CN105936943B - 一种快速灵敏的马尔堡病毒rt-lamp检测方法 - Google Patents

一种快速灵敏的马尔堡病毒rt-lamp检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种快速灵敏的马尔堡病毒RT‑LAMP检测方法。本发明的检测方法通过设计特异性引物，通过环介导的等温扩增(LAMP)技术，采用添加荧光目视的试剂，可以简单快速的检测到扩增产物；检测方法包括：标本RNA提取，RT‑LAMP扩增，结果判读。本发明能对马尔堡病毒进行快速灵敏的检测，仪器设备和操作简单，检测时间段。通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止马尔堡病毒的传入。

Description

一种快速灵敏的马尔堡病毒RT-LAMP检测方法
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速灵敏的马尔堡病毒RT-LAMP检测方法。
背景技术
随着全球经济一体化和贸易自由化，国外的医学媒介生物通过先进的交通工具和国际贸易，可以迅速把传染病从一个国家或地区传向全球，造成国际间传播。近年来,新发病毒性传染病在世界各国频频暴发流行,对人类健康带来严重威胁,给社会造成巨大经济损失。比如2003年的严重急性呼吸综合征(SARS)在部分国家和地区的流行,2004年我国和周边国家的禽流感流行,2009年全球甲型H1N1流感疫情，2014年非洲的埃博拉疫情给社会安定、经济建设和人们的生命健康带来了重大的影响。这些新发病毒性传染病的频发给我们敲响了警钟,加强对其的研究和监测以及早预防控制是至关重要的。
马尔堡出血热是由马尔堡病毒引起的一种致死率极高的烈性传染病。马尔堡病毒和埃博拉病毒共同构成丝状病毒属，但属两个不同的种系。最早有关马尔堡出血热爆发的记录是在1967年德国马尔堡。据报道当时有31人感染病毒发病，其中7人死亡。这31个感染病毒的人中有25人是由于接触了感染马尔堡病毒的猴子而致病的。之后常发生于一些非洲国家，迄今为止已经发生12次疫情，最严重的一次疫情在2004至2005年发生于安哥拉，累计报告病例374例，其中死亡329例。MARV主要通过密切接触传播，病死率为23％～90％，目前还没有商品化疫苗。
马尔堡病毒基因组全长约19kb，为单股负链RNA病毒。基因组编码7种病毒蛋白，包括核蛋白(NP)、基质蛋白VP24和VP40、结构蛋白VP30和VP35、依赖RNA的RNA多聚酶(L蛋白)、糖蛋白7(gp7)。
目前马尔堡病毒的检测方法主要有病毒分离培养与鉴定、血清中和试验、酶联免疫吸附检测(ELISA)、核酸检测等。对于病毒性疾病来说,病毒分离与培养鉴定是最可靠的检测手段。但是上述病毒分离需在生物安全4级(P4)实验室条件下进行,且所需时间较长,对实验室及实验人员要求极高，也不适用于广泛应用及国境口岸的快速筛查。血清中和试验是病毒血清学检测的主要方法,但同样需要在P4级实验室中进行。同时在2005年的疫情检测中发现ELISA、IgM等血清学或免疫学的检测方法灵敏度较低，假阴性率高，只有核
酸检测的手段灵敏度得到了一致的认可，但是常规的PCR操作复杂，设备庞大，技术难度比较高，不利于口岸现场诊断以及疫区现场检测。因此迫切需要研发一种新型的快速、简单的核酸检测方法。本发明专利通过研究一种逆转录环介导等温扩增反应(RT-LAMP)方法检测马尔堡病毒。
环介导等温扩增法是一种新型恒温核酸扩增方法，其特征是针对目标核酸上的六个区段设计4种或6种引物，然后利用链置换反应在一定的温度下进行反应。4种引物中的2种内引物其3’端和5’端能分别识别靶核酸序列中2个不同区域，并设计成其5’端序列可与由3’端起始的延伸反应所合成的互补链区域退火结合。内引物可形成茎环结构，并进行自我延伸反应，随后在环状结构位置有新的内引物退火结合进行链置换合成反应。二者不断循环重复，实现扩增反应。因此，即便只有1种酶，环介导等温扩增法也可以实现恒温扩增。以RNA为模板时，只需事先加入逆转录酶，就可一步完成cDNA的合成和核酸扩增过程(逆转录环介导等温扩增反应)。
环介导等温扩增基因扩增法的特征是在合成大量核酸的同时，还会生成大量副产物焦磷酸离子。荧光目测试剂中所含的钙黄绿素初始因与锰离子结合而处于荧光淬灭状态。但随着环介导等温扩增反应的进行，因为被反应副产物焦磷酸离子夺去结合的锰离子，钙黄绿素恢复游离从而发出荧光。进而与反应液中的镁离子相结合，使荧光得到增强。根据这一原理，可以通过荧光目视检测轻松判断是否发生了环介导等温扩增。
环介导的等温扩增(LAMP)方法具备快速、高效、特异性强、灵敏度高等优点。LAMP方法速度快，对实验要求不高，只需要一台水浴锅即可，不需要无菌操作，在短时间内可以检测大量样品，适于实验室血清诊断、海关检疫及大规模疫病普查。此外，LAMP检测法比较灵敏，而且结果也较为可靠。
目前对于马尔堡病毒的分子生物学检测主要是通过PCR技术，本发明根据马尔堡病毒的特异性基因片段V35，设计了一组特异性引物，采用RT-LAMP的方法可以在短短的半小时到一小时内检测扩增片段，操作上只要一台恒温水浴锅即可，方法简单，灵敏度高，时间短。本发明的检测方法可运用于马尔堡病毒快速灵敏的检测，作为口岸快速筛查的方法，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之一是提供一种快速灵敏的马尔堡病毒RT-LAMP检测方法，本发明能对马尔堡病毒基因进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止疫情的发生和国外马尔堡病毒的传入。
本发明所提供的快速灵敏的马尔堡病毒RT-LAMP检测方法，包括如下步骤：
(1)全血标本进行RNA液提取；
(2)RT-LAMP扩增：
a.RT-PCR反应体系包括：2×反应缓冲液(RM),待测样本基因特异性引物，dd H2O,酶溶液,RNA提取液，荧光目视试剂；
b.将PCR反应液加入PCR管，放入63℃的恒温仪器或LAMP检测仪，恒温反应的反应条件：63℃反应60min。；
(3)结果判读：阴性对照颜色为棕色，阳性样本为绿色，如果用LAMP检测仪则有明显的扩增曲线。
步骤(1)中所述的RNA提取可使用血液样本基因组RNA提取试剂盒提取RNA。取100ul全血样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA；
步骤(2)中所述的PCR反应体系为：2X反应缓冲液12.5μl,特异性引物混合液2.5μl,酶液1.0μl,dd H2O 3.0μl,荧光目测试剂1.0μl，RNA提取液5μl。
步骤(2)中所述的待测样本基因特异性引物为以马尔堡病毒特有基因VP35基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各三对引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB，对VP35基因在多种马尔堡病毒中的序列进行比较，选取同源性最高的一段设计引物可提高马尔堡病毒检出的特异性。三对特异性引物为：
内引物-FIP:5’-GTTTCCTCACTGAGTTCAAGGACCCGGTTAAAAATGCAACAACAG-3’ (SEQID NO 1)
内引物-BIP：5’-CAAGCCAAACCTCTCAGCCAGGATGTGGAATGGAGTGT-3’ (SEQ ID NO 2)
外引物-F3：5’-AGCTTGTAGTAAGGGGACTA-3’ (SEQ ID NO 3)
外引物-B3:5’-GTAAGCAATTTTTGAAAGGACC-3’ (SEQ ID NO 4)
环引物-LF: 5’-ACATCTTGTCGGCTGCAT-3’ (SEQ ID NO 5)
环引物-LB:5’-TTACCCATCTACCCGGCAA-3’ (SEQ ID NO 6)
本发明针对马尔堡病毒特有基因，设计三对特异性引物，使得本发明的检测方法检测马尔堡病毒基因的准确率更高，可以灵敏、特异地检测马尔堡病毒，与常规PCR方法比较，检测灵敏度和特异性均明显高于常规方法。本发明的检测方法不仅可以满足日常疫情安全检测的要求，也可以满足临床样品的检测要求。本发明与现有检测方法相比，反应只需要在一台小型LAMP扩增仪或者恒温水浴中即可完成，检测结果可以通过目测的方法检测到，大大缩减了检测的时间和复杂性，检测设备简单易于携带，大大提高了当前的检测能力。而从样品采集到检测总时间完全可以在1小时内完成，有益于快速准确的检测马尔堡病毒。
附图说明
图1为实施例1马尔堡病毒RT-LAMP检测结果。
左边图为右边图的检测管在LAMP扩增仪检测到的信号强度，右图为肉眼观测到的颜色变化，右图上面的数字代表的copies/ul。
图2为实施例1马尔堡病毒RT-LAMP检测方法马尔堡病毒V35阳性样本检测特异性结果。
左为不同样品扩增产物荧光强度，右为不同柱状图样本名称。
图3为实施例1马尔堡病毒RT-LAMP检测方法灵敏性实验结果。
左为各柱形图的样本浓度，右为不同浓度样本的扩增产物荧光强度。
图4为实施例1马尔堡病毒RT-LAMP检测方法检测时间测定结果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1马尔堡病毒RT-LAMP检测方法的特异性与灵敏性
一、实验步骤
1.马尔堡病毒、埃博拉病毒RNA的体外合成
利用经生物信息学方法分析已公开发表的马尔堡病毒安哥拉株基因组序列(Ang1379c)，人工合成含特异检测马尔堡病毒VP35片段(约600bp)克隆于PCR cloning vector(TOPO TA cloning kit)上，用质粒DNA提取试剂盒纯化质粒DNA，测序证实***片段正确后进行体外转录：先用Not I酶切质粒使线性化以排除下游RNA产物，再用MAXIscript T7Kit进行体外转录，生成目的RNA，然后用TurboDNase进行DNase处理，去除未转录完的质粒DNA模板，最后用乙醇沉淀，提纯RNA产物，即为阳性对照RNA模板，保存于-70℃超低温冰箱待用。同样的方法得到埃博拉病毒VP35的RNA片段。
2.血液样本的采集
取口岸检测病人的全血样本1.0ml，离心处理得到血清。
3.基因组RNA的提取
使用血液样本基因组RNA提取试剂盒(离心柱型，Qiagen公司)提取登革热RNA、黄热RNA、西尼罗病毒RNA。取100uL血清样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取RNA。
4.RNA浓度的测定
通过Nanodrop 2000c测定RNA片段的浓度，并根据RNA片段的大小计算RNA的拷贝数。
5.靶基因的扩增
5.1引物的设计
以马尔堡病毒特有基因VP35基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的各三对引物：内引物FIP/BIP、外引物F3/B3、环引物LF/LB，对VP35基因在多种马尔堡病毒中的序列进行比较，选取同源性最高的一段设计引物可提高马尔堡病毒检出的特异性。三对特异性引物为：
内引物-FIP:5’-GTTTCCTCACTGAGTTCAAGGACCCGGTTAAAAATGCAACAACAG-3’ (SEQID NO 1)
内引物-BIP：5’-CAAGCCAAACCTCTCAGCCAGGATGTGGAATGGAGTGT-3’ (SEQ ID NO 2)
外引物-F3：5’-AGCTTGTAGTAAGGGGACTA-3’ (SEQ ID NO 3)
外引物-B3:5’-GTAAGCAATTTTTGAAAGGACC-3’ (SEQ ID NO 4)
环引物-LF: 5’-ACATCTTGTCGGCTGCAT-3’ (SEQ ID NO 5)
环引物-LB:5’-TTACCCATCTACCCGGCAA-3’ (SEQ ID NO 6)
5.2反应体系
在LAMP扩增仪上进行扩增，扩增体系为：2X反应缓冲液12.5μl,特异性引物混合液2.5μl,酶液1.0μl,dd H2O 3.0μl,荧光目测试剂1.0μl，RNA提取液5μl。
恒温反应的反应条件：63℃反应60min。
6.结果判读
a，在LAMP扩增仪上进行扩增，通过扩增柱状图进行判断
b，在恒温仪器中进行扩增，通过扩增体系颜色变化判断，阴性对照为棕色，阳性为绿色。
7.检测体系特异性
根据RNA浓度的测定，得到10E+6copies/ul与1copies/ul两个马尔堡病毒V35核酸片段浓度样本，分别以两个浓度的马尔堡病毒VP35基因RNA、埃博拉病毒V35基因片段、登革热病毒RNA、黄热病毒RNA、西尼罗病毒RNA为模板按照5.2步骤进行检测，观察其特异性。
8.体系灵敏性检测
按照5.2的方法对各稀释度进行测定，并计算检测方法的检测下限。
9.检测时间：根据检测的曲线，确定检测时间
二、结果
1.马尔堡病毒的检测能力
用体外合成的马尔堡RNA样品进行了实验，结果见图1。通过实验发现，从1copy/ul到109copies/ul的样品都可以检测到，并且检测结果通过机器检测荧光强度与肉眼观察反应液颜色的变化结果一致。充分说明该方法操作简单，只要有一台水浴锅就可以进行反应，并观察结果。与机器采集荧光强度相比，可能不如机器精准。
2.样本特异性试验：
如图2显示，两个马尔堡病毒V35核酸片段10E+6copies/ul与1copies/ul高低两个浓度均可以检测到，而其他病毒RNA及埃博拉人工合成V35核酸片段均未检测到。
3，灵敏性实验
分别检测100copies/ul、10copies/ul、1copies/ul、0.1copies/ul、0.01copies/ul、0.001copies/ul及0.0001copies/ul不同稀释浓度梯度的样本，进行方法灵敏性实验，如图3显示，可以检测到1copies/ul浓度的样本，样本量为5ul，检测下限5copies。
4，检测时间测定
当10、100copies/ul的样本在28min时可以检测到，而1copy/ul样本在42min时可以检测到，具体见图4。另外其他数据显示10E+6copies/ul样本甚至可以在16min时可以检测到，具有极好的时效性。

Claims (1)

1.基于RT-LAMP快速灵敏检测马尔堡病毒的引物，其特征在于，以马尔堡病毒VP35基因片段为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计三对特异性引物为：
内引物-FIP：
5’-GTTTCCTCACTGAGTTCAAGGACCCGGTTAAAAATGCAACAACAG-3’(SEQ ID NO.1)内引物-BIP：
5’-CAAGCCAAACCTCTCAGCCAGGATGTGGAATGGAGTGT-3’(SEQ ID NO.2)
外引物-F3：
5’-AGCTTGTAGTAAGGGGACTA-3’(SEQ ID NO.3)
外引物-B3：
5’-GTAAGCAATTTTTGAAAGGACC-3’(SEQ ID NO.4)
环引物-LF：
5’-ACATCTTGTCGGCTGCAT-3’(SEQ ID NO.5)
环引物-LB：
5’-TTACCCATCTACCCGGCAA-3’(SEQ ID NO.6)。
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