CN101845517B - 一种恒温快速检测甲型h1n1流感病毒核酸的方法及试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测病毒核酸的方法及试剂盒，属于生物技术领域。本发明是一种快速、等温的甲型H1N1流感病毒RNA扩增方法，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7RNA多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，扩增效率大于等于PCR，其反应产物是单链RNA。本发明的有益效果是：具有与RT-PCR检测方法相同或更高的敏感性；重要的是由于扩增产物为RNA，避免了RT-PCR扩增产物的污染问题；整个反应在一小时内完成；操作简单方便；反应可实时监控，也可采取终点法检测，可作为目前甲型H1N1流感病毒检测的重要工具。

Description

一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法及试剂盒

技术领域

本发明涉及一种检测病毒核酸的方法及试剂盒，属于生物技术领域。

背景技术

2009年3月墨西哥暴发“人感染猪流感”疫情，造成人员死亡。6月11日世界卫生组织(以下简称WHO)宣布将流感大流行警告级别提高为最高的6级，意味着新一轮的流感大流行的到来。研究发现，此次疫情的病原为变异后的新型甲型H1N1流感病毒，该毒株包含有猪流感、禽流感和人流感三种流感病毒的基因片段，可以在人之间传播。WHO初始将此次流感疫情称为“人感染猪流感”，但随着对疫情性质的深入了解，现已将其重新命名为“甲型H1N1流感”。我国***于4月30日宣布将其纳入《中华人民共和国传染病防治法》规定的乙类传染病，依照甲类传染病采取预防、控制措施。本次发生的甲型H1N1流感是由变异后的新型甲型H1N1流感病毒所引起的急性呼吸道传染病。通过飞沫、气溶胶、直接接触或间接接触传播，临床主要表现为流感样症状，少数病例病情重，进展迅速，可出现病毒性肺炎，合并呼吸衰竭、多脏器功能损伤，严重者可以导致死亡。截止2009年11月29日，我国已报道确诊病例9.1万余例，死亡178例。对甲型H1N1流感病人的快速诊断可以对疾病的治疗、及时制定、实施防控措施提供指导。

甲型H1N1流感病毒的检测方法包括病毒分离培养、病毒核酸检测和血清学检查三个方面。病毒分离：呼吸道标本中可分离出甲型H1N1流感病毒。合并病毒性肺炎时肺组织中亦可分离出该病毒。然而，病毒分离方法费时、费力，无法满足疾病流行期间同时处理大量标本的需要。血清学检查：动态检测血清甲型H1N1流感病毒特异性中和抗体水平呈4倍或4倍以上升高。但是，抗体的产生需要一至两周的时间，不能达到早期诊断的目的。目前常用的是病毒核酸检测，以RT-PCR及real-time RT-PCR法检测呼吸道标本(咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰)中的甲型H1N1流感病毒核酸，结果可呈阳性。该方法检测灵敏度高，操作简单，但具有样品污染，假阳性率高等缺点，导致错误结果。

发明内容

本发明要解决技术问题是：针对以上现有技术存在的缺点，提出一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法及试剂盒，实现快速、准确检测甲型H1N1流感病毒的目的。

为了解决以上技术问题，本发明的技术方案包括以下步骤：

a.制备特异性检测引物，对现有核酸数据库中的所有甲型H1N1流感血凝素基因核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序列，得到特异性检测引物：

5’-ATTCACCATCCATCTACTAG-3’

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3’；

b.设计特异性检测探针，在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，所述分子信标探针的5’端用5(6)-羧基荧光素进行荧光标记，3’端用淬灭荧光4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸进行荧光标记，得到特异性检测探针：

FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL；

c.提取样品病毒核酸；

d.恒温扩增样品病毒核酸，取扩增反应液与病毒RNA混合，65±2℃温育3-5分钟，41±2℃温育3-5分钟，加入酶混合物，离心后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪，41±2℃恒温反应60-90分钟；

e.用荧光检测仪读取检测结果。

本发明的目的通过以下技术方案进一步实现：在上述步骤d中取11ul扩增反应液与2ul病毒RNA混合，65℃温育3-5分钟，41℃温育3-5分钟，加入7ul的酶混合物，以4000转/分钟离心3秒后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪，41℃恒温反应60-90分钟；所述扩增反应液含有40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、12mM氯化镁、70mM氯化钾、5mM二硫苏糖醇1、1mM的脱氧三磷酸核苷酸、0.5-2mM的三磷酸核苷酸、15％二甲亚砜、0.4-1μM的特异性检测引物和0.1-0.6μM特异性检测探针。所述酶混合物含有4-12U的AMV逆转录酶、20-60U的T7RNA多聚酶和0.05-0.2U的核酸酶H。41℃恒温反应60分钟，每分钟采集荧光信号一次。

根据以上方法，本发明还提出一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的试剂盒，所述试剂盒内含有11ul扩增反应液和7ul酶混合物。

其中，所述扩增反应液含有40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸、12mM氯化镁、70mM氯化钾、5mM二硫苏糖醇1、1mM的脱氧三磷酸核苷酸、0.5-2mM的三磷酸核苷酸、15％二甲亚砜、0.6μM的特异性检测引物和0.2μM特异性检测探针。

所述酶混合物含有8U的AMV逆转录酶、40U的T7RNA多聚酶和0.1U的核酸酶H。

本发明是一种快速、等温的甲型H1N1流感病毒RNA扩增方法，整个反应有赖于AMV逆转录酶、T7 RNA多聚酶和核酸酶H(RNase H)共同协作而完成，不需特殊仪器，不需温度循环，其扩增效率大于等于PCR，其反应产物是单链RNA。RNA扩增产物与荧光信号的增长呈现对应关系。本发明的有益效果是：具有与RT-PCR检测方法相同或更高的敏感性；重要的是由于扩增产物为RNA，避免了RT-PCR扩增产物的污染问题；整个反应在一小时内完成；操作简单方便；反应可实时监控，也可采取终点法检测，可作为目前甲型H1N1流感病毒检测的重要工具。

附图说明

图1为本发明设计的分子信标二级结构示意图；

图2为检测限实验实时扩增曲线图；

图3为临床标本梯度稀释实时扩增曲线图。

具体实施方式

实施例一

一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法，步骤如下：

a.制备特异性检测引物，运用生物信息学知识和相关生物信息学软件对现有核酸数据库中能够检索到的所有甲型H1N1流感血凝素(HA)基因核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序列(下划线部分)，得到特异性检测引物，如下所示：

正向SW HA P2

5’-ATTCACCATCCATCTACTAG-3’

反向SW H1 P1

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3’，

所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；

b.设计特异性检测探针，运用生物信息学知识和相关生物

信息学软件在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，在分子信标探针的5’端用5(6)-羧基荧光素(FAM)进行荧光标记(用“R”标示)，3’端用淬灭荧光4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)进行荧光标记(用“Q”标示)，同时在5’端和3’端加上茎环序列(下划线部分)得到以下特异性检测探针：

FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL；标记的作用是：在无靶标存在的情况下，分子信标的茎环结构使得R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到荧光信号。随着恒温扩增反应的进行，分子信标与完全互补的靶序列(RNA扩增产物)形成刚性并且更加稳定的双链杂交体，使得R基团和Q基团距离增大，R基团所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。分子信标二级结构如图1所示，特异性检测探针由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；

c.提取样品病毒RNA，用Trizol或商品化核酸提取试剂盒按常规方法提取来源于各类组织样本、鼻咽拭子、口腔含漱液、鼻咽或气管抽取物、痰或粪便中的病毒核酸；

d.恒温扩增样品病毒RNA，将扩增反应液11ul与病毒RNA2ul混合后，65℃温育5分钟，41℃温育5分钟，加入酶混合物7ul，以4000转/分钟离心3秒后迅速放回全自动荧光定量PCR检测仪，41℃恒温反应60分钟，每1分钟采集荧光信号一次。

当荧光检测采用终点检测法时，可将扩增管稍微离心并于41℃保温60分钟，将扩增管放入荧光检测仪检测。

e.用荧光检测仪读取检测结果；

结果分析和条件设定如下：对于多通道荧光PCR仪，选定FAM检测通道读取检测结果。域值(Cut off值)的设定原则以刚好超过阴性对照扩增信号的20％为准，不同仪器可根据仪器噪音情况进行调整。阳性标本扩增信号超过cut off值，并出现特定的扩增曲线。扩增信号未超过cut off值或者无特征性扩增曲线，表明样品为阴性。对于终点检测法检测，荧光检测仪的激发波长设为487nm，检测波长设为525nm，荧光值＝样品荧光值或各对照荧光值-空白对照荧光值，Cut off值的设定原则以阴性对照扩增信号的2倍为准，样品的荧光信号大于Cut off值，表示样本为阳性，如样品的荧光信号小于Cut off值，表明样品为阴性。

对本发明的方法进行检测限的确定：以10000拷贝/ul体外转录的甲型H1N1流感病毒HA基因片断进行10倍梯度稀释，用上述方法进行检测，最终计算本发明恒温实时快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法最低可以达到每个反应检测50个拷贝病毒，如图2所示。

以下对本发明的方法做灵敏度特异性实验：

运用本发明恒温实时快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法对67个实际样本及24个流感病毒分离株(其中含8个季节性H1N1流感，6个季节性H3N2流感，2个禽流感H5N1及4个H9N2，4个乙型流感)进行检测，并与参考方法进行比较。参考方法为病毒分离培养、RT-PCR方法和real-time RT-PCR方法，其中任两种阳性判断该样品为阳性，如表1所示，本发明恒温实时快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法与参考方法的比较，本发明可监测出所有甲型H1N1流感病毒，而与其它流感病毒无交叉反应，其灵敏度、特异度、阴、阳性预测值均为100％，具有极高的灵敏度、特异度。

表1

将上述任意一例阳性标本进行10倍稀释后，分别以本发明恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的方法、世界卫生组织推荐的real-time RT-PCR方法及国家疾控中心推荐的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒进行检测。结果发现本发明及国家疾控中心推荐的甲型H1N1流感病毒检测试剂盒均可检测10^-4稀释的标本，优于世界卫生组织推荐的real-time RT-PCR方法，此方法只能检测10^-3稀释的标本，如图3所示。本发明提供的检测方法灵敏度高、特异性强且反应时间短，可以替代反应时间较长的real-time RT-PCR方法作为快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的新方法；其扩增后的产物为RNA，避免了目前检测方法中扩增产物为DNA所带来的污染环境问题；可用任意荧光检测设备，操作简单，无需特殊仪器即可完成。

实施例二

利用本发明的方法制备一种恒温实时快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的检测试剂盒，其制备方法与常规制备试剂盒的方法相同，此处不再赘述，所不同的是：该试剂盒中包括含引物探针的恒温扩增反应液11ul和由AMV逆转录酶、T7 RNA多聚酶和核酸酶H组成的酶混合物7ul。其中扩增反应液中含有40mM三羟甲基氨基甲烷-盐酸(pH 8.5)，12mM氯化镁，70mM氯化钾，5mM二硫苏糖醇1，1mM的脱氧三磷酸核苷酸(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)，0.5-2mM的三磷酸核苷酸(ATP，CTP，UTP，GTP，ITP)，15％(vol/vol)二甲亚砜，0.6μM的特异检测引物，0.2μM特异检测探针。酶混合物为0.1U核酸酶H，40U T7 RNA多聚酶和8U of AMV逆转录酶。其检测结果见实施例一中的表1。

除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。

Claims (2)

1.一种恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒内含有按以下步骤制备的物质：

a.制备特异性检测引物，对现有核酸数据库中的所有甲型H1N1流感血凝素基因核酸序列进行同源性对比，根据保守序列设计引物，在反向引物的5’端加入T7启动子序列，得到特异性检测引物：

5’-ATTCACCATCCATCTACTAG-3’

5’-AATTCTAATACGACTCACTATAGGGGTCCAGTAATAGTTCATTCTC-3’；

b.设计特异性检测探针，在上述特异性检测引物的内部设计分子信标探针，所述分子信标探针的5’端用5(6)-羧基荧光素(FAM)进行荧光标记，3’端用淬灭荧光4-(4’-恶烷氨基苯偶氮)苯甲酸(DABCYL)进行荧光标记，得到特异性检测探针：

FAM-CGCGATACAGCAAGAAGTTCAAGCCKGAATCGCG-DABCYL；

c.制备扩增反应液；

d.酶混合物，所述酶混合物含有4-12U的AMV逆转录酶、20-60U的T7RNA多聚酶和0.05-0.2U的核酸酶H。

2.根据权利要求1所述恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述扩增反应液为11ul，所述酶混合物为7ul。3.根据权利要求2所述恒温快速检测甲型H1N1流感病毒核酸的试剂盒，其特征在于：所述酶混合物含有8U的AMV逆转录酶、40U的T7RNA多聚酶和0.1U的核酸酶H。

Images