CN101358246B

CN101358246B - 用于检测猪瘟病毒的lamp试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN101358246B
Application number: CN 200810042217
Authority: CN
Inventors: 李健; 熊炜; 王巧全; 胡永强; 邱璐; 刘俊平
Original assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Current assignee: Shanghai Entry Exit Inspection and Quarantine Bureau of PRC
Priority date: 2008-08-28
Filing date: 2008-08-28
Publication date: 2012-06-13
Anticipated expiration: 2028-08-28
Also published as: CN101358246A

Abstract

本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。该试剂盒包含由六条LAMP引物的LAMP反应液构成的检测体系。经检测验证，本发明试剂盒具有良好的特异性灵敏度，扩增快速、高效，且鉴定简便。本发明的检测体系在65℃等温条件下，能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到猪瘟病毒，不需要复杂仪器，能较好满足对猪瘟病毒的现场检测，为食品安全检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对***现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、食品***门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用。

Description

用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属卫生检验领域，涉及一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，特别涉及一种用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒及其建立方法和应用。

技术背景

猪瘟(Swine Fever，SF)，又称猪霍乱病毒，欧洲称为古典猪瘟。1833年首次在美国发现猪瘟，现已传播到世界的许多国家和地区。根据粮农组织—国际兽疫局—世界卫生组织(FAO-OIE-WHO)动物卫生年鉴(1992)公布的资料，现有44个国家和地区存在猪瘟。主要分布在南美、欧洲和亚洲的国家和地区。猪瘟造成的经济损失是巨大的。在荷兰，1983和1984度为了控制猪瘟，用于运输和消毁感染猪群、消毒房舍、赔偿农民损失、防疫猪的鉴定和注册等共花费1.27亿法朗。此外，如同感染猪场的生产损失、感染区域停止生猪调运和限制出口等方面的间接损失则难于估计。在英国，1963年实行强制性屠宰政策后，于1966年消灭了猪瘟。为此，共耗资1200万英镑。此后，除1971年曾发生过3次小规模爆发外，直到1986年仍保持无猪瘟国家。但在1986年4月发生典型急性猪瘟，扑杀了26群共7781头生猪，仅此项的补偿损失就达45万多美元。

环介导的等温核酸扩增技术(LAMP)是由T.Notomi(2000)发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖4条特异设计的引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下可以高效、快速、高特异地扩增靶序列。近年来，国外已将该技术广泛应用于病原体检测。Masaki Imai等人(2007)利用LAMP建立了禽流感病毒的实验室确诊体系；Nobuyuki Hayashi等人(2007)针对四种香酒酵母的ITS序列设计了LAMP特异性引物，建立了高效的LAMP检测体系。LAMP还可以检测其他与人类相关的病毒，如病毒性出血性败血病(VHS)、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒(EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒(EBV)、虹彩病毒、人类疱疹病毒8型、造血组织坏死病毒(IHHNV)、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒等。目前国内外均未见有用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒及在猪瘟病毒检测中的应用。

发明内容

本发明目的在于提供一种用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒。

本发明的试剂盒包含如下组分：

(1)LAMP反应液：

每23μL LAMP反应液中含有：DEPC水1.9μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；25mMMgSO46μL；5M Betaine5μL；10mM dNTP3μL；50μM Primer F30.1μL；50μM PrimerB30.1μL；50μM Primer FIP0.8μL；50μM Primer BIP0.8μL；50μM Primer LF 0.4μL；50μM Primer LB0.4μL；8U/μL Bst酶1μL；5U/μLAMV逆转录酶1μL；

(2)六条LAMP引物(排序序列1-6)：

Forward Outer F3 AGCTCCCTGGGTGGTCTA

Reverse Outer B3 CCTAATAGTGGGCCTCTGCA

Forward Inner FIP GCCCTCGTCCACATAGCATCTCAGTACAGGACAGTCGTCAGT

Reverse Inner BIP GCCCAAGACACACCTTAACCCTTCAGGTCGTACTCCCATCAC

Forward Loop LF GGGCTTCTGCTCACGTCG

Reverse Loop LB GGTCGCTAGGGTGAAATC

本发明的另一目的在于提供上述LAMP试剂盒的建立方法。

所述的LAMP试剂盒通过下述方法和步骤制备：

1)从基因数据库检索获得所有猪瘟病毒基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得序列7的猪瘟病毒基因的特异性的保守靶序列，

2)根据步骤1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-6的六条LAMP引物；

3)根据所得的六条LAMP引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

表1是23μLLAMP反应液的具体配置。

表1

注：表中所列各成分浓度为母液浓度。

本发明的进一步目的是提供所述试剂盒的应用方法。

上述的用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒检测猪瘟病毒的方法为：首先配置LAMP反应液，然后提取待测样品中的核酸，取该核酸提取液加入上述已配制得的LAMP反应液中，置65℃恒温45min进行LAMP扩增；扩增后往反应液中添加Picogreen或SYBRgreen，根据反应液的颜色变化，判断结果：绿色，说明待测样品中存在猪瘟病毒；桔黄色，说明待测样品中不存在猪瘟病毒。

上述用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒的应用方法具体包括以下步骤：

(1)配制23μL上述LAMP反应液；

(2)按常规方法提取待测样品中的核酸；

(3)取2μL所述核酸的提取液加入步骤(1)制得的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm瞬时离心30S以混匀反应液；

(4)置65℃恒温45min进行LAMP扩增；

(5)取出扩增反应管，在反应液中添加5μLPicogreen或SYBRgreen，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在猪瘟病毒，若为桔黄色，则待测样品中不存在猪瘟病毒。

本发明以六种与猪瘟病毒类似病毒核酸为模板检测体系的特异性，结果显示，本发明方法只能扩增猪瘟病毒核酸而不能检测到其他非目标病毒核酸，证实所建立的LAMP具有良好的特异性；以10^-3、10^-4……10^-9稀释度的猪瘟病毒核酸为模板分别进行LAMP和RT-PCR，比较两种检测方法的灵敏度，结果显示本LAMP可以检测到10^-5浓度核酸，RT-PCR法只能检测到10^-4浓度核酸，证实所建立的LAMP具有良好的灵敏度；用Sph I内切酶确定产物的特异性，结果显示，LAMP扩增产物在凝胶电泳图谱上呈阶梯状，经内切酶消化，出现100bp电泳条带，与理论预期值相符合，说明是特异性扩增。

本发明具有下列突出的优点：

1)高特异性：6条引物对靶序列8个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，即LAMP能从相差仅一个核苷酸的基因标本中，找出相应的靶序列进行扩增，(图1)。

2)高灵敏度：LAMP灵敏度可与PCR相媲美或更高，其所需扩增模板可达10拷贝或更少，(图2)。

3)鉴定简便：向反应液中加入picogree(或SYBRgreen)等荧光染料时，如果有扩增，picogreen就会和DNA结合，通过肉眼观察即可，如果反应液变绿，则为阳性；如反应液为桔黄色，则说明呈阴性反应，(图3)。

4)操作简单：一旦LAMP引物设计成功，只要将检测样品(靶核酸)和试剂一起放入65℃恒温水浴锅，约1h，就可以判断扩增与否。

5)快速、高效扩增：整个扩增反应一小时即可完成，且产率可达到0.5mg/ml。

本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到猪瘟病毒，不需要复杂仪器，为食品安全检测提供了新的技术平台，能较好满足目前对***现场检测的迫切需要，用于进出口检疫、食品***门、畜牧饲养场等的现场检测，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

附图说明

图1为猪瘟病毒LAMP检测体系的特异性检测结果电泳图，

其中，M.DNA Marker；1～7.分别为猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒、猪***病毒；阴性对照。

图2为猪瘟病毒LAMP检测体系的灵敏度验证电泳图，

其中，M.DNA Marker；1～7.分别为10^-3、10^-4……10^-9稀释度的猪传染性肠胃炎病毒核酸；8.阴性对照。

图3为LAMP扩增特异性确认电泳图，其中，

泳道1：LAMP扩增产物在凝胶电泳图谱上呈阶梯状，

泳道2：经内切酶消化，出现100bp电泳条带，与理论预期值相符合。

具体实施方式

实施例1

1，特异性DNA序列查找

从美国基因数据库—GenBank检索获得多株猪瘟病毒基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析即找到特异性的保守靶序列进行LAMP引物设计。

2，LAMP引物设计

通过专门的LAMP引物设计软件设计引物

Primer design V3(http://primerexplorer.jp/elamp3.0.0/index.html)，

设计的具体LAMP引物为(排序序列1-6)：

3，建立检测体系

设置不同终浓度的Mg²⁺(2，4，6，8，10，mM)、dNTP(0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0.1.2，1.4mM)、内外引物浓度比例(1:1，1:2，1:4，1:61:8，1:10，1:12)，分别在不同反应时间(10，20，30，45，60min)和温度(57℃，60℃，63℃，65℃，68℃)下反应，最终获得最佳反应参数，从而建立猪瘟病毒LAMP检测体系。

优化的检测体系(23μl)如下：

1×ThermoPol buffer，8mM Mg²⁺，1M betaine，1.2mM dNTP，0.2μM外引物(F3和B3)，1.6μM内引物(FIP和BIP)，0.8μM环引物(LF和LB)，2μl模板RNA，5U AMV逆转录酶，8U Bst聚合酶。检测反应条件：65℃恒温45min。

所述的Mg²⁺终浓度＝(母液浓度25mM×4μl+ThermoPol buffer中含20mM×2.5μl)/25μl。

4，分析检测体系的灵敏性、特异性

以猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪细小病毒和猪***病毒五种病毒核酸为模板检测体系的特异性，结果显示，LAMP检测体系的特异性测试良好，可以在众多病毒中特异性的检测到猪瘟病毒。

以10^-1、10^-2……10^-7稀释度的猪传染性肠胃炎病毒核酸为模板分别进行LAMP和RT-PCR比较两种检测方法的灵敏度，结果显示，LAMP灵敏度比普通RT-PCR法高10倍。

其检测程序为：

(1)按下述配比配制反应体系(23μL)：

(2)LAMP扩增

用Trizon或RNeasy Mini Kit商品化RNA提取试剂盒提取待测样品中的核酸。取2μL核酸提取液加到上述已配制好的LAMP反应液中，使终反应体积为25μL，10000rpm，瞬时离心30S以混匀反应液。然后放于65℃恒温45min进行LAMP扩增。

(3)结果判断

取出反应管，往反应液中添加5μL Picogreen(或SYBRgreen)，若反应液变成绿色，则说明反应呈阳性，若为桔黄色，则反应为阴性。

为验证本发明效果的可靠性，进行以下鉴定：

1、LAMP扩增特异性确认

用Sph I内切酶判定产物结构，确定其为特异性扩增产物。经内切酶消化，出现100bp电泳条带(泳道2)，与理论预期值相符合，说明是特异性扩增(图3)。

2、猪瘟病毒LAMP检测体系的特异性，

以猪繁殖与呼吸综合症病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪猪细小病和猪***病毒五种病毒核酸为模板检测体系的特异性(图1)。结果显示，猪瘟LAMP检测法只能扩增猪瘟病毒核酸而不能检测到其他非目标病毒核酸，证实所建立的LAMP具有良好的检测特异性。

3、猪瘟病毒LAMP检测体系的灵敏度及与普通RT-PCR比较

以10^-1、10^-2……10^-7稀释度的猪瘟病毒核酸为模板分别进行LAMP和RT-PCR，比较两种检测方法的灵敏度(图2)。结果显示，所建立的猪瘟病毒LAMP检测法比RT-PCR灵敏度高10倍。

序列表：

<110>中华人民共和国上海出入境检验检疫局

<120>用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒及其使用方法

<160>7

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>Forward Outer F3

<223>人工序列

<400>1

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Reverse Outer B3

<400>2

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Reverse Outer B3

<400>2

<210>3

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Forward Inner FIP

<400>3

<210>4

<211>42

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Reverse Inner BIP

<400>4

<210>5

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Forward Loop LF

<400>5

<210>6

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<223>Reverse Loop LB

<400>6

<210>7

<211>

<212>DNA

<213>人工序列

<223>猪瘟病毒基因特异性保守靶DNA序列

<400>7

Claims

1.一种用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒，其特征包含如下组分：

(1)LAMP反应液：

每23μL LAMP反应液中含有：DEPC水1.9μL；10×ThermoPol buffer 2.5μL；25mMMgSO46μL；5M Betaine 5μL；10mM dNTP 3μL；50μM Primer F3 0.1μL；50μM PrimerB3 0.1μL；50μMPrimer FIP 0.8μL；50μM Primer BIP 0.8μL；50μM Primer LF 0.4μL；50μM Primer LB 0.4μL；8U/μL Bst酶1μL；5U/μLAMV逆转录酶1μL；

(2)排序序列1-6的LAMP引物：

Forward Outer F3 AGCTCCCTGGGTGGTCTA

Reverse Outer B3 CCTAATAGTGGGCCTCTGCA

Forward Inner FIP GCCCTCGTCCACATAGCATCTCAGTACAGGACAGTCGTCAGT

Reverse Inner BIP GCCCAAGACACACCTTAACCCT TCAGGTCGTACTCCCATCAC

Forward Loop LF GGGCTTCTGCTCACGTCG

Reverse Loop LB GGTCGCTAGGGTGAAATC。

2.用于检测猪瘟病毒的LAMP试剂盒的制备方法，其特征是包括下述步骤：

1)从基因数据库检索获得猪瘟病毒基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，获得序列7的猪瘟病毒基因的特异性的保守靶序列；

2)根据步骤1)所得的保守靶的DNA序列，设计序列1-6的LAMP引物；

3)根据所得的LAMP引物配置LAMP反应液，构成检测体系。

3.按权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的LAMP反应液是权利要求1所述的23μL LAMP反应液。