CN101070554A - 环介导逆转录等温扩增技术(rt－lamp)检测hcv和h5n1等rna病毒基因 - Google Patents

环介导逆转录等温扩增技术(rt－lamp)检测hcv和h5n1等rna病毒基因 Download PDF

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马学军
李启明
侯云德
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Abstract

本发明属于生物技术应用领域，涉及人类医学及兽医，包括RNA病毒在各种生物制品、献血员、病人血液标本等的监测。具体是应用环介导逆转录等温扩增技术(RT－LAMP)，通过计算机软件分析RNA病毒保守和病毒特异性基因序列，对每种病毒设计出六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配，省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成在等温环境中的循环置换扩增反应，最后用电泳或肉眼来检测结果，与传统的RT－PCR方法比较，它具有更安全、特异、灵敏、便捷的优势。

Description

环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)检测HCV和H5N1等RNA病毒基因
发明领域
本发明是环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)用于HCV和H5N1等RNA病毒检测。用于RNA病毒在各种生物制品、、献血者、病人血液标本等的监测。应用范围包括人用，兽用及其它生物防御用。
发明背景
RT-LAMP技术是在实验过程中使核酸链通过在等温环境中的循环置换扩增实现对靶序列的放大，而达到检测的目的。由于反应中使用了三对特异性引物，只有在三对引物均与特异的靶序列结合时扩增反应才能进行，因此这种检测方法的特异性很高。其中一对特殊的引物的5′端含有一端与下游扩增产物互补的序列，因此，这对引物的单链产物就可形成一个类似哑铃状回文结构，这种结构正好为下一步等温置换扩增反应提供了一个可被周而复始利用的模板，从而保证了扩增的持续进行，最终，扩增产物在核酸电泳胶上形成连续的梯状条带。
从RT-LAMP的原理和特点不难看出，该方法在RNA病毒的检测方面应该有着传统基因诊断方法无法比拟的优势，与一些常规的基因检测手段相比，该技术在可操作性和检测时间及设备要求方面具有更大的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，它的检测时间可以缩短到两小时以内，灵敏度可达到检测十个拷贝以上的病毒核酸分子。除了应用一些常用聚合酶外，对硬件设备基本无特殊要求，在普通的生物实验室就可完成这项检测工作。在试验实施中只需一步就可完成实验操作，减少了污染机会并方便了实验过程中的质控工作。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，加之扩增反应在65℃等温条件下进行，没有核酸的变复性过程，不但节省了大量的时间又减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会。第三，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第四，RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。
发明内容：
1.本发明是对目前对RNA病毒检测技术手段的改进和补充，它具有安全、特异、灵敏、便捷的优势。这主要体现在以下几个方面。首先，扩增反应只有在六条引物完全与识别的靶序列中八个结合区匹配的情况下才能顺利进行，所有这些特性都在很大程度上减少了扩增反应的背景，从而使检测特异性得到改善。第二，该技术省略了单独的逆转录和巢式PCR的二次扩增步骤，只需一步就可完成实验操作，没有核酸的变复性过程，减少了RNA酶和扩增核酸的污染机会，提高了检测的敏感性和安全性。第三，所有的扩增过程都可在65℃同温下完成，无需PCR仪，降低了对实验硬件的要求。第四，较RT-PCR缩短了检测所需的时间。
2.通过Blast、AlignX和Primer5.0程序、选择丙型肝炎病毒HCV的5′UTR区和禽流感病毒H5N1的HA和NA基因的相对保守区，对每个保守区分别设计了六条引物，其中包括两条外引物(F3、B3)和两条内引物(FIP、BIP)，两条环结合引物(Loop1、Loop2)。所有引物的具体序列见表1。
表1：LAMP检测HCV和H5N1(HA和NA)的引物序列
HCV-LAMP  Primer name   Sequence(5′-3′)
 F3B3cFIP(F2+Flc)BIP(B1+B2c)Loop-1Loop-2   ACCCAACACTACTCGGCTAGATCACTCCCCTGTGAGGAACAGAGCCATAGTGGTCTGCGGTGGATCCAAGAAAGGACCCGGTCTCCTGGAGGCTGCACGACACTTACTGTCTTCACGCAGAAAGCATACTAACGCCATGGCTAGGAGTACACCGGAATTGCCAG
HA-LAMP(H5N1) Primer name  Sequence(5′-3′)
 H-F3H-B3cH-FIP(F2+F1c)H-BIP(B1+B2c)H-Loop-1H-Loop-2  CCAATTTTACTCCACTTATTTCCCAAATGTCAAGAACCTTTACGAAAGTGTAAAAAACGGAACGTATGTGGTCTTGCTTCTTCTGAATACCATTTGTGATAGAACTCGAAACAGTGTACAGCTTAGGGATAATGCTAGTCGGACCTTGTCGTGACTAAACAGAGAGGA
NA-LAMP(H5N1)  Primer name  Sequence(5′-3′)
 N-F3N-B3cN-FIP(F2+F1c)N-BIP(B1+B2c)N-Loop-1N-Loop-2  CATTACAGTAAAGCAAGAGCCGAGTCTGTTGCTTGGTCGGCCAGACACTATCAAGAGTTGGAGGAACTTCACATTCAGACTCTTGAGTTCATACAGCCACAGCCCCATTGTCTGGTTGATGGCACCAGTTGGTTGAATCATGACAAGCACTTGCGTGCATGTGTAAATGGC
3.建立了如下的检测过程，详见如下：
(1)合成探针：使用大连宝生物生物技术公司合成仪合成。
(2)将待测标本按Qiagen公司的病毒RNA提取试剂盒步骤处理，获得样本的RNA。
(3)RT-LAMP反应。
(4)电泳检测。
(5)肉眼观察。
具体实施方式
实施方案1：丙型肝炎病毒基因的RT-LAMP检测
RT-LAMP反应体系如下：F3与B3c，5pmol；BIP与FIP，40pmol；Loop-1与Loop-2，20pmol；其它反应组分终浓度为1.0mM dNTP，1mM betaine，6mM MgSO4，2.5μl10×Bst-DNA Polymerase Buffer，8UBst-DNA polymerase，1U AMV反转录酶，5μl HCV RNA样品，补水至25μl，混匀，65℃，水浴1.5h。行1.5％琼脂糖凝胶电泳，观察结果。同时设立阴性对照，阴性对照组除用水替代RNA外其它反应组份及程序均相同。RT-LAMP扩增产物可进一步经酶切鉴定。RT-LAMP的扩增反应中可以形成可视的焦磷酸镁沉淀，因此肉眼也可观察到阳性反应管中的白色混浊物。
实施方案2：禽流感病毒H5N1的NA1基因区的RT-LAMP检测
方法与丙型肝炎病毒基因的RT-LAMP检测相同，使用引物改为：N-F3，N-B3c，N-BIP，N-FIP，N-Loop1和N-Loop2。
实施方案3：禽流感病毒H5N1的HA5基因区的RT-LAMP检测
方法与丙型肝炎病毒基因的RT-LAMP检测相同，使用引物改为：H-F3，H-B3c，H-BIP，H-FIP，H-Loop1和H-Loop2。
实施方案4：RT-LAMP检测H5N1病毒的特异性
方法与禽流感病毒H5N1的HA5基因区的RT-LAMP检测相同，使用的RNA样品改为H1，H3和B型人流感病毒。
实施方案5：丙型肝炎病人的血清标本的检测结果
对收集于甘肃省临床检验中心和湖北省干细胞研究中心的60份丙型肝炎病人的血清进行检测，RT-LAMP检测HCV病毒的阳性检测结果与常规RT-PCR方法或Real time-PCR方法完全一致，说明检测的特异性和灵敏度是满意的。

Claims (6)

1、一种用于RNA病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)，其中包括：用于H5N1和HCV病毒检测的寡核苷酸引物。
2、权力要求1所述的RNA病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的引物包括表1所列的基因序列及其每种序列的互补序列或变体。
3、权力要求1所述的RNA病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)包括如下病毒及其变异株：丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus，HCV)和禽流感病毒H5N1及其它的流感病毒亚型等。
4、权力要求1所述的RNA病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)应用范围包括：H5N1、HCV和其它RNA病毒。
5、权力要求4所述的本发明的应用范围包括人用，兽用及其它生物防御用。
6、权力要求1所述的RNA病毒检测的环介导逆转录等温扩增技术(RT-LAMP)的反应程序和检测程序。
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