CN111286551A

CN111286551A - 结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法

Info

Publication number: CN111286551A
Application number: CN202010007480.XA
Authority: CN
Inventors: 张阿梅; 罗娟秀; 宋玉竹; 夏雪山; 李晓菲
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Kunming University of Science and Technology
Priority date: 2020-01-04
Filing date: 2020-01-04
Publication date: 2020-06-16

Abstract

结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法，试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的引物。基于巢式PCR的原理，通过逻辑筛选获得不与其它物种匹配的特异性基因设计高特异性的引物。进行PCR验证引物特异性，确定可用于鉴定结核分枝杆菌的特异性检测。PCR扩增产物经琼脂糖电泳检测，依据能否扩增出目的片段来实现结核分枝杆菌简便、经济、快速的检测。具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，且该方法对仪器的要求较低，能够广泛应用于县级及以上级别的医院。该方法的建立能够帮助临床医生快速准确诊断结核病患者，及时用药，达到早诊断、早治疗的目的。

Description

结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及结核分支杆菌快速检测试剂盒领域，特别涉及结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法。

背景技术

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的具有高度传染性的疾病，主要通过呼吸***传播，因此绝大多数患者的累及器官为肺，即常说的肺结核。机体其他器官或组织发生结核感染的情况相对肺组织较少，但也时有发生，肺外结核常见的感染部位包括脑、骨骼和***等。结核病是当今致病率和死亡率极高的传染性疾病之一，主要易感人群为青壮年，严重危害人类的健康，给感染者、家庭和社会带来了沉重的负担，已成为全球范围严重的公共卫生问题。19世纪早期，由于缺乏有效的预防和治疗措施，欧洲约五分之一的人口死于结核病；直到20世纪初期和中期，随着卡介苗和结核治疗药物的出现，结核病的发病率和死亡率得到了有效的控制。但是由于抗生素的滥用、环境污染的严重和艾滋病的流行等原因，仅在抗结核药物应用后不久该病的发病率、耐药率和死亡率均有升高趋势。全球传染病死亡数据显示，因结核分枝杆菌感染而死亡的人数超过艾滋病死亡人数，仅低于腹泻和疟疾的死亡人数。中国是世界上30个结核病高负担国家之一，患病人数居世界第二，仅次于印度。

分子生物学检测技术是近些年发展起来的检测方法，具有快速、特异性及敏感性高等特点。应用分子检测技术的基本原理，对结核分枝杆菌及其他相近的分枝杆菌进行序列比对，从而设计出能够特异性检测结核分枝杆菌的引物，可以对患者的痰液样品是否存在结核分枝杆菌进行快速检测。

通过研究，我们以临床结核患者痰液为实验材料，设计了两对针对结核分枝杆菌进行特异性扩增的引物，建立一种特异性好、灵敏度高、并且快速、准确的结核分枝杆菌分子检测方法，且该方法对仪器的要求较低，能够广泛应用于各类实验室和县级及以上级别的医院。该方法的建立能够帮助科研工作者和临床检验科室快速准确诊断结核样本，达到快速准确诊断的目的。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法，针对痰或其他体液样品中结核分枝杆菌进行快速检测。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

结核分枝杆菌的快速检测引物，该引物序列为：如SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

一种结核分枝杆菌的快速检测试剂盒，所述试剂盒的检测试剂包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、特异性引物、琼脂糖凝胶配制试剂。

进一步的，所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性引物。

一种结核分枝杆菌的快速检测试剂盒的使用方法，该方法包括如下步骤：

(1)收集结核患者的痰液样本，提取结核分枝杆菌全基因组DNA；

(2)以提取的DNA为模板，应用权利要求1所述两对特异性引物对其进行扩增，得到相应的PCR扩增产物；

(3)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

(4)进行试剂盒灵敏度检测，设置6个梯度，用以检测出所能检测到的最低水平的结核分枝杆菌DNA拷贝数为10个拷贝；

(5)进行试剂盒特异性检测，随机选取了5种临床常见致病微生物，进行核酸提取，用本发明的两对引物进行扩增，检测是否能够扩增出PCR产物。

进一步的，所述步骤(4)中，灵敏度检测设置的6个梯度具体为：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10个拷贝。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明中的试剂盒与其它现有技术相比，具有快速、简单、经济、准确、灵敏的特点，仪器设备要求不高，试剂和实验条件较易达到，仅需要DNA提取试剂、PCR扩增试剂、以及本发明中最重要的两对高特异性引物即可，PCR产物通过琼脂糖电泳方法快速检测，适合于在大规模的样本筛查中推广应用。本发明对于结核分枝杆菌快速检测研究中具有重要意义。

附图说明

图1为本发明方法的部分检测结果展示。

图2为本发明方法的灵敏度检测电泳图谱。

图3为本发明方法的特异性实验电泳图谱。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法，研发一种准确、快速、简易、经济的针对患者痰液样品中结核分枝杆菌的检测试剂盒。从NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)下载结核分枝杆菌标准株全基因组序列和其他分离株序列208条，下载其他分枝杆菌基因组序列173条，进行序列分析和人工校对筛选，筛选获得结核分枝杆菌的高度保守且特异性序列区段，该区段序列与其它分枝杆菌序列无明显相似性。基于巢式PCR的原理，根据这段获得的序列设计针对结核分枝杆菌高度特异的引物。通过PCR扩增，检测引物的可用性，同时摸索引物的最适工作条件和验证设计引物的特异性，确定其可用于鉴定结核分枝杆菌的特异性。目前能够进行结核分枝杆菌快速分子检测的试剂盒和仪器是X-pert检测，但是该仪器与试剂价格昂贵，对医院和检验科室的要求高，检测费用高，并非所有患者都能承担该检测费用。我们所研发的试剂盒中包含经过反复实验摸索得到的高度特异性的结核分枝杆菌检测引物，经该引物PCR扩增后，产物可通过琼脂糖电泳进行检测，依据能否扩增出目的片段来实现结核分枝杆菌简便、经济、快速和准确的检测。

为确定巢式PCR方法检测结核分枝杆菌的特异性和灵敏度，选取了5种常见致病微生物，进行引物特异性检测。用巢式PCR一步产物构建阳性质粒，对不同拷贝数的阳性质粒进行扩增，以确定其灵敏度，并提供本技术检测的最低水平的DNA拷贝数的技术参数。

本发明利用巢式PCR方法检测结核分枝杆菌，包括以下一种或几种试剂的组合：

(1)从痰液中提取结核分枝杆菌DNA的试剂。

(2)用于一步和二步扩增结核分枝杆菌特异序列的引物和相关的PCR试剂；

(3)配制琼脂糖凝胶的试剂。

用于分子检测结核分枝杆菌的试剂盒，所用的两对PCR引物为

(1)

myco--F1：5’-ATGACGGCAATCTCGTGCTCA-3’

myco-R1:5’-TTAGCTGGCCGCCAGCTGCTCG-3’

(2)

myco-F2:5’-GCAAGACCGTCGAGGTCACC-3’

myco-R2:5’-CCAGGACGTTGTTGAGCAGCA-3’

用于分子检测结核分枝杆菌的试剂盒，所述检测试剂包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、特异性引物、琼脂糖凝胶配制试剂。

应用本发明试剂盒进行结核分枝杆菌检测的具体操作如下：

(2)以提取的DNA为模板，应用本发明设计的两对特异性引物对其进行扩增，得到相应的PCR扩增产物；

(3)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测条带存在与否及大小是否正确；

(4)进行试剂盒灵敏度检测，设置6个梯度(即10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10个拷贝)用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。

实验例：如图1所示。

1、引物设计

基于巢式PCR的原理，通过Blast分析各分枝杆菌序列筛选获得不与其它物种匹配的特异性基因设计特异性高的引物，引物序列见序列表，产物大小为375bp。

2、样品采集

由昆明市某医院提供实验所需临床样品。

3、样品基因组DNA提取

使用试剂盒法从痰样品中提取结核分枝杆菌基因组DNA。

4、巢式PCR扩增

巢式PCR反应体系：

(1)内围PCR总体积20μL，包含30ng基因组DNA，10μL

2×TSINGKE^TM Master Mix，***正反向引物各3μM，余下用ddH₂O补齐。

(2)***PCR总体积20μL，包含1.5μL内围PCR产物DNA，

10μL 2×TSINGKE^TM MasterMix，内围正反向引物各3μM，余下用dd H₂O补齐

PCR反应程序：

(1)内围PCR：94℃，预变性5min；94℃变性30s，57.5℃退火30s，72℃延伸10s，重复20个循环；72℃延伸5min。

(2)***PCR：94℃，预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，重复25个循环；72℃延伸5min。

5、PCR产物检测

PCR产物检测：取PCR产物3μL在2％的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE，150V恒压电泳23min，凝胶成像***下观察拍照。实验结果展示(见图1)。图1中，泳道M为2000bp的核酸分子标准品，泳道1-10为结核病人痰标本核酸PCR产物。泳道11为阴性对照。泳道12为阳性对照。该检测方法检出结果与临床诊断结果一致。该结果表明我们设计的特异性引物能够高效的检测出临床样品中存在的结核分枝杆菌。

6、灵敏度检测

使用构建成功的阳性质粒作为模板，设置6个梯度(即10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10个拷贝)用以检测出本技术所能检测到的最低水平的突变DNA的技术参数。按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。

用本发明方法进行痰样品中结核分枝杆菌的检测灵敏度实验的电泳结果(见图2)。图2中，泳道M为2000bp的核酸分子标准品，泳道1-6的质粒拷贝数为10、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶。泳道7为阴性对照。模板拷贝数由低到高时，可以明显的看出条带由微弱到明亮的变化，在10拷贝数的质粒作为模板时，条带同Marker相比，条带的亮度高于Marker，故在拷贝数为10的情况下仍能有效工作。由此，可以得出用于检测结核分枝杆菌的两对引物具有较高的灵敏度，即10个拷贝时即可扩增出特异性片段，可以检测到结核分枝杆菌的存在。

7、特异性实验

本发明为了验证巢式PCR引物的特异性，选取了5种常见致病菌，进行核酸提取，对巢式PCR引物进行测试。将模板按照与步骤4和5相同的PCR反应体系和程序扩增并检测。

用本发明方法进行痰标本中结核分枝杆菌的检测特异性实验的电泳结果(见图3)。图3中，泳道M为2000bp的核酸分子标准品，泳道1-5分别是金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯氏菌、溶血葡萄球菌和鲍曼不动杆菌核酸扩增产物。泳道6为结核分枝杆菌扩增产物，泳道7为阴性对照。图3中仅有结核分枝杆菌基因组DNA扩增出目的条带，而其他菌类的基因组DNA扩增结果均为阴性。由此，可以得出用于检测结核分枝杆菌的两对引物具有良好的特异性，能够有效的将结核分枝杆菌在临床常见的呼吸***病原菌中检测出来。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

序列表

<110> 昆明理工大学

<120> 结核分枝杆菌的快速检测引物、试剂盒及其使用方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacggcaa tctcgtgctc a 21

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttagctggcc gccagctgct cg 22

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaagaccgt cgaggtcacc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccaggacgtt gttgagcagc a 21

Claims

1.结核分枝杆菌的快速检测引物，其特征在于，该引物序列为：如SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示。

2.一种结核分枝杆菌的快速检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测试剂包括DNA提取试剂、PCR扩增试剂、特异性引物、琼脂糖凝胶配制试剂。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括核苷酸序列如SEQ IDNO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的特异性引物。

4.根据权利要求2-3任一所述一种结核分枝杆菌的快速检测试剂盒的使用方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：

(3)将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，灵敏度检测设置的6个梯度具体为：10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²和10个拷贝。