CN103060472A

CN103060472A - 一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒

Info

Publication number: CN103060472A
Application number: CN2013100061320A
Authority: CN
Inventors: 刘学忠; 胡锦松; 李庆林; 刘骁
Original assignee: CHENGDU XUEZHONG AGRICULTURAL DEVELOPMENT Co Ltd; Sichuan Agricultural University
Current assignee: CHENGDU XUEZHONG AGRICULTURAL DEVELOPMENT Co Ltd; Sichuan Agricultural University
Priority date: 2013-01-08
Filing date: 2013-01-08
Publication date: 2013-04-24

Abstract

本发明公开了一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO：1 、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4所示。本发明提供了一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的介导等温扩增检测试剂盒对丙型肝炎进行病原学诊断，为丙型肝炎的早期快速诊断提供新方法。

Description

一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒

技术领域

本发明涉及病原体检测技术领域，尤其涉及的是一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。

背景技术

丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus, HCV）属于黄病毒科，是慢性丙型肝炎的病原，迄今为止大约有 2 亿人感染 HCV，感染人口约占全球人口的 2～3%。据报道有些国家HCV 感染率可高达 10%以上例如在非洲和中东一些国家。HCV病毒在遗传变异出表现出来的高变异的特性、以及高效率的细胞培养体系和合适的 HCV 感染小动物模型的缺乏是目前抑制对HCV 深入研究的瓶颈，严重阻碍了科学家对 HCV 生活史、疫苗和特异性抗病毒药物的研究。随着科学技术的发展和不断的深入研究，HCV在病原学、分子生物学、流行病学等领域取得了很多备受关注的研究成果。

HCV 是一直径约为50nm的球状颗粒。颗粒外表有脂质包膜，结合着宿主来源的脂质或免疫球蛋白。HCV的基因组是一单股正链 RNA 分子。

不同个体来源或同一个体不同病程阶段的HCV颗粒可表现出显著不同的浮力密度，主要为1.06g/ mL和1.17g/mL两种密度。HCV在被感染宿主体内的主要寄生地是肝脏，其病毒的浓度是外周循环血中的120倍。HCV有严格的宿主限制性，迄今已证实的可感染宿主只有人类和黑猩猩。虽有利用连续传代的细胞系在体外培养条件下支持HCV复制的报道，但是目前尚不能形成可供进行分子生物学研究的体外模型。

HCV仅有Huh7, Huh7.5, Huh7.5.1三种体外细胞培养***，黑猩猩﹑恒河猴等灵长类动物可感染HCV，但症状较轻。

发明内容

提高丙型肝炎病人疗效的最佳途径是早发现、早诊断、早治疗，要实现这一目的最关键的是早期对HCV病原学的确诊，迄今为止广泛应用于临床的丙型肝炎的病原学确诊方法操作繁琐，费时费力，检测试剂和仪器昂贵，检测费用相对较高的缺点。本发明的目的为提供一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO：1 、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4所示。

所述丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒的使用方法：

分别取5μL HCV RNA模板、取引物FIP和BIP各40 pmol/L，引物F3和B3各5 pmol/L，混匀后置于冰上，加入1.6 mol/L betaine，16 mmol/L MgSO₄，40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 20 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH₄)₂SO₄, 0.2% Tween 20, 2.8 mmol/L dNTPs, Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶50U，补充DEPC处理水至25μL。轻轻混匀反应液，分别置恒温水槽 60℃反应60min，最后80℃孵育 5min以灭活酶终止反应。反应产物于2.5%琼脂糖凝胶l00V电泳 40min，EB染色，全自动凝胶图象分析***观察。

结果判定方法：如扩增产物条带呈LAMP特征性梯状条带为阳性，无任何条带为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，反应液变绿为阳性，反应液保持橙色为阴性。HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，在紫外灯下观察反应液发出荧光为阳性而阴性对照管未见荧光为阴性。

丙型肝炎疾病的早期快速确诊是治疗丙型肝炎的基础和首要条件，寻找敏感性高、特异性强、简便及能批量操作的方法具有重要意义。

迄今为止广泛应用于临床的丙型肝炎的病原学确诊方法是实时定量RT-PCR，但操作繁琐，费时费力，检测试剂和仪器昂贵，检测费用相对较高。本发明通过BLAST比对GeneBank上已公布的27个HCV国际参考毒株的5’-非编码区（5’-UTR）的保守区域和部分核心保守区序列确定RT-LAMP目标序列，根据我国流行的HCV主要为1b型这一特性，以GenBank公布的HCV 1b型基因组全序列（登录号：GU451224）的5’-UTR和核心蛋白的保守区域为目标序列，设计出HCV特异的内引物FIP、BIP和外引物F3、B3，构建了HCV逆转录环介导等温扩增检测法。该方法与临床常用的PCR检测法相比具有很好的敏感性，其最低检测限度可达600 IU/mL。特异性试验中，以HAV，HBV和HEV为模板均扩增不出阳性结果，显示该方法有较好的特异性。在对临床样品的检测比较中我们发现，其检测率比巢式RT-PCR高，几乎和实时定量RT-PCR的检测率相同，并且没有发现HCV的基因型差异对敏感性有影响。该方法在急性HCV感染的早期诊断上有广阔的应用前景。

本发明提供了一种特异性高、操作简便、反应迅速、成本低廉的介导等温扩增检测试剂盒对丙型肝炎进行病原学诊断，为丙型肝炎的早期快速诊断提供新方法。

附图说明

图1 RT-LAMP反应时间的优化结果

图2 RT-LAMP扩增HCV RNA后加入SYBR Green I荧光染料肉眼观察图

图3 RT-LAMP扩增HCV RNA后加入SYBR Green I荧光染料紫外灯下观察结果

图4 RT-LAMP检测HCV的特异性分析

图5 RT-LAMP和RT-PCR检测HCVRNA以及LAMP和PCR检测重建质粒的敏感性分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

2.1 RT-LAMP引物设计

通过BLAST比对GeneBank上已公布的27条代表7个基因型的HCV国际参考毒株的全基因组序列（基因型分类参考http：//euhcvdb.ibcp.fr/euHCVdb.登录号见表1）以确定RT-LAMP目标序列，根据GenBank公布的HCV1b型基因组全序列（登录号：GU451224）的5-UTR和核心蛋白的保守序列，输入在线软件primer Explorer V4（http://primerexplorer.jp/e/）设计RT-LAMP特异的内引物FIP、BIP和外引物F3、B3。

表127条代表7个基因型的HCV国际参考毒株登录号

2.2 HCV阳性血清总RNA的提取

将150μL血清加入1.5mL离心管中，而后加入500μL的Trizol对上清液进行处理，振荡后，在室温下静置5min。EP管中加入100μL氯仿，用力按紧盖子，在旋涡振荡器上剧烈振荡 15s，室温下静置 5min，4℃下12,000r/min离心15min。离心后管中混合液从下而上分成三层，即下层红色的酚一氯仿层、中间层和含水的无色上层。小心吸取上层清液(约250μL)置于另一1.5mL离心管中并加入等量的异丙醇，充分混匀后室温下放置15min，4℃下12,000r/min，离心10min，此时在EP管壁和底部可见白色胶状RNA沉淀。弃上清液，加入500μL 75%乙醇溶液洗涤沉淀，在旋涡振荡器上充分混匀，4℃下7,500r/min，离心 5min。弃上清液，再小心吸取剩余液体弃去。加入20μLDEPC处理水，用枪头轻轻吹打RNA沉淀至其完全溶解，于260nm和280nm测定其OD值，计算RNA的浓度:C_RNA(μL/mL)= OD260nm×稀释倍数×40，保存于-80℃。

2.3 HCV 5'-UTR和核心蛋白保守区域RT-PCR引物设计和合成

根据GenBank公布的HCV 1b型基因组全序列（登录号：GU451224）的5'-UTR和核心蛋白的保守区域，综合运用引物设计软件Oligo6.7，primer5.0设计RT-PCR引物，引物序列为：

上游引物P1: 5'cac tcc cct gtg agg aac tac 3'；

下游引物P2: 5'cat aag cgg aag ctg gga 3'

上述引物由上海英骏生物技术有限公司合成，预扩增片段长度为881bp。

注：因为我国流行的HCV主要为1b型，所以我们根据GenBank公布的HCV 1b型基因组全序列（登录号：GU451224）的5-UTR和核心蛋白的保守区域作为目的片段进行HCV RT-PCR引物设计。

2.4 HCV 5'-UTR和核心蛋白保守区片段的RT-PCR扩增

按照Prime Script ^TMRT reagent Kit反转录试剂盒说明书进行反转录合成cDNA, 其反应体系为:

总体积为20μL，反应条件为：45℃ 45min，70℃ 15min。扩增出来的cDNA 用作以下PCR体系扩增模板。

PCR反应体系为：

总体积为20μL，反应条件为： 94℃ 2min(预变性)、94℃ 30s(变性)、58℃ 30s(退火)， 72℃ 45s(延伸)，36个循环后，72℃延伸10min，4℃保存。取5μL PCR产物1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2.5构建目标序列质粒

2.5.1 RT-PCR扩增片段的胶回收、连接、转化和鉴定

扩增的目的片段经1%琼脂糖凝胶电泳，然后用DNA胶回收试剂盒进行回收纯化处理，具体步骤参照试剂说明书。

2.5.2感受态细胞的制备

按照常规方法制作E. coli DH5α的感受态。

2.5.3重组质粒的连接

取准备好的1.5 mLEP管，编号。先加入目的片段 3.5uL，再加入4μL的so1ution I(使用时于冰中融解)，最后将0.5μL pMD18-T载体加到无菌离心管中，然后把EP管放入16℃的温水保温瓶中反应 1-3h。同时做两组对照反应，其中一只对照组有质粒载体无外源DNA；另外一只对照组有外源DNA片段没有质粒载体。

2.5.4 E. coli DH5α感受态细胞的转化

从－80℃冰箱中取出一支100μL E. coli DH5α感受态细胞悬液，使其在冰面上缓慢解冻。分别把每组4μL的连接反应混和物加至 E. coli DH5α感受态细胞中，轻轻吹打几次混匀。42℃加热 90s后，再放入冰水中静置 1min。最后加入300μL LB液体培养基，37℃水浴 60min，中途摇匀1-2次。

2.5.5重组质粒的筛选

分别取转化原液50μL分别滴在含有X-gal、IPTG和Amp的LB固体培养基上，并用无菌玻棒均匀涂布，倒置平板于37℃培养箱，孵育16h左右，待出现明显单菌落时拿出平板观察。不带有pMD18-T载体的细菌，由于无Amp抗性，不能在含有Amp的LB平板上生长。带有pMD18-T载体的质粒由于具有β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和ITPG的LB平板上显示出蓝色菌落。重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性，在X-gal和ITPG的LB平板上为白色菌落。用无菌牙签挑取阳性单菌落接种于含Amp50μg/mL的5mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养12h。

2.5.6重组质粒的提取、鉴定

2.5.6.1质粒提取试剂盒提取重组质粒

重组质粒的提取参照试剂盒说明书

2.5.6.2 PCR鉴定

以纯化的质粒DNA为模板，以P1、P2为引物进行PCR扩增，从而来鉴定阳性克隆筛选结果。

2.5.6.3测序鉴定

取10μL纯化的质粒DNA送上海英骏生物技术有限公司测序，将阳性重组质粒命名为pMD18-T-HCV-UTR-core。

2.6 HCV RT-LAMP体系的建立

引物的预处理:将装有引物的EP管放入离心机在12,000r/min下离心2min，使得吸附于离心管壁的引物沉到管底部，加入无RNA酶超纯水，盖上盖子轻轻的来回摇晃，使得引物充分溶解，在放入离心管瞬时离心，反复操作2-3次，放入-20℃冰箱保存备用。

2.6.1 HCV RT-LAMP反应体系的建立及反应时间的优化

分别取5μL HCV RNA模板、取引物FIP和BIP各40 pmol/L，引物F3和B3各5 pmol/L，混匀后置于冰上，加入1.6 mol/L betaine，16 mmol/L MgSO₄，40 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 20 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH₄)₂SO₄, 0.2% Tween 20, 2.8 mmol/L dNTPs, Bst DNA聚合酶8U，AMV逆转录酶50U，补充DEPC处理水至25μL。轻轻混匀反应液，分别置恒温水槽 60℃反应 30min、45min、60min、75min，最后80℃孵育 5min以灭活酶终止反应。反应产物于2.5%琼脂糖凝胶l00V电泳 40min，EB染色，全自动凝胶图象分析***观察。如呈LAMP特征性梯状条带为阳性，无任何条带为阴性。

2.6.2 RT-LAMP产物加染料后肉眼观察

在25μL的反应产物中加入100×SYBR Green I染料2μl，混匀，室温静置5min后观察结果，阳性反应液呈绿色，阴性呈反应液呈橙色。

2.7 RT-LAMP特异性分析

经FQ-PCR验证的1份HAV、1份HBV、1份HCV、1份HEV阳性血清标本，作为检测对象，提取RNA或DNA进行RT-LAMP检测。

2.8 RT-LAMP敏感性分析

2.8.1以血清中抽提的总RNA为模板的敏感性分析

将提取的HCV阳性血清的总RNA用酶标仪测定其浓度，然后进行5倍梯度稀释，其浓度分别为9375000、1875000、375000、75000、15000、3000、600 和 120 IU/mL,用优化好的HCV RT-LAMP体系进行敏感性分析。取5uL反应产物，2.5%琼脂糖凝胶电泳100V电泳 40min，EB染色，全自动凝胶图象分析***观察。

同时进行RT-PCR 反应，取5ul反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳100V电泳 40min，EB染色，全自动凝胶图象分析***观察。

2.8.2以重组质粒为模板的敏感性分析

质粒DNA浓度按5×梯度稀释，其浓度分别为31250000、6250000、1250000、250000、50000和10000、2000和400 IU/mL作为模板，分别用LAMP和PCR法进行检测。LAMP反应体系: 引物FIP和BIP各40pmol/L，引物F3和B3各5pmol/L，1.6mol/L betaine，16mmol/L MgSO₄，40mmol/L Tris-HCl (pH 8.8), 20mmol/L KCl, 20mmol/L (NH₄) ₂SO₄, 0.2% Tween 20, 2.8mmol/L dNTPs, Bst DNA聚合酶8U，质粒模板1μL，补充DEPC处理水至25μL。LAMP反应条件: 60℃ 60min，80℃ 5min。PCR反应体系: 250μmol/L dNTPs，5mmol/L MgCl₂，引物P1和P2各 0.5 μmol/L, Taq DNA聚合酶2.5U，10×PCR buffer，质粒DNA模板1μL，补充DEPC处理水至20μL。PCR循环条件:94℃ 2min; 94℃ 30s，58℃ 30s， 72℃ 45s，36个循环; 72℃ 10min。

2.9 HCV RT-LAMP与临床常用检测方法的比较

106个HCV阳性血清样品提取RNA后采用构建好的HCV RT-LAMP诊断方法进行检测，然后与Real time RT-PCR和Nested RT-PCR进行比较。

3 结果

3.1引物的设计

根据发表在GenBank数据库中的HCV1b型（登录号：GU451224）基因组全序列的保守片段（158-337bp）的6个位点，通过primer ExplorerV4设计两对引物(见表2)，其中包括2条外引物(F3和B3)、2条内引物(FIP和BIP)。

表2引物名称和序列

3.2确定RT-LAMP反应时间

在60℃恒温水槽分别反应 30min、45min、60min、75min 。RT-LAMP产物电泳结果显示反应时间的不同其反应产物的特征性电泳梯状条带不同，其中反应时间为60min时候的产物条带较明显(见图1)，图1中：M，DNA Marker DL-2000; 1-4泳道，反应时间为30、45、60、75min; N, 阴性对照；

3.3肉眼观察RT-LAMP产物（SYBR Green I染色法）

HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，阳性反应管中反应液变绿，而阴性对照管保持橙色（见图2），图2中：1，阴性对照；2，阳性。

3.4 SYBR Green I染色紫外灯下观察RT-LAMP产物

HCV RNA经RT-LAMP扩增后加入SYBR Green I荧光染料，在紫外灯下观察可见阳性管中反应液发出荧光，而阴性对照管未见荧光（见图3），图3中：1，阳性；2，阴性对照。

3.5 HCV RT-LAMP的特异性分析

以优化好的RT-LAMP反应条件同时检测HAV﹑HBV﹑HCV和HEV，RT-LAMP产物电泳结果显示HCV呈现特征性梯状条带，而其他病毒株均无特征性梯状条带（见图4），图4中：M，DNA Marker DL-2000；1, HCV；2, HAV; 3, HBV; 4, HEV; 5,N 阴性对照。

3.6 HCV RT-LAMP的敏感性分析

RT-LAMP检测HCV RNA下限为600 IU/mL，LAMP检测重建质粒的下限为 400 IU/mL (图5 A，C);RT-PCR和PCR则为15 000 IU/mL和10000 IU/mL(图5 B，D)。图5中：M，DNA Marker DL-2000；Al-5，质粒浓度为250000、50000、10000、2000和400 IU/mL的LAMP检测；B1-6，质粒浓度为31250000、6250000、1250000、250000、50000和10000 IU/mL的PCR检测；Cl-5，RNA浓度分别为75000、15 000、3000、600 和120 IU/mL的RT-LAMP检测；D6-11，RNA浓度分别为9375000、1 875 000、375 000、75000、15 000和3000 IU/mL的RT-PCR检测。

3.7临床患者血清标本的检测比较

用RT-LAMP、real-time RT-PCR和nested RT-PCR三种方法分别检测106份临床血清标本，比较结果见表3。

表3RT-LAMP、实时荧光定量RT-PCR和套式RT-PCR检测106个临床标本的

比较结果

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.一种丙型肝炎病毒环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于，包括外引物F3、B3和内引物FIP、BIP，所述引物序列依次如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、 SEQ ID NO：3 SEQ ID NO：4所示。