CN101983240B - 凝集性酵母及其制备方法 - Google Patents

Abstract

通过将外源的凝集性基因导入马克斯克鲁维酵母菌，提供适于生物乙醇的工业生产的、具有耐热性和凝集性的新型马克斯克鲁维酵母转化株，以及该转化株的有效制备方法。作为用于赋予马克斯克鲁维酵母凝集性的外源基因，本发明人等着眼于酿酒酵母的凝集性基因FLO，制备了含有已知表达启动子序列和源于酿酒酵母的FLO基因序列的线状DNA片段。将该线状DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌，结果，确认能够高效地得到马克斯克鲁维酵母转化株，同时作为预料之外的结果，确认上述转化株的凝集性显著提高，从而完成了本发明。

Description

凝集性酵母及其制备方法

技术领域

本发明涉及用于生物乙醇生产的、属于凝集性得到提高的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的凝集性酵母及其制备方法等。

背景技术

微生物在工业产品生产中占有重要的位置。其中，更高效、便宜地进行生产是人们想解决的一项课题。其解决方法有：选择表现更高生产率的菌株、以及对用于微生物培养的培养基的组成或培养温度等培养条件进行研究等。以近年来分子遗传学的发展为基础，作为菌株的一种选择方式，可以列举由现有的菌株利用特定的优秀基因，将菌株转化的方法。目前，即使对于生产有用的食品类的酵母，为了更有效的生产，也较多地进行了转化。

作为用于有效生产的转化的一种，可以列举提高菌体凝集性的转化。利用了发酵法的醇生产，可以通过在作为发酵酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中使用醇生产率特别高的株，并利用分批发酵法或连续发酵法这样的方法来实施。现有的分批发酵法，是通过在醇发酵酵母中添加糖蜜等作为原料，并在一定的条件下进行培养来生成醇的。生成的醇通过加热培养液而蒸馏回收，但残留在培养液中的酵母由于加热而灭活。因此，在持续进行醇生产时，必须要补充酵母液。这样的工序效率差，进而成本高。当使用凝集性酵母时，静置并回收上清液的醇，在沉淀的凝集性酵母中添加新的发酵液，可再次进行醇生产，因此对于利用了分批发酵法的醇生产，优选使用凝集性的酵母。

作为赋予凝集性的转化的方法，有在醇发酵酵母染色体上的任意的标记基因区域，导入作为外源DNA的凝集性基因表达盒而制成的实用的凝集性醇发酵酵母和其育种方法(专利文献1)；获取酵母的凝集性基因的、编码与凝集性有关的蛋白区域的DNA，并将该DNA导入啤酒酵母中来制备凝集性得到强化的酵母的方法(专利文献2)；用于燃料用乙醇生产的凝集性酵母的构筑(非专利文献1)等。这些已经报道的转化酵母，是将源于酿酒酵母的凝集性基因导入属于酿酒酵母的酒类制造用酵母而制成的。另一方面，对于在属于与酿酒酵母为不同属的酵母中导入了源于酿酒酵母的凝集性基因的转化酵母，尚未有报道，并且对于源于酿酒酵母的凝集性基因在酿酒酵母以外的酵母中是否也能参与凝集性的调节，完全不清楚。

对于酿酒酵母，全基因组分析已经完成，正在确定凝集性基因。涉及凝集性的FLO基因群组中，有存在于1号染色体上的FLO1基因(非专利文献2)、存在于8号染色体上的FLO5基因(非专利文献3)、存在于5号染色体上的FLO8基因(非专利文献4)、存在于1号染色体上的FLO9基因(非专利文献5)、存在于11号染色体上的FLO10基因(非专利文献6)等。这些基因被认为是具有与FLO1类似的碱基序列的凝集素样蛋白质。

目前，从石油供给的问题考虑，在世界范围内，正尝试进行使用来自生物资源(バイオマス)的能源来代替石油的探索。依赖于生物资源的新能源的一种有作为生物资源燃料的生物乙醇。生物乙醇可以利用较多含有糖质或淀粉质的植物资源获得。作为利用以生物资源为原料的微生物来进行醇生产的方法，公开了将西谷椰子原木的粉碎物糖化，利用酿酒酵母进行的乙醇的发酵生产法(专利文献3)；使用属于酿酒酵母的酵母，由垃圾等废弃物生产燃料用醇的方法(专利文献4)。在生物乙醇的生产中使用的酵母，优选具有可与生物资源的处理相对应的耐热性、具有与醇生产酵母同样高的凝集性的酵母。

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)是具有耐热性的酵母，由Lertwattanasakul以及山田等，确认了醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase；Adh)的表达，所述醇脱氢酶与由糖向乙醇的转换有关(非专利文献7)。马克斯克鲁维酵母不仅可以产生乙醇，而且由于蛋白质生产率高，因而被认为在工业生产中非常有用，然而现状是，没有一般性地确立马克斯克鲁维酵母的转化方法，这等的研究没有进展。因此，对于适于生物乙醇的工业生产的马克斯克鲁维酵母转化株，至今没有任何报道。

专利文献1：专利第3040959号公报

专利文献2：专利第3643404号公报

专利文献3：特开2007-195406号公报

专利文献4：特开2006-325577号公报

非专利文献1：Biotechnol Lett，30：97-102，2008

非专利文献2：Yeast，9：423-427，1993

非专利文献3：Science，265：2077-2082，1994

非专利文献4：Nature 387：78-81，1997

非专利文献5：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：3809-3813，1995

非专利文献6：Nature 369：371-378，1994

非专利文献7：Biosci.Biotechnol.Biochem.71：1170-82，2007

发明内容

本发明的课题在于，通过将外源的凝集性基因引入马克斯克鲁维酵母菌，提供适于生物乙醇的工业生产，并具有耐热性和凝集性的新型的马克斯克鲁维酵母转化株，以及提供上述转化株的有效制备方法。

本发明人等着眼于酿酒酵母的凝集性基因FLO作为用于赋予马克斯克鲁维酵母凝集性的外源基因，制备了含有已知的表达启动子序列和源于酿酒酵母的FLO基因序列的直链状(线状)DNA片段，来作为用于诱导FLO基因表达的FLO基因表达盒。将该线状DNA片段导入马克斯克鲁维酵母菌，结果确认能够高效地得到马克斯克鲁维酵母转化株，同时作为预料之外的结果，确认上述转化株的凝集性显著提高，从而完成本发明。

即，本发明涉及

[1]具有凝集性和耐热性的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)转化株的制备方法，其特征在于，依次含有下述工序(A)～(C)：(A)在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的内源性FLO基因的上游导入标记基因序列和表达启动子序列来制备酿酒酵母转化株的工序；(B)由染色体DNA得到含有标记基因序列、表达启动子序列和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色体DNA源于工序(A)中制备的酿酒酵母转化株；(C)将工序(B)中得到的DNA片段作为FLO基因表达盒导入马克斯克鲁维酵母，制备马克斯克鲁维酵母转化株的工序；

[2]根据上述[1]所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，酿酒酵母的内源性FLO基因是选自FLO1基因、FLO5基因、FLO9基因和FLO10基因中的1种以上的FLO基因；

[3]根据上述[1]或[2]所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，标记基因为营养缺陷型标记基因；

[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，营养缺陷型标记基因是组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、赖氨酸(リシン)、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1种的营养缺陷型基因；

[5]根据上述[4]所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，营养缺陷型标记基因是URA3基因；

[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的制备方法，其特征在于，马克斯克鲁维酵母是在组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1种的营养缺陷型基因中具有突变的马克斯克鲁维酵母突变体；

[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，表达启动子是3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH3)启动子；

[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，将线状的DNA片段作为FLO基因表达盒导入马克斯克鲁维酵母；

[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，马克斯克鲁维酵母转化株是RAK4299株(NITEBP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、RAK4301株(NITE BP-516)或者RAK4302株(NITE BP-517)。

另外本发明涉及

[10]由上述[1]～[8]中任一项所述的制备方法制备的、具有凝集性和耐热性的马克斯克鲁维酵母转化株；

[11]根据上述[10]所述的马克斯克鲁维酵母转化株，其特征在于，其是RAK4299株(NITE BP-514)、RAK4300株(NITE BP-515)、RAK4301株(NITE BP-516)或者RAK4302株(NITE BP-517)。

根据本发明，可以将马克斯克鲁维酵母转化，来制备凝集性和耐热性优异的酵母，能够提供有效用于生物乙醇的工业生产的酵母。

附图说明

[图1]是表示在FLO基因上游***源于pST106质粒的TDH3启动子和URA3DNA片段的示意图。

[图2]是表示转化用DNA片段的电泳结果的图。(Lane 1，6：DNAladder，lane 2：源于FLO3，lane 3：源于FLO5，lane 4：源于FLO9，lane 5：源于FLO10)

[图3]是表示导入了转化用DNA片段的酿酒酵母BY4700的染色体DNA(TF)、和没有导入的染色体DNA(WT)的电泳结果的图。

[图4]是表示导入转化用DNA片段所得到的4种类型酿酒酵母的染色体DNA中的重组FLO基因的电泳结果的图。(Lane 1，6：DNA ladder，lane  2：URA3-TDH3p-FLO1，lane 3：URA3-TDH3p-FLO5，lane4：URA3-TDH3p-FLO9，lane 5：URA3-TDH3p-FLO10)

[图5]是表示相对于马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042和酿酒酵母BY4700的各转化株的凝集性的图。

[图6]是表示马克斯克鲁维酵母转化株在28℃和40℃下的凝集性的图。

[图7]是表示对于温度为40～50℃的热休克的时间，相对于温度的反应时间的上限和下限的图。

[图8]是表示对于马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化的结果的照片的图。使用25ng直链DNA的URA3片段，可以得到板面的转化株数。

[图9]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化效果中酵母细胞浓度的影响的图。

[图10]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化效果中聚乙二醇(PEG)的分子量和热休克后的稀释液的影响的图。

[图11]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化效果中DTT的影响的图。

[图12]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化效果中DNA片段大小的影响的图。

[图13]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042的转化效果中热休克温度和时间的影响的图。

[图14]是表示马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042为在使用了DNA片段的转化中最有效的菌株的图。

具体实施方式

作为本发明的具有凝集性和耐热性的酵母的制备方法，只要含有在耐热性马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)中导入FLO基因表达盒的方法即可，没有特别限制。上述FLO基因只要是可赋予马克斯克鲁维酵母凝集性的FLO基因，可使用任意的基因，可以优选列举例如全基因组序列得到解析的酿酒酵母的FLO基因，更具体地，可以优选例示酿酒酵母的FLO1基因、FLO5基因、FLO9基因、FLO10基因等。对于酿酒酵母的FLO基因的信息，从DDBJ(DNA Data Bank of Japan)、EMBL-EBI(European Molecular Biology Laboratory)、GenBank-NCBI(National Center for Biotechnology Information)、SGD(Saccharomyces Genome Database)等的基因组数据库中，可知其碱基序列信息。

上述FLO基因表达盒只要可在马克斯克鲁维酵母中诱导FLO基因的表达即可，没有特别限制，优选下述那样的FLO基因表达盒，其含有用于有效选择转化株的标记基因序列，还以通过表达启动子控制FLO基因的表达这样的方式来设计。上述选择标记基因可以列举抗生素等的耐药性基因、营养缺陷型标记基因等编码受体(宿主)细胞中缺失产物的基因等，上述耐药性基因可以例示对于氨苄青霉素、博来霉素、卡那霉素、寡霉素等药物的耐药性基因等，上述营养缺陷型标记基因可以例示HIS3、URA3、LEU2等，特别优选使用营养缺陷型标记基因。通过将选择性培养基与营养缺陷型标记基因组合，可以选择表达标记基因的细胞，例如当将URA3的营养缺陷型基因导入细胞时，转化的宿主细胞可以在不含有尿嘧啶的培养基中生长，可进行被赋予凝集性的菌株的选择。另外，上述表达启动子没有特别限制，具体可以列举例如3-磷酸甘油醛脱氢酶3(TDH3、GAP)启动子、TDH1启动子、TDH2启动子、PHO5启动子、PGK启动子、ADH启动子、GAL1启动子、GAL10启动子、热休克蛋白质启动子、MFα1启动子、CUP1启动子等，这些启动子序列可以是源于生物体的基因组DNA序列，也可以是利用化学方法等，人工得到的DNA序列。

用于导入FLO基因表达盒进行转化的马克斯克鲁维酵母(クルイベロマイセス·マルシアヌ)菌体，优选使用作为标记的基因突变的突变体。获取突变基因的方法没有特别限制，可以使用现有公知的方法进行。作为利用了UV照射的方法，例如有Hashimoto等的方法(Applied andEnvironmental Microbiology，71(1)：312-319，2005)。在该方法中，对于菌体生长的板上的酵母株，从距离35cm处照射UV 20秒，得到0.05～0.2％的突变体。根据该方法，可以得到组氨酸(His)、亮氨酸(Leu)、精氨酸(Arg)、尿嘧啶(Ura)、蛋氨酸(Met)、色氨酸(Tri)的营养缺陷型突变株。或者，还有下述的方法：将基因破坏盒载体(Gene Disruption Cassette Vector)等具有与靶基因同源的碱基序列、不能作为基因发挥功能的DNA导入细胞中，进行同源重组、使其不活化的方法(日本特开2001-46053号公报)。当进行无法目测表达的基因的突变时，需要导入标记基因，以能够通过细胞的药物(抗生素等)感受性试验、细胞的繁殖速度、酶活性试验、光学方法或营养缺陷试验来进行观察。

如上述那样，作为使用了FLO基因表达盒的本发明的酵母制备方法，所述FLO基因表达盒含有营养缺陷型标记基因序列和源于酿酒酵母的FLO基因序列，且可利用上述表达启动子控制上述FLO基因的表达这样来进行设计，可以列举下述制备方法，其依次含有下述工序(A)～(C)：(A)在酿酒酵母的内源性FLO基因的上游导入营养缺陷型标记基因序列和表达启动子序列来制备酿酒酵母转化株的工序；(B)由染色体DNA得到含有营养缺陷型标记基因序列、表达启动子序列和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色体DNA源于工序(A)中制备的酿酒酵母转化株；(C)将工序(B)中得到的DNA片段作为FLO基因表达盒导入营养缺陷型基因具有突变的马克斯克鲁维酵母突变体，来制备马克斯克鲁维酵母转化株的工序，所述营养缺陷型基因对应于在上述DNA片段中含有的营养缺陷型标记基因。

在上述工序(A)中，酿酒酵母转化株，可以通过在营养缺陷型基因发生突变的酿酒酵母菌株中导入含有营养缺陷型标记基因序列、源于酿酒酵母的FLO基因序列的转化用DNA片段来制备，作为上述营养缺陷型基因发生突变的酿酒酵母菌株，可以使用市售的尿嘧啶缺陷型基因突变的酿酒酵母BY4700株；尿嘧啶、亮氨酸、赖氨酸的缺陷型基因突变的酿酒酵母BY4740株；组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶的缺陷型基因突变的酿酒酵母BY4743株；或根据Hashimoto等的方法(Applied and EnvironmentalMicrobiology，71(1)：312-319，2005)制备的尿嘧啶要求性缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605等。另外，在上述转化用DNA片段的制备中，基于酿酒酵母FLO基因的序列信息，可以使用由从起始密码子ATG起、由含有ATG在内、直至第40个碱基的序列构成的DNA片段，例如，作为包含40个碱基的DNA片段的碱基序列，源于FLO1基因时可以列举atgacaatgcctcatcgctatatgtttttggcagtcttta(Seq.No.序列编号1)，源于FLO5基因时可以列举atgacaattgcacaccactgcatatttttggtaatcttgg(Seq.No.2)，源于FLO9基因时可以列举atgtctctggcacattattgtttactactagccatcgtca(Seq.No.3)，源于FLO10基因时可以列举atgcctgtggctgctcgatatatatttttgaccggcctat(Seq.No.4)等。将基于这些FLO基因的碱基序列信息制备的DNA片段退火，***到具有表达启动子序列和营养缺陷型标记基因序列的质粒中，通过利用PCR扩增所需区域，可以得到FLO基因表达盒用的DNA序列。上述具有表达启动子序列和营养缺陷型标记基因序列的质粒没有特别限制，可以优选列举质粒URA3-TDH3p(称为“pST106”)，其根据Turgeon等的方法(Plasmid51：24-36，2004)制备，具有TDH3p作为表达启动子，并具有尿嘧啶缺陷型基因作为营养缺陷型基因。

在基因突变株中导入转化用DNA片段的方法，可以使用导入DNA片段的一般的转化方法。可以使用例如接合法、电穿孔法、感受态细胞法、微注射法、粒子炮法等任意的方法。另外，也可以利用赤田等的方法(特开2005-269920号公报)，在含有碱金属离子和聚乙二醇的培养基中进行热休克，而导入转化用DNA片段。

在上述工序(A)中，作为使用了尿嘧啶缺陷型基因突变的酿酒酵母BY4700株的酿酒酵母转化株的例子，可以列举导入了URA3-TDH3p-FLO401的酿酒酵母RAK3977株、导入了URA3-TDH3p-FLO405的酿酒酵母RAK3979株、导入了URA3-TDH3p-FLO409的酿酒酵母RAK3981株、或导入了URA3-TDH3p-FLO4010的酿酒酵母RAK3983株等利用以下实施例制备的转化株。

在上述工序(B)中，作为由源于工序(A)制备的酿酒酵母转化株的染色体DNA、来得到编码FLO基因表达盒的DNA片段的方法，可以列举下述方法，即，对于上述酿酒酵母转化株的染色体DNA，用使用了SDS(月桂基硫酸钠)溶液等的通常的方法进行裂解·搅拌·提取·离心分离的操作，由此进行纯化，将经纯化的染色体DNA作为模板进行PCR反应的方法。在上述PCR反应时，通过使用为了扩增含有FLO基因表达盒序列的DNA序列而设计的引物，可以得到编码FLO基因表达盒的DNA片段，所述FLO基因表达盒序列含有营养缺陷型标记基因序列、表达启动子序列、和FLO基因序列。

在上述(C)中，只要是在染色体基因上具有突变的马克斯克鲁维酵母营养缺陷型突变体，所述染色体基因对应于在上述FLO基因表达盒中含有的营养缺陷型标记基因，则可以使用任意的营养缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母突变体，可以选择组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸等营养缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母突变体。例如，如以下实施例所示，当使用URA3-TDH3p-FLO基因片段作为FLO基因表达盒时，可以使用尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母菌株的马克斯克鲁维酵母RAK3605株来制备。

作为使用本发明的制备方法制备的、具有凝集性和耐热性的酵母，没有特别限制，具体可以列举例如，在尿嘧啶缺陷型基因突变的马克斯克鲁维酵母RAK3605株中，导入源于酿酒酵母RAK3977株的FLO基因表达盒(URA3-TDH3p-FLO1)而成的马克斯克鲁维酵母RAK4299株(保藏号：NITE BP-514)，导入源于酿酒酵母RAK3979株的FLO基因表达盒(URA3-TDH3p-FLO5)而成的马克斯克鲁维酵母RAK4300株(保藏号：NITE BP-515)，导入源于酿酒酵母RAK3981株的FLO基因表达盒(URA3-TDH3p-FLO9)而成的马克斯克鲁维酵母RAK4301株(保藏号：NITE BP-516)，导入源于酿酒酵母RAK3983株的FLO基因表达盒(URA3-TDH3p-FLO10)而成的马克斯克鲁维酵母RAK4302株(保藏号：NITE BP-517)等。并且，上述4种马克斯克鲁维酵母突变株保藏于独立行政法人制品评价技术基础机构(独立行政法人製品評価技術基盤機構)专利微生物保藏中心(地址：千叶县木更津市上总镰足2-5-8，千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8)。

在本发明中，作为用于选释转化的菌株的培养基，可以是通常使用的酵母培养用培养基，例如可以使用实施例中列举的YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖)、YM培养基(0.3％酵母提取物、0.3％麦芽提取物、0.5％胨、1％葡萄糖)。对于培养基的碳源、氮源的种类、碱金属离子等在培养基中的添加物，只要能够有效地进行转化株的选择，则可以是任何培养基。对于培养，在25～33℃、优选28～30℃的温度下进行1～5天、优选2～3天。

下面，列举实施例来更详细地说明本发明，但本发明不受这些实施例的限制。

实施例1

<过表达启动子TDH3p向酿酒酵母的FLO基因的上游中的***>

A.URA3-TDH3p片段的扩增

以具有作为标记基因的URA3基因序列、和作为表达启动子序列的TDH3的pST106质粒作为模板，使用表1所示的引物进行PCR反应，制备酿酒酵母转化用的DNA片段。上述引物以***pST106质粒的URA3-TDH3p序列的方式进行设计，此外，将酿酒酵母的FLO1、FLO5、FLO9或FLO10基因上游序列分别以含有40个碱基的方式进行设计。PCR反应液是用各自为0.2μl的1对0.2μM的引物、KOD plus缓冲液1.0μl(TOYOBO社制)、0.2mM dNTPs1.0μl(TOYOBO社制)、0.2mMMgSO₄0.8μl(TOYOBO社制)、0.4ng/μl pST106质粒0.4μl、KOD Plus DNA聚合酶0.2μl(TOYOBO社制)、灭菌水6.2μl制成的、总体积为10μl的溶液。反应首先在94℃下加热1分钟，然后在94℃下进行20秒的热变性，在55℃下退火30秒钟，在68℃下进行3分钟的延伸反应，以上反应过程进行30个循环。结果得到分别具有FLO1、FLO5、FLO9或FLO10基因上游的同源序列的DNA片段URA3-TDH3p-FLO401、URA3-TDH3p-FLO405、URA3-TDH3p-FLO409、URA3-TDH3p-FLO4010(以下，有时将这些DNA  片段统称为URA3-TDH3p-FLO40s)(图1、2)。

[表1]

B.URA3-TDH3p序列向酿酒酵母中的导入

将酿酒酵母BY4700株在放入了2ml YPD培养基(1％酵母提取物、2％聚胨、2％葡萄糖)的试管中接种，在28℃、150rpm的条件下培养一夜。将培养液1ml移入加入了YPD培养基9ml的培养皿，在28℃、150rpm的条件下培养5小时。培养液以8500rpm的转速进行3分钟的离心分离，收集细胞，用灭菌蒸馏水清洗一次。残渣用灭菌蒸馏水100μl溶解。转化用的溶液通过将115μl 60％的PEG3350、5μl 4M的醋酸锂、15μl蒸馏水混合来制备。将细胞裂解液50μl移入加入了转化用缓冲液135μl的微型离心分离用管中，加入鲑鱼DNA10μl和上述A制备的4种DNA片段(URA3-TDH3p-FLO40s)各5μl，使用搅拌机充分搅拌30秒钟。将管在42℃下进行40分钟的热处理。将转化后的细胞溶液200μl在选择培养基上摊开，在28℃下培养2-3天。随机采集在缺少尿嘧啶的培养基上生长的细胞菌落，将转化细胞分离。使转化细胞在YPD培养基上生长，并在4℃下保存。

C.利用了PCR的酿酒酵母转化株的确认

1.PCR用DNA的制备

将上述B制备的转化细胞，在放入了1ml YPD培养基的12孔板的孔中接种，在28℃下培养20小时。培养后，添加YPD培养基1ml，再在28℃下培养4小时。采集培养液1.5ml，转移至微型离心分离用管中，以12000rpm的转速进行3分钟的离心分离后，除去上清液，用灭菌蒸馏水将残渣清洗一次。除去蒸馏水，将7.5μl的细胞转移至含有2.5μl 1％SDS的微型离心分离用管中，使用搅拌机充分搅拌30秒。以12000rpm的转速进行3分钟的离心分离，取上清液。上清液用于菌落PCR。

2.菌落PCR

菌落PCR使用如表2所示的引物进行。PCR反应液包括0.4μM的1对引物各0.4μl、KOD Dash缓冲液1.0μl(TOYOBO社制)、0.2mMdNTPs1.0μl(TOYOBO社制)、KOD Dash DNA聚合酶0.2μl(TOYOBO社制)、灭菌水4.0μl，以上述制备的转化细胞的染色体DNA5.0μl作为模板，在总体积为10μl的液体中进行PCR。反应首先在94℃下加热1分钟，然后在94℃下进行20秒钟的热变性，在60℃下退火2秒钟，在74℃下进行4分钟的延伸反应，上述反应过程进行30次循环。结果确认，如图3所示，可制备在酿酒酵母BY4700株中导入了URA3-TDH3p-FLO40s的转化株。这里制备的4种酿酒酵母的转化株，是在内源性的FLO1、FLO5、FLO9或FLO10基因的上游含有作为选择标记的URA3基因序列、和TDH3启动子序列的转化株。

[表2]

实施例2

<源于酿酒酵母的URA3-TDH3p-FLOs向马克斯克鲁维酵母中的导入>

A.URA3-TDH3p-FLOs的扩增

使用源于实施例1中制备的酿酒酵母的转化株的染色体DNA作为模板，来制备马克斯克鲁维酵母转化用的DNA片段(URA3-TDH3p-FLOs；FLO基因表达盒)。如表3所示，设计用于扩增各酿酒酵母的转化株的URA3序列、TDH3p序列和完整长度FLO基因的引物，并扩增DNA片段URA3-TDH3p-FLOs。PCR反应按与实施例1A相同的方法进行。反应首先在94℃下加热1分钟，然后在94℃下进行20秒钟的热变性、在55℃下退火30秒钟，在68℃下进行5分钟的延伸反应，上述反应过程进行30次循环。结果，用琼脂糖电泳以及UV照射的照片来分析扩增的PCR产物(图4)。

[表3]

B.马克斯克鲁维酵母的URA3缺陷株的制备

马克斯克鲁维酵母的URA3缺陷株利用Hashimoto等的方法(ApplMicrobiol.Biotechnol.，69：689-696，2006)取得。即，将酵母株涂在YPD板上，照射UV60秒钟后，在28℃下培养一晚，将该板复制成用Akada等的方法(Yeast 23，399-405，2006)制备的5-FOA培养基，再培养3天。将生长的菌落分离，确认尿嘧啶缺陷型后，将转化成功的株作为RAK3605株。

C.URA3-TDH3p-FLOs向马克斯克鲁维酵母染色体中的导入

将马克斯克鲁维酵母RAK3605在加入了25ml YPD培养基的250ml三角烧瓶中接种，在28℃下培养18小时。将培养液25ml移入50ml的离心管中，以8500rpm的转速进行5分钟的离心分离，收集细胞，除去上清液。转化用的溶液为600μl的溶液，其含有60％的PEG3350400μl、1M的DTT 60μl、4M的醋酸锂30μl、蒸馏水110μl。用500μl的转化用溶液裂解细胞。将细胞裂解液100μl移入微型离心分离用管中，并加入作为FLO基因表达盒的上述制备的DNA片段5μl，使用搅拌机充分搅拌30秒钟。将管在47℃下进行15分钟的热处理。在转化后的细胞溶液中加入100ml的YPD培养基，将200μl在缺少尿嘧啶的培养基上摊开，在28℃下培养2-3天。采集在缺少尿嘧啶的培养基上生长的细胞菌落，并将转化细胞分离。使转化细胞在YPD培养基上生长1-2天，并在4℃下保存。

实施例3

<表达FLO基因的马克斯克鲁维酵母和酿酒酵母的凝集性>

将表达FLO基因的马克斯克鲁维酵母、和酿酒酵母分别在加入了5mlYPD培养基的试管中接种，在28℃、150rpm的条件下培养24小时。培养后，使用搅拌机将试管充分搅拌15秒钟，将试管在试管架上竖立1小时，观察随时间的凝集速度。如图5所示，FLO基因过表达株与野生株(WT：马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042、WT：酿酒酵母BY4700)相比，表现为高的凝集性。

实施例4

<马克斯克鲁维酵母的FLO基因过表达株在高温下的凝集性>

将表达FLO基因的马克斯克鲁维酵母在孔中接种，所述孔是在24孔板的各孔中加入了5ml YPD培养基的孔，在28℃或40℃下，以150rpm的转数振荡24小时进行培养。如图6所示，马克斯克鲁维酵母的FLO基因过表达株，可以维持高温下的凝集性。

[参考例]

下面，作为参考例，表示对于使用了直链状DNA的、有效的马克斯克鲁维酵母的转化方法的条件进行研究的结果。

<材料>

1.培养基

对于YPD培养基，在蒸馏水中溶解1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖，用高压釜在121℃下处理20分钟。缺少尿嘧啶的培养基(以下称为“-U培养基”)由源于0.17％酵母的氮源(除去氨基酸和硫酸铵)、0.5％硫酸铵、2％葡萄糖、还有0.06％的氨基酸混合物(4％腺苷硫酸盐、16％L-色氨酸、16％L-盐酸组氨酸、16％L-蛋氨酸、32％L-亮氨酸和16％L-盐酸赖氨酸)制成。这些成分溶解在蒸馏水中，用高压釜在121℃下处理20分钟之前，用1N氢氧化钠调制成pH6.0。当形成固体培养基时，添加2％琼脂。

2.酵母菌株

利用酿酒酵母BY4704(ATCC200868)得到用于转化的URA3基因片段。宿主使用作为马克斯克鲁维酵母的URA3缺陷株的DMKU3-1042、NCYC587(由National Collection of Yeast Cultures，Institute of FoodResearch，Norwich Research Park，Colney，Norwich，United Kingdom，NR47UA.获得)、IFO0273和IFO0277(上述2种由独立行政法人制品评价技术基础机构バイオテクノロジ一本部·生物遗传资源部门(NBRC)获得)。全部酵母在用于转化前，在新鲜的YPD培养基的板上，在28℃下培养1～2天。

3.DNA片段

源于酿酒酵母BY4704的URA3基因片段，使用KOD-Plus DNA聚合酶(TOYOBO社制)进行PCR来扩增。引物组适当使用URA3-40(5’-atcaaagaaggttaatgtggctgtgg-3’：Seq.No.24)和URA3-40c(5’-ttcgtcattatagaaatcattacgac-3’：Seq.No.25)、URA3-300(5’-gaagagtattgagaagggcaac-3’：Seq.No.26)和URA3-300c(5’-tgttgtgaagtcattgacacag-3’：Seq.No.27)、或者URA3-1000(5’-tactaggaaatgagaatttttggaa-3’：Seq.No.28)和URA3-1000c(5’-tgcgatt器cagtggaacagtggta-3’：Seq.No.29)。PCR首先是在94℃下加热1分钟，然后在94℃下进行20秒钟的热变性，在55℃下退火30秒钟，在68℃下进行3分钟的延伸反应，上述过程进行30次循环。

<转化方法>

将作为URA3基因缺陷株的马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042菌株细胞在放入了YPD培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖、2％琼脂)的培养皿上，在28℃下培养一夜，从中采集试验用的细胞。细胞接种到放入了YPD液体培养基(1％酵母提取物、2％胨、2％葡萄糖)25ml的三角烧瓶中，在28℃下、在通气下以150rpm的转速振荡培养17小时。取出培养液50ml，移入离心分离管中，以8000rpm的转速进行2分钟的离心分离。除去上清液，在残渣中加入1.4ml转化用缓冲液(60％PEG33502ml、4M醋酸锂150μl、1M DTT 300μl、灭菌蒸馏水550μl)，搅拌混合15秒，将混合溶液移入到微型离心分离管中。以12000rpm的转速进行15秒钟的超速离心分离，除去上清液。在残渣中加入上述转化用缓冲液500μl，充分搅拌。将混合液100μl移入微型离心分离管中，并添加DNA片段(URA3)25ng(0.5μl)作为试验用，对照不添加上述DNA片段(URA3)。用混合器充分混合，在47℃下进行15分钟的热休克并培养。接着，在反应液中加入灭菌水和-U培养基150μl并使其混悬，将混合液用涂布器涂在-U固体培养基的板上，在28℃下培养2～3天。

使用利用URA3-40(Seq.No.24)和URA3-40c(Seq.No.25)扩增的DNA片段进行的结果示于图14。对于作为对照的URA3基因缺陷株，观察不到菌体的生长，对于试验用株，发现较多的菌落，证明在细胞中摄入了URA3基因的DNA。

<酵母细胞浓度的影响>

在YPD液体培养基中生长的酵母细胞的浓度，利用600nm(OD600)的吸光度进行测定。除了在42℃下进行2小时的热休克处理以外，在与实施例1相同的条件下进行转化。其结果如图9所示，明了酵母细胞的浓度越高，反应性越高。

<转化用反应液组成的影响>

1.聚乙二醇(PEG)的分子量和稀释溶剂

在与实施例1相同的条件下，改变转化用缓冲液中聚乙二醇(PEG)的分子量来进行转化。PEG使用PEG3350(平均分子量3350)和PEG600(平均分子量600)，使其在转化用缓冲液中最终浓度为40％。另外，作为对照，在不加入PEG的情况下，同样来进行转化。如图10所示，添加PEG3350可以得到有效的结果。

2.DTT

在与上述条件相同的条件下，将转化用缓冲液中DTT的最终浓度从0改变至100mM来进行转化。其结果如图11所示，明了DTT的效果有浓度依赖性。

<源于酿酒酵母染色体的DNA片段大小的影响>

在与上述条件相同的条件下，仅改变扩增引物而对酿酒酵母的染色体URA3DNA片段进行转化。所用的引物使用DNA长度为1.702kb的URA3-300(Seq.No.26)和URA3-300c(Seq.No.27)的组、或者长度为2.804kb的URA3-1000(Seq.No.28)和URA3-1000c(Seq.No.29)的组，用PCR进行扩增。其结果如图12所示，在PCR中，对于任一种情况均表现高的转化效率。此外，对于反应液的混悬，使用-U培养基的情况表现高的转化效率。

<热休克的时间和温度的影响>

在与上述条件相同的条件下，对于添加DNA片段后的反应液的热休克，仅改变温度和时间进行转化。热休克在42℃、47℃或49℃的温度下进行1分钟、5分钟、15分钟或45分钟。其结果如图13所示，明了根据温度不同，有效时间不同。

<宿主马克斯克鲁维酵母的菌株的选择>

在与上述条件相同的条件下，使用与马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042相同的URA3基因缺陷株，即NCYC587、IFO0273和IFO0277进行转化。其结果如图14所示，知晓作为宿主，使用马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042是最有效的。此外，对于反应液的混悬，使用-U培养基的情况表现高的转化效率。

本发明的酵母的转化方法与现有的人为转化法相比，具有下述优点：操作简便，转化所需要的时间短，且具有每1μg的DNA为10的6次方个以上这样的高转化率，而且转化细胞的保存良好，可以充分地进行传代。

工业适用性

根据本发明，可以提供有利于生物乙醇的工业生产的、凝集性和耐热性优异的乙醇产生酵母。

受理机构记入栏

国际局记入栏

Claims (9)

1.具有凝集性和耐热性的马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)转化株的制备方法，其特征在于，依次含有下述工序(A)～(C)：

(A)在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的内源性FLO1基因或内源性FLO9基因的上游导入标记基因序列和表达启动子序列来制备酿酒酵母转化株的工序；

(B)由染色体DNA得到含有标记基因序列、表达启动子序列、和FLO基因序列的DNA片段的工序，所述染色体DNA源于工序(A)中制备的酿酒酵母转化株；

(C)将工序(B)中得到的DNA片段作为FLO基因表达盒导入马克斯克鲁维酵母，制备马克斯克鲁维酵母转化株的工序。

2.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，标记基因为营养缺陷型标记基因。

3.根据权利要求2所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，营养缺陷型标记基因是组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1种的营养缺陷型基因。

4.根据权利要求3所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，营养缺陷型标记基因是URA3基因。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的制备方法，其特征在于，马克斯克鲁维酵母是在组氨酸、亮氨酸、尿嘧啶、蛋氨酸、赖氨酸、腺嘌呤、色氨酸、精氨酸的至少1种的营养缺陷型基因中具有突变的马克斯克鲁维酵母突变体。

6.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，表达启动子是3-磷酸甘油醛脱氢酶(TDH3)启动子。

7.根据权利要求1所述的马克斯克鲁维酵母转化株的制备方法，其特征在于，将线状的DNA片段作为FLO基因表达盒导入马克斯克鲁维酵母。

8.由权利要求1所述的制备方法制备的、具有凝集性和耐热性的马克斯克鲁维酵母转化株。

9.根据权利要求8所述的马克斯克鲁维酵母转化株，其特征在于，其是RAK4299株，其保藏号为：NITE BP-514，或RAK4301株，其保藏号为：NITE BP-516。

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