CN109234303A - 一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的构建方法 - Google Patents

一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明的目的在于构建一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的方法，具体步骤如下：(1)啤酒酵母基因组的获得：将啤酒酵母TT21三区培养，直至出单克隆，然后平涂在平板上获得菌体，用SDS处理获得啤酒酵母基因组；(2)目的基因的克隆：利用合理引物、条件，PCR扩增出Aro10(S.c)、Aro10(S.b)的基因；(3)构建表达载体：以pYPGE15质粒为载体，将Aro10(S.c)、Aro10(S.b)基因分别***启动子PGK下游，构建pYPGE‑ARO10(S.c)、pYPGE‑ARO10(S.b)表达载体；(4)获取重组菌株：将pYPGE‑ARO10(S.c)、pYPGE‑ARO10(S.b)表达载体通过醋酸锂化学转化法转入啤酒酵母TT21中，得到Aro10的重组酵母；(5)重组菌株的啤酒发酵；(6)苯乙醇含量检测：采用高效液相色谱法进行检测芳香醇含量的变化。

Description

一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的构建方法
技术领域
本发明涉及一种表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的重组啤酒酵母***提高芳香醇风味的构建，属于基因工程技术领域。
背景技术
啤酒酵母可以利用各种各样的氨基酸作为氮源，包括三种芳香氨基酸L-酪氨酸、L-苯丙氨酸和L-色氨酸。其主要代谢产物为酪醇、苯乙醇和色醇，他们被称为杂醇油。从氨基酸形成的杂醇油是通过艾利希途径三种酶催化转变的。在苯丙氨酸的例子中，氨基酸脱氨基变为苯丙酮酸然后脱羧基成为苯乙醛并形成苯乙醇。
在啤酒的产生中，风味物质的形成过程中起着非常重要作用。杂醇油是其生产中形成的产物，高级醇(杂醇油)是含量最多的挥发性风味物质。高级醇包括丙醇、2-甲基丙醇(异丁醇)、光学活性戊醇、3-甲基丁醇(异戊醇)和苯乙醇，苯乙醇是杂醇油的重要组成部分，也是决定发酵食品品质的一个关键因素。
苯乙醇(Phenethyl Alcohol)为无色透明液体，具有玫瑰型香气，香味淡雅细腻，香气轻柔甜和。其风味特征类似玫瑰蜂蜜，在食品、发酵、酿酒工业中具有广阔的应用前景。苯乙醇是清酒和葡萄酒等酒精饮料的重要风味化合物。例如，在每1L清酒中含有20-70mg苯乙醇。黄酒中高于100mg/L。因此，为了增加啤酒的口感丰富度，可适当改变芳香醇的含量。
芳香醇的形成途径有两条：
1、氨基酸降解代谢途径：从氨基酸代谢路线可知，一般来说，当麦汁中某一氨基酸的含量超出酵母的需要时，则多余的氨基酸就形成了高级醇。
2、可发酵性糖合成代谢途径：从糖代谢路线可知，生物合成氨基酸的最后阶段形成α-酮酸，α-酮酸经脱羧酶和醇脱氢酶的作用，生成相应的芳香醇。
在芳香醇的代谢调控中第一步反应的转氨酶与菌体的生理生长密切相关，通过与α-酮戊二酸之间的转氨作用与TCA循环紧密联系。但是目前绝大多数研究者关注的是第二步反应中苯丙酮酸脱羧酶，它是艾氏途径中的关键酶。在不同氮源的条件下，苯丙酮酸脱羧酶活性主要由Aro10基因决定的。
发明内容
本发明的目的在于构建一种表达苯丙酮酸脱羧酶基因Aro10的重组啤酒酵母。
本发明提供的表达Aro10的啤酒酵母***具体步骤如：
(1)啤酒酵母基因组的获得：将啤酒酵母TT21三区培养，直至出单克隆，然后平涂在平板上获得大量菌体，用SDS处理菌体获得啤酒酵母基因组；
(2)目的基因的克隆：利用合理同源引物，合适条件，PCR扩增出Aro10(S.c)、Aro10(S.b)的基因；
(3)构建表达载体：以pYPGE15质粒为载体，将Aro10(S.c)、Aro10(S.b)基因分别***启动子PGK下游，5′端酶切位点为BmaH I，3′端酶切位点为Sma I，构建pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达载体；
(4)获取重组菌株：将pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达载体通过醋酸锂化学转化法转入啤酒酵母TT21中，得到Aro10的重组酵母；
(5)重组菌株的啤酒发酵；
(6)苯乙醇含量检测：采用高效液相色谱法进行测定芳香醇含量，检测器为二极管阵列检测器，检测芳香醇含量的变化。
本发明的的积极意义
1.本发明采用采用质粒表达基因的方法构建载体，较整合至基因组的方法更为简便快速，大大缩短构建周。
2.本发明将啤酒酵母中的Aro10基因进行表达，优化了目的基因的引物序列，合理加入Aro10基因，使啤酒酵母无需外源补充其他基因。
5.本发明获得提取啤酒酵母基因组时，采用固体培养基大量培养菌体。
6.本发明实现了苯丙酮酸脱羧酶基因Aro10在酵母中的过表达，提高了重组啤酒酵母菌在芳香醇产生效率，提升重组啤酒酵母菌的工业生产潜力，在啤酒发酵中提升风味
附图说明
图1是Aro10(S.c)、Aro10(S.b)的pcr扩增图；
图2是pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)的大肠杆菌菌落验证图；
图3是pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达质粒图谱；
图4是pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达质粒酶切验证图；
图5是重组啤酒酵母TT21/pYPGE-ARO10-B、TT21/pYPGE-ARO10-C验证图；
图6是苯乙醇含量图。
具体实施方式
实施案例1目的基因的克隆
1.将保存于甘油管的酵母菌悬液，从-80℃冰箱中取出置于冰水混合物(或4℃冰箱)中解冻，至酵母菌悬液完全融化。将酵母悬液用移液器混合均匀，吸取100μL涂布于YPD平板上，用封口膜将平板封口后，倒置于25℃培养箱中培养。培养约2-3天，至酵母单菌落长至2-3mm后，置于4℃冰箱中备用。
2.将新鲜酵母单菌落用接种环挑取紧密划线于YPD平板上，静置培养，直到菌体长出来。从平板上刮下菌体，加入含有30μL的SDS溶液的Ep管，用涡旋混合器混匀，放至95℃水浴锅中5分钟后冰上放置5分钟，重复三次后离心吸取上清20μL至新的Ep管中，放置-20℃备用。
3.以酵母基因组为模板，通过同源引物PCR扩增出TT21的Aro10所对应的基因序列，扩增PCR图见图1。
实施案例2 pYPGE-Aro10表达载体的构建
1.先将Buffer、限制性内切酶置于冰中，待其充分融化并混合均匀后，配制双酶切反应体系，配制完毕后混合均匀，置于30℃水浴锅内，酶切30min。酶切结束后，使用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒回收酶切产物，以去除酶切产物中的未切开质粒，以免影响后续的质粒与目的基因的连接。
2.以5′端BamH I为酶切位点，3′端Sma I为酶切位点，***pYPGE15质粒载体启动子PGK下游，构建表达载体pYPGE-Aro10表达载体图谱见图3。大肠杆菌菌落PCR验证见图2。并通过单酶切、双酶切对表达载体进行验证，以确定表达载体pYPGE-Aro10构建成功，酶切验证图见图4。
实施案例3表达载体pYPGE-Aro10化学转化法转入啤酒酵母中
1.通过醋酸锂化学转化法将表达载体pYPGE-Aro10转化转入啤酒酵母TT21中，涂板得到转化子。
2.利用SDS热裂解法粗提1得到的重组啤酒酵母转化子的基因组，通过PCR方法验证其正确性，基因组PCR核酸图见图5。
实施案例4高效液相色谱法验证发酵液中芳香醇含量
1.在无菌条件下，取啤酒酵母单菌落接入5mLYPD液体培养基中，25℃静置培养48h；然后取100μL转接于10mLYPD液体培养基中，25℃静置培养48h后放入10℃培养箱备用。
2.离心收集菌体后去称重取菌体，每220mL麦汁中1.1g酵母的接种量接种到麦汁中，主发酵温度12℃，每隔24h取样测定糖度和乙醇含量，直至糖度将至5.0°P，主酵结束，取酒样进行分析。
3.将酒样用0.22μm孔径的滤膜过滤，收集滤液后进行高效液相色谱法，二极管阵列检测器检测芳香醇含量，芳香醇含量如图6。

Claims (5)

1.一种啤酒酵母中表达苯丙酮酸脱羧酶Aro10的构建方法，包括以下步骤：
(1)啤酒酵母基因组的获得：将啤酒酵母TT21三区培养，直至出单克隆，然后平涂在平板上获得大量菌体，用SDS处理菌体获得啤酒酵母基因组；
(2)目的基因的克隆：利用合理同源引物，合适条件，PCR扩增出Aro10(S.c)、Aro10(S.b)的基因；
(3)构建表达载体：以pYPGE15质粒为载体，将Aro10(S.c)、Aro10(S.b)基因分别***启动子PGK下游，5′端酶切位点为BmaH I，3′端酶切位点为Sma I，构建pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达载体；
(4)获取重组菌株：将pYPGE-ARO10(S.c)、pYPGE-ARO10(S.b)表达载体通过醋酸锂化学转化法转入啤酒酵母TT21中，得到Aro10的重组酵母；
(5)重组菌株的啤酒发酵；
(6)苯乙醇含量检测：采用高效液相色谱法进行测定芳香醇含量，检测器为二极管阵列检测器，检测芳香醇含量的变化。
2.根据权利要求1所述的一种啤酒酵母中表达Aro10的构建方法，其特征在于，采用质粒表达基因的方法构建载体，较整合至基因组的方法更为简便快速，大大缩短构建周期。
3.根据权利要求1所述的一种啤酒酵母中表达Aro10基因的构建方法，其特征在于，将啤酒酵母中的Aro10基因进行表达，优化了目的基因的引物序列，合理加入Aro10基因，使啤酒酵母无需外源补充其他基因。
4.根据权利要求1所述的一种啤酒酵母中表达Aro10的构建方法，其特征在于，获得提取啤酒酵母基因组时，采用固体培养基大量培养菌体。
5.根据权利要求1所述的一种啤酒酵母中表达Aro10的构建方法，其特征在于，实现了苯丙酮酸脱羧酶基因Aro10在酵母中的过表达，提高了重组啤酒酵母菌在芳香醇产生效率，提升重组啤酒酵母菌的工业生产潜力，在啤酒发酵中提升风味。
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