CN104059994B - 一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法和在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测中的应用。本发明涉及的miRNA分子包括hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p。通过Taqman低密度芯片和qRT-PCR方法，鉴别出上述4中miRNA在发热伴血小板减少综合征病毒发病早期表达特异性地显著升高。用这4种血清miRNA作为分子靶标，建立了一种快速、敏感、特异的发热伴血小板减少综合征病毒急性感染的检测方法。本发明涉及hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p在发热伴血小板减少综合征病毒感染早期诊断中的用途，以及检测hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p所用的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法和在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测中的应用。
背景技术
发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS)是我国近年来新发现的由布尼亚病毒引起的一种出血性疾病，病原称之为SFTS病毒。本病主要分布山区和丘陵地带的农村，呈散发，人群普遍易感。临床表现为发热，体温多在38℃以上，伴乏力、恶心、呕吐等，部分病例有头痛、肌肉酸痛、腹泻等。绝大部分患者预后良好，但部分病例病情危重，出现意识障碍、皮肤瘀斑、消化道出血、肺出血等，可因休克、呼吸衰竭、弥漫性血管内凝血等多脏器功能衰竭死亡，重症死亡率高达15-30％。目前在我国的河南、湖北、山东、安徽、辽宁、江苏、浙江等地都发现了SFTS病例。近期在日本、韩国和美国都发现了由SFTS相关病毒引起的病例，表明病毒的分布范围较广，SFTS已成为威胁人类健康和公共卫生的重要新发传染病。
目前针对SFTS的诊断方法主要有病毒分离、血清学方法和病毒核酸检测方法等。病毒分离耗时费力，且试验操作的生物安全要求高，一般实验室难以开展。检测特异性IgG抗体的血清学方法适合回顾性诊断和流行病学调查，而检测早期抗体IgM的方法敏感性较差。基于PCR的病毒核酸检测有快速、特异和敏感的特点，但要依赖于病毒血症的出现。因此，建立一种针对SFTS病毒感染早期的诊断方法，对于疾病的临床救治和防控意义重大。MicroRNA(miRNA)是一类人体内天然存在的非编码RNA，在转录后水平对基因进行负调控，参与调节细胞的多种重要的生命活动，包括发育、分化、生长、稳态、应激反应、细胞凋亡、免疫激活以及肿瘤生成等。在各种疾病(包括病毒性疾病)的发展过程中，miRNA也扮演着重要角色。从疾病诊断的角度看，异常表达的miRNA可以作为疾病诊断的分子靶标，目前这方面的研究主要集中在癌症、代谢性疾病等方面。miRNA在病毒感染过程中也起着重要作用，研究表明流感病毒、肠道病毒、乙肝病毒等感染，都能引起人体血清中miRNA的差异性表达。血清中成熟的miRNA分子具有高度的稳定性，而且在病毒血症消失后依然可以检出。因此，建立一种基于血清miRNA的检测方法，对于SFTS病毒急性感染的早期诊断具有重要意义。
发明内容
本发明需要解决的问题是提供一种基于血清miRNA的试剂盒及其使用方法和在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测中的应用。
本发明提供的检测发热伴血小板减少综合征病毒急性感染特异性miRNA的试剂盒由AMV反转录体系、PCR反应体系、miR-16内参、阴性质控品和4种miRNA特异性引物探针组成；4种miRNA名称和序列分别是：hsa-miR-188-3p CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA、
hsa-miR-517a-3p AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU、hsa-miR-518f-5pCUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC和hsa-miR-511-3p AAUGUGUAGCAAAAGACAGA。
本发明所述一种基于miRNA的试剂盒在发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测中的使用方法:
SFTS急性感染血清miRNA差异表达的检测：收集SFTS急性期病人血清6份、健康正常血清6份，将两组血清(每份200μL)分别混合，采用酚氯仿法提取总RNA。miRNA差异表达的检测采用TaqMan ArrayHuman v3.0芯片(Applied Biosystems,USA)进行检测。提取的总RNA反转录采用Taqman MiRNA ReverseTranscription Kit(Applied Biosystems,USA)。得到的cDNA进行PCR，然后进行qRT-PCR反应。.采用SDS software v2.3和RQ Manager v1.2.1(Applied Biosystems)软件进行数据分析。CT值大于或等于40定义为未检出
血清差异表达miRNA验证：通过qRT-PCR对SFTS急性感染者血清差异表达显著miRNA进行验证。验证的miRNA特异性引物探针有美国Applied Biosystems设计合成，采用人工合成的单链miR-16作为标准品。试验结果采用SPSS 18.0软件进行统计学分析，数据表示方法为median土SD，组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。结果筛选出6种miRNA可以作为SFTS感染的早期诊断的分子靶标。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
通过检测SFTS病毒感染相关的血清miRNA表达，可以对病毒感染做出早期诊断，而且不依赖于病毒血症的出现，具有快速、敏感、特异等特点，为临床救治和疾病控制提供一种新的检测方法和重要的实验依据。
附图说明
图1qRT-PCR检测急性感染血清中hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p的表达水平
图2ROC曲线评价hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p在SFTSV急性感染中的诊断价值
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1：血清总RNA提取
收集SFTS急性期病人血清6份、健康正常血清6份，将两组血清(每份200μL)分别混合，采用酚氯仿法提取总RNA，具体步骤：1.取100ul血清样品加入含有300ul DEPC水的1.5ml EP中，后加入1ul10f/ul cel-miR-238用于参数校准，充分混匀后加入200ul水饱和酚，剧烈震荡混匀，静置3min，加入200ul氯仿，再次充分震荡混匀后16000g室温离心15分钟。2.吸取上清液，加入两倍上清体积的异丙醇，再加入1/10上清体积3M醋酸钠约40ul，充分混匀后-20℃静置2h，后于4℃下，16000g，离心20min。3.弃上清，加入75％乙醇1ml，4℃，16000g，离心20min。4.弃上清，室温干燥，加入20ul DEPC水溶解RNA。
实施例2：SFTS急性感染血清miRNA差异表达检测
采用TaqMan Array Human v3.0芯片(Applied Biosystems,USA)进行检测。每组样品在Array A板上检测212种miRNA，内参选用U6snRNA。1.反转录采用Taqman MiRNA Reverse Transcription Kit(AppliedBiosystems,USA)：将50ng总RNA加入4.5ul Megaplex pool反转录混合液，包括Megaplex RT Primers(10×)0.8μl，dNTPs 0.2μl，MultiScribe Reverse Transcriptase(50U/μl)1.5μl，RT Buffer(10×)0.8μl，MgCl2(25mM)0.9μl，RNase inhibitor(20U/μl)0.1μl，Nuclease-free water 0.2μl。2.预扩增：TaqMan PreAmp Mastermix(2×)12.5μl与Megaplex PreAmp Primer(10×)2.5μl进行，反转录产物2.5μl，Nuclease-free water 7.5μl。3.qRT-PCR反应在7900HT仪器上(Applied Biosystems)进行：用0.1×TE pH8.0稀释预扩增反应液4倍，每个稀释产物9μl与TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 450μl、Nuclease-free water 441μl混合，取100μl reaction mix加入Array A板上样点，1200rpm离心2次，每次1min。4.数据分析：采用SDS software v2.3，miRNA表达水平分析采用RQ Manager v1.2.1(Applied Biosystems)，CT值大于或等于40定义为未检出。
结果显示，与健康人血清相比，SFTS急性感染者血清miRNA特异性表达上调的有30个。
实施例3：血清差异表达miRNA验证
对实施例2中所得到的SFTS急性感染者血清特异性表达的30种miRNA进行qRT-PCR验证。验证实验选用58份血清，其中29份为SFTS感染急性期血清，29份为健康人血清。检测30种miRNA特异性引物探针有美国Applied Biosystems设计合成，采用人工合成的单链miR-16作为内参基因标准品。检测22中miRNA的每份样本都做三个重复，差异表达水平用2-(ΔCtmiRNA-ΔCtcontrol)计算。本实验采用SPSS18.0软件进行统计学分析，数据表示方法为median土SD，组间比较采用t检验，P<0.05为差异显著。
表1病例组和对照组中SFTS患者和正常人血淸miRNA的表达差异对比。
验证结果表明，与健康对照组血清相比，SFTS急性感染血清中，hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p表达水平显著升高，如图1所示。ROC曲线分析也表明，hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p在感染与健康血清的鉴别检测中，具有很好的特异性和敏感性，如图2所示。因此，这四种miRNA可以作为SFTS感染的早期诊断的分子靶标。
实施例3：检测试剂盒的制备
应用荧光定量PCR(qRT-PCR)原理，制备一种基于血清miRNA的发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测试剂盒，试剂盒的组成部分为AMV反转录体系、PCR反应体系、miR-16内参、阴性质控品和4种血清miRNA(hsa-miR-188-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-518f-5p和hsa-miR-511-3p)特异性引物探针。具体检测步骤：
(1)反转录：按照AMV逆转录体系配置除RNA、RT-Primer之外的母液，将7μl母液、2μlRNA与1μl引物混合均匀。反应程序为：第一步：16℃，15min；第二步：42℃，60min；第三步：85℃，5min；第四步：降温至4℃。阴性对照cDNA制备与样本cDNA制备同时进行，用DEPC水代替RNA。
(2)qRT-PCR检测：配置qRT-PCR体系中除cDNA和probe以外的母液。将1μl cDNA、0.33μl Probe与14.77μl母液均匀混合，并且每个样本每种miRNA检测三复孔，加入96孔PCR板中，每板中分别加入10-3、10-4、10-5、10-6的miR-16样本体系混合物各三复孔，混合均匀。在ABI 7900荧光定量PCR仪上进行qRT-PCR反应，反应条件为95℃5min；95℃15s，60℃1min，40个循环。
(3)结果判定：检测标本和阴性对照间比较采用t检验，P<0.05为差异显著，判为标本检测阳性。
<110>江苏省疾病预防控制中心
<120>一种基于血清miRNA的发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测试剂盒和应用
<160>9
<210>1
<211>50
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
hsa-miR-188-3p （CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA）
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<212>DNA
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<400>3
hsa-miR-518f-5p（CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC
<210>4
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<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
hsa-miR-518f-5p（CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC
Claims (1)
1.基于血清miRNA的检测试剂在制备发热伴血小板减少综合征病毒早期感染检测试剂盒中的应用，其特征是所述基于血清miRNA的检测试剂为：AMV反转录体系、PCR反应体系、miR-16内参、阴性质控品和4种miRNA特异性引物探针；所述4种miRNA名称和序列分别是：hsa-miR-188-3p CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA、hsa-miR-517a-3p AUCGUGCAUCCCUUUAGAGUGU、hsa-miR-518f-5p CUCUAGAGGGAAGCACUUUCUC和hsa-miR-511-3p AAUGUGUAGCAAAAGACAGA。
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