TWI444476B

TWI444476B - 將多重基因順序化及***基因體且同時過度表現該等多重基因之方法

Info

Publication number: TWI444476B
Application number: TW100142611A
Authority: TW
Inventors: Jui Jen Chang; Feng Ju Ho; Cheng Yu Ho; Wen Hsiung Li; Ming Che Shih; Chieh Chen Huang
Original assignee: Academia Sinica
Priority date: 2011-08-31
Filing date: 2011-11-21
Publication date: 2014-07-11
Also published as: TW201309797A; US9340794B2; US20140248703A1

Description

將多重基因順序化及***基因體且同時過度表現該等多重基因之方法

本發明係關於一種將多重基因順序化及***一細胞基因體中並且同時大量表現該多重基因於該細胞中的方法。

合成生物學是一種對新生物系統之設計和建構的嶄新科學及對天然生物系統之重新設計。為了進行細胞之大規模基因體工程，一種可同時引入多重基因於一基因體中的有效高通量之方法是必要的。

各種技術已被開發使多個基因或DNA模組能結集成較大的構築體，例如鏈反應克隆技術(chain reaction cloning)(Pachuk et al.,2000)、OGAB方法(Tsuge et al.,2003)、活體內DNA彙編(Shao et al.,2004)、USER克隆技術(USER cloning)(Bitinaite et,al.,2007)、MAGIC(Li and Elledge,2005)、SLIC(Li and Elledge,2007)、融合技術(In-Fusion)(Marsischky and LaBaer,2004)、PIPE(Quan and Tian,2009)、環狀聚合酶延伸克隆法(circular polymerase extension cloning)(Quan and Tian,2009)和酵母菌中的單一步驟集合方法(one-step assembly in yeast)(Gibson et al.,2008;Gibson et al.,2009)。這些方法主要係基於歷史上已知特性的宿主，例如大腸桿菌(Escherichia coli )、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis )和釀酒酵母(S. cerevisiae )。對於在生物製程上具有極大特性的新發現之其他生物體仍然需要新的分子生物學工具。

本發明是基於發現一種依賴啟動子進行基因集合及同時大量表達(Promoter-based Genes Assembly and Simultaneous Overexpression；PGASO)的方法，該方法可以有效地將多重基因以預定順序***一細胞基因體中的預定位置。在特定具體實施例中，顯示該方法可以應用於馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus )。PGASO於基因體工程上優於現有技術的原因有四：(1)可以單一步驟將多個基因轉形至一基因體中；(2)特定的上游啟動子序列可以應用在基因的集合，且其係以預設的順序集合而無須連接子序列；(3)基因卡匣組擁有各自獨立的啟動子，可以同時表達不同的表現量；(4)PGASO適用於任可藉由同源重組工程改造的宿主。

據此，本文係提供一種將複數個核酸分子以預定順序***一細胞基因體中預定位置的方法且該核酸分子可同時大量表現於該細胞中。該方法包括提供一種預以彼此相鄰的預定順序***細胞基因體中預定位置的複數個核酸分子，該複數個核酸分子包括第一個核酸分子、最後一個核酸分子以及至少一個介入的核酸分子***第一個核酸分子與最後一個核酸分子之間。其中該複數個核酸分子之任一者包含(a)一段核酸序列，該核酸分子的5'端係操作地連接一啟動子序列，以及(b)一段重疊的序列位於該核酸分子的3'端，每一核酸分子中的啟動子序列是不同的。至少有一個介入的核酸分子其重疊序列係與相鄰的核酸分子之部分啟動子序列同源及至少有一個介入的核酸分子其部分啟動子序列係與另一相鄰的核酸分子之部分重疊序列同源。第一個核酸分子之部分啟動子序列是與預定位置的第一段序列同源且最後一個核酸分子其重疊序列是與預定位置的第二段序列同源。將複數個核酸分子引進細胞中，據此.，該複數個核酸分子藉由重疊序列和啟動子序列之間的同源重組以預定順序連接在一起，並藉由第一個核酸分子之啟動子序列與預定位置的第一段序列進行同源重組以及最後一個核酸分子其重疊序列與預定位置的第二段序列進行同源重組***基因體中。

本文所描述的方法可用於建造一細胞供各種用途。例如，該方法可用於設計一具有一定酶素活性之細胞。

本發明之一或多個具體實施例之細節描述於其下的圖式及說明中。本發明之其他特徵、目的及優點將由本文的說明、圖式及申請專利範圍清楚呈現。此處所描述的係一種將多重基因***一細胞基因體中的方法，並且同時大量表現該核酸分子於該細胞中。該方法包括提供一種預以彼此相鄰的預定順序***細胞基因體中預定位置的複數個核酸分子，該複數個核酸分子包括第一個核酸分子、最後一個核酸分子以及至少一個介入的核酸分子***第一個核酸分子與最後一個核酸分子之間。根據本發明，該複數個核酸分子包括至少兩個核酸分子，特定而言，至少三個核酸分子，更特定而言，至少四個核酸分子，更加特定而言是至少五個核酸分子。

複數個核酸分子之任一者包含(a)一段核酸序列，該核酸分子的5'端係操作地連接一啟動子序列，以及(b)一段重疊的序列位於該核酸分子的3'端，每一核酸分子中的啟動子序列是不同的。至少有一個介入的核酸分子其重疊序列係與相鄰的核酸分子之部分啟動子序列同源及至少有一個介入的核酸分子其部分啟動子序列係與另一相鄰的核酸分子之重疊序列同源。第一個核酸分子之部分啟動子序列是與預定位置的第一段序列同源且最後一個核酸分子其重疊序列是與預定位置的第二段序列同源。將複數個核酸分子引進細胞中，據此，該複數個核酸分子藉由重疊序列和啟動子序列之間的同源重組以預定順序連接在一起，並藉由第一個核酸分子之啟動子序列與預定位置的第一段序列進行同源重組以及最後一個核酸分子其重疊序列與預定位置的第二段序列進行同源重組***基因體中。

啟動子序列是一段核酸序列，其中包含一功能啟動子。它也可以包含額外的序列，例如，一段啟動子之內源性5'上游序列或是一段與啟動子異源的序列。較佳的，該啟動子序列係位於或接近核酸分子的5'端。任何合適的啟動子皆可用於構建本文所述之核酸分子。啟動子的例子包括但不限於乳糖酵母菌(K. lactis )的Lac4啟動子、釀酒酵母菌(S. cerevisiae )的GapDHI啟動子、乳糖酵母菌(K. lactis )的GapDHI啟動子、釀酒酵母菌(S. cerevisiae )的AdhI啟動子或乳糖酵母菌(K. lactis )的AdhI啟動子。

重疊的序列可以是任何足以促進同源重組進行之長度，例如介於40和2,000個鹼基之間。其較佳地的位置是位於或接近該核酸分子的3'端。

預定位置可以是宿主細胞基因體中的任何地方。它可以在啟動子區域內、基因體中的編碼區或非編碼區域。該位置可以是包含重覆序列的區域。該位置也可以是***基因體中的外源序列。

為了監測核酸分子整合至基因體中的情形，其中一個核酸分子可以包含一段可編碼成一篩選標記的序列(例如，一種造成抗生素抗性的蛋白質)，和另一段可編碼成一報導蛋白質的序列(例如，綠色螢光蛋白質)。技藝人士能夠選擇適當的篩選標記和報導蛋白質。

在一具體實施例中，在複數個核酸分子中之核酸序列分別編碼為一個篩選標記、一個報導蛋白質以及至少一個蛋白質，例如酶素。任何類型的酶素皆可使用於本發明，包括但不限於，β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)、內切葡聚醣酶(endoglucanase)、外切葡聚醣酶(exoglucanse)、纖維雙糖水解酶(cellubiohyrolase)、蛋白酶(protease)、核酸酶(nuclease)、澱粉酶(amylase)、漆氧化酶(laccases)、果膠酶(pectinase)、脂肪酶(lipase)及胜肽酶(peptidase)。

本文所述的方法可以適用於任何宿主細胞。具體而言，它可用來有效地建造馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus )，如下面描述的實例所示。在一特定實例中，宿主細胞係一種分離的菌株，命名為馬克斯克魯維酵母菌KY3，其係於2011年11月4日寄存於台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心，寄存編號為BCRC 920076。

以下特定實例僅係舉例說明而非以任何方式限制揭示內容之其餘部分。無須進一步的闡述，咸相信本發明所屬技術領域中具有通常知識者基於此處說明即可利用本發明至最廣的程度。在本處引述之任何刊物均以參考文獻完整併入。

材料與方法 (1)多重基因卡匣之構築體

我們的PGASO方法係說明於圖2，其係用於在預設的順序中集合5個基因卡匣。在第一個基因卡匣中，KanMx基因和來自pKlac2載體(乳糖酵母菌蛋白質表現試劑組，New England Biolabs)的Lac4 啟動子片段係利用Lac4-KanMx引子對增幅並集合成一個片段。第二個及第三個基因卡匣中的編碼區，EGIII基因和CBHI基因，係從裏氏木黴(T. reesei )的cDNA增幅製備，並分別藉由ScGapDH-EgIII和KlGapDH-CBHI引子對透過融合PCR，與ScGapDH啟動子與KlPADHI啟動子區域集合。第四個具有gfp基因的基因卡匣係利用KlADHI-GFP引子對進行構築。第五個具有NpaBGS基因及ScADHI啟動子的基因卡匣係分別增幅製備，並利用ScADHI-NpaBGS引子對進行構築。每個基因卡匣包含一個46p的重覆區域，其可與相鄰基因卡匣的3’端進行重組基因集合。PCR反應係使用TaKaRa EX Taq系統和表格1所列之引子對。

表1　用於PGASO構築的引子對

(2)酵母轉形和克隆篩選

將細胞在30℃下培養於5 mL的YPD培養基(1% Bacto Difco-酵母萃取物、2% Bacto Difco-蛋白腖、2% Merck-D(+)-葡萄醣)，於250 rpm搖晃16小時。為了於KY3中表現外源酵素，我們遵循乳糖酵母菌(K. lactis )的轉形方法(Colussi and Taron,2005)。將一個體積5 μg的目標DNA片段與40 μL的勝任細胞混合，其中目標DNA片段中每個片段具有相同的莫耳比。電穿孔(electroporation)(其電擊條件為1.0 kV，400Ω與25 μF電容)係以鋁製樣品槽(2 mm)在BioRad系統(GenePluser Xcell TM，Bio-Rad，海克力斯，加州)中進行。將細胞塗抹於含康納黴素(kanamycin；20 μg/mL)的YPG平板培養基(1% Bacto Difco-酵母萃取物、2% Bacto Difco-蛋白腖、2% Merck-D(+)-半乳糖)。為了確認每一個片段之存在及其所需之順序，每一分離的菌落先以QucikExtract^TM DNA萃取溶液(EPICENTRE，麥迪遜，威斯康辛)處理，移去酵母菌細胞壁並且以專一性引子對(表1)進行PCR分析。為了驗證這些基因卡匣確實進入KR5菌株中且以正確順序集合，設計了位於每個基因卡匣中專一性的內部引子並以PCR進行確認(表1)。這些轉形株進一步在亮視野顯微鏡下以位相差進行觀察，並在GFP濾片下進行螢光之觀察，並以共軛焦顯微鏡和單一分子偵測系統(Leica TCS-SP5-MP-SMD，德國)擷取影像。

(3)定量PCR分析

將每種分離的細胞培養於含有卡那黴素(kanamycin)(20 μg/mL)的YPG培養基中，在30℃、200 rpm培養16小時。接著使用RNeasy Protect迷你試劑組(High Pure RNA Isolation Kit,Roche)自酵母菌細胞純化mRNA模板。使用反轉錄酶試劑組(SuperScript^TM II kit,Invitrogen)進行cDNA的合成。每一基因係根據製造商之操作步驟以特定引子對透過Universal Probe Library Set(480 Probes Master,Roche)於LightCycler(LightCycler 480,Roche)上進行相對定量。

(4)酶活性的定量分析

取酵母菌的培養上清液進行幾項具有不同之測試基質的葡聚醣酶活性分析。總葡聚醣酶活性的測定係混合40 μL的上清液與60 μL的緩衝溶液(50 mM 4-甲基傘形基-β-D-吡喃纖維素雙糖苷(4-methylumbelliferyl-β-D-cellobiopyranoside；MUC)，50 mM醋酸鈉(sodium acetate)，pH 3)。藉由螢光強度偵測儀(fluorescent intensity reader；SpectraMax M2，MDS)測量酵素反應中釋放的4-甲基傘形酮(4-methylumbelliferone；MU)的螢光單位(fluorescence units；FU)，激發光波長為365 nm，放射光波長為465 nm。外切葡聚醣酶(exo-glucanse)和內切葡聚醣酶(endo-glucanse)的活性係藉混合40 μL上清液與包含2%磷酸-溶脹纖維素(phosphoric acid-swollen cellulose；PASC)或2% CM-纖維素(CM-cellulose)的60 μL衝溶液測定。還原糖之量係利用Somogyi-Nelsonz方法決定其中葡萄糖同等物之數目而測量。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性的定量分析與上述方法相似，但是，其係以50 mM的對硝基苯-D-葡萄糖(p-nitrophenyl -D-glucose；pNP-Glc )作為基質，且其檢測係於紫外光410 nm之光源照射下完成。蛋白質濃度係藉Bradford法決定。

(5)碳源利用性和乙醇生產分析

轉形的酵母菌細胞係生長於2%瓊脂的YP培養盤上，並分別以纖維雙糖(cellobiose)、β-聚醣(β-glycan)、CMC或PASC作為碳源來源。液體培養基配方也可用於酵母菌生長和乙醇發酵。乙醇生產力係藉附有火焰離子化偵測器(flame ionization detector；FID)、不銹鋼分離管柱(80/120 Carbopack B/6.6% Carbowax，2 m x 2 mm)與氮氣作為移動相氣體(mobile gas)的氣相層析儀(Shimadze GC-14，日本製)進行分析。分析條件包括管柱之加熱，其係自80至150℃以每分鐘4℃的升溫速率進行、180℃之注射溫度以及250℃之檢測溫度。每回的發酵實驗與其後的分析各重複三次。

結果 (1)藉由單一外源酵素基因操作改善纖維素分解能力

木質纖維素(lignocellulose)之多醣含有己糖和戊糖，例如葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)和***糖(arabinose)；這些成分之豐富度係隨著不同種類之原料而改變。馬克斯克魯維酵母菌(K. marxianus )KY3、釀酒酵母菌實驗室菌株(S. cerevisiae )BY和乳糖酵母菌(K. lactis )GG799分別進行了碳源利用性的分析。這三株酵母菌株皆使用葡萄糖(glucose)、半乳糖(galactose)、果糖(fructose)、甘露糖(mannose)，棉子糖(rafinnose)、甘油(glycerol)和蔗糖(sucrose)供生長，但只有馬克斯克魯維酵母菌KY3(K. marxianus KY3)可以利用木糖、纖維雙糖和***糖(圖1a)。為了提高代謝纖維雙糖的能力，係於我們先前的研究中源自牛瘤胃真菌的β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)基因(00196)且引入酵母菌株KY3-196中(Ho et al.,2011;Wang et al.,2010)(圖1b)。

(2)PGASO

這種啟動子依賴型基因集合及同時大量表達(PGASO)的技術係被發展成可將多重基因卡匣以預定順序***一細胞基因體中。每一基因卡匣包含2個部分：(1)該基因序列在5'端連接一啟動子序列，及(2)一段在該基因卡匣之3'端的重疊序列(圖2)。為了促進位置專一性之***，第一個基因卡匣之啟動子序列之5'端和最後一個基因卡匣之3'端的一部份皆與宿主基因體中的預定位置同源。每一基因卡匣的啟動子序列應不同於所有其它的基因卡匣。然而，在每一基因卡匣之3'端的重疊序列應與下游相鄰基因卡匣的部分啟動子序列同源。當基因卡匣***細胞中時，他們透過重疊序列和啟動子序列之間的同源重組連接在一起，並透過在第一個基因卡匣之啟動子序列及在最後一個基因卡匣之3'端的同源重組***基因體中。

在先前的研究中，許多啟動子被發展於釀酒酵母菌(S. cerevisiae )的基因表現系統，但很少研究用於馬克斯克魯維酵母菌(K. marxianus )。根據Fonseca等人於，2008，馬克斯克魯維酵母菌在生物技術未來具有巨大的潛力，因為其優於模式生物乳糖酵母菌(K. lactis )與釀酒酵母菌(S. cerevisiae )。為了增加我們對於馬克斯克魯維酵母菌的生物學知識以及產業上的應用潛力，我們的新基因體工程工具，PGASO，肯定會有很大的價值。PGASO可應用於馬克斯克魯維酵母菌，例如KY3，供酵素組合的最適化或是所需途徑的構築。在不同啟動子所觀察到的廣泛驅動力可進一步制定一種高效率的基因表達系統作為最適化酵素雞尾酒研究或是在酵母菌中進行基因調控策略。

(3)五個片段***的基因操作

為了賦予馬克斯克魯維酵母菌KY3於較高級碳源的水解能力，例如纖維素，將三個纖維素酶基因以及篩選標記和報導基因***KY3菌株的基因體中。這三個纖維素酶基因是β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)基因(NpaBGS)，最初發現於牛瘤胃真菌中，及兩個裏氏木黴(T. reesei )纖維素酶基因，內切葡聚醣酶基因(EGIII)，另一個係外切葡聚醣酶(exo-glucanse)基因(CBHI)。利用對於卡那黴素(kanamycin)抗性必要之新黴素磷酸轉移酶基因(neomycin phosphotransferase gene)(Kan MX)被用作克隆篩選的標記基因。綠色螢光蛋白(GFP)基因被用作啟動子的報導系統並作為一個生物感測器以監測細胞狀態。這5個基因被集合為一個單一的基因卡匣以供透過重組化***的基因操作。為了避免非預期的多重基因***相似區域之重組事件，造成，本文係使用具有低同源序列的異源性啟動子。一個理想的啟動子應具備的特性如高表達、低背景、快速誘導和簡單的誘導條件。一些符合這些條件的持續性啟動子被選擇用於五個基因基因卡匣的構築和***。這些啟動子包括源自釀酒酵母菌(S. cerevisiae )的ScPGapDH和ScPADHI，以及源自乳糖酵母菌(K. lactis )來的KlPGapDH和KlPADHI，其5'上游區域在彼此之間只有40-55%的序列相似度。

以單一步驟轉形五個基因卡匣至馬克斯克魯維酵母菌KY3基因體中已經完成。第一個基因卡匣有一篩選標記基因(KanMX基因，810 bp)連接PLac4啟動子之一部分。在第二個基因卡匣中，一內切葡聚醣酶基因(EGIII基因，1449 bp)與KlPGapDH啟動子連接。在第三個基因卡匣的外切葡聚醣酶基因(CBHI基因，1749 bp)係由KlPGapDH啟動子驅動。第四個基因卡匣含有一報導基因(GFP基因，720 bp)以及ScPADHI啟動子。在最後一個基因卡匣中，一β-葡萄糖苷酶基因(NpaBGS基因，2526 bp)係與KlPADHI啟動子連接。這五個基因卡匣係以PCR製備，每個啟動子的5'端有46 bp之突出(overhang)且終結子區域的3'端有46 bp之突出(圖2a)。該突出被設計來促進同源重組，因為每一個片段之5'端與其5'端上游相鄰片段的3'終端重疊；第一個基因卡匣(KanMX基因)之5'端突出以及最後一個基因卡匣(NpaBGS基因)之3'終端突出係與馬克斯克魯維酵母菌KY3中的LAC4啟動子區域重疊(圖2b)。因此，這五個基因卡匣，每一個都有一獨立的啟動子、來自乳糖酵母菌(K. lactis )的α因子(alpha factor)、基因編碼區及終結子，會以預設順序集合成如「Kan-EGIII-CBHI-GFP-NpaBGS」之總長度為14,877 bp的DNA片段，該片段接著透過單一步驟基因重組***K. marxianus KR5的LAC4啟動子區域(圖2b)。以以卡那黴素(kanamycin)抗性篩選KR5菌株；藉由螢光顯微鏡證實綠色螢光蛋白透過啟動子ScPADHI之活化(圖2c)。

在KR5中5個基因的***可藉由五對基因專一性內部引子(表格1)之PCR來確認；該PCR產物可解析為五條特定條帶(圖3a)。為了確認這些基因卡匣係以正確順序集合，設計了四個內部引子對，分別跨越每一個卡匣的間隙(gap)區域(表格1)。PCR產物中四個特定條帶皆為正確預期的大小(圖3b)。以單一步驟將多重基因片段集合之方法已成功地在KR5中證實。此外，自KR5和適當對照菌株中分離基因體DNA和總RNA以進行定量PCR分析，其係以5組基因專一性的引子對利用UPL系統進行分析。5個基因的相對表現量分別為約3倍(kan)，2倍(egIII)，1倍(cbhI)，1.5倍(gfp)和11倍(NpaBGS)倍，其係相對於肌動蛋白(actin)的表現量(圖3c)。同樣地，觀察到的5個基因於所構築的分離株中其相對於KR5內生性肌動蛋白(actin)基因的相對***套數比率分別為約3倍(kan)，2倍(egIII)，2倍(cbhI)，1.5倍(GFP)和6倍(NpaBGS)(圖3d)。這些數據顯示5個基因間不等量的基因套數與轉錄豐度。該不等量導因於非專一的基因***以及不同啟動子的各種轉錄效率。比較轉錄豐度與***套數，推測在KR5菌株中來自乳糖酵母菌(K. lactis )的GapDHI啟動子本質較弱，而來自釀酒酵母菌(S. cerevisiae )的AdhI相較於本研究的其他持續性啟動子則較強。我們的研究顯示利用重疊片段的方式集合特定的序列係可行的，且PGASO可藉由啟動子的設計量身定制以供不同用途。這也顯示，馬克斯克魯維酵母菌KY3是一個適用於多重基因集合和藉由合成生物學進行基因體工程的好宿主。

(4)KR5之分泌型纖維素酶之表現

為了量測分泌型纖維素酶的活性，將KR5之上清液收集起來不經過蛋白質純化即進行分析。利用商品化纖維素酵素混合試劑組中的Celluclase1.5L與Novo188當作標準物，使用相同蛋白質濃度量測KR5分泌型纖維素酶以及商品化酵素的比活性。纖維素酵素的比活性測定係以MUC作為基質來進行，其結果指出KR5上清液中的總葡聚醣酶活性與兩種商品化酵素相當且高於對照菌株(圖4a)。累積還原糖分析顯示，KR5分泌的CBHI使外切葡聚醣酶在分解磷酸-溶脹纖維素(PASC)的活性上有顯著提升，且其比活性為商品化纖維素酵素Celluclase 1.5L的80%(圖4b)。以染劑CMC當作基質的活性分析結果顯示，KR5之分泌型EGIII使其上清液中內切葡聚醣酶的活性顯著提升，其比活性為商品化纖維素酵素Celluclase 1.5L的60%(圖4c)。利用pNPG作為基質的活性測定結果顯示KR5菌株上清液中，NpaBGS的β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)活性高於對照菌株，且其比活性接近商品化纖維素酵素Novo188所表現的80%(圖4d)。這些數據也證實在沒有任何顯著的後轉譯修飾的問題下，已成功共表現這些外源性的真菌基因，且這些基因產物也成功地被分泌出來。

(5)糖類利用性和乙醇生產分析

為了測定KR5菌株、KY3-NpaBGS菌株(KY3-NpaBGS是基因體包含NpaBGS基因的KY3菌株)與對照菌株的碳源利用性及酒精發酵能力，本研究選用了幾種類型的纖維素進行測試。三種菌株皆能利用葡萄糖和纖維雙糖進行生長，但只有KR5菌株可以額外地同化β-葡聚糖和CMC(圖1b)。為了檢試KR5同步糖化發酵(SSF)的能力，於含有纖維雙糖、β-葡聚糖、CMC或PASC作為唯一碳源的YP培養基進行發酵。細胞在30℃下於YPD培養基中培養24小時後，收集O.D.為20的細胞供隨後之接種。如圖1所示，KR5可以利用纖維雙糖、β-葡聚糖、CMC或PASC作為唯一碳源進行發酵。KR5之纖維雙糖的轉化效率與其葡萄糖利用率一樣好，其在37℃下培養168小時，可生產8.5 g/L的乙醇，轉換率達93%(圖5a)。當2%的β-葡聚糖為唯一碳源時，KR5在37℃下培養168小時，可生產5.4 g/L的乙醇，轉換率達74%(圖5b)。這些數據顯示KR5可以表達纖維素分解酵素，且可由纖維素原料直接生產乙醇。CMC和PASC的同化能力比起對照組只有適度的增加(圖5b)。

其他實施例

在本說明書中所揭露的所有特徵都可能與其他方法結合，且所揭露的每一個特徵都可能被其他具有相同、相等或相似目的的特徵所取代。因此，除了特別顯著的特徵之外，本說明書所揭露的所有特徵皆僅為相等或相似特徵中的一個例子。

所屬技術領域中具有通常知識者從上述說明可輕易認知本發明之主要特徵，然而，需了解在不背離本發明之精神和範圍內可作各種修改。據此，其他實施例亦包含於下列的申請專利範圍中。

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圖1為一組照片顯示各種轉形酵母株之碳源利用性。酵母菌株馬克斯克魯維酵母菌KY3、釀酒酵母菌BY、乳糖酵母菌GG799、NC(轉殖空載體作為對照組的KY3轉形株)、196(轉殖β-岩藻醣苷水解酶(beta-flucosidase)的KY3轉形株)與KR5菌株於培養基上的生長情形，其中培養基所含碳源為下列其中之一：葡萄糖(glucose)、甘露糖(mannose)、半乳糖(galactose)、木糖(xylose)、***糖(arabinose)、甘油(glycerol)、果糖(fructose)、甘露糖(mannose)、蔗糖(sucrose)、棉子糖(rafinnose)、纖維雙糖(cellobiose)、β-葡聚糖(beta-glycan)、CMC、PASC及微晶纖維素(avicel)。

圖2為一組圖表顯示實例的基因卡匣組和5個基因卡匣於KR5菌株的基因體整合，以及螢光顯微鏡的分析結果。KR5中5個基因卡匣的基因整合。(a)5個基因卡匣中每一個卡匣都包含一個獨立的啟動子、來自乳糖酵母菌的α因子、基因編碼區、終結子，和一段與相鄰基因重疊的46 bp之片段。KanMX、EGIII、CBHI、GFP與NpaBGS基因卡匣分別以橙色、藍色、深藍色、綠色與紫色代表。(b)基因卡匣在KR5中係以如「Kan-EGIII-CBHI-GFP-NpaBGS」的預定順序集合。(c)KR5之螢光顯微鏡照片。

圖3為一組圖表顯示PCR結果以及定量PCR分析，其係以馬克斯克魯維酵母菌NC菌株(空載體之對照組)和KR5的結果進行分析。***基因之確認和定量PCR之分析。(a)五個基因的***係以五對基因專一性內部引子進行PCR確認。PCR產物中顯示五個特定條帶：810 bp(kan)、1012 bp(egIII)、1068 bp(cbhI)、750 bp(gfp)與896 bp(NpaBGS)。(b)基因卡匣的順序係以四組內部引子對經PCR反應進行確認。PCR產物產生四個特定條帶，大小分別為2293 bp(kan-egIII)、1512 bp(egIII-cbhI)、2273 bp(cbhI-gfp)及1905 bp(gfp-NpaBGS)。KR5中各個基因卡匣之轉錄本(c)和基因套數(d)與肌動蛋白(actin)基因比較之相對比例顯示於圖中。

圖4為一組圖表顯示馬克斯克魯維酵母菌NC菌株(空載體之對照組)和KR5株的纖維分解酵素活性分析結果。馬克斯克魯維酵母菌轉形株之纖維素分解酵素活性分析。(a)以MUC作為唯一基質的總比活性測定。(b)以PASC作為唯一基質的外切葡聚醣酶(Exoglucanse)比活性測定。(c)以染劑CMC作為唯一基質的內切葡聚醣酶(Endoglucanse)比活性測定。(d)以pNPG作為唯一基質的β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)比活性測定。使用商業化纖維分解酵素混合試劑組Celluclase 1.5 L和Novo188以作為對照組。*：P<0.05(顯著)；**：P<0.01；***：P<0.001；N.S.：非顯著。

圖5為一組圖表顯示同步進行糖化與發酵能力測試之結果。同步醣化與醱酵(SSF)係於YPD培養基(2%葡萄糖)及YP培養基包含(a)纖維雙糖和β-葡聚糖(b)CMC或PASC，其分別被馬克斯克魯維酵母菌NC菌株和KR5菌株作為碳源。

<110>　中央研究院

<120>　將多重基因順序化及***基因體之方法並且同時大量表現該多重基因

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Claims

一種同時轉殖複數個核酸分子及表現該複數個核酸分子所編碼之產物之方法，該方法包括，提供一種預依彼此相鄰的預定順序***細胞基因體中預定位置的複數個核酸分子，該複數個核酸分子含有各自獨立的啟動子，該複數個核酸分子包括第一個核酸分子、最後一個核酸分子以及至少一個介入的核酸分子***第一個核酸分子與最後一個核酸分子之間，其中該複數個核酸分子之任一者包含(a)一段核酸序列，該核酸分子的5'端係操作地連接一啟動子序列，以及(b)一段重疊的序列位於該核酸分子的3'端，每一核酸分子中的啟動子序列是不同的，其中至少有一個介入的核酸分子其重疊序列係與相鄰的核酸分子之部分啟動子序列同源及至少有一個介入的核酸分子其部分啟動子序列係與另一相鄰的核酸分子之重疊序列同源，且其中第一個核酸分子之部分啟動子序列是與預定位置的第一段序列同源且最後一個核酸分子其重疊序列是與預定位置的第二段序列同源；及引入複數個核酸分子進入細胞中，據此該複數個核酸分子藉由重疊序列和啟動子序列之間的同源重組依預定順序連接在一起，並藉由第一個核酸分子之啟動子序列與預定位置的第一段序列進行同源重組以及最後一個核酸分子其重疊序列與預定位置的第二段序列進行同源重組***基因體中，培養該細胞以表現該複數個核酸分子所編碼之產物。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該啟動子序列包括啟動子和啟動子5'之上游區域序列。
如申請專利範圍第2項之方法，其中該啟動子序列中與重疊序列或預定位置中的一段序列同源的部分包含5'之上游區域序列。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該預定位置係一啟動子區域、一編碼區域或一非編碼區域。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該預定位置係一組重複的序列。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該預定的位置係一個***細胞基因體中的外源序列。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該複數個核酸分子包含至少五個核酸分子。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該核酸序列於複數個核酸分子中分別編碼成一個篩選標記、一個報導蛋白質、至少一個酵素、胜肽或RNA產物。
如申請專利範圍第8項所述之方法，其中該酵素係選自於由β一葡萄糖苷酶(beta-glucosidase)、內切葡聚醣酶(endoglucanase)、外切葡聚醣酶(exoglucanse)、纖維雙糖水解酶(cellubiohyrolase)、蛋白酶(protease)、核酸酶(nuclease)、澱粉酶(amylase)、漆氧化酶(laccases)、果膠酶(pectinase)、脂肪酶(lipase)以及胜肽酶(peptidase)所組成的群組。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該啟動子序列於複數個核酸分子中任一核酸分子係包含一個乳糖酵母菌(K.lactis )的Lac4啟動子、一個釀酒酵母菌(S.cerevisiae )的GapDHI啟動子、一個乳糖酵母菌(K.lactis )的GapDHI啟動子、一個釀酒酵母菌(S.cerevisiae )的AdhI啟動子或一個乳糖酵母菌(K.lactis )的AdhI啟動子。
如申請專利範圍第1項之方法，其中該細胞是馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus )。
如申請專利範圍第11項所述之方法，其中該細胞係一種分離之馬克斯克魯維酵母菌(Kluyveromyces marxianus )菌株KY3，係寄存於台灣食品工業發展研究所菌種寄存中心，寄存編號為BCRC 920076。