CN101245395B - 大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法。该方法包括两对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的环介导等温扩增引物FIP、BIP、F3与B3，和一种利用上述两对引物检测大菱鲆红体病病毒虹彩病毒的LAMP方法，其中包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和检测结果判断。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出鱼苗、成鱼及饲料中的大菱鲆红体病虹彩病毒，非常适用于大菱鲆红体病虹彩病毒的流行情况调查。
Description
技术领域
本发明属于鱼类病毒检测技术，是涉及用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)反应检测大菱鲆红体病虹彩病毒的一种分子生物学方法——大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法。
背景技术
大菱鲆红体病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是广泛存在于鱼苗、成鱼以及饲料和养殖水体中的一种新的鱼类虹彩病毒，近年来该病毒在我国养殖大菱鲆中迅速流行，导致患病大菱鲆大量死亡，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。因此开发新的技术快速、准确、灵敏地检测TRBIV，加强苗种和鱼体检疫以及养殖水体环境的监测，对预防病毒感染，切断病毒传播，保障我国大菱鲆水产养殖业的健康持续发展具有重要意义。
目前，有关大菱鲆红体病虹彩病毒检测方法的报道还不多，史成银等(2004)通过组织病理学方法和电子显微镜发现报道了大菱鲆虹彩病毒，陈松林等(2004)利用接种培养牙鲆胚胎细胞的方法分离和鉴定到该病毒。在这些方法中，传统的组织病理学方法只能对患病大菱鲆的组织病理状态做出初步判断，并不能直接检测到大菱鲆红体病虹彩病毒的存在；电子显微镜技术虽然可以直接观察到病毒粒子的存在，但其操作复杂、耗费时间长；人工接种培养细胞的方法检测精度低、检测过程耗费时间更长。上述三种方法均不能快速、简便、准确地检测大菱鲆红体病虹彩病毒。史成银等(2007)开发出大菱鲆红体病虹彩病毒PCR检测法，该方法克服了上述三种方法的缺点，在实验室条件下实现了对大菱鲆红体病虹彩病毒的相对快速、准确检测。由于常规的PCR检测需要昂贵的PCR仪、凝胶电泳和成像***，这大大限制了PCR检测方法在生产中的推广应用。
环介导等温扩增技术是2000年由Notomi等发明的。该技术针对目的基因的6个区段，设计4条特异引物并利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在一定温度下对核酸进行等温扩增。最近几年已开始应用于生物致病病原的检测。此前，已有应用LAMP技术检测鱼类虹彩病毒的报道，Caipang等(2004)开发了真鲷虹彩病毒(RSIV)的LAMP检测技术。大菱鲆红体病虹彩病毒和真鲷虹彩病毒虽同属虹彩病毒科，但属于不同的病毒种，其基因组间存在较大的差异，所以已报道的真鲷虹彩病毒LAMP检测技术并不适用于大菱鲆红体病虹彩病毒的检测。目前，尚未见利用LAMP技术检测大菱鲆红体病虹彩病毒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，以实现能对大菱鲆红体病虹彩病毒进行快速、特异、灵敏、简便的现场检测，克服已有技术的不足。
本发明具体包括两个部分：1、提供两对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、46bp、18bp和18bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为FIP、BIP、F3和B3；2、提供一种大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物显示的颜色对检测结果进行判断，如果显示绿色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性。
上述两对LAMP引物序列(FIP、BIP、F3和B3)分别与大菱鲆红体病虹彩病毒的主要衣壳蛋白基因上相应位置核苷酸序列相同或互补，其寡聚核苷酸序列如下：
FIP：5’-TGCGGTGGCTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3’
BIP：5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’
F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’
B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’。
利用上述的LAMP引物，根据以下步骤即可进行TRBIV病毒的检测，具体包括以下四个步骤：
(1)制备待检样品的LAMP反应模板：取0.5克样品，采用天根生化科技有限公司组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)进行组织DAN的提取和纯化，制备LAMP反应的DNA模板；
(2)配制LAMP反应体系：取上述制备的DNA模板1μL，加入到如下反应体系中：引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1.4Mm，MgCl2 8mM，Betaine 1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO4 2mM，(NH4)2SO4 10mM，TritonX-100 0.1％，Bst DNA聚合酶8U，加入双蒸水使反应体系的总体积达到25μL，上述的dNTP为dTTP、dATP、dGTP和dCTP的混合物，其质量比为1∶1∶1∶1；
(3)按照如下反应程序进行LAMP反应：63℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟；
(4)判断LAMP检测结果：LAMP反应结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinderTM 2μL，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阴性。
本发明所提供的TRBIV检测方法具有如下优点：
(1)灵敏度高。对TRBIV的检测极限可低至101个拷贝，对TRBIV检测的灵敏比普通PCR方法高10倍以上。
(2)特异性强。所用的特异引物根据TRBIV主要衣壳蛋白基因中6个不同区域设计，特异性超过常规PCR。
(3)检测时间短。2-3个小时便可获得检测结果，比现有最快捷的PCR检测法节省3-5个小时。
(4)仪器要求宽松。不需要普通PCR所用的PCR仪、凝胶电泳和成像***，只要一个水浴锅或金属浴就能完成检测反应。
(5)操作简单、结果明显。整个检测过程不涉及复杂仪器或设备，稍具分子生物学基础的人员即可完成操作；检测结果清晰明显，直接用眼睛观察就可以判断。
(6)对人和环境安全。检测过程中不使用有毒试剂，对人和环境都非常安全。
(7)低成本。LAMP检测总成本大大低于现有最廉价的PCR检测方法。
总之，该方法具有比普通PCR检测方法更高的特异性、灵敏性和便捷性，可以替代大菱鲆红体病虹彩病毒的电子显微镜、细胞培养和PCR检测法。
具体实施方式
下面通过实施例详细叙述本发明的技术内容。
为了建立TRBIV的LAMP检测方法，首先要选择TRBIV所具有的特异核苷酸序列，然后进行LAMP引物的设计和合成。史成银等(2007)研究表明TRBIV的主要衣壳蛋白基因(GenBank注册号为：AY590687)与其他虹彩病毒不同，可以作为TRBIV的特征核苷酸序列，用于TRBIV的鉴定和检测。在确定主要衣壳蛋白基因作为TRBIV检测的特异核苷酸序列之后，就可以根据该基因的核苷酸序列设计LAMP扩增的引物。LAMP引物的设计首选软件PrimerExplore 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，也可以使用常用的引物设计软件(如PrimerPrimier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的设计要求进行引物设计。利用软件PrimerExplore 4.0在线设计的TRBIV主要衣壳蛋白基因的LAMP引物如下：
FIP：5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3’
BIP：5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’
F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’
B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’。
按照上述引物序列进行LAMP引物的合成(可由商业的DNA合成公司合成，如上海生物工程公司)。
合成制备TRBIV主要衣壳蛋白基因的LAMP扩增引物之后，就可以进行TRBIV的LAMP检测了。其LAMP检测方法包括反应模板的制备、LAMP反应体系、LAMP反应程序和扩增结果的判断。
LAMP检测反应所用的DAN模板可以用常规的组织核酸提取方法制备，也可用商品化的组织DAN提取试剂盒制备。本发明中采用天根生化科技有限公司(TIANGEN)组织基因组DNA提取试剂盒(TIANamp Genomic DNA Kit)进行样品DAN的提取和纯化，制备LAMP反应DNA模板的详细操作步骤参见该试剂盒的使用说明书。
制备LAMP反应DNA模板后，即可进行TRBIV的LAMP反应检测，为此，首先要配制出具有最佳扩增效率和检测特异性的反应体系，本发明中的LAMP反应中的引物、dNTP和Betaine(甜菜碱)的浓度均做了优化，它们的最佳浓度分别是引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，四种dNTP各1.4mM，Betaine 1M。最终确定的反应体系为：引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1.4mM，MgCl2 8mM，Betaine(甜菜碱)1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO4 2mM，(NH4)2SO410mM，TritonX-100 0.1％，待检样品DNA模板1μL，Bst DNA聚合酶8U。按照上述体系要求配制反应混合物，混匀后分装到无菌Eppendorf管中(规格为200μL)，然后加入双蒸水使各Eppendorf管中反应体系的总体积达到25μL。
在反应程序中，扩增温度过高(如65℃)或过低(如60℃)均不利于LAMP反应获得最佳效果，本发明提供的引物和采用本发明确定的反应体系时，其扩增温度为62℃-64℃，最佳的反应温度为63℃。另外，反应时间对反应产物量也有较大影响，在反应时间少于45分钟时，无法观测到反应产物，为保证LAMP反应产生足够的产物便于观测，本发明中反应时间确定为1个小时。扩增反应结束时应在80℃保温5分钟以灭活DNA聚合酶。所以，进行LAMP检测时，需将上述含有反应体系的Eppendorf管放入水浴锅或金属浴中，63℃保温1个小时，然后80℃保温5分钟。
LAMP反应结束后，即可在反应产物中加入核酸染料进行检测结果的判断，本发明中使用的核酸染料为厦门百维信生物科技有限公司商品化生产的GeneFinderTM。在反应产物中加入100倍稀释的GeneFinderTM 2μL，用眼睛观察所测试样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阴性。
实施例1用LAMP方法检测鱼体内的TRBIV
首先按照本发明提供的LAMP引物序列合成用于TRBIV检测的LAMP引物FIP、BIP、F3和B3。然后根据以下步骤进行TRBIV病毒的检测。
(1)制备待检样品的LAMP反应模板：
取待检鱼的脾脏组织0.5克，采用天根生化科技有限公司组织基因组DNA提取试剂盒(TIANampGenomic DNAKit)进行组织DNA的提取和纯化，制备LAMP反应的DNA模板，具体提取和纯化步骤参见该试剂盒的操作说明书。
(2)配制LAMP反应体系：
取上述制备的DNA模板1μL，加入到如下反应体系中：引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.2μM，dNTP 1.4mM，MgCl2 8mM，Betaine(甜菜碱)1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO42mM，(NH4)2SO4 10mM，Triton X-100 0.1％，Bst DNA聚合酶8U；加入双蒸水使反应体系的总体积达到25μL。
(3)按照如下反应程序进行LAMP反应：
63℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟。
(4)判断LAMP检测结果：
反应结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinderTM 2μL，然后用眼睛观察被测样品的LAMP反应产物，如果显示绿色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性，如果显示橙黄色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阴性。
利用上述方法已经完成了取自山东、辽宁、河北的36份大菱鲆样品的检测，检测结果显示，凡是经TRBIV的PCR检测方法确定为阳性的样品，LAMP检测方法均能检测到TRBIV的存在；而其中两份经TRBIV的PCR检测方法确定为阴性的样品，用LAMP检测方法却检测出TRBIV的存在，后来把PCR检测方法的循环数增加到40，从这两份样品中又检测到了TRBIV，这说明PCR检测方法可能会出现漏检的情况，这也反映出该LAMP检测方法比PCR检测方法具有更高的灵敏度和可靠性。
实施例2用于TRBIV检测的LAMP方法和PCR方法的灵敏度测定及比较
用TRBIV主要衣壳蛋白基因(MCP)特异的PCR引物(MCP-sense：5′-CACCATGTCTGCAATCTTA-GGT-3′和MCP-anti-sense primer：5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTGC-3′)扩增TRBIV主要衣壳蛋白基因的全长序列，并构建到载体pDEST32中，获得含有TRBIV MCP基因全长的质粒pDEST32-MCP，然后测定质粒浓度并作10倍的梯度稀释。
将上述稀释后的质粒用作LAMP反应的模板分别进行扩增，用凝胶电泳分析LAMP的反应产物，结果显示本发明提供的LAMP检测方法对TRBIV的检测极限为101个拷贝的病毒粒子。
同时，将上述梯度稀释的质粒用作PCR反应的模板，利用大菱鲆TRBIV主要衣壳蛋白基因特异的PCR引物(MCP-F：5’-CGTGTTAAGATCCCCTCC-3’和MCP-R：5’-TCTCGTAAATGAGTGACACC-3’)，按照如下反应程序分别进行扩增：
94℃变性4min，1个循环；
94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸1min，35个循环；
72℃延伸10min，1个循环；
然后在2％的琼脂糖凝胶电泳上分析PCR产物，结果发现，PCR方法对TRBIV的检测极限仅仅为102个拷贝病毒粒子。
可见，本发明所提供的大菱鲆红体病虹彩病毒LAMP检测方法比目前用于该病毒检测的PCR方法灵敏度高10倍。
Claims (4)
1.一种饲料和水体中的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，其特征在于它的方法包括以下两部分：
1).提供两对用于检测大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP引物序列，即长度分别为45bp、46bp、18bp和18bp的寡聚核苷酸序列，依次命名为FIP、BIP、F3和B3；上述两对LAMP引物的寡聚核苷酸序列如下：
FIP：5’-TGCGGTGGGTGACGTTCTTTACTTTTCTTGGTGCATCTGGACCTC-3’
BIP：5’-ACGTGCAAAGCAATTACACCGCTTTTGCAAAGGCAGATTGACCTTG-3’
F3：5’-GTCACACCCGCAGACAAT-3’
B3：5’-ACCTCGGACAGGGGATTG-3’
2).提供一种大菱鲆红体病虹彩病毒的LAMP检测方法，即首先从待检测样品中制备反应模板，并配制LAMP反应体系，然后通过LAMP反应程序对反应模板进行扩增，最后根据反应混合物的颜色显示对检测结果进行判断。
2.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述的LAMP反应体系：引物FIP和BIP各1.6μM，引物F3和B3各0.21μM，四种dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)各1.4mM，MgCl2 8mM，Betaine 1M，Tris-HCl 20mM，KCl 10mM，MgSO4 2mM，(NH4)2SO4 10mM，Triton X-100 0.1％，待检样品DNA 1μL，Bst DNA聚合酶8U，该反应体系的总体积为25μL。
3.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述的LAMP反应程序：63℃保温60分钟，然后80℃保温5分钟。
4.根据权利要求1所述的大菱鲆红体病虹彩病毒环介导等温扩增检测方法，其特征在于所述的LAMP检测结果判断方法：LAMP反应结束后，在反应体系中加入100倍稀释的GeneFinderTM 2μL，然后在阳光下观察被测样品LAMP反应产物的颜色，如果是绿色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阳性，如果是橙黄色则表示该样品的大菱鲆红体病虹彩病毒检测结果为阴性。
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