JP5435657B2 - 凝集性酵母、及びその作製法 - Google Patents
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Description
siae)の内在性FLO1遺伝子、及び、内在性FLO9遺伝子から選択される1以上のFLO遺伝子の上流にマーカー遺伝子配列及び発現プロモーター配列を導入してサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を作製する工程;(B)工程(A)で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体DNAから、マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、FLO遺伝子配列を含むDNA断片を得る工程;(C)工程(B)で得られたDNA断片を、FLO遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を作製する工程;の工程(A)〜(C)を順次含むことを特徴とする凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)形質転換体の作製方法や、[2]マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子であることを特徴とする上記[1]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[3]栄養要求性マーカー遺伝子がヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも1つの栄養要求性遺伝子であることを特徴とする上記[2]に記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[4]栄養要求性マーカー遺伝子がURA3遺伝子であることを特徴とする上記[3]記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[5]クルイベロマイセス・マルシアヌスが、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも1つの栄養要求性遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体であることを特徴とする上記[1]〜[4]のいずれかに記載の作製方法や、[6]発現プロモーターがグリセルアルデヒド-3-リン酸 デヒドロゲナーゼ3(TDH3)プロモーターであることを特徴とする上記[1]〜[5]のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[7] 線状のDNA断片を、FLO遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することを特徴とする上記[1]〜[6]のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法や、[8] クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体形質転換体が、RAK4299株(NITE BP−514)、又は、RAK4301株(NITE BP−516)であることを特徴とする上記[1]〜[7]のいずれか記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法に関する。
Molecular Biology Laboratory)、GenBank−NCBI(National
Center for Biotechnology Information)、SGD(Saccharomyces Genome Database)等のゲノムデータベースから、その塩基配列情報を知ることができる。
Microbiology,71(1):312-319,2005)、がある。この方法では、生育させたプレート上の酵母株に35cmの距離からUVを20秒照射して、0.05〜0.2%の変異体が得られている。この方法に準じて、ヒスチジン(His)、ロイシン(Leu)、アルギニン(Arg)、ウラシル(Ura)、メチオニン(Met)、トリプトファン(Tri)の栄養要求性変異株を得ることができる。あるいは、遺伝子破壊カセットベクター等、標的とする遺伝子と相同的な塩基配列を持ち、遺伝子として働き得ないDNAを細胞中に導入して相同的組換えを起こさせ、不活化させる方法もある(特開2001−46053号公報)。発現を目視できない遺伝子の変異を行う場合は、細胞の薬剤(抗生物質等)感受性試験、細胞の生育速度、酵素活性試験、光学的方法又は栄養要求性試験により観察できるようなマーカー遺伝子を導入する必要がある。
Microbiology,71(1):312-319,2005)に準じて作製したウラシル要求性遺伝子変異のクルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605等を用いることができる。また、上記形質転換用DNA断片の作製には、サッカロマイセス・セレビシエFLO遺伝子の配列情報に基づき、開始コドンATGからATGを含んで40番目の塩基までの配列からなるDNA断片を用いることができ、例えば、40塩基からなるDNA断片の塩基配列としては、FLO1遺伝子由来の場合は、atgacaatgcctcatcgctatatgtttttggcagtcttta(配列番号1)であり、FLO5遺伝子由来の場合は、atgacaattgcacaccactgcatatttttggtaatcttgg(配列番号2)であり、FLO9遺伝子由来の場合は、atgtctctggcacattattgtttactactagccatcgtca(配列番号3)であり、FLO10遺伝子由来の場合は、atgcctgtggctgctcgatatatatttttgaccggcctat(配列番号4)等を挙げることができる。これらのFLO遺伝子の塩基配列情報を基に作製したDNA断片をアニールして、発現プロモーター配列と栄養要求性マーカー遺伝子配列を有するプラスミドに挿入し、PCRによって所望の領域を増幅することでFLO遺伝子発現カセット用のDNA配列を得ることができる。上記発現プロモーター配列と栄養要求性マーカー遺伝子配列を有するプラスミドとしては、特に制限されるものではないが、例えば、Turgeonらの方法(Plasmid 51:24-36,2004)にしたがって作製された、発現プロモーターとしてTDH3pを、栄養要求性遺伝子としてウラシル要求性遺伝子を有するプラスミドURA3−TDH3p(「pST106」という)を好適に挙げることができる。
A.URA3−TDH3p断片の増幅
マーカー遺伝子であるURA3遺伝子配列と、発現プロモーター配列であるTDH3とを有するpST106プラスミドをテンプレートに、表1に示すプライマーを用いてPCR反応を行い、サッカロマイセス・セレビシエ形質転換用のDNA断片を作製した。上記プライマーはpST106プラスミドのURA3−TDH3p配列をはさむように設計されており、さらに、サッカロマイセス・セレビシエのFLO1、FLO5、FLO9又はFLO10遺伝子上流配列をそれぞれ40塩基含むよう設計されている。PCR反応液は、1対の0.2μMのプライマーを各々0.2μl、KOD plusバッファー1.0μl(TOYOBO社製)、0.2mM dNTPs1.0μl(TOYOBO社製)、0.2mM
MgSO40.8μl(TOYOBO社製)、0.4ng/μl pST106プラスミド0.4μl、KOD Plus DNA polymerase0.2μl(TOYOBO社製)、滅菌水6.2μlで、トータル10μlの液とした。反応は、まず94℃で1分間加熱し、その後、94℃で20秒間の熱変性、55℃で30秒間のアニーリング、68℃で3分間の伸長反応を30サイクル行った。その結果、FLO1、FLO5、FLO9又はFLO10遺伝子上流の相同配列をそれぞれ持つDNA断片URA3−TDH3p−FLO401、URA3−TDH3p−FLO405、URA3−TDH3p−FLO409、URA3−TDH3p−FLO4010(以下、これらのDNA断片を総称してURA3−TDH3p−FLO40sということがある)を得た(図1、2)。
サッカロマイセス・セレビシエ BY4700株を、2mlのYPD培地(1%酵母エキス、2%ポリペプトン、2%グルコース)の入ったテストチューブに接種し、28℃、150rpmで一夜培養した。培養液1mlを、YPD培地9mlの入ったペトリ皿へ移し、28℃、150rpmで5時間培養した。培養液は、8500rpmで3分間の遠心分離を行い、細胞を集め、滅菌蒸留水で一度洗った。残渣は、滅菌蒸留水100μlで溶解した。形質転換用の溶液は、60%のPEG3350を115μl、4Mのリチウムアセテート5μl、蒸留水15μlを混合して調製した。細胞溶解液50μlは、形質転換用バッファー135μlの入ったマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、サーモンDNA10μlと上記Aで作製した4種類のDNA断片(URA3−TDH3p−FLO40s)をそれぞれ5μlを加え、攪拌機を使って30秒間よく攪拌した。チューブを42℃で40分間熱処理をした。形質転換された細胞溶液200μlは、選択培地へ広げ、28℃で2−3日培養した。ウラシル欠損培地で生育した細胞のコロニーをランダムに採取して形質転換細胞を分離した。形質転換細胞は、YPD培地に生育させ、4℃で保存した。
1.PCR用DNAの調製
上記Bで作製した形質転換細胞を、1mlのYPD培地の入った12穴プレートのウエルに接種し、28℃で20時間培養した。培養後、YPD培地1mlを添加し、さらに28℃で4時間培養した。培養液1.5mlを採取して、マイクロ遠心分離用のチューブへ移し、12000rpmで3分間の遠心分離を行った後、上清を除き、残渣を滅菌蒸留水で一度洗った。蒸留水を除き、7.5μlの細胞を2.5μlの1%SDSを含むマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、攪拌機を使って30秒間よく攪拌した。12000rpmで3分間遠心分離を行い、上清を取った。上清は、コロニーPCRに使用した。
コロニーPCRは表2に示すプライマーを用いて行った。PCR反応液は、0.4μMの1対のプライマーを各々0.4μl、KOD Dashバッファー1.0μl(TOYOBO社製)、0.2mMdNTPs1.0μl(TOYOBO社製)、KOD Dash DNA polymerase0.2μl(TOYOBO社製)、滅菌水4.0μlで、上記で作製した形質転換細胞の染色体DNA5.0μlをテンプレートとして、トータル10μlの液でPCRを行った。反応は、まず94℃で1分間加熱し、その後、94℃で20秒間の熱変性、60℃で2秒間のアニーリング、74℃で4分間の伸長反応を30サイクル行った。その結果、図3で示すとおりサッカロマイセス・セレビシエ BY4700株にURA3−TDH3p−FLO40sが導入された形質転換体が作製されたことを確認した。ここで作製された4種類のサッカロマイセス・セレビシエの形質転換体は、内在性のFLO1、FLO5、FLO9又はFLO10遺伝子の上流に、選択マーカーであるURA3遺伝子配列と、TDH3プロモーター配列とを含むものである。
A.URA3−TDH3p−FLOsの増幅
実施例1で作製したサッカロマイセス・セレビシエの形質転換体由来の染色体DNAをテンプレートとして用いてクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換用のDNA断片(URA3−TDH3p−FLOs;FLO遺伝子発現カセット)を作製した。表3に示すように、各サッカロマイセス・セレビシエの形質転換体のURA3配列、TDH3p配列及び完全長FLO遺伝子を増幅するためのプライマーを設計し、DNA断片URA3−TDH3p−FLOsを増幅した。PCR反応は、実施例1Aと同様に行った。反応は、まず94℃で1分間加熱し、その後、94℃で20秒間の熱変性、55℃で30秒間のアニーリング、68℃で5分間の伸長反応を30サイクル行った。その結果、増幅したPCR産物をアガロース電気泳動やUV照射の写真で分析した(図4)。
クルイベロマイセス・マルシアヌスのURA3欠損株は、Hashimotoらの方法(Appl Microbiol. Biotechnol., 69:
689-696, 2006)で取得した。すなわち、酵母株をYPDプレートにスプレッドし、UVを60秒照射後、28℃で一晩培養し、そのプレートを、Akadaらの方法(Yeast 23, 399-405, 2006)で調製した5−FOA培地にレプリカし、さらに3日間培養した。生育したコロニーを単離し、ウラシル要求性を確認後、形質転換が成功した株をRAK3605株とした。
クルイベロマイセス・マルシアヌス RAK3605を、25mlのYPD培地の入った250mlの三角フラスコに接種し、28℃で18時間培養した。培養液25mlを、50mlの遠心管に移し、8500rpm5分間の遠心分離を行い、細胞を集め、上清を除去した。形質転換用の溶液は、60%のPEG3350を400μl、1MのDTT60μl、4Mのリチウムアセテート30μl、蒸留水110μlを含む600μlとした。細胞を500μlの形質転換用溶液で溶解した。細胞溶解液100μlをマイクロ遠心分離用のチューブへ移し、上記作製のDNA断片5μlをFLO遺伝子発現カセットとして加え、攪拌機を使って30秒間よく攪拌した。チューブを47℃で15分間熱処理をした。形質転換された細胞溶液に100mlのYPD培地を加え、200μlをウラシル欠損培地へ広げ、28℃で2-3日培養した。ウラシル欠損培地で生育した細胞のコロニーを採取して形質転換細胞を分離した。形質転換細胞は、YPD培地に1−2日間生育させ、4℃で保存した。
FLO遺伝子を発現するクルイベロマイセス・マルシアヌスと、サッカロマイセス・セレビシエを、それぞれ5mlのYPD培地の入ったテストチューブに接種し、28℃、150rpmで24時間培養した。培養後、テストチューブを,攪拌機を使って15秒間よく攪拌し、テストチューブはラックに1時間立てておき、経時的に凝集速度を観察した。図5に示すように、FLO遺伝子過剰発現株では、野生株(WT:クルイベロマイセス・マルシアヌス DMKU3−1042、WT:サッカロマイセス・セレビシエ BY4700)に比較し、高い凝集性を示した。
FLO遺伝子を発現するクルイベロマイセス・マルシアヌスを、24穴板の各ウエルに5mlのYPD培地が入っているウエルに接種し、28℃又は40℃、150rpmで24時間振とう培養した。図6に示すように、クルイベロマイセス・マルシアヌスのFLO遺伝子過剰発現株では、高温での凝集性が維持されていた。
[参考例]
以下に参考例として、直鎖状DNAを用いた効率的なクルイベロマイセス・マルシアヌスの形質転換方法の条件検討を行った結果を示す。
1.培地
YPD培地は、蒸留水中、1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコースを溶解し、121℃で20分間オートクレーブを掛けた。ウラシル欠損培地(以下「−U培地」とする)は、0.17%酵母由来の窒素源(アミノ酸と硫酸アンモニウムを除く)、0.5%硫酸アンモニウム、2%グルコース、さらに0.06%のアミノ酸混合物(4%アデノシンサルフェイト、16%L−トリプトファン、16%L−塩酸ヒスチジン、16%L−メチオニン、32%L−ロイシンと16%L−塩酸リシン)とした。これらの成分は蒸留水に溶解し、121℃で20分間オートクレーブに掛ける前に、1N水酸化ナトリウムでpH6.0に調製した。固体培地にする場合は、2%寒天を加えた。
サッカロマイセス・セレビシエBY4704(ATCC200868)より、形質転換のためのURA3遺伝子断片を得た。宿主としては、クルイベロマイセス・マルシアヌスのURA3欠損株であるDMKU3−1042、NCYC587(National Collection of Yeast Cultures,Institute
of Food Research,Norwich Research Park,Colney,Norwich,United
Kingdom,NR4 7UA.より入手)、IFO0273とIFO0277(前記2種は、独立行政法人製品評価技術基盤機構バイオテクノロジー本部・生物遺伝資源部門(NBRCより入手)を使用した。すべての酵母は、形質転換に使用する前に、新鮮なYPD培地のプレート上で、28°C、1〜2日間培養した。
サッカロマイセス・セレビシエ BY4704由来のURA3遺伝子断片は、KOD−Plus DNA ポリメラーゼ(TOYOBO社製)を用いてPCRを行い増幅した。プライマーセットは、URA3−40(5’−atcaaagaaggttaatgtggctgtgg−3’:配列番号24)とURA3−40c(5’−ttcgtcattatagaaatcattacgac−3’:配列番号25)、URA3−300(5’−gaagagtattgagaagggcaac−3’:配列番号26)とURA3−300c(5’−tgttgtgaagtcattgacacag−3’:配列番号27)、またはURA3−1000(5’−tactaggaaatgagaatttttggaa−3’:配列番号28)とURA3−1000c(5’−tgcgattggcagtggaacagtggta−3’:配列番号29)を適宜用いた。PCRは、まず94℃で1分間加熱し、その後、94℃で20秒間の熱変性、55℃で30秒間のアニーリング、68℃で3分間の伸長反応を30サイクル行った。
URA3遺伝子欠損株である、クルイベロマイセス・マルシアヌス DMKU3−1042菌株細胞を、YPD培地(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース、2%寒天)の入ったシャーレ上で28℃、一夜培養し、そこから試験用の細胞を採取した。細胞は、YPD液体培地(1%酵母エキス、2%ペプトン、2%グルコース)25mlの入った三角フラスコへ接種し、28℃で17時間、通気下150rpmで振とう培養した。培養液50mlを取り、遠心分離管に移して、8000rpmで2分間遠心分離を行った。上清を除き、残渣に形質転換用バッファー(60%PEG3350
2ml、4Mリチウムアセテート 150μl、1M DTT 300μl、滅菌蒸留水550μl)を1.4ml加え、15秒間攪拌混合し、混合溶液をマイクロ遠心分離管に移した。12000rpmで15秒間超遠心分離を行い、上清を除いた。残渣に、前記形質転換用バッファー500μlを加え、良く攪拌した。混合液100μlをマイクロ遠心分離管に移し、試験用には、DNA断片(URA3)25ng(0.5μl)を添加し、対照には添加しなかった。ミクサーでよく混合し、47℃で15分間ヒートショックを行って培養した。次いで、反応液に滅菌水及び-U培地150μlを加えて懸濁し、混合液をスプリーダーで−U固体培地のプレートに伸ばし、28℃で2〜3日培養した。
YPD液体培地中で生育させた酵母細胞の濃度は、600nm(OD600)の吸光度で測定した。42°Cで2時間のヒートショック処理を行うことを除いては、実施例1と同じ条件下で形質転換を行った。その結果、図9に示すように、酵母細胞の濃度は濃い程反応性が高いことが明らかになった。
1.ポリエチレングリコール(PEG)の分子量と希釈溶媒
実施例1と同じ条件下で、形質転換用バッファー中のポリエチレングリコール(PEG)の分子量を変えて形質転換を行った。PEGは、PEG3350(平均分子量3350)とPEG600(平均分子量600)を用い、形質転換用バッファー中、最終濃度40%となるようにした。また、対照としてPEGを加えない場合も同様に行った。図10に示すように、PEG3350を添加する方が効果的な結果であった。
上述の条件と同じ条件下で、形質転換用バッファー中のDTTの最終濃度を0から100mMまで変えて形質転換を行った。その結果、図11に示すように濃度依存的に、DTTの効果が明らかになった。
上述の条件と同じ条件下で、サッカロマイセス セレビシエの染色体URA3DNA断片を、増幅プライマーのみを変えて形質転換を行った。用いたプライマーは、DNAサイズが1.702kbとなるURA3−300(配列番号26)とURA3−300c(配列番号27)のセット、またはサイズが2.804kbとなるURA3−1000(配列番号28)とURA3−1000c(配列番号29)のセットを用いPCRで増幅した。その結果、図12に示すようにPCRでは、いずれの場合にも高い形質転換効率を示した。なお、反応液の懸濁は−U培地を用いる方が高い形質転換効率を示した。
上述の条件と同じ条件下で、DNA断片を加えた後の反応液のヒートショックについて、温度と時間のみを変えて形質転換を行った。ヒートショックは、42℃、47℃または49℃の温度で、1分間、5分間、15分間または45分間行った。その結果、図13に示すように、温度により効果的な時間が異なることが明らかになった。
上述の条件と同じ条件下で、クルイベロマイセス マルシアヌス DMKU3−1042と同じURA3遺伝子欠損株である、NCYC587、IFO0273およびIFO0277を用いて形質転換を行った。その結果、図14に示すように、宿主としては、クルイベロマイセス マルシアヌス DMKU3−1042を用いることが最も効果的であることが分かった。なお、反応液の懸濁は−U培地を用いる方が高い形質転換効率を示した。
Claims (10)
- 以下の工程(A)〜(C)を順次含むことを特徴とする凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス(Kluyveromyces marxianus)形質転換体の作製方法。
(A)サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の内在性FLO1遺伝子、及び、内在性FLO9遺伝子から選択される1以上のFLO遺伝子の上流にマーカー遺伝子配列及び発現プロモーター配列を導入してサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体を作製する工程;
(B)工程(A)で作製されたサッカロマイセス・セレビシエ形質転換体由来の染色体DNAから、マーカー遺伝子配列、発現プロモーター配列、及び、FLO遺伝子配列を含むDNA断片を得る工程;
(C)工程(B)で得られたDNA断片を、FLO遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入し、クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体を作製する工程; - マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子であることを特徴とする請求項1記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- 栄養要求性マーカー遺伝子がヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも1つの栄養要求性遺伝子であることを特徴とする請求項2に記載のクルベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- 栄養要求性マーカー遺伝子がURA3遺伝子であることを特徴とする請求項3記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- クルイベロマイセス・マルシアヌスが、ヒスチジン、ロイシン、ウラシル、メチオニン、リシン、アデニン、トリプトファン、アルギニンの少なくとも1つの栄養要求性遺伝子に変異を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス変異体であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- 発現プロモーターがグリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ3(TDH3)プロモーターであることを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- 線状のDNA断片を、FLO遺伝子発現カセットとしてクルイベロマイセス・マルシアヌスに導入することを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- クルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体が、RAK4299株(NITE BP−514)、又は、RAK4301株(NITE BP−516)であることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体の作製方法。
- 請求項1〜7のいずれかに記載の作製方法により作製された凝集性及び耐熱性を有するクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体。
- RAK4299株(NITE BP−514)、又は、RAK4301株(NITE BP−516)であることを特徴とする請求項9記載のクルイベロマイセス・マルシアヌス形質転換体。
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