CN111321249A

CN111321249A - 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法

Info

Publication number: CN111321249A
Application number: CN202010150878.9A
Authority: CN
Inventors: 汪运山; 杨炜华; 钊倩倩; 周云英; 徐祎慧; 王敏; 王军; 韩淑毅
Original assignee: JINAN CENTER HOSPITAL
Current assignee: JINAN CENTER HOSPITAL
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2020-03-06
Publication date: 2020-06-23

Abstract

本发明提供一种SARS‑CoV‑2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法，属于医学分子生物学诊断技术领域。本发明基于RdRp、E和N基因在SARS‑COV‑2中稳定性与独特性，设计三组引物组对上述基因进行扩增检测，降低引物浓度，提高了反应的特异性，降低假阳性；因此本发明提供的是一种检测速度快、灵敏度高、特异性强的检测引物组、试剂盒及检测方法，具有良好的实际应用之价值。

Description

一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于医学分子生物学诊断技术领域，具体涉及一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

冠状病毒是一个大型病毒家族，已知可引起感冒以及中东呼吸综合征(MERS)和严重急性呼吸综合征(SARS)等较严重疾病。SARS-COV-2是以前从未在人体中发现的冠状病毒新毒株，其基因序列与SARS冠状病毒有79.5％的相似性，进入细胞的路径与SARS冠状病毒相同，即通过ACE2细胞受体，但 SARS-COV-2比引发非典的SARS更容易传播。

目前，临床和疾控***通过荧光PCR法检测SARS-COV-2核酸或病毒核酸测序确证病毒感染。荧光PCR法需要特殊核酸扩增仪和检测仪，而且扩增时使用两条引物，靶向两个基因片段，准确性有限，存在假阳性或假阴性。而且因灵敏度所限，出现多例患者核酸检测阴性的现象，不仅使患者得不到及时诊治，而且因漏诊导致病毒进一步扩散感染，不利于疫情控制。新型冠状病毒 (SARS-COV-2)感染引起的肺炎疫情需要更加准确、快速、便捷的检测方法和检测试剂。环介导等温扩增方法(LAMP)是近几年新兴的一种基因扩增方法，采用4-6条引物，靶向6条或更多基因片段，特异性强，而且扩增效率特别高，使得扩增产物肉眼可见，对仪器设备、操作人员和场地要求不高，与常见的核酸扩增技术相比较，它具有以下几个明显的优势:1)整个扩增过程在恒温下完成，不需要复杂的变温设备；2)扩增效率更高，是一般PCR扩增效率的10-100倍； 3)耗时更少，一般PCR扩增需要花费2-3h，而LAMP扩增只需要0.5-1h即可完成；4)结果可目视，容易判断，无需电泳或荧光检测仪，节约时间，避免污染。LAMP的这些优势使得其自发明以来就获得广泛关注，但发明人发现，在医疗领域目前只有检测结核分枝杆菌、沙门氏菌和军团菌的试剂盒商品化，尚未有SARS-COV-2的方法及试剂盒的相关报道。

发明内容

针对上述现有技术的不足，本发明基于RdRp、E和N基因在SARS-COV-2 中稳定性与独特性，提供了一种检测速度快、灵敏度高、特异性检测SARS-COV-2 的LAMP检测用引物组、试剂盒及检测方法。

本发明的目的之一在于提供一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组，所述LAMP检测引物组至少包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；其中，第一引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-GTTACGATGGTGGCTGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

B3:5'-GGCATACTTAAGATTCATTTGAG-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP:

5'-AGCCTTACCCCATTTATTAAATGGAGCTAACCAAGTCATCGTCAA-3'(SEQ ID NO.3)；

BIP:5'- AATGAGTTATGAGGATCAAGATGCATTATAGTAGGGATGACATTACGT -3'(SEQ IDNO.4)；

Lp:5'-AAACCAGCTGATTTGTCTAGGTTG-3'(SEQ ID NO.5)。

第二引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-AGATCACATTGGCACCCG-3'(SEQ ID NO.6)；

B3:5'-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3'(SEQ ID NO.7)；

FIP:5'-TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC-3' (SEQ ID NO.8)；

BIP:5'-GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3'(SEQ ID NO.9)；

LF:5'-GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT-3'(SEQ ID NO.10)；

LB:5'-CGTAGTCGCAACAGTTAAGAAATTC-3'(SEQ ID NO.11)。

第三引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-AGCTGATGAGTACGAACTT-3'(SEQ ID NO.12)；

B3:5'-TTCAGATTTTTAACACGAGAGT-3'(SEQ ID NO.13)；

FIP:

5'-ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTATTCGTTTCGGAAGAGACAG-3' (SEQ ID NO.14)；

BIP:5'-TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT -3'(SEQ IDNO.15)；

LP:5'-CTGCGCTTCGATTGTGTGCGT-3'(SEQ ID NO.16)；

本发明的目的之二在于提供上述引物组在基于环介导等温扩增法检测 SARS-CoV-2中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种检测SARS-CoV-2的LAMP检测方法，所述方法包括使用上述引物组进行LAMP扩增。

本发明的目的之四在于提供一种SARS-CoV-2的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶和逆转录酶。

其中，所述反应缓冲液组分包括Tris-HCl(pH 8.8)、KCl、MgSO₄、(HN₄)₂SO₄、Tween20、甜菜碱和dNTPs。

所述试剂盒还包括显色液，所述显色液为锰离子鳌和型钙黄绿素。

所述检测试剂盒还设置有阳性对照和阴性对照。

本发明的目的之五在于提供上述试剂盒在基于环介导等温扩增法检测 SARS-CoV-2中的应用。

以上一个或多个技术方案的有益技术效果：

1.针对SARS-COV-2基因中高度保守、特异的RdRp、N、E基因中的6个片段，自行设计并优选出特异性高、反应迅速、包含有6条引物的引物组。N基因最敏感，反应最快，1copy病毒基因即可在20分钟内检测到，不存在假阴性； RdRp基因最特异，不存在假阳性；三个基因一起检测，既保证了敏感性，有保障了特异性。

2.无需事先逆转录，从RNA到扩增以及结果判读在一个反应管中一步法完成。将每个反应所需试剂预先混合并置于反应管中，检测时只需要在反应管中加入样本RNA即可进行反应，避免因多次加样带来的污染及误差，对操作人员要求低，提高检测的精确度和便捷度；

3.反应液包括2×反应缓冲液(200mMTris-Hcl，pH8.8；100mM氯化钾；100mM 硫酸铵；20mM硫酸镁和1％TritonX-100、甜菜碱、dNTP、超纯水)、酶溶液(1 单位逆转录酶，100单位BstDNA聚合酶)、引物组、荧光染料。反应液采用Tris-HCl 缓冲体系，更加稳定；甜菜碱的浓度高达32μmol/20μl，更好的保护Bst DNA 聚合酶的活性，提高反应效率；降低引物浓度，提高了反应的特异性，降低假阳性；

4.用于结果判断的染料采用钙黄绿素，反应效率高，特异性好，只能检测到 LAMP反应而对常规PCR反应无效，避免因核酸扩增中的微弱PCR反应带来的假阳性；

4.染料预先加到反应液，反应结束后不需要再打开反应管，避免了因形成气溶胶产生的DNA污染，有效保护反应环境，避免后续检测中的假阳性；

5.反应快速，30min内即可完成；设置结果判断的时间范围为25-35min，因为40min以后可能产生假阳性，所以40min以后的结果不予判读，确保了检测结果的准确性。

与同类试剂盒相比，本试剂盒更加方便、快捷、特异、精确，对仪器设备和操作人员要求低。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例中LAMP法目视鉴定SARS-COV-2结果图(RdRp基因)，其中左管为阴性，右管为阳性；

图2为本发明实施例中LAMP法目视检测试剂盒特异性结果图(RdRp基因)；其中，1-2为阳性标本，3-8为阴性标本。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

目前检测SARS-COV-2的试剂盒均为荧光PCR法，临床和疾控***检测 SARS-COV-2的荧光PCR试剂盒主是针对N基因和ORF1ab(本发明试剂盒所用的RdRp基因位于ORF1ab内)设计，也有的是针对N基因、ORF1ab(或RdRp) 和E基因设计。临床使用中发现N基因的特异性比较差，不少样本只有N基因阳性，而ORF1ab呈阴性。除了SARS-COV-2和SARS、MERS外，还有四种冠状病毒引起的人类疾病，而且是成人普通感冒的主要病原之一，儿童感染率较高，主要是上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。N基因对SARS-COV-2特异性差，N基因阳性样本中有可能存在这四种常见冠状病毒，但是为了不漏检，本发明试剂盒依然包含N基因，为了进一步提高检测准确性，本发明试剂盒又同时检测E基因和RdRp基因。因此，本发明针对SARS-COV-2的RdRp、N、E三个基因设计引物，采用环介导等温扩增技术进行扩增并检测。

本发明的一个典型实施方式中，提供一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组，所述LAMP检测引物组至少包括第一引物组、第二引物组和第三引物组；其中，第一引物组针对RdRp基因进行扩增，其核苷酸序列如下：

F3:5'-GTTACGATGGTGGCTGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

B3:5'-GGCATACTTAAGATTCATTTGAG-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP:5'- AGCCTTACCCCATTTATTAAATGGAGCTAACCAAGTCATCGTCAA-3'(SEQ IDNO.3)；

BIP:5'- AATGAGTTATGAGGATCAAGATGCATTATAGTAGGGATGACATTACGT -3'(SEQ IDNO.4)；

Lp:5'-AAACCAGCTGATTTGTCTAGGTTG-3'(SEQ ID NO.5)。

第二引物组针对N基因进行扩增，其核苷酸序列如下：

F3:5'-AGATCACATTGGCACCCG-3'(SEQ ID NO.6)；

B3:5'-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3'(SEQ ID NO.7)；

FIP:5'-TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC-3' (SEQ ID NO.8)；

BIP:5'-GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT -3'(SEQ ID NO.9)；

LF:5'-GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT-3'(SEQ ID NO.10)；

LB:5'-CGTAGTCGCAACAGTTAAGAAATTC(SEQ ID NO.11)。

第三引物组针对E基因进行扩增，其核苷酸序列如下：

F3:5'-AGCTGATGAGTACGAACTT-3'(SEQ ID NO.12)；

B3:5'-TTCAGATTTTTAACACGAGAGT-3'(SEQ ID NO.13)；

FIP:5'- ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTATTCGTTTCGGAAGAGACAG-3'(SEQ IDNO.14)；

BIP:5'-TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT -3'(SEQ IDNO.15)；

LP:5'-CTGCGCTTCGATTGTGTGCGT-3'(SEQ ID NO.16)；

本发明的又一具体实施方式中，提供上述引物组在基于环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种检测SARS-CoV-2的LAMP检测方法，所述方法包括使用上述引物组进行LAMP扩增。

本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法包括：

S1.配置LAMP反应体系，通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增；

S2.通过肉眼观察反应管颜色变化判断检测样品中是否含有SARS-CoV-2。

其中，所述步骤S1中，

LAMP反应体系包括反应液和待测RNA样品，其中，所述反应液中包含上述引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶和显色液。

其中，所述显色液为锰离子鳌和型钙黄绿素。

其中，所述RNA模板包括但不限于从咽喉液、肺泡灌洗液、唾液、痰液、血液、尿液和粪便中获得的RNA样品；

LAMP反应条件为：60-65℃恒温反应20-30min。

所述步骤S2中，如肉眼观察反应产物为绿色浑浊液体，则确认含有 SARS-CoV-2；如反应产物为橙色透明液体，则表明不含有SARS-CoV-2。

本发明的又一具体实施方式中，所述检测方法还包括设置有阳性对照和阴性对照；

本发明的又一具体实施方式中，阳性对照为在上述反应液中加入PC RNA；所述阴性对照为上述反应液中加入超纯水。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种SARS-CoV-2的LAMP检测试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶和逆转录酶。

所述检测试剂盒还设置有阳性对照和阴性对照。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述试剂盒在基于环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

1.RNA提取

扩增所用RNA通过市售合格提取仪及试剂提取，无特殊要求。

2.引物设计及筛选

根据RdRp、N、E三个基因序列，分别利用Primer Explorer V5软件设计多组引物，每引物组包括一对特异性内引物和一对特异性外引物，根据反应时间及特异性对不同引物的反应进程和结果进行监测、筛选，确定反应快、特异性高的最佳引物。筛选到的引物序列见表1。

表1引物序列

3.LAMP反应体系

LAMP反应总体系为12.5μL，反应时加入10μL反应液，再加入2.5μL待检测RNA。同时设阳性对照和阴性对照。

阳性对照为：反应时在反应液中加入PC RNA；

阴性对照为：反应时在反应液中加入超纯水。

10μL反应液含有：反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、显色液、外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP、环引物；

其中，反应缓冲液成分及含量见表2；

表2反应缓冲液成分及含量

Bst DNA聚合酶的活性含量为：100单位

逆转录酶的活性含量为：1单位

显色液为：锰离子鳌和型钙黄绿素，0.5nmol；

各引物的含量见表3；

表3各引物在20μL反应体系中的含量

4.试剂盒设置

每个试剂盒中应包含检测管和对照管，最少应设置检测管和阳性对照、阴性对照，本试剂盒设置为8人份，内含24个检测管(8个×3排，RdRp、N和E基因各1排)，1个阳性对照管和1个阴性对照管。

5.反应条件

将2.5μL待检RNA加入LAMP反应管的反应液内，混匀，阳性对照中加入 PC RNA，阴性对照中加入无菌超纯水。将LAMP反应管置水浴锅中或金属浴中进行扩增，扩增条件为：60-65℃水浴恒温反应20-30min。

6.结果判定

在LAMP反应进行的过程中，随着大量DNA的合成，还产生一种副产物焦磷酸根离子，焦磷酸根离子浓度与生成的DNA成正比。反应初期，显色液中的钙黄绿素与荧光淬灭剂锰离子结合而不发荧光。由于焦磷酸根离子更易与锰离子结合从而释放了钙黄绿素。游离的钙黄绿素可以自发荧光，在镁离子存在的条件下，这种荧光效果得到了加强。而且这种荧光在自然光下可被裸眼观察到。扩增反应前，反应液为淡橙色，待检测样本RNA被逆转录并扩增后反应液变为绿色。因此从反应开始至结果判读均不需要打开反应管，可以有效避免因形成气溶胶而导致的DNA污染及假阳性的产生。

所以，反应液变为绿色的为阳性结果；反应液不变色仍为淡橙色的为阴性结果。若反应时间延长至30min以上，可能会出现假阳性，结果判定以30分钟以内时为准。

本试剂盒检测3个基因，在阴阳性对照正常的情况下，结果判断如下：

表4判断为SARS-CoV-2阳性的各基因组合

7.敏感性检测

将RNA用DEPC水进行系列稀释，使稀释浓度为10、20、40、80、100、200、400、800、1000倍，同时做LAMP和荧光PCR，检测两种方法出现阳性反应的最低模板浓度，计算本试剂盒的检测限。结果显示，所用荧光PCR试剂盒可以检测稀释20倍的样本，所用荧光PCR说明书中检测限为1000copies/ml。本试剂盒三个基因中N基因能检测稀释400倍的样本，说明检测灵敏度比荧光 PCR试剂盒高20倍，检测限为50copies/ml，E基因能检测80倍稀释的样本，检测限为250copies/ml，RdRp能检测40倍稀释的样本，检测限为500copies/ml，综合评定本试剂盒检测限为500copies/ml，是临床所用试剂盒检测灵敏度的2倍。而且，试剂盒中N基因的灵敏度非常高，是临床所用试剂盒检测灵敏度的20倍，而N基因阳性的样本需要进一步复查，这样可以保证不漏检。

表5本试剂盒中各基因检测灵敏度

8.特异性检测

选择临床检测新型冠状病毒肺炎阳性标本和阴性标本，以及甲型流感、乙型流感、呼吸道合胞病毒阳性标本，提取RNA，进行LAMP扩增。结果35分钟时，只有临床阳性的新型冠状病毒RdRp基因和E基因呈阳性，其他标本均为阴性，表明本引物具有很高的特异性。

9.临床样本应用检测

采用本试剂盒对经过临床确证的207份标本(阳性21份，阴性186份)进行检测。本试剂盒鉴定出阳性标本20份，阴性标本187份。未验证出的1份阳性标本经荧光PCR再次检测为阴性，分析原因为RNA降解。采用本试剂盒检测，从扩增样本到结果判定结束仅需30分钟，而传统荧光PCR需要接近3个小时。相比之下，本试剂盒具有快速、便捷、准确的特点，可操作性强。

表6本试剂盒各基因检测临床样本结果

应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 济南市中心医院

<120> 一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组、试剂盒及方法

<130>

<160> 16

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gttacgatgg tggctgta 18

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggcatactta agattcattt gag 23

<210> 3

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

agccttaccc catttattaa atggagctaa ccaagtcatc gtcaa 45

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

aatgagttat gaggatcaag atgcattata gtagggatga cattacgt 48

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

aaaccagctg atttgtctag gttg 24

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

agatcacatt ggcacccg 18

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ccattgccag ccattctagc 20

<210> 8

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

tgctcccttc tgcgtagaag ccaatgctgc aatcgtgcta c 41

<210> 9

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ggcggcagtc aagcctcttc cctactgctg cctggagtt 39

<210> 10

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

gcaatgttgt tccttgagga agtt 24

<210> 11

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

cgtagtcgca acagttaaga aattc 25

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

agctgatgag tacgaactt 19

<210> 13

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

ttcagatttt taacacgaga gt 22

<210> 14

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

accacgaaag caagaaaaag aagtattcgt ttcggaagag acag 44

<210> 15

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

ttgctagtta cactagccat ccttaggttt tacaagactc acgt 44

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgcgcttcg attgtgtgcg t 21

Claims

1.一种SARS-CoV-2的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，所述LAMP检测引物组至少包括针对RdRp基因进行扩增的第一引物组、针对N基因扩增的第二引物组和针对E基因扩增的第三引物组。

2.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，第一引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-GTTACGATGGTGGCTGTA-3'(SEQ ID NO.1)；

B3:5'-GGCATACTTAAGATTCATTTGAG-3'(SEQ ID NO.2)；

FIP:5'-AGCCTTACCCCATTTATTAAATGGAGCTAACCAAGTCATCGTCAA-3'(SEQ ID NO.3)；

BIP:5'-AATGAGTTATGAGGATCAAGATGCATTATAGTAGGGATGACATTACGT-3'(SEQ ID NO.4)；

Lp:5'-AAACCAGCTGATTTGTCTAGGTTG-3'(SEQ ID NO.5)。

3.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，第二引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-AGATCACATTGGCACCCG-3'(SEQ ID NO.6)；

B3:5'-CCATTGCCAGCCATTCTAGC-3'(SEQ ID NO.7)；

FIP:5'-TGCTCCCTTCTGCGTAGAAGCCAATGCTGCAATCGTGCTAC-3'(SEQ ID NO.8)；

BIP:5'-GGCGGCAGTCAAGCCTCTTCCCTACTGCTGCCTGGAGTT-3'(SEQ ID NO.9)；

LF:5'-GCAATGTTGTTCCTTGAGGAAGTT-3'(SEQ ID NO.10)；

LB:5'-CGTAGTCGCAACAGTTAAGAAATTC-3'(SEQ ID NO.11)。

4.如权利要求1所述的环介导等温扩增检测引物组，其特征在于，第三引物组核苷酸序列如下：

F3:5'-AGCTGATGAGTACGAACTT-3'(SEQ ID NO.12)；

B3:5'-TTCAGATTTTTAACACGAGAGT-3'(SEQ ID NO.13)；

FIP:5'-ACCACGAAAGCAAGAAAAAGAAGTATTCGTTTCGGAAGAGACAG-3'(SEQ ID NO.14)；

BIP:5'-TTGCTAGTTACACTAGCCATCCTTAGGTTTTACAAGACTCACGT-3'(SEQ ID NO.15)；

LP:5'-CTGCGCTTCGATTGTGTGCGT-3'(SEQ ID NO.16)。

5.权利要求1-4任一项所述引物组在基于环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2中的应用。

6.一种检测SARS-CoV-2的LAMP检测方法，其特征在于，所述方法包括使用权利要求1-4任一项所述引物组进行LAMP扩增。

7.如权利要求6所述的检测SARS-CoV-2的LAMP检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：

S2.通过肉眼观察反应管颜色变化判断检测样品中是否含有SARS-CoV-2；

优选的，所述步骤S1中，

LAMP反应体系包括反应液和待测RNA样品，其中，所述反应液中包含上述引物组，还包含反应缓冲液、Bst DNA聚合酶、逆转录酶和显色液；

优选的，所述显色液为锰离子鳌和型钙黄绿素。

优选的，所述RNA模板包括但不限于从咽喉液、肺泡灌洗液、唾液、痰液、血液、尿液和粪便中获得的RNA样品；

优选的，LAMP反应条件为：60-65℃恒温反应20-30min；

优选的，所述步骤S2中，如肉眼观察反应产物为绿色浑浊液体，则确认含有SARS-CoV-2；如反应产物为橙色透明液体，则表明不含有SARS-CoV-2；

优选的，所述检测方法还包括设置有阳性对照和阴性对照；

8.一种SARS-CoV-2的LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1-4任一项引物组、反应缓冲液、BstDNA聚合酶和逆转录酶。

9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述反应缓冲液组分包括Tris-HCl、KCl、MgSO₄、(HN₄)₂SO₄、Tween20、甜菜碱和dNTPs；

优选的，所述试剂盒还包括显色液，所述显色液为锰离子鳌和型钙黄绿素；

优选的，所述检测试剂盒还设置有阳性对照和阴性对照。

10.权利要求9所述试剂盒在基于环介导等温扩增法检测SARS-CoV-2中的应用。