CN101171012B

CN101171012B - 富含立体异构体的3-氨基羰基双环庚烯嘧啶二胺化合物及其用途

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Publication number: CN101171012B
Application number: CN2005800371195A
Authority: CN
Inventors: A·阿加德; R·辛格; H·李
Original assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Rigel Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2004-11-15
Filing date: 2005-11-15
Publication date: 2013-04-17
Anticipated expiration: 2025-11-15
Also published as: GB0523012D0; CA2580150C; RU2416604C2; CA2580150A1; US8044054B2; EP1824489A2; KR101335917B1; ITMI20052171A1; ES2359416T3; UA88660C2; HK1114338A1; GB2420559A; NO20073068L; JP4812770B2; AU2005307849B2; SI1824489T1; US20070179140A1; US20080051412A1; FR2877944A1; DE602005025803D1

Abstract

本发明提供了具有抗增殖活性的3-氨基羰基-双环庚烯-2，4-嘧啶二胺化合物的立体异构体和立体异构混合物、包括这些化合物的组合物、以及使用这些化合物抑制细胞增殖和治疗增殖性疾病如致瘤性癌症的方法。

Description

富含立体异构体的3-氨基羰基双环庚烯嘧啶二胺化合物及其用途

相关申请的交叉引用

本申请根据35U.S.C.§119(e)要求于2004年11月15日提交的第60/628,199号申请的优先权，该申请的内容在此引入作为参考。

技术领域

本发明涉及显示抗增殖活性的4N-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-N2-取代苯基-2，4-嘧啶二胺化合物的富含立体异构体(stereo-isomerically enriched)的组合物；这些化合物的前体药物、中间体和制备这些化合物和/或前体药物的合成方法；包括这些化合物和/或前体药物的药物组合物；以及这些化合物和/或前体药物在多种情况中的用途，包括例如治疗增殖性疾病如肿瘤和癌症。

背景技术

癌症是一类各种各样的疾病，其特征在于异常细胞的不受控制的生长和扩散。通常，所有类型的癌症在细胞生长和***的控制方面都有一些异常。调节细胞***和/或细胞通讯的通路在癌细胞中发生变化，因此这些控制和限制细胞生长的调节机制不起作用或者被绕过了。通过连续多轮的突变和自然选择，通常来源于单个突变细胞的一组异常细胞，积累了提供高于其它细胞的选择性生长优势的额外的突变，从而进化成为在细胞群中占优势的细胞类型。许多类型的癌细胞所显示的遗传不稳定性增强了这种突变和自然选择的过程，这种不稳定性是从体细胞突变或通过生殖系遗传而获得的。癌细胞的易变性增强增加了其进展形成恶性细胞的可能性。当癌细胞进一步进化时，一些在局部侵袭，然后转移(mestasize)定殖(colonize)在癌细胞组织源以外的组织中。这种特性以及肿瘤细胞群的异质性使癌症成为一种特别难以治疗和根除的疾病。

传统的癌症治疗利用了癌细胞的较强增殖能力及其对DNA损害的较高敏感性。电离辐射(包括γ-线和x-线)以及细胞毒剂(例如博莱霉素、顺铂、长春碱、环磷酰胺、5′-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤)依赖于对DNA的广泛损害和使染色体结构失稳，最终引起癌细胞的破坏。这些治疗对于细胞周期检验点存在缺陷的那些类型癌症特别有效，该缺陷限制了这些细胞在细胞***之前修复受损DNA的能力。但是，这些治疗的非选择性性质经常会引起严重和令人虚弱的不良反应。这些药物的全身性应用可能会导致正常的健康器官和组织受损，并危害患者的长期健康。

尽管根据癌细胞如何发展的知识已经开发了许多选择性化学治疗方法，例如抗***化合物他莫西芬，但所有的化学治疗方法的有效性均受到耐药性发展的制约。特别是，与细胞膜相结合的转运子如MdrI的表达增加产生了多药耐药性显型，其特征在于药物从细胞的流出(efflux)增加。这些类型的癌细胞适应性严重限制了某些种类的化疗剂的有效性。因此，识别其它化疗剂，尤其是活性立体异构体和/或立体异构体混合物对于建立有效对抗增殖性疾病的异质性性质和克服在与其它化合物一起治疗的过程中可能发生的任何耐药性的治疗是很关键的。而且，使用包括特定化疗药物的不同立体异构体和/或立体异构体混合物(它们可能具有不同的特性和细胞靶标)的化疗剂组合，增加了化疗的有效性，并且限制了耐药性的产生。

发明内容

在一个方面，本发明提供了富含特定非对映异构体的4N-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-2N-取代苯基-2，4-嘧啶二胺化合物，该化合物对多种不同类型的肿瘤细胞表现出抗增殖活性。在一些实施方式中，提供了根据结构式(I)的化合物：

包括其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和N-氧化物，其富含结构式(Ia)对应的非对映异构体，该非对映异构体被称为(1R，2R，3S，4S)非对映异构体：

其中：

每一个R¹均独立地选自氢、低级烷基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-C(O)OR^a、卤素、-CF₃和-OCF₃；

每一个R²均独立地选自氢、低级烷基、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-NHC(O)R^a、卤素、-CF₃、-OCF₃、

和

每一个R³均独立地选自氢、低级烷基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、卤素、-CF₃、-OCF₃、

和

每一个R⁴均独立地选自氢、低级烷基、芳基烷基、-OR^a、-NR^cR^c、-C(O)R^a、-C(O)OR^a和-C(O)NR^cR^c；

R⁵是氢、卤素、氟、-CN、-NO₂、-C(O)OR^a或-CF₃；

每一个n均独立地为1至3的整数；

每一个R^a均独立地选自氢、低级烷基和低级环烷基；

每一个R^b均独立地选自-OR^a、-CF₃、-OCF₃、-NR^cR^c、-C(O)R^a、-C(O)OR^a、-C(O)NR^cR^c和-C(O)NR^aR^d；

每一个R^c均独立地选自氢和低级烷基，或者，两个R^c取代基可以与其所连接的氮原子一起形成4-9元饱和环，该饱和环任选地包括1-2个另外的杂原子基团，该杂原子基团选自O、NR^a、NR^a-C(O)R^a、NR^a-C(O)OR^a和NR^a-C(O)NR^a；并且，

每一个R^d均独立地为低级单-羟基烷基或低级二-羟基烷基。

在一些实施方式中，结构式(I)的化合物是根据结构式(IIa)的(2-外-3-外)顺式异构体的外消旋混合物：

包括其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和N-氧化物，其中R¹、R²、R³和R⁵如上述结构式(I)所定义。

在一些实施方式中，化合物是根据上述结构式(Ia)的富含立体异构体的非对映异构体，包括其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和N-氧化物，其基本不含其对映异构体以及其任何其它非对映异构体。

在另一方面，本发明提供了富含立体异构体的化合物的前体药物。这种前体药物在其前体药物形式时可以是有活性的，或者可以是无活性的，直到在生理或其它使用条件下转变为活性药物形式。在前体药物中，该富含立体异构体的化合物的一个或多个官能团被包含在前体部分(promoiety)中，该前体部分在使用条件下典型地通过水解、酶解或一些其它的裂解机制从分子中裂解出来，从而得到官能团。例如，伯氨基或仲氨基可以包含在酰胺前体部分中，该酰胺前体部分在使用条件下裂解生成伯氨基或仲氨基。因此，前体药物包含特殊类型的保护基团，称为“前体基团(progroup)”，这些保护基团掩蔽了化合物的一个或多个官能团，其在使用条件下裂解得到活性药物化合物。富含立体异构体的化合物中可以用包含在前体部分中的前体基团掩蔽的官能团包括但不限于，氨基(伯氨基和仲氨基)、羟基、硫烷基(硫醇)、羧基、羰基等。适用于掩蔽这些官能团以得到前体部分、在需要的使用条件下可裂解的种种前体基团在本领域中是公知的。所有这些前体基团，可以单独或组合地包含在前体药物中。可以包含在前体药物中的生成伯氨基或仲氨基的前体部分的具体例子包括但不限于，酰胺类、氨基甲酸酯类、亚胺类、脲类、苯膦基类、磷酰基类和氧硫基类。可以包含在前体药物中的生成硫烷基的前体部分的具体例子包括但不限于，硫醚类，例如S-甲基衍生物(单硫代、二硫代、氧硫代、氨基硫代乙缩醛)、甲硅烷基硫醚类、硫酯类、硫代碳酸酯类、硫代氨基甲酸酯类、不对称二硫化物类等等。可以包含在前体药物中的裂解生成羟基的前体部分的具体例子包括但不限于，磺酸酯类、酯类和碳酸酯类。可以包含在前体药物中的生成羧基的前体部分的具体例子包括但不限于，酯类(包括甲硅烷基酯类、草氨酸酯类和硫酯类)、酰胺类和酰肼类。

在又一方面，本发明提供了包括一种或多种富含立体异构体的化合物的组合物。该组合物通常包括一种或多种化合物，和/或其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物，以及适当的载体、赋形剂和/或稀释剂。载体、赋形剂和/或稀释剂的确切性质将取决于该组合物的预期用途，其范围可以从适用于活体外使用或活体外使用可接受、到适合兽用或兽用可接受、到适用于人体使用或人体使用可接受。

在活体外试验中，这里所述的富含立体异构体的化合物是增殖性异常细胞如肿瘤细胞的有效抑制剂。因此，在再一方面，本发明提供了抑制异常细胞特别是肿瘤细胞增殖的方法。该方法通常包括，用有效抑制细胞增殖量的这里所述的一种或多种富含立体异构体的化合物和/或其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物，与异常细胞如肿瘤细胞接触。细胞可以与该化合物本身接触，或者该化合物可以调配在组合物中。该方法可以在活体外条件下实施，或作为治疗方式在活体内条件下实施，用于治疗或预防增殖性疾病如致瘤性癌症。

在仍然再一个方面，本发明提供了治疗增殖性疾病的方法。该方法可以在兽医领域的动物中或在人体内实施。该方法通常包括，将有效治疗或预防增殖性疾病量的这里所述的一种或多种富含立体异构体的化合物和/或其前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物给予动物或人类受试者。一种或多种化合物可以以本身形式给予受试者，或者一种或多种化合物可以以组合物的形式给药。能够根据该方法治疗的增殖性疾病包括但不限于致瘤性癌症。

这里所述的富含立体异构体的化合物是Aurora激酶的有效抑制剂。Aurora激酶是一类已知为细胞***关键调节物的酶。已经在几种类型人类癌细胞如乳腺肿瘤、结肠肿瘤、肾脏肿瘤、***、神经母细胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、胰腺肿瘤、***肿瘤和其它实体肿瘤中发现存在较高水平的Aurora激酶(参见，例如，Bischott等人，1998，EMBO J.17：3052-3065；Geopfert & Brinkley，2000，Curr.Top.Dev. Biol.49：331-342；Sakakura等人，2001，Br.J.Cancer84：824-831)，而且Aurora激酶的过度表达已经显示出会导致细胞蜕变，通过该过程正常细胞变成癌细胞。尽管不希望受任何特殊的作用理论约束，但是可以相信这里所述的富含立体异构体的化合物及其活性前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物，通过抑制一种或多种Aurora激酶而发挥其抗增殖活性。

因此，在仍然又一个方面，本发明提供了抑制Aurora激酶活性的方法。该方法通常包括，将有效抑制Aurora激酶活性量的这里所述的一种或多种富含立体异构体的化合物和/或其活性前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物与Aurora激酶接触。该方法可以在活体外条件下使用纯化或部分纯化的Aurora激酶(例如，使用表达Aurora激酶的细胞提取物)、在活体外条件下使用表达Aurora激酶的完整细胞或者在活体内条件下进行，从而抑制Aurora激酶介导的过程(例如，细胞有丝***)和/或作为治疗或预防至少部分由Aurora激酶活性介导的疾病或功能障碍的治疗方法。

在仍然又一个方面，本发明提供了治疗或预防Aurora激酶介导的疾病或功能障碍的方法。该方法通常包括给予动物或人类受试者有效治疗或预防Aurora激酶介导的疾病或功能障碍量的这里所述的一种或多种富含立体异构体的化合物和/或其活性前体药物、盐、水合物、溶剂化物和/或N-氧化物。Aurora激酶介导的疾病和功能障碍包括其中Aurora激酶家族的酶具有重要作用的任何疾病、功能障碍或其它不良状况。这种Aurora激酶介导的疾病或功能障碍的具体例子包括但不限于，黑色素瘤；白血病；以及实体肿瘤，例如结肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、***、黑色素瘤、肾癌、***癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌和膀胱癌。

其它方面包括但不限于中间体、以及用于合成富含立体异构体的化合物和前体药物的方法，这些内容将在下面详细描述。

附图说明

图1-4说明了在标准异种移植处理和回归模型(regression model)中，(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟 -N2-[(3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)]苯基-2，4-嘧啶二胺二盐酸盐(化合物60a·2HCl)对多种不同类型肿瘤生长的抑制效果。

具体实施方式

定义

这里所使用的下述术语具有下述含义：

“烃基(alkyl)”作为其本身或者作为另一取代基的一部分时，指的是通过从母体烷、烯或炔的单个碳原子上去掉一个氢原子而得到的饱和或不饱和的支链、直链或环状一价烃基，其具有指定数目的碳原子(即，C1-C6表示1至6个碳原子)。典型的烃基包括但不限于甲基；乙基类，例如乙基、乙烯基、乙炔基；丙基类，例如丙-1-基、丙-2-基、环丙-1-基、丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、环丙-1-烯-1-基；环丙-2-烯-1-基、丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁基类，例如丁-1-基、丁-2-基、2-甲基-丙-1-基、2-甲基-丙-2-基、环丁-1-基、丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基、丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；以及类似基团。在指定具体饱和程度的情况中，使用如下定义的专门术语“烷基(alkanyl)”、“烯基”和/或“炔基”。“低级烃基”指的是含有1至6个碳原子的烃基。

“烷基(alkanyl)”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是通过从母烷的单个碳原子上去掉一个氢原子而得到的饱和支链、直链或环状烃基。典型的烷基包括但不限于甲基；乙基；丙基类，例如丙-1-基、丙-2-基(异丙基)、环丙-1-基等；丁基类，例如丁-1-基、丁-2-基(仲丁基)、2-甲基-丙-1-基(异丁基)、2-甲基-丙-2-基(叔-丁基)、环丁-1-基等；以及类似基团。

“烯基”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是通过从母烯的单个碳原子上去掉一个氢原子而得到的具有至少一个碳-碳双键的不饱和支链、直链或环状烃基。该基团的双键或多个双键可以是顺式或反式构型。典型的烯基包括但不限于乙烯基；丙烯基类，例如丙-1-烯-1-基、丙-1-烯-2-基、丙-2-烯-1-基、丙-2-烯-2-基、环丙-1-烯 -1-基、环丙-2-烯-1-基；丁烯基类，例如丁-1-烯-1-基、丁-1-烯-2-基、2-甲基-丙-1-烯-1-基、丁-2-烯-1-基、丁-2-烯-2-基、丁-1，3-二烯-1-基、丁-1，3-二烯-2-基、环丁-1-烯-1-基、环丁-1-烯-3-基、环丁-1，3-二烯-1-基等；以及类似基团。

“炔基”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是通过从母炔的单个碳原子上去掉一个氢原子而得到的具有至少一个碳-碳参键的不饱和支链、直链或环状烃基。典型的炔基包括但不限于乙炔基；丙炔基类，例如丙-1-炔-1-基、丙-2-炔-1-基等；丁炔基类，例如丁-1-炔-1-基、丁-1-炔-3-基、丁-3-炔-1-基等；以及类似基团。

“烃二基”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是通过从母烷、烯或炔的两个不同碳原子上各去掉一个氢原子或者从母烷、烯或炔的单个碳原子上去掉二个氢原子而得到的饱和或不饱和的支链、直链或环状二价烃基，其具有指定数目的碳原子(即，C1-C6表示1至6个碳原子)。两个单价基中心或二价基中心的每一个价位均可以与相同或不同的原子连接。典型的烃二基包括但不限于甲二基；乙二基类，例如乙-1，1-二基、乙-1，2-二基、乙烯-1，1-二基、乙烯-1，2-基；丙二基类，例如丙-1，1-二基、丙-1，2-二基、丙-2，2-二基、丙-1，3-二基、环丙-1，1-二基、环丙-1，2-二基、丙-1-烯-1，1-二基、丙-1-烯-1，2-二基、丙-2-烯-1，2-二基、丙-1-烯-1，3-二基、环丙-1-烯-1，2-二基、环丙-2-烯-1，2-基、环丙-2-烯-1，1-二基、丙-1-炔-1，3-二基等；丁二基类，例如丁-1，1-二基、丁-1，2-二基、丁-1，3-二基、丁-1，4-二基、丁-2，2-二基、2-甲基-丙-1，1-二基、2-甲基-丙-1，2-二基、环丁-1，1-二基、环丁-1，2-二基、环丁-1，3-二基、丁-1-烯-1，1-二基、丁-1-烯-1，2-二基、丁-1-烯-1，3-二基、丁-1-烯-1，4-二基、2-甲基-丙-1-烯-1，1-二基、2-亚甲基-丙-1，1-二基、丁-1，3-二烯-1，1-二基、丁-1，3-二烯-1，2-二基、丁-1，3-二烯-1，3-二基、丁-1，3-二烯-1，4-二基、环丁-1-烯-1，2-二基、环丁-1-烯-1，3-二基、环丁-2-烯-1，2-基、环丁-1，3-二烯-1，2-二基、环丁-1，3-二烯-1，3-二基、丁-1-炔-1，3-二基、丁-1-炔-1，4-二基、丁-1，3-二炔-1，4-二基等；以及类似基团。在指定具体饱和程度的情况中，使用专门术语“烷二基”、“烯二基”和/或“炔二基”。其中，当特别指定二个价位在相同碳原子上时，使用专门术语“亚烃基(alkylidene)”。“低级烃二基”是含有1至6个碳原子的烃二基。在一些实施方式中，烃二基是饱和的非环烷二基，其基中心在末端碳原子上，例如，甲二基(甲撑)；乙-1，2-二基(乙撑)；丙-1，3-二基(丙撑)；丁-1，4-二基(丁撑)；以及类似基团(也称为烃撑(alkylene)，其定义如下)。

“烃撑(alkylene)”作为其本身或者作为另一取代基的一部分时，指的是通过从直链母烷、烯或炔的两个末端碳原子上各去掉一个氢原子而得到的具有两个末端一价基中心的直链饱和或不饱和烃二基。如果在特定的烃撑中存在双键或三键，则该双键或三键的位置用方括号表示。典型的烃撑包括但不限于亚甲基(甲撑)；乙撑类，例如乙撑、乙烯撑、乙炔撑；丙撑类，例如丙撑、丙烯[1]撑、丙二烯[1，2]撑、丙炔[1]撑等；丁撑类，例如丁撑、丁烯[1]撑、丁烯[2]撑、丁烯[1，3]二撑、丁炔[1]撑、丁炔[2]撑、丁二炔[1，3]撑等；以及类似基团。在指定具体饱和程度的情况中，使用专门术语烷撑(alkano)、烯撑(alkeno)和/或炔撑(alkyno)。在一些实施方式中，烃撑为(C1-C6)或(C1-C3)烃撑。在一些实施方式中，烃撑是直链饱和烷撑，例如，甲撑、乙撑、丙撑、丁撑等。

“环烃基”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是环状形式的“烃基”。典型的环烃基包括但不限于环丙基；环丁基类，例如环丁基和环丁烯基：环戊基类，例如环戊基和环戊烯基：环己基类，例如环己基和环己烯基；以及类似基团。

“母芳环体系(parent aromatic ring system)”指的是具有共轭π电子体系的不饱和环或多环体系。特别是，“母芳环体系”的定义包括稠环体系，该稠环体系中的一个或多个环是芳族的且一个或多个环是饱和或不饱和的，例如芴、茚满、茚、非那烯(Phenalene)、四氢萘等。典型的母芳环体系包括但不限于，醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁(azulene)、苯、屈(chrysene)、蒄(coronene)、荧蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、indacene、s-indacene、茚满、茚、萘、octacene、octaphene、艾氏剂(octalene)、卵苯、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七矅烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉红省、四氢萘、苯并[9，10]菲、联三萘等。

“芳基”作为其本身或者作为另一取代基的一部分时，指的是通过从母芳环体系的单个碳原子上除去一个氢原子而得到的一价芳烃基，其具有指定数目的碳原子(即，C5-C15表示5至15个碳原子)。典型的芳基基团包括但不限于由下述物质衍生得到的基团：醋蒽烯、苊、醋菲烯、蒽、薁(azulene)、苯、屈(chrysene)、蒄(coronene)、荧蒽、芴、并六苯、己芬、hexalene、as-indacene、s-indacene、茚满、茚、萘、octacene、octaphene、艾氏剂(octalene)、卵苯、戊-2，4-二烯、并五苯、并环戊二烯、戊芬、苝、非那烯、菲、苉、七矅烯(pleiadene)、芘、皮蒽、玉红省、四氢萘、苯并[9，10]菲、联三萘等及其各种氢异构体。在一些实施方式中，芳基基团是(C5-C15)芳基，更典型的是(C5-C10)芳基。具体的例子是苯基和萘基。

“卤素”或“卤”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，除非另有说明，否则指的是氟、氯、溴和碘。

“卤代烃基”作为其本身或者作为另一取代基的一部份时，指的是其中一个或多个氢原子被卤素替换的烃基。因此，术语“卤代烃基”意味着包括单卤代烃基、二卤代烃基、三卤代烃基等、直至全卤代烃基。例如，表达式“(C1-C2)卤代烃基”包括氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、1-氟乙基、1，1-二氟乙基、1，2-二氟乙基、1，1，1-三氟乙基、全氟乙基等等。

“羟烃基”作为其本身或者作为另一取代基的一部分时，指的是其中一个或多个氢原子被羟基取代基所替代的烃基。因此，术语“羟烃基”意味着包括单羟基烃基、二羟基烃基、三羟基烃基等等。

以上定义的基团可以包括本领域中通用的字首和/或字尾以得到其它公知的取代基。其例子是，“烃基氧基”或“烃氧基”指的是结构式为-OR的基团，“烃基胺”指的是结构式为-NHR的基团，并且“二烃基胺”指的是结构式为-NRR的基团，其中每一个R均独立地为烃基。另一个例子是，“卤代烃氧基”或“卤代烃基氧基”指的是结构式为-OR′的基团，其中R’是卤代烃基。

“前体药物”指的是可能需要在使用条件下(例如在体内)进行转变以释放活性药物的活性化合物(药物)的衍生物。前体药物在转化成活性药物之前经常(但并非必需)是药理学无活性的。前体药物典型地通过下述方式获得：用前体基团(progroup)(定义如下)掩蔽药物化合物中的官能团(其被部分认为是活性所需的)形成前体部分，该前体部分在特定使用条件下转变(如裂解)释放官能团并由此得到活性药物。前体部份的裂解可以自发进行，例如通过水解反应的方式；或者其可以被另一种试剂催化或引发，如通过酶、光、酸或碱，或者改变与其相接触的物理或环境的参数如改变温度。该试剂对于使用条件来说可以是内源的，如被给予前体药物的细胞中存在的酶或胃的酸性条件；或可以外源性地提供。

适合用于掩蔽这里所述的富含立体异构体的活性化合物中的官能团以产生前体药物的大量前体基团及所得到的前体部分在本领域中是公知的。例如，羟基官能团可以被掩蔽成磺酸酯、酯或碳酸酯前体部分，该前体部分在活体内可以水解产生羟基。氨基官能团可以被掩蔽成为酰胺、氨基甲酸酯、亚胺、脲、苯膦基、磷酰基或氧硫基前体部分，该前体部分在活体内可以水解产生氨基。羧基基团可以被掩蔽成为酯(包括甲硅烷基酯类和硫酯类)、酰胺或酰肼前体部分，该前体部分可以在活体内水解产生羧基。合适的前体基团及其各自的前体部分的其它具体例子对于本领域技术人员来说是显而易见的。

“前体基团”指的是这样一类保护基团：当其用于在富含立体异构体的活性药物化合物中掩蔽官能团形成前体部分时，将药物转变为前体药物。前体基团典型地经由在特定使用条件下可以裂解的键连接到药物的官能团。因此，前体基团是在特定使用条件下裂解释放官能团的前体部分的一部分。其具体例子是，结构式-NH-C(O)CH₃的酰胺前体部分包括前体基团-C(O)CH₃。

“增殖性疾病”指的是特征在于异常细胞增殖(例如，其中细胞***比其相应的正常细胞要多)的疾病或功能障碍。异常增殖可以由作用机制或作用机制的组合引起。例如，一个或多个细胞的细胞周期可以被影响，这样(多个)细胞的***比其相应的正常细胞更为频繁，或者另一个例子是，一个或多个细胞可以绕过在正常情况下限制其***次数的抑制性信号。增殖性疾病包括但不限于，缓慢或迅速生长的肿瘤和癌症。

“抗增殖化合物”指的是与未处理的相似类型对照细胞相比抑制细胞增殖的化合物。抑制作用可以由任何机制或机制组合引起，并且可以以抑制细胞生长或细胞毒性的方式来抑制增殖。具体例子是，这里所述的抑制作用包括但不限于停止细胞***，降低细胞***、增殖和/或生长的速率，和/或通过任何作用机制包括例如凋亡而诱导细胞死亡。

“Aurora激酶”指的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员，其通常被称为“Aurora”激酶。丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的Aurora家族对于细胞增殖来说是很重要的(参见，例如，Bischhoff & Plowman，1999，Trends Cell Biol.9：454-459；Giet & Prigent，1999，J.Cell Science112：3591-3601；Nigg，2001，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2：21-32；Adams等人，2001，Trends Cell Biol.11：49-54)。现在，存在三种已知的哺乳动物族成员：Aurora-A(“2”)、Aurora-B(“1”)和Aurora-C(“3”)(参见，例如，Giet & Prigent，1999，J.Cell Sci.112：3591-3601；Bischoff &Plowman，1999，Trends Cell Biol.9：454-459)。如这里所述，“Aurora激酶”不仅包括这三种已知的哺乳动物族成员，还包括后来发现的哺乳动物族成员以及来自其它种属和生物体的同源蛋白(来自其它种属和生物体的Aurora激酶家族同源成员的非限制性例子参见Schumacher等人，1998，J.Cell Biol.143：1635-1646；Kimura等人，1997，J.Biol.Chem.272：13766-13771)。

“Aurora激酶介导的过程”或“Aurora激酶介导的疾病或功能障碍”指的是，其中Aurora激酶具有重要作用的细胞过程、疾病或功能障碍。人们相信，Aurora激酶在调节细胞周期的有丝***期的蛋白质磷酸化事件中具有关键的作用。人类Aurora激酶在有丝***过程中显示了清楚的亚细胞定位。例如，在细胞周期的M期，Aurora-A是上调的，并且在有丝***过程中定位在纺锤极上，暗示参与了中心小体的功能。Aurora-A的活性在***前期达到最大，并且据信Aurora-B在***后期和***末期的染色单体分离和卵裂沟形成的过程中具有重要的作用。Aurora-C的作用不太明确，但已经显示其在有丝***从***后期至胞质***过程中定位在中心体上。而且，抑制哺乳动物细胞的Aurora激酶活性会引起异常细胞生长和多倍性(Terada等人，1998，EMBO J.17：667-676)。因此，人们认为，Aurora激酶调节细胞***、染色体分离、有丝***纺锤体形成和胞质***。这里使用的各种过程均在“Aurora激酶介导的过程”的范围内。

而且，自从其在1997年发现以来，哺乳动物Aurora激酶家族已经与肿瘤发生密切地联系起来。对此，最令人信服的证据是Aurora-A的过度表达使啮齿类动物的成纤维细胞转化(Bischoff等人，1998，EMBOJ.17：3052-3065)。该激酶水平较高的细胞含有多个中心体和多极纺锤体，并且迅速地变成非整倍体。Aurora激酶的致瘤活性可能与这种遗传不稳定性的产生有关。事实上，在乳腺肿瘤和胃肿瘤中已经观察到Aurora-A基因座的增加和染色体不稳定性之间的关联性(Miyoshi等人，2001，Int.J.Cancer92：370-373；Sakakura等人，2001，Brit.J.Cancer84：824-831)。

已有报道，在大量人类肿瘤中Aurora激酶过度表达。在下述情况中已经检测出Aurora-A的表达增加：超过50％的结直肠肿瘤(Bischoff等人，1998，EMBO J.17：3052-3065；Takahashi等人，2000，Jpn.J.CancerRes.91：1007-1014)、卵巢肿瘤(Gritsko等人，2003，Clinical CancerResearch9：1420-1426)和胃肿瘤(Sakakura，2001，Brit.J.Cancer84：824-831)；以及94％的侵袭性乳腺导管腺瘤(Tanaka，1999，CancerResearch.59：2041-2044)。也已有报道，在肾肿瘤、***、神经母细胞瘤、黑色素瘤、淋巴瘤、胰腺肿瘤和***肿瘤细胞系中存在高水平的Aurora-A(Bischoff等人，1998，EMBO J.17：3052-3065；Kimura等人，1999，J.Biol.Chem.274：7334-7340；Zhou等人，1998，NatureGenetics20：189-193；Li等人，2003，Clin Cancer Res.9(3)：991-7)。在人膀胱癌中观察到了Aurora-A的增加/过度表达，且Aurora-A的增加与非整倍性和进攻性临床行为有关系(Sen等人，2002，J Natl Cancer Inst.94(17)：1320-9)。而且，Aurora-A基因座(20q13)的增加与***阴性的乳腺癌患者的不良预后有关(Isola等人，1995，American Journal ofPathology147：905-911)。Aurora-B在多种人肿瘤细胞系中高度表达，包括白血病细胞(Katayama等人，1998，Gene244：1-7)。该酶的水平升高成为了原发性结直肠癌的Duke′s期的指标(Katayama等人，1999，J.Nat′l Cancer Inst.91：1160-1162)。Aurora-C通常仅仅在生殖细胞中发现，其也在高百分比的原发性结直肠癌中和多种肿瘤细胞系(包括***和乳腺癌细胞)中过度表达(Kimura等人，1999，J.Biol.Chem. 274：7334-7340；Takahashi等人，2000，Jpn.J.Cancer Res.91：1007-1014)。

相反，在大多数正常组织中，Aurora家族低水平表达，例外的是具有高比例***细胞的组织，例如胸腺和睾丸(Bischoff等人，1998，EMBO J.，17：3052-3065)。

为了进一步综述Aurora激酶在增殖性疾病中的作用，请见Bischhoff & Plowman，1999，Trends Cell Biol.9：454-459；Giet & Prigent，1999，J.Cell Science112：3591-3601；Nigg，2001，Nat.Rev.Mol.Cell Biol.2：21-32；Adams等人，2001，Trends Cell Biol.11：49-54；以及Dutertre等人，2002，Oncogene21：6175-6183。

尽管癌细胞过度表达蛋白并非总是表示抑制蛋白活性会产生抗肿瘤作用，但是已经在功能试验中证实，至少下述类型的肿瘤细胞对Aurora激酶活性的抑制是敏感的：***癌(DU145)、***(Hela)、胰腺癌(Mia-Paca2、BX-PC3)、组织性白血病(U937)、肺腺癌、肺表皮样癌、小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌、MolT3(全部)和Molt4(全部)。

基于已经发现的Aurora激酶在多种癌症中的作用，“Aurora激酶介导的疾病和功能障碍”的例子包括但不限于黑色素瘤、白血病和实体肿瘤癌症，例如结肠癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、***、黑色素瘤、肾癌、***癌、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌和膀胱癌。

“治疗有效量”指的是足以治疗具体的功能障碍或疾病或其一种或多种症状的化合物用量。对于致瘤性增殖性疾病来说，除其它情况以外，治疗有效量包括足以导致肿瘤萎缩、或者降低肿瘤生长速率的用量。

在许多情况下，致瘤性增殖性疾病的标准治疗方法包括除去肿瘤的外科手术，其单独使用或者与药物(化疗)和/或放疗联合。这里所使用的“治疗有效量”的化合物意味着所包括的化合物用量能够预防已经通过手术除去的(多个)肿瘤的受试者的肿瘤复发、或者延缓这些受试者的(多个)肿瘤的复发速率。

因此，如这里所使用的，为其它类型治疗(例如，手术干预和/或使用其它抗增殖药物的治疗)提供辅助治疗益处的化合物用量包括在“治疗有效量”的含义内，该抗增殖药物包括，例如，5-氟尿嘧啶、长春瑞滨、紫杉醇、长春碱、顺铂、拓扑替康等。

“预防有效量”指的是足以防止受试者发生特定疾病或功能障碍的化合物用量。典型地，实施预防的受试者没有罹患特定的功能障碍或疾病，但是被认为具有发展该种疾病或功能障碍的高风险，例如但不限于，诊断标志物和家族史。

富含立体异构体的化合物和纯立体异构体化合物

近年来，已经发现某些N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-N2-取代苯基-2，4-嘧啶二胺化合物(表示为下述结构式(I))，在活体外试验中是Aurora激酶活性和肿瘤细胞增殖的有效抑制剂(参见，例如，2005年5月18日提交的第11/133,419号申请、与本申请同时提交的题目为“Stereoisomerically Enriched β-Lactams Using CandidaAntarctica”的共同未决申请(申请号未知，代理人卷号375462-030US)、以及2005年5月18日提交的国际申请PCT/US05/17470号及其所参考的优先权申请)：

本领域技术人员应当意识到，在结构式(I)中，碳原子1、2、3和4位上的立体化学并未指定，因此，根据结构式(I)的化合物包括8个由下述结构式(Ia)至(Ih)所示的非对映异构体：

结构式(I)的化合物还包括两种由下述结构式(IIa)和(IIb)表示的顺式外消旋体、以及两种由下述结构式(IIIa)和(IIIb)表示的反式外消旋体：

(2-外-3-外) (2-内-3-内)

结构式(IIa)的顺式外消旋体可以被称为2-外-3-外的外消旋体，并且分别包括结构式(Ia)和(Ib)的(1R，2R，3S，4S)和(1S，2S，3R，4R)非对映异构体。结构式(IIb)的顺式外消旋体可以被称为2-内-3-内的外消旋体，并且分别包括结构式(Ic)和(Id)的(1R，2S，3R，4S)和(1S，2R，3S，4R)非对映异构体。如实施例部分中更详细的描述，对于其中R⁵是氟、R¹是氢、R²是4-甲基哌嗪-1-基且R³是甲基的化合物，这两种顺式外消旋体在活体外抗增殖试验中显示出对多种不同的肿瘤细胞系的抗增殖活性。但是，在用两种外消旋体检测的所有细胞系中，这种2-外-3-外的外消旋体(外消旋体r1)的功效比相应的2-内-3-内的外消旋体(外消旋体r2)大约高20倍。而且，已经发现，在外消旋体r1的功效中外消旋体r1的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体承担了大部分作用。当以分离的立体异构体进行试验时，对于相同的细胞系，这种(1R，2R，3S，4S)非对映异构体(称为“a”非对映异构体)通常显示纳摩尔范围内的IC50，而(1S，2S，3R，4R)非对映异构体(称为“b”对映异构体)一般显示微摩尔范围内的IC50。因此，通常该化合物的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体的功效比其相应的(1S，2S，3R，4R)对映异构体高1000倍。在所检测的细胞系中，其功效也比2-内-3-内的r2外消旋体高大约20-50倍。在对Aurora激酶B的基于细胞的抑制试验中，与其(1S，2S，3R，4R)对映异构体相比，(1R，2R，3S，4S)非对映异构体也显示相似的较佳结果。根据对这种(1R，2R，3S，4S)非对映异构体效果的观察，期望根据结构式(Ia)的所有(1R，2R，3S，4S)非对映异构体与其相应的(1S，2S，3R，4R)对映异构体、2-外-3-外的外消旋体、2-内-3-内的外消旋体、以及其它相应的非对映异构体相比，都会显示出相似的较佳功效。

因此，这里提供了富含这种特别有效的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体的化合物。在一个实施方式中，这种富含立体异构体的化合物包括根据结构式(I)的化合物：

其富含结构式(Ia)相应的非对映异构体：

其中：

每一个R¹均独立地选自氢、低级烃基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-C(O)OR^a、卤素、-CF₃和-OCF₃；

每一个R²均独立地选自氢、低级烃基、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-NHC(O)R^a、卤素、-CF₃、-OCF₃、

和

每一个R³均独立地选自氢、低级烃基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、卤素、-CF₃、-OCF₃、

和

每一个R⁴均独立地选自氢、低级烃基、芳基烃基、-OR^a、-NR^cR^c、-C(O)R^a、-C(O)OR^a和-C(O)NR^cR^c；

R⁵是氢、卤素、氟、-CN、-NO₂、-CO(O)R^a或-CF₃；

每一个n均单独地为1至3的整数；

每一个R^a均独立地选自氢、低级烃基和低级环烃基；

每一个R^c均独立地选自氢和低级烃基，或者两个R^c取代基可以与其所连接的氮原子一起形成4-9元饱和环，该环任选地包括1-2个另外的选自O、NR^a、NR^a-C(O)R^a、NR^a-C(O)OR^a和NR^a-C(O)NR^a的杂原子基团；并且

每一个R^d均单独地为低级单羟基烃基或低级二羟基烃基。

在另一个实施方式中，这种富含立体异构体的化合物包括根据结构式(IIa)的2-外-3-外的顺式外消旋体，其中R¹、R²、R³、R⁴和R⁵的定义如前述对富含结构式(Ia)的非对映异构体的结构式(I)的定义。

如这里所使用的，当特定的非对映异构体以大大超过化合物中存在的任何其它非对映异构体的量存在时，则化合物“富含”该非对映异构体。包含该特定非对映异构体的化合物的实际百分比将取决于存在的其它非对映异构体的数目。具体例子是，当特定对映异构体在混合物的组成中超过50％时，外消旋混合物“富含”该特定对映异构体。不管存在的非对映异构体数目有多少，富含特定非对映异构体的化合物一般包括至少大约60％、70％、80％、90％或者甚至更多的该特定非对映异构体。该特定非对映异构体的富集量(enrichment)可以使用本领域技术人员常用的传统分析方法来确认，下面将详细讨论。

在另一个实施方式中，富含立体异构体的化合物包括前述根据结构式(Ia)的化合物，其中R¹、R²、R³、R⁴和R₅如前面对结构式(I)的规定，该化合物基本不含相应的对映异构体和/或任何其它相应的非对映异构体。“基本不含”指的是，当使用本领域技术人员常规使用的传统分析方法确定时，该化合物包括少于大约10％不需要的非对映异构体和/或对映异构体(在下面将详细讨论)。在一些实施方式中，不需要的立体异构体的量可以少于10％，例如，9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或甚至更少。含有大约95％或更多的所需立体异构体的富含立体异构体的化合物在此被称为“基本上纯的”立体异构体。含有大约99％或更多的所需立体异构体的富含立体异构体的化合物在此被称为“纯的”立体异构体。任何富含立体异构体的化合物的纯度(非对映异构体的纯度；％de)可以使用传统的分析方法来确认，下面将详细讨论。

在这里所述的各种富含立体异构体的化合物的一些实施方式中，R¹是氢；R²是

或

且R³不是或

在这里所述的各种富含立体异构体的化合物的其它实施方式中，R³是氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或氯。在另一些实施方式中，R⁴是甲基、-C(O)CH₃、-C(O)OCH₃或-C(O)OCH₂CH₃。

在这里所述的各种富含立体异构体的化合物的又一些实施方式中，R¹是氢；R²不是或

且R³是

或

在仍然另一些实施方式中，R²是氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或氯。优选R⁴是甲基、-C(O)CH₃、-C(O)OCH₃或-C(O)CH₂CH₃。

在这里所述的各种富含立体异构体的化合物的仍然又一些实施方式中，R²不是

或

且R³不是

或

在再一些实施方式中，R¹和R²均是氢，且R³是-OCH₂NHR^a。在一些其它实施方式中，R¹、R²和R³每一个都相互独立地选自氢、甲基、甲氧基、三氟甲基和氯，条件是R¹、R²和R³中的至少两个不是氢。

仍然在其它实施方式中，R¹是氢；R²选自氢、

和

且R³选自氢、低级烃基、卤素、-CF₃、

和

仍然在其它的实施方式中，R³选自氢、甲基、氯、-CF₃、

和

且R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R^a，其中R^a是甲基或乙基。还是在另一个实施方式中，R²选自氢、和

且R³选自氢、低级烃基、卤素、-CF₃、

和

仍然在其它实施方式中，R³选自氢、甲基、氯、-CF₃、

和

且R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R³，其中R^a是甲基或乙基。优选R²是

R⁴是-COR^a，其中R^a是甲基；且R³是氢。在其它实施方式中，R²是

R⁴是-CO(O)R^a，其中R^a是乙基；且R³是氢。仍然在另一个实施方式中，R²是

且R³是氢。

还是在另一个实施方式，R²是氢；R³是

或

且R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R^a，其中R^a是甲基或乙基。优选R²是

R⁴是甲基；且R³选自氢、甲基、氯和-CF₃。更优选R³是甲基。

仍然在这里所述的富含立体异构体的化合物的其它实施方式中，R⁵是氟。

仍然在其它实施方式中，富含立体异构体的化合物是在立体异构上基本上是纯的、或者在立体异构上是纯的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[(3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)]苯基-2，4-嘧啶二胺。

在下表I中说明了根据结构式(I)的化合物的其它示例性实施方式，该化合物可以在立体异构上富含前述结构式(Ia)相应的非对映异构体、基本不含其任何对映异构体和/或非对映异构体、和/或是基本上纯的或者纯的前述结构式(Ia)的非对映异构体：

Figure DEST_PATH_G05837119520080114D000011

当意指这里所述的特定化合物的特定非对映异构体和/或外消旋混合物如表I中所述的化合物时，化合物编号之后跟随一个字母，该字母如下指明特定的非对映异构体或外消旋混合物：

a＝(1R，2R，3S，4S)

b＝(1S，2S，3R，4R)

c＝(1R，2S，3R，4S)

d＝(1S，2R，3S，4R)

e＝(1R，2R，3R，4S)

f＝(1S，2S，3S，4R)

g＝(1R，2S，3S，4S)

h＝(1S，2R，3R，4R)

r1＝2-外-3-外顺式外消旋体

r2＝2-内-3-内顺式外消旋体

r3＝2-外-3-内反式外消旋体

r4＝2-内-3-外反式外消旋体

因此，具体例子是，化合物60的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体被称为化合物60a。

本领域技术人员应当意识到，这里所述的富含立体异构体的化合物可以包括能够用前体基团掩蔽的官能团以形成前体药物。这种前体药物通常，但并不一定，在转变成其活性药物形式之前是药理学无活性的。例如，酯基通常在暴露于胃内的酸性条件时经过酸催化水解作用得到母体羧酸、或者在暴露于肠内或血液的碱性条件时经过碱催化水解作用。因此，当受试者经口服给药时，包括酯部分的富含立体异构体的化合物可以被认为是其相应羧酸的前体药物，不管该酯形式是否是药理学活性的。

这里所述的各种富含立体异构体的化合物的前体药物均包括在本发明的范围内。在这些前体药物中，任何可用的官能部分都可以用前体基团掩蔽形成前体药物。这里所述的富含立体异构体的化合物内的官能团(可以用前体基团掩蔽包含在前体部分中)，包括但不限于胺类(伯胺和仲胺)、羟基类、硫烷基类(硫醇类)、羧基类等。适用于掩蔽这些官能团产生在所需使用条件下可裂解的前体部分的多种前体基团在本领域中是公知的。所有这些前体基团单独或其组合，都可以包含在本发明的富含立体异构体的前体药物中。

在一个说明性实施方式中，富含立体异构体的前体药物是根据前述结构式(I)的化合物，其中R^a、R^b和R^c除其前述选择之外，还可以是富含前述结构式(Ia)相应的非对映异构体的前体基团。

本领域技术人员应当理解，这里所述的许多化合物和前体药物、以及这里具体描述和/或说明的多种化合物种类，都可以显示互变异构和构象异构现象。例如，该化合物和前体药物可以存在几种互变异构形式，包括烯醇式、酮式及其混合物。对于各种化合物名称，说明书和权利要求内的结构式和化合物附图仅仅能够代表可能的互变异构或构象形式中的一种，应该理解本发明包括具有这里所述的一种或多种用途的化合物或前体药物的任何互变异构体或构象异构体、以及这些各种不同的异构体形式的混合物。在围绕2，4-嘧啶二胺核心结构有限旋转的情况下，atrop异构体也是可能的，并且也特别地包括在本发明的化合物和/或前体药物中。

根据各种取代基的特性，富含立体异构体的化合物和前体药物可以是盐形式。这样的盐包括适用于药学用途的盐(“药学可接受的盐”)、适用于兽用的盐等。这样的盐可以来源于酸或碱，这在本领域中是公知的。

在一些实施方式中，该盐是药学可接受的盐。通常，药学可接受的盐是基本上保留了母体化合物的一种或多种所需药理学活性的盐，并且适用于人体给药。药学可接受的盐包括用无机酸或有机酸形成的酸加成盐。适用于形成药学可接受的酸加成盐的无机酸包括，例如但不限于，氢卤酸(例如，盐酸、氢溴酸、氢碘酸等)、硫酸、硝酸、磷酸等。适用于形成药学可接受的酸加成盐的有机酸包括，例如但不限于，乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、草酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、烃基磺酸(例如，甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸等)、芳基磺酸(例如，苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸等)、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸、粘康酸等。

药学可接受的盐还包括当母体化合物中存在的酸性质子被金属离子(例如，碱金属离子、碱土金属离子或铝离子)置换、或用有机碱(例如，乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、N-甲基葡糖胺、吗啉、哌啶、二甲胺、二乙胺等)配位形成的盐。

富含立体异构体的化合物和前体药物及其盐，还可以是水合物、溶剂化物和/或N-氧化物的形式，这些在本领域中是公知的。

这里所述的化合物和前体药物的立体异构体富集程度(Stereoiso-meric enrichment)和/或纯度可以通过本领域技术人员公知的常规分析方法确定。例如，使用手性NMR移位试剂、使用手性柱的气相色谱分析、使用手性柱的高压液相色谱分析、通过与手性试剂的反应形成非对映异构体衍生物、以及传统的分析方法都可用来确定特定立体异构体的立体异构体富集程度和/或纯度。或者，使用已知立体异构体富集程度和/或纯度的起始原料合成可以用来确定这里所述的化合物的立体异构体富集程度和/或纯度。确定立体异构体同质性的其它分析方法也为专业技术人员所熟知。

合成方法

富含立体异构体的化合物和前体药物可以经多种不同的合成途径、使用市售起始原料和/或通过常规合成方法制备的起始原料合成。可以用来合成这里所述的富含立体异构体的化合物和前体药物的多种示例性合成途径如WO03/063794和US2004/0029902所述，该申请的公开内容在此引入作为参考。

为说明的日的，能够用于合成这里所述的所有化合物的示例性合成方案如下述方案(I)所述：

方案(I)

在方案(I)中，R¹、R²、R³和R⁵如前述对结构式(I)的定义，X是卤素(例如，F、Cl、Br或I)，每一个G都相互独立地选自O和S。应该注意，氨基羧酰胺6中的“*”表示不指定特定的立体中心。因此，本领域技术人员将会意识到，可以使用方案(I)来制备根据结构式(I)的化合物的外消旋非对映异构体混合物、富含非对映异构体的混合物、以及结构式(I)的化合物的立体异构体(基本不含其它特定的非对映异构体)。

就方案(I)而言，尿嘧啶或硫脲嘧啶2使用标准卤化剂POX₃(或其它卤化剂)，在标准条件下在2-位和4-位上双卤化，得到2，4-双-卤代嘧啶4。嘧啶4中C4位上的卤化物比C2位上的卤化物对亲核试剂更有反应性。可以利用这种反应性的差异通过下述方式合成这里所述的化合物和前体药物：首先，将2，4-双-卤代嘧啶4与1当量2-氨基双环[2.2.1]庚-5-烯-3-羧酰胺6反应，得到8；然后与苯胺10反应，得到根据结构式(I)的化合物。本领域技术人员将会理解，氨基羧酰胺6的立体异构构象和光学纯度在大多数情况下将决定结构式(I)的化合物的立体异构构象和光学纯度。

在大多数情况下，如在该方案中说明的那样，C4卤化物对亲核试剂更具反应性。但专业技术人员应当意识到，R⁵取代基的性质可能会改变其反应性。例如，当R⁵是三氟甲基时，获得4N-取代-4-嘧啶胺8和相应的2N-取代-2-嘧啶胺的50：50混合物。不管R⁵取代基的性质如何，通过调节溶剂和其它合成条件(如温度)能够控制反应的区域选择性，这在本领域中是公知的。

当反应混合物经微波加热时，方案(I)中描绘的反应会进行地更迅速。当以此方式加热时，使用下述条件：在Smith反应器(PersonalChemistry，Biotage AB，Sweden)中，在密封试管中(在20巴压力下)在乙醇中加热至175℃，持续5-20分钟。

尿嘧啶或硫脲嘧啶2起始原料可以从商业渠道购得，或使用有机化学标准技术制备。可用作方案(I)中的起始原料的市售尿嘧啶和硫脲嘧啶包括，例如但不限于，尿嘧啶(Aldrich#13,078-8；CAS登记号66-22-8)；2-硫脲嘧啶(Aldrich#11,558-4；CAS登记号141-90-2)；2，4-二硫脲嘧啶(Aldrich#15,846-1；CAS登记号2001-93-6)；5-溴尿嘧啶(Aldrich#85,247-3；CAS登记号51-20-7)；5-氟尿嘧啶(Aldrich#85,847-1；CAS登记号51-21-8)；5-碘尿嘧啶(Aldrich#85,785-8；CAS登记号696-07-1)；5-硝基尿嘧啶(Aldrich#85,276-7；CAS登记号611-08-5)；5-(三氟甲基)-尿嘧啶(Aldrich#22,327-1；CAS登记号54-20-6)。其它5-取代的尿嘧啶和/或硫脲嘧啶可购自GeneralIntermediates of Canada，Inc.，Edmonton，CA(http://www.general- intermediates.com)和/或Interchim，Cedex，France(http://www.inter-chim.com)，或者可以使用标准技术制备。教授合适的合成方法的大量教科书参考资料在下文中提供。

苯胺10可以从商业渠道购得，或者可以使用标准技术合成。例如，可以使用标准化学技术从硝基前体合成合适的苯胺。具体的示例性反应在实施例部分中提供。还可以参见Vogel，1989，Practical OrganicChemistry，Addison Wesley Longman，Ltd.和John Wiley & Sons，Inc.。

专业技术人员应当理解，在一些情况下，苯胺10可以包括在合成过程中需要保护的官能团。所使用的任何(多个)保护基团的确切性质取决于被保护的官能团性质，这对于本领域技术人员是显而易见的。选择合适保护基以及其连接和去除的合成策略的指导可以参见，例如，Greene & Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第三版，JohnWiley & Sons，Inc.，New York(1999)及其所引用的参考文献(以后称为“Greene & Wuts”)。

这里所述的前体药物可以通过上述方法的常规改进方法制备。

专业技术人员应当理解，需要的前述结构式(Ia)对应的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体可以通过手性分离或其它标准技术分离。手性解离特定非对映异构体的方法在实施例部分中更详细地描述。

富含立体异构体的化合物和/或基本上纯的和/或纯的非对映异构体也可以从具有特定立体化学的2-氨基-3-羧酰胺起始原料6，或在手性助剂的辅助下合成。

在一个示例性实施方式中，如下述方案(II)中所述，使用(R)-甲基-对-甲氧基苄胺18作为手性助剂，化学解离需要的非对映异构体。

在方案(II)中，2-外-3-外的外消旋β-内酰胺14r1(如Stajar等人，1984，Tetrahedron40(12)：2385中所述的制备)用Boc基团保护，得到相应的外消旋Boc-保护的β-内酰胺16r1。然后，Boc-保护的外消旋体16r1与(R)-甲基-对-甲氧基苄胺18反应，得到非对映异构体20a和20b的混合物。这种非对映异构体混合物与酸如TFA反应以裂解Boc基团，得到非对映异构体22a和22b的混合物，其可以与2，4-二卤代嘧啶4反应，得到化合物24a和24b的外消旋混合物。在此阶段，化合物24a和24b可以通过结晶相互分离，并且与苯胺10反应得到分离的非对映异构体25a和25b。然后，从分离的非对映异构体25a和25b裂解手性助剂，分别得到分离的根据结构式(Ia)和(Ib)的非对映异构体。

对于化合物25a和25b，其中R¹是氢、R²是4-甲基-哌嗪-1-基、R³是甲基且R⁵是氟，手性助剂的裂解证明是很困难的。对于其中这种裂解被证明是很困难的这些和其它化合物，可以从化合物24a和24b裂解手性助剂，并且用得到的分离化合物与苯胺10反应，得到分离的根据结构式(Ia)和(Ib)的非对映异构体。这些反应的具体例子如实施例部分中所述。

富含立体异构体的化合物、基本上是纯立体异构体的(substantiallystereoisomerically pure)特定非对映异构体和/或纯立体异构体(substantially pure)的特定非对映异构体的化合物也可以从富含立体异构体的、基本上是纯立体异构体的和/或纯立体异构体的β-内酰胺合成。这种富含立体异构体和/或(基本上是)纯立体异构体的β-内酰胺可以被酶解和分离。在一个示例性实施方式中，如Eniko等人，2004，Tetrahedron Asymmetry15：573-575所述，使用固定化脂肪酶(购自Sigma Chemical Co.，目录编号L4777)，从2-外-3-外的β-内酰胺的外消旋混合物中可以分解和分离(基本上是)纯立体异构体的β-内酰胺。在另一个示例性实施方式中，使用与树脂结合的固定化chirazymeL-2型B脂肪酶(B型南极假丝酵母，c-f，购自Biocatalytics，Inc.，Pasadena，CA)，能够从2-外-3-外的Boc-保护的外消旋β-内酰胺16r1中分解和分离(基本上是)纯立体异构体的β-内酰胺，如2004年11月15日提交的第60/628,401号申请、2005年5月18日提交的第11/133,419号共同未决申请和2005年5月18日提交的国际申请PCT/ US05/17470、以及与本申请同时提交的题目为“StereoisomericallyEnriched β-Lactams Using Candida Antarctica”的共同未决申请(申请号未知，代理人卷号375462-030US)所述，上述专利申请的公开内容在此引入作为参考。使用该酶解离β-内酰胺的特定非对映异构体的具体例子如实施例部分所述，其是合成2-外-3-外的外消旋β-内酰胺16r1的方法。

利用酶反应合成根据结构式(Ia)的特定非对映异构体的例子如下述方案(III)和(IV)中所述。如方案(III)和(IV)所述的使用Novozyme435酶的具体例子如实施例部分所述，该酶像上面所讨论的和方案(III)所示的Chirazyme酶一样，可以用于从外消旋β-内酰胺中解离对映异构体。

方案(IV)

抗增殖活性化合物的活性

富含立体异构体的活性化合物通常抑制希望的细胞如肿瘤细胞的增殖，当在标准的活体外细胞增殖试验中测量时，其IC₅₀在大约20μM或更小的范围内。当然，专业技术人员应当理解，显示较低IC₅₀(例如在10μM、1μM、100nM、10nM、1nM或甚至更低的数量级)的化合物可以特别地用于治疗应用中。抗增殖活性可以是细胞生长抑制性的或是细胞毒性的。在期望抗增殖活性对特殊类型细胞有特异性的情况下，该化合物可用希望类型的细胞测定活性，并且反向筛选对其它细胞类型缺乏的活性。在这种反向筛选中，所需的“无活性”程度、或者预期的活性与无活性之比可以根据不同情况变化，并且可以由用户选择。

活性化合物还典型地抑制Aurora激酶的活性，其IC₅₀在大约20μM或更小的范围内，典型地在大约10μM、1μM、100nM、10mM、1mM、或甚至更小的范围内。针对Aurora激酶的IC₅₀可以在标准的活体外试验中用分离的Arurora激酶、或者在功能性细胞阵列中测定。可以用于测定Aurora激酶活性程度的合适的酶联测定法如Fox等人，1998，Protein Sci.7：2249-2255中所述。肯普肽序列LRRASLG(Bochern Ltd.，UK)可以用作Aurora激酶-A、Aurora激酶-B和/或Aurora激酶-C的底物，反应在30℃在含有100mM HEPES(pH7.5)、10mM MgCl₂、25mM NaCl、1mM DTT的溶液中进行。IC₅₀值可以采用市售软件(例如，Prism3.0，GraphPed Software，San Diego，CA)使用程序化非线性回归确定。合适的基于细胞的功能试验如实施例部分所述。

抗增殖化合物的应用

富含立体异构体的活性化合物，包括其各种前体药物、盐、水合物和/或N-氧化物形式，可以用于抑制Aurora激酶、Aurora激酶介导的过程和/或多种情况下的细胞增殖。根据一些实施方式，细胞或细胞群与有效抑制Aurora激酶活性、Aurora激酶介导的过程和/或细胞或细胞群增殖的量的这种化合物相接触。当用于抑制细胞增殖时，化合物可发挥细胞毒性杀死细胞、或者发挥细胞生长抑制作用抑制增殖而不杀死细胞。

在一些实施方式中，这些方法可以作为治疗方法在活体内实施以治疗或预防Aurora激酶介导的疾病或功能障碍，尤其是增殖性疾病。因此，在一个具体实施方式中，这里所述的富含立体异构体的化合物(以及这里所述的各种形式)可以用于治疗或预防动物受试者包括人的增殖性疾病。该方法通常包括给予受试者有效治疗活预防疾病的量的富含立体异构体的化合物或其前体药物、盐、水合物或N-氧化物。在一个实施方式中，受试者是哺乳动物，包括但不限于牛、马、猫、犬、啮齿动物或灵长类动物。在另一个实施方式中，受试者是人。

使用这里所述的化合物可治疗或预防各种细胞增殖性疾病。在一些实施方式中，这些化合物用来治疗累及受试者的各种癌症。通常，癌症根据癌细胞来源的组织和细胞类型分类。癌(carcinoma)被认为是来源于上皮细胞的癌症(cancer)，而肉瘤被认为是来源于***和肌肉的癌症。其它癌症类型包括来源于造血细胞的白血病和来源于神经组织的神经***细胞的癌症。对于非侵袭性肿瘤，腺瘤被认为是具有腺体结构的良性上皮肿瘤，而软骨瘤被认为是来源于软骨的良性肿瘤。在本发明中，可以用该化合物治疗的增殖性疾病包括癌、肉瘤、白血病、神经细胞肿瘤和非侵袭性肿瘤。

在一个具体的实施方式中，这些化合物用来治疗来源于多种组织类型的实体肿瘤，包括但不限于骨癌、乳腺癌、呼吸道癌症、脑癌、生殖器官癌症、消化道癌症、尿道癌、膀胱癌、眼癌、肝癌、皮肤癌、头部癌症、颈部癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾癌、胰腺癌、血癌、卵巢癌、结肠癌、男性生殖细胞/***癌、及其转移癌。

具体的增殖性疾病包括下列的疾病：a)乳腺增殖性疾病，包括但不限于，侵袭性导管癌、侵袭性小叶癌、导管癌、原位导管癌和转移性乳腺癌；b)皮肤增殖性疾病，包括但不限于基底细胞癌、鳞状细胞癌、恶性黑色素瘤和卡波西肉瘤(Karposi′s sarcoma)；c)呼吸道增殖性疾病，包括但不限于小细胞肺癌和非小细胞肺癌、支气管水肿、胸膜肺母细胞瘤、恶性间皮细胞瘤；d)脑增殖性疾病，包括但不限于下丘脑神经胶质瘤、小脑和脑星形细胞瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、少突角质细胞瘤、脑膜瘤、以及神经外胚层和松果体肿瘤；e)***官增殖性疾病，包括但不限于***癌、睾丸癌和***癌；f)女性生殖器官增殖性疾病，包括但不限于子宫癌(子宫内膜癌)、***、卵巢癌、***癌、外阴癌、子宫肉瘤、卵巢生殖细胞肿瘤；g)消化道增殖性疾病，包括但不限于***癌、结肠癌、结直肠癌、食管癌、胆囊癌、胃癌、胰腺癌、胰腺癌-胰岛细胞癌、直肠癌、小肠癌和唾液腺癌；h)肝脏增殖性疾病，包括但不限于肝细胞癌、胆管癌、混合性肝细胞胆管癌和原发性肝癌；i)眼部增殖性疾病，包括但不限于眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤和横纹肌肉瘤；j)头部增殖性疾病和癌症，包括但不限于喉癌、下咽癌、鼻咽癌、口咽癌、以及唇癌和口腔癌、颈部鳞癌、转移性鼻窦癌；k)淋巴瘤的增殖性疾病，包括但不限于各种T细胞和B细胞淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金氏病和中枢神经细胞的淋巴瘤；l)白血病，包括但不限于急性髓性白血病、急性淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓性白血病和毛细胞性白血病；m)甲状腺的增殖性疾病，包括甲状腺癌、胸腺瘤和恶性胸腺瘤；n)肉瘤，包括但不限于软组织肿瘤、骨肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、淋巴肉瘤和横纹肌肉瘤。

应当理解，增殖性疾病的描述不限于这里所述的各种情况，而且包括特征为不受控制的生长和恶性表现的其它疾病。还应当理解，增殖性疾病包括这里所述的肿瘤和癌症类型的各种转移形式。本发明的化合物可检测对这里所述的疾病的功效，并建立有效的治疗方案。如下面进一步所述，功效包括肿瘤的缩减或缓解、细胞增殖速度的下降，或对细胞生长的细胞生长抑制或细胞毒性作用。

联合治疗

这里所述的富含立体异构体的化合物可单独使用、与另一种化合物联合使用、或辅助其它抗增殖治疗或与其它抗增殖治疗联合使用。因此，这些化合物可以与传统的癌症治疗方法一起使用，例如γ-射线和x-射线形式的电离辐射、外部递送或通过植入放射活性化合物的内部递送、以及手术除去肿瘤后的继续治疗。

在另一个方面，这些化合物可以与可用于被治疗的疾病或病情的其它化疗药物一起使用。这些化合物可同时、依次通过相同的给药途径给药、或者通过不同的途径给药。

在一些实施方式中，本发明的化合物可以与其它抗癌药剂或细胞毒剂一起使用。各种类型的抗癌和抗瘤化合物包括但不限于烷化剂、抗代谢物、长春花属植物碱类(vinca alkyloids)、紫杉烷类、抗生素类、酶类、细胞因子类、铂配位络合物、取代脲类、酪氨酸激酶抑制剂、激素类和激素拮抗剂。示例性的烷化剂包括但不限于，二氯甲二乙胺(mechlorothamine)、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、乙撑亚胺、甲基三聚氰胺、烷基磺酸盐(例如，白消安)和卡莫司汀。示例性的抗代谢剂包括，例如但不限于，叶酸类似物甲氨喋呤；嘧啶类似物氟尿嘧啶、胞嘧啶***糖苷；嘌呤类似物巯基嘌呤、硫鸟嘌呤和硫唑嘌呤。示例性的长春花属植物碱包括，例如但不限于，长春碱、长春新碱、紫杉醇和秋水仙碱。示例性的抗生素包括，例如但不限于，放线菌素D、柔红霉素和博来霉素。有效作为抗瘤剂的示例性的酶包括L-天冬酰胺酶。示例性的配位化合物包括，例如但不限于，顺铂和卡铂。示例性的激素和激素相关化合物包括，例如但不限于，肾上腺皮质类固醇类强的松和***；芳香酶抑制剂氨基导眠能(amino glutethimide)、福美司坦(formestane)和阿那曲唑(anastrozole)；黄体激素化合物羟基孕酮己酸盐、甲羟孕酮；以及抗***化合物他莫昔芬。

这些和其它有用的抗癌化合物如Merck Index，第十三版(O’NeilMJ.等人主编)Merck Publishing Group(2001)和Goodman and Gilmans The Pharmacological Basis of Therapeutics，第十版，Hardman，J.G.和Limbird，L.E.主编，1381-1287页，McGraw Hill，(1996)所述，这两篇资料在此引入作为参考文献。

可以与这里所述的富含立体异构体的化合物联合使用的其它抗增殖化合物包括，例如但不限于针对生长因子受体的抗体(例如，抗-Her2)；活化T细胞的抗体(例如，抗-CTLA-4抗体)；以及细胞因子如干扰素-α和干扰素-γ、白介素-2和GM-CSF。

剂型和给药

当用于治疗或预防这些疾病时，活性化合物和前体药物可以单独给药、作为一种或多种活性化合物的混合物给药、或者作为与治疗这些疾病和/或与这些疾病相关的症状的其它药物的混合物或组合而联合给药。活性化合物和前体药物也可以与其它功能障碍或疾病的药物如类固醇、膜稳定剂的混合物或组合而联合给药。活性化合物或前体药物可以以其本身给药，或作为包括活性化合物或前体药物的药物组合物给药。

包括活性化合物(或其前体药物)的药物组合物可以通过常规的混合、溶解、制粒、制锭研磨、乳化、封装、包埋或冻干工艺制备。组合物可以常规的方式使用一种或多种生理学可接受的载体、稀释剂、赋形剂或促进活性化合物加工成为药学可使用的制剂的助剂配制(见Remington′s Pharmaceutical Sciences，第十五版，Hoover，J.E.主编，Mack Publishing Co.(2003))。

活性化合物或前体药物可以药物组合物本身，或如前所述以水合物、溶剂化物、N-氧化物或药学可接受的盐的形式进行配制。一般，这些盐在水溶液中的溶解性比相应的游离酸和碱高，但也可形成溶解性比相应的游离酸和碱低的盐。

药物组合物可以采取实际上适合任何给药方式的形式，给药方式包括，例如，经局部、眼、口、口腔、全身、鼻、注射、透皮、直肠、***等途径，或适合吸入或吹入给药的形式。

对于局部给药，(多种)活性化合物或(多种)前体药物可制成溶液、凝胶、油膏、乳膏、悬浮液等，这在本领域中是公知的。

全身制剂包括设计用于注射给药如皮下、静脉内、肌肉内、鞘内或腹膜内注射给药的制剂，以及设计用于透皮、透粘膜口腔或肺部给药的制剂。

有用的可注射制剂包括(多种)活性化合物在水性或油性载体中的无菌悬浮体、溶液或乳液。组合物也可含有配制剂，如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂。注射剂型可以以单位剂型存在，例如，在安瓿中或多次剂量容器中，并且可以含有添加的防腐剂。

或者，可注射剂型可以以粉末形式提供，其在使用前使用合适的载体重新配置，该载体包括但不限于无菌无热源水、缓冲液、葡萄糖溶液等。为此，(多种)活性化合物可以通过本领域任何公知技术如冻干进行干燥，并且在使用前重新配制。

对于透粘膜给药，在制剂中使用适合被透过的屏障的渗透剂。这些渗透剂在本领域中是公知的。

对于口服给药，药物组合物可以使用药学可接受的赋形剂通过常规方式制备成例如锭剂、片剂或胶囊的形式，该赋形剂如粘合剂(例如预胶化玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填料(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸氢钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，马铃薯淀粉或羟基乙酸淀粉钠)；或湿润剂(例如，月桂基硫酸钠、卵磷脂)。片剂可以通过本领域中公知的方法，使用例如糖、薄膜或肠溶包衣包覆。

用于口服给药的液体制剂可采取例如酏剂、溶液、糖浆剂或悬浮体的形式，或可以以在使用前使用水或其它合适的载体配制的干燥产品的形式存在。这种液体制剂可以通过常规方式使用药学可接受的添加剂制备，该添加剂例如悬浮剂(例如，山梨醇糖浆、纤维素衍生物或氢化食用脂)；乳化剂(例如，卵磷脂或***胶)；非水载体(例如，杏仁油、油性酯类、乙醇、cremophore^TM或分馏的植物油)；以及防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。该制剂还可以含有缓冲盐、防腐剂、调味剂、着色剂和适当的甜味剂。

口服给药制剂可以适当地配置为提供活性化合物的或其前体药物的可控释放，这在本领域中是公知的。

对于口腔含化给药，组合物可以此采取以常规方式配制的片剂或锭剂形式。

对于直肠和***给药途径，(多种)活性化合物可以被配制为溶液(用于保留灌肠)、或者含有常规栓剂基质如可可脂或其它甘油酯的栓剂或油膏。

对于鼻内给药或通过吸入或吹入给药，(多种)活性化合物或(多种)前体药物可以方便地以气溶胶喷雾的形式递送，该气溶胶喷雾来自使用合适的喷射剂的压缩包装或喷雾器，该喷射剂例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、碳氟化合物、二氧化碳或其它合适的气体。在压缩气溶胶的情况下，可以通过提供阀门来确定剂量单位以定量递送。用于吸入器或吹入器中的胶囊和药筒(例如由明胶组成的胶囊和药筒)可以配制成含有该化合物的粉末混合物和合适的粉末基质如乳糖或淀粉。

对于眼内给药，(多种)活性化合物或(多种)前体药物可制成为适合眼内给药的溶液、乳液、悬浮液等。适用于将化合物向眼给药的多种载体在本领域中是公知的。具体的非限制性离子如美国专利第6,261,547号；美国专利第6,197,934号；美国专利第6,056,950号；美国专利第5,800,807号；美国专利第5,776,445号；美国专利第5,698,219号；美国专利第5,521,222号；美国专利第5,403,841号；美国专利第5,077,033号；美国专利第4,882,150号；以及美国专利第4,738,851号中所述。

对于长期药物递送，(多种)活性化合物或(多种)前体药物可制成缓释(depot)制剂以便通过植入或肌肉内注射给药。活性成分可以使用合适的聚合物或疏水材料(例如，在可接受的油中的乳液)或离子交换树脂配制，或者配制成微溶的衍生物如微溶的盐。或者，可以使用制成为粘着盘或贴片的透皮递送***，可缓慢地释放(多种)活性药物经皮吸收。为此，可以使用渗透促进剂来促进(多种)活性化合物的经皮渗透。合适的透皮贴片描述如，例如，美国专利第5,407,713号；美国专利第5,352,456号；美国专利第5,332,213号；美国专利第5,336,168号；美国专利第5,290,561号；美国专利第5,254,346号；美国专利第5,164,189号；美国专利第5,163,899号；美国专利第5,088,977号；美国专利第5,087,240号；美国专利第5,008,110号；以及美国专利第4,921,475号中所述。

或者，可以采用其它药物递送***。脂质体和乳液是公知的可用来递送(多种)活性化合物或(多种)前体药物的递送载体的离子。也可采用某些有机溶剂如二甲亚砜(DMSO)，尽管通常代价是毒性较高。

如果需要，药物组合物可以以包含一个或多个含(多种)活性化合物的单位剂型的包装或分配装置而存在。该包装，例如，可以包括金属箔或塑料薄膜，如薄膜包装。包装或分配装置可以伴有给药说明书。

有效剂量

(多种)活性化合物或(多种)前体药物、或其组合物通常以有效达到所需结果的量使用，例如有效治疗或预防被治疗的特定疾病的量。(多种)化合物可以治疗性地给药以达到治疗益处。治疗益处指的是消除或改善被治疗的潜在疾病和/或消除或改善与潜在疾病相关的一种或多种症状，使得患者在感觉或病情上报告有所改善，尽管患者可能仍然受累于潜在疾病。治疗益处也包括停止或延缓疾病的进展，不管是否实现改善。

给药的化合物用量将取决于多种因素，包括，例如被治疗的特殊适应征、给药方式、被治疗的适应征的严重性和患者的年龄和体重、特殊活性化合物的生物利用度等。有效剂量的测定包括在本领域技术人员的能力范围内。

最初，可以从活体外试验中估算有效剂量。例如，用于动物的初始剂量可以配置为达到活体外试验所测定的特殊化合物的IC₅₀或之上的活性化合物循环血液或血清浓度，该活体外试验如实施例部分所述。对达到这种循环血液或血清浓度的剂量的计算要考虑特殊化合物的生物利用度，这包括在专业技术人员的能力之内。为了进行指导，读者可参考Fingl & Woodbury，＂General Principles，＂In：Goodman andGilman′s The Pharmaceutical Basis of Therapeutics，第一章，1-46页，最新版，Pergamon Press，及其所引用的参考文献。

初始剂量也可以从活体内数据如动物模型来估算。用于检测化合物治疗或预防上述各种疾病的功效的动物模型是本领域中公知的。用药剂量一般在大约0.0001或0.001或0.01毫克/千克/天至大约100毫克/千克/天的范围内，但可以更高或更低，该剂量取决于其它因素中的化合物活性、其生物利用度、给药方式和上述各种因素。用药剂量和间隔可以个别调整以提供足以保持治疗或预防效果的(多种)化合物的血浆水平。例如，这些化合物可每周给药一次、每周数次(例如，每隔一天)、每天一次或每天数次，其取决于其它因素中的给药方式、被治疗的特定适应征和主治医生的判断。在局部给药和选择性摄取的情况下，如局限性局部给药，(多种)化合物的有效局部浓度与血浆浓度不相关。专业技术人员将不需进一步试验就能优化有效的局部用药量。

优选，(多种)化合物将提供治疗或预防性有益效果，而基本上不会引起毒性。可以采用标准药学方法来确定(多种)化合物的毒性。毒性与治疗(或预防)效应之间的量比LD₅₀/ED₅₀是治疗指数(LD₅₀是半数致死量，ED₅₀是半数治疗有效量)。优选表现高治疗指数的(多种)化合物(compound(s))。

试剂盒

这里所述的化合物和/或前体药物可以以试剂盒的形式装配。在一些实施方式中，试剂盒提供(多种)化合物和试剂以制备用于给药的组合物。该组合物可以是干燥或冻干的形式，或是在溶液中，尤其是无菌溶液中。当组合物是干燥形式时，试剂可以包括药学可接受的稀释剂以制备液体剂型。该试剂盒可以含有用于给药或分散组合物的装置，包括但不限于注射器、滴管、透皮贴片或吸入剂。

试剂盒可以包括与这里所述的化合物联合使用的其它治疗性化合物。在一些实施方式中，治疗药物是其它的抗癌和抗瘤化合物。这些化合物可以以单独的形式提供，或与本发明的化合物混合。

试剂盒将包括关于组合物制备和给药、组合物的副作用、以及其它相关的信息的适当说明书。这些说明书可以是任何合适的格式，包括但不限于印刷品、录像带、计算机可读磁盘或光盘。

实施例

参考下述实施例进一步说明本发明，这些实施例描述了这里所述的各种化合物的制备、测定其生物学活性的方法及其应用方法。在不背离本发明的范围的前提下，对原料和实施方法的许多修改对于专业技术人员来说是显而易见的。

制备4-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-甲基硝基苯

反应：

步骤：4-氟-3-甲基硝基苯1(20g，129mmol)和N-甲基哌嗪3(25.82g，258mmol)在N-甲基吡咯烷酮(NMP)(10mL)中的均质混合物在N₂下回流(120℃)24小时。反应混合物冷却至室温，倾入饱和Nacl溶液(100mL)中。得到的固体用声波处理大约30秒，过滤，用冰冷的水(2×10mL)洗涤，并且在高真空中干燥，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-甲基硝基苯5(28g，92％)。¹H NMR(CD₃OD)：δ8.02(m，2H)，7.13(d，1H，J＝9.3Hz)，3.08(m，4H)，2.66(m，4H)，2.38(s，6H)；LCMS：纯度：99％，MS(m/e)：236(MH⁺)。

制备4-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-甲基苯胺

反应：

步骤：4-(4-甲基哌嗪)-3-甲基硝基苯5(20g，85mmol)、10％Pd/C(1.3g)在甲醇(1.2升)中的非均质混合物在40PSI氢化[H₂]3小时。钯催化剂通过硅藻土(celite)垫过滤，用甲醇(3×50mL)洗涤，并且将合并的滤液浓缩，得到4-(4-甲基哌嗪-1-基)-3-甲基苯胺7(15g，86％)。¹HNMR(CD₃OD)：δ6.83(d，1H，J＝8.7Hz)，6.59(d，1H， J＝2.7Hz)，6.54(dd，1H，J＝8.4和2.7Hz)，2.84(t，4H，J＝4.8Hz)，2.60(bm，4H)，2.34(s，3H)，2.20(s，3H)；LCMS：纯度：99.9％，MS(m/e)：206(MH⁺)。

制备3-氮杂-4-氧代-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯

反应：

外消旋，2-外-3-外

步骤：第一部分：2，5-降冰片二烯47(25.0mL，0.246mol)在CH₂Cl₂(110mL，干净瓶)中的溶液在冰/NaCl浴(-10℃)中冷却。以将温度保持在低于5℃的速率向其中滴入CSI(21.4mL，0.246mole)/CH₂Cl₂(45mL，干净瓶)溶液(加入过程大约为1.25小时)。在加入完成后，反应混合物在0-5℃搅拌1小时，然后从冷却浴中取出，使其回暖至20℃。反应混合物用水(60mL)冷却，并剧烈搅拌几分钟。分离有机层，用盐水洗涤，用Na₂SO₄干燥。浓缩得到浅褐色油。

第二部分：Na₂SO₃(24.5g)、水(70mL)和CH₂Cl₂(30mL)的混合物在冰/NaCl浴中冷却。将来自第一部分的油用CH₂Cl₂稀释至100mL，并以将温度保持在低于15℃的速率逐滴加入至上述混合物中(加入过程大约为1.75小时)。反应混合物的pH用pH计监测，根据需要用10％NaOH(w/v)调整保持碱性(pH7-10)。在加入完成后，反应混合物在0-5℃搅拌1小时(最终pH为8.5)。将反应混合物倒入分液漏斗中，分离CH₂Cl₂层。该有机相为浓稠的胶状固体悬浮体。其用水(大约400mL)稀释，以制备流动性更好的溶液。水层进一步用CH₂Cl₂(4(×100mL)萃取。(或者，可以通过离心将固体从CH₂Cl₂中分离出来。然后，可以用水稀释该固体(直至几乎完全溶解)，并用CH₂Cl₂萃取)。水层进一步用CH₂Cl₂萃取(10×100mL)。用TLC监测CH₂Cl₂萃取物中产物的存在。合并的有机萃取物用盐水洗涤，用MgSO₄干燥，并且通过硅藻土过滤。除去溶剂得到所需产物，白色固体的外消旋-2-外-3-内的3-氮杂-4-氧代-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯14r1 (20.5g，62％)。¹HNMR(DMSO-d₆)：δ8.01(bs，1H)，6.22(dd，J＝3.3和5.4Hz，1H)，6.12(dd，J＝3.3和5.4Hz，1H)，2.88(dd，J＝1.5和3.3，IH)，2.79(bs，1H)，2.74(bs，1H)，1.58(d，J＝9.3Hz，1H)，和1.47(d，J＝9.3Hz，1H)。

制备4-氧代-3-叔丁氧基羰基氮杂-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯

反应：

(外消旋，2-外-3-外) (外消旋，2-外-3-外)

步骤：3-氮杂-4-氧代-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯(14r1；外消旋-2-外-3-外；10.0g，74mmol)、(BOC)₂O(16.1g，74mmol)和DMAP(1.1g)在CH₂Cl₂中的均质混合物在N₂和室温中搅拌24小时。向此反应混合物中加入EtOAc(100mL)，然后加入H₂O(100mL)，继续搅拌1小时。分离有机层，并且用H₂O(2×100mL)洗涤。有机层用无水Na₂SO₄干燥，并且减压除去溶剂，得到4-氧代-3-叔丁氧基羰基氮杂-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯(16r1；外消旋-2-外-3-外)(16.5g，70％)； ¹H NMR(DMSO-d₆)：δ6.29(dd，J＝3.3和5.4Hz，1H)，6.19(dd，J＝3.3和5.4Hz，1H)，3.77(d，J＝4.5Hz，1H)，3.13(bs，1H)，3.08-3.04(m，1H)，2.93(bs，1H)，1.45(s，9H)。LCMS：95％。

从(±)外消旋(2-外-3-外)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺来制备和分离在立体异构方面是纯的非对映异构体

从2-氨基双环[2.2.1]庚-5-烯-3-羧酰胺的(2-外-3-外)外消旋体如下制备题述化合物的外消旋混合物。

反应：

(外消旋，2-外-3-外)(外消旋，2-外-3-外)

步骤：将外消旋的N-BOC-β-内酰胺16r1(2.0g)在正压氮气下投入至配有橡胶隔片和磁力搅拌棒的圆底烧瓶中。向其中加入乙酸乙酯(25mL)，然后加入30％氨/水(25mL)，并且在室温搅拌3小时。分离乙酸乙酯层，并且用5％NaHCO₃(20mL)水溶液洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，并且蒸发溶剂，得到1.10gm的外消旋N-BOC羧酰胺28r1。

反应：

步骤：将外消旋的N-BOC内酰胺28r1(2.00g，7.9mmol)投入进配有N₂入口和磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，然后用20％TFA/CH₂Cl₂在室温处理2小时。将得到的溶液减压浓缩。在高真空下几小时除去痕量的TFA，得到中间体TFA盐(30r1，外消旋)。将得到的外消旋TFA盐30r1用2，4-二氯-5-氟嘧啶10(1.58g，9.51mm)/MeOH:H₂O(20:10mL)在NaHCO₃(1.33g，15.84mmol)的存在下在室温处理48小时。反应混合物用H₂O(25mL)稀释，用NaCl饱和，并且用EtOAc(3×50mL)萃取。经过用无水Na₂SO₄干燥，蒸发溶剂，残渣用色谱(硅胶，CH₂Cl₂，然后是2-4％2N NH₃/MeOH/CH₂Cl₂)处理，得到1.3g的外消旋单-SNAr产物36r1。

反应：

Figure DEST_PATH_G05837119520080114D000021

步骤：装有外消旋单-SNAr产物36r1(1.1g，8mmol)、苯胺7(0.90g，4.4mmol)、TFA(0.6mL)和甲醇(9mL)的密封管在100℃搅拌24小时。将得到的粘稠均质溶液浓缩，残渣用色谱(硅胶，CH₂Cl₂，然后是2-5％2N NH₃/MeOH/CH₂Cl₂)处理，得到所需的2-外-3-外的外消旋2，4-嘧啶二胺衍生物60r1(1.12g；纯度：95％)：

分离对映异构体：通过手性制备性HPLC色谱Phenomenex Chirex3020(250×10mm柱)从外消旋体60r1分解和分离非对映异构体，用己烷∶二氯甲烷∶甲醇的35∶63∶2(体积∶体积∶体积)的混合物以6mL/min的流速洗脱。在9.44分钟时流出的对映异构体被称为E1对映异构体，在12.74分钟流出的对映异构体被称为E2对映异构体。

使用Chirazyme，酶促制备纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-l-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

制备纯立体异构体的N-Boc-β-内酰胺

反应：

Figure DEST_PATH_G05837119520080114D000022

步骤：装有4-氧代-3-叔丁氧基羰基氮杂-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯(16r1；外消旋-2-外-3-外)(4.0g，17.02mmol)、结合树脂/固定化chirazyme L-2，B型，c.f.(8.0g，得自BioCatalytics Inc.，Pasadena，CA)和二异丙醚(80mL)的干燥密封管在孵育器中在60℃轻轻地振荡60 小时。(酶促解离外消旋N-BOCβ-内酰胺16r1后进行质子NMR。可以看出，纯对映异构体的N-BOC内酰胺16a的叔丁基和N-BOC羧酸26b以1:1的比例结合)。将得到的反应混合物过滤，并且用二异丙醚(2×40mL)洗涤固体树脂。浓缩滤液，得到纯对映异构体的N-BOC-β-内酰胺16a和N-BOC羧酸26b的混合物(总质量：4.0gm)。

反应：

步骤：将纯对映异构体的N-BOC-内酰胺16a和N-BOC羧酸26b的混合物(4.0g)在正压氮气下投入配有橡胶隔片和磁力搅拌棒的圆底烧瓶中。向其中加入乙酸乙酯(50mL)，然后加入25％氢氧化铵水溶液(50mL)，并且在室温下搅拌3小时。用TLC监测反应进程。分离乙酸乙酯层，用5％NaHCO₃水溶液(40mL)洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，蒸发溶剂，得到2.00gm(7.93mmol，偏离理论值8.51mmol；93％产率)的所需纯对映异构体的N-BOC羧酰胺28a，通过手性HPLC测定的对映异构体过量超过99％。含有N-BOC氢氧化铵的水溶液用冷的1N HCl酸化，然后用CH₂Cl₂萃取再生的N-BOC羧酸26b(1.8g，7.11mmol，偏离理论值8.51mmol，84％产率)。¹H NMR(DMSO-d₆)：7.26(bs，1H)，6.66(bs，1H)，6.13(m，2H)，3.59(t，1H，J＝6.9Hz)，2.80(s，1H)，2.54(s，1H)，2.31(d，1H，J＝8.1Hz)，2.00(d，1H，J＝8.7Hz)，1.36(s，9H)，1.30(d，1H，J＝8.1Hz)；LCMS：MS(m/z)：254(MH⁺)；[α]D-76.78°(c1.0，MeOH)。

制备纯立体异构体的单SNAr产物

反应：

步骤：将纯对映异构体的N-BOC羧酰胺28a(2.00g，7.93mmol)投入至配有N₂入口和磁力搅拌棒的圆底烧瓶中，然后用20％TFA/CH₂Cl₂在室温处理2小时。用TLC监测反应进程。将得到的溶液减压浓缩。在高真空下几小时除去痕量的TFA，得到定量产率的纯对映异构体的中间体TFA盐30a。¹H NMR(DMSO-d₆)：8.10(bs，2H)，7.92(s，1H)，7.25(s，1H)，6.29(m，1H)，6.18(m，1H)，4.38(bs，1H)，3.06(d，1H，J＝7.2Hz)，2.97(s，1H)，2.87(s，1H)，2.43(d，1H，J＝7.5Hz)，2.10(d，1H，J＝6Hz)，1.36(d，1H，J＝8.7Hz)；LCMS：MS(m/z)：152(MH⁺)。

将得到的TFA盐30a用2，4-二氯-5-氟嘧啶34(1.58g，9.51mmol)/MeOH:H₂O(20:10mL)在NaHCO₃(1.33g，15.84mmol)的存在下在室温处理48小时。反应混合物用H₂O(25mL)稀释，用NaCl饱和，并且用EtOAc(3×50mL)萃取。用无水Na₂SO₄干燥，蒸发溶剂，残渣用色谱(硅胶，CH₂Cl₂，然后是2-4％2N NH₃/MeOH/CH₂Cl₂)处理，得到2.02g(91％)所需的单-SNAr产物36a。¹H NMR(DMSO-d₆)：8.25(d，1H，J＝7.2Hz)，8.07(d，1H，J＝3.3Hz)，7.71(s，1H)，7.19(s，1H)，6.29(m，2H)，3.99(t，1H，J＝7.8Hz)，2.85(s，1H)，2.75(s，1H)，2.49(d，1H，J＝0.9Hz)，2.11(d，1H，J＝8.7Hz)，1.39(d，1H，J＝8.7Hz)；LCMS：纯度：95％，MS(m/z)：283(MH⁺)。用手性HPLC测定的对映异构体纯度超过99％；[α]D+61.10°(c1.0，MeOH)。

制备纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

反应：

步骤：将纯对映异构体的单-SNAr产物36a(2.25g，8mmol)、苯胺7(1.80g，8.8mmol)、TFA(1.12mL)和异丙醇(18mL)投入至配有搅拌棒、回流冷凝器和N₂入口的干燥反应烧瓶中，将得到的反应混合物在回流温度搅拌8-10小时。反应混合物冷却至室温后，加入乙酸乙酯(20mL)。过滤得到的固体，用乙酸乙酯(2×5mL)洗涤，得到酸盐形式的化合物60a。然后，将得到的固体投入水中，用NaHCO₃水溶液将含水混合物调节至pH9，这使得固体沉淀。从混合物中过滤固体，用水洗涤并干燥，得到3.3g(93％)的2，4-嘧啶二胺衍生物60a。 ¹H NMR(DMSO-d₆)：8.85(s，1H)，7.83(d，1H，J＝2.7Hz)，7.68(s，1H)，7.47(s，2H)，7.36(d，1H，J＝7.8Hz)，7.18(s，1H)，6.89(d，1H，J＝8.7Hz)，6.32(m，1H)，6.25(m，1H)，4.11(t，1H，J＝7.8Hz)，3.32(s，3H)，2.86(s，1H)，2.76(m，4H)，2.49(m，4H)，2.46(m，2H)，2.21(s，3H)，2.11(d，1H，J＝8.4Hz)，1.39(d，1H，J＝9Hz)；LCMS：纯度：100％，MS(m/z)：452(M⁺)；通过手性HPLC测定>99％ee；[α]_D ^RT+101.2°(c1.0，MeOH)。手性分析数据、¹H NMR和LCMS发现与被称为E1的对映异构体相同。

使用Novazyme435酶，酶促制备纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

制备纯立体异构体的β-内酰胺

反应：

步骤：向装有250ml二异丙醚的耐压烧瓶中加入固定化Lipolase(8.0g，购自Sigma公司，订单号L4777)、β-内酰胺14r1(外消旋：2-外-3-外)(4.0g，7.4mmol)和水(0.13ml，7.4mmol)。将混合物用氮气脱气20分钟，密封烧瓶，在70℃孵育14天。将混合物冷却至室温，用硅藻土过滤，用300ml二异丙醚洗涤。合并的滤液浓缩至干，残渣从二异丙醚中结晶，得到无色针状的纯对映异构体的β-内酰胺14a(1.22g，61％)。通过手性HPLC测定对映异构体纯度超过99％。

制备纯立体异构体的2-N-Boc-氨基-3-氨基羰基-双环[2.2.1]庚-5-烯

反应：

步骤：将纯对映异构体的3-氮杂-4-氧代-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯14a(1.1g，8.2mmol)、(BOC)₂O(2.76g，12.3mmol)和DMAP(100mg)/CH₂Cl₂在N₂和室温中搅拌3小时，得到纯对映异构体的N-BOC内酰胺16a，其不需分离就可进一步使用。向此反应混合物中加入20ml25％氢氧化铵水溶液，另外继续搅拌4小时。加入水，反应混合物用二氯甲烷(2×50ml)萃取。合并的有机相用HCl(5％)水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，减压浓缩至干，得到白色固体的纯对映异构体的N-BOC 羧酰胺28a(2.51g)，其不需进一步纯化就可用于下一步骤。

制备纯立体异构体的单SNAr产物(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-2-氯-5-氟-4-氨基吡啶

反应：

步骤：将纯对映异构体的N-BOC羧酰胺28a(2.51g)溶解在10ml二氯甲烷中，并且用10ml TFA处理。混合物在室温搅拌1小时，减压浓缩至干。残渣悬浮在甲苯中，再次浓缩至干。得到的固体溶解在甲醇:水(30ml:3ml)中，并且用1.5g碳酸氢钠处理。加入5-氟-2，4-二氯嘧啶34(3g，17.9mmol)，并且将混合物在室温搅拌2天。真空除去挥发物，并且将残渣悬浮在盐水中。过滤沉淀，干燥，用柱色谱(硅胶，二氯甲烷-甲醇，20:1)处理，得到所需的白色固体的纯对映异构体的单-SNAr产物36a(1.7g，74％)。

反应：

步骤：将密封管中的苯胺7(400mg，1.95mmol)、纯对映异构体的单-SNAr产物36a(400mg，1.41mmol)和TFA/异丙醇(0.2ml/4ml)的均质混合物在100℃搅拌20小时。混合物冷却至室温，用2ml二***稀释，得到的沉淀过滤，用二***洗涤。剩余的固体溶解在水中，用25％氢氧化铵水溶液处理。得到的沉淀过滤，用水洗涤，干燥，得到527mg(83％)的所需产物，灰白色固体的2，4-嘧啶二胺衍生物60a。通过LCMS测定纯度大于97％，通过手性HPLC测定对映异构体纯度大于99％。手性分析数据、¹H NMR和LCMS分析与被称为E1的对映异构体是相同的。

使用(R)-甲基-对甲氧基苄胺作为手性助剂，制备纯立体异构体的化合物

制备2-外-3-外的外消旋胺类

反应：

步骤：4-氧代-3-叔丁氧基羰基氮杂-三环[4.2.1.0(2，5)]壬-7-烯(16r1；外消旋-2-外-3-外)(9.2g，40mmol)和(R)-甲基-4-甲氧基苄胺13(18，24g，48mmol)/无水THF(75mL)的均质混合物在室温搅拌48小时。将反应混合物浓缩，悬浮在己烷(5mL)中，用声波处理，过滤分离固体，得到非对映异构体20a和20b的混合物(12mg)。或者，可以使用柱色谱(硅胶，己烷，然后是5％、10％、20％和50％EtOAc/己烷)进行纯化。

制备2-外-3-外的外消旋单SNAr产物，然后通过结晶分离纯异构体的化合物

反应：

步骤：非对映异构体20a和20b(6.0g，17mmol)、TFA(20mL)在CH₂Cl₂中的均质混合物在室温搅拌2小时。使用TLC监测反应进程。将得到的反应物浓缩至干，在高真空下干燥几小时，得到中间体22a和22b的非对映异构体混合物。然后，混合物与2，4-二氯-5-氟嘧啶34(3.4g，20mmol)在NaHCO₃(5.7g，68mmol)/MeOH:H₂O(各50mL)的存在下在室温反应24小时。然后，反应混合物用被NaCl饱和的水(50mL)稀释，并且用CH₂Cl₂萃取。萃取物用无水Na₂SO₄干燥，然后减压除去溶剂，得到残渣，该残渣用色谱(硅胶，CH₂Cl₂，然后是2％2N NH₃/MeOH/CH₂Cl₂)。色谱纯化，得到非对映异构体38a和38b的混合物(4.0g)(在反相LCMS上可以看到1:1比例的清晰分离)。得到的4.0克化合物使用EtOAc:己烷(30:150mL；v/v)结晶，得到中间体38a的结晶物质，其通过X-线晶体结构确认；化学纯度：96％和％de：96％。[α]D-36.7°(c，0.18MeOH)。含有其它异构体的母液具有很差的％de(70-80％)，其假定为非对映异构体38b。

制备包括手性助剂的纯立体异构体的产物

反应：

步骤：将非对映异构体38a(1.42g，3.4mmol)、苯胺7(0.834g，4.0mmol)和TFA(700mg)在MeOH(10mL)中的混合物在密封管中在100℃加热24小时。得到的残渣用色谱(硅胶，CH₂Cl₂，然后是2％2N NH₃/MeOH/CH₂Cl₂)处理，得到无色固体的的产物40a，化学纯度：96％。

手性助剂的裂解

已经发现从40a中裂解手性助剂是很困难的，因此如下从中间体化合物38a和38b中裂解手性助剂，然后与苯胺7进行第二次SNAr反应。

从纯立体异构体的中间体38a裂解手性助剂，并且制备纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

反应：

步骤：是带有手性助剂38a的单-SNAr产物与DDQ(3当量)/CH₂Cl₂:H₂O在室温反应，获得所需的单-SNAr产物36a。用柱色谱纯化单-SNAr产物，发现与经酶途径获得的化合物36a是相同的，其通过手性分析性HPLC、LCMS和¹H NMR确认。进一步，单-SNAr产物36a与苯胺7在密封管中在MeOH:TFA中在100℃反应24小时，得到所需的产物60a。用柱色谱纯化，并且用¹HNMR、LCMS和手性分析性HPLC分析。手性分析性HPLC、LCMS和¹H NMR分析表明，产物60a的数据与被称为E1的对映异构体相匹配。

从中间体38b中裂解手性助剂，并且制备纯立体异构体的(1S，2S，3R，4R)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

反应：

步骤：使单-SNAr产物38b与DDQ(3当量)/CH₂Cl₂:H₂O在室温反应，得到所需的单-SNAr产物36b(手性助剂裂解后)。用柱色谱纯化单-SNAr产物，发现与经酶途径获得的化合物相比是不同的非对映异构体，这可以通过手性分析性HPLC确认。进一步，单-SNAr产物36b与苯胺7在密封管中在MeOH:TFA中在100℃反应24小时，得到所需的产物60b。用柱色谱纯化，并且用¹HNMR、LCMS和手性分析性HPLC分析。手性分析性HPLC、LCMS和¹H NMR分析表明，产物60b的数据与被称为E2的对映异构体相同。[α]_D ^RT-102.00°(c，1.0MeOH)。

制备HCl盐

外消旋60r1的HCl盐和纯立体异构体的60a如下所述进行制备。

制备外消旋的N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺盐酸盐

在0℃，向2-外-3-外的外消旋N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺(60r1)(0.140g，0.3mmol)在MeOH(3mL)中的溶液中逐滴加入HCl(4M，二噁烷，0.170mL，0.681mmol)，然后在0℃搅拌1小时，在室温反应15分钟。过滤清亮的均质溶液，浓缩并在EtOH中重新溶解。向乙醇溶液中加入乙酸乙酯沉淀所需的产物，分离得到2-外-3-外的外消旋N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺二盐酸盐(化合物60r1-2HCl)。LCMS：纯度：98％；MS(m/e)：453(MH⁺)。

制备纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺盐酸盐

以与前述相似的方式，2当量的HCl(4M，二噁烷)与纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺(60a)之间相互作用得到纯立体异构体的(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺二盐酸盐(化合物60a·2HCl)。LCMS：纯度：97％；MS(m/e)：453(MH⁺)；[α]_D+46.3°(c，0.04MeOH)。

制备(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-(1，3-噁唑-2-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺

如上所述制备(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-(1，3-噁唑-2-基)苯基]-2，4-嘧啶二胺(化合物90a)。 ¹HNMR(DMSO-d₆)：9.36(s，1H)，8.48(s，1H)，8.14(s，1H)，9.92(d，1H，J＝3Hz)，7.79(d，1H，J＝7.8Hz)，7.68(s，1H)，7.42(m，4H)，7.18(s，1H)，6.29(m，1H)，6.13(m，1H)，4.21(t，1H，J＝4.8Hz)，2.86(s，1H)，2.77(s，1H)，2.55(d，1H，J＝8.1Hz)，2.14(d，1H，J＝8.4Hz)，1.39(d，1H，J＝8.7Hz)；LCMS：纯度：98％，MS(m/e)：407(MH⁺)。

在活体外对细胞增殖的抑制

使用标准活体外抗增殖试验方法，检测化合物60r1、60r2、60r1·2HCl、60a、60b和60a·HCl对多种不同类型肿瘤细胞的增殖抑制能力。所检测的各种细胞系包括：A549(肺癌)；ASPC-1(胰腺癌)；BXPC-3(胰腺癌)；CaOV-3(卵巢腺癌)；COLO205(结直肠腺癌)；DU145(***癌)；ES-2(卵巢透明细胞癌)；H1299(非小细胞肺癌)；H1155(非小细胞肺癌)；H460(大细胞肺癌)；HELA(***)；HL160(早幼粒细胞前髓细胞性白血病)；K562(骨髓慢性髓性白血病)；L1210(小鼠淋巴细胞性白血病)；MiaPaCa-2(胰腺癌)；MOLT4(T淋巴细胞急性淋巴细胞白血病)；OVCAR-3(卵巢腺癌)；MOLT3(T淋巴细胞急性淋巴细胞白血病)；OVCAR-8(卵巢癌)；PC3(***腺癌)；SK-OV-3(卵巢腺癌)；SU86.86(胰腺癌)；SW620(结直肠腺癌)；THP-1(单核细胞急性单核细胞白血病)；TOV-21G(卵巢透明细胞癌)；U2OS(骨肉瘤)；以及U937(组织细胞性淋巴瘤)。

下表2中提供了用这些化合物所获得的IC₅₀值。在表2中，“+”表示IC₅₀值≤1μM，“++”表示IC₅₀值≤20nM，“+++”表示IC₅₀值≤10nM，且“—”表示IC₅₀值>1μM。空白表示化合物没有对指定的细胞系进行检测。

Figure DEST_PATH_G05837119520080114D000041

在功能性细胞试验中抑制Aurora激酶

在涉及其底物组蛋白H3的磷酸化的功能性细胞试验中，检测化合物60a和60b抑制Aurora激酶-B的能力。对于测定而言，在第一天的下午较晚时，将A549细胞接种在微量滴定板的孔中(5000个细胞/孔，在100μl F12K培养基中)。细胞生长过夜(37℃，5％CO₂)。第二天，向每个孔中加入50μl诺考达唑(nocodazole)(在培养基中1μM)，得到的终浓度为333nM。在相同条件下，细胞另外生长18小时。

第三天，将50μl等份不同浓度的检测化合物加入孔中。检测化合物通过用2mM母液(在DMSO中)连续稀释2倍而制备。然后，在DMSO中的稀释化合物进一步用培养基稀释1:50，得到含有4×检测化合物、98％培养基、2％DMSO的最终溶液。孵育后，洗涤培养基/检测化合物，并且用2％对-甲醛固定细胞(在Dulbecco’s磷酸缓冲盐水“DPBS”中；每孔25μl；孵育>20mm)。固定的细胞用DPBS(200μl/孔)洗涤一次，用磷酸-组蛋白H3染色(Cell Signaling Technology；在DPBS中1:500，10％正常羊血清“NGS”，0.05％Triton X-100；室温1-2小时)，并且用DPBS洗涤两次(200μl/孔)。然后，细胞用以荧光染料标记的二抗(二抗驴抗-鼠AlexFluor488(Invitrogen MolecularProbes；1:2000)和DAPI(1:15,0001mg/ml母液)在室温染色1小时，用DPBS(200μl/孔)洗涤三次，并且在DPBS(100μl/孔)中在4℃保存以备分析使用。

具有Plan-NEOFLUAR10×物镜、Hamamatsu Lightningcure200汞-氙光源和Omega Optical XF57四滤镜(quad filter)的Zeiss AxiovertS100倒置荧光显微镜用于所有数据的收集。该***配有带有X/Y/Z控制、Ludl滤光轮、Zymark Twister机械手和来自Roper Scientific公司的Quantix数码相机的Ludl Mac2000机动镜台。所有硬件在运行Win2000的PC上用带有ScopePro/StagePro4.1模块(Media Cybernetics)的ImagePro4.5控制。为ImagePro编写可视化Basic脚本(Visual BasicScript)进行自动化硬件控制和图像采集。使用包含StagePro的自动对焦软件进行聚焦，该软件使用最大局部对比从每孔中一次捕捉的Z系列中确定聚焦的最大平面。一旦完成正确的聚焦，在下一个邻接图像的3×3网格线内捕捉图像，但不包括聚焦的位置。捕捉图像并使用包含在Image Pro软件包中的分割和形态学程序以12-位格式进行分析。对已鉴别的核进行计数，使用MySQL4.0.14将每个细胞的像素数据以及试验条件储存在数据库中。随后使用Matlab6.5完成对试验结果的分析和图表的描记。

对于磷酸-组蛋白H3的分析，数据转换为Facs文件，使用FlowJo进行分析。在每一个化合物浓度对磷酸-H3细胞的百分比作图，以确定Aurora B抑制的EC50。

结果，在此试验中，化合物60a抑制Aurora激酶-B的IC₅₀为大约7nM。相反，其对映异构体化合物60b的IC₅₀为2.49μM，高了接近350倍。

化合物E1在猴中的药代动力学

化合物60a经静脉内(在盐水中1mg/kg)和口服(在盐水中5mg/kg)对猴给药，监测血浆浓度随时间的变化。当通过静脉内给药时，化合物的血浆浓度在给药后11小时仍然高于7nM的IC₅₀；当口服给药时，化合物的血浆浓度经20小时仍然高于IC₅₀。

化合物60a在活体内缩减肿瘤

对化合物60a·2HCl进行检测，以检测其在SCID小鼠的标准异种移植治疗模型中缩减A549和Colo205肿瘤、和在SCID小鼠的标准异种移植消退模型中缩减Colo205和MiaPaCa肿瘤的能力。当出现可触及并具有预选体积(治疗模型为大约100mm³；消退模型>300mm³)的肿瘤时，给予小鼠一定量的检测化合物，并且根据下表3(治疗方案)和表4(消退方案)中指定的用药方案。

结果：在治疗模型中，化合物60a·2HCl对Colo205肿瘤生长的抑制作用如图1和图2所示。每天用药方案的结果如图1所示；脉冲式用药方案的结果见图2。对于所有测试的剂量水平来说，与载体对照组相比，两种用药方案均明显降低了肿瘤生长速率(p<0.050)。549肿瘤对治疗的响应差一些，在5天给药/2天停药的用药方案和一天四次10mg/kg的剂量水平下，平均肿瘤体积大约减小40％(p>0.05)。

在消退模型中，化合物60a·2HCl对Colo205肿瘤生长的抑制作用如图3所示。在消退模型中，60a·2HCl对MiaPaCa肿瘤的作用如图4所示。对于两种肿瘤系，都观察到肿瘤生长速率的显著降低。这些降低与给药方式无关。而且，在MiaPaCa肿瘤中观察到的降低类似于紫杉醇的观察结果(见图4)。

尽管在前面已经较详细地描述了本发明以促进理解，但显而易见的是在附加的权利要求范围内可进行某些改变和修改。因此，所述的实施方式要被认为是说明性的而非限制性的，本发明不受这里所述的内容限制，但在附加的权利要求的范围和等价的范围内是可以进行修改的。

在本申请中引用的所有文献和专利文献引入本申请中作为参考文献用于各种目的。

Claims

1.一种根据结构式(I)的化合物：

或者其盐，其富含结构式(Ia)的相应非对映异构体：

其中：

R¹选自氢、C1-C6烃基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-C(O)OR^a、卤素、-CF₃和-OCF₃；

每一个R²均独立地选自氢、C1-C6烃基、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、-NHC(O)R^a、卤素、-CF₃、-OCF₃、

每一个R³均独立地选自氢、C1-C6烃基、-(CH₂)_n-OH、-OR^a、-O(CH₂)_n-R^a、-O(CH₂)_n-R^b、卤素、-CF₃、-OCF₃、

每一个R⁴均独立地选自氢、C1-C6烃基、C5-C15芳基烃基、-OR^a、-NR^cR^c、-C(O)R^a、-C(O)OR^a和-C(O)NR^cR^c；

R⁵是氢、卤素、氟、-CN、-NO₂、CO₂R^a或-CF₃；

每一个n均独立地为1至3的整数；

每一个R^a均独立地选自氢、C1-C6烃基；

每一个R^c均独立地选自氢和C1-C6烃基，或者两个R^c取代基可以与其所连接的氮原子一起形成5-7元饱和环，该环任选地包括1-2个另外选自O、NR^a、NR^a-C(O)R^a、NR^a-C(O)OR^a和NR^a-C(O)NR^a的杂原子基团；并且

每一个R^d均独立地为C1-C6单羟基烃基或C1-C6二羟基烃基。

2.根据权利要求1所述的化合物，其仅包括(2-外-3-外)立体异构体。

3.根据权利要求1所述的化合物，其含有60％或更多的结构式(Ia)的非对映异构体。

4.根据权利要求1所述的化合物，其含有90％或更多的结构式(Ia)的非对映异构体。

5.根据权利要求1所述的化合物，其含有99％或更多的结构式(Ia)的非对映异构体。

6.根据权利要求1所述的化合物，其中R⁵是氟。

7.根据权利要求6所述的化合物，其中R¹是氢；R²是

R³不是

8.根据权利要求7所述的化合物，其中R³是氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或氯。

9.根据权利要求7所述的化合物，其中R⁴是甲基、-C(O)CH₃、-C(O)OCH₃或-C(O)OCH₂CH₃。

10.根据权利要求6所述的化合物，其中R¹是氢；R²不是

R³是

11.根据权利要求10所述的化合物，其中R²是氢、甲基、甲氧基、三氟甲基或氯。

12.根据权利要求10所述的化合物，其中R⁴是甲基、-C(O)CH₃、-C(O)OCH₃或-C(O)CH₂CH₃。

13.根据权利要求6所述的化合物，其中R²不是

R³不是

14.根据权利要求13所述的化合物，其中R¹和R²每一个都是氢，R³是-OCH₂NHR^a。

15.根据权利要求13所述的化合物，其中R¹、R²和R³每一个均独立地选自氢、甲基、甲氧基、三氟甲基和氯，条件是R¹、R²和R³中的至少两个不是氢。

16.根据权利要求6所述的化合物，其中R¹是氢；R²选自氢、

R³选自氢、C1-C6烃基、卤素、-CF₃、

17.根据权利要求16所述的化合物，其中R³选自氢、甲基、氯、-CF₃、

R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R^a，其中R^a是甲基或乙基。

18.根据权利要求16所述的化合物，其中R²选自氢、

R³选自氢、C1-C6烃基、卤素、-CF₃、

19.根据权利要求18所述的化合物，其中R³选自氢、甲基、氯、-CF₃、R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R^a，其中R^a是甲基或乙基。

20.根据权利要求19所述的化合物，其中R²是

R⁴是-COR^a，其中R^a是甲基；R³是氢。

21.根据权利要求19所述的化合物，其中R²是

R⁴是-CO(O)R^a，其中R^a是乙基；R³是氢。

22.根据权利要求19所述的化合物，其中R²是

R³是氢。

23.根据权利要求19所述的化合物，其中R²是氢；R³是

或

R⁴是甲基、-COR^a或-CO(O)R^a，其中R^a是甲基或乙基。

24.根据权利要求19所述的化合物，其中R²是

R⁴是甲基；R³选自氢、甲基、氯和-CF₃。

25.一种化合物，其是N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基-2，4-嘧啶二胺，其中所述化合物富含(1R，2R，3S，4S)非对映异构体。

26.根据权利要求25所述的化合物，其含有95％或更多的(1R，2R，3S，4S)非对映异构体。

27.根据权利要求25或26所述的化合物，其是药学可接受的盐的形式。

28.根据权利要求27所述的化合物，其是选自下组的有机酸的盐：乙酸、三氟乙酸、丙酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、草酸、丙酮酸、乳酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、马来酸、延胡索酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、苯甲酸、3-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、1，2-乙烷-二磺酸、2-羟基乙磺酸、苯磺酸、4-氯苯磺酸、2-萘磺酸、4-甲苯磺酸、樟脑磺酸、4-甲基双环[2.2.2]-辛-2-烯-1-羧酸、葡庚糖酸、3-苯基丙酸、三甲基乙酸、叔丁基乙酸、月桂基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、羟基萘甲酸、水杨酸、硬脂酸和粘康酸。

29.根据权利要求28所述的化合物，其是苯甲酸盐。

30.一种药物组合物，其包括根据权利要求1、25、26、27、28或29中任何一项所述的化合物和载体和/或赋形剂。

31.根据权利要求30所述的药物组合物，其中所述的载体和/或赋形剂是药学可接受的。

32.一种用于抑制细胞增殖的组合物，其包括权利要求1-29中任何一项所述的化合物。

33.根据权利要求32所述的组合物，其中所述的细胞是肿瘤细胞。

34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述的肿瘤细胞是肺、结肠、乳腺、胃、卵巢、宫颈、黑色素瘤、肾、***、白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺、膀胱或肝肿瘤细胞。

35.一种在活体外抑制Aurora激酶活性的方法，其包括将Aurora激酶与一定量的根据权利要求1-29中任何一项所述的化合物相接触。

36.根据权利要求35所述的方法，其在活体外进行的，其中所述的Aurora激酶是分离或部分分离的。

37.根据权利要求35所述的方法，其使用表达Aurora激酶的细胞在活体外进行。

38.一种抑制Aurora激酶介导的过程的方法，其包括将表达Aurora激酶的细胞与有效抑制Aurora激酶介导的过程的量的根据权利要求1所述的化合物在活体外相接触。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述的被抑制的Aurora激酶介导的过程是有丝***。

40.根据权利要求38所述的方法，其中所述的细胞是肿瘤细胞。

41.根据权利要求38所述的方法，其中所述的细胞与一定浓度的化合物相接触，所述的浓度等于或大于其在活体外试验中测定的IC₅₀。

42.一种用于治疗Aurora激酶介导的疾病的组合物，其包括根据权利要求1-28中任何一项所述的化合物。

43.根据权利要求42所述的组合物，其中所述的Aurora激酶介导的疾病是增殖性疾病。

44.根据权利要求43所述的组合物，其中所述的增殖性疾病是癌症。

45.根据权利要求44所述的组合物，其中所述的癌症是转移性肿瘤。

46.根据权利要求42所述的组合物，其用于口服给药。

47.根据权利要求42所述的组合物，其用于经静脉内给药。

48.根据权利要求30-34和42-47中任何一项所述的组合物，其中所述的化合物是(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基-2，4-嘧啶二胺。

49.根据权利要求1-29中任何一项所述的化合物在制备用于抑制Aurora激酶介导的疾病的药物中的应用。

50.根据权利要求49所述的应用，其中所述的Aurora激酶介导的疾病是增殖性疾病。

51.根据权利要求50所述的应用，其中所述的增殖性疾病是癌症。

52.根据权利要求51所述的应用，其中所述的癌症是转移性肿瘤。

53.根据权利要求51所述的应用，其中所述的癌症选自肺癌、乳腺癌、胃癌、卵巢癌、***、黑色素瘤、肾癌、***癌、白血病、淋巴瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、膀胱癌和肝癌。

54.根据权利要求49-53中任何一项所述的应用，其中所述的化合物是(1R，2R，3S，4S)-N4-(3-氨基羰基双环[2.2.1]庚-5-烯-2-基)-5-氟-N2-[3-甲基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基-2，4-嘧啶二胺。