CN104419761A - 一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒和使用方法 - Google Patents
一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒和使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于食品中荞麦成分过敏原的检测技术，具体是指用多环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification of DNA）检测食品中的荞麦过敏原的试剂盒和检测方法。该试剂盒和检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高、操作简便、重复性好等优点，可广泛应用于食品中荞麦过敏原成分的快速检测领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种利用多环介导等温扩增（LAMP)技术进行食品中荞麦过敏原成分的快速检测方法，具体是一种食品中荞麦过敏原成分快速检测试剂盒的制备和使用方法。
背景技术
荞麦又称为三角麦、乌麦、花荞，属于双子叶蓼科植物，其栽培品种为甜荞麦( Fagopyrum esculentum，Common buckwheat，简称CB) 和苦荞麦( Fagopyrum tataricum，Tartary buckwheat，简称TB)。荞麦具有较高的营养价值和药用价值，含有多种人体必需的氨基酸以及生物活性物质，能防治糖尿病、高血压、冠心病和胃病等多种疾病，对人体有极好的保健作用。然而，荞麦含有的过敏原成分会使许多接触或食用它的人产生过敏症状，甚至食品中含有痕量的荞麦成分都会导致严重的休克等过敏反应。
因此，急需建立食品中荞麦过敏成分快速检测方法及相关检测方法标准，本研究采用环介导等温扩增（lamp）方法检测食品中荞麦过敏原成分，建立高效、特异、快速检测食品中荞麦过敏成分（栽培型和野生型）的方法，为进出口食品荞麦成分的鉴定提供切实可行的技术支持。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、特异性强、灵敏度高而且成本低的技术方法，主要是使用环介导等温扩增技术（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）方法检测食品中荞麦过敏原成分的试剂盒，并提供一种食品中荞麦过敏原成分的制备和使用方法，从而为食品中荞麦过敏原成分的快速检测提供科学依据。
本发明的主要原理为：环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerasc)的作用下，60-65℃恒温扩增，15-60rain左右即可核酸扩增，效率可达109～10个数量级，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。
本发明一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于包括：
（1）LAMP扩增反应液A
包括：10×ThermolPol缓冲液，50mmol/L硫酸镁溶液，5mol/L甜菜碱，dNTPs溶液（每种核苷酸浓度10 mmol/L），8U/μL Bst DNA聚合酶， 0.2-0.6μmol/L外侧上下游引物，0.2-0.6μmol/L内侧上下游引物；
所述10×ThermolPol缓冲液含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100；
所述外侧上游引物（F3）序列为： 5’- ATCCTCGGACCGAGATGG -3’，外侧下游引物（B3）序列为： 5’-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3’， 内侧上游引物（FIP）序列为：5’-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC -3’，内侧下游引物（BIP）序列为5’-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC -3’；
所述dNTP四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP：dATP：dGTP：dCTP=2:1:1:1.
（2）显色液：SYBR Green I 荧光染料或DNAGreen，1000 ×；
LAMP扩增反应液A每管23ul，组成为： 2.5ul 10 ×ThermoPol缓冲液，1.0ul 5 μmol/L外侧上游引物（F3），1.0ul 5 μmol/L外侧下游引物（B3），1.0 ul 40 μmol/L内侧上游引物（FIP），1.0ul 40 μmol/L内侧下游引物（BIP），5.0ul 10 mmol/L dNTPs ，4ul 5 mol/L甜菜碱 ，0.5ul 100 mmol/L硫酸镁溶液(包括缓冲液中所含硫酸镁)。1ul 8 U/μL Bst DNA聚合酶。2ul 10 ng/μL DNA模板和6ul双蒸水。
一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法 ，其特征是包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取：
A.称取300 mg经预处理的样品于2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃温浴30 min～90 min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀；
B. 2 000g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解DNA；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min ；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μL TE缓冲液溶解沉淀，即为待检样品模板DNA：
（2）进行荞麦过敏原成分的环介导等温扩增反应
A：在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入2ul待检样品模板DNA。
B：65 ℃恒温扩增60 min，80 ℃ 5 min使酶灭活，反应结束。
（3）显色检测
反应结束后，在待检的每个反应管中加入1ul显色液，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行颜色观察，如果颜色为黄色，说明待检样品不含有荞麦过敏原成分，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有荞麦过敏原成分。
本发明的优点在于建立了食品中荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒及检测方法，本试剂盒根据荞麦过敏原蛋白的保守区六个序列设计了两个特异性的内引物和两个特异性外引物，该保守基因序列为荞麦主要种属所共有，以保证从种的水平上检测荞麦过敏原成分。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，且结果不必用凝胶电泳法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单快速，可用于食品中荞麦过敏原成分的检测，适用于基层检测使用。
具体实施方式：
按下列配方制作的荞麦过敏原成分的检测试剂盒包含有以下（1）-（2）：
（1）LAMP扩增反应液A
包括10×ThermolPol缓冲液，50mmol/L硫酸镁溶液，5mol/L甜菜碱，dNTPs溶液（每种核苷酸浓度10 mmol/L），8U/μL Bst DNA聚合酶， 0.3μmol/L外侧上下游引物，0.3μmol/L内侧上下游引物。
其中10×ThermolPol缓冲液含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100；
其中所述外侧上游引物（F3）序列为： 5’- ATCCTCGGACCGAGATGG -3’，外侧下游引物（B3）序列为： 5’-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3’， 内侧上游引物（FIP）序列为：5’-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC -3’，内侧下游引物（BIP）序列为5’-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC -3’；
（2）显色液：SYBR Green I 荧光染料或DNAGreen，1000 ×。
上述的环等温扩增反应液A每管23ul的组成为： 2.5ul 10 ×ThermoPol缓冲液，1.0ul 5 μmol/L外侧上游引物（F3），1.0ul 5 μmol/L外侧下游引物（B3），1.0 ul 40 μmol/L内侧上游引物（FIP），1.0ul 40 μmol/L内侧下游引物（BIP），5.0ul 10 mmol/L dNTPs ，4ul 5 mol/L甜菜碱 ，0.5ul 100 mmol/L硫酸镁溶液(包括缓冲液中所含硫酸镁)。1ul 8 U/μL Bst DNA聚合酶。2ul 10 ng/μL DNA模板和6ul双蒸水。
使用上述试剂盒检测荞麦过敏原成分按照以下程序进行检测：
（1）待检样品DNA的提取：
A.称取300 mg经预处理的样品于2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃温浴60min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀；
B. 2 000g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解DNA；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min ；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μL TE缓冲液溶解沉淀，即为待检样品模板DNA：
（2）进行荞麦过敏原成分的环介导等温扩增反应：
A：在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入2ul待检样品模板DNA。
B：65 ℃恒温扩增60 min，80 ℃ 5 min使酶灭活，反应结束。
（3）显色检测：
反应结束后，在待检的每个反应管中加入1ul显色液，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行颜色观察，如果颜色为黄色，说明待检样品不含有荞麦过敏原成分，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有荞麦过敏原成分。
Claims (5)
1.一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒 ，其特征在于包括：
（1）LAMP扩增反应液A
包括：10×ThermolPol缓冲液，50mmol/L硫酸镁溶液，5mol/L甜菜碱，dNTPs溶液（每种核苷酸浓度10 mmol/L），8U/μL Bst DNA聚合酶， 0.2-0.6μmol/L外侧上下游引物，0.2-0.6μmol/L内侧上下游引物；
所述外侧上游引物（F3）序列为： 5’- ATCCTCGGACCGAGATGG -3’，外侧下游引物（B3）序列为： 5’-AGTCCTTCTCTTCCTGCCT-3’， 内侧上游引物（FIP）序列为：5’-CTCCGACAACCTGGACTCTTCCAACTTGAACGCGCACAGC -3’，内侧下游引物（BIP）序列为5’-AGTGTGTTCGACGACAACGTGCTCAACACCACTGCGAATCC -3’；
（2）显色液：SYBR Green I 荧光染料或DNAGreen，1000 ×。
2.根据权利要求1 所述的荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒 ，其特征在于所述10×ThermolPol缓冲液含有200 mmol/L Tris-HCl（pH 8.8）、100 mmol/L硫酸铵、100 mmol/L 氯化钾、20 mmol/L硫酸镁、1% Triton X-100。
3.根据权利要求1中所述的荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒 ，其特征在于所述dNTP四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP：dATP：dGTP：dCTP=2:1:1:1。
4.根据权利要求1中所述的一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于所述LAMP扩增反应液A每管23ul，组成为： 2.5ul 10 ×ThermoPol缓冲液，1.0ul 5 μmol/L外侧上游引物（F3），1.0ul 5 μmol/L外侧下游引物（B3），1.0 ul 40 μmol/L内侧上游引物（FIP），1.0ul 40 μmol/L内侧下游引物（BIP），5.0ul 10 mmol/L dNTPs ，4ul 5 mol/L甜菜碱 ，0.5ul 100 mmol/L硫酸镁溶液(包括缓冲液中所含硫酸镁)，1ul 8 U/μL Bst DNA聚合酶，2ul 10 ng/μL DNA模板和6ul双蒸水。
5.一种荞麦过敏原成分环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法，其特征在于包括下列步骤：
（1）待检样品DNA的提取
A.称取300 mg经预处理的样品于2 mL离心管中，加入600 μL CTAB缓冲液和40 μL蛋白酶K，振荡混匀，65℃温浴30 min～90 min，期间每隔10 min 轻柔颠倒混匀；
B. 2 000g离心5 min，取上清于另一干净的2 mL离心管中，加入等体积的酚、三氯甲烷和异戊醇的混合液（25：24：1），震荡混匀；
C. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
D. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用预热至65℃ 的TE缓冲液溶解DNA；
E. 加入5 μL RNA酶溶液，37 ℃ 30 min ；
F. 加入200 μL三氯甲烷：异戊醇（24：1），强烈振荡；
G. 12 000 g离心10 min，取上清至干净的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀；
H. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，用4℃预冷的70%乙醇500 μL，涡旋清洗沉淀；
I. 12 000 g离心10 min，弃去上清液，倒置晾干后加100 μL TE缓冲液溶解沉淀，即为待检样品模板DNA；
（2）进行荞麦过敏原成分的环介导等温扩增反应
A：在装有23uL LAMP反应液A的反应管中加入2ul待检样品模板DNA；
B：65 ℃恒温扩增60 min，80 ℃ 5 min使酶灭活，反应结束；
（3）显色检测
反应结束后，在待检的每个反应管中加入1ul显色液，将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀，在黑色背景下立即进行颜色观察，如果颜色为黄色，说明待检样品不含有荞麦过敏原成分，如果颜色变为绿色，则说明待检样品含有荞麦过敏原成分。
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|---|---|---|---|---|
| CN106755298A (zh) * | 2016-11-15 | 2017-05-31 | 河南省产品质量监督检验院 | 一种对食品中大豆过敏原p34蛋白基因进行定量的检测方法 |
| CN106916896A (zh) * | 2016-04-27 | 2017-07-04 | 苏茂顺 | 一种用于检测麦角菌的试剂盒及检测方法 |
| CN107299142A (zh) * | 2017-07-26 | 2017-10-27 | 上海速创诊断产品有限公司 | 一种用于检测芝麻过敏原2S albumin基因的LAMP引物组合物及其试剂盒 |
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2013
- 2013-09-10 CN CN201310407049.4A patent/CN104419761A/zh active Pending
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