CN101892325A - 用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组及检测体系 - Google Patents
用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组及检测体系 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组及检测体系，用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到肠道病毒71型，不需要复杂仪器，为肠道病毒71型检测提供了新的技术平台。
Description
技术领域
本发明涉及一种用环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)检测肠道病毒的引物组、检测体系、检测方法及用途。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)，属于小核糖核酸(Ribonucleic Acid RNA)病毒科肠道病毒(Enterovirus，EV)属，A组EV。1974年Schmidt等首次报道，从美国加利福尼亚州20例具有中枢神经***症状患者(1969～1973年)分离到EV71。随后，世界上许多国家都有EV71流行的报道。EV71感染可引起手足口病(Hand，Foot，and Mouth Disease，HFMD)、疱疹性咽峡炎、无菌性脑炎、无菌性脑膜炎和脊髓灰质炎样麻痹，但更多情况下是发生隐性感染。肠道病毒的传统检测方法为先将病毒分离培养，然后进行血清中和试验定型分类，此法繁琐、耗时、费力，虽然多数培养结果可在1周内得到，但中和试验却十分费时、昂贵，甚至有时无法定型。PCR方法具有快速、敏感性强、特异性高等诸多优点，已应用于肠道病毒的检测，但由于需要昂贵的仪器设备和较高检测费用，以及对检测人员较高的技术要求，因而使其不适用于现场快速检测及和基层普及应用。
LAMP技术是由Notomi等于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术缩短了核酸扩增时间，提高了扩增效率，并且具有更高的灵敏度、特异性，降低了仪器设备及检测条件的要求，被公认为具有较强实用性的分子检测技术。目前，LAMP技术已经成功应用于多种病毒的检测，如SARS冠状病毒、登革热病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒等，但尚未见该方法在肠道病毒71型检测方面的应用。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足，提供了一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组；
本发明的第二个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系。
本发明的第三个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的方法。
本发明的第四个目的是提供一种用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系的用途。
本发明的技术方案概述如下：
用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组，它由序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列组成。
用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系，该体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1μL-2μL；
5mol/L的Betaine 2μL-6μL；
10mmol/L的dNTP 2μL-3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的方法，它包括下述步骤：
(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA；(2)取3μL所述cDNA加入到22μL的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒；(3)加入20μL矿物油，于62℃恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1小时；(4)取出反应管，加入SYBR Green Ⅰ型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在肠道病毒71型，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在肠道病毒71型，所述用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1μL-2μL；
5mol/L的Betaine 2μL-6μL；
10mmol/L的dNTP 2μL-3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系的用途。
本发明具有下列优点：
1)高特异性：4条引物对靶序列6个特异区域的识别保证了LAMP扩增的高度特异性，见图1。
2)高灵敏度：LAMP灵敏度比聚合酶链式反应(PCR)更高，其所需扩增模板可达101拷贝/反应，见图2。
3)鉴定简便：扩增结果通过肉眼观测，向反应液中加入SYBR Green Ⅰ荧光染料时，若反应液呈绿色，则为阳性；若反应液呈桔黄色，则为阴性反应，见图3。
4)操作简单：将待测样品和检测试剂混合后，只需放入62℃恒温加热仪器中进行LAMP反应即可。
5)快速、高效：整个扩增反应只需1小时即可完成。
本发明的检测体系可以在等温条件下，快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到肠道病毒71型，不需要复杂仪器，为肠道病毒71型检测提供了新的技术平台，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
附图说明
图1：肠道病毒71型LAMP检测体系的特异性。
图2：LAMP(A)、PCR(B)检测肠道病毒71型的灵敏度比较。
图3：本发明检测体系SYBR Green Ⅰ型荧光检测法检测结果图。
具体实施方式
实施例1：特异性基因组序列查找和LAMP引物设计
从GenBank中检索获得肠道病毒71型基因组序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到肠道病毒71型的特异性的保守靶序列，该保守靶序列的DNA序列为：
CCCGAGATGGAGTGTTTGACTACTACACCACAGGGTTAGTCAGTATATGGTATCAGACAAATTACGTGGTTCCAATCGGGGCGCCCAATACAGCCTATATAATAGCACTAGCGGCAGCCCAAAAGAACTTCACTATGAAATTGTGCAAGGATGCTAGTGATATCCTGCAGACGGGCACCATCCAGGGAGACAGGGT
LAMP引物设计
通过专门的LAMP引物软件Primer design V3(http://primerexplorer.jp/elamp3.0.0/index.html)设计引物，设计的具体LAMP引物(用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物)为：
| 序列 | 名称 | 类型 | 长度(碱基数) |
| SEQ ID NO.1 | F3 | 正向外引物 | 20 |
| SEQ ID NO.2 | B3 | 反向外引物 | 18 |
| SEQ ID NO.3 | FIP | 正向内引物 | 39 |
| SEQ ID NO.4 | BIP | 反向内引物 | 40 |
实施例2：检测体系的建立
通过设置不同终浓度的Mg2+(3mmol/L，3.5mmol/L，4mmol/L，4.5mmol/L，5mmol/L，5.5mmol/L)、dNTP(0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L、1.6mmol/L、1.8mmol/L)、Betaine(0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L、1mol/L、1.2mol/L、1.4mol/L)和温度(60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃)，优化得到最佳反应参数，从而建立肠道病毒71型LAMP检测体系。优化的检测体系(22μL)之一种如下：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1.5μL；
5mol/L的Betaine 5μL；
10mmol/L的dNTP 3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
检测反应条件：62℃恒温1小时。
注：Mg2+终浓度＝(母液浓度25mmol/L×1.5μL+ThermoPol缓冲液中含20mmol/L×2.5μL)/25μL
实施例3：用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系，该体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1.5μL；
5mol/L的Betaine 3.5μL；
10mmol/L的dNTP 2.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
实施例4：用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系，该体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1μL；
5mol/L的Betaine 2μL；
10mmol/L的dNTP 2μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
实施例5：用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系，该体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 2μL；
5mol/L的Betaine 6μL；
10mmol/L的dNTP 3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
实施例2-5中，体系为22μL，还可以同等倍数扩大或缩小该体系，各组分加入量也随扩大倍数或缩小倍数同比例扩大或缩小。
实施例6：检测体系的特异性分析
以肠道病毒柯萨奇A16、柯萨奇B3、柯萨奇B5、埃可30、脊髓灰质炎病毒及甲型肝炎病毒6种病毒核酸为模板检测体系的特异性。
(1)反应体系(22μL)配制：
| 超纯水 | ThermoPol缓冲液(10×) | Mg2+(25mmol/L) | Betaine(5mol/L) | dNTP(10mmol/L) | F3/B3(各10μmol/L) | FIP/BIP(各100μmol/L) | Bst酶(8U/μL) |
| 7.2μL | 2.5μL | 1.5μL | 5μL | 3μL | 各0.5μL | 各0.4μL | 1μL |
(2)LAMP扩增：
首先配置出22μL一种用于检测肠道病毒71型的LAMP检测体系，取3μL制备好的待检测样品中的病毒核酸(已预先逆转录为cDNA)加到上述已配制好的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系中，使最终反应体积为25μL，10000转/分钟，瞬时离心30秒，混匀反应液后，加入20μL矿物油，放于62℃恒温中1小时，进行环介导恒温扩增技术扩增1小时。结果见图1。
图1中的各个泳道分别是：
M：DNA Marker；
1：肠道病毒71型；
2-7：分别为肠道病毒柯萨奇A16、柯萨奇B3、柯萨奇B5、埃可30、脊髓灰质炎病毒减毒株和甲型肝炎病毒减毒株。
上述结果表明，肠道病毒71型LAMP检测法只能扩增肠道病毒71型而不能检测到其他非目标病毒核酸，故所建立的LAMP检测方法具有良好的检测特异性。
实施例7：检测体系的灵敏度分析
以107-100拷贝/μL的含有肠道病毒71型序列的标准质粒为模版，分别进行LAMP和PCR，比较两种检测方法的灵敏度。结果见图2。
图2(A)是LAMP检测结果，图2(B)是PCR检测结果，两图中的各个泳道分别是：
M：DNA Marker；
1-8：分别以107-100拷贝/μL的标准质粒为模版；
9：阴性对照。
以上结果表明，用LAMP体系检测肠道病毒71型的效果很好，其灵敏度比普通PCR法高10倍。
实施例8：检测体系的SYBR Green Ⅰ型荧光检测
LAMP检测体系和过程同实施例7，反应结束后向反应管中加入9μL SYBR Green Ⅰ型核酸染料，反应液变成绿色，则说明反应成阳性。若为桔黄色，则反应为阴性，结果见图3。
图3(A)：肉眼观察。
图3(B)：紫外灯下观察。
其中各个泳道分别是：
M：DNA Marker；
1-8：分别以107-100拷贝/μL的标准质粒为模板；
9：阴性对照。
实施例9：取自实际环境水体样品的LAMP检测
采集天津地区某处地表水水样1L，浓缩10000倍，抽提浓缩水样的总RNA，随机引物逆转录为cDNA作为模版备用。检测体系如下。
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1.5μL；
5mol/L的Betaine 2μL；
10mmol/L的dNTP 3μL；
10μmol/L的引物F3 0.5μL；
10μmol/L的引物B3 0.5μL；
100μmol/L的引物FIP 0.4μL；
100μmol/L的引物BIP 0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
取3μL上述cDNA加入到22μL的LAMP检测体系中，10000转/分钟，离心30秒，加入20μL矿物油，于62℃恒温中进行LAMP扩增1小时，取出反应管，加入10μL SYBR Green
Ⅰ型核酸染料，反应液变成绿色，说明所测水样中存在肠道病毒71型。
实施例2-5的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系对实施例9同样的实际环境水体样品进行检测，检测步骤也同实施例9，各检测体系的结果也使反应液变成绿色，说明实施例2-5的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系可用于检测肠道病毒71型。
Claims (4)
1.用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的引物组，其特征是它由序列表中SEQ IDNO.1所示核苷酸序列、SEQ ID NO.2所示核苷酸序列、SEQ ID NO.3所示核苷酸序列和SEQID NO.4所示核苷酸序列组成。
2.用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系，其特征是该体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1μL-2μL；
5mol/L的Betaine 2μL-6μL；
10mmol/L的dNTP 2μL-3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
3.用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的方法，其特征是它包括下述步骤：
(1)提取待检测样品中的病毒RNA并逆转录为cDNA；(2)取3μL所述cDNA加入到22μL的用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系中，10000转/分钟，离心30秒；(3)加入20μL矿物油，于62℃恒温中进行环介导恒温扩增技术扩增1小时；(4)取出反应管，加入SYBR Green Ⅰ型核酸染料，若反应液变成绿色，则说明待测样品中存在肠道病毒71型，若为桔黄色，则说明待测样品中不存在肠道病毒71型，所述用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系由下述原料组成：
10×的ThermoPol缓冲液2.5μL；
25mmol/L的Mg2+ 1μL-2μL；
5mol/L的Betaine 2μL-6μL；
10mmol/L的dNTP 2μL-3μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.1所示核苷酸序列0.5μL；
10μmol/L的序列表中SEQ ID NO.2所示核苷酸序列0.5μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.3所示核苷酸序列0.4μL；
100μmol/L的序列表中SEQ ID NO.4所示核苷酸序列0.4μL；
8U/μL的Bst酶1μL；
加超纯水至总体积为22μL。
4.用环介导恒温扩增技术检测肠道病毒71型的检测体系的用途。
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