CN116376726A - 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 - Google Patents
提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116376726A CN116376726A CN202310432198.XA CN202310432198A CN116376726A CN 116376726 A CN116376726 A CN 116376726A CN 202310432198 A CN202310432198 A CN 202310432198A CN 116376726 A CN116376726 A CN 116376726A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- strain
- gibberellin
- target
- yield
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229930191978 Gibberellin Natural products 0.000 title claims abstract description 56
- IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N gibberellic acid GA3 Natural products OC(=O)C1C2(C3)CC(=C)C3(O)CCC2C2(C=CC3O)C1C3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 56
- 239000003448 gibberellin Substances 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 45
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 61
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 55
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims abstract description 35
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 26
- 230000010354 integration Effects 0.000 claims abstract description 25
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims abstract description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000007852 inverse PCR Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000011559 double-strand break repair via nonhomologous end joining Effects 0.000 claims abstract 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 32
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 28
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 28
- 241000223218 Fusarium Species 0.000 claims description 24
- 108091033409 CRISPR Proteins 0.000 claims description 22
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 18
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 14
- 108090000913 Nitrate Reductases Proteins 0.000 claims description 14
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 14
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 235000012424 soybean oil Nutrition 0.000 claims description 11
- 239000003549 soybean oil Substances 0.000 claims description 11
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 claims description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 claims description 10
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 10
- 238000010354 CRISPR gene editing Methods 0.000 claims description 9
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 8
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 8
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 8
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 8
- 108020005075 5S Ribosomal RNA Proteins 0.000 claims description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 7
- 101150095344 niaD gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 7
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 claims description 7
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 6
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 claims description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 6
- 239000008118 PEG 6000 Substances 0.000 claims description 5
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 claims description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 5
- 102000016862 Dicarboxylic Acid Transporters Human genes 0.000 claims description 4
- 108010092943 Dicarboxylic Acid Transporters Proteins 0.000 claims description 4
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 claims description 4
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 4
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 3
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 claims description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 238000012269 metabolic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 14
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 230000006780 non-homologous end joining Effects 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 8
- IXORZMNAPKEEDV-SNTJWBGVSA-N LSM-6641 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-SNTJWBGVSA-N 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 7
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 6
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 4
- IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N gibberellin A3 Chemical compound C([C@@]1(O)C(=C)C[C@@]2(C1)[C@H]1C(O)=O)C[C@H]2[C@]2(C=C[C@@H]3O)[C@H]1[C@]3(C)C(=O)O2 IXORZMNAPKEEDV-OBDJNFEBSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002173 cutting fluid Substances 0.000 description 3
- 230000005782 double-strand break Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- 239000005980 Gibberellic acid Substances 0.000 description 2
- 101150064138 MAP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 2
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000013307 optical fiber Substances 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000007363 ring formation reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 1
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 1
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 1
- 241000221778 Fusarium fujikuroi Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000008236 biological pathway Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 230000008635 plant growth Effects 0.000 description 1
- 229940093429 polyethylene glycol 6000 Drugs 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- -1 suspending Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
- C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
- C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
- C12N9/0044—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on other nitrogen compounds as donors (1.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
- C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P27/00—Preparation of compounds containing a gibbane ring system, e.g. gibberellin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Botany (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及基因工程领域，公开了一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用。该鉴定方法包括以下步骤：将出发菌株中的改造基因敲除得到改造基因缺陷菌；制备改造基因缺陷菌的原生质体，将原生质体与改造基因进行NHEJ随机整合得到N个转化菌株，将N个转化菌株进行筛选得到赤霉素产量最高的转化菌株作为目标菌株；将目标菌株经反向PCR鉴定出改造基因在出发菌株上的整合靶点，以获得提高赤霉素产量的靶点。本发明还将出发菌株采用上述的鉴定方法处理得到的目标菌株作为发酵生产赤霉素的重组菌株。该鉴定方法能够鉴定出赤霉素产量提高的新靶点，获得高产赤霉素的重组菌株，为赤霉素生产菌的代谢工程改造提供了新的平台。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体地，涉及一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用。
背景技术
DNA双链断裂(DSB)会对细胞构成严重威胁，其修复途径主要包括非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)，其中HR是一种精细的修复方式，能够将供体DNA片段整合到基因组上的靶标位点来修复DSB。相对来说，NHEJ修复不需要大片段的同源序列识别，直接通过末端几个碱基直接相连的方式进行的，属于一种易错修复。对真核生物来说，NHEJ修复占主导地位，它可以在没有模板的前提下有效的修复DSB，与受限于同源模板的HR不同，它可以将目的基因随机性的***到基因组的不同位置，从而得到具有不同基因表达水平的重组菌株。
作为植物生长激素赤霉素的优势宿主，藤仓赤霉菌被认为是工业发酵生产的良好的细胞工厂。然而，它是一种具有复杂代谢机制的非模式菌，依靠发酵工程和诱变育种已经无法进一步解决产量瓶颈，为了获得性能优良、可稳定遗传的重组菌株，合成生物学改造技术受到越来越多的关注。继同源重组技术在赤霉菌中建立以来，赤霉素合成生物途径中的关键基因被鉴定及过表达。然而，目前还未有通过对赤霉素合成途径的关键基因以外的基因进行整合，以提高菌株生产赤霉素能力的研究和报道。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用，该鉴定方法能够鉴定出赤霉素产量提高的新靶点，获得高产赤霉素的重组菌株，为赤霉素生产菌的代谢工程改造提供了新的平台。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法，该鉴定方法包括以下步骤：
(1)将出发菌株中的改造基因敲除得到改造基因缺陷菌；
(2)制备所述改造基因缺陷菌的原生质体，将所述原生质体与所述改造基因进行NHEJ随机整合得到N个转化菌株，将N个所述转化菌株进行筛选得到赤霉素产量最高的转化菌株作为目标菌株；
(3)将所述目标菌株经反向PCR鉴定出所述改造基因在所述出发菌株上的整合靶点，以获得提高赤霉素产量的靶点。
优选地，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因。
优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。
优选地，步骤(1)中所述敲除的过程包括：采用CRISPR/Cas9***将所述改造基因敲除。
优选地，所述CRISPR/Cas9***的敲除骨架为pFfCas9-sgRNA质粒，所述pFfCas9-sgRNA质粒的组件包括Cas9基因、启动子pTRPC和强RNA聚合酶III型启动子5s rRNA；所述pFfCas9-sgRNA质粒的内部设计stuⅠ位点用于***营养筛选标记niaD中的N20。
优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述5s rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述N20的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
优选地，步骤(2)中所述NHEJ随机整合的过程包括：将所述原生质体、所述改造基因与PEG6000、STC缓冲液混合后悬浮得到悬浮液，将所述悬浮液置于固体再生平板上进行转化培养。
优选地，所述固体再生平板的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L。
优选地，所述转化培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
优选地，步骤(2)中所述筛选的过程包括：将所述转化菌株依次进行传代培养、发酵培养I。
优选地，所述传代培养的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L。
优选地，所述传代培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
优选地，所述发酵培养I的培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO41.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。
优选地，所述发酵培养I的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天。
本发明第二方面提供上述的鉴定方法在提高赤霉素产量中的应用。
本发明第三方面提供一种重组菌株，该重组菌株为将出发菌株采用上述的鉴定方法处理后得到的目标菌株。
优选地，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因，所述整合靶点为双羧酸转运蛋白位点处。
优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。
本发明第四方面提供一种赤霉素的制备方法，该制备方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养II。
优选地，所述发酵培养II的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天。
优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO4 1.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法，基于非末端同源重组的随机整合方法获得赤霉素生产菌的分子改造靶点，采用DNA随机整合技术向改造基因缺陷菌中导入该改造基因表达框，使改造基因随机整合到改造基因缺陷菌的染色体中，从而形成多个改造基因缺陷菌转化子，作为赤霉素生产菌突变库，将转化子进行发酵实验筛选到赤霉酸产量提高的高产菌株，并利用反向PCR技术鉴定改造基因整合在染色体中的位置，有利于鉴定出赤霉素产量提高的新靶点；同时该鉴定方法中获得的目标菌株可作为高产赤霉素的重组菌株。
进一步优选地，本发明以藤仓赤霉菌作为出发菌株，硝酸盐还原酶基因作为改造基因，转化效率高，更加有利于转化子的筛选，也表明DNA随机整合技术在藤仓赤霉菌中具有良好的转化效率。
附图说明
图1是实施例1中质粒pUC57-T7-fcc1-FfniaD的图谱；
图2是实施例2中30株转化菌株的发酵液中赤霉素GA3的含量图；
图3是本发明中提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法的工艺流程图。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明第一方面提供一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法，参见图3，该鉴定方法包括以下步骤：
(1)将出发菌株中的改造基因敲除得到改造基因缺陷菌；
(2)制备所述改造基因缺陷菌的原生质体，将所述原生质体与所述改造基因进行非同源末端(Nonhomologous End Joining，NHEJ)随机整合得到N个转化菌株，将N个所述转化菌株进行筛选得到赤霉素产量最高的转化菌株作为目标菌株；
(3)将所述目标菌株经反向PCR鉴定出所述改造基因在所述出发菌株上的整合靶点，以获得提高赤霉素产量的靶点。
本发明提供的提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法，基于非末端同源重组的随机整合方法获得赤霉素生产菌的分子改造靶点，采用DNA随机整合技术向改造基因缺陷菌中导入该改造基因表达框，使改造基因随机整合到改造基因缺陷菌的染色体中，从而形成多个改造基因缺陷菌转化子，作为赤霉素生产菌突变库，将转化子进行发酵实验筛选到赤霉酸产量提高的高产菌株，并利用反向PCR技术鉴定改造基因整合在染色体中的位置，有利于鉴定出赤霉素产量提高的新靶点；同时该鉴定方法中获得的目标菌株可作为高产赤霉素的重组菌株。
根据本发明，优选地，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因(niaD基因)。进一步优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明的发明人在研究过程中，意外地发现，采用niaD基因作为改造基因，获得的突变株转化效率高，有利于转化子的筛选，以最终的赤霉素产量为依据，可实现高效快速地筛选出赤霉素高产菌株；同时利用反向PCR鉴定出具体的整合靶点，揭示影响赤霉素产量的内在机制。
根据本发明，所述出发菌株可以是任意一种生产赤霉素的菌株，优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于进一步提高获得的目标菌株发酵合成赤霉素的产量。
根据本发明，优选地，步骤(1)中所述敲除的过程包括：采用CRISPR/Cas9***将所述改造基因敲除。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于提高DNA随机整合的转化效率。
本发明中，CRISPR/Cas9***可以采用现有技术中已有的组成及方法，具体地，采用CRISPR/Cas9***敲除所述改造基因的敲除骨架为pFfCas9-sgRNA质粒，所述pFfCas9-sgRNA质粒的组件包括Cas9基因、启动子pTRPC和强RNA聚合酶III型启动子5srRNA，所述pFfCas9-sgRNA质粒的内部设计stuⅠ位点用于***营养筛选标记niaD中的N20。进一步优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述5s rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述N20的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
本发明中，制备所述改造基因缺陷菌的原生质体可以采用现有的方法进行，示例性地，制备所述改造基因缺陷菌的原生质体的过程包括：首先配置崩溃酶(Dryslase)与溶壁酶(Lysing)的重量比为3:7的酶液，将酶液经过滤除菌后加入湿菌丝，置于25-35℃摇床中以转速为50-70rpm，每0.5h取样进行显微镜观察菌丝的裂解以及原生质体的生成情况，酶解后通过擦镜纸过滤菌丝，取滤液2500-3500rpm离心8-12min，弃上清，用STC缓冲液洗涤原生质体沉淀，最终保存至STC缓冲液中。
本发明中，STC缓冲液的组分为：山梨醇180-185g/L，无水氯化钙0.4-0.7g/L，Tris-base 0.1-0.15g/L，盐酸调节pH至7-8。
根据本发明，优选地，步骤(2)中所述NHEJ随机整合的过程包括：将所述原生质体、所述改造基因与聚乙二醇6000(PEG6000)、STC缓冲液混合后悬浮得到悬浮液，将所述悬浮液置于固体再生平板上进行转化培养。
本发明中，可将原生质体采用STC缓冲液形成溶液后，与所述改造基因、PEG6000、STC缓冲液进行混合、悬浮。
根据本发明，优选地，所述固体再生平板的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L。
根据本发明，优选地，所述转化培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
根据本发明，优选地，步骤(2)中所述筛选的过程包括：将所述转化菌株依次进行传代培养、发酵培养I。其中，传代培养的次数可以是一次或者多次，以得到稳定传代的转化菌株。
根据本发明，所述传代培养的培养基采用固体再生培养基，优选地，所述传代培养的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L。
根据本发明，优选地，所述传代培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
根据本发明，所述发酵培养I进行前可将传代培养获得的转化菌株，接种至种子培养基I中进行活化培养I，以对转化菌株的生长进行有效活化促进，提高对转化菌株生产赤霉素能力的准确表征。所述活化培养I的温度、时间等条件参数可根据出发菌株的类别进行相应的选择，以适于转化菌株的生长。优选地，所述活化培养I的条件包括：温度为25-30℃，时间为40-60h。
根据本发明，所述种子培养基I和发酵培养I的培养基的组分可根据出发菌株的类别进行选择，一般含有碳源、氮源、金属盐等营养成分。优选地，步骤(2)中所述发酵培养I的培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO41.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。
本发明中，碳源可以采用葡萄糖、果糖、蔗糖等物质中的一种或多种，氮源可以采用蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、酵母浸膏中的一种或多种。
根据本发明，所述发酵培养I的温度、时间等条件参数可根据出发菌株的类别进行相应的选择，以适于转化菌株的大量增殖。优选地，所述发酵培养I的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天。
本发明第二方面提供上述的鉴定方法在提高赤霉素产量中的应用。基于本发明提供的鉴定方法能够获得赤霉素生产菌种提高赤霉素产量的基因作用靶点，为高效生产赤霉素的工程菌的改造提供研究基础。
通过本发明提供的鉴定方法，能够获得在整合靶点上表达改造基因的目标菌株，基于此，本发明第三方面提供一种重组菌株，该重组菌株为将出发菌株采用上述的鉴定方法处理后得到的目标菌株。
根据本发明，优选地，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因，所述整合靶点为双羧酸转运蛋白位点处。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于进一步提高获得的目标菌株发酵合成赤霉素的产量。
根据本发明，优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
根据本发明，优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于更好地提高赤霉素的产量，为藤仓赤霉菌的代谢工程改造提供了新的平台。
本发明第四方面提供一种赤霉素的制备方法，该制备方法包括：将上述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养II。
根据本发明，所述发酵培养II进行前可将重组菌株接种至种子培养基II中进行活化培养II，以对重组菌株的生长进行有效活化促进。所述活化培养II的温度、时间等条件参数可根据重组菌株的类别进行相应的选择，以适于重组菌株的生长。优选地，所述活化培养II的条件包括：温度为25-30℃，时间为40-60h。
根据本发明，所述种子培养基II和发酵培养基的组分可根据重组菌株的类别进行选择，一般含有碳源、氮源、金属盐等营养成分。优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO4 1.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。
根据本发明，所述发酵培养II的温度、时间等条件参数可根据重组菌株的类别进行相应的选择，以适于重组菌株的大量增殖。优选地，所述发酵培养II的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天。
根据本发明，优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO4 1.5-4g/L，ZnSO40.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。发明人发现，在该优选的实施方式下，有利于更好地提高赤霉素的产量。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
以下实施例中，STC缓冲液的组分为：182g/L山梨醇、0.555g/L无水氯化钙，0.121g/L Tris-base，盐酸调节pH至7.5；
固体再生培养基的组分为：葡萄糖20g/L、酵母基础培养基6g/L、硝酸钠0.8499g/L、琼脂粉20g/L、蔗糖0.5mol/L，pH调整为6.5；
种子培养基的组分为：葡萄糖80g/L、酵母膏30g/L、MgSO4·7H2O 1.2g/L、KH2PO43g/L、ZnSO4 0.08g/L、MnSO4 0.08g/L；
发酵培养基的组分为：葡萄糖80g/L、酵母膏30g/L、豆油1.2g/L、MgSO4·7H2O1.2g/L、(NH4)2SO4 0.3g/L、KH2PO4 3g/L、ZnSO4 0.08g/L、MnSO4 0.08g/L。
实施例1
(1)以藤仓赤霉菌(Fusarium fujikuroi)NJtech02(由南京工业大学纪晓俊教授课题组提供，保藏编号为CCTCC NO:M 2015614，已在专利申请CN105441340A中公开)作为出发菌株，采用CRISPR/Cas9技术将所述改造基因敲除得到硝酸盐还原酶基因敲除菌；其中，CRISPR/Cas9***的敲除骨架为pFfCas9-sgRNA质粒，pFfCas9-sgRNA质粒的组件包括Cas9基因、启动子pTRPC和强RNA聚合酶III型启动子5s rRNA，且该质粒的内部设计stuⅠ位点用于***营养筛选标记niaD中的N20；sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，5s rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，N20的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示；
(2)将pUC57-T7-fcc1质粒(核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示)用Ec oRⅠ单酶切得到线性化质粒骨架，利用引物对FfniaD-PCR-F(核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)和FfniaD-PCR-R(核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示)，从藤仓赤霉菌基因组(CCTCC NO:M 2015614)上扩增出4074bp的片段，该片段两侧与线性化质粒骨架具有22bp的同源区域，在Clone ExpressUltra OneStep Cloning Kit克隆酶(购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司)的作用下完成Gibson组装得到连接液，将20μL连接液导入大肠杆菌DH5α感受态，涂布于LB平板上(含有100μg/mL的氨苄抗性终浓度)培养过夜，挑选平板上的阳性克隆子利用引物对pUC-tongyong-F(核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示)和pUC-tongyong-R(核苷酸序列如SEQ IDNO：6所示)进行PCR验证，选择正确的核苷酸条带对应的质粒送至南京擎科公司进行SangerDNA测序，最终得到质粒pUC57-T7-fcc1-FfniaD(niaD的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，Ff前缀说明该基因为藤仓赤霉菌的内源基因)，其质粒图谱如图1所示；
FfniaD-PCR-F:ttgtaaaacgacggccagtgaaGAGAGTTGCAGACTATAAGACAT ATG(SEQ IDNO：3)；
FfniaD-PCR-R:ttcgcgaggtaccgagctcgaaATATTGTTTGTTCATATGTACGTT CC(SEQ IDNO：4)；
pUC-tongyong-F:tcttcgctattacgccagct(SEQ ID NO：5)；
pUC-tongyong-R:caggaaacagctatgaccat(SEQ ID NO：6)；
(3)使用引物FfniaD-PCR-F和FfniaD-PCR-R扩增出FfniaD片段，从PC R反应液中回收DNA，浓缩得到高浓度线性FfniaD核苷酸片段；
(4)制备藤仓赤霉菌原生质体：首先配置崩溃酶(Dryslase)与溶壁酶(Lysing)的重量比为3:7的酶液，将10mL酶液经过滤除菌后加入1g湿菌丝，置于30℃摇床中以转速为60rpm，每0.5h取样进行显微镜观察菌丝的裂解以及原生质体的生成情况，酶解后通过擦镜纸过滤菌丝，取滤液3000rpm离心10min，弃上清，用STC缓冲液洗涤原生质体沉淀，最终保存至STC缓冲液中作为原生质体溶液；
取10μL步骤(3)得到的高浓度线性FfniaD核苷酸片段加入原生质体溶液中，并加入1mL的PEG6000冰上静置20min后，加入2mL的STC缓冲液，悬浮后涂布于固体再生培养基平板上，在温度为28℃条件下培养5天等待转化子生成。
实施例2
将实施例1中得到的转化子在固体再生培养基上进行15次传代培养(每次为在温度为28℃条件下培养48h)，最终得到稳定传代的转化菌株，挑选30株转化菌株分别接种到30mL种子培养基中，在温度为28℃条件下培养48h得到种子液；将各自的种子液以10体积％的接种量接种到40mL发酵培养基中，于温度为28℃、转速为220rpm的摇床中连续培养9天后得到发酵液，将发酵液经过12000rpm离心5min取得上清液，上清液通过0.22μm水系膜过滤后，装入液相进样瓶中，进行HPLC分析，检测各个转化菌株对应的发酵液中的赤霉素GA3产量。
30株转化菌株的发酵液中赤霉素GA3的含量如图2和表1所示，以出发菌株作为对照(Control)，共得到6株产量没有提升的转化菌株(与出发菌株的GA3产量之间的差值小于5mg/g DCW)，9株产量提高的转化菌株(相对于出发菌株，GA3产量提高5mg/g DCW以上)以及15株产量减少的转化菌株(相对于出发菌株，GA3产量降低5mg/g DCW以上)，根据结果可以推测有6个不影响菌体生产性能的新靶点以及9个有利于GA3合成的靶点。由此可以看出，本发明构建的DNA随机整合平台是可以高效的在藤仓赤霉菌中运行的，方便之后的靶点改造。
表1
实施例3
将实施例2中GA3产量最高的29号转化菌株(作为目标菌株)在YPD平板上进行划线，通过真菌基因组DNA提取试剂盒(购自北京索莱宝科技有限公司)提取赤霉菌的基因组；在10μL的体系中进行酶切反应(3μL基因组DNA)，选择同尾酶组合NheⅠ/XbaⅠ(该酶包括6bp简并位点，可以增大环化概率)；
将酶切液在80℃热击失活，此时内切酶不再具有切割核苷酸序列的功能，将10μL酶切液全部加入100μL T4 ligase自连环化体系中，线性化片段完成自我环化，得到自连产物；以自连产物直接做模板，在50μL KOD扩增体系中以引物序列设计在niaD基因内的引物对niaD-PCR-F1(核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示)和niaD-PCR-R2(核苷酸序列如SEQ IDNO：8所示)进行反向PCR(KOD扩增体系组成为：1μL KOD，25μL 2xBuffer,10μL 1M dNTP，1.5μLniaD-PCR-F1，1.5μL niaD-PCR-R1)，KOD FX延伸3min，40个循环，跑胶进行凝胶电泳分析，将单片段割胶回收DNA片段，送至南京擎科公司进行Sanger DNA测序，将序列与赤霉菌基因组序列进行比对，发现niaD靶点整合在XP_023429025.1的位置，XP_023429025.1靶点编码双羧酸转运蛋白carboxylic acid transport，可能通过影响前体物质外排等因素从而增加GA3产量。
niaD-PCR-F1:CATCAACGCATACCAGCAATTG(SEQ ID NO：7)；
niaD-PCR-R2:GTCAATTGCTGGTATGCGTTGA(SEQ ID NO：8)。
实施例4
将实施例3中的目标菌株作为生产赤霉菌的重组菌株，接种到30mL种子培养基中，在温度为28℃条件下培养48h得到种子液；将种子液以10体积％的接种量接种到40mL发酵培养基中，于温度为28℃、转速为220rpm的摇床中连续培养9天后得到发酵液，将发酵液经过12000rpm离心5min取得上清液，上清液通过0.22μm水系膜过滤后，装入液相进样瓶中，进行HPLC分析，检测重组菌株的发酵液中的赤霉素GA3产量，结果见表2。
实施例5
将实施例3中的目标菌株作为生产赤霉菌的重组菌株，接种到30mL种子培养基中，在温度为25℃条件下培养60h得到种子液；将种子液以8体积％的接种量接种到40mL发酵培养基(发酵培养基的组分替换为：葡萄糖40g/L、酵母膏40g/L、豆油1.6g/L、MgSO4·7H2O1.6g/L、(NH4)2SO4 0.2g/L、KH2PO41.5g/L、ZnSO4 0.1g/L、MnSO4 0.1g/L)中，于温度为25℃、转速为250rpm的摇床中连续培养12天后得到发酵液，将发酵液经过12000rpm离心5min取得上清液，上清液通过0.22μm水系膜过滤后，装入液相进样瓶中，进行HPLC分析，检测重组菌株的发酵液中的赤霉素GA3产量，结果见表2。
实施例6
将实施例3中的目标菌株作为生产赤霉菌的重组菌株，接种到30mL种子培养基中，在温度为30℃条件下培养40h得到种子液；将种子液以12体积％的接种量接种到40mL发酵培养基(发酵培养基的组分替换为：葡萄糖120g/L、酵母膏25g/L、豆油0.8g/L、MgSO4·7H2O0.8g/L、(NH4)2SO4 0.5g/L、KH2PO44g/L、ZnSO4 0.05g/L、MnSO4 0.05g/L)中，于温度为30℃、转速为200rpm的摇床中连续培养8天后得到发酵液，将发酵液经过12000rpm离心5min取得上清液，上清液通过0.22μm水系膜过滤后，装入液相进样瓶中，进行HPLC分析，检测重组菌株的发酵液中的赤霉素GA3产量，结果见表2。
实施例7
按照实施例4的方法发酵制备赤霉素，不同的是，将发酵培养基的组分替换为：葡萄糖81.2g/L、酵母膏30g/L、MgSO4·7H2O 1.2g/L、(NH4)2SO4 0.3g/L、KH2PO4 3g/L、ZnSO40.08g/L、MnSO4 0.08g/L。
实施例8
按照实施例4的方法发酵制备赤霉素，不同的是，将发酵培养基的组分替换为：葡萄糖80g/L、酵母膏30g/L、豆油3g/L、MgSO4·7H2O 1.2g/L、(NH4)2SO4 0.3g/L、KH2PO4 3g/L、ZnSO4 0.08g/L、MnSO4 0.08g/L。
对比例1
按照实施例4的方法发酵制备赤霉素，不同的是，将重组菌株替换为出发菌株(保藏号为CCTCC NO:M2015614)，结果见表2。
表2
| 编号 | 发酵液中的赤霉素GA3产量(mg/g DCW) |
| 实施例4 | 105.7 |
| 实施例5 | 98.5 |
| 实施例6 | 120.5 |
| 实施例7 | 92.3 |
| 实施例8 | 90.8 |
| 对比例1 | 60.2 |
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法，其特征在于，该鉴定方法包括以下步骤：
(1)将出发菌株中的改造基因敲除得到改造基因缺陷菌；
(2)制备所述改造基因缺陷菌的原生质体，将所述原生质体与所述改造基因进行NHEJ随机整合得到N个转化菌株，将N个所述转化菌株进行筛选得到赤霉素产量最高的转化菌株作为目标菌株；
(3)将所述目标菌株经反向PCR鉴定出所述改造基因在所述出发菌株上的整合靶点，以获得提高赤霉素产量的靶点。
2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征在于，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因；
优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。
3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中所述敲除的过程包括：采用CRISPR/Cas9***将所述改造基因敲除；
优选地，所述CRISPR/Cas9***的敲除骨架为pFfCas9-sgRNA质粒，所述pFfCas9-sgRNA质粒的组件包括Cas9基因、启动子pTRPC和强RNA聚合酶III型启动子5s rRNA；所述pFfCas9-sgRNA质粒的内部设计stuⅠ位点用于***营养筛选标记niaD中的N20；
优选地，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：9所示，所述5s rRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，所述N20的核苷酸序列如SEQ ID NO：11所示。
4.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中所述NHEJ随机整合的过程包括：将所述原生质体、所述改造基因与PEG6000、STC缓冲液混合后悬浮得到悬浮液，将所述悬浮液置于固体再生平板上进行转化培养；
优选地，所述固体再生平板的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L；
优选地，所述转化培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
5.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中所述筛选的过程包括：将所述转化菌株依次进行传代培养、发酵培养I；
优选地，所述传代培养的培养基含有：葡萄糖15-25g/L、酵母基础培养基5-8g/L、硝酸钠0.5-1g/L、琼脂粉15-25g/L、蔗糖0.3-0.8mol/L；
优选地，所述传代培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
6.根据权利要求5所述的鉴定方法，其特征在于，所述发酵培养I的培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO4 1.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L；
优选地，所述发酵培养I的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天。
7.权利要求1至6中任意一项所述的鉴定方法在提高赤霉素产量中的应用。
8.一种重组菌株，其特征在于，该重组菌株为将出发菌株采用权利要求1至6中任意一项所述的鉴定方法处理后得到的目标菌株。
9.根据权利要求8所述的重组菌株，其特征在于，所述改造基因为硝酸盐还原酶基因，所述整合靶点为双羧酸转运蛋白位点处；
优选地，所述硝酸盐还原酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；
优选地，所述出发菌株为藤仓赤霉菌，更优选为保藏号为CCTCC NO:M2015614的藤仓赤霉菌。
10.一种赤霉素的制备方法，其特征在于，该制备方法包括：将权利要求8或9所述的重组菌株接种至发酵培养基中进行发酵培养II；
优选地，所述发酵培养II的条件包括：接种量为8-12体积％，温度为25-30℃，转速为200-250rpm，时间为8-12天；
优选地，所述发酵培养基含有：碳源40-120g/L，氮源25-40g/L，豆油0.8-1.6g/L，MgSO4·7H2O 0.8-1.6g/L，(NH4)2SO4 0.2-0.5g/L，KH2PO4 1.5-4g/L，ZnSO4 0.05-0.1g/L，MnSO4 0.05-0.1g/L。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310432198.XA CN116376726A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310432198.XA CN116376726A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116376726A true CN116376726A (zh) | 2023-07-04 |
Family
ID=86973256
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310432198.XA Pending CN116376726A (zh) | 2023-04-20 | 2023-04-20 | 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116376726A (zh) |
-
2023
- 2023-04-20 CN CN202310432198.XA patent/CN116376726A/zh active Pending
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN107586789B (zh) | 高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用 | |
| CN108753669B (zh) | 一种腺嘌呤生产菌株及其构建方法和应用 | |
| CN107709540A (zh) | 新型库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种ng7及其用途 | |
| CN1225125A (zh) | 用于将木糖发酵为乙醇的稳定的重组酵母 | |
| CN110157623B (zh) | 一种镰刀菌菌株及其发酵生产d-泛解酸内酯水解酶的方法 | |
| CN106754466A (zh) | 一种用于高效外源蛋白表达和高密度培养的枯草芽孢杆菌 | |
| CN101983240B (zh) | 凝集性酵母及其制备方法 | |
| CN105420154A (zh) | 双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用 | |
| CN103820337A (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的酿酒酵母菌及其应用 | |
| CN100532536C (zh) | 一株高产核酸酶p1的桔青霉菌及其选育方法 | |
| CN113604472B (zh) | 一种应用于里氏木霉的CRISPR/Cas基因编辑*** | |
| WO2018038577A1 (ko) | 7-아미노세팔로스포란산의 고농도 생산 재조합 아크레모니움 크리소제눔 균주의 제조방법 및 이 방법으로 제조된 균주 | |
| CN109486688A (zh) | 一种里氏木霉基因工程菌及其制备方法和应用 | |
| CN103555646B (zh) | 一种共表达l-***糖异构酶基因和甘露糖-6-磷酸异构酶的基因工程菌 | |
| CN102676406A (zh) | 一种用于发酵生产核糖核酸的热带假丝酵母菌及其应用 | |
| CN105349441B (zh) | 高产孢子的木霉菌T23-Ovel1菌株及其构建方法 | |
| Naumova et al. | Molecular genetic characteristics of Saccharomyces cerevisiae distillers’ yeasts | |
| CN1191369C (zh) | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 | |
| CN116376726A (zh) | 提高赤霉素产量的靶点的鉴定方法及其应用 | |
| CN114561301B (zh) | 重组裂殖壶菌及其构建方法和应用 | |
| CN109929853B (zh) | 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 | |
| CN110358687B (zh) | 一株产d泛解酸内酯水解酶的赤霉菌及应用、发酵方法 | |
| CN105062906B (zh) | 一种优化有机磷水解酶酵母工程菌及其酶的生产方法 | |
| CN113373172A (zh) | 一种酿酒酵母大片段基因编辑的方法 | |
| CN111893107A (zh) | 一株异源表达纤维素酶基因egⅳ的毕赤酵母工程菌株及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |