CN107312872A - 同时鉴别h5亚型禽流感病毒及其na亚型的多重pcr引物组、试剂盒和检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法。本发明针对禽流感病毒的M、H5、N1、N2、N6和N8基因6个基因建立的分型及检测引物组合物如SEQ ID NO:1～12所示。本发明引物组合物及试剂盒可同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型，特异性强，灵敏度高，交叉反应小，重复性好，通过多重PCR扩增检测，可通过直观的特征条带的判断，来区分不同NA亚型的H5禽流感病毒。本发明能够大大减少检测成本，并且操作简单，用时简短，对H5亚型禽流感病毒的流行病毒调查及防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。

Description

同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试 剂盒和检测方法
技术领域
本发明属于分子检测技术领域，更具体地，涉及一种同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由禽流感病毒(AIV)引起的一种禽类急性传染病，同时，某些亚型的禽流感病毒能够感染人类。禽流感病毒为负链单股RNA病毒目正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒，其基因组由8个基因片段组成，分别为PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M以及NS，根据其糖蛋白血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)的抗原性不同，可将AIV分为16种HA亚型(H1-H16)，9种NA亚型(N1-N9)。禽流感根据致病性可分为高致病性禽流感与低致病性禽流感，部分H5与H7为高致病性禽流感，能够造成鸡群的大量死亡，特别是近年来频频爆发的H5疫情，给多个国家和地区的养殖业带来巨大的经济损失。在我国，H5N1亚型禽流感病毒在1996年首次在广东省分离得到，随后2003年青海湖爆发H5N1疫情，造成了大量的野鸟的死亡，H5N1迅速传播从亚洲逐步蔓延至欧洲以及非洲在内的56个国家和地区，最近几年，H5N2、H5N6、H5N8亚型禽流感病毒也在国内外不同地区相继爆发疫情，造成了大量的家禽死亡和被扑杀。此外，部分H5亚型禽流感病毒发生了抗原变异，获得了跨种间传播的能力直接感染人并引起死亡的案例也提示了H5亚型不仅给养殖业带来巨大伤害，同时还是人类世界公共卫生的巨大安全隐患。
建立禽流感病毒的快速检测及诊断方法不仅有助于早期发现和控制病情，同时也有利于禽流感的监测及检测技术的储备，为应对流感大流行的出现提供早期的监测数据并及时采取有效的防范措施。禽流感的传统检测方法包括病毒的分离与鉴定，分离AIV的常用方法有鸡胚培养分离法，另外通过血清学检测可以进一步区分病毒的HA及NA亚型，由于禽流感亚型众多而且新的变异株不断出现，虽然病毒分离与鉴定是检测病毒的金标准，但操作繁琐，检测周期长，且容易受抗体等因素影响使检测结果不准确和及时，不利于疾病的诊断及对于疫情的控制；随着生物技术的日益更新和迅速发展，现代分子生物学手段逐渐被用来检测AIV，如实时荧光定量PCR、环介导等温扩增法、基因芯片法以及高通量测序等，这类方法虽然特异性和敏感性较好，但是对于仪器和设备的要求较高，目前还不够普及。聚合酶链式反应(PCR)操作简单，仪器要求不高，耗时短，准确度高的同时，也有着不错的特异性与敏感性，结果更为直观，易于判断，样品保存方便，重检也方便，当日即可完成，建立多重PCR能够同时扩增出多个目的基因片段进而实现多种病原体的快速诊断并降低检验成本。
目前，我国流行的H5亚型禽流感病毒以N1、N2、N6以及N8这四种NA亚型较为常见，而不同NA亚型的H5禽流感的爆发都具有发病急、传播快、症状相似的特点，因此仅凭临床对于病情的观察不能判定具体的NA亚型，而目前用的较多的检测方法均侧重于HA方面的检测，对于能够同时检测H5的HA与其四种常见NA亚型的多重PCR方法则尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组合物，其核苷酸序列分别如下所示：
针对禽流感病毒M基因的引物：
MU：5’-TTCTAACCGACGTCGAAAC-3’；
ML：5’-TTAGTCAGAGTTGACARGAT-3’；
针对禽流感病毒H基因的引物：
H5U：5’-ATGAACACTCARTATGAGG-3’；
H5L：5’-GCATTATCCYTAATCTGTAG-3’；
针对禽流感病毒N1基因的引物：
N1U：5’-TTCGAGTCTGTTGCTTGGT-3’；
N1L：5’-GGAGTATTCCTCATAGTGAT-3’；
针对禽流感病毒N2基因的引物：
N2U：5’-CAATTGGCTCTGYTTGTCT-3’；
N2L：5’-TGGTYCCCTGYCCAATTGC-3’；
针对禽流感病毒N6基因的引物：
N6U：5’-TGCAATCAGAATAGGTGAGG-3’；
N6L：5’-TGCTTGTGTGCGTCATCRT-3’；
针对禽流感病毒N8基因的引物：
N8U：5’-TTGATGCTGTRGCATGGTC-3’；
N8L：5’-CATGCGACTAGTGCATGAAC-3’；
上述碱基R＝A/G，Y＝C/T。
同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的试剂盒，其特征在于：含有分别针对禽流感病毒的M、H5、N1、N2、N6和N8基因序列设计的引物。
作为上述试剂盒的进一步优选，所述引物的核苷酸序列如下所示：
针对禽流感病毒M基因的引物：
MU：5’-TTCTAACCGACGTCGAAAC-3’；
ML：5’-TTAGTCAGAGTTGACARGAT-3’；
针对禽流感病毒H基因的引物：
H5U：5’-ATGAACACTCARTATGAGG-3’；
H5L：5’-GCATTATCCYTAATCTGTAG-3’；
针对禽流感病毒N1基因的引物：
N1U：5’-TTCGAGTCTGTTGCTTGGT-3’；
N1L：5’-GGAGTATTCCTCATAGTGAT-3’；
针对禽流感病毒N2基因的引物：
N2U：5’-CAATTGGCTCTGYTTGTCT-3’；
N2L：5’-TGGTYCCCTGYCCAATTGC-3’；
针对禽流感病毒N6基因的引物：
N6U：5’-TGCAATCAGAATAGGTGAGG-3’；
N6L：5’-TGCTTGTGTGCGTCATCRT-3’；
针对禽流感病毒N8基因的引物：
N8U：5’-TTGATGCTGTRGCATGGTC-3’；
N8L：5’-CATGCGACTAGTGCATGAAC-3’；
上述碱基R＝A/G，Y＝C/T。
作为上述试剂盒的进一步优选，引物对MU与ML、引物对H5U与H5L、引物对N1U与N1L、引物对N2U与N2L、引物对N6U与N6L、引物对N8U与N8L的摩尔比为(2～4)：(2～4)：(1～2)：(1～2)：(2～4)：(1～2)。
作为上述试剂盒的进一步优选，还含有反应液、DNA聚合酶、阴性对照。
作为上述试剂盒的进一步优选，反应液含有10×PCR buffer、2.5mM MgCl2、2.5mMdNTP，三者体积比为：2：2：2.5。
作为上述试剂盒的进一步优选，DNA聚合酶为Ex Taq聚合酶。
非疾病诊断的同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品核酸；
(2)将待检样品核酸进行反转录，获得待检样品cDNA；
(3)将待检样品cDNA作为模板，利用前述引物组合物或前述试剂盒中的引物进行多重PCR扩增；
(4)凝胶电泳后，根据扩增片段条带及大小，判断结果：
如果出现的条带中，至少有158bp、215bp两条条带，则样品中含有H5亚型禽流感病毒；
如果有158bp、215bp两条条带，还有324bp大小的特征条带，则样品中含有H5N1；
如果有158bp、215bp两条条带，还有396bp大小的特征条带，则样品中含有H5N2；
如果有158bp、215bp两条条带，还有635bp大小的特征条带，则样品中含有H5N6；
如果有158bp、215bp两条条带，还有503bp大小的特征条带，则样品中含有H5N8；
除以上情况外，均判断为不含有H5亚型禽流感病毒。
作为上述检测方法的进一步优选，多重PCR扩增的25μL体系组分为：待测样品cDNA1μL，10×PCR buffer 2μL，2.5mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 2μL，Ex Taq polymerase 0.25μL，各个引物的终浓度为20pmol/uL，用RNA-free水补足至25μL。
作为上述检测方法的进一步优选，多重PCR扩增的条件为：94℃3min，然后94℃30s，54～56℃30s，72℃1min，30～35个循环，72℃延伸5～10min。
本发明的有益效果是：
本发明针对禽流感病毒的M、H5、N1、N2、N6和N8基因6个基因建立的分型及检测引物组合物如SEQ ID NO:1～12所示。本发明引物组合物及试剂盒可同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型，特异性强，灵敏度高，交叉反应小，重复性好，通过多重PCR扩增检测，可通过直观的特征条带的判断，来区分不同NA亚型的H5禽流感病毒。本发明能够大大减少检测成本，并且操作简单，用时简短，对H5亚型禽流感病毒的流行病毒调查及防控，保障养禽业的健康持续发展具有重要意义。
附图说明
图1：临床单一感染H5亚型禽流感病毒的多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图，图中，泳道1为H5N1，泳道2为H5N2，泳道3为H5N6，泳道4为H5N8，泳道5为新城疫病毒核酸模板，泳道6为DEPC水，泳道7为100bp Ladder Marker；
图2：多模板的多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图；图中，泳道1和2为H5N1与H5N2的混合模板反应条带，泳道3和4为H5N1与H5N6的混合模板反应条带，泳道5和6为H5N1和H5N8的混合模板反应条带，泳道7和8为H5N2与H5N6的混合模板反应条带，泳道9和10为H5N2与H5N6的混合模板反应条带，泳道11和12为H5N6与H5N8的混合模板反应条带，泳道13为100bpLadder Marker；
图3：单引物扩增105～1pg/μL的cDNA模板的灵敏度试验结果；图中标识的M、H5、N1、N2、N6、N8分别为对应的单引物扩增结果，各单引物扩增由左至右分别对应105～1pg/μL的cDNA模板，Marker为100bp Ladder Marker；
图4：引物组合物扩增浓度为105～1pg/μL的cDNA模板的灵敏度试验结果；图中，泳道M为100bp Ladder Marker，泳道由左至右分别为105～1pg/μL的cDNA模板。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组合物的设计
根据禽流感病毒的M、H5、N1、N2、N6和N8基因在GenBank中下载大量相应序列，对各基因片段的序列进行分析与比较，找出各基因片段相对保守区域，设计特异性引物，随后对设计好的引物进行分析和筛选，获得本发明多重PCR引物组合物(见表1)，由上海Invitrogen进行合成，PAGE纯化。
表1、引物信息
引物信息如表1所示，兼并碱基代码R＝A/G，Y＝C/T，根据实际检测的病原体的毒株不同对检测获得的实际扩增产物长度可在预计扩增产物的长度基础上上下波动3bp。
实施例2、同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的试剂盒
同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的试剂盒，包括如SEQ ID NO:1～12所示的同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组合物，反应液、Ex Taq聚合酶。
多重PCR引物组合物中引物对MU与ML、引物对H5U与H5L、引物对N1U与N1L、引物对N2U与N2L、引物对N6U与N6L、引物对N8U与N8L的摩尔浓度比为2：2：1：1：2：1；反应液含有10×PCR buffer、2.5mM MgCl2、2.5mM dNTP，三者体积比为：2：2：2.5。
实施例3、同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的检测方法
(1)核酸提取：采用TRIzol病毒核酸提取方法提取病毒核酸，具体步骤为：750μL的TRIzol与250μL的病毒样品尿囊液充分混匀，静置5min；加入200μL氯仿充分混匀静置5min；4℃12000rpm离心10min，将上清约450μL吸入新的干净EP管，加入500μL的异丙醇，静置20min，4℃12000rpm离心10min后弃上清，贴壁加入1ML的70％冰乙醇，12000rpm离心5min后弃上清，然后重复加入70％冰乙醇再洗涤一次，将EP管倒置晾干后加入25μL的RNA-free水洗脱，获得病毒样品核酸。
(2)反转录：反转录反应体系参照Promega公司逆转录酶(货号M1705)说明书进行，将获得的病毒样品核酸按照如下反应体系和反应条件进行反转录，得到病毒样品cDNA；反转录反应体系：5×Reverse Transcriptase Buffer 8μL，50mmol/L Random Primer(9mer)2mL，dNTP Mixture(10mM/L)4μL，40U Ribonuclease Inhibitor 0.5μL,5U/μL MLVReverse Transcriptase 1μL，病毒核酸25μL；反转录温度42℃，反应1.5h。
(3)多重PCR扩增：将病毒样品cDNA和试剂盒的物品，按多重PCR反应总体积为25μL配置，体系组分为：病毒样品cDNA 1μL，10×PCR buffer 2μL，2.5mM MgCl2 2μL，2.5mMdNTP 2μL，Ex Taq polymerase 0.25μL，SEQ ID NO:1～12所示的引物的各引物终浓度为20pmol/uL，用RNA-free水补足至25μL；反应条件为：94℃3min，然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，30个循环，72℃延伸5min，置于4℃。
(4)配制1.5％的琼脂糖凝胶，待胶凝固，取各扩增产物5μL与1μL 6×loadingbuffer混匀加入上样孔，在末尾加入100bp Ladder Marker，110V，40min，在凝胶成像仪中观察各扩增片段；根据扩增产物片段大小判断结果：
如果出现的条带中，至少有158bp、215bp两条条带，则样品中含有H5亚型禽流感病毒；
如果有158bp、215bp两条条带，还有324bp大小的特征条带，则样品中含有H5N1；
如果有158bp、215bp两条条带，还有396bp大小的特征条带，则样品中含有H5N2；
如果有158bp、215bp两条条带，还有635bp大小的特征条带，则样品中含有H5N6；
如果有158bp、215bp两条条带，还有503bp大小的特征条带，则样品中含有H5N8；
除以上情况外，均判断为不含有H5亚型禽流感病毒。
实施例4、特异性试验
分别以多株已知病毒核酸的单一阳性标本作为模板，包括H5N1、H5N2、H5N6、H5N8、设置对照为：新城疫病毒核酸模板；阴性对照：DEPC水，采用实施例1的引物组合物进行多重PCR扩增。
多重PCR引物组合物对单一模板进行检测时，如图1所示，模板为H5N1、H5N2、H5N6、H5N8分别扩增出了M、H5和各自NA的三条条带，其中M对应158bp，H5对应215bp，N1对应324bp，N2对应396bp，N6对应635bp，N8对应503bp的条带，新城疫病毒核酸模板和DEPC水均无任何条带。
分别以多种病原的混合cDNA样品作为模板，包括H5N1与H5N2的混合模板、H5N1与H5N6的混合模板、H5N1和H5N8的混合模板、H5N2与H5N6的混合模板、H5N2与H5N6的混合模板、H5N6与H5N8的混合模板，采用实施例1的引物组合物进行多重PCR扩增。。
多重PCR引物组合物对混合模板进行检测时，如图2所示，H5N1、H5N2、H5N6、H5N8两两组合的混合模板扩增产生4个条带，并且混合模板在扩增中不会存在干扰作用。
以上试验结果表明：本发明的多重PCR引物组合物检测单一模板和混合模板均特异性强，引物之间交叉反应小，可通过直观的特征条带的判断，来区分不同NA亚型的H5禽流感病毒。
实施例5、灵敏度和重复性试验
反转录之后，应用核酸蛋白含量测定仪测定cDNA模板浓度，然后对cDNA模板进行10倍倍比的连续稀释，获得浓度为105～1pg/μL的cDNA模板，分别以单引物和引物组合物进行PCR扩增，试验在不同日重复3次测定各DNA模板的核酸浓度，以模板最高稀释倍数扩增呈阳性为其PCR的敏感度。
单引物扩增结果如图3所示，综合各引物灵敏性，能检测的最小核酸浓度约为100pg/uL；
引物组合物扩增结果如图4所示，对于M、H5、N1、N2、N6、N8基因最低可以检测至100pg/μL的核酸样本。
以上试验结果表明：本发明的多重PCR单引物和引物组合物均有100pg/μL的检测灵敏度，并且引物组合后相互干扰小，重复性优良。
实施例6、临床样品检验
对临床50份样品，包括36份病料及14份棉拭子进行禽流感病毒多重PCR的检测。
表2、临床样品的检测结果
临床样品的检测结果如表2所示，50临床样品中，阴性样品18份，阳性样品32份，其中1份H5N1，10份H5N2，20份H5N6，1份H5N8。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州市华南农大生物药品有限公司
<120> 同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组、试剂盒和检测方
法
<130>
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
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Claims (10)

1.同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的多重PCR引物组合物，其核苷酸序列分别如下所示：
针对禽流感病毒M基因的引物：
MU：5’-TTCTAACCGACGTCGAAAC-3’；
ML：5’-TTAGTCAGAGTTGACARGAT-3’；
针对禽流感病毒H5基因的引物：
H5U：5’-ATGAACACTCARTATGAGG-3’；
H5L：5’-GCATTATCCYTAATCTGTAG-3’；
针对禽流感病毒N1基因的引物：
N1U：5’-TTCGAGTCTGTTGCTTGGT-3’；
N1L：5’-GGAGTATTCCTCATAGTGAT-3’；
针对禽流感病毒N2基因的引物：
N2U：5’-CAATTGGCTCTGYTTGTCT-3’；
N2L：5’-TGGTYCCCTGYCCAATTGC-3’；
针对禽流感病毒N6基因的引物：
N6U：5’-TGCAATCAGAATAGGTGAGG-3’；
N6L：5’-TGCTTGTGTGCGTCATCRT-3’；
针对禽流感病毒N8基因的引物：
N8U：5’-TTGATGCTGTRGCATGGTC-3’；
N8L：5’-CATGCGACTAGTGCATGAAC-3’；
上述碱基R＝A/G，Y＝C/T。
2.同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的试剂盒，其特征在于：含有分别针对禽流感病毒的M、H5、N1、N2、N6和N8基因序列设计的引物。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述引物的核苷酸序列如下所示：
针对禽流感病毒M基因的引物：
MU：5’-TTCTAACCGACGTCGAAAC-3’；
ML：5’-TTAGTCAGAGTTGACARGAT-3’；
针对禽流感病毒H基因的引物：
H5U：5’-ATGAACACTCARTATGAGG-3’；
H5L：5’-GCATTATCCYTAATCTGTAG-3’；
针对禽流感病毒N1基因的引物：
N1U：5’-TTCGAGTCTGTTGCTTGGT-3’；
N1L：5’-GGAGTATTCCTCATAGTGAT-3’；
针对禽流感病毒N2基因的引物：
N2U：5’-CAATTGGCTCTGYTTGTCT-3’；
N2L：5’-TGGTYCCCTGYCCAATTGC-3’；
针对禽流感病毒N6基因的引物：
N6U：5’-TGCAATCAGAATAGGTGAGG-3’；
N6L：5’-TGCTTGTGTGCGTCATCRT-3’；
针对禽流感病毒N8基因的引物：
N8U：5’-TTGATGCTGTRGCATGGTC-3’；
N8L：5’-CATGCGACTAGTGCATGAAC-3’；
上述碱基R＝A/G，Y＝C/T。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：引物对MU与ML、引物对H5U与H5L、引物对N1U与N1L、引物对N2U与N2L、引物对N6U与N6L、引物对N8U与N8L的摩尔比为(2～4)：(2～4)：(1～2)：(1～2)：(2～4)：(1～2)。
5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还含有反应液、DNA聚合酶、阴性对照。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：反应液含有10×PCR buffer、2.5mMMgCl2、2.5mM dNTP，三者体积比为：2：2：2.5。
7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：DNA聚合酶为Ex Taq聚合酶。
8.非疾病诊断的同时鉴别H5亚型禽流感病毒及其NA亚型的检测方法，包括如下步骤：
(1)提取待检样品核酸；
(2)将待检样品核酸进行反转录，获得待检样品cDNA；
(3)将待检样品cDNA作为模板，利用权利要求1的引物组合物或权利要求2～7任一项的试剂盒中的引物进行多重PCR扩增；
(4)凝胶电泳后，根据扩增片段条带及大小，判断结果：
如果出现的条带中，至少有158bp、215bp两条条带，则样品中含有H5亚型禽流感病毒；
如果有158bp、215bp两条条带，还有324bp大小的特征条带，则样品中含有H5N1；
如果有158bp、215bp两条条带，还有396bp大小的特征条带，则样品中含有H5N2；
如果有158bp、215bp两条条带，还有635bp大小的特征条带，则样品中含有H5N6；
如果有158bp、215bp两条条带，还有503bp大小的特征条带，则样品中含有H5N8；
除以上情况外，均判断为不含有H5亚型禽流感病毒。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：多重PCR扩增的25μL体系组分为：待测样品cDNA 1μL，10×PCR buffer 2μL，2.5mM MgCl2 2μL，2.5mM dNTP 2μL，Ex Taqpolymerase 0.25μL，各个引物的终浓度为20pmol/uL，用RNA-free水补足至25μL。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：多重PCR扩增的条件为：94℃3min，然后94℃30s，54～56℃30s，72℃1min，30～35个循环，72℃延伸5～10min。
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