ES2648899T3 - Inmunoensayo de cribado múltiplex - Google Patents

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Jean-Claude Manuguerra
Jessica VANHOMWEGEN
Philippe Despres
Sylvie Paulous
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Institut Pasteur de Lille
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Abstract

Método de ensayo in vitro para detectar por lo menos dos anticuerpos diana en una muestra biológica que comprende: (a) poner en contacto un primer soporte sólido que comprende un sustrato de AGT acoplado covalentemente a una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de AGT que presenta una actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa y un primer epítopo que es reconocido por un primer anticuerpo diana con la muestra biológica, en el que dicho sustrato de AGT está acoplado covalentemente además a dicho primer soporte sólido; (b) poner en contacto un segundo soporte sólido que comprende un sustrato de AGT acoplado covalentemente a una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de AGT que presenta una actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa y un segundo epítopo que es reconocido por un segundo anticuerpo diana, pero no por dicho primer anticuerpo diana con la muestra biológica, en el que dicho sustrato de AGT está acoplado covalentemente además a dicho segundo soporte sólido y (c) detectar la presencia o ausencia de los dos anticuerpos diana.

Description

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alternativamente por lo menos aproximadamente 67% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 68% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 69% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 71% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 72% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 73% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 74% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 75% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 76% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 77% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 78% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 79% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos 80% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 81% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 82% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 83% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 84% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 85% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 86% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 87% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 88% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 89% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 90% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 91% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 92% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 93% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 94% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 96% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 97% de identidad de secuencia de aminoácidos, alternativamente por lo menos aproximadamente 98% de identidad de secuencia de aminoácidos, y alternativamente por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia de aminoácidos con SEC ID NO: 1. En una forma de realización preferida, una secuencia homóloga de SEC ID NO: 1 es por lo menos 64%, preferentemente 70%, y más preferentemente 80% idéntica a SEC ID NO: 1.
En una forma de realización preferida, el mencionado polipéptido homólogo es un fragmento o un mutante del polipéptido de hAGT de SEC ID NO: 1, teniendo dicho fragmento o mutante una actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa.
Dichos fragmentos pueden tener un tamaño de por lo menos 50, preferentemente 100, y más preferentemente 150 aminoácidos, y contienen por lo menos el “dominio catalítico” del polipéptido de AGT como se define anteriormente, que es responsable de la actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa de la enzima AGT. Estos fragmentos se pueden obtener usando técnicas habituales que son conocidas por el experto en la materia.
Hasta ahora se han descrito diferentes enzimas mutantes derivadas de AGT nativa (Lim A. et al, 1996; Daniels
D.S. et al, 2000; Juillerat A. et al, 2003, documentos WO 2005/085470, WO 2004/031405). En particular, se ha obtenido una proteína mutante de 20 kDa que contiene las mutaciones Cys62Ala, Lys125Ala, Ala127Thr, Arg128Ala, Gly131Lys, Gly132Thr, Met134Leu, Arg135Ser, Cys150Ser, Asn157Gly, Ser159Glu truncada en el aminoácido 182 (el denominado mutante “AGT26” en el documento WO 2005/085470, también denominado “SNAP 26” en el documento WO 2006/114409). Se ha mostrado que este mutante particular “SNAP26” tiene actividad marcadora potenciada.
En el contexto de la presente invención, la secuencia de un polipéptido de AGT más preferido contiene las mutaciones descritas en el documento WO 2005/085470, cuyas posiciones se pueden transponer a la vista de SEC ID NO: 1, correspondiendo el resto de metionina de partida de SNAP26 al resto de metionina en la posición 32 de SEC ID NO: 1 (por lo tanto, se deberían añadir 31 aminoácidos a las posiciones descritas en el documento WO 2005/085470 para obtener las correspondientes en SEC ID NO: 1.
En una forma de realización preferida, la secuencia homóloga de AGT útil en la invención corresponde a la secuencia de AGT nativa de SEC ID NO: 1, en la que se sustituyen entre 1 y 30, preferentemente entre 6 y 25, y en particular 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, o 23 aminoácidos por otros aminoácidos, y/o se eliminan 1 a 40, preferentemente 1 a 20, en particular 10 a 20 aminoácidos, más preferentemente 15 aminoácidos, en el término
C.
En una forma de realización más preferida, la secuencia homóloga de AGT contiene las siguientes mutaciones
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En la forma de realización más preferida, el polipéptido de AGT usado en el método de la invención es el mutante SNAP de SEC ID NO: 2.
La enzima AGT transfiere irreversiblemente el grupo alquilo desde su sustrato, O6-alquilguanina-ADN, a uno de sus restos de cisteína. Sin embargo, las sustituciones de O6-bencilguanina en el C4 del anillo bencílico no afectan significativamente la actividad de AGT frente a derivados de O6-bencilguanina. Esta propiedad se ha usado para transferir un marcador unido al C4 del anillo bencílico a AGT (véanse los documentos WO 2004/031404 y WO 2005/085470).
Se ha mostrado que un número de derivados de O6-bencilguanina reaccionan con la enzima AGT transfiriendo su grupo bencilo a la cisteína del sitio activo de la enzima AGT (véase Damoiseaux et al., ChemBiochem., 2001, documentos WO 2004/031404 y WO 2005/085470).
En una forma de realización preferida, los sustratos de AGT usados en el método de la invención son derivados de bencilguanina que tienen la fórmula I:
R1-X-CH2-R3-R4-Y
en la que:
-R1 es un grupo reconocido por dicho polipéptido de AGT como sustrato, tal como un grupo heteroaromático que contiene 1 a 5 átomos de nitrógeno, y preferentemente un radical purínico de la fórmula:
imagen11
en la que R5 es hidrógeno, halógeno, por ejemplo cloro o bromo, trifluorometilo, o hidroxi; R6 es hidrógeno, hidroxi, o amino no sustituido o sustituido; y R2 es hidrógeno, un alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, o un resto de sacárido;
-X es un átomo de oxígeno o de azufre; preferentemente un átomo de oxígeno;
-R3 es un grupo aromático o heteroaromático, o un grupo alquilo, cicloalquilo o heterociclilo insaturado opcionalmente sustituido, con el doble enlace conectado a CH2; preferentemente un fenilo, por ejemplo un fenilo sustituido mediante R4 en posición para o meta,
-R4 es un resto enlazador,
-Y es un grupo reactivo, preferentemente un grupo amino.
En una forma de realización preferida, dicho resto enlazador R4 es un enlazador flexible. Las unidades enlazadoras se escogen en el contexto de la aplicación ideada, es decir, en la transferencia del sustrato a una proteína de fusión que contiene AGT. El enlazador no interfiere con la reacción con AGT ni con el anticuerpo diana.
Por ejemplo, puede ser un grupo alquileno de cadena lineal o ramificada con 1 a 20 átomos de carbono, preferentemente 5 a 15 átomos de carbono, en el que:
(a)
uno o más átomos de carbono están sustituidos por oxígeno, en particular en el que cada tercer átomo de carbono está sustituido por oxígeno, por ejemplo un grupo polietilenoxi con 1 a 5 unidades etilenoxi;
(b)
uno o más átomos de carbono están sustituidos por nitrógeno que porta un átomo de hidrógeno, y los átomos de carbono adyacentes están sustituidos por oxo, representando una función amida -NH-CO-;
(c)
uno o más átomos de carbono están sustituidos por oxígeno, y los átomos de carbono adyacentes están sustituidos por oxo, representando una función éster -O-CO-;
(d)
el enlace entre dos átomos de carbono adyacentes es un doble o un triple enlace, representando una función -CH=CH-o -C≡C-;
13
(e) uno o más átomos de carbono están sustituidos por un fenileno, un cicloalquileno saturado o insaturado, un bicicloalquileno saturado o insaturado, un grupo heteroaromático que forma puente o un grupo heterociclilo saturado o insaturado que forma puente;
5 (f) dos átomos de carbono adyacentes están sustituidos por un enlazamiento de disulfuro –S-S-; o una combinación de dos o más, especialmente dos o tres, grupos alquileno y/o alquileno modificado como se define en (a) a (f) en la presente memoria anteriormente, que contiene opcionalmente sustituyentes.
Los sustituyentes considerados son, por ejemplo, alquilo inferior, por ejemplo metilo, alcoxi inferior, por ejemplo 10 metoxi, aciloxi inferior, por ejemplo acetoxi, o halogenilo, por ejemplo cloro.
En una forma de realización preferida, R4 es un grupo polietilenoxi con 1 a 8 unidades etilenoxi, que comprende además uno a cuatro átomos de nitrógeno que portan un átomo de hidrógeno, cuyos átomos de carbono adyacentes están sustituidos por oxo, representando una función amida -NH-CO-.
15 En una forma de realización más preferida, R4 es -CH2-NH-CO-NH-[C2H4-O]n-, en el que n está comprendido entre 1 y 8, preferentemente 2 y 6, y es muy preferentemente 3.
En una forma de realización preferida, dicho grupo reactivo es un grupo funcional que facilita la unión y el
20 enlazamiento del sustrato en el soporte sólido. Tales grupos funcionales son bien conocidos en la técnica. Incluyen amina, ésteres activados, acrilamidas, azidas de acilo, haluros de acilo, nitrilos de acilo, aldehídos, cetonas, haluros de alquilo, anhídridos, haluros de arilo, aziridinas, boronatos, ácidos carboxílicos activados, carbodiimidas, diazoalcanos, epóxidos, haloacetamidas, haloplatinato, halotriazinas, imidoésteres, isocianatos, isotiocianatos, maleimidas, fosforamiditos, haluros de solilo, ésteres de sulfonato y haluros de sulfonilo.
25 preferentemente es el grupo amina -NH2.
En el lado opuesto, el soporte sólido se debería funcionalizar mediante grupos complementarios que corresponden a tales grupos reactivos. Los grupos complementarios que corresponden a cada uno de estos grupos reactivos son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, se proporcionan en la tabla I del documento WO
30 2010/107433.
En una forma de realización preferida, el sustrato de AGT usado en el método de la invención es:
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En otra forma de realización preferida, el sustrato de AGT usado en el método de la invención es el enlazador fluorescente denominado “SNAP-cell® 505”, que tiene la siguiente fórmula:
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40 Estos derivados de bencilguanina poseen un grupo bencilpurínico (guanina) para la interacción específica con el dominio SNAP, así como un grupo amina libre para el acoplamiento covalente a la superficie de las microesferas. Está comercializado por New England BioLaps, y se ha acoplado con éxito a la superficie de las micropartículas de la invención.
45 Los sustratos de la invención se preparan generalmente mediante métodos estándar conocidos en la técnica. Por ejemplo, en la solicitud de patente WO 2005/085470 se explican métodos particulares.
Los métodos de la invención requieren que los sustratos de AGT se acoplen covalentemente a los soportes
50 sólidos. En el contexto de la presente invención, un sustrato de AGT se “acopla covalentemente” a un soporte sólido si está unido permanentemente a dicho soporte sólido, y no se desorberá o lixiviará con el tiempo. Según la invención, un sustrato de AGT se une permanentemente al mencionado soporte sólido si permanece unido
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a) activar el mencionado soporte sólido funcionalizado,
b) añadir un sustrato de dicho polipéptido de AGT, suspendiéndose dicho sustrato en un amortiguador que contiene entre 0 y 20% de DMSO, en condiciones apropiadas de manera que el sustrato se una covalentemente a dicho soporte,
c) poner en contacto el mencionado polipéptido de AGT con el soporte revestido con sustrato de la etapa b) en un amortiguador de PBS/DTT,
en el que las moléculas no unidas se eliminan por lavado tras las etapas b) y c).
Los lavados se pueden llevar a cabo usando cualquier tipo de amortiguadores de lavado apropiados. Tales amortiguadores se usan normalmente por el experto en la materia, y no necesita detallarse adicionalmente en la presente memoria. Preferentemente, se usa un amortiguador de PBS.
Como se usa en la presente memoria, las “condiciones apropiadas” son las habituales. Preferentemente, el acoplamiento covalente del sustrato de AGT se lleva a cabo a temperatura ambiente y, si los soportes sólidos están marcados fluorescentemente, en la oscuridad.
La funcionalización del soporte sólido se puede llevar a cabo por cualquier medio convencional (como los recordados anteriormente). La activación de dicho soporte sólido funcionalizado se lleva a cabo consecuentemente. En una forma de realización preferida, los mencionados soportes sólidos se funcionalizan con grupos carboxilo superficiales, y se activan adicionalmente con un amortiguador de activación clásico, por ejemplo una disolución de EDAC 50 mg/ml o una disolución de S-NHS 50 mg/ml.
En una forma de realización preferida, DTT está a una concentración de 1 mM en el amortiguador de PBS/DTT.
La presente solicitud describe un soporte sólido que se ha obtenido mediante el mencionado método, y al uso de dicho soporte sólido en el inmunoensayo de la invención.
Los mencionados soportes sólidos se pueden almacenar entonces en amortiguadores de almacenamiento convencionales, por ejemplo que contienen 0,5 g/l de azida sódica, 0,1% de BSA, 0,02% de tween 20, y/o 1 mM de DTT.
Todas estas etapas de acoplamiento se llevan a cabo preferentemente in vitro, en amortiguadores que están desprovistos de células vivas, de manera que no es necesario tener en cuenta la reacción con enzimas AGT endógenas, y por lo tanto la reacción de la proteína de fusión de AGT (exógena) es muy específica.
Los soportes sólidos que se pueden usar en los métodos de la invención pueden ser de cualquier tipo, por ejemplo tubos de ensayo, pocillos de microtitulación, láminas, perlas, chips, y/o micropartículas, con la condición de que se puedan identificar específicamente entre sí. Tal identificación es posible, por ejemplo, cuando están situados espacialmente de forma separada (por ejemplo, los pocillos en una placa de microtitulación, o diferentes localizaciones en un chip), o cuando están marcados de forma diferente. Por lo tanto, un “soporte sólido” se ha de entender en un significado amplio, es decir, designando partes pequeñas discretas de un soporte sólido completo (en el caso de una placa o un biochip), o un gran número de micropartículas idénticas que comparten características detectables comunes (en adelante denominado en la presente memoria como “subconjunto”) de micropartículas.
En una forma de realización preferida, los soportes sólidos usados en esta invención se pueden identificar específicamente por su localización específica, tamaño, diámetro, peso, granulometría, y/o marcaje. Tal marcaje es, por ejemplo, un fluorocromo, un fluoróforo, un cromóforo, un radioisótopo, una etiqueta másica, o cualquier tipo de etiqueta detectable que sea conocida en la técnica.
Los soportes sólidos usados en la invención pueden estar hechos de cualquier material, por ejemplo en poliestireno, celulosa, nitrocelulosa, vidrio, cerámica, resina, caucho, plástico, sílice, silicona, metal, y/o polímero. Los materiales poliméricos incluyen poliestireno bromado, poliácido acrílico, poliacrilonitrilo, poliamida, poliacrilamida, poliacroleína, polibutadieno, policaprolactona, policarbonato, poliéster, polietileno, politereftalato de etileno, polidimetilsiloxano, poliisopreno, poliuretano, poliacetato de vinilo, policloruro de vinilo, polivinilpiridina, policloruro de vinilbenceno, poliviniltolueno, policloruro de vinilideno, polidivinilbenceno, polimetacrilato de metilo, polilactida, poliglicolida, poli(lactida-co-glicolida), polianhídrido, poliortoéster, polifosfaceno, polifosfozano, polisulfona, o combinaciones de los mismos, que son asimismo aceptables. La mayoría de estos soportes están comercialmente disponibles. Por ejemplo, las perlas de polímeros sintéticos tales como poliestireno, poliacrilamida, poliacrilato, o látex, están comercialmente disponibles de numerosas fuentes, tales como Bio-Rad Laboratories (Richmond, Calif.) y LKB Produkter (Estocolmo, Suecia). Las perlas formadas de macromoléculas naturales y partículas tales como agarosa, agarosa reticulada, globulina, ácido desoxirribonucleico, y liposomas, están comercialmente disponibles de fuentes tales como Bio-Rad Laboratories, Pharmacia (Piscataway, NJ), e
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Tabla 1: Combinaciones ventajosas de microesferas acopladas a antígeno a incluir en el kit de la invención
Paneles de microesferas
Veterinario Enfermedad equina X X X X
Enfermedad bovina
X
Sindrómico
Fiebre hemorrágica X X X X X
Encefalitis
X X X X X X X X X X X
Similar a la gripe
X X X X X X X X X X X X X X X X X X
Geográfico
Oceanía X X X X X X X X X X X X X X
Américas
X X X X X X X X X
Europa
X X X X X X X X X
Asia
X X X X X X X X X X X X X X
África
X X X X X X X X X X
Microesferas acopladas al antígeno
Descripción Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Forma soluble segregada de la proteína Ede cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Forma soluble segregada de la proteína Ede cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta Dominio III de la proteína E de cubierta
Abreviatura
SNAP+ DEN1.EDIII SNAP+ DEN2.EDIII SNAP+ DEN3.EDIII SNAP+ DEN4.EDIII SNAP+ YF.EDIII 5NAP+ WNV.EDIII WNV.prM-sE+SNAP SNAP+ USU.EDIII JE.prM-sE+SNAP SNAP+JE-1. EDIII SNAP+JE-2. EDIII SNAP+JE-2. EDIII SNAP+JE-4. EDIII SNAP+JE-5. EDIII 5NAP+MVE. EDIII SNAP+SLE. EDIII SNAP+ZIKV. EDIII SNAP+WSL. EDIII SNAP+ROCV. EDIII SNAP+RabV.EDIII SNAP+Insectflavi.EDIII
Agente
Especie Virus del dengue tipo 1 Virus del dengue tipo 2 Virus del dengue tipo 3 Virus del dengue tipo 4 Virus de la fiebre amarilla Virus del Nilo Occidental Virus de Usutu Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 3 Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 1 Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 2 Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 3 Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 4 Virus de la encefalitisjaponesa genotipo 5 Virus de la encefalitis delValle de Murray Virus de la encefalitis deSaint-Louis Virus del Zika Virus de Wesselsbron Virus de Rocio Virus de Rabensburg Flavivirus insectívoro (col.la Timone)
Género
Flavivirus
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Virus de la encefalitisportada por la garrapata
SNAP+TBE.EDIII Dominio III de la proteína E de cubierta X X X
Virus de la FiebreHemorrágica de Omsk
SNAP+ OMSK.EDIII Dominio III de la proteína E de cubierta X X
Virus de la Enfermedad delBosque de Kyasanur
SNAP+ KAS.EDIII Dominio III de la proteína E de cubierta X X
Virus de Akhumra
SNAP+ALK.EDIII Dominio III de la proteína E de cubierta X X
Orthobunyavirus
Virus de Schmallenberg SNAP+AKA.N Nucleoproteína N X X
Virus de Akabane
SNAP+AKA.N Nucleoproteína N X X X
Virus de Aino
SNAP+AIN.N Nucleoproteína N X X X
Virus de Shamonda
SNAP+SHA.N Nucleoproteína N X X X
Bunyavirus
Virus de la Fiebre del Valledel Rift SNAP+ RVF.N Nucleoproteína N X X X X X
Alphavirus
Virus de Chikungunya CHIK.sE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X X X X X
Virus del Río Ross
RR.SE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X X
Virus de Mayaro
MAY,sE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X
Virus de la encefalitisequina oriental
EEE.SE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X X
Virus de la encefalitisequina occidental
WEE.sE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X X
Virus de la encefalitisequina venezolana
VEE,sE2+SNAP Forma soluble segregada de la proteínaE2 de cubierta X X X
Nairovirus
Virus de la fiebrehemorrágica de Crimea-Congo SNAP+CCHF.N Nucleoproteína N X X X X X
Ebolavirus
Virus del ébola virus (Zaire) SNAP+ EBO.N Nucleoproteína N X X
Marburgvirus
Virus de Marburgo SNAP+ MAR.N Nucleoproteína N X X
Arenavirus
Virus de Lass LAS.ectoGP1+SNAP Ectodominio de Glicoproteína 1 X X
LAS.ectoGP2+SNAP
Ectodominio de Glicoproteína 2 X X
SNAP+ LAS.N
Nucleoproteína N X X
Virus de Junin
JUN .ectoGP1+SNAP Ectodominio de Glicoproteína 1 X X
JUN ,ectoGP2+SNAP
Ectodominio de Glicoproteína 2 X X
SNAP+ JUN.N
Nucleoproteína N X X
Virus de Machupo
MAC .ectoGP1+SNAP Ectodominio de Glicoproteína 1 X X
MAC .ectoGP2+SNAP
Ectodominio de Glicoproteína 2 X X
SNAP+ MAC.N
Nucleoproteína N X X
Virus de Sabia
SAB .ectoGP1+SNAP Ectodominio de Glicoproteína X X
SAB .ectoGP2+SNAP
Ectodominio de Glicoproteína X X
SNAP+SAB.N
Nucleoproteína N X X
Virus de Guanarito
GUA .ectoGP1+SNAP Ectodominio de Glicoproteína X X
GUA .ectoGP2+SNAP
Ectodominio de Glicoproteína X X
SNAP+ GUA.N
Nucleoproteína N X X
Betocoronavirus
Betacoronavirus humano(2cEMC/2012) SNAP+ huCOV.N Nucleoproteína N X
huCOV.S+SNAP
Forma soluble de la proteína spike S X
Hepacivirus
Virus de la hepatitis Cgenotipo 1b (cepa TCHMR2/03) SNAP+HCV.C protein C de la cápside X X X X X
Hepevirus
Virus de la hepatitis E SNAP+ HEV.C protein C de la cápside X X X X X
Enterovirus
Enterovirus 71 (cepa JLAFP-EV71-07-03) SNAP+ EV71.VP1 protein VP1 de la cápside X X X X X X
Plasmodium
Plasmodium falciparum SNAP+MSP1(19)+AMA-1 (III) Proteínas MSP-1(19)+ AMA-1(lll) entándem X X X X X X X
Leptospira
Leptospira interrogansserovar Lai cepa 56601 SNAP+HbpA LA forma de 55 kDa de la proteína HbpA X X X X X X X X
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Ejemplos
En el contexto de la invención, se desarrolló un inmunoensayo a base de perlas múltiplex para la detección rápida y simultánea de anticuerpos contra arbovirus en fluidos biológicos.
El sistema se basa en la tecnología xMAP (Luminex corporation), y usa una mezcla de microesferas revestidas con antígeno como reactivos de captura para inmunoglobulinas humanas específicas. Se acoplaron distintos conjuntos de microesferas (Magplex, Luminex corporation) con proteínas de fusión de AGT purificadas, a saber, las proteínas recombinantes víricas etiquetadas con SNAP: sSNAP-DV1.EDIII, sSNAP-DV2.EDIII, sSNAP-DV3.EDIII, sSNAP-DV4.EDIII, sSNAP-WN.EDIII, sSNAP-JE.EDIII, sSNAP-USU.EDIII, sSNAP-TBE.EDIII, sSNAP-YF.EDIII, sSNAP-MVE.EDIII, sSNAP-Rocio.EDIII, sSNAP-WSL.EDIII, sSNAP-ZIKA.EDIII, SNAP-DV1ectoM, sSNAP-N.RVF, sSNAP-N.TOS, y CHIK.sE2-SNAP. Los antígenos recombinantes se acoplaron covalentemente a la superficie carboxílica de la microesfera usando un sustrato de la proteína AGT como enlazador (BG-PEG-NH2, New England Biolabs), potenciando de ese modo la eficiencia de la captura de anticuerpos en comparación con los procedimientos de acoplamiento amínico estándar.
La validación técnica usando anticuerpos anti-etiqueta de SNAP y anticuerpos monoclonales específicos de ratón confirmó la eficiencia del acoplamiento y demostró la estabilidad del antígeno a largo plazo (hasta seis meses). Esta solicitud no está limitada a antígenos víricos, ya que se puede usar cualquier péptido o polipéptido para el revestimiento de las perlas y la captura subsiguiente de anticuerpos.
I) Material y métodos
1. Se usaron los siguientes amortiguadores y disoluciones:
a) amortiguador de PBS: 100 ml de 10X PBS, pH 7,4 en 1 l H2O estéril
b) amortiguador de acoplamiento de SNAP (PBS-DTT): 100 ml de 10 X PBS, pH 7,4, 0,5 ml de 10% de tween 20, 1 ml de 1,0 M de DTT, en 1 l de H2O estéril
c) amortiguador de bloqueo/de ensayo (PBS-B): PBS, 1% de BSA, pH 7,4 en 1 l H2O estéril
d) amortiguador de almacenamiento (PBS-TBN): 100 ml de 10X de PBS, 1 g de BSA, 2 ml de 10% de tween 20, 500 me de azida sódica, 1 ml de 1,0M de DTT, en 1 l de H2O estéril
e) disolución de sustrato (4 mg/ml): 2 mg de BG-PEG-NH2, DMSO 500 µl.
f) disolución de activación (EDAC/SNHS): 50 mg/ml de disolución de EDAC, o 50 mg/ml de SNSHS en agua destilada
2. Se usaron los siguientes materiales:
2.1. microesferas de MagPlex Luminex: MC 100XX-ID (en el que XX es la región de fluorescencia), XX puede ser, por ejemplo, 26, 27, 28, 29, 34, 35, 36, 37, 45, 52, 53, 63, 64, como se menciona en la figura 7B
2.2. sustrato de hAGT: PEG-BG-NH2 (NEB S9150S)
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2.3. proteínas de fusión SNAP-EDIII vírica:
La generación de una proteína de fusión que comprende restos de AGT y de EDIII vírica es bien conocida por el experto en la materia. Para este fin, se puede usar cualquier procedimiento de síntesis conocido, con la condición de que la enzima AGT permanezca activa en la proteína de fusión.
En el presente caso, se ha usado el mutante SNAP de AGT de SEC ID NO: 2, y se han generado proteínas de fusión SNAP-EDIII vírica.
Se ha escogido el sistema de expresión inducible en Drosophila S2 (DES, Invitrogen), para la producción en masa de EDIII individual de flavivirus en células de animales no vertebrados, y se ha usado el plásmido
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Claims (5)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método de ensayo in vitro para detectar por lo menos dos anticuerpos diana en una muestra biológica que
    comprende: 5
    (a)
    poner en contacto un primer soporte sólido que comprende un sustrato de AGT acoplado covalentemente a una primera proteína de fusión que comprende un polipéptido de AGT que presenta una actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa y un primer epítopo que es reconocido por un primer anticuerpo diana con la muestra biológica, en el que dicho sustrato de AGT está acoplado covalentemente además a dicho primer soporte sólido;
    (b)
    poner en contacto un segundo soporte sólido que comprende un sustrato de AGT acoplado covalentemente a una segunda proteína de fusión que comprende un polipéptido de AGT que presenta una actividad de O6-alquilguanina-ADN alquiltransferasa y un segundo epítopo que es reconocido por un
    15 segundo anticuerpo diana, pero no por dicho primer anticuerpo diana con la muestra biológica, en el que dicho sustrato de AGT está acoplado covalentemente además a dicho segundo soporte sólido y
    (c) detectar la presencia o ausencia de los dos anticuerpos diana.
  2. 2. Método de ensayo según la reivindicación 1, en el que dicho método se utiliza para detectar por lo menos 5, más preferentemente por lo menos 15 y todavía más preferentemente por lo menos 50 anticuerpos diana en una muestra biológica de un sujeto.
  3. 3. Método de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicho sustrato de dicho 25 polipéptido de AGT es un derivado de O6-bencilguanina que presenta la fórmula I:
    R1-X-CH2-R3-R4-Y
    en la que:
    -R1 es un grupo heteroaromático que contiene 1 a 5 átomos de nitrógeno, preferentemente un radical purínico de la fórmula:
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    35 en la que R5 es hidrógeno, halógeno, por ejemplo cloro o bromo, trifluorometilo, o hidroxi; R6 es hidrógeno, hidroxi, o amino no sustituido o sustituido; y R2 es hidrógeno, un alquilo de 1 a 10 átomos de carbono, o un resto de sacárido;
    - X es un átomo de oxígeno o de azufre; preferentemente un átomo de oxígeno;
    -R3 es un grupo aromático o heteroaromático, o un grupo alquilo, cicloalquilo o heterociclilo insaturado opcionalmente sustituido, con el doble enlace conectado a CH2; preferentemente un fenilo, por ejemplo un fenilo sustituido mediante R4 en posición para o meta,
    45 -R4 es un resto enlazador, preferentemente -CH2-NH-CO-NH-[C2H4-O]n-, en el que n está comprendido entre 1 y 8, preferentemente 2 a 6;
    - Y es un grupo reactivo.
  4. 4. Método de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos soportes sólidos se pueden identificar específicamente por su ubicación, tamaño, diámetro, peso, granulometría, y/o marcado específicos.
    55 5. Método de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichos soportes sólidos están marcados con un fluorocromo, un cromóforo, un radioisótopo, y/o una etiqueta másica.
  5. 6. Método de ensayo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dichos soportes sólidos son micropartículas, preferentemente micropartículas magnéticas o micropartículas marcadas internamente con colorantes fluorescentes.
    238
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