-CoV-2蛋白质或其片段固定在基材上。因此，所公开的免疫测定包括在有效于使生物样品中存在的抗体与固定的SARS-CoV-2特异性蛋白质或其片段结合的条件下，进行已固定有一个或多个SARS-CoV-2蛋白质或其片段的基材的接触。然后可以通过已经标记的物种特异性抗-IgM、抗-IgG、抗-IgA、抗-IgD、抗-IgE抗体(例如，抗人、抗兔、抗犬、抗大鼠、抗小鼠、抗松鼠、抗山羊、抗猪或抗鹿抗体)检测与附接至基材的SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体。例如，抗-IgG-PE和/或抗-IgM-PE报告物可以用于检测和/或定量获自疑似感染病毒的个体的生物样品中的SARS-CoV-2特异性抗体。在某些优选实施方式中，物种特异性抗体是抗人抗体。在某些其他的实施方式中，免疫测定提供了一种方法，根据从个人获得的样品中检测到的抗核衣壳抗体，将感染Sars-CoV-2的个体与免疫的个体区分开。

本文所公开的蛋白质和片段可以通过共价或非共价键合固定在固体支持物上。在将抗体、细胞因子或SARS-CoV-2蛋白质或其片段共价固定在基材上的实施方式中，在添加SARS-CoV-2蛋白质或其片段之前，将活化并酯化羧化基材，例如颗粒、塑料、聚苯乙烯或珠。羧基活化使用水溶性碳二亚胺，例如1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺(CMC)实现。酯化使用NHS、NHSS或HOBt或其他合适的试剂实现。羧基活化和酯化后，将SARS-CoV-2蛋白质或其片段被添加到pH值为6-10之间的缓冲液(例如，乙酸钠缓冲液pH 5.1、磷酸缓冲液pH7.0，其具有或不具有去污剂(例如，CHAPS))中的活性(actived)表面。偶联后，将基材(例如珠)在含有蛋白质阻断剂，例如BSA、小鼠IgG、牛γ球蛋白(BGG)或动物血清(山羊、马、鼠)的缓冲液中封闭。蛋白质阻断剂可以0.1-10重量/体积百分比的数量存在。然后可以用合适的缓冲液对与基材偶联的封闭的抗原进行洗涤并用于所需的免疫测定形式。

如上所述，本发明涉及免疫测定方法，其包括采集可能含有抗体的体液或组织样品(例如，生物样品)；在有效于形成特定蛋白质-抗体复合物(有时称为特异性结合蛋白质和抗体或给定的蛋白质和特异性结合该蛋白质或其片段的抗体的“免疫复合物”)的条件下使生物样品与SARS-CoV-2蛋白质或其片段(和/或一种或多种细胞因子)接触；并测定接触的(反应的)样品中抗体-分析物免疫复合物的存在(例如，确定抗体-细胞因子复合物和/或包含抗体和SARS-CoV-2蛋白质或其片段的免疫复合物的量)。

在各种实施方式中，所公开的方法涉及这样的诊断方法，其包括采集可能包含抗体(IgG、IgE、IgD、IgM或IgA同种型)的体液或组织样品(生物样品)，并检测和/或定量生物样品内抗体和/或一种或多种细胞因子的存在。通常，检测IgM、IgA和/或IgG抗体(尽管也可以检测其他同种型的抗体)。在各种实施方式中，生物样品是源自静脉血样品的血清或血浆样品。已知含有抗体的其他体液，例如唾液、胃分泌物、鼻腔分泌物、粘液等，也可称为生物样品并用于所公开的免疫测定中。

在不同的实施方式中，该测定可包括将生物样品中的一种或多种抗体固定在基材上(形成包被有抗体的基材)，向包被有抗体的基材添加本文公开的一种或多种肽和/或蛋白质，然后检测与肽或蛋白质结合的抗体。可以通过使用标记的肽或蛋白质，或通过添加与肽或蛋白质特异性结合的标记抗体来检测存在于生物样品中的抗体。

在特定的实施方式中，多重免疫测定可以用于检测一种或多种SARS-CoV-2蛋白质或其片段和/或一种或多种SARS-CoV-2蛋白质或其片段的特异性抗体的存在，以及，任选地，一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的任何组合)。因此，当前描述的免疫测定涉及在一次测定中检测大于一种的分析物，因此，被称为多重测定。目前描述的测定包括将单个或多个分析物固定在可区分的固体支持物上的组件，以便每个分析物可以通过流式细胞仪鉴定和量化。测定组件和考虑因素包括固体支持物和如何区分不同类型的固体支持物(例如标记物或其他区分参数)，专门固定一种或多种所需分析物和去除其他样品材料的组件，以及用于检测和量化所需分析物的标记物。

当前描述的多重测定涉及使用固体支持物，通常是颗粒或珠。对于流式细胞术检测，应避免发射高水平自发荧光的颗粒或珠，因为这会增加背景信号并有可能使其不适用。通过标准乳液聚合由各种不同的起始单体产生的颗粒或珠通常表现出低自发荧光，而那些已经改性以增加孔隙率的(“大孔”颗粒)表现出高自发荧光。这类颗粒或珠中的自发荧光随着尺寸的增加和二乙烯基苯单体百分比的增加而进一步增加。在这些限制内，颗粒或珠的尺寸范围可以变化，具体的尺寸范围并不重要。在大多数情况下，颗粒或珠粒的聚集尺寸范围在颗粒或珠粒直径为约0.3微米至约100微米的范围内，例如在约0.5微米至约40微米的范围内。

磁性颗粒或珠在本领域中是常用的，并且可以使分离和洗涤步骤对于目前描述的测定更方便。“磁性颗粒”、“磁性响应材料”、“磁珠”等术语表示响应磁场的材料。磁性响应材料包括顺磁材料(例如，铁、镍和钴，以及金属氧化物，例如Fe₃O₄、BaFe₁₂O₁₉、CoO、NiO、Mn₂O₃、Cr₂O₃和CoMnP)，铁磁材料，亚铁磁材料和变磁材料。磁性响应材料并不构成整个颗粒或珠，而是通常构成微粒或珠的一个组分，而其余部分由聚合材料组成，所述聚合材料可以经化学衍生以允许附着测定试剂(例如，抗原/分析物或抗体)。用于施加和移除作为测定的一部分的磁场的方法和仪器是本领域技术人员已知的并且在文献中有报道。文献报告的示例是Forrest等,美国专利号4,141,687；Ithakissios,美国专利号4,115,534；Vlieger等,Analytical Biochemistry 205:1-7(1992)；Dudley,Journal of ClinicalImmunoassay14:77-82(1991)；和Smart,Journal of Clinical Immunoassay 15:246-251(1992)。

形成微粒或珠的聚合物基质可以是与当前描述的多重测定相容的任何材料。基质应该对生物样品的成分和测定试剂是惰性的，具有最小的自发荧光，是固体并且不溶于样品和测定中使用的任何其他试剂或洗涤液，并且能够将测定试剂固定到微粒。合适的聚合物的示例是聚酯、聚醚、聚烯烃、聚环氧烷、聚酰胺、聚氨酯、多糖、纤维素和聚异戊二烯。交联能够用于许多聚合物，以赋予微粒结构完整性和刚性

可以通过常规方式将用于连接测定试剂(例如，抗原/分析物或抗体)的官能团掺入聚合物结构中。合适的官能团的示例是胺基、铵基、羟基、羧酸基和异氰酸酯基。测定试剂通常直接或间接地(例如通过连接基团)共价结合至固相表面。连接基团可以用作增加固相表面上反应基团的密度和降低空间位阻以增加测定的范围和灵敏度的手段，或用作向固相表面添加特定类型反应基团以拓宽可以固定在固相的测定试剂类型的范围的手段。合适的有用的连接基团的示例是聚赖氨酸、聚甘氨酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸和聚精氨酸。

多重测定中不同类型的颗粒或珠可以彼此区分，例如，通过尺寸、重量、光散射或吸光度、反射率、形状或标记，例如荧光(染料)标记物。当颗粒或珠大小用作区分因素(区分特征)时，选择尺寸子范围的宽度和介于相邻子范围的平均直径之间的间距，以允许通过流式细胞术区分不同类型的颗粒或珠，这对于使用流式细胞术以及针对流式细胞术的仪器的技术人员来说是显而易见的。通常，给定平均直径的子范围约为平均直径的±5％CV或更小，其中CV是变异系数，定义为颗粒或珠直径的标准偏差除以平均颗粒直径乘以100％。不同类型的颗粒的子范围的平均直径通常间隔开子范围之一的平均直径的至少约6％，例如，子范围之一的平均直径的至少约8％或10％。

光散射也可用于区分不同类型的颗粒或珠。侧向角光散射随颗粒或珠尺寸、粒度、吸光度和表面粗糙度变化，而前向角光散射主要受尺寸和折射率影响。改变这些特性中的任何一个都会导致光散射差异，而这可以作为区分不同颗粒或珠组的手段。

区分参数的另一示例是吸光度。当将光施加到颗粒或珠时，颗粒或珠对光的吸收主要通过侧向(侧角)散射光强度的变化来表示，而前向散射光的强度相对不受影响。因此，通过观察横向散射光强度的差异来确定与颗粒或珠相关的各种有色染料之间的吸光度差异。

可以用作区分参数以将一组的颗粒或珠与另一组的颗粒或珠区分的其他物理参数包括赋予颗粒或珠不同的发射光谱和/或散射特性的可激发荧光染料或有色染料。或者，不同浓度的一种或多种荧光染料可用于区分或区别颗粒或珠。

当可区别特征是荧光染料或颜色时，可以将其包被在颗粒或珠的表面，包埋于颗粒或珠中，或与颗粒或珠材料的分子结合。因此，可以通过将聚合物材料与荧光染料结合，或通过用染料浸渍颗粒或珠来制造荧光颗粒或珠。具有已经掺入染料并因此适用于本发明的颗粒或珠可从供应商购得，例如Spherotech有限公司(美国伊利诺伊州利伯蒂维尔)和分子探针有限公司(Molecular Probes,Inc.)(美国俄勒冈州尤金市)。

标记物可以是直接或间接发出或生成可检测信号的任何物质或成分。在一些实施方式中，标记物是荧光团，其中许多已在文献中报道并因此为本领域技术人员所知，并且其中许多是易于商购的。关于荧光团的文献来源包括：Cardullo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:8790-8794(1988)；Dexter,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953)；Hochstrasser等,Biophysical Chemistry 45:133-141(1992)；Selvin,Methods in Enzymology 246:300-334(1995)；Steinberg,Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971)；Stryer,Ann.Rev.Biochem.47:819-846(1978)；Wang等,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990)；和Wang等,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。下述是可以用作标记物的荧光团的非限制性示例：

4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪-2,2'二磺酸；吖啶；异硫氰酸吖啶；5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)；4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺-3,5二磺酸盐/酯；N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺；邻氨基苯甲酰胺；BODIPY；亮黄(Brilliant Yellow)；香豆素；7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)；7-氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；花青染料；氰苷；4',6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)；5',5″-二溴邻苯三酚-磺萘酞(溴邻苯三酚红)；7-二乙氨基-3-(4'-异硫氰基苯基)-4-甲基香豆素；二亚乙基三胺五乙酸酯；4,4'-二异硫氰酸二氢茋-2,2'-二磺酸；4,4'-二异硫氰酸芪-2,2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-(4'-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；伊红；伊红异硫氰酸酯；赤藓红B；异硫氰酸赤藓红；乙锭；5-羧基荧光素(FAM)；5-(4,6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(TAF)；2',7'-二甲氧基-4'5'-二氯-6-羧基荧光素(JOE)；荧光素；异硫氰酸荧光素；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰苯胺；酚红；藻红蛋白((PE)包括但不限于B和R型)；邻苯二甲醛；芘；芘丁酸盐/酯；1-芘丁酸琥珀酰亚胺酯；量子点；活性红4(Cibacron^TM亮红3B-A)；6-羧基-X-罗丹明(ROX)；6-羧基罗丹明(R6G)；丽丝胺罗丹明B磺酰氯罗丹明；罗丹明B；罗丹明123；罗丹明X异硫氰酸酯；磺胺B；磺胺101；磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；N,N,N',N'-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；核黄素；蔷薇酸；和镧系螯合物衍生物。

用于所公开的免疫测定的特定荧光团包括荧光素、异硫氰酸荧光素、藻红蛋白(PE)、罗丹明B和德克萨斯红(磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物)。本段前述列表中的任何荧光团均可用于当前描述的测定，以标记颗粒或珠，或标记结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)。荧光色素可以通过常规共价键连接，在荧光团上和颗粒或珠或结合剂(例如，抗体或链霉亲和素)上使用合适的官能团。这些基团的识别以及形成连接的反应对本领域技术人员来说是显而易见的。可以用于代替荧光团的其他标记物是放射性标记物和酶标记物。这些同样是本领域已知的。流式细胞术方法和仪器是本领域已知的。仪器和方法的描述可以在例如细胞术简介：学习指南(Introduction to Flow Cytometry:A Learning Guide)(2000)BD公司(Becton,Dickinson,and Company)；McHugh,“用于定量和同时检测多种可溶性分析物的流式微球免疫测定(Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitativeand Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes),”细胞生物学方法(Methods in Cell Biology)42,B部分(学术出版社(Academic Press),1994)中找到。

本发明还涉及用于检测对象SARS-CoV-2感染的试剂盒和组合物。本文公开的多重测定提供了对SARS-CoV-2蛋白质或其片段的特异性免疫球蛋白G(IgG)抗体、IgA和/或IgM抗体的检测和/或定量。本文公开的多重测定可以检测和/或定量特异性IgG、IgA和/或IgM抗体的数量，以及，任选地，检测和/或定量生物样品中存在一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的任何组合)。本文公开的多重测定还可以检测SARS-CoV-2特异性抗体的总量的存在，以及，任选地，检测和/或定量生物样品中存在一种或多种选自下述的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的任何组合)。

当前描述的各种测定提供了至少两个维度的检测，例如，固定珠的特性(identity)(例如，负荷有单个SARS-CoV-2特异性肽或蛋白质或本文所公开的SARS-CoV-2特异性肽和/或蛋白质的任何组合的珠，以及与固定于珠上的SARS-CoV-2特异性肽和/或蛋白质结合的抗体的存在和/或数量，以及，任选地，一种或多种选自下述的细胞因子的存在和/或数量：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α(例如，这些分析物中的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11种的任何组合)。这种多维方面允许多重形式，使得超过一种分析物可以在单一测定中检测。

因此，一个方面提供基材群体的组合。这些基材组合由两个或更多个(例如，2、3、4、5、6、7或更多个)不同且独特的可检测物理参数(例如染料特征)组成，各个不同且独特的可检测物理参数与单个基材群体相关联。

在一些实施方式中，在有珠存在的情况下，各个抗体同种型，以及，任选地，一个或多个细胞因子的存在和数量都在同一个接收器或容器中(管、孔、比色皿等)进行测量。如上所述，各个珠群携带特异性可检测物理参数(例如，染料特征)，以及SARS-CoV-2特异性蛋白质或其片段。因此，珠可以携带选自刺突(S)、S1、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白和/或其片段的单一肽或蛋白，例如S1蛋白的RBD或其片段或针对一种或多种选定细胞因子的特异性单克隆或多克隆抗体。

在某些方面，SARS-CoV-2免疫测定将利用刺突和核衣壳蛋白或这两种蛋白质的片段，以及，任选地，一种或多种细胞因子的特异性抗体。蛋白质或其片段可以包括但不限于SARS-CoV-2刺突糖蛋白S1、S1蛋白的RBD部分、刺突糖蛋白S2和核衣壳蛋白，并且可以固定在固体基材(例如珠)上。此外，该测定可以采用抗体包被的珠来检测病毒抗原，以及，任选地，对一种或多种细胞因子的特异性抗体。抗体检测刺突蛋白或其片段(如S1、S1蛋白的RBD和/或S2)和/或核衣壳蛋白质或其片段，以及，任选地，一种或多种选定的细胞因子。免疫测定的某些实施方式将采用多重流动免疫测定，该方法与传统的EIA非常相似，但允许在一个试管中同时检测和鉴定多种蛋白质的抗体。

偶联/固定抗体和重组蛋白质抗原

抗体(例如细胞因子特异性抗体和/或SARS-CoV2蛋白抗原或其片段的特异性抗体)和蛋白质抗原(如SARS-CoV-2S、S1、S1蛋白的RBD部分或其片段、S2、核衣壳或其组合)可以固定在固体支持物(例如微颗粒、珠或表面，如芯片、微量滴定板、膜或玻璃)上。在一些固定方案中，可以在添加抗体和/或一种或多种SARS-CoV-2特异性蛋白质抗原之前激活和酯化羧化的珠。使用水溶性碳二亚胺，例如1-环己基-3-(2-吗啉代乙基)碳二亚胺(CMC)实现羧基活化。使用NHS、NHSS或HOBt实现酯化。羧基活化和酯化后，将抗体和一种或多种SARS-CoV-2蛋白质抗原添加到pH值在6-10之间的缓冲液中的活化表面。例如，乙酸钠缓冲液pH5.1，磷酸盐缓冲液pH 7.0，具有或不具有去污剂(例如，CHAPS，离子和两性离子去污剂)。偶联/固化后，将固体支持物封闭在含有蛋白质阻断剂(例如BSA、小鼠IgG、牛γ球蛋白(BGG)、动物血清(山羊、马、鼠))的缓冲液中。蛋白质阻断剂以0.1-10重量/体积百分比的数量存在。

第一方面和第二方面提供了一对免疫测定，确定为形式A(第一方面)和形式B(第二方面)。这些免疫测定形式提供了对SARS-CoV-2抗体的单独检测或对总IgG、IgM和/或IgA以及，任选地，一种或多种细胞因子的检测。在这些免疫测定中，固体支持物(例如，可通过不同的荧光染料/特征相互区分的荧光标记的珠(也称为染色珠))可以包被蛋白质抗原(例如，刺突(S)、S1、S1蛋白质的RBD部分、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段)，以及，任选地，一种或多种细胞因子，如上所述的单独或不同的组合，然后将包被的一种或多种固体支持物与患者样品组合，例如，疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样本与样本稀释剂一起。在检测IgA或IgM的情况下，试验采用有助于阻断人IgG与蛋白抗原结合的样品稀释剂，从而增加IgA或IgM的检测，或者用能从样品中去除IgG的试剂对样品进行预处理(例如，包被有抗IgG抗体的磁珠或用含有抗IgG抗体的缓冲液(如含有缓冲液成分的样品稀释剂，例如三乙醇胺50mM、氯化钠150mM、氯化镁50mM、蛋白质，如2％BSA，3mg/ml山羊抗人IgG，和防腐剂，如叠氮钠))预处理。孵育后，未结合的样品可以被洗去，并加入标记的抗Ig(抗IgG、IgM或IgA)抗体，以允许检测与固体支持物结合的样品中的抗体。例如，可以使用抗人IgG和抗人IgM、抗人IgA抗体，或结合IgA、IgG和IgM的抗体的混合物(见图1和图2)。当检测或定量一种或多种细胞因子以及SARS-CoV-2抗体时，可以使用对所选的一种或多种细胞因子具有特异性的标记的抗体来检测一种或多种细胞因子的存在或定量。可以在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育和洗涤。各个测定的特性通过染色珠的荧光特征确定，而细胞因子或抗原捕获的抗体的数量通过附着的标记的抗Ig的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各涂覆的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

第三方面提供了一种被鉴定为形式C的免疫测定，用于检测SARS-CoV-2总抗体，以及，任选地，一种或多种细胞因子。在该免疫测定中，固体支持物(例如，可通过不同的荧光染料/特征相互区分的荧光标记的珠(也称为染色珠))可以包被蛋白质抗原(例如，刺突(S)、S1、S1蛋白质的RBD部分、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段)，以及，任选地，一种或多种细胞因子，如上所述的单独或不同的组合，将包被的一种或多种固体支持物与患者样品组合，例如，疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样本。孵育后，未结合的样品被洗去，可将对各类免疫球蛋白具有特异性的生物素化蛋白质(例如，对各类抗体(IgM、IgA和IgG)具有特异性的生物素化抗体，或与IgG抗体结合的生物素化蛋白A或G)添加至洗过的珠并进行孵育。当检测或定量一种或多种细胞因子以及SARS-CoV-2总抗体时，可以使用对所选的一种或多种细胞因子具有特异性的生物素化抗体来检测一种或多种细胞因子的存在或定量。然后洗去未结合的生物素化蛋白质，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以便检测总结合抗体(图3)。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(蛋白质或细胞因子包被的珠)通过染色珠的荧光特征确定，而被包被蛋白质捕获的选定的细胞因子和抗体的总量通过结合至生物素化的抗体的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

第四方面提供了一种被鉴定为形式D的免疫测定，用于检测SARS-CoV-2抗原，以及，任选地，一种或多种细胞因子。在这方面，固体支持物上包被有结合选定的抗原(例如，刺突(S)、S1、S1蛋白的RBD部分、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段)的单克隆和/或多克隆抗体，以及，任选地，对一种或多种细胞因子具有特异性的单克隆和/或多克隆抗体。抗体涂覆的一种或多种固体支持物，例如荧光标记的珠(也称为染色珠)，可以通过不同的荧光染料/特征来区分彼此)可以与患者样品组合，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品。孵育后，洗去未结合的样品，然后加入各个选定的抗原的生物素化抗体，任选地，加入一种或多种细胞因子，使其孵育。生物素化的抗体结合至抗体结合的蛋白质和/或细胞因子(当被测定时)。然后洗去未结合的生物素化抗体，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以便检测总结合蛋白质(图4)。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(抗体包被的珠)通过染色珠的荧光特征确定，而包被的抗体捕获的抗原总数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。在某些实施方式中，形式D免疫测定可与形式C的抗体测定组合，通过组合形式C和形式D的珠的亚群，并使用为各个形式设定的适当检测试剂。

另一种适合检测SARS-CoV-2抗原的形式在图5中说明。在这种形式中，包含SARS-CoV-2结构蛋白的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD、N蛋白和S2抗原的珠的三个亚群)与固定了SARS-CoV-2抗原的特异性抗体的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD的特异性抗体的珠亚群)混合。每个珠亚群都被荧光标记，以便通过不同的荧光染料/特征区分彼此。珠的混合物可以与患者样品组合，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品。孵育后，未结合的样品被洗去，加入对应于固定在各个珠亚群上的SARS-CoV-2抗原的生物素化的SARS-CoV-2抗原和选定的SARS-CoV-2抗原的生物素化抗体，允许孵育。生物素化的抗体结合至固定在SARS-CoV-2特异性抗体的珠上的SARS-CoV-2抗原，生物素化的抗原结合至与固定在选定珠亚群上的抗原结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化抗体和未结合的生物素化SARS-CoV-2抗原，并加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测样品中存在的总结合抗体和选定抗原(图5)。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(抗体或抗原包被的珠)通过染色珠的荧光特征确定，包被的抗体捕获的总抗原数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定，同样地，样品中的抗原也通过荧光检测。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

另一种适合检测SARS-CoV-2抗原的形式在图6中说明。在这种形式中，包含SARS-CoV-2蛋白的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD、N蛋白和S2抗原的珠的三个亚群)与固定了SARS-CoV-2抗原的特异性抗体的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD的特异性抗体的珠亚群)混合。每个珠亚群都被荧光标记，以便通过不同的荧光染料/特征区分彼此。珠的混合物可以与患者样品组合，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品。孵育后，未结合的样品被洗去，加入对应于固定在各个珠亚群上的SARS-CoV-2抗原的生物素化的SARS-CoV-2抗原和选定的SARS-CoV-2抗原的生物素化抗体，允许孵育。生物素化的抗体结合至固定在SARS-CoV-2特异性抗体的珠上的SARS-CoV-2抗原，生物素化的抗原结合至与固定在选定珠亚群上的抗原结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化抗体和未结合的生物素化SARS-CoV-2抗原，并加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测样品中存在的总结合抗体并鉴定选定的抗原(图6)。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(抗体或抗原包被的珠)通过染色珠的荧光特征确定，包被的抗体捕获的总抗原数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定，同样地，样品中的抗原也通过荧光检测。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

另一种适合检测SARS-CoV-2抗原的形式在图7中说明。在这种形式中，包含SARS-CoV-2抗原的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD、N蛋白和S2抗原的珠的三个亚群)与珠的一个或多个亚群混合，选自IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α的一种或多种细胞因子的特异性抗体被固定于所述珠亚群(例如，固定了IL-6特异性抗体的珠亚群)。每个珠亚群都被荧光标记，以便通过不同的荧光染料/特征区分彼此。珠的混合物可以与患者样品组合，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品。孵育后，未结合的样品被洗去，加入对应于固定在各个珠亚群上的SARS-CoV-2抗原的生物素化的SARS-CoV-2抗原和选定的各个细胞因子或趋化因子的生物素化抗体，允许孵育。生物素化的抗体结合至细胞因子或趋化因子，所述细胞因子或趋化因子结合至固定了细胞因子或趋化因子的特异性抗体的珠，生物素化的抗原结合至与固定在选定珠亚群上的抗原结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化抗体和未结合的生物素化SARS-CoV-2抗原，并加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测样品中存在的总结合抗体并鉴定选定的抗原(图7)。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(抗体或抗原包被的珠)通过染色珠的荧光特征确定，包被的抗体捕获的总抗原数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定，同样地，样品中的抗原也通过荧光检测。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

另一方面，提供了一种检测SARS-CoV-2抗原和一种或多种细胞因子的免疫测定，所述一种或多种细胞因子选自：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。在这方面，固体支持物(珠)的一个或多个亚群包被有单克隆和/或多克隆抗体，所述抗体结合选定的抗原(例如，刺突(S)、S1、S1蛋白的RBD部分、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段)和选定用于检测/量化的细胞因子。在这种形式中，包含SARS-CoV-2抗原的珠的一个或多个亚群(例如，固定了RBD、N蛋白和S2抗原的珠的三个亚群)与珠的一个或多个亚群混合，选自IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α的一种或多种细胞因子的特异性抗体被固定于所述珠亚群(例如，固定了IL-6特异性抗体的珠亚群)。每个珠亚群都被荧光标记，以便通过不同的荧光染料/特征区分彼此。珠的混合物可以与患者样品组合，例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品。孵育后，未结合的样品被洗去，加入各个选定的细胞因子或趋化因子的生物素化抗体，以及对于各个相应的珠亚群上存在的选定的SARS-CoV-2抗原特异性的生物素抗体，允许孵育。生物素化抗体与结合至珠的细胞因子结合，细胞因子特异性抗体被固定在珠上，选定的SARS-CoV2抗原的特异性生物素化抗体与结合在珠的SARS-CoV2抗原结合，该珠上固定有SARS-CoV2抗原的特异性抗体。然后洗去未结合的生物素化抗体和未结合的生物素化SARS-CoV-2抗原，并加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测和鉴定样品中存在的细胞因子和选定的SARS-CoV2抗原。在使用BioPlex 2200、Bioplex 200或Luminex平台(例如LX-200、Magpix、Flexmap 360等)进行检测前对反应进行孵育然后洗涤。各个测定的特性(细胞因子或SARS-CoV-2抗原)通过染色珠的荧光特征确定，而捕获的总抗原和细胞因子的数量由结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。各包被的蛋白质的结果可以单独报告，作为一组或一些类型的预定义算法或其任何组合。

如上所述，本公开的各个免疫测定可以利用SARS-CoV-2刺突(S)、S1、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段(例如，S1蛋白的RBD)作为分析物。在上下文中，任何特定SARS-CoV-2蛋白的片段可包含约5至约50、约10至约40、约15至约30、约20、约10或约5个氨基酸。在其他实施方式中，SARS-CoV-2蛋白的片段的长度范围为该蛋白的5个氨基酸至(n-1)个连续氨基酸，其中n是特定SARS-CoV-2蛋白的总长度。因此，对于核衣壳，片段范围为核衣壳的5至418个连续氨基酸。对于刺突蛋白，片段长度在5到1272个连续氨基酸之间。在一个实施方式中，刺突蛋白的片段横跨刺突蛋白序列的氨基酸13-1213。在另一实施方式中，片段是S1蛋白的RBD或RBD的片段。对于S1蛋白(所公开的刺突蛋白长度的氨基酸13-685)，片段是S1序列的5到672个连续氨基酸。对于S2蛋白(所公开的刺突蛋白的氨基酸686-1273)，片段长度是5到588个连续氨基酸长度。对于包膜蛋白，片段范围为包膜蛋白的5至94个连续氨基酸。对于膜蛋白，片段范围为包膜蛋白的5至221个连续氨基酸。对于本领域技术人员而言显而易见的是，不同长度的特定蛋白质的片段可以偶联/固定至特定的固体支持物上(例如，固体支持物1可以包含相同长度、不同长度或不同长度的组合的蛋白质片段)。

SARS-CoV-2核蛋白(419AA MW 45626；也称为“N”蛋白或核衣壳蛋白)

MSDNGPQNQRNAPRITFGGPSDSTGSNQNGERSGARSKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEDLKFPRGQGVPINTNSSPDDQIGYYRRATRRIRGGDGKMKDLSPRWYFYYLGTGPEAGLPYGANKDGIIWVATEGALNTPKDHIGTRNPANNAAIVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRNSSRNSTPGSSRGTSPARMAGNGGDAALALLLLDRLNQLESKMSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKAYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQELIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYTGAIKLDDKDPNFKDQVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKADETQALPQRQKKQQTVTLLPAADLDDFSKQLQQSMSSADSTQA(SEQ ID NO:1)

SARS-CoV-2刺突蛋白(1273AA MW 141178)

SARS-CoV-2S1蛋白(AA 13-685)

SARS-CoV-2S2蛋白(AA 686-1273)

MFVFLVLLPLVSS/QCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSS VLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRRAR/SVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDKVEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ IDNO:2)

SARS-CoV-2包膜(AA1-75)

MYSFVSEETGTLIVNSVLLFLAFVVFLLVTLAILTALRLCAYCCNIVNVSLVKPSFYVYSRVKNLNSSRVPDLLV(SEQ ID NO:3)

SARS-CoV-2膜(AA1-222)

MADSNGTITVEELKKLLEQWNLVIGFLFLTWICLLQFAYANRNRFLYIIKLIFLWLLWPVTLACFVLAAVYRINWITGGIAIAMACLVGLMWLSYFIASFRLFARTRSMWSFNPETNILLNVPLHGTILTRPLLESELVIGAVILRGHLRIAGHHLGRCDIKDLPKEITVATSRTLSYYKLGASQRVAGDSGFAAYSRYRIGNYKLNTDHSSSSDNIALLVQ(SEQ ID NO:4)

>QJF75467.1表面糖蛋白[严重急性呼吸***综合征冠状病毒2]

SARS-CoV-2刺突蛋白(1273AA MW 141178)

SARS-CoV-2S1蛋白(AA 13-685)

SARS-CoV-2S2蛋白(AA 686-1273)

MFVFLVLLPLVSSQCVNLTTRTQLPPAYTNSFTRGVYYPDKVFRSSVLHSTQDLFLPFFSNVTWFHAIHVSGTNGTKRFDNPVLPFNDGVYFASTEKSNIIRGWIFGTTLDSKTQSLLIVNNATNVVIKVCEFQFCNDPFLGVYYHKNNKSWMESEFRVYSSANNCTFEYVSQPFLMDLEGKQGNFKNLREFVFKNIDGYFKIYSKHTPINLVRDLPQGFSALEPLVDLPIGINITRFQTLLALHRSYLTPGDSSSGWTAGAAAYYVGYLQPRTFLLKYNENGTITDAVDCALDPLSETKCTLKSFTVEKGIYQTSNFRVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVXNATRFASVYAWXRKRISNCVADYSXLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIXWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRXSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGXEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGLTGTGVLTESNKKFLPFQQFGRDIADTTDAVRDPQTLEILDITPCSFGGVSVITPGTNTSNQVAVLYQDVNCTEVPVAIHADQLTPTWRVYSTGSNVFQTRAGCLIGAEHVNNSYECDIPIGAGICASYQTQTNSPRXAXSVASQSIIAYTMSLGAENSVAYSNNSIAIPTNFTISVTTEILPVSMTKTSVDCTMYICGDSTECSNLLLQYGSFCTQLNRALTGIAVEQDKNTQEVFAQVKQIYKTPPIKDFGGFNFSQILPDPSKPSKRSFIEDLLFNKVTLADAGFIKQYGDCLGDIAARDLICAQKFNGLTVLPPLLTDEMIAQYTSALLAGTITSGWTFGAGAALQIPFAMQMAYRFNGIGVTQNVLYENQKLIANQFNSAIGKIQDSLSSTASALGKLQDVVNQNAQALNTLVKQLSSNFGAISSVLNDILSRLDXXEAEVQIDRLITGRLQSLQTYVTQQLIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQSAPHGVVFLHVTYVPAQEKNFTTAPAICHDGKAHFPREGVFVSNGTHWFVTQRNFYEPQIITTDNTFVSGNCDVVIGIVNNTVYDPLQPELDSFKEELDKYFKNHTSPDVDLGDISGINASVVNIQKEIDRLNEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKWPWYIWLGFIAGLIAIVMVTIMLCCMTSCCSCLKGCCSCGSCCKFDEDDSEPVLKGVKLHYT(SEQ ID NO:5)

本发明提供的替代性方法还利用变体SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，任选地，与野生型刺突(S)、S1、RBD、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段组合，用于检测从对象获得的生物样品中的抗体。当这些方法寻求区分接种疫苗的个体和感染的个体时，如上所述，免疫测定法包括核衣壳蛋白已经固定其上的基材。变体SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段包括刺突蛋白变体及其片段，其包含下文表1-3中所列的突变，包括包含SEQ ID NO:2或5中任一个的氨基酸的319-541的变体RBD片段。所公开的SARS-CoV-2变体刺突蛋白的片段是给定的SARS-CoV-2刺突蛋白变体的5至(n-1)的连续氨基酸。在各种情况下，刺突蛋白变体的片段将在其连续氨基酸范围内包括与突变体刺突蛋白相关的氨基酸突变(在表1、表2和表3中鉴定)。氨基酸突变的编号与表1-2的SEQ ID NO:2或5中的氨基酸编号有关。在本发明的范围内还有多种SARS-CoV-2变体(如B.1.1.7、B.1.351、P.1和其他已知SARS-CoV-2变体)的刺突蛋白序列及其片段，包括RBD序列。这些刺突蛋白变体的序列可以在公共数据库中获得。表3还提供了与这些变体相关的氨基酸突变，相对于野生型序列(SEQ ID NO:2)。

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对于位于位置683、685、986和987的氨基酸突变，刺突蛋白变体或其片段可以存在2、3或4个氨基酸突变的任意组合。在某些实施方式中，刺突蛋白变体或其片段内存在三个或所有四个氨基酸突变。因此，可以固定在固体支持物上的刺突蛋白变体的片段是S1的片段，并且长度可以在5-685个连续氨基酸之间，前提是该片段包括表1或2或3中鉴定的一个或多个氨基酸取代(例如，SEQ ID NO:5或6的氨基酸13-685或氨基酸319-541)。优选的实施方式提供刺突蛋白变体或其片段，其包含如表1和2或表3中鉴定的刺突变体中鉴定的单个氨基酸取代。长度或片段可包括或排除经加工的信号肽(例如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的氨基酸2-12)。在一些实施方式中，SEQ ID NO:5的354位的氨基酸是Asx(天冬氨酸或天冬酰胺)。因此，SEQ ID NO:5的刺突蛋白变体可以包含位于354位的天冬氨酸或天冬酰胺，以及表1和表2中鉴定的一个或多个其他突变(即在第342、367、435、458、483、683、685、986和/或987位)。因此，在刺突蛋白变体的情况下，长度可以包括或排除蛋白质的信号肽。在多个实施方式中，在本公开的方法的实践中利用的刺突蛋白变体片段包括S1、S2和本文公开的RBD变体片段。还有其他实施方式提供了，S1、S2和RBD中的至少一个是刺突蛋白变体，S1、S2和RBD中的至少一个是不含氨基酸突变的刺突蛋白的片段。

在多个其他实施方式中，所公开的各个免疫测定可以利用三聚体化SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、三聚体化变体SARS-CoV-2刺突(S)蛋白、S1、S2、包膜(E)、核衣壳(N)和/或膜(M)蛋白或其片段(例如，S1蛋白的RBD)作为分析物，并且可以如上所述固定在珠上。可以从商业供应商(例如，艾美捷技术公司(Icosagen Technologies,Inc.),加利福尼亚旧金山或爱沙尼亚；百普赛斯生物科技公司(ACROBiosystems,Inc.),特拉华州纽瓦克；或在以下网站可及的其他供应商：

antibodies-online.com/areas/infectious-disease/covid-19/sars-cov-2-proteins)获得三聚体化SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和三聚体化变体SARS-CoV-2刺突(S)蛋白。或者，SARS-CoV-2刺突(S)蛋白和/或三聚体化的变体SARS-CoV-2刺突(S)蛋白或可以由公开的刺突蛋白利用三聚体化结构域构建。在一些实施方式中，刺突S1和S2之间的弗林蛋白酶裂解(RRAR)位点可以被突变以防止S1和S2结构域之间的裂解。

本公开，因此，提供以下非限制性实施方式：

1.一种包含至少两种SARS-CoV-2蛋白或其片段的基材，其选自下组：刺突(S)和/或其片段、S1和/或其片段(例如S1的RBD或其片段)、S2和/或其片段、包膜(E)和/或其片段、核衣壳(N)和/或其片段和/或膜(M)蛋白和/或其片段及其组合，所述蛋白质和/或其片段被固定在所述基材上。

2.如实施方式1所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

3.如实施方式1或2所述的基材，其中，所述基材是颗粒或珠。

4.根据实施方式3所述的基材，其中所述基材是包含两个或更多独立的颗粒或珠的亚群的颗粒或珠的群体，各个颗粒或珠的亚群可通过特异性可检测参数进行区分，各个珠亚群包含固定在其上的不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段。

5.如实施方式4所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

a)刺突(S)和/或其片段固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1和/或其片段固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2和/或其片段固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；

d)包膜(E)蛋白和/或其片段固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上；

e)核衣壳(N)和/或其片段固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上；和

f)膜(M)蛋白和/或其片段固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上；

6.如实施方式5所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含2、3、4、5或6个颗粒或珠的亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

7.如实施方式4-6中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料、荧光团、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

8.如实施方式7所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

9.一种用于检测哺乳动物中抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包括实施方式1-8中任一项所述的基材的基材接触，并且检测与固定在所述基材表面上的SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体的存在与否。

10.如实施方式9所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

11.一种包含特异性地结合至SARS-CoV-2蛋白或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段的基材，所述SARS-CoV-2蛋白或其片段选自下组：刺突(S)和/或其片段、S1和/或其片段(例如S1的RBD或其片段)、S2和/或其片段、包膜(E)和/或其片段、核衣壳(N)和/或其片段和/或膜(M)蛋白和/或其片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在所述基材上。

12.如实施方式11所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

13.如实施方式11或12所述的基材，其中，所述基材是颗粒或珠。

14.根据实施方式13所述的基材，其中所述基材是包含两个或更多独立的颗粒或珠的亚群的颗粒或珠的群体，各个颗粒或珠的亚群可通过特异性可检测参数进行区分，各个珠的亚群包含固定的结合至不同的SARS-CoV-2蛋白质或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段。

15.如实施方式14所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

a)特异性地结合刺突(S)和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)特异性地结合S1和/或其片段(例如S1的RBD或其片段)的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)特异性地结合S2和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；

d)特异性地结合包膜(E)蛋白和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上；

e)特异性地结合核衣壳(N)和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上；和

f)特异性地结合膜(E)蛋白和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上。

16.如实施方式15所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含2、3、4、5或6个颗粒或珠的亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

17.如实施方式14-16中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

18.如实施方式17所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

19.一种检测哺乳动物中SARS-CoV-2感染的方法，包括从该哺乳动物获得生物样品，使所述生物样品与根据实施方式11-18中任一项所述的基材接触，并检测所述生物样品中是否存在结合至固定在所述基材表面的抗体的SARS-CoV-2蛋白或其片段。

20.如实施方式19所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

21.如实施方式20所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

22.如实施方式9-10中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗免疫球蛋白(抗Ig)抗体，所述抗体用荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂或放射性同位素可检测地标记。

23.如实施方式22所述的方法，其中，所述抗-Ig抗体被对各类免疫球蛋白具有特异性的荧光团可检测地标记，并且将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量的结果。

24.如实施方式9-10中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与可检测标记的生物素结合配体接触。

25.如实施方式24所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

26.根据实施方式19-21中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触各个不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段的特异性生物素化抗体，以及使结合至所述基材的SARS-CoV-2蛋白或其片段的所述生物素化抗体与可检测标记的生物素结合配体接触，并确定基材的荧光强度。

27.如实施方式26所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

28.根据实施方式9-10或22-25中任一项所述的方法，所述方法包括将生物样品与根据实施方式11-18中任一项所述的基材接触，并检测所述生物样品中是否存在结合至固定在所述基材表面的抗体的SARS-CoV-2蛋白或其片段。

29.根据实施方式19-21或26-27中任一项所述的方法，所述方法包括将生物样品与根据实施方式1-8中任一项所述的基材接触，并检测是否存在结合至固定在所述基材表面的SARS-CoV-2蛋白质或其片段的抗体。

30.一种包含颗粒或珠群体的基材，该颗粒或珠群体包括两个或更多独立的颗粒或珠的亚群，各个颗粒或珠亚可通过特异性可检测参数进行区分，各个珠的亚群包括固定化的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，其结合至不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段或选自以下的细胞因子：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。

31.如实施方式30所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

e)特异性地结合核衣壳(N)和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上；

f)特异性地结合膜(E)蛋白和/或其片段的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上；

g)特异性地结合IL-1β的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第七特异性可检测物理参数的第七颗粒或珠上；

h)特异性地结合IFN-γ的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第八特异性可检测物理参数的第八或珠上；

i)特异性地结合IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第九特异性可检测物理参数的第九颗粒或珠上；

j)特异性地结合单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十特异性可检测物理参数的第十颗粒或珠上；

k)特异性地结合IL-4的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十一特异性可检测物理参数的第十一颗粒或珠上；

l)特异性地结合IL-10的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十二特异性可检测物理参数的第十二颗粒或珠上；

m)特异性地结合IL-2R的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十三特异性可检测物理参数的第十三颗粒或珠上；

n)特异性地结合IL-6的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十四特异性可检测物理参数的第十四颗粒或珠上；

o)特异性地结合粒细胞集落刺激因子(G-CSF)的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十五特异性可检测物理参数的第十五颗粒或珠上；

p)特异性地结合巨噬细胞炎性蛋白-1A的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十六特异性可检测物理参数的第十六颗粒或珠上；和

q)特异性地结合TNF-α的单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段或多克隆抗体或其抗原结合片段被固定在具有第十七特异性可检测物理参数的第十七颗粒或珠上。

32.如实施方式31所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个颗粒或珠的亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

33.如实施方式30-32中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

34.如实施方式33所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

35.如实施方式30-34中任一项所述的基材，其中，所述颗粒或珠是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

36.一种检测哺乳动物中SARS-CoV-2感染的方法，其包括从该哺乳动物获得生物样品，将所述生物样品与根据实施方式30-35中任一项的基材接触，并检测在所述生物样品中与固定在所述底物表面的抗体结合的SARS-CoV-2蛋白或其片段是否存在，以及，任选地，检测细胞因子是否存在，所述细胞因子选自下述：IL-1β，IFN-γ，IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)，IL-4，IL-10，IL-2R，IL-6，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。

37.如实施方式36所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

38.如实施方式37所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

39.根据实施方式36-38中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触各个不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段的特异性生物素化抗体，以及，任选地，各个所选的细胞因子的特异性生物素化抗体，和使结合至SARS-CoV-2蛋白或其片段的所述生物素化抗体与，当测定时，用结合至可检测标记的生物素-结合配体的所述基材的各个选定的细胞因子的特异性抗体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

40.如实施方式39所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

41.一种包含颗粒或珠群体的基材，该颗粒或珠群体包括两个或更多独立的颗粒或珠的亚群，各个颗粒或珠亚可通过特异性可检测参数进行区分，各个珠的亚群包含固定于其上的、不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段，或选自以下的细胞因子的特异性抗体：IL-1β、IFN-γ、IFNγ诱导型蛋白10(IP-10)、单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、IL-4、IL-10、IL-2R、IL-6、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬细胞炎症蛋白-1A和TNF-α。

42.如实施方式41所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

b)S1和/或其片段(例如S1的RBD或其片段)固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

e)核衣壳(N)和/或其片段固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上；

43.如实施方式42所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16或17个颗粒或珠的亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

44.如实施方式41-43中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

45.如实施方式44所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

46.如实施方式41-45中任一项所述的基材，其中，所述颗粒或珠是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

47.一种用于检测哺乳动物中SARS-CoV2抗体和，任选地，细胞因子的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包含实施方式41-46中任一项所述的基材的生物样品接触，并且检测与SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体的存在与否，以及，任选地，检测细胞因子的存在与否。

48.如实施方式47所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

49.如实施方式47-48中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗免疫球蛋白(抗Ig)抗体，和任选地，用荧光染料(荧光团)、发光剂、电子致密试剂或放射性同位素可检测标记的细胞因子特异性抗体。

50.如实施方式49所述的方法，其中，在测定时，所述抗-Ig抗体用对各类免疫球蛋白具有特异性的荧光团和对各细胞因子具有特异性的荧光团可检测地标记，并且将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量的结果。

51.如实施方式47-48中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体和细胞因子特异性抗体，在测定时，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与用荧光团可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

52.如实施方式51所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

53.如实施方式36-40或47-52中任一项所述的方法，其中所述方法测定一种或多种所述细胞因子的存在和/或定量。

54.如实施方式53所述的方法，其中，所述一种或多种细胞因子是IL-6和/或IL-2R。

55.如实施方式53所述的方法，其中，所述一种或多种细胞因子选自：IL-6、IL-2R、粒细胞集落刺激因子、IP-10、MCP-1、巨噬细胞炎性蛋白-1A、TNF-α及其组合。

56.如实施方式1-8中任一项所述的基材，其中，所述颗粒或珠的四个或更多个独立的亚群的群体包括：

a)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和

d)核衣壳(N)固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上。

57.一种区分感染了SARS-CoV-2的哺乳动物和疫苗接种了刺突蛋白疫苗的哺乳动物的方法，包括从哺乳动物获得生物样品，将所述生物样本与基材接触，和检测存在或不存在与固定在基材上的SARS-CoV-2核衣壳结合的抗体，任选地，检测存在或不存在细胞因子，

其中所述基材包括四个或更多独立的颗粒或珠的亚群的群，所述亚群选自：

58.如实施方式57所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

59.如实施方式57-58中任一项所述的方法，其中所述检测包括使与所述生物样品接触的所述基材与具有可检测的标记的抗-免疫球蛋白(抗-Ig)抗体接触。

60.如实施方式59所述的方法，其中所述方法通过测量各个珠亚群捕获的抗体的量，通过各个珠亚群上附接的带标记的抗-Ig的强度，来量化生物样品中的抗体量。

61.如实施方式60所述的方法，其中所述标记的抗-Ig用荧光标记物标记，各个颗粒或珠的亚群的身份由染色珠的荧光特征确定，而抗原捕获的抗体量由附接的带标记的抗-Ig的荧光强度确定。

62.如实施方式61所述的方法，其中将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

63.如实施方式57-58中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与用荧光团可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

64.如实施方式63所述的方法，其中将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

65.一种包含至少两种SARS-CoV-2蛋白或其片段的基材，其选自下组：刺突蛋白(S)和/或其片段、S1和/或其片段、RBD或其片段、S2和/或其片段、刺突蛋白(S)和/或其片段、S1蛋白变体和/或其片段、RBD变体或其片段、S2蛋白变体和/或其片段、包膜(E)和/或其片段、核衣壳(N)和/或其片段和/或膜(M)蛋白和/或其片段及其组合，所述蛋白质和/或其片段被固定在所述基材上，其中：

所述基材是包含两个或更多独立的颗粒或珠的亚群的颗粒或珠的群体，各个颗粒或珠的亚群通过特异性可检测参数进行区分；

各个颗粒或珠的亚群包含不同的SARS-CoV-2蛋白质或其片段固定其上；和

至少一个颗粒或珠的亚群包含选自下组的SARS-CoV-2蛋白质变体：刺突蛋白变体和/或其片段、S1蛋白变体和/或其片段、RBD变体或其片段、S2蛋白变体和/或其片段。

66.如实施方式65所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

67.如实施方式65或66所述的基材，其中，所述颗粒或珠的群体包含至少2或3个颗粒或珠的亚群，各亚群包含不同的固定于其上的SARS-CoV-2蛋白变体。

68.根据实施方式65或66所述的基材，其中所述基材是包含两个或更多独立的颗粒或珠的亚群的颗粒或珠的群体，各个颗粒或珠的亚群可通过特异性的可检测参数进行区分，各个珠亚群包含固定在其上的不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段，和至少一个包含SARS-CoV-2蛋白变体的颗粒或珠的亚群，所述SARS-CoV-2蛋白变体选自下组：刺突蛋白变体和/或其片段、S1蛋白变体和/或其片段、RBD变体和/或其片段、S2蛋白变体和/或其片段。

69.如实施方式65-68所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多个独立的亚群：

a)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上的突变V367X，其中X是任何氨基酸或X是F；

b)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上的突变F342X，其中X是任何氨基酸或X是L；

c)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上的突变A435X，其中X是任何氨基酸或X是S；

d)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上的突变K458X，其中X是任何氨基酸或X是R；

e)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上的突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

f)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上的突变V483X，其中X是任何氨基酸或X是A；

g)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第七特异性可检测物理参数的第七颗粒或珠上的突变N354X，其中X是任何氨基酸或X是D；

h)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第八特异性可检测物理参数的第八颗粒或珠上的突变R683X1和/或R685X2，其中X1和X2是任何氨基酸或X1和X2是A；

i)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第九特异性可检测物理参数的第九颗粒或珠上的突变K986X3和/或V987X4，其中X3和X4是任何氨基酸或X3和X4是P；

j)SARS-CoV-2刺突蛋白变体或其片段，其包含固定在具有第十特异性可检测物理参数的第十颗粒或珠上的突变R683X1、R685X2、K986X3和V987X4，其中X1是任何氨基酸或X1是A；X2是任何氨基酸或X2是A；X3是任何氨基酸或X3是P；X4是任何氨基酸或X4是P；

k)SARS-CoV-2刺突蛋白(SEQ ID NO:2)或其片段，其固定在具有第十一特异性可检测物理参数的第十一颗粒或珠上；

l)SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，来源于SARS-CoV-2变体B.1.1.7，其固定在具有第十二特异性可检测物理参数的第十二颗粒或珠上；

m)SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，来源于SARS-CoV-2变体B.10.351.7，其固定在具有第十三第十一特异性可检测物理参数的第十三颗粒或珠上；和/或

n)SARS-CoV-2刺突蛋白或其片段，来源于SARS-CoV-2变体P.1，其固定在具有第十四特异性可检测物理参数的第十四颗粒或珠上，

其中该突变是相对于SEQ ID NO:2的氨基酸编号。

70.如实施方式70所述的基材，其中所述颗粒或珠的群体包括含有所述变体刺突蛋白的S1、S2和RBD片段的颗粒或珠的亚群。

71.根据实施方式69或70所述的基材，其中颗粒或珠的群体包括至少一个含有野生型S1、S2或RBD片段的颗粒或珠的亚群和至少一个含有所述变体刺突蛋白的S1、S2和RBD片段的颗粒或珠的亚群。

72.如实施方式71所述的基质，其中形成了刺突蛋白珠的组合群体，该群体包括含有一个或两个刺突蛋白的野生型S1、S2或RBD片段的所述颗粒或珠的亚群，以及含有一个或两个所述变体刺突蛋白的S1、S2和RBD片段的颗粒或珠的亚群，条件是刺突蛋白珠的组合群体是由包括野生型S1蛋白或S1变体的颗粒或珠的亚群、包括野生型S2蛋白或S2变体的颗粒或珠的亚群和包括野生型RBD蛋白或RBD变体的颗粒或珠的亚群构成。

73.如实施方式69-72中任一项所述的基材，其中，所述颗粒或珠群体包含颗粒或珠的2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个亚群，各亚群具有特异性可检测物理参数。

74.如实施方式68-73中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料、荧光团、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

75.如实施方式74所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

76.如实施方式65-68中任一项所述的基材，其中，所述颗粒或珠的群体包括四个或更多个独立的颗粒或珠的亚群包括：

a)变体刺突蛋白受体结合结构域(RBD)固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)变体S1固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)变体S2固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和

77.一种用于检测哺乳动物中抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包括实施方式65-76中任一项所述的基材的基材接触，并且检测与固定在所述基材表面上的SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体的存在与否。

78.如实施方式77所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

79.一种区分感染了SARS-CoV-2的哺乳动物和疫苗接种了刺突蛋白疫苗的哺乳动物的方法，包括从哺乳动物获得生物样品，将所述生物样本与基材接触，和检测存在或不存在与固定在基材上的SARS-CoV-2核衣壳结合的抗体，任选地，检测存在或不存在细胞因子，

a)所述刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或RBD变体固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1或其变体固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2或其变体固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和

d)核衣壳(N)固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上，条件是至少一个颗粒或珠的亚群提供RBD变体、S1变体或S2变体。

80.如实施方式77-79中任一项所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

81.如实施方式77-80中任一项所述的方法，其中所述检测包括使与所述生物样品接触的所述基材与具有可检测的标记的抗-免疫球蛋白(抗-Ig)抗体接触。

82.如实施方式81所述的方法，其中所述方法通过测量各个珠亚群捕获的抗体的量，通过各个珠亚群上附接的带标记的抗-Ig的强度，来量化生物样品中的抗体量。

83.如实施方式82所述的方法，其中所述标记的抗-Ig用荧光标记物标记，各个颗粒或珠的亚群的身份由染色珠的荧光特征确定，而抗原捕获的抗体量由附接的带标记的抗-Ig的荧光强度确定。

84.如实施方式83所述的方法，其中将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

85.如实施方式77-80中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与用荧光团可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

86.如实施方式85所述的方法，其中将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

实施例

实施例1-IgM/IgA血清学测量

使其中含有氨基酸13-685的S1片段，含有RBD的S1片段、N蛋白和S2抗原被固定在珠上的荧光标记的珠与患者样品(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品和样品稀释剂一起)接触。用含有抗-人IgG抗体的稀释剂稀释样品，以阻断人IgG与S1蛋白片段的结合，从而增加IgA或IgM的检测。孵育后，洗去未结合的样品，并加入标记的抗-人IgA和抗-人IgM抗体，以允许检测与固体支持物结合的样品中的抗体。在使用BioPlex2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并洗涤。SARS-CoV-2抗原捕获的抗体量通过附接的带标记的抗-IgA和抗-IgM的荧光强度确定，将样品荧光强度与一组标准品或校准品相比较，以生成定性、半定量或定量的结果。

实施例2-IgG血清学测量

使其中含有RBD的S1片段、N蛋白和S2抗原被固定在珠上的荧光标记的珠与患者样品(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品和样品稀释剂一起)接触。孵育后，洗去未结合的样品，并加入标记的抗-人IgG抗体，以允许检测与固体支持物结合的样品中的抗体。在使用BioPlex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并洗涤。SARS-CoV-2抗原捕获的抗体量通过附接的带标记的抗-IgG的荧光强度确定，将样品荧光强度与一组标准品或校准品相比较，以生成定性、半定量或定量的结果。

实施例3–总血清学反应测量

使含有其中S1的RBD(珠亚群1)、N蛋白(珠亚群2)和S2抗原(珠亚群3)与之固定的荧光标记珠的多个亚群的荧光标记珠的群体与患者样品(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品与样品稀释剂一起)接触。孵育后，未结合的样品被洗去，可将对各类免疫球蛋白具有特异性的生物素化蛋白质(例如，对各类抗体(IgM、IgA和IgG)具有特异性的生物素化抗体，或通用检测报告抗体)添加至洗过的珠并进行孵育。然后洗去未结合的生物素化蛋白质，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以便检测总结合抗体。在使用BioPlex 2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并随后洗涤。基材捕获的总抗体量通过与生物素化抗体结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。每个珠亚群捕获的总抗体量也可以通过测量与每个珠亚群相关的生物素化抗体结合的标记链霉亲和素的荧光强度来确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

实施例4–对SARS-CoV-2抗原及抗体的多重检测

荧光标记珠群体包含：1)荧光标记的珠的一个或多个亚群，其上固定有结合SARS-CoV-2RBD、N蛋白和S2抗原的单克隆和/或多克隆抗体；以及2)荧光标记的珠的一个或多个亚群，其上固定有RBD、N蛋白和S2抗原，使所述荧光标记珠群体与患者样品(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)合并。孵育后，洗去未结合的样品。将RBD、N蛋白和S2抗原的特异性生物素化抗体和生物素化的RBD、N蛋白和S2抗原加入至经洗涤的珠，并允许进行孵育。生物素化的抗体结合至与固定在各个相应的珠亚群上的抗体结合的RBD、N蛋白和S2抗原，而生物素化的RBD、N蛋白和S2抗原结合至与固定在相关珠亚群上的RBD、N蛋白和S2抗原蛋白结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化试剂，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测总结合免疫球蛋白和结合的SARS-CoV-2抗原。在使用BioPlex2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并随后洗涤。珠亚群的特性通过染色珠的荧光特征确定，而捕获的总抗原和抗体的数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

实施例5–对SARS-CoV-2抗体和IL-6的多重检测

荧光标记珠群体包含：1)荧光标记珠的亚群，其已固定有对IL-6具有特异性的抗体；和2)荧光标记珠的一个或多个亚群，其已固定有RBD、N蛋白和S2抗原，使所述荧光标记珠群体与患者样品(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)合并。孵育后，洗去未结合的样品。将对IL-6具有特异性的生物素化抗体和生物素化RBD、N蛋白和S2抗原添加至经洗涤的珠并允许进行孵育。生物素化的抗体结合至与其上已固定IL-6特异性抗体的珠结合的IL-6，而生物素化的RBD、N蛋白和S2抗原结合至与固定在相关珠亚群上的RBD、N蛋白和S2抗原蛋白结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化试剂，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测总结合免疫球蛋白和结合的SARS-CoV-2抗原。在使用BioPlex2200、Bio-Plex 200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并随后洗涤。珠亚群的特性通过染色珠的荧光特征确定，而捕获的IL-6和SARS-CoV2特异性抗体的数量和/或存在通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

实施例6–对SARS-CoV-2抗原和IL-6的多重检测

荧光标记珠群体包含：1)荧光标记的珠的一个或多个亚群，其上固定有结合SARS-CoV-2RBD、N蛋白和S2抗原的单克隆和/或多克隆抗体；以及2)荧光标记的珠的亚群，其上固定有IL-6的特异性单克隆和/或多克隆抗体，使所述荧光标记珠群体与患者样品组合(例如，来自疑似暴露于SARS-CoV-2病毒的个体的生物样品)合并。孵育后，洗去未结合的样品。将对IL-6具有特异性的生物素化抗体和生物素化RBD、N蛋白和S2抗原添加至经洗涤的珠并允许进行孵育。生物素化的抗体结合至与其相关珠亚群上已固定的抗体结合的IL-6，而生物素化的RBD、N蛋白和S2抗原结合至与固定在相关珠亚群上的RBD、N蛋白和S2抗原蛋白结合的抗体。然后洗去未结合的生物素化试剂，加入标记的链霉亲和素-PE(藻红蛋白)，以允许检测IL-6和结合的SARS-CoV-2抗原。在使用BioPlex 2200、Bio-Plex200或Luminex LX-200平台进行检测前，孵育反应并随后洗涤。珠亚群的特性通过染色珠的荧光特征确定，而捕获的总抗原和IL-6的数量通过结合的标记的链霉亲和素的荧光强度确定。将样品荧光强度与一组标准品或校准品的荧光强度进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

实施例7

对总计583个样品进行了抗SARS-COV2抗体和IgG抗体检测，所述样品包括483个入院正常(接受常规检查的对象的样品)和100个孕妇样品。所有测试的样品在2019年11月之前采集。核衣壳(N)的特异性抗体在表4中鉴定为“抗-NC IgG”。表4中提供的百分比指的是不包含SARS-CoV-2抗原特异性IgG的样品百分比。

表4.BioPlex 2200SARS-Cov-2 IgG测定特异性

¹对象经历了常规检查

实施例8

血清学测试的分析特异性是衡量其识别特异性抗体同时排除其他非特异性抗体能力的量度。交叉反应性指的是配体支持与非待测抗体结合并导致假阳性测试结果的能力。从32个患病组中收集的283个样品进行了交叉反应性RBD和S1抗原的测试。列表仅显示了两种分析物RBD和S1的交叉反应性。

表5：BioPlex 2200SARS-Cov-2 IgG测定：交叉反应性

/>

实施例9

来自COVID患者的578个独特样品购自商业供应商。在578个样品中，453个(78.4％)带有完整的人口统计数据和PCR检测结果。所有样品通过BioPlex 2200血清学IgG测定进行测试。收集了所有四种分析物(RBD、S1、S2和N(在表6和7中称为nCapsid))的血清学IgG数据。

表6：显示IgG的阳性样品的数量

表7：显示IgG的阳性样品的数量(表示为％)

实施例10-检测感染野生型和SARS-CoV2变体的患者的抗-RBD和抗-S1 IgG抗体

为了解决血清学IgG测定是否能检测到感兴趣的变体，对代表感兴趣变体的重组RBD和S1蛋白与COVID-19患者血清的结合进行了评估。对55名COVID-19阳性患者的血清进行了测试，以确定是否存在针对野生型和突变的蛋白的抗-RBD和抗-S1抗体。本研究中使用的RBD突变体包括N501Y和加州变体L452R，而S1突变体的代表是D614G、英国变体B1.1.7和南非变体S1。图8提供的框图显示了最小、最大和中位的IgG抗体水平(U/mL)，这是由它们与固定在磁珠表面的重组蛋白的反应性来衡量的。珠信号对每种蛋白质都是独立校准的，并处理成个体抗体指数(AI)值。变体L452R代表加利福尼亚变体。因此，图8显示了SARS-CoV2特异性IgG抗体对野生型和突变型刺突蛋白的反应性，与S1突变型蛋白相比，野生型和突变型RBD蛋白的抗体反应性更高。这些观察结果支持用血清学IgG测定检测针对野生型和突变型蛋白的IgG抗体。

通过分析WHO标准和参考组的血清反应性，进一步证明了血清学IgG测定可以与包含来自B.1.1.7(英国)、B.1.351(南非)和P1(巴西)的SARS-CoV2病毒的S1和S2结构域的三聚体刺突蛋白结合(见图9)。来自新出现的SARS-CoV2变体的三聚体蛋白表现出与WHO患者组血清的结合，支持血清学IgG检测在检测关注的变体(VOC)中COVID-19抗体的效用。

实施例11-检测感染SARS-CoV2的患者和疫苗接种个体的抗体

通过分析感染的和疫苗接种的个体的抗体情况，检验了血清学IgG测定(具有检测抗-RBD、抗-S1、抗-S2和抗核衣壳抗体的能力)成功区分天然感染和疫苗接种个体的能力。共有195名PCR阳性的SARS-CoV2患者和66名接种疫苗的对象被测试出存在抗核衣壳(核蛋白)抗体。195名COVID-19患者在症状出现后14至196天不等，66名辉瑞-生物技术公司和莫德纳mRNA疫苗接种对象在用疫苗首次免疫后10天至62天不等。评估了对象是否存在抗-RBD、抗-S1、抗-S2和抗-核衣壳抗体，结果见表8。如数据所示，大多数受感染的患者表现出抗-核衣壳(nCapsid)抗体，用辉瑞-生物技术公司和莫德纳mRNA疫苗接种的对象没有表现出抗-核衣壳(核蛋白)抗体。

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10.Juanjuan Zhao,Quan Yuan,Haiyan Wang,等2019年新型冠状病毒疾病患者对SARS-CoV-2的抗体反应(Antibody responses to SARS-CoV-2in patients of novelcoronavirus disease 2019.)2020年3月3doi:https://doi.org/10.1101/2020.03.02.20030189.

序列表

<110> 生物辐射实验室股份有限公司(BIO-RAD LABORATORIES, INC.)

<120> SARS-CoV-2免疫测定及其材料

<130> BRL.143C2XC1PCT

<150> US 63/021,628

<151> 2020-05-07

<150> US 63/032,541

<151> 2020-05-30

<150> US 63/114,675

<151> 2020-11-17

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 419

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(419)

<223> 核蛋白

<400> 1

Met Ser Asp Asn Gly Pro Gln Asn Gln Arg Asn Ala Pro Arg Ile Thr

1 5 10 15

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20 25 30

Ser Gly Ala Arg Ser Lys Gln Arg Arg Pro Gln Gly Leu Pro Asn Asn

35 40 45

Thr Ala Ser Trp Phe Thr Ala Leu Thr Gln His Gly Lys Glu Asp Leu

50 55 60

Lys Phe Pro Arg Gly Gln Gly Val Pro Ile Asn Thr Asn Ser Ser Pro

65 70 75 80

Asp Asp Gln Ile Gly Tyr Tyr Arg Arg Ala Thr Arg Arg Ile Arg Gly

85 90 95

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Leu Gly Thr Gly Pro Glu Ala Gly Leu Pro Tyr Gly Ala Asn Lys Asp

115 120 125

Gly Ile Ile Trp Val Ala Thr Glu Gly Ala Leu Asn Thr Pro Lys Asp

130 135 140

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145 150 155 160

Leu Pro Gln Gly Thr Thr Leu Pro Lys Gly Phe Tyr Ala Glu Gly Ser

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180 185 190

Ser Ser Arg Asn Ser Thr Pro Gly Ser Ser Arg Gly Thr Ser Pro Ala

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Gln Gln Gly Gln Thr Val Thr Lys Lys Ser Ala Ala Glu Ala Ser Lys

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275 280 285

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325 330 335

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<213> SARS-CoV-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

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<223> 刺突蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(685)

<223> SARS-CoV-2 S1蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (319)..(541)

<223> RBD结构域

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (686)..(1273)

<223> SARS-CoV-2 S2蛋白

<400> 2

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

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20 25 30

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145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

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850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

<210> 3

<211> 75

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(75)

<223> 包膜蛋白

<400> 3

Met Tyr Ser Phe Val Ser Glu Glu Thr Gly Thr Leu Ile Val Asn Ser

1 5 10 15

Val Leu Leu Phe Leu Ala Phe Val Val Phe Leu Leu Val Thr Leu Ala

20 25 30

Ile Leu Thr Ala Leu Arg Leu Cys Ala Tyr Cys Cys Asn Ile Val Asn

35 40 45

Val Ser Leu Val Lys Pro Ser Phe Tyr Val Tyr Ser Arg Val Lys Asn

50 55 60

Leu Asn Ser Ser Arg Val Pro Asp Leu Leu Val

65 70 75

<210> 4

<211> 222

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(222)

<223> 膜蛋白

<400> 4

Met Ala Asp Ser Asn Gly Thr Ile Thr Val Glu Glu Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Leu Glu Gln Trp Asn Leu Val Ile Gly Phe Leu Phe Leu Thr Trp Ile

20 25 30

Cys Leu Leu Gln Phe Ala Tyr Ala Asn Arg Asn Arg Phe Leu Tyr Ile

35 40 45

Ile Lys Leu Ile Phe Leu Trp Leu Leu Trp Pro Val Thr Leu Ala Cys

50 55 60

Phe Val Leu Ala Ala Val Tyr Arg Ile Asn Trp Ile Thr Gly Gly Ile

65 70 75 80

Ala Ile Ala Met Ala Cys Leu Val Gly Leu Met Trp Leu Ser Tyr Phe

85 90 95

Ile Ala Ser Phe Arg Leu Phe Ala Arg Thr Arg Ser Met Trp Ser Phe

100 105 110

Asn Pro Glu Thr Asn Ile Leu Leu Asn Val Pro Leu His Gly Thr Ile

115 120 125

Leu Thr Arg Pro Leu Leu Glu Ser Glu Leu Val Ile Gly Ala Val Ile

130 135 140

Leu Arg Gly His Leu Arg Ile Ala Gly His His Leu Gly Arg Cys Asp

145 150 155 160

Ile Lys Asp Leu Pro Lys Glu Ile Thr Val Ala Thr Ser Arg Thr Leu

165 170 175

Ser Tyr Tyr Lys Leu Gly Ala Ser Gln Arg Val Ala Gly Asp Ser Gly

180 185 190

Phe Ala Ala Tyr Ser Arg Tyr Arg Ile Gly Asn Tyr Lys Leu Asn Thr

195 200 205

Asp His Ser Ser Ser Ser Asp Asn Ile Ala Leu Leu Val Gln

210 215 220

<210> 5

<211> 1273

<212> PRT

<213> SARS-CoV-2

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(1273)

<223> 刺突蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (13)..(685)

<223> SARS-CoV-2 S1蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (319)..(541)

<223> RBD结构域

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (342)..(342)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (354)..(354)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (367)..(367)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (435)..(435)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (458)..(458)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (483)..(483)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (683)..(683)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (685)..(685)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (686)..(1273)

<223> SARS-CoV-2 S2蛋白

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (986)..(987)

<223> Xaa = 任何氨基酸

<400> 5

Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val

1 5 10 15

Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe

20 25 30

Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu

35 40 45

His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp

50 55 60

Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp

65 70 75 80

Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu

85 90 95

Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser

100 105 110

Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile

115 120 125

Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr

130 135 140

Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr

145 150 155 160

Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu

165 170 175

Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe

180 185 190

Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr

195 200 205

Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu

210 215 220

Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr

225 230 235 240

Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser

245 250 255

Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro

260 265 270

Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala

275 280 285

Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys

290 295 300

Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val

305 310 315 320

Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys

325 330 335

Pro Phe Gly Glu Val Xaa Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala

340 345 350

Trp Xaa Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Xaa Leu

355 360 365

Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro

370 375 380

Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe

385 390 395 400

Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly

405 410 415

Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys

420 425 430

Val Ile Xaa Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn

435 440 445

Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Xaa Ser Asn Leu Lys Pro Phe

450 455 460

Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys

465 470 475 480

Asn Gly Xaa Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly

485 490 495

Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val

500 505 510

Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys

515 520 525

Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn

530 535 540

Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu

545 550 555 560

Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val

565 570 575

Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe

580 585 590

Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val

595 600 605

Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile

610 615 620

His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser

625 630 635 640

Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val

645 650 655

Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala

660 665 670

Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Xaa Ala Xaa Ser Val Ala

675 680 685

Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser

690 695 700

Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile

705 710 715 720

Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val

725 730 735

Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu

740 745 750

Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr

755 760 765

Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln

770 775 780

Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe

785 790 795 800

Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser

805 810 815

Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly

820 825 830

Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp

835 840 845

Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu

850 855 860

Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly

865 870 875 880

Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile

885 890 895

Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr

900 905 910

Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn

915 920 925

Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala

930 935 940

Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn

945 950 955 960

Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val

965 970 975

Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Xaa Xaa Glu Ala Glu Val Gln

980 985 990

Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val

995 1000 1005

Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn

1010 1015 1020

Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys

1025 1030 1035

Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro

1040 1045 1050

Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val

1055 1060 1065

Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1070 1075 1080

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn

1085 1090 1095

Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln

1100 1105 1110

Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val

1115 1120 1125

Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro

1130 1135 1140

Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn

1145 1150 1155

His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn

1160 1165 1170

Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu

1175 1180 1185

Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1190 1195 1200

Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu

1205 1210 1215

Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met

1220 1225 1230

Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys

1235 1240 1245

Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro

1250 1255 1260

Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr

1265 1270

Claims

1.一种检测哺乳动物体内SARS-CoV2抗体，以及，任选地，细胞因子的方法，包括从哺乳动物获得生物样品，将所述生物样品与基材接触，并检测是否存在与SARS-CoV-2蛋白或其片段结合的抗体，以及，任选地，是否存在细胞因子，所述基材包括颗粒或珠的四个或更多独立的亚群的群体，其选自：

a)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的颗粒或珠的第一亚群上；

b)S1，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的颗粒或珠的第二亚群上；

c)S2，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的颗粒或珠的第三亚群上；和

d)核蛋白(N)，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的颗粒或珠的第四亚群上。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

3.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗免疫球蛋白(抗-Ig)抗体，以及，任选地，细胞因子特异性抗体，所述抗-Ig抗体和细胞因子特异性抗体是用荧光染料，荧光团、发光剂、电子致密试剂或放射性同位素可检测标记的。

4.如权利要求3所述的方法，其中，在测定时，所述抗-Ig抗体被对各类免疫球蛋白具有特异性的荧光团和对各细胞因子具有特异性的荧光团可检测地标记，并且将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量的结果。

5.如权利要求1-2中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体和细胞因子特异性抗体，在测定时，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与用荧光团可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

6.如权利要求5所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

7.如权利要求5所述的方法，其中所述方法测定一种或多种所述细胞因子的存在和/或定量。

8.一种包含至少两种SARS-CoV-2蛋白或其片段的基材，其选自下组：刺突(S)和/或其片段、S1和/或其片段、S2和/或其片段、包膜(E)和/或其片段、核蛋白(N)和/或其片段和/或膜(M)蛋白和/或其片段及其组合，所述蛋白质和/或其片段被固定在所述基材上。

9.如权利要求8所述的基材，其中，所述基材是玻璃、塑料、聚苯乙烯或硝酸纤维素。

10.如权利要求8-9所述的基材，其中，所述基材是颗粒或珠。

11.根据权利要求10所述的基材，其中所述基材是包含颗粒或珠的两个或更多独立的亚群的颗粒或珠的群体，颗粒或珠的各个亚群通过特异性的可检测参数可区分，珠的各个亚群包含固定在其上的不同的SARS-CoV-2蛋白或其片段。

12.如权利要求11所述的基材，其中，所述群体包含选自下述的颗粒或珠的两个或更多独立的亚群：

a)刺突(S)和/或其片段，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1和/或其片段，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2和/或其片段，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；

d)包膜(E)蛋白和/或其片段，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上；

e)核蛋白(N)和/或其片段，其固定在具有第五特异性可检测物理参数的第五颗粒或珠上；和

f)膜(M)蛋白和/或其片段，其固定在具有第六特异性可检测物理参数的第六颗粒或珠上。

13.如权利要求12所述的基材，其中所述颗粒或珠的群体包括颗粒或珠的两个、三个、四个、五个或六个亚群，各个亚群具有特异性的可检测物理参数，优选颗粒或珠的四个或更多个独立的亚群选自：a)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；b)S1，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；c)S2，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和d)核蛋白(N)，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上。

14.如权利要求11-13中任一项所述的基材，其中，所述特异性可检测物理参数是荧光染料、荧光团、发光剂、电子致密试剂、放射性同位素或粒径。

15.如权利要求14所述的基材，其中，所述特异性可检测参数是荧光团。

16.一种用于检测哺乳动物中抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包括权利要求8-15中任一项所述的基材的基材接触，并且检测与固定在所述基材表面上的SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体的存在与否。

17.如权利要求16所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

18.一种区分感染了SARS-CoV-2的哺乳动物和疫苗接种了刺突蛋白疫苗的哺乳动物的方法，包括从哺乳动物获得生物样品，将所述生物样品与基材接触，和检测与固定在基材上的SARS-CoV-2核蛋白结合的抗体的存在与否，任选地，检测细胞因子的存在与否，

所述基材包括颗粒或珠的四个或更多独立的亚群的群体，所述亚群选自：

a)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和

d)核蛋白(N)，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上。

19.如权利要求18所述的方法，其中，所述哺乳动物是人、非人类灵长类动物、犬科动物或猫科动物。

20.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中所述检测包括使与所述生物样品接触的所述基材与具有可检测的标记的抗-免疫球蛋白(抗-Ig)抗体接触。

21.如权利要求20所述的方法，其中所述方法通过测量各个珠亚群捕获的抗体的量，通过各个珠亚群上附接的带标记的抗-Ig的强度，来量化生物样品中的抗体量。

22.如权利要求21所述的方法，其中所述标记的抗-Ig用荧光标记物标记，颗粒或珠的各个亚群的身份由染色珠的荧光特征确定，而由抗原捕获的抗体量由附接的带标记的抗-Ig的荧光强度确定。

23.如权利要求22所述的方法，其中将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成定性、半定量或定量结果。

24.如权利要求18-19中任一项所述的方法，其中，所述检测包括使与所述生物样品接触的基材接触抗-Ig抗体，其经生物素化，并且使所述生物素化抗体与用荧光团可检测标记的生物素结合配体接触，并确定各个珠亚群的荧光强度。

25.如权利要求24所述的方法，将样品荧光强度与一组标准品或校准品进行比较，以生成与所述基材结合的总Ig的定性、半定量或定量结果。

26.一种区分感染了SARS-CoV-2的哺乳动物和疫苗接种了刺突蛋白疫苗的哺乳动物的方法，包括从哺乳动物获得生物样品，将所述生物样品与基材接触，和检测与固定在基材上的SARS-CoV-2核衣壳结合的抗体的存在与否，任选地，检测细胞因子的存在与否，

其中所述基材包括颗粒或珠的四个或更多独立的亚群的群体，所述亚群选自：

a)刺突蛋白受体结合结构域(RBD)或RBD变体，其固定在具有第一特异性可检测物理参数的第一颗粒或珠上；

b)S1或其变体，其固定在具有第二特异性可检测物理参数的第二颗粒或珠上；

c)S2或其变体，其固定在具有第三特异性可检测物理参数的第三颗粒或珠上；和

d)核衣壳(N)，其固定在具有第四特异性可检测物理参数的第四颗粒或珠上，条件是颗粒或珠的至少一个亚群提供RBD变体、S1变体或S2变体。

27.一种包含至少两种SARS-CoV-2蛋白或其片段的基材，其选自下组：刺突蛋白(S)和/或其片段、S1和/或其片段、RBD或其片段、S2和/或其片段、刺突蛋白(S)和/或其片段、S1蛋白变体和/或其片段、RBD变体或其片段、S2蛋白变体和/或其片段、包膜(E)和/或其片段、核衣壳(N)和/或其片段和/或膜(M)蛋白和/或其片段及其组合，所述蛋白质和/或其片段被固定在所述基材上，其中：

所述基材是包含颗粒或珠的两个或更多独立的亚群的颗粒或珠的群体，颗粒或珠的各个亚群通过特异性可检测参数可区分；

颗粒或珠的各个亚群包含固定于其上的不同的SARS-CoV-2蛋白质或其片段；和

颗粒或珠的至少一个亚群包含选自下组的SARS-CoV-2蛋白质变体：刺突蛋白变体和/或其片段、S1蛋白变体和/或其片段、RBD变体或其片段、S2蛋白变体和/或其片段。

28.一种用于检测哺乳动物中抗体的方法，其包括获得所述哺乳动物的生物样品，使所述生物样品与包括权利要求27所述的基材的基材接触，并且检测与固定在所述基材表面上的SARS-CoV-2蛋白质或其片段结合的抗体的存在与否。