CN109161565B - 一种利用乳清生产乙醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种高效利用乳清生产乙醇的方法，所述方法是通过利用一株保藏编号为CGMCC No.11223的乳清利用型酿酒酵母工程菌在含有乳清或乳糖的培养基中静置培养发酵来生产乙醇。本发明所述酿酒酵母菌，在缓解葡萄糖阻遏现象的同时消除酿酒酵母菌自身的半乳糖代谢调控，该菌能够在乳清浓度为120g/L(乳糖含量为53.1g/L)的培养基中生长、发酵产乙醇，发酵周期为54h，乳清中乳糖利用率为98.7％，无水乙醇对乳糖得率为49.7％(相当于理论得率的92.3％)；同时缓解了葡萄糖对半乳糖的阻遏，使葡萄糖和半乳糖同时被利用。

Description

一种利用乳清生产乙醇的方法

本申请是如下专利申请的分案申请，原申请的申请号：2015106320883，申请日：2015-09-29，发明名称：一株高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌及其构建方法。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是利用一株乳清利用型酿酒酵母工程菌高效利用乳清生产乙醇的方法。

背景技术

乳清是指在制造干酪或干酪素时，分离出絮凝物后剩下的极稀薄的液体，是工业生产干酪及干酪素的副产品，每生产1t的干酪产生9t乳清，含有牛奶中55％的营养，但是由于乳清具有很高的BOD和COD，所以对环境造成很大的负担。目前，全球乳清产量约为16亿吨，而只有其中的50％得到处理，用于食品、饲料等方面，剩下的约8亿吨没有得到有效利用，被***到自然界中，不但造成环境的污染，而且还造成该资源的巨大浪费。乳清中除了含有20％乳品蛋白外，含量最多的是乳糖，约占乳清5％左右，是产生高BOD和COD的主要原因。

如何利用乳清中的乳糖，从而减低乳清对环境的污染一直是乳制品行业关注的问题。乳糖的利用主要有以下几个方向：用于食品行业、用于饲料行业、用于医药行业。但是随着全球能源危机的加剧，以及世界粮食安全问题等因素，乳清成为新的生产燃料乙醇的主要原料，也使得利用乳清生产燃料乙醇成为一个全新的热点。

目前国外利用乳清生产燃料乙醇已有40多年的历史，所使用的菌种主要有克鲁维酵母和酿酒酵母。克鲁维酵母虽然能够利用乳清，但是该属酵母酒精产率低，抗逆性差，菌体生长量大，不适用于生产乙醇。酿酒酵母虽然是生产乙醇的最佳首选，但是野生型酿酒酵母不能够利用乳清为唯一碳源，所以如何改造酿酒酵母，使其可以发酵乳清产乙醇，一直是科研人员的研究热点。目前国外的解决方法主要分为以下几种：一、是利用原生质体融合技术，对酿酒酵母及克鲁维酵母进行融合，筛选既可以利用乳糖又能高效产乙醇的突变株；二、是采用基因工程手段，把外源基因导入到酿酒酵母体内，使得酿酒酵母具有分解乳糖的能力，从而解决其不能利用乳清的问题。目前导入最多的外源基因为克鲁维酵母的LAC4基因(编码乳清分解酶)和LAC12基因(编码乳清通透酶)。但是上述两种方法所构建的菌株均存在乳清利用缓慢、发酵周期长等问题。

对于Lac⁺酿酒酵母工程菌株而言，乳清中的乳糖先要被分解成葡萄糖和半乳糖之后才会再继续代谢。而对于酿酒酵母来说，其在利用半乳糖和葡萄糖时存在巨大差异，这种差异既包括半乳糖代谢自身的调控，也包括葡萄糖对半乳糖利用酶系的抑制，即葡萄糖阻遏现象。半乳糖作为酿酒酵母的“替代碳源”，耗氧状态下其代谢速率仅为葡萄糖代谢速率的1/3。半乳糖需先经过Leloir途径代谢成6-磷酸葡萄糖后才能进入糖酵解途径被酵母利用。Leloir途径所需酶由GAL基因编码，酿酒酵母的GAL基因属于典型的表达调节基因。有四种基因产物参与了GAL基因***的这种表达调节，它们分别是位于XVI染色体上的GAL4基因编码一种能结合上述五种基因的上游序列位点并激活这些基因转录的Gal4蛋白；还有位于染色体XIII上的GAL80基因编码的Gal80蛋白则能和Gal4蛋白直接结合，从而抑制Gal4的转录激活功能；以及位于染色体IV上的GAL3基因编码的Gal3蛋白可以在半乳糖诱导信号的作用下同ATP、半乳糖发生别构效应，产生的别构效应物同Gal80蛋白结合，释放Gal4蛋白，但是目前半乳糖产生诱导信号的作用机制还不清楚。除了上述三种调控蛋白外，最近研究表明位于染色体XIV上的GAL6基因编码的Gal6蛋白也属于GAL调控基因的一种，Gal6蛋白会影响GAL家族基因转录mRNA的稳定性。

除了GAL基因自身表达调节过程，其表达还受葡萄糖的抑制。在酵母菌中，许多基因的表达受葡萄糖的控制和调节作用，葡萄糖的阻遏涉及到很多因素，包括葡萄糖信号传输、中间调节因子、特殊转录阻遏和激活蛋白等，Mig1蛋白复合体和GAL-激活蛋白(Gal4)之间的复杂作用被认为是葡萄糖阻遏半乳糖代谢的主要步骤。

在酿酒酵母中，中性海藻糖分解酶是由NTH1和NTH2基因编码，其中起主要作用的是NTH1编码的蛋白。而葡萄糖阻遏蛋白复合物是由三个蛋白组成的复合物，其中只有由MIG1编码的Mig1蛋白同半乳糖利用所需酶基因结合，抑制其转录。而在半乳糖代谢调控途径中，起到负调控表达作用的调控蛋白共有两个，分别为Gal80(由GAL80基因编码)和Gal6(由GAL6基因编码)。

邹静等《Lac⁺酿酒酵母工程菌中GAL80基因敲除对乳清利用的影响》公开了构建一株可以高效利用乳清的酿酒酵母工程菌株，克隆了AY5的GAL80基因，构建敲除质粒pUC-GABCUP。以该质粒为模板PCR扩增同源重组片段GA-CUPl-GB，以Lac⁺酿酒酵母AY51024M为受体菌株，利用同源重组的方法敲除受体菌株中的GAL80基因，得到一株既解除Gal80抑制又能利用乳清的菌株AY51024M-G。

目前，国内外还没有在过表达LAC4和LAC12基因同时又解除半乳糖代谢调控的报道。

发明内容

本发明的目的是通过利用一株乳清利用型酿酒酵母工程菌提供一种高效利用乳清生产乙醇的方法。

所述方法是利用保藏编号为CGMCC No.11223的酿酒酵母菌株在含有乳清或乳糖的培养基中静置培养发酵来生产乙醇，发酵周期54h。

优选的，所述培养基的组成为：乳清粉120g/L或乳糖53.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水。

优选的，所述发酵的温度为30℃。

本发明提供的乳清利用型酿酒酵母工程菌(Saccharomyces cerevisiae)具体为AY5MG，已于2015年8月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC No.11223，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae。

本发明所述酿酒酵母工程菌AY5MG在乳清浓度为120g/L(乳糖含量为53.1g/L)的培养基中生长发酵产乙醇，发酵周期为54h，乳清中乳糖利用率为98.7％；无水乙醇对乳糖得率为49.7％(相当于理论得率的92.3％)。

本发明所述乳清利用型酿酒酵母工程菌的构建方法，是通过强启动子PGK1分别表达乳糖分解酶基因LAC4及乳糖通透酶基因LAC12，同时敲除MIG1、NTH1以及GAL6基因，在缓解葡萄糖阻遏现象的同时消除酿酒酵母菌自身的半乳糖代谢调控，得到一株具有高耐性的高效利用乳糖产乙醇酿酒酵母工程菌。

本发明所述酿酒酵母工程菌株的构建方法具体包括如下步骤：

1)以酿酒酵母基因组为模版，将PCR扩增出的GAL6基因的上、下游片段GAL6A和GAL6B与pUC19质粒连接得到质粒pUC-G6AB；

2)将来源于Yep-C质粒的铜抗性基因CUP1与pUC-G6AB连接，得到质粒pUC-G6AB-CUP1；

3)利用PCR扩增技术，以质粒pUC-G6AB-CUP1为模板，扩增出GAL6基因的同源重组片段GAL6A-CUP1-GAL6B；

4)采用醋酸锂转化法将GAL6A-CUP1-GAL6B同源重组片段导入到酿酒酵母受体菌株的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株；所述受体菌株是采用专利CN102604849B公开的方法通过强启动子PGK1分别表达乳清分解酶基因LAC4及乳清通透酶基因LAC12，同时敲除MIG1基因和NTH1基因而获得的基因工程菌。

5)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳清的酿酒酵母工程菌(双倍体)。

本发明还提供了一种专门用于鉴定所述的去除半乳糖代谢负调控子的验证序列，该基因序列是以G6A-U和G6B-D为引物，以所述的利用乳清酿酒酵母工程菌株基因组为模板，扩增片段测序为一特异性序列，如序列表1所示。

可以利用G6A-U和G6B-D扩增出的引物大小来判断该基因是否被去除。

本发明的优点和积极效果：

本发明使菌株在原有利用乳清能力的基础上，通过阻断半乳糖代谢调控负阻遏元件基因，获得了一株去除半乳糖代谢调控、快速高效利用乳清产乙醇的酿酒酵母工程菌株AY5MG。

本发明所获得的可以利用乳清的酿酒酵母工程菌Saccharomyces cerevisiaeAY5MG(保藏号CGMCC No.11223)与初始的酿酒酵母菌(受体菌AY-510B24M Saccharomycescerevisiae CGMCC No.5843)相比，能够更为快速的利用乳清，在乳清浓度为120g/L(乳糖含量为53.1g/L)的培养基中生长、发酵产乙醇；发酵周期为54h，乳清中乳糖利用率为98.7％；无水乙醇对乳糖得率为49.7％(相当于理论得率的92.3％)；同时缓解了酿酒酵母自身的半乳糖代谢调控，使乳清可以被快速利用，在含有19％(v/v)乙醇，或者发酵温度为39℃时可以正常发酵。本发明酿酒酵母工程菌对发酵设备及条件没有特殊要求，一般酒厂的设备和条件均可使用，因而有广泛的应用前景，能为以乳清为原料生产燃料乙醇提供可能。

附图说明

图1：质粒pUC-G6AB-CUP1的构建流程；

图2：质粒pUC-G6AB-CUP1的验证电泳图。

图3：阳性重组酿酒酵母单倍体的验证。

图4：乳清利用型酿酒酵母工程菌的构建路线图。

图5：工程菌与亲本在模拟乳清分解液中发酵情况比较，其中(A)为亲本AY-510B24M，(B)为工程菌AY5MG。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的受体菌株是可以采用任何来源的Lac⁺酿酒酵母双倍体菌株。

实施例1：去除半乳糖代谢调控的乳清酿酒酵母基因工程菌的构建

(1)基因工程菌株的构建

1)以酿酒酵母AY5(Saccharomyces cerevisiae CGMCC No 2.1364)基因组为模板，以G6A-U和G6A-D为引物，利用PCR扩增出GAL6基因全序列上游的长度为646bp大小的片段GAL6A，同理利用G6B-U和GB6-D为引物，扩增出GAL6基因全序列下游的长度为665bp大小的片段GAL6B(引物序列及酶切位点见表1)，然后将GAL6A、GAL6B与pUC19质粒连接得到质粒pUC-G6AB；

2)以Yep-C质粒为模板，以Cup-U和Cup-D1、Cup-D2为引物，扩增出1410bp的铜抗性基因CUP1与质粒pUC-G6AB相连接，得到质粒pUC-G6AB-CUP1(构建流程见图1)；

3)以已构建的pUC-G6AB-CUP1质粒为模板，以G6A-U、G6B-D为引物，利用PCR扩增技术，扩增出同源重组片段GAL6A-CUP1-GAL6B；

表1质粒构建过程中所用的引物序列以及酶切位点

图2为pUC-G6AB-CUP1质粒的构建过程的电泳验证图。其中，泳道1为以AY-510B24M为模板扩增出的GAL6A片段；泳道2为以pUC-G6AB-CUP1质粒为模板，扩增出的GAL6A片段；泳道3为以AY-510B24M为模板扩增出的GAL6B片段；泳道4为以pUC-G6AB-CUP1质粒为模板，扩增出的GAL6B片段；泳道5为以Yep-C为模板扩增出的CUP1片段；泳道6以pUC-G6AB-CUP1质粒为模板，扩增出的CUP1片段；泳道7为以pUC-G6AB-CUP1质粒为模板，扩增出来的GAL6A-CUP1-GAL6B基因片段，泳道M为DL5000DNA marker。

4)采用醋酸锂转化法将GAL6A-CUP1-GAL6B同源重组片段导入到Lac⁺酿酒酵母的a型和α型单倍体，得到同源重组后的酿酒酵母基因工程单倍体菌株；本实施例所用Lac⁺酿酒酵母具体为专利CN102604849B公开的酿酒酵母AY-510B24M(Saccharomyces cerevisiae，保藏号为CGMCC No 5843)

图3为a和α型阳性重组单倍体PCR验证结果。其中泳道1为a型重组单倍体中扩增出来的GAL6A-CUP1-GAL6B基因片段；泳道2为α型重组单倍体中扩增出来的GAL6A-CUP1-GAL6B基因片段；泳道3为AY-510B24M为模板，采用相同的引物扩增出来的完整GAL6片段；泳道4为DL5000 DNA marker。泳道1、2表明亲本中的GAL6基因已经被GAL6A-CUP1-GAL6B同源重组片段替代。

5)将纯化后的酿酒酵母a型和α型重组单倍体进行融合，通过抗性平板和生孢实验筛选得到可以利用乳清的工程菌(双倍体)。

(2)基因工程菌株的特异性序列

获得的基因工程菌株AY5MG染色体中含有一段特异性序列，可通过PCR扩增测序后进行负调控基因GAL6去除的鉴定。

特异性片段扩增的引物序列分别为：

G6A-U:5'-AAAGAATTCGCGGAAAGGCAGGCAATA-3’

G6B-D:5'-ATCAAGCTTATGGTAGCCGAATGAATGAAAT-3’

特异性片段的基因序列见序列表1。

实施例2：利用乳清产燃料乙醇工程菌发酵性能的研究

将AY5MG和其亲本AY-510B24M分别接入20mL葡萄糖培养液中，30℃过夜培养12h；离心洗涤后将菌液全部转至200mL乳清培养基中，30℃静置培养发酵。乳清培养基为(g/L)：乳清粉120(乳糖含量为53.1g/L)，(NH₄)₂SO₄ 5，MgSO₄·7H₂O 1，用水定容至1L。发酵期间每隔24h震荡取样，并记录失重；发酵结束后，停止培养并称重；测定发酵液的残糖浓度、酒精浓度和菌体干重表征其综合性能，结果见表2。

表2酿酒酵母受体菌和工程菌在乳清中发酵性能

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值。

实施例3：乳清利用型酿酒酵母工程菌与出发菌株乳清分解产物的葡萄糖阻遏现象研究

将工程菌和受体菌分别接入5mL YEPD培养液中，30℃过夜培养12h；将菌液全部转至20mL半乳糖培养液中，30℃培养24h。配制模拟乳清分解产物培养基：葡萄糖3g，半乳糖3g，(NH₄)₂SO₄ 0.5g，MgSO₄·7H₂O 0.1g，酵母粉0.2g，蛋白胨0.1g，KH₂PO₄ 0.3g，蒸馏水100mL。按10％接种量接种，30℃静置培养。发酵期间每隔一定时间振荡取样，测不同糖浓度，结果见图5。乳清中乳糖在酿酒酵母工程菌株内首先要分解成葡萄糖和半乳糖，然后再进入各自的代谢途径。然而对于酿酒酵母而言，葡萄糖的存在会严格抑制半乳糖的利用，这就是葡萄糖阻遏现象。从图5可以看出，去除GAL6基因，也可以减缓AY51024M的葡萄糖阻遏现象，缩短在混糖中的发酵周期。

实施例4：所得工程菌与受体菌耐性比较

将工程菌与受体菌分别接于6mL/管YEPD中进行一级培养，30℃静置培养24h后取种子液0.5mL接于不同酒精浓度的YEPD培养基中，30℃静置培养观察产气情况。温度耐性实验为取种子液0.5mL接于YEPD培养基中，在不同温度中培养，观察其产气情况。酒精耐性及温度耐性见表4，具体培养基成分含量见表3。

表3不同酒精浓度培养基成分含量

表4工程菌与受体菌酒精耐性、温度耐性比较

注：“+”为生长，“－”为不长；所示结果为三个平行实验平均结果。

序列表

<110> 河北科技师范学院

<120> 一种利用乳清生产乙醇的方法

<130> 1

<141> 2018-10-19

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2948

<212> DNA

<213> 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)

<220>

<221> variation

<222> (1…2948)

<400> 1

aggagcaagc aactgaccca atattgactg ccactggacc tgaagacatg caacaaagtg 60

gaattcgcgg aaaggcaggc aatatgcttt acaaacaggc aaattttgtc tcttaatcct 120

gtgaagaggc atcgtatatt cagtgctttt tgaaatttag aaaatagtcg ctttattgat 180

tatgctacat atgttatttt gctttagtat gtgtcaaata gcatgcaatc gccgggtagt 240

gagtgacaca tccttttttc ccctcccacc agaaagtcac ctgctctctt aatcaatggg 300

gttgcatgtg gtaatcaatt gataacgccg gctgacaagt cgccgacggg cacccataaa 360

taaacgataa atagcccttg ctcttttgtt acatgcttcc tacttctgtt tcccggtcct 420

tgtatctcaa gacgtttaga agccaccttt tacgagcacc acaaattgtt ttaaaaagaa 480

tgtcctcttc catcgatatc agtaagatca actcttggaa caaagagttt caatccgact 540

taacccatca attggcaacc actgtcctta agaattataa tgccgatgat gcactgttga 600

acaagactag actgcaaaag caagataaca gggttttcaa cactgttgtc tctactgatt 660

ccactccagt caccaaccaa aaaagctctg gtagatgttg gttgtttgcc gcggtaccca 720

gctgaagctt cgtacgctgc aggtcgacaa cccttaatat aacttcgtat aatgtatgct 780

atacgaagtt attaggtcta gagatctgtt tagcttgcct cgtccccgcc gggtcacccg 840

gccagcgaca tggaggccca gaataccctc cttgacagtc ttgacgtgcg cagctcaggg 900

gcatgatgtg actgtcgccc gtacatttag cccatacatc cccatgtata atcatttgca 960

tccatacatt ttgatggccg cacggcgcga agcaaaaatt acggctcctc gctgcagacc 1020

tgcgagcagg gaaacgctcc cctcacagac gcgttgaatt gtccccacgc cgcgcccctg 1080

tagagaaata taaaaggtta ggatttgcca ctgaggttct tctttcatat acttcctttt 1140

aaaatcttgc taggatacag ttctcacatc acatccgaac ataaacaacc atgggtaagg 1200

aaaagactca cgtttcgagg ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt 1260

ataaatgggc tcgcgataat gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga 1320

agcccgatgc gccagagttg tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta 1380

cagatgagat ggtcagacta aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc 1440

attttatccg tactcctgat gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggcaaaacag 1500

cattccaggt attagaagaa tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag 1560

tgttcctgcg ccggttgcat tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg 1620

tatttcgtct cgctcaggcg caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt 1680

ttgatgacga gcgtaatggc tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt 1740

tgccattctc accggattca gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt 1800

ttgacgaggg gaaattaata ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat 1860

accaggatct tgccatccta tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac 1920

ggctttttca aaaatatggt attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga 1980

tgctcgatga gtttttctaa tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt 2040

gtcatttgta tagttttttt atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat 2100

ttatattttt tttcgcctcg acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt 2160

aatatcatgc gtcaatcgta tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta 2220

acgccgccat ccagtgtcga aaacgagctc tcgagaaccc ttaatataac ttcgtataat 2280

gtatgctata cgaagttatt aggtgatatc agatccacta gtggcctatg cggatccctg 2340

ccacgtcgat gaaacgtcta aattaccact tcgctaccgc gttgaaaatt cctggggtaa 2400

agactccggt aaagacggat tatacgtgat gactcaaaag tacttcgagg agtactgctt 2460

tcaaattgtg gtcgatatca atgaattgcc aaaagagctg gcttcaaaat tcacctcagg 2520

taaggaagag ccgattgtct tgcccatctg ggacccaatg ggtgctttgg ccaaataaat 2580

agtttcagca gctctgatgt agatacacgt atctcgacat gttttatttt tactatacat 2640

acataaaaga aataaaaaat gataacgtgt atattattat tcatataatc aatgagggtc 2700

acaaaggaaa ggttagcata ttaaataact gagctgatac ttcaacagca tcgctgaaga 2760

gaacagtatt gaaaccgaaa cattttctaa aggcaaacaa ggtactccat atttgctgga 2820

cgtgttcttt ctctcgtttc atatgcataa ttctgtcata agcctgttct ttttcctggc 2880

ttaaacatcc cgttttgtaa aagagaaatc tattccacat atttcattca ttcggctacc 2940

ataagctt 2948

Claims (3)

1.一种利用乳清生产乙醇的方法，其特征在于，所述方法是利用保藏编号为CGMCCNo.11223的酿酒酵母菌株在含有乳清或乳糖的培养基中静置培养发酵来生产乙醇，发酵周期54h。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基的组成为：乳清粉120g/L或乳糖53.1g/L，(NH₄)₂SO₄ 5g/L，MgSO₄·7H₂O 1g/L，溶剂为水。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述发酵的温度为30℃。

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